PT92358A - Processo para a preparacao de uma sequencia de adn que codifica para o gene da proteina do involucro do virus do enrolamento da batateira (potato leafroll virus=plrv - Google Patents

Description

Descrição da patente de invenção de BCOSCIISH GROP EE1SE-AEGE IES2ITUÍPE, britânico, instituição pdblica, com sede em Invergowrie*Dundee I)D2 5DA, Escócia,Grã-Bretanha, (inventores: Brian Reavy e Michael Andrew Mayo,residentes na Escócia), para "PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO 3Ki UMA SE-QUSIGIA DE A3)H QI3E GODIPIGA PARA O GElfE Μ PROSE IHA 130 IlTOifJORO DO VÍRUS DG EMQBA-» HEHÍOO DA BASAPEIEA (PQPADO IiEAPROLL VIRUS == PLH?)»

Besoricão O vírus do enrolamento da batateira (Potato Leafrool Virus = PELV) é um vírus que se propaga de planta para planta por vectores afídios e aue provoca uma doença grave que efecta o rendimento da colheita da batata. 31 um luteovirus, um grupo de vírus cujos membros são earacterizados por serem transmitidos duma forma persistente por vectores afídios e por terem partículas iso-métricas que contém o genoma virai de AEN de cadeia simples e que estão largamente confinados ao tecido do liber das plantas infectadas. - 1 - t

Esta invenção proporciona uma sequência de ADN earacterizada por ser capaz de ser transcrita para produzir ΑΈΜ que é ele próprio capaz de ser transladado para produzir a proteína do invólucro (partícula de virus) de PEEV, A invenção refera-se também subs-taneialmente I sequência de ADS seguintes 10 30 50 AÍTIVAATTCTTAGCGGGATTTGCTTTAGGATTCTCATCCGCAATCCCATTTTCAGTAGC 70 90 110 CGGTTTATATTTTGTTTACCTAAAGATTTCCTCCCACGTGCGATCAATTGTTAATGAGTA 130 150 170

CGGTCGTGGTTAAAGGAAATGTCAATGGJGGTGTACAACÁACCAAGAA^GOGAAGAAGGC AATCCCTTCGCAGGCGCGOTAACAGAGTTCAGCCAGTGGTTATGGTCACGGOOCCTGGGC 250 270 290 AACCCAGGOGCCGAAGACGCAGAAGAGGAGGCAATCGCCGCTCAAGAAGÂACTGGAGTTC 310 330 350 cccgaggaggaggctcaagógagacattcgtgtttacaaâggacaacctcgtgggcaacâ 370 390 410 o:caaggaagtttcaccttcgggccgagtctatcagactgtccggcattcaaggatggaâ 430 450 470 tactcaaggcc^ccatgagtataagatcÂcaagcatcttacttcagttcgtcagogagg 490 510 530

CXrrCTTCCAjCCTCCTCCGGTTCCATGGCTTATGAGTTGGÃCCCCCATTGCAAAGTATCAT 550 570 590

CCCTCCAGTCCTACGTCAACAAGTTCCAAÃTTACGAAGGGCGGCGCCAAÃACTTATCAAG 610 630 650 CGCGGATGATAÀACGGGGTÃGAATGGCACGATTCTTCTGAGGATCAGTGCCGGATACTGT 670 . 699 710 GGAAGGGAAÂTGGAAAATCTTCAGATTCCGCAGGATCCTTCAGAGTCACCATCAAGGTAG 730 750 770 CTTTGCAAAÂCCCCAAATAGGTAGACTCCGGATCAGAGCCTAGTCCAAGCCCACAACCAÁ 790 810 830 cacccactccaactccccagaagcacgagcgatttattgcttacgttggcatacctatgò 850 . 870 890 TAACCATTCÃGGCCAGGGAGAACGACGACCAAATCATATTGGGTTCCTTÂGGGAGCCAAÃ 910 930 950 GGATGAAATATATAGAGGACGAGAACCAGAATTATACAAAGTTTAGTTCTGAGTATTACT 970 990

CTCAATCGAGCATGCAAGCCGTCCCTATGTATTACTTCAATG 2

Esta sequência, com a sua proteína ào invólucro de 23 k produto da tradução é: 10 30 50 ATAAATTCTTAGCGGGATTTGCTTTAGGATTCTCATCCGCAATCCCATTTTCAGTAGC 70 90 110

CGGTTTATATTTTGTTTACCTAAAGATTTCCTCCCACGTGCGATCAATTGTTAATGAGTA 130 150 170 M S T CGGTCGTGGTTAAAGGAAATGTCAATGGTGGTGTACAACAACCAAGAATGOGAAGAAGGC VVVKGNVN GGV QQPRMRRRQ 190 210 230

AATCCCTTCGCAGGCGCGOTAACAGAGTTCAGCCAGTGGTTATGGTCACGGOOCCTGGGC

SLRRRANRVQPVVMVTAFGQ 250 270 290 aacccaggcgccgaagacgcagaagaggaggcaatcgccgctcaagaagaactcgagttc

PRRRRRRRGGNRRSRRTGVP 310 330 350

CCCGAGGACGAGGCTCAAGOG AGACATTCGTGTTTAC 7-AAGGACAACCTCGTGC GCAACA RGRGSSETFVFTKONLVGNT 370 390 410 cccaaggaagtttcaccttcgggccgagtctatcagactgtccggcattcaag^atggaa

QGSFTFGPSLSOCPAFKDGI 430 450 470

tactcaaggcctaccatgagtataagatcacaagcatcttacttcagttcgtcmcgagg LKAYHEYKIT SXLLQFVSEA 490 510 530

CCTCTTCCACCTCCTCCGGTTCCATCGCTTATGAGTTGGACCCCCATTGCAAAGTATCAT sstssgsiaveldphckvss 550 570 590

CCCTCCAGTCCTACGTCAACAAGTTCCAAATTACGA?,GGGCGGCGCCAAAACT':.'GC7LAG LQSYVNKFQITKGGAKTYQ-A 610 630 650

CGCGGA?GATAAACGGGGTAG7ATGGCACGATTCTTC?GAGGATCAGTGCCGG?~ACTGT RMINGVEWHOSS EDQCRTLW 670 690 710

GGAAGGGAAATGGAAAATCTTCAGATTCCGCAGGATCCTTCAGAGTCACCATC--.AGGTAG KGNGKSSDSAGSFRVTIKVA 730 750 770

CTTTGCAAAACCCCAAATAGGTAGACTCCGGATCAGACCCTAGTCCAAGCCCACYA.CCAA

L Q Μ Ρ Κ 790 CACCCACTCCAACTCCCCAGAAGCACGAGCGATTTATTGCTTACGTTGGCATACCTATGC 850 870 890 TAACCATTCAGGCCAGGGAGAACGACGACCAAATCATATTGGGTTCCTTAGGGAGCCAAA 910 930 950 GGATGAAATATATAGAGGACGAGAACCAGAATTATACAAAGTTTAGTTCTGAGTATTACT 970 990

CTCAATCGAGCATGCAAGCCGTCCCTATGTATTACTTCAATG lum aspecto adicional a presente invenção proporciona um plasmídeo bacteriano caracterizado por conter uma sequência de ADI capaz de Mbridar com uma porção de genoma de ARI de PR1V. 0 plasmídeo bacteriano tem a sequência de ADI que contém a sequência de codificação que especifica a proteína do invólucro de PLRY que quando posta em contacto com células de planta adequada provoca a transformação de algumas células com as sequências plasmídicas que coutém o ADI específico de PIiEV* A invenção também proporciona um processo para a preparação de uma sequência de ADI duplex capaz de hi^ri,dação com uma porção de ARI de genoma de pelo menos uma fracção isolada de PERIT que compreendes a) isolar ARI a partir de partículas de PDRY purificadas; b) sintetizar cópias de ADI de uma porção do ARI levando o referido ARI ao contacto com uma transcri-ptase inversa na presença de um iniciador oligonu-cleotidico sintético sob condiç-ães de tempo e de temperatura suficientes para a produção de ADI-complementar (ADIe)j e c) sintetizar ADI duplex levando hibridos de ADIc-ARI ao contacto com ribonuclease H e polimerase de ADI sob condiçães de tempo e de temperatura suficien tes para a produção de ADI duplex. 4 -

Ainda nua outro aspecto a presente invenção proporciona uma sonda de ADI átil para a deteeçio de PIjSV e earacterizada por compreender uma sequência de ADI complementar de uma porção de genoma de ARI de PERV e capaz de hibridação com ele.

Ainda num outro aspecto a presente invenção proporciona um processo de deteeção de HiRV numa amostra que contém PLRV e que compreendes a) translacção de encaixe ou oligo-mareação de AM plasmídico que contém a sequência de ADI especifica do PLRV na presença de trifosfato de desoxirri-bonucleosido marcado por meio de radioactividade ou de outro modo; b) aplicação de amostras de plantas suspeitas de infecção ou de insectos suspeitos de virulência num suporte» por exemplo» uma folha de nitrocelu-lose» ou outra membrana» para ligar os componentes de ARI; c) tratamento do suporte com ADI marcado sob oondi-çães tais que o ADI pode Mbridar com sequências de ARI complementares ou substàncialmente complemta-tares; e d) lavar o suporte sob condiçêes tais que essencialmente só o ADI marcado Mbrida&o ê retido e detec-tar este ADI ligado* lum outro aspecto a presente invenção proporciona um processo para a preparação de ABI que é capaz de Mbridar com uma porção do AEI de genoma de pelo menos um isolado de PDRV e que compreendes - 5 - a) — isolar a sequência de AM específica de FLSY a partir do vector de clonagem de plasmídeo; b) inserir a sequência de ADI específica de PM? nua vector de transcrição; c) copiar a sequência de AM para a preparação de AM marcado para utilização na deteoção de AM de PIE? como no aspecto da presente invenção acima referido % d) aplicar amostras de plastas suspeitas de infec-ção ou de insectos suspeitos de virulência num suportef por exemplo uma folha de nitroceluiose ou outra membrana, para ligar os componentes de ARIT; e) tratar o suporte com ARI marcado sob condiçães tais que o AM pode hibridar com sequências de AEN complementares ou substancialmente complementares; e f) lavar o suporte sob condic-Ses tais que essencialmente apenas é retido o AH! marcado hibridado e détectar este ARiJ ligado, luta aspecto adicional a presente invenção proporciona um processo para a preparação de proteína de invólucro de PLR? que compreende cultivar uma célula hospedeira sob condiçSes que promovem a síntese de proteína de invólucro de FIE? e em que a referida célula hospedeira é para além disso caaracterizada por ser transformada por um vector de expressão que compreende a sequência de AM numa orientação com uma sequência de promotor tal que na hospedeira o referido AM é expresso para produzir a proteína de invólucro de PDRY.

Rum aspecto adicionar a presente invenção proporciona um processo para a transformação de - 6 - plantas de tal modo que as plantas transformadas expressam a sequência de âblsf para produzir proteina de involucro de PLRV quer dum modo transitório quer dum modo constitutivo e exemplificado por a) cortar pelo menos uma. porção de soquencia de ãdn especifica do PISV tal que a porção cortada compreenda alguma ou toda a região que codifica para a protei na de invólucro de PIEV; b) inserir a porção cortada num bloco integrado ("cassete") de expressão de um plasmideo; c) transformar células ou prccoplasto.;. de plantas com um plasmideo que inclui o bloco integrado de expressão; d) seleccionar as células transformadas © regenerar plantas transformadas a partir destas células. 0 bloco integrado (“cassette") de expressão plasnidico pode incluir elementos do plasmideo t‘i de Agrobacterium tumsfasciens. As células ou os proto-plastos de plantas são por exemplo os das plantas da batateira* h presente invenção pode proporcionar uma sequência específica do Plii"J para trsnsformagSes do células de plantas por qualquer processo- cie tal modo que as células transformadas expressam a sequência de ADIí a fim de produzir a proteína do invólucro de PIMV ou uma sua parte, 3sta invenção refere-se à clcnagem de informação genética do vírus do enrolamento da batateira.

Esta informação genética © útil como uma sonda para a detec-çâo de genomas de PlTtV em amostras* para a preparação da proteína do invólucro de PlílV por meio de técnicas de i\Dli 7 -

I

recombinante e para a preparação de células transgenlcas e de plantas que sintetizam constitutivameate a proteína do invólucro de PIjRV. o termo "PiflV" na parte gue se segue desta especificado e nas Reivindicações em apêndice é usada para designar o vírus do enrolamento da batateira e vírus relacionados gue podem tomar a forma de diferentes estirpes de F. PvV ou vírus muito semelhantes mas diferentes,, tal como, por exemplo# vírus do cirao amarelo do tomate*

Os termos “orotalna do ir.vólucro" "proteína de partícula de vírus" nesta especificação são usados para se fazer o relacionamento entre a proteína cio invólucro de 23 k isolada e/ou a fusão da proteína do invólucro de 23 X com a totalidade ou parte do produto do gene da proteína Z>3 k codificada depois da extremidade 3* do gene cia proteína do invólucro de 23 iz e carsetdrisada por a fusão das proteínas conter a proteína do invólucro de 23 k nas suas extremidades Il-terminals e por seroa produzidas por tradução com leituras seguicla do oodSo de terminação de proteína do invólucro cie 23 k# ãs formas de concretização cia presente invenção serão agora descritas apenas com finalidades ilustrativas nos exemplos que se seguem, com referência aos diagramas que os acompanhara, nos quais: rxgura t * 1 <3 um diagrama ue mostra as posições de (a) locais ds enzimas de restrição relevantes* (b) a região de codificação da proteína do invólucro# íc) a sequência duaa sonda selectiva e (d) a sequência contida em pSM-39?

k figura 2 um diagrama que mostra a construçSo dum plasmídeo da presente invenção projectado para ensaiar a expressão do gene da proteína do invólucro em células animais; A Figura 3 e um diagrama que ilustra a construçSo dum plasmídeo da presente invenção usado para a transformarão de plsatas? A Figura 4 @ a sequência da proteína do invólucro de 23 kt cia região d© leitura ttguida e da sequência de gene; A Figura 5 ê uma placa dos produtos de tradução in vifcro de transcrição de ãKII específico de

IT< U:J A figura

Norfcheern e cie MI3 extraído de 6 é orna plantas placa cie mane'as de normais e feransgénicas; A Figura 7 e a sequência de ΑΒιϊ cia presente invenção com a proteína no invólucro de 23 k* ΕΕΒΙΦΙΡ 1 A utilização racional pars a clonagem cia informação genética de PíMV foi a seguinte? propagou--se IINR fazendo crescer plantas de batateira a partir de tubérculos de batateira infectados por PLrv e purificaram--se as partículas de vírus tratando extraetos de tecidos de folha e de caule destas plantas como cteeorito por troada & Harrison (1980) com a diferença de crue se usou delluclast a 5% (Rovo Snzfme Products Limited) era lugar de briselase para macerar o tecido vascular* Depois deste tratamento clarificou-se o exfcracto por tratamento com solvente e recolheram-se partículas de PLR.V de suspensão por precipitação . 9 - com polietileno-glicol e centrifugação diferenciai, cxanforme descrito por Tomada & H^rrison (1980)„

Purificaram-se as partículas de PURV mais profundamente por sedimentação em gradientes de densidade sucrose como descrito por Camada C- Harrison (1980), O ARN foi estraído das partículas purificadas como descrito por Mayo et al (1982) e foi recuperado por precipitação a partir cio cfcanol a 70%-, 0 ARK foi hihridaclo com iniciadores oligonucleoticlicos a 65 graus centrigrados em tris-HCl 50 nil a pll 7,5, iCCl 75 ml, cloreto de magnésio 3 m»l o ditiotrei- ~ol ic durante 2 minutos @ :3ox ar:

Eecxdo Isntamente du rante SO minutos até 42 graus centrigrados*

Preparou-se ADHc de dup*;a cadeia a partir do ARN iniciado usando um conjunto de sintese ds ADNc (“kic") (Amarsharn Internacional) e depois ligou-se em pUC 19 (Pharmacia), que tinha sicL· previaraente linsarisado usando a endoauclease de restrição SmaX, usando liçase de kiiti T4 sob condições recomendadas pelo fabricante (ML), transforsaram--se células eoRipetentes de Bscherichia coli, estirpe BH5 alfa (brl) , com os plasmídeos recombinantes sob as condições recomendadas pelo fabricante e em seguida saieocionaram-se colónias de transformastes adequadas pela ausência da B-ga-lactosidase activa e por serem resistentes â ampicilina e depois por hibridacão de colónia (Kaniatis et al) usando como sonda ADNc feito para ARH de ϊΣ&ν como descrito por Taylor et ai (1976) ·Deteria:naram-se as dimensões das inserções de λγ&τ cm pUC 19 nestes clones bacterianos que bibriciam positivamente faseado preparações em pequena escala de plasmídeos, cindindo o ABK coti as endonueleasos de restrição Sac I e Pst 1 e determinando a(s> dimensão (dimensões) do(s) ,sue Be fragmento(s) da ADN decois de subtrair a pode atribuir ao pUG 19 linearisado· S^le-ícionaram-se clones adequados como os que continham dois locais StuX separados por 51 nucleótidos, um local 13amH£ â distância de 217 nucleó- 10

tidos para o lado 3* do local mais perto da extremidade 3* dos locais Stu I. e que tem pelo menos 600 nucleótidos para o lado 3* do local BamBI e pelo menos 50 nucleótidos para o lado 3* do local de BamHI. ú clone seleccionado (pPIR439) tinha uma dimensão de inserção de cerca de 1 kb e assim abrange a região de codificação da proteína de invólucro (Figura D* A sua localização foi verificada determinando a sequência nucleotídica dos fragmentos obtidos com enzimas de restrição da inserção de ADN por terminação da cadeia didesoxi (Sanger et al., 1977)* A inclusão da região de codificação da proteína do invólucro entre a sequência obtida foi confirmada por estabelecimento da existência dum quadro de leitura aberto capaz de ser traduzido para dar um polipeptídeo com a dimensão da proteína do invólucro de PRLV e por expressão do potencial de codificação da sequência em células KeLa# 3m outras experiências seleecionaram--se também clones adequados na fase de mancha de colónia usando uma sonda de 200 nucleótidos de A7)N de cadeia dupla com uma sequência complementar da que termina à distância de cerca de 200 nucleótidos na direcção de 5* do codão de início da proteína do invólucro (ver Figura 1) que tinha sido clonaclo no bacfceriéfago A13 e em seguida marcado com F32 como descrito por Darlser et al., (1985)*

Ha Figura 1 os símbolos representam o seguinte» 5* 3* St cr a extremidade 5' do ARH de i TIIV a extremidade 3* do ARH de PIRV os locais BanfrX Ϊ cm pPIS. 439

a região que codifica para a proteína do invólucro da riliV PÍcom seta) ppLR 439 - a posição da sonda selectiva - a posição cia sequência específica de

- 11 - O veetor para expressão em células HeLa foi preparado como ae segue (ver-também Fig. 2).

Na Figura 2 as abreviaturas representam o seguintes CP - ADHe do viras ão enrolamento da batateira gue codifica para a proteína do invólucro l/ER - repetição terminal longa do vírus do sarcoma c’e rous SV 4o - intrão do autigene t pequeno do vírus de simio 40

O plasmídeo pPXS439 foi cortado integralmente com ScoRl na extremidade 5* da região que codifica para a proteína do invólucro. O ADN foi purificado por extrac-ção com fenol/cloroférmio e por precipitação com etanol. As extremidades coesivas do ADH foram preenchidas usando o fragmento de Klenow de polimerase de AON I e ligou-se o AD2Í dum adaptador de HiadlII (Pharmacia) ao ADK com as extremidades alinhadas como descrito por Píaniatis et al.» (1982)* c ADH foi em seguida purificado como acima e foi cortado integralmente cem Sal I na extremidade 3* da região que codifica para a proteína ão invólucro* Sm seguida purificou-se no-vamente o ADN# tomaram-se as extremidades alinhadas e ligou--se a ADK dum adaptador de Egl II como acima. A seguir a uma ou maio novas purificações, o ADH foi cortado com êind III e Bgl II a fim de gerar extremidades coesivas para clonar em p?R 315 (Srowne et al·, 1988) que tinha sido cortado com Hind III e Bgl II» o ADN cortado foi submetido a electroforese - 12 - 4

em agarose de baixo ponto de fusão a 1 % {Serva), cortaram--se os fragmentos dimensionados adeguadamente (cerca de 1 kb para o ADKc da região que codifica para a proteína do invólucro e cerca de 5,5 fcb para o fragmento 315 pSR) do gel, purificaram-se e em seguida ligaram-se num volume total de 10 jul como descrito por lianiatis et al», (1982) . Utilizpu-se 1 jil da mistura de reacção de ligação para transformar cê-lulas competentes da estirpe de B, coli H3 101 (BRL) como descrito pelos fabricantes. As células transformadas de íiB 101 foram seleccionadas pelo seu crescimento na presença de amplicina e a estrutura do plasmídeo gue elas continham foi estabelecida digerindo o plasmideo preparado a partir de culturas dos transfbrmantes pelo processo da 1:1 se alcalina (Birnboim & Doly 1979) com uma mistura de Hinâ III e Bgl II*

Os transflormantes adequados continham um plasraideo que continha um fragmento de inserção de 1 kb no local de clonagem de pM 315. Bste plasmídeo foi denominado pStll 105 e foi transfectado em células HeLa por co-precapitação com fosfato de cálcio seguida por tratamento de choque cora glicerol e butirata de sodio como descrito por Gorman (1985). As células transfectadas foram em seguida cultivadas durante 24 horas a 37 graus centígrados. As células foram em seguida extraídas por tratamento cora tampão de amostra em imunodepositadas em nitrocelulose como descrito por íosvbin et al. (1979). Fizeram-se reagir as folhas de nitrocelulose com una diluição do 1/100 do anticorpo monoelonal SÍ21 1 que é específico para a proteína d® invólucro de hLK\f. Detectou-se anticorpo ligado por reacção com anticorpos anti-rato conjugados com fosfatase alcalina seguida por reacção da enzima ligada para dar um produto cie reacção corado como recomendado pelos fabricantes (BioRad). A especificação da reacção foi estabeleci-· da tratando õ.q modo semelhante os exfcractos de células trans-fèctados com plasmídeo a que falta a sequência de í.TM específica de PISV. A expressão da região de codificação para o lado 3* do gene de proteína do invólucro foi examinada - 13 -

por tradução in vitro de transcritos cia sequência de ADN específica de PRLV em pPLR439« O ADR foi separado do pPlR439 por digestão com EcoRl e Sall, e ligado em pBluescripf (Stratagene) cortado por EcoRX/SalX para dar origem a pSC103* Os transcritos de ARN foram produzidos essencialmente como descrito por Stratagene usando pSCR103 linearizado por SalX e polimerase de ARN T7. Ãdicionaramrse transcritos de ARR a misturas de tradução de lisado de reticulócitos (Amersnam 35

International) juntamente com S-metionina. Depois de 90 feinutos a 30 graus celsius a mistura foi analisada por fluorogrnfia. Os polipeptídeos radioactivos específicos para o arn transcrito incluem a proteína de invólucro (Ar 23000. 23 k) e um polipeptídeo de 32 k que ê a dimensão esperada para a traduçSo do ARN transcrito integral incluindo o co-dSo de terminação para a proteína do invólucro cie 23 k e para cerca cie 9 ii dá proteína de leitura seguida (Figura 5). A sequência completa da proteína do invólucro cie 23 k © da regiSo de leitura seguida e a sequência que a codifica de (fâayo et al*, 1989} são apresentadas na Figura 3. A construção do vactor para expressar a proteína do invólucro em plantas foi a seguir (ver também Figura 3).

Ra Figura 3 as abreviaturas representam o seguintes CP - ADNc do vírus do enrolaras ato da batateira que ecdifica para a proteína do invólucro 35S - promotor 35S do vírus do mosaico da couve-flor. LD - margem esquerda do ADH-t de p5?i 3?37 RB - maxosm direita do ADR-t de pl-i ‘137 is.an - fosfotransferase de neomicina bn5 nos - promotor de sintase de nopalina - 14 - ph - sequências de poliadenilação de síntese de nopa- lina

EcoRI ""N dal 1 l representam as posições dos locais de HindiΙΪ f cisão de endunucleases de restrição Bgl II / A sequência que codifica para a proteína do invélucro foi separada de pPLR 439 por digestão com EcoR I e Sal I* As extremidades deste fragmento de ADR foram tornadas ãlitíhadas e em seguida ligou-se o fragmento a ADN de um adaptador de Bgl II como descrito acima* A seguir a digestão com Bgl II o fragmento foi clonado no local BamJ de pROR 2# um vector baseado em Bin 19 (3evan 1984) que contém um promotor 35S do vírus do mosaico d2 couve-flor e sequências de poliadenilação de síntese de nopalina, como descrito acima# com a diferença de que a selsccão de recombi-nantes foi feita usando resistência â canamicina em vez de amplicina. Os clones que contém a região que codifica para a proteína do invólucro de RRLV na orientação adequada foram identificados por análise das dimensões dos produtos da digestão por Kind III e Sam H dum plasmídeo de preparação feito por lise alcalina como descrito acima· Gs clones que contém a inserção na orientação correcta produzem um fragmento de cerca de 1*5 kb e e^fce clone foi denominado pSCR.107· ííobili-zou-se pSCR107 a partir de E.coli HB 101 para Agrofoacterium LB4404 por emparelhamento tri-parental usando o plasmídeo pRk2013 como descrito por (Armitage et al 1988)* A presença do plasmídeo na agrobactéria transformada foi confirmada por uma busca rápida nas agrobactérias como descrito por An et al* (1988) seguida por digestões adequadas por enzimas de restrição*

Bsta agrobactéria transformada ÍLBA107) foi usada para transformar a batateira e Bicotiana clevelandi:. por processos de cocultura convencionais (Draper et al*# 15 -

1988)· 0 tecido transformado foi obtido por selecção de regenerantes resistentes à canamicina. Estes foram em segui-da cultivados para dar as plantas completas. A presença da sequência especifica de PRLV em material transformado foi verificada por análise de mancha de Northern de sondagem de espectros de ARN* A sonda foi ADN específico de FRI*V oligo-marcado separado de pPLR439 por digestSo com EcoRI e Sall.

Detectou-se na batateira uma espécie de ARN específico de PIRV de 1 kb e em tecidos de N. cie* velandii indicado que os genomas vegetais continham a sequência específica de PRLV e que esta era transcrita pelas células das plantas (l?ig. 6)*

As batateiras transformadas com a sequência específica de WIN eram raais resistentes à infecção por ERXjV transmitido por afídio do que as plantas de controlo, e nas plantas que foram infectadas o vírus multiplicou--se num grau mais reduzido do que nas plantas de controlo. na Pigura 5 a pista marcada "pSCRlOS" mostra os produtos proteicos específicos de PiRV? a proteína do invólucro cie 23 k e as proteínas de leitura seguida de 32 k estão indicadas do lado direito* A pista marcada "-RIJA'* mostra os produtos endógenos produzidos pelo lisado de reticulocito.

Ha Rigura 6, a pista 0 e ãF:H duma planta normal não transformada? as pistas vl β ϊδ são ARNs de batateira transformadas? a pista T7 é ARKf duma planta de Nico-tiana clevelandii transformada* As posições e as dimensões (kb) de marcadores de virus de mosaico da relva estão indicadas â esquerda. A seta indica o transcrito de específico de ?LRV de 1 k detectado usando um ADEF específico de PXRV oligo-marcado separado de pPiR439 por digestão com EcoRI e Sall. - 16 -

EXEMPIO 2

Prooactacao e purificação do viras* 0 PLRV isolado usado foi derivado da estirpe 1, um vírus Isolado de plantações (Tamada et al*, 1984} obtido a partir de tubérculos infectados de batateira da variedade cara cultivada na Escócia* o vírus isolado foi mantido em tubérculos de batateira e extrairam-se partículas de vírus de rebentos e folhas de batateira infectada e puri£icou-se como descrito por Tamada & Harrison (198o) com a diferença de que se usou

Celiuclast a 5% (íbvo Snsime Products) em lugar de Driselase para macerar os tecidos vasculares*

Extracelo e análise de ARH. Sedimenta-ram-se partículas de vírus de fracções de sucrose por centrifugação a alta velocidade e extraiu-se ο AEN do aglomerado conforme descrito por ílayo et al. (1982)* A Ar do ARH foi avaliada por electroforese de ARO tratado com glioxal em géis de agarose* Os marcadores de i-:r eram ARN*s de partículas de virus de mosaico da relva e de mosaico de tabaco e ARN ribossomal de Sscherichia coli.

Glonaoem molecular* Sm algumas experiências poliadenilou-se o ARN em misturas reaccionais que continham Tris-HCl 50 mã pH 7,9* HaCl 0*25 H* i-ígCl 10 mH* 40 )ig de albumina de soro de bovino* ATP 0*8 mH, 5 ug de ARN de PLRV e 2*5 unidades de polimerase de poli(A) em loo ul durante 15 minutos a 37 graus celsius, recuperou-se e temperou-se para oligo (dT) como descrito por Aaniatis et al* (1982)· Em outros ensaios o ARN foi temperado para iniciadores de oligonucleótido sintético (Applied BioSystems). Estes eram 5*TACfTCTITCACtíGAGTTS* (A), 5*a3CTíxC£TOTCTíTyOGG3* e 5 *GGTTCSCGTGQT*tíTAtfA,r‘A 3* (8) que são complementares dos nucleotidos 641 a 658* 1954 a 1973 e 4488 a 4506, respectiva-mente, na sequência do ARN de tiRV (Mayo et al** 1989), Sintetizou-se ADN de dupla cadeia por transcrição inversa seguida por sintese de ADN de segunda cadeia e tratamento com - 17 - *

nuclease si (Maniatis et al., 1982) para a primeira clonagem ou, em algumas experiências, usando um "kit" comercial (Amer-sham). Fizeram-se plasmldeos de recombinantes por adição de 3* oligo (dC) ao APNc seguida de têmpera com p3R322 ou pUG9 cortado com Pstl e com um apêndice de oligo (dG), por adição de adaptadores de ScoRl e ligação em pUC19 cortado com EcoR7* ou por ligação de extremidades alinhadas em pUCl9 cortado por Smal. Os processos foram essencialmente os descritos por Maniatis et al. (1982) ou como recomendado pelos fabricantes das enzimas usadas* Usou-se p3R3 22 recom-binante para transformar a estirpe de sucoii m 1 tornada competente por tratamento com caci2, RbCl e Mnci2 e as estirpes JlluRu e alfa DH5 (Bethesda Research Laboratories) foram hospedeiros para plasmldeos pCU recombinantes* 8nsaiaram-se clones candidatos (pSR322 sensível à amplicilina ou pUC lac-negativp) por deposito em mancha de colónia êíariatis et al·, 1982) quer com ADNc mareado com 32P para ΜΙΙΊ de PIJRV feito por iniciação aleatória (Taylor et al*, 1976) quer com sequência de PLRV específicas isoladas do ADN recombinante de bactereófago M13 marcado como descrito por Barker et al* (1985).

SuDclonaaem g s&cmenciacão. Prepararara--se plasmldeos por lise alcalina (Birnboim & Doly, 1979? Maniatis et al*7 1982) e analisaram-se para locais de restrição por digestão e electroforese em géis de poliacrilamlda. Recuperaram-se fragraentos adequados de adn de inserção por electroeluição e precipitação de com espermina* Ligaram-se fragmentos de ASM e MM sob forma replicativa ÍRP) de M13 mplO ou de M13mpll e sequen ciou-se por terminação de cadeia de didesoxirribonucleófcido (S^nger et al*, 1977) e electroforese num gradiente de tampão de géis a 6 %* Usou-se desoxi--7-desaza-GTP em vez de dGX*P quando se usou polimerase de • Klenow* Sm algumas experiências usou-se polimerase T4 modificada (Sequenase? Cambridge Bioscience). As sequências foram • reunidas usando os programas DBUTIL e D3AUS0 e analisadas por ! ANALYSEO, DIAGOK OU GAP. - 18 - *

Traduc5o in vitro. Traduziu-se ARN a 0# 1 mg/ml num extracto de germen de trigo# Os polipeptídeos foram marcados cora /“35 SJT-metionina e analisados por elee-troforese em géis de poliaerilamida a 10% e fluorografia* As proteínas marcadas foram beta-galactosidase (Mr 116 k), alfa--fosforilase {97,4 k>, alumina de soro de bovino <66 k), ovalbumina (45 k) e anidrase carbónica (29 k) (sigma)·

Fez-se um depósito da cultura bacteriana de E, coli com a sequência de ADN na National Collection of Industrial and Marine Bactéria Ltd (NCIMB), 2orry Research Station, 135 Abbey Road, Aberdeen, Scotland a 2 de Novembro de 1988; foi-lhe atribuido o numero de depósito NCIB 40083*

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Claims (1)

1. ΑΑϊ'ΑDA 2, EáEHISOIJ B D ci R0B3R2S I Μ (1984). Variation among British. isolates of potato leafroll virus. Annals of Applied Biology 104* 107-116. 2ΑΓΕ.0Η J K, IBBH23ITS33K E & SOT«IS J (1976). Bfficient transcription of EIA into MA by avian sarcoma viras polymerases. Biocliimica et Mophysica Acta 442, 924-930, TO;,BIS H* STABHLII 2 & G0PJ3QI J (1979). Dlectrophoretie transfer of protelas from polyaorylamide gels to oitrocellulose sheets? procedure and some applications. Erooeedlngs of tlae lational Academy of Sciences, USA 76 4350-4354. Podem ser efectuados melhoramentos e modificaçSes sem se afastar do âmbito da presente invenção. EBIYIHBIOÁU ÕBS - lê - Processo para a preparação de uma sequência de ADI duplex que ê capas de Mbridar com uma porção do ARI gendmieo de pelo menos um isolado de PERV (vfrus do enrolamento da batateira), caracterisado por compreender as fases dej (a) isolar ARI a partir de partículas de PLRV purificado; (b) sintetizar cdpias de ADI de uma porção do ARI levando o ARI ao contacto com uma transcriptase inversa na presença de um iniciador sob condiçães de tempo e de temperatura suficientes para a produção de ADI complementar )ADfc); e - 21 -

   Μ sintetizar ADI? duplex levando híbridos de ADHc-APJT ao contacto com ribonuolease H e com uma polimerase ADIT-c--AM sob condigoes de tempo e de temperatura suficientes para a produção de ADI duplex. - 2â Processo de acordo com a reivindicação 1» caracterizado por a sequência de ADI? obtida ser capaz de transcrição para produzir AM que codifica para a proteína do invólucro do PDRV. - 3£ - mbstanoialmente no seguinte? ÍQ 50 Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 ou 2,caracterizado por a sequência de ADI obtida i^gluir ou consistir ATAAATTCTTAGCGGGATTTGCTTTAGGATTCTCATCCGCAATCCCATTTTCAGTAGC 70 90 110 cggtttatattttgtttacctaaagatttcctcccacgtgcgatcaattgttaatgagtà 130 150 170 cggtcgtggttaaaggaaatgtcaatggtggtgtacaacãaccaagaatgogaagaaggc 190 210 230 aatcccttcgcaggcgcgotaacagagttcagccagtggttatggtcacggoocctgggc 250 270 290 aacccaggogccgaagacgcagaagaggaggcaatcgccgctcaagaagâactggagttò 310 330 359 cccgaggacgaggctcaagógagacattcgtgtttacaaãggacaacctcgtgggcaacã 370 390 410 cccaaggaagtttcaccttcgggccgagtctatcagactgtccggcattcaaggatggaâ 430 450 470 tactcaaggcctaccatgagtataagatcacaagcatcttacttcagttcgtcagogagg 490 510 530 cctcttccacctcctccggttccatggcttatgagttggãcccccattgcaaagtatcat 550 570 590 ox^í^gtcctaggtcaacaagttccaaâttacgaagggcggcgccaaâacttatcaag 610 630 650 cgcggatgataaacggggtãgaatggcacgattcttctgÂggatcagtgccggatactgt 670 , 690 710 GGAAGGGAAÁTGGAAAATCTTCAGATTCCGCAGGATCCTTCAGAGTCACCATCAAGGTAG 730 750 . 770 CTTTGCAAAÂCCCCAAATAGGTAGACTCCGGATCAGAGCCTAGTCCAAGCCCACAACCAÀ 790 810 830 CACCCACTCCAACTCCCCAGAAGCACGAGCGATTTATTGCTTACGTTGGCATACCTATGÒ 850 . 870 890 taaccattcãggccagggagaacgacgaccaaatcatattgggttccttágggagccaaâ 910 930 950 ggatgaaatatatagaggacgagaaccagaattatacaaagtttagttctgagtattact 970 990 CTCAATCGAGCATGCAAGCCGTCCCTATGTATTACTTCAATG 22

   910 930 950 GGATGAAATATATAGAGGACGAGAACCAGAATTATACAAAGTTTAGTTCTGAGTATTACT 970 990 CTCAATCGAGCATGCAAGCCGTCCCTATGTATTACTTCAATG 10 30 50 ATAAATTCTTAGCGGGATTTGCTTTAGGATTCTCATCCGCAATCCCATTTTCAGTAGC 70 90 110 CGGTTTATATTTTGTTTACCTAAAGATTTCCTCCCACGTGCGATCAATTGTTAATGAGTA 130 150 170 M S T CGGTCGTGGTTAAAGGAAATGTCAATGGTGGTGTACAACAACCAAGAATGOGAAGAAGGC VVVKGNVN GGV QQPRMRRRQ 190 210 230 AATCCCTTCGCAGGCGCGOTAACAGAGTTCAGCCAGTGGTTATGGTCACGGOOCCTGGGC SLRRRANRVQPVVMVTAPGQ 250 270 290 AACCCAGGCGCCGAAGACGCAGAAGAGGAGGCAATCGCCGCTCAAGAAGAACTGGAGTTC PRRRRRRRGGNRRSRRTGVP 310 330 350 CCCGAGGACGAGGCTCAAGOGAGACATTCGTGTTTACAAAGGACAACCTCGTGGGCAACA RGRGSSETFVFTKONLVGNT 370 390 410 CCCAAGGAAGTTTCACCTTCGGGCCGAGTCTATCAGACTGTCCGGCATTCAAGGATGGAA QGSFTFGPSLSOCPAFKDGI 430 450 470 TACTCAAGGCCTACCATGAGTATAAGATCACAAGCATCTTACTTCAGTTCGTCAGCGAGG LKAYHEYKIT SILLQFVSEA 490 510 530 CCTCTTCCACCTCCTCCGGTTCCATCGCTTATGAGTTGGACCCCCATTGCAAAGTATCAT SSTSSGSIAVELDPHCKVSS 550 570 590 CCCTCCAGTCCTACGTCAACAAGTTCCAAATTACGAAGGGCGGCGCCAAAACTTATCAAG LQSYVNKFQITKGGAKTYQA 610 630 650 CGCGGATGATAAACGGGGTAGAATGGCACGATTCTTCTGAGGATCAGTGCCGGATACTGT RMINGVEWHOSSEDQCRILVJ 670 690 710 GGAAGGGAAATGGAAAATCTTCAGATTCGGCAGGATCCTTCAGAGTCACCATCAAGGTAG KGNGKSSDSAGSFRVTIKVA 730 750 770 CTTTGCAAAACCCCAAATAGGTAGACTCCGGATCAGAGCCTAGTCCAAGCCCACAACCAA - 23 l·

   L Q Μ P K 790 810 830 CACCCACTCCAACTCCCCAGAAGCACGAGCGATTTATTGCTTACGTTGGCATACCTATGC 850 870 890 taaccattcaggccagggagaacgacgaccaaatcatattgggttccttagggagccaaa 910 930 950 GGATGAAATATATAGAGGACGAGAACCAGAATTATACAAAGTTTAGTTCTGAGTATTACT 970 990 CTCAATCGAGCATGCAAGCCGTCCCTATGTATTACTTCAATG - 4â - Processo para a preparação de um plas-mídeo bacteriano earacterizado por se incorporar nua pias— mídeo bacteriano apropriado à sequência de APS preparada de acordo coa qualquer das reivindicações 2 ou 3· Processo para a preparação de um organismo hospedeiro transformado earacterizado por se transformar um organismo hospedeiro apropriado com o plasmídeo bacteriano obtido de acordo com o processo da reivindicação 4· - 6s - Processo de acordo com a reivindicação 5, earacterizado por o organismo hospedeiro ser Bscherichia coll PHSalfa. - 7^ - Processo para a pregaraçao de um vector de olonagem earacterizado por se incorporar nua vector apropriado à sequência de APS preparada de acordo com qualquer das reivindicaçães 1 a 3* - 24

   Processo para a preparação de uma sonda de AM para uso na detecção de PLRY caraeterizado por se incorporar usa sequência de AM complementar de uma porção do genoma de ARH de PLRY c capas de blbridação com ele* - 9a - Processo de detecção de PLilY em amostras que contém PI&V caraetsrisado por compreender as fases ues (a) proceder a translacção de encaixe ou a oligo-mar-oação de ADR plasaídico que contém a sequência de AM específica do P1EY na presença de trifosfato de desoxirribonucleésiâo marcado por radioactivi-dade ou doutro modo? (b) aplicar amostras de plantas suspeitas de infecçSo ou insectos suspeitos de virulência num suporte para ligar os componentes de ARI? (c) tratar 0 suporte com 0 AM marcado sob condioges tais que o ADH possa Iiibridar com sequências de ABE complementares ou substancialmente complementares? e (d; lavar o suporte sob condiçges tais que apenas é retido essenoialmente ADH marcado hibiidado e detec-tar este ADH ligado. 10 a - Processo para a preparação de ÂEI que é capaz de hibridação com uma porção do AEN gendmieo de 25 -

   para pelo senos um isolado de PIE?» earaoterisado por compreender as fases des (a) isolar a sequência de ADI específica de IAeT a partir do vector de clonagem plasmídico? (b) inserir a sequência de ADI! específica de PLSY num vector de transcrição? (c) copiar a sequência de A3ÍT para produzir ΛΒΗ niaroado para uso na deteeção de AEII de PIS? coao no aspecto da invenção definido acima? (d) aplicar amostras de plantas sujeitas de estarem infectadas ou de inseetos suspeitos de virulência nuíd suporte, por exemplo, uma película de nitroee-lulose ou outra membrana, para ligar os componentes de ΔΗΗ; (e) tratar o suporte com o AM marcado sob condiçãos tais que ο ΑΙ1Π possa hibridar com sequências de AM complementares ou substancialmente complementares? (f) lavar o suporte sob condiçães tais que esseneial-tnente somente ΑΕΠ marcado hlbridado é retido e ãe-teotar este AM ligado. — 11E Processo para a preparação de proteína de invólucro de PLEV caracterizado por compreender uma fase de cultura de uma célula hospedeira sob oondiçães que promovem a síntese de proteína de invólucro de PLIíY, sendo a referida célula hospedeira para além disso caracte-rizada por ser transformada por um vector de expressão que - 26 - £ % compreende a sequência de ADI obtida de acordo com qualquer das reivindieaçSes 1 ou 2 numa orientação com uma sequência de promotor tal que no hospedeiro a referida sequência de ADI ê expressa para produzir proteína de invólucro de HiHV. A requerente reivindica a prioridade do pedido britânico apresentado era 19 de novembro de 1988» sob o ns. 8827094.7. iíisooa» 20 de iíoverabro de 1989 .11.

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