PT93764B - Processo para a preparacao de moleculas comportando pelo menos uma sequencia peptidica portadora de um, ou varios, epitopo(s) caracteristico(s) de uma proteina produzida por "p.falciparum" ao nivel do estadio esporozoito e nos hepatocitos - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

DA

PATENTE DE INVENÇÃO

N.° 93 764

REQUERENTE: INSTITUT PASTEUR, francês, com sede em 25-28, rue du Dr. Roux, 75724 Paris Cedex 15, França.

EPÍGRAFE: PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE MOLÉCULAS

COMPORTANDO PELO MENOS UMA SEQUENCIA PE PTlDICA PORTADORA DE UM, OU VÁRIOS EPITOPO(S) CARACTERlSTICO(S) DE UMA PROTEl NA PRODUZIDA POR P.FALCIPARUM AO Nl VEL DO ESTÁDIO ESPOROZOITO E NOS HEPATO CITOS

INVENTORES: Pierre Druilhe e Claudine Guerin-Marchand.

Reivindicação do direito de prioridade ao abrigo do artigo 4.° da Convenção de Paris de 20 de Março de 1883.

França, em 12 de Abril de 1989, sob o n^e . 89 04847.

INPl MOO 113 R F 15732

INSTITUT PASTEUR

PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE MOLÉCULAS COMPORTANDO PELO MENOS UMA SEQUÊNCIA PEPTIDICA PORTADORA DE UM, OU VÃRIOS EPITOPO(S) CARACTERÍSTICO(S) DE UMA PROTEÍNA PRODUZIDA POR P. FALCIPARUM AO NÍVEL DO ESTÁDIO ESPOROZOITO E NOS HEPATOCITOS

Os parasitas responsáveis pelo paludismo no homem, particu larmente Plasmodium falciparum e Plasmodium vivax para apenas citar os principais de entre eles, apresentam no hospedeiro humano morfologias diferentes e exprimem antigénios diferentes em função da sua localização no organismo do hospedeiro infectado. As diferenças morfológicas e antigénicas destes parasitas no decurso dos seus ciclos de vida no homem, permitem definir pelo menos quatro estádios de desenvolvimento distintos.

primeiro estádio de desenvolvimento do parasita no homem corresponde à forma esporozoito introduzida no sangue do hospedeiro, por picadas de insectos portadores do parasita. 0 segundo estádio corresponde ã passagem do parasita no fígado e ã infecção das células hepáticas em que os parasitas se desenvolvem para formar os esquizontes hepáticos que quando maduros (62 dia depois da penetração dos esporozoitos) libertam por rebentamento os merozoítos hepáticos. 0 terceiro estádio caracteriza-se pela infecção dos eritro eitos sanguíneos pelas formas assexuadas (merozoitos) do parasita; este estádio eritrocitário de desenvolvimento do parasita corresponde à fase patogénica da doença. 0 quarto estádio cor responde ã formação das formas com potencial sexuado (ou gametócitos) que se transformarão em formas sexuadas ou gametas extracelulares no mosquito.

Sabe-se que foram empreendidos numeros estudos para isolar a partir das estirpes de parasitas infectantes para um hospedeiro humano fracções polipeptídicas, por um lado para assegurar o diagnóstico in vitro do paludismo mediante detecção dos anticorpos correspondentes e, por outro lado, para tentar a vacina contra o paludismo.

Por exemplo, bancos de CADNs clonados derivados dos esporo zoitos de Plasmodium falciparum foram estabelecidos por ENEA e colab. (1984) Science, vol. 225, 628-630. Ele reconheceu que estes bancos comportavam clones susceptíveis de exprimir polipéptidos imunogénicos contendo unidades repetitivas de 4 aminoácidos específicos do antigénio circum-esporozoitário (de P. falei parum).

Contudo, poucos trabalhos foram efectuados sobre as formas hepáticas dos parasitas responsáveis pelo paludismo. A morfologia das formas hepáticas foi descrita pela primeira vez em 1948 a partir de biopsias de voluntários humanos infectados [Trans. Roy. Soc. Trop. Med. Hyg., 41, 785 (1948)]. Um antigénio especjL fico do estádio hepático de P. falciparum pôde ser descrito

no fígado de macacos da América do Sul insensíveis às formas san guíneas do parasita, mas em que as formas hepáticas se podem desenvolver [Am. J. Trop. Med. Hyg., 33 . (3), 336-341 (1984)].

A detecção da localização dos antigénios específicos do fígado foi realizada minuciosamente mediante imunofluorescência ao longo das etapas de maturação do esquizonte. Estão localizados na periferia do parasita de tamanho compreendido entre 5 e 40 micras; por consequência, estão distribuídos entre os citómeros ou pacotes de merozoitos, quando os esquizontes atingem entre 50 e 100 micras. Distinguem-se dos antigénios de superfície dos espo rozoitos e dos antigénios repartidos pelos esquizontes do sangue e do fígado que dão uma imagem de imunofluorescência interna do parasita.

Ainda que doravante seja possível cultivar formas hepáticas de P. falciparum nos hepatócitos humanos [Science, 227, 440 (1985)], a fraca taxa de esporozoitos que se transformam em ) formas maduras do parasita pelos métodos de cultura in vitro e in vivo não permite a análise bioquímica dos antigénios produzidos no estádio hepático.

Observou-se igualmente que os indivíduos atingidos pelo paludismo possuem uma taxa muito elevada de anticorpos dirigidos contra os antigénios hepáticos. Estes antigénios hepáticos parecem ser imunogénios muito potentes, entre os mais potentes de todos os antigénios sintetizados nos diferentes estádios de desen volvimento do parasita. Pelo contrário, a taxa de anticorpos diri. gidos contra as formas dos estádios sanguíneos do parasita é ι

-4por vezes muito baixa e, por este motivo, o diagnóstico realizado a partir de antigénios específicos dos estádios sanguíneos pode por vezes ser falsamente negativo.

Um dos objectivos da presente invenção é precisamente permitir o diagnóstico in vitro da infecção de um indivíduo por P. falciparum nas condições mais sensíveis que não o permitem os métodos actuais.

A presente invenção tem igualmente por objectivo novas com posições para a vacinação no homem contra o paludismo provocado por P. falciparum.

A presente invenção diz mais particularmente respeito a mo léculas, polipeptidos ou composições peptídicas ou polipeptídicas, caracterizadas pelo facto de apresentarem na sua estrutura uma ou vãrias sequências peptídicas portadoras de um ou vários epitopos característicos das proteínas presentes quer na superfí cie dos esporozoitos, quer resultante da actividade infecciosa do P, falciparum nas células hepáticas.

Uma molécula expressa especificamente durante a fase hepática foi identificada mediante separação com soros policlonais de um banco de ADN genómico clonado em um vector de expressão [GUERIN-MARCHAND, C. e colab; Nature, 329, 164-167, (1987)]. Esta molécula LSA (Liver Stage Antigen) é constituída por motivos repetitivos de 17 aminoãcidos e parece muito imunogénica nas condições naturais de exposição à doença.

A molécula polipeptídica objecto da presente invenção difere pela ausência de repetições na sequência reconhecida pelos anticorpos e pela sua expressão tanto ao nível do estádio esporozoito como do estádio hepático.

Far-se-á, na descrição que se segue, referência aos desenhos em que:

- a figura 1 fornece a sequência nucleotídica que codifica para o polipeptido de 87 aminoácidos caracteristica das formas espo rozoitos e das formas hepáticas de P. falciparum.

- a figura 2 fornece a sequência nucleotídica da figura 1 assim como a sequência complementar desta última, e um mapa de restrição desta sequência de ADN;

- a figura 3 representa as sequências nucleotídicas I e II resul. tantes da sequência de nucleotidos da figura 1 e utilizáveis como pares de iniciação do ADN ou como sondas;

- a figura 4 representa a revelação em imunotransferência, a par tir de um extracto de esporozoitos (estirpe NF54), da proteína parasitária comportando a sequência polipeptídica de acordo com a presente invenção (4ê coluna; polipeptido de 70 KD designado por DG671 ou SALSA), em relação a diversas testemunhas: soro total (SHI2 e SHI5), anticorpos monoclonais dirigidos contra o tetrape ptido repetitivo da circumesporozoito-proteína (Mab), anticorpos

-6anti-LSA (DG307°);

- a figura 5 representa a localização da proteína SALSA na super fície do esporozoito: marcação, em microscopia electrónica de cortes de esporozoitos (estirpe NF54), pelos anticorpos anti-SAL SA (DG671) revelada por um segundo anticorpo marcado com ouro co loidal. Testemunhas: soro total (SHI2) e anticorpos anti-LSA (controlo).

Um polipeptido de acordo com a presente invenção caracteriza-se essencialmente pelo facto de comportar pelo menos uma sequência peptídica portadora de um, ou vários, epitopo(s) característico ( s ) de uma proteína produzida no estádio esporozoito e nos hepatócitos infectados por P. falciparum, esta sequência compreende uma sucessão de cerca de 10 aminoácidos no número máximo de aminoácidos do seguinte encadeamento peptídico:

Glu-Phe-Arg-Val-Ser-Thr-Ser-Asp-Thr-Pro-Gly-Gly-Asn1 13

Glu-Ser-Ser-Ser-Ala-Phe-Pro-Gln-Phe-Ile-Trp-Ser-Ala14 26

Glu-Lys-Lys-Asp-Glu-Lys-Glu-Ala-Ser-Glu-Gln-Gly-Glu27 39

Glu-Ser-His-Lys-Lys-Glu-Asn-Ser-Gln-Glu-Ser-Ala-Asn40 52

Gly-Lys-Asp-Asp-Val-Lys-Glu-Glu-Lys-Lys-Thr-Asn-Glu

65

Lys-Lys-Asp-Asp-Gly-Lys-Thr-Asp-Lys-Val-Gln-Glu-Lys 66 78

-Ί

f ( »

Val-Leu-Glu-Lys-Ser-Pro-Lys-Glu-Phe. 79 87 e na qual Leu representa a leucina, Ser representa a serina, Lys representa a lisina, Glu representa o ácido glutânico, Gin representa a glutamina, Asp representa o ácido aspártico, Phe representa a fenilalanina, Vai representa a valina, Thr' representa a treonina, Pro representa a prolina, Gly representa a glicina, Asn representa a asparagina, Ala representa a alanina, Ile representa a isoleucina,Trp representa o triptofano, His representa a histidina, Leu representa a leu cina e Arg representa a arginina.

A presente invenção diz em primeiro lugar respeito aos péptidos monoméricos comportando a sequência peptídica única de 87 aminoácidos correspondendo à fórmula indicada antes, e cujos ami noácidos terminais possuem extremidades respectivamente amina e carboxílico livres, ou oligómeros contendo particularmente múltiplos da sequência peptídica de 87 aminiãcidos referida antes.

A presente invenção diz igualmente respeito ao próprio polipeptido de 87 aminoácidos, caracterizado pelo encadeamento de aminoácidos referido antes.

Esta sequência peptídica de 87 aminoácidos possui a característica de ser reconhecida pelos anticorpos que reconhecem os estádios esporozoito e hepático de P. falciparum; esta sequência de 87 aminoácidos não é reconhecida pelos anticorpos que

reconhecem os estádios sanguíneos (eritrocitários) de P. falciparum.

A presente invenção tem igualmente por objecto qualquer sequência peptídica resultante da sequência de 87 aminoácidos re ferida antes, (por vezes designada adiante por sub-sequência peptídica) e constituída por uma sucessão de 5, e de preferência de 10 a 86 aminoácidos, compreendida no encadeamento peptídico de 87 aminoácidos referida antes. Estas sub-sequências peptídicas possuem características antigénicas análogas às descritas an tes para o polipeptido de 87 aminoácidos.

Um processo de selecção de uma sub-sequência peptídica de acordo com a presente invenção consiste em verificar que esta sub-sequência ê reconhecida pelos imunosoros humanos provenientes de indivíduos infectados por P. falciparum.

Como exemplo de sub-sequências peptídicas de acordo com a presente invenção, pode-se citar particularmente os polipeptidos delimitados respectivamente pelos aminoácidos situados nas posições 1 a 5, 20 a 50, 52 a 65 e 72 a 80 do encadeamento peptídico referido antes.

Duas sub-sequências peptídicas particularmente interessantes, designadas, a seguir, por SALSA 1 e SALSA 2, são representa das pelos seguintes encadeamentos de aminoãcidos :

- SALSA 1 :

Ser-Ala-Glu-Lys-Lys-Asp-Glu-Lys-Glu-Ala-Ser-Glu-GlnGly-Glu-Glu-Ser-His-Lys-Lys-Glu-Asn-Ser-Gln-Glu-SerAla, ou ainda representada da seguinte maneira

SAEKKDEKEASEQGEESHKKENSQESA

- SALSA 2 :

Asn-Gly-Lys-Asp-Asp-Val-Lys-Glu-Glu-Lys-Lys-Thr-AsnGlu-Lys-Lys-Asp-Asp-Gly-Lys-Thr-Asp-Lys-Val-Gln-GluLys-Val-Leu-Glu-Lys-Ser-Pro-Lys-Glu-Phe, ou ainda representada da maneira seguinte :

NGKDDVKEEKKTNEKKDDGKTDKVQEKVLEKSPKEF

De um modo geral, a presente invenção diz respeito a qualquer polipeptido comportando 10 a 87 aminoácidos descritos antes e codificado pelo ácido nucleico representado na figura 1.

É evidente que as funções reactivas livres que são susceptíveis de possuir alguns aminoácidos que entram na constituição dos polipeptidos de acordo com a presente invenção, particular-10mente os grupos carboxilo livres transportados pelos grupos Glu ou pelo aminoácido C-terminal, por um lado, e/ou os grupos livres transportados pelo aminoácido N-terminal ou pelos aminoácidos interiores na cadeia peptídica, por exemplo Lys, podem, por outro lado, ser modificados, desde que esta modificação não conduza a uma modificação das propriedades antigénicas, eventualmente, imunogénicas, do conjunto do polipeptido. As moléculas assim modificadas entram naturalmente no quadro da protecção dada â presente invenção pelas reivindicações. Estas funções car boxilo são eventualmente aciladas ou esterifiçadas.

Outras modificações entram igualmente no quadro da presente invenção. Em particular, as funções amina ou éster, ou as duas simultaneamente, dos aminoácidos terminais podem estar empe nhadas em ligações com outros aminoácidos. Por exemplo o ácido N-terminal pode estar ligado a uma sequência comportando um ou vários aminoácidos correspondendo a uma parte da região C-terminal de um outro péptido de acordo com a definição dada antes, ou vice-versa.

Ê evidente que igualmente qualquer sequência peptídica resultante da modificação, mediante substituição e/ou mediante adição e/ou supressão de um ou vários aminoácidos, da sequência peptídica de 87 aminoácidos, ou de uma sub-sequência peptídica de acordo com a presente invenção, entra, igualmente, no quadro da protecção dada à presente invenção pelas reivindicações, desde que esta modificação não altere as propriedades antigénicas ou imunogénicas do referido polipeptido particularmente quando

estas propriedades imunogénicas foram reforçadas de modo adequado, por exemplo mediante associação do polipeptido com um adjuvante imunológico apropriado (por exemplo um muramilpeptido ou mediante acoplamento com uma molécula portadora de peso molecular mais elevado (por exemplo uma soro-albumina ou uma poli-lisi na) ou uma toxina do tipo tetânico ou um outro antigénio de P. falciparum.

A presente invenção diz mais particularmente respeito a qualquer polipeptido caracterizado pela presença na sua estrutura de uma ou várias sequências peptídicas apresentando reacções imunológicas cruzadas com toda ou parte da sequência peptídica correspondente à fórmula anterior, ou sub-sequência peptídica de acordo com a presente invenção, em relação aos anticorpos inductíveis por esta última in vivo.

A presente invenção diz igualmente respeito a qualquer sequência de nucleótidos que codifique para um polipeptido de acordo com a presente invenção.

A presente invenção tem mais particularmente por objectivo a sequência de nucleótidos, constituída por 261 nucleótidos, representados na figura 1, e que codificam para o polipeptido de 87 aminoácidos referida antes.

A presente invenção diz igualmente respeito às sequências nucleotídicas que codificam para as sub-sequências peptídicas de acordo com a presente invenção. Como exemplo, citam-se as sequên-12cias nucleotídicas delimitadas respectivamente pelos nucleótidos situados nas posições 1 a 45, 60 a 150, 156 a 195 e 216 a 240 da figura 1.

A presente invençaõ diz igualmente respeito a qualquer sequência de nucleótidos que codifique para um polipeptido igual, ou análogo, tanto do ponto de vista da estrutura como das características antigénicas, aos de acordo com a presente invenção, sendo esta sequência capaz de se hibridar com a sequência núcleo tídica da figura 1, ou a sequência complementar desta última, nas seguintes condições :

- prê-tratamento (prê-hibridação) do filtro de nitrocelulose que suporta o fragmento de ácido nucleico a ensaiar com o tampão de hibridação (constituído por 6 x SSC, 2,5% de leite, 0,5% de SDS) , sendo esta operação efectuada a 65°C durante 1 hora·,

- substituição do tampão de hibridação em contacto com o suporte, sobre o qual o fragmento de ácido nucleico é então fixado, por tampão de hibridação com a mesma composição (comportando além disso o ADN de salmão desnaturado), e adição da sequência da figura 1, como sonda, particularmente marcada radioactivamente e previamente desnaturada mediante tratamento a 100°C durante minutos.

- incubação do referido fragmento de ácido nucleico fixado sobre o suporte neste tampão de incubação com a sequência da figura 1 a 65°C durante um tempo compreendido entre 16 e 24 horas;

- eliminação do tampão contendo a sonda não fixada, mediante 3 lavagens sucessivas de 5 minutos cada uma com 2 x SSC, O,1Z SDS a 65°C, seguidas de 3 lavagens sucessivas de 5 minutos, cada uma, com 0,1 x SSC, 0,1Z SDS a 65°C.

Recorde-se que 1 x SSC é constituído por 0,15 M de cloreto de sódio e 0,01 M de citrato de sódio, pH 7; o SDS é o dodecil-sulfato de sódio.

A presente invenção tem igualmente por objecto qualquer ácido nucleico recombinante contendo pelo menos uma sequência de nucleótidos de acordo com a presente invenção, inserida em um ácido nucleico heterólogo em relação à dita sequência de nucleotidos.

A presente invenção diz mais particularmente respeito a um ácido nucleico recombinante tal como definido antes, em que a se quência de nucleótidos de acordo com a presente invenção é prece dida de um promotor (particularmente um promotor indutível) sob o controlo do qual a transcrição da dita sequência ê susceptível de ser efectuada e, eventualmente, seguida de uma sequência que codifica para sinais de terminação da transcrição.

A presente invenção diz respeito a qualquer vector recombi nante, utilizado em particular para a clonagem de uma sequência nucleotídica de acordo com a presente invenção, e/ou a expressão do polipeptido codificado por esta sequência, e caracterizado pelo facto de conter um ácido nucleico recombinante, tal como

definido antes, em um dos seus sítios não essencial para a sua replicação.

Como exemplo de vector referido antes, citam-se os plasmídeos, os cosmídeos e os fagos.

A este título, a presente invenção diz mais particularmente respeito ao plasmídeo DG 671 depositado na C.N.C.M. sob o número 1.855 em 3 de Abril de 1989.

A presente invenção tem igualmente por objecto um processo para a preparação de um polipéptido de acordo com a presente invenção, mediante transformação de um hospedeiro celular com um vector recombinante do tipo indicado antes, seguida de cultura do hospedeiro celular assim transformado, e da recuperação do po lipeptido no meio de cultura.

Assim, a presente invenção diz respeito a qualquer hospedeiro celular transformado por um vector recombinante tal como definido antes e comportando os elementos de regulação que permi. tem a expressão da sequência de nucleótidos que codifica para um polipéptido de acordo com a presente invenção.

A presente invenção tem mais particularmente por objecto pares de iniciação de ADN (ou de ARN) utilizáveis no quadro da síntese de sequências nucleotídicas e/ou polipeptídicas de acordo com a presente invenção, pela técnica do PCR (Polymerase Chain Reactión”) tal como descrita nas patentes de invenção

-15norte-americanas Νθ . 4 683 202 e Νθ. 4 683 195 e no pedido de pa tente de invenção europeia Νθ. 200-362 (PCR=amplificação em cadeia do ADN).

A presente invenção diz respeito a qualquer par de iniciação de ADN ou de ARN, caracterizado pelo facto de ser constituído por cerca de 10 a 25 nucleótidos, iguais aos 10 a 25 primeiros nucleótidos da sequência de nucleótidos que codifica para uma sequência peptidica de acordo com a presente invenção ou iguais aos 10 a 25 últimos nucleótidos da referida sequência.

A presente invenção diz igualmente respeito a qualquer par de iniciação de ADN ou de ARN, caracterizado pelo facto de ser constituído por cerca de 10 a 25 nucleótidos complementares dos 10 a 25 primeiros nucleótidos da sequência nucleotídica que codi. fica para uma sequência peptidica de acordo com a presente inven ção ou complementar dos 10 a 25 últimos nucleótidos da referida sequência de nucleótidos.

A presente invenção tem igualmente por objectivo qualquer par de iniciação de ADN ou de ARN, caracterizado pelo facto de ser constituido por cerca de 10 a 25 nucleótidos capazes de se hibridar com os 10 a 25 primeiros nucleótidos ou com os 10 a 25 últimos nucleótidos da referida sequência de nucleótidos que codificam para um polipeptido de acordo com a presente invenção, nas condições de hibridação definidas antes.

/

-16Assim, a presente invenção diz mais particularmente respei. to a um processo para a preparação de um polipeptido de acordo com a presente invenção comportando as seguintes etapas :

- eventualmente, amplificação prévia de acordo com a técnica PCR da quantidade de sequências de nucleótidos que codificam para o referido polipeptido com dois pares de iniciação de ADN esco lhidos de maneira a que um destes pares de iniciação seja igual aos 10 a 25 primeiros nucleótidos da sequência nucleotídica que codifica para o referido polipeptido, enquanto o par de iniciação é complementar dos 10 a 25 últimos nucleótidos (ou hibrida-se com estes 10 a 25 últimos nucleótidos) da referida sequência nucleotídica, ou inversamente de maneira que um destes pares de iniciação seja igual aos 10 a 25 últimos nucleoti. dos da referida sequência, enquanto o outro par de iniciação é complementar dos 10 a 25 primeiros nucleótidos (ou hibrida-se com os 10 a 25 primeiros nucleótidos) da referida sequência nucleotídica seguida da introdução das referidas sequências de nucleótidos assim amplificadas em um vector apropriado,

- cultura, em um meio de cultura apropriado, de um hospedeiro celular previamente transformado por um vector apropriado contendo um ácido nucleico de acordo com a presente invenção comportando a sequência nucleotídica que codifica para o referido polipeptido, e

- a recuperação, a partir do referido meio de cultura do polipeptido produzido pelo referido hospedeiro celular transformado.

-17/

Como exemplo de pares de iniciação de ADN ou de ARN de acordo com a presente invenção, citam-se as sequências de fórmulas I e II representadas na figura 3.

Os péptidos de acordo com a presente invenção podem prepa rar-se de acordo com técnicas clássicas, no domínio da síntese dos péptidos. Esta síntese pode realizar-se em solução homogénea ou em fase sólida.

Por exemplo, recorrer-se-á à técnica de síntese em solução homogénea descrita por HOUBENWEYL na obra intitulada Methode der Organishen Chemie (Método da Química Orgânica) editado por E. Wunsch, vol. 15-1 e II, THIEME, Stuttgart 1974.

Este método de síntese consiste em se condensar sucessiva mente dois-a-dois os aminoacilos sucessivos na ordem pretendida, ou em se condensar aminoacilos e fragmentos previamente formados e contendo já vários aminoacilos na ordem apropriada, ou ainda vários fragmentos previamente assim preparados, enten dendo-se que se terá o cuidado de proteger previamente todas as funções reactivas transportadas por estes aminoacilos ou fragmentos, com excepção das funções amina de um ecarboxilo de outro ou vice-versa, que devem normalmente intervir na formação das ligações peptídicas, particularmente após activação da função carboxilo, de acordo com métodos bem conhecidos na síntese dos péptidos. Como variante, poder-se-á recorrer a reacções de acoplamento onde intervêm reagentes de acoplamento clássico, do tipo carbodiimida, tais como por exemplo 1-etil-18-

-3-(3-dimetil-aminopropil)-carbodiimida.

Quando o aminoacilo utilizado possui uma função ácido suplementar (particularmente no caso do ácido glutâmico), estas funções serão protegidas, por exemplo com grupos butil terc.-éster.

No caso da síntese progressiva, aminoácido por aminoácido, a síntese inicia-se de preferência pela condensação do aminoácido C-terminal com o aminoácido que corresponde ao aminoacilo vizinho na sequência pretendida e assim sucessivamente, de vizinho em vizinho, até ao aminoácido N-terminal. De acordo com uma outra técnica preferida da presente invenção, recorrer-se-á à descrita por R.D. MERRIFIELD no artigo intitulado Solid phase peptide synthesis (J. Am. Soc., 45, 2149-2154).

Para produzir uma cadeia peptidica de acordo com o processo descrito por MERRIFIELD, recorre-se a uma resina polimérica muito porosa, sobre a qual se fixa o primeiro aminoácido C-termi nal da cadeia. Este aminoácido é fixado sobre a resina por inter médio do seu grupo carboxílico e a sua função amina é protegida, por exemplo pelo grupo t-butoxicarbonilo.

Logo que o primeiro aminoácido C-terminal se fixa sobre a resina, retira-se o grupo protector da função amina lavando a re sina com um ácido.

No caso em que o grupo protector da função amina é o grupo t-butoxicarbonilo, pode-se eliminar mediante tratamento da resina com ácido trifluoroacético.

Liga-se, em seguida, o segundo aminoãcido que fornece o se gundo aminoacilo da sequência pretendida, a partir do resíduo aminoacilo C-terminal sobre a função amina desprotegida do primeiro aminoãcido C-terminal fixado sobre a cadeia. De preferência, activa-se a função carboxilo deste segundo aminoãcido, por exemplo com diciclohexilcarbodiimida, e protege-se a função ami na, por exemplo com butoxi terc.-earbonilo.

Obtém-se deste modo a primeira parte da cadeia peptídica pretendida, que comporta dois aminoãcidos, e cuja função amina terminal· está protegida. Como anteriormente, desprotege-se a fun ção amina e pode-se, em seguida, proceder à fixação do terceiro aminoacilo, em condições semelhantes às da adição do segundo ami. noácido C-terminal.

Fixa-se assim, uns após outros, os aminoãcidos que vão constituir a cadeia peptídica sobre o grupo amina desprotegido cada vez previamente da porção da cadeia peptídica já formada e que está ligada à resina.

Logo que se forma a totalidade da cadeia peptídica pretendida, eliminam-se os grupos protectores dos diferentes aminoácidos que constituem a cadeia peptídica e desliga-se o péptido da resina por exemplo com ãcido fluorídrico.

/ .

A presente invenção diz igualmente respeito aos oligómeros hidrossolúveis dos péptidos monoméricos referidos antes.

A oligomerização pode provocar um crescimento da imunogeni. cidade dos péptidos monoméricos de acordo com a presente invenção. Sem que uma tal indicação enumerada possa ser considerada como limitativa, mencionar-se-á, contudo, que estes oligómeros podem, por exemplo, conter entre 2 a 10 unidades monoméricas.

Pode-se recorrer, para realizar a oligomerização, a qualquer técnica de polimerização correntemente utilizada no domínio dos péptidos, sendo esta polimerização conduzida até à obtenção de um oligómero ou polímero contendo o número de motivos monoméricos pretendido para a aquisição da imunogenecidade pretendida.

Um método de oligomerização ou de polimerização do monómero consiste na reacção deste último com um agente de reticulação tal como o glutaraldeído.

Pode-se igualmente recorrer a outros métodos de oligomerização ou de acoplamento, por exemplo o que utiliza ligações sucessivas de unidades monoméricas, por intermédio das suas funções terminais carboxilo e amina na presença de agentes de acoplamento homo- ou hetero-bifuncionais.

A presente invenção diz ainda respeito aos conjugados obti dos mediante ligação covalente dos péptidos de acordo com a presente invenção (ou dos referidos oligómeros) a moléculas transf ex-

portadoras (naturais ou sintéticas), fisiológicamente aceitáveis e não tóxicas, por intermédio de grupos reagentes complementares respectivamente transportados pela molécula transportadora e o pêptido. Exemplos de grupos apropriados são ilustrados a seguir.

Como exemplo de moléculas transportadoras ou suportes macromoleculares que entram na constituição dos conjugados de acor do com a presente invenção, mencionam-se proteínas naturais, tais como a anatoxina tetânica, a ovalbumina, soro-albuminas, hemociaminas, o PPD da tuberculina (Purified Protein Derivative = PPD) etc. .

Como suportes macromuleculares sintéticos, mencionam-se, por exemplo, polilisinas ou poli (D-L-alanina)-poli-(L-lisina).

A literatura menciona outros tipos de suportes macromolecu lares susceptíveis de ser utilizados, os quais apresentam em geral um peso molecular superior a 20.000.

Para sintetizar os conjugados de acordo com a presente invenção, pode-se recorrer a processos conhecidos, tais como o dej5 crito por FRANTZ e ROBERTSON em Infect. and Immunity, 33, 193-198 (1981), ou o descrito em Applied and Environmental Microbiology, (Outubro de 1981), vol. 42, ηθ 4, 611-614 por P.E. KAUFFMAN utilizando o pêptido e a molécula transportadora apropriada .

-22Na prática, utiliza-se, com vantagem, como agente de ligação os seguintes compostos, citados a título não limitativo : aldeído glutãrico, cloroformato de etilo, carbodiimidas hidrossolúveis [N¹ -(3-dimetil-amino-propil)-carbodiimida, HC1], diisocianatos, bis-diazobenzidina, di- e tricloro-s-triazinas, brometos de cianogénio, assim como os agentes de ligação mencionados em Scand. J. Immunol., (1978), vol. 8, p. 7-23 (AVRAMEAS, TERNYNCK, GUESDON).

Pode-se recorrer a qualquer processo de ligação que faça intervir por um lado uma ou várias funções reactivas do pêptido e, por outro lado, uma ou várias funções reactivas de moléculas suportes. Trata-se, com vantagem, das funções carboxilo e amina, as quais podem dar lugar a uma reacção de acoplamento na presença de um agente de acoplamento do género dos utilizados na sínte se das proteínas, por exemplo a l-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida, o N-hidroxibenzotriazol, etc.. Pode-se ainda recor rer ao glutaraldeído, particularmente quando se trata de religar entre si grupos aminados respectivamente transportados pelo pêptido e a molécula de suporte.

Os ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção podem preparar-se quer mediante um processo químico, quer de acordo com outros processos.

Um modo apropriado para a preparação dos ácidos nucleicos comportando no máximo 200 nucleótidos (ou 200 pb, quando se trata de ácidos nucleicos bicatenários) a presente invenção compre-23-

ende as seguintes etapas

- síntese do ADN utilizando o método automatizado das y^-cianoetilfosforamidite descrito em Bioorganic Chemistry'4; 274-325 (1986),

- clonagem dos ácidos nucleicos assim obtidos em um vector apropriado e a recuperação do ácido nucleico mediante hibridação com uma sonda apropriada.

Um modo para a preparação, por via química, de ácidos nucleicos de comprimento superior a 200 nucleotidos (ou 200 pb, quando se trata de ácidos nucleicos bicatenários) a presente invenção compreende as seguintes etapas :

- ligação de oligonucleotidos sintetizados quimicamente, dotados nas suas extremidades de sítios de restrição diferentes, cujas sequências são compatíveis com o encadeamento de aminoácidos do polipeptido natural de acordo com o princípio descrito em Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 80; 7461-7465, (1983),

- clonagem dos ácidos nucleicos assim obtidos em um vector apropriado e recuperação do ácido nucleico pretendido mediante hibridação com uma sonda apropriada.

Os ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção podem preparar-se, igualmente, da seguinte maneira:

- incubação do ADN genómico, isolado a partir de uma estirpe de P. falciparum, com a ADNase I, seguida de adição de EDTA e purificação mediante extracção com a mistura fenol/clorofórmio/ /álcool isoamílico (25 : 24 : 1) e depois com éter,

- tratamento do ADN assim extraído com ECO RI metilase na presen ça de DTT e purificação mediante extracção tal como a descrita antes,

- incubação do ADN assim purificado com os 4 desoxinucleotidos trifosfatos dATP, dCTP, dGTP e dTTP na presença de T4 ADN poli_ merase e de ADN ligase de E. Coli, seguida de purificação de acordo com o método descrito antes,

- clonagem dos ácidos nucleicos assim obtidos em um vector apropriado e recuperação do ácido nucleico pretendido com uma sonda apropriada.

As sondas nucleotídicas utilizadas para a recuperação do ácido nucleico pretendido nos processos referidos antes , são constituídas geralmente por 40 a 200 nucleotidos da sequência nu cleotídica representada na figura 1, ou a sua sequência complementar, e são susceptíveis de se hibridar com o ácido nucleico pretendido nas condições de hibridação definidas antes. A síntese destas sondas efectua-se de acordo com o método automatizado das β -cianoetilfosforamidites descrito em Bioorganic Chemistry 4, 274-325 (1986).

5Além do facto de estarem presentes ao nível do esporozoito, os polipeptidos de acordo com a presente invenção possuem igualmente propriedades antigénicas características dos antigénios e£ pecíficos do estádio hepático do desenvolvimento de P. falciparum¹¹ .

Com efeito, como será mais particularmente descrito com exemplos de moléculas polipeptídicas de acordo com a presente in venção na descrição permenorizada que se segue, os polipeptidos de acordo com a presente invenção reagem especificamente com os anticorpos dirigidos contra os antigénios hepáticos produzidos por P. falciparum e igualmente com os anticorpos dirigidos con tra outros antigénios de esporozoito de P. falciparum, mas não com os anticorpos dirigidos contra antigénios produzidos em outros estádios ou por outras espécies de Plasmodium.

Estes polipeptidos de acordo com a presente invenção reconhecem, portanto, especificamente os anticorpos produzidos pelo sistema imunitário de um indivíduo infectado por P. falciparum sob o efeito dos antigénios do estádio hepático cujo o carácter fortemente imunogénico foi anteriormente mencionado.

Assim a possibilidade de produção em grande quantidade das moléculas de acordo com a presente invenção assim como as suas propriedades de reconhecimento específico dos anticorpos mais activamente produzidos quando da infecção de um indivíduo por P. falciparum, fazem das ditas moléculas reagentes de escolha para o diagnóstico in vitro do paludismo em um indivíduo infe-26-

ctado por P. falciparum.

A presente invenção diz por conseguinte respeito a um processo para a detecção in vitro de anticorpos correlativos ao paludismo resultante da infecção de um indivíduo por P. falciparum em um tecido ou fluído biológico susceptível de os conter, compreendendo este processo o contacto do tecido ou fluído bioló gico com uma molécula de acordo com a presente invenção nas condições que permitam uma reacção imunológica in vitro entre as referidas moléculas e os anticorpos eventualmente presentes no tecido ou fluído biológico e a detecção in vitro do complexo antigénio-anticorpo eventualmente formado.

De preferência, o meio biológico é constituído por um soro humano.

Qualquer processo clássico pode ser utilizado para realizar uma tal detecção.

A título de exemplo um método preferido utiliza processos imunoenzimáticos de acordo com a técnica ELISA, ou imunofluorescentes, ou radioimunológicos (RIA) ou equivalente.

Assim a presente invenção diz igualmente respeito a qualquer polipeptido de acordo com a presente invenção marcado com um marcador adequado do tipo enzimático, fluorescente, radioacti vo, etc..

c

Tais métodos compreendem por exemplo as seguintes etapas :

deposição de determinadas quantidades de uma composição polipej? tídica de acordo com a presente invenção nos poços de uma micro placa de titulação, introdução nos referidos poços de diluições crescentes do soro que se quer diagnosticar, incubação da microplaca, lavagens repetidas da microplaca, introdução nos poços da microplaca de anticorpos marcados contra imunoglobulinas do sangue, sendo a marcação destes anticor pos realizada com uma enzima seleccionada entre as que sao capazes de hidrolizar um substrato modificando a absorção das ra diações deste último, pelo menos a um determinado comprimento de onda, detecção, mediante comparação com uma testemunha de controlo, da quantidade de substrato hidrolisado.

A presente invenção diz igualmente respeito a caixinhas ou tojos, ou kits para o diagnóstico in vitro do paludismo procado por P. falciparum que compreende :

- uma composição polipeptídica de acordo com a presente invenção,

- reagentes para a constituição do meio propício ã realização da reacção imunológica,

- reagentes que permitam a detecção do complexo antigénios-anticorpos produzido pela reacção imunológica. Tais reagentes podem, igualmente, comportar um marcador, ou ser susceptíveis de ser reconhecidos na sua totalidade por um reagente marcado. Mais particularmente no caso em que a composição polipeptídica referida antes não estã marcada,

- um tecido ou fluído biológico de referência desprovido de anti. corpos reconhecidos pela composição polipeptídica referida antes .

A presente invenção diz respeito aos próprios anticorpos formados contra os polipeptidos de acordo com a presente invenção e obtidos mediante imunização de um animal com estes polipej) tidos seguida da recuperação dos anticorpos formados.

É evidente que esta produção não está limitada aos anticor pos policlonais.

Aplica-se ainda a qualquer anticorpo monoclonal produzido por qualquer hibridoma susceptível de ser formado, pelos métodos clássicos, a partir das células esplénicas de um animal, particu larmente do murganho ou do rato, imunizados contra um dos poli-

peptídos purificados de acordo com a presente invenção, por um lado, e células de uma linha de células de mieloma apropriada por outro lado e, de ser seleccionado, pela sua capacidade para produzir anticorpos monoclonais que reconhecem o polipeptido ini cialmente utilizado para a imunização dos animais.

Os anticorpos de acordo com a presente invenção podem reve lar-se particularmente úteis para a detecção dos esporozoitos nos mosquitos.

A presente invenção diz igualmente respeito a uma sonda nu cleotídica para a detecção caracterizada pelo facto, de ser cons tituída por toda ou parte de uma das sequências de nucleótidos tais como definidas antes de acordo com a presente invenção.

A presente invenção tem mais particularmente por objecto um método para o diagnóstico in vitro do paludismo em um indivíduo susceptível de estar infectado por P. falciparum que com preende as seguintes etapas :

- eventualmente amplificação prévia da quantidade de sequências de nucleótidos de acordo com a presente invenção, susceptíveis de estar contidos na amostra biológica colhida no referido indivíduo, com dois pares iniciadores do ADN escolhidos da maneira indicada antes,

- contacto da amostra biológica referida antes com uma sonda nucleotídica tal como definida antes, em condições que permitam a

produção de um complexo de hibridação formado entre a dita sonda e a referida sequência de nucleótidos,

- detecção do complexo de hibridação, referido antes, eventualmente formado.

Como exemplo de sondas nucleotidicas de acordo com a presente invenção, cita-se a sequência nucleotídica da figura 1, ou ainda as sequências de fórmulas I e II da figura 3.

A presente invenção abre finalmente o caminho para a prepa raçao de novos princípios vacinantes contra o paludismo resultan te da infecção de um indivíduo por P. falciparum.

A presente invenção diz igualmente respeito a composições preparadas sob a forma de vacinas contendo quer o pêptido de acordo com a presente invenção, quer um oligómero deste pêptido, quer ainda um conjugado deste pêptido ou oligómero com uma molécula transportadora, em associação com um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico e, eventualmente, com outros ingre dientes activos vacinantes contra o paludismo.

Composições farmacêuticas, com vantagem, são constituídas por soluções, suspensões ou lipossomas injectãveis contendo uma dose eficaz de pelo menos um composto de acordo com a presente invenção. Estas soluções, suspensões ou lipossomas realizam-se, de preferência,em uma fase aquosa esterilizada isotónica, de pre ferência salina ou glicosada.

-31A presente invenção diz mais particularmente respeito a tais suspensões, soluções ou forma de lipossoma aptas a ser admi. nistradas mediante injecções intradérmicas, intramusculares ou subcutâneas, ou ainda mediante escarificações.

Diz igualmente respeito a composições farmacêuticas administráveis por outras vias, particularmente por via oral ou rectal, ou ainda sob a forma de aerossois destinados a contactar com as mucosas, particularmente as mucosas oculares, nasais, pul monares ou vaginais.

Em consequência, diz igualmente respeito a composições far macêuticas em que um, pelo menos, dos compostos de acordo com a presente invenção se encontra associado a excipientes aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico, sólidos ou líquidos, adaptados â constituição de formas orais, oculares ou nasais, ou com excipientes adaptadas para a constituição de formas de administração rectal, ou ainda com excipientes gelatinosos para admini^ tração vaginal. Diz igualmente respeito a composições liquidas isotónicas contendo pelo menos um dos conjugados de acordo com a presente invenção, adaptadas ã administração sobre as mucosas, particularmente oculares e nasais.

As composições vacinantes de acordo com a presente invenção contêm além disso, com vantagem, um veículo tal como a polivinil-pirrolidona, para facilitar a administração da vacina. Em vez da polivinil-pirrolidona, pode-se utilizar qualquer outro tipo de adjuvante no sentido clássico que se dava antigamente a

esta expressão, quer dizer uma substância que permita a absorção mais fácil de um medicamento ou que facilite a sua acção no orga nismo. Como exemplo de outros adjuvantes deste último tipo, menciona-se ainda a carboximetil-celulose, os hidróxidos e os fosfa tos de alumínio ou quaisquer outros adjuvantes deste tipo, bem conhecidos dos entendidos na matéria. Contêm, finalmente, se necessário, um adjuvante imunológico, particularmente do tipo mura milpeptídico.

A presente invenção não se limita, evidentemente,aos modos de realização descritos antes como exemplos e os entendidos na matéria podem efectuar modificações sem que por isso se saia do quadro das reivindicações anexas ; particularmente certos aminoácidos que intervêm na sequência dos péptidos de acordo com a presente invenção podem ser substituídos por aminoácidos isofuncionais ou isostéricos; por exemplo, uma ou várias das substituições seguintes podem ser consideradas :

Glu é substituída por Asp ou Gin,

Leu é substituída por Ala, etc..

Entende-se, naturalmente, que os péptidos resultantes de tais substituições constituem equivalentes dos péptidos mais par ticularmente reivindicados, desde que os próprios ou os oligómeros ou conjugados formados a partir destes péptidos apresentem propriedades imunogénicas semelhantes.

mais particularmente ãs proteínas quiméricas que se podem obter mediante técnicas da engenharia genética, podendo estas proteínas quiméricas conter uma ou várias sequências peptídicas, comportando respectivamente os 87 aminoãcidos das sequências de acordo com a presente invenção e incorporadas ou religadas a um fragmento peptídico além da ^Z?-galactosidase. Este último fragmento peptídico tem de preferência um peso mulécular suficiente para reforçar a imunogenecidade das sequências peptídicas de acordo com a presente invenção e não interfere do ponto de vista imunológico com a manifestação da imunogenecidade pretendida.

Soros provenientes de indivíduos europeus vivendo em zonas endémicas e seguindo uma profilaxia contínua com medicamentos di. rigidos contra os esquizontes dos estádios sanguíneos foram selecci. onados e testados utilizando antigénios do estádio dos esporozoi. tos (antigénios CS), do estádio hepático (antigénio LSA) e dos estádios sanguíneos. A maior parte destes soros reagiu com os an ) tigénios de todos os estádios provavelmente devido ao facto de se ter interrompido a profilaxia. Três soros colhidos a partir de indivíduos que residiram na África tropical rural e ingeriram 100 mg de cloroquina por dia sem interrupção durante 23 a 26 anos, não reagem com os antigénios dos estádios sanguíneos de acordo com o ensaio de imunofluorescência (IFA) e o teste da imunotransferência sobre nitro-celulose. Estes três soros possuem, contudo, títulos elevados em anticorpos dirigidos contra os esporozoitos e as proteínas do estádio hepático (diluição IFA 1/3200 e 1/6400 respectivamente).

Um dos três soros anteriores, de especificidade reduzida, foi utilizado para crivar um banco de ADN genómico construído no bacteriófago X gt 11 da seguinte maneira :

1) CONSTRUÇÃO DO BANCO DE ADN GENÓMICO DE Plasmodium falciparum .

Isolou-se o ADN genómico do clone 96 da estirpe tailandesa Tak9 de P. falciparum [Science, 212, 1.37-1.38 (1981)] de acordo com técnicas clássicas.

Incubaram-se amostras de 18 g de ADN de P. falciparum a 15°C em um tampão 50 mM Tris HCl pH 7,5 , 1 mM MnC^, 20 ^x_g/ml de albumina de soro bovino, com quantidades respectivas de ADNase I (Boehringer Mannheim) de 5 pg durante 5 minutos ou então 3,5 pg durante 5 ou 10 minutos. Após a adição de 5 mM de EDTA (Ácido etilenodiaminotetraacético) reunem-se as amostras e purificam-se mediante extracção com a mistura fenol/clorofórmio/álco ol isoamílico (25 V : 24 V : 1 V) e depois com éter. Concentra-se o ADN mediante precipitação com etanol a -20°C na presença de 2,5 M de acetato de amónio.

Submetem-se 45 y^g do ADN assim tratado a uma metilação com 180 U de Eco Rl metilase (Biolabs) nas condições recomendadas pelo fornecedor, com adição suplementar de 5 mM de DTT (ditiotreitol), durante 15 minutos a 37°C. Após purificação do ADN como descrito antes, incubam-se 10 ytLg de ADN com 40 mM de Tris NC1 pH 8,0, 10 mM de sulfato de amónio, 10 mM de 2-mercaptoeta-35-

nol, 0,5 mM de EDTA, 0,05 mM de NAD (nicotinamida-adenina-dinucleotido), 0,1 mM de dXTP (comportando os 4 desoxinucleotidos trifosfatados dATP, dCTP, dGTP e dTTP), na presença de 10 U T4 ADN polimerase (PL Biochemicals) e 10 U de E. coli ADN ligase (Biolabs). Purifica-se e concentra-se o ADN de acordo com o processo descrito antes.

Ligam-se então 8 y66g de ADN com 0,4 ^/4g de um adaptador ou linker Eco RI (adaptadores fosforilados Eco RI comercializados por Biolabs) por 4 U T4 ADN ligase (Biotec) no tampão 50 mM Tris HC1 pH 8,0, 10 mM MgCl₂, 20 mM DTT, 1 mM ATP, 50 ^fg/ml de albumina de soro bovino.

Após incubação a 4°C durante 5 horas, adiciona-se 2 U T4

ADN ligase e continua-se a reacção a 4°C durante 16 horas. Submete-se o tubo a vários ciclos de congelação a -80°C/descongelação para interromper a reacção. Dilui-se em seguida o ADN e aju£ ta-se o tampão de incubação de modo a obter as condições recomen dadas pelo fornecedor para a utilização da enzima Eco RI. Adicio nam-selOO U da enzima Eco RI (Promega Biotec) e incubam-se duran te 3 horas a 37°C. Interrompe-se a reacção mediante um aquecimen to de 10 minutos a 60°C e purifica-se e concentra-se o ADN de acordo com o processo descrito antes.

Ressuspende-se o ADN em 100 jUÀ. de tampão 50 mM Tris HC1 pH 8,0, 1 mM EDTA e deposita-se sobre um gradiente 5-20X de saca rose preparado em 25 mM de acetato de sódio, 10 mM EDTA e centrifuga-se em um rotor Beckman SW 50.1 a 45000 rotações por minuto

durante 150 minutos. Analisam-se as fracçôes sobre gel de agarose e reúnem-se as que contêm os fragmentos de ADN de tamanhos compreendidos entre cerca de 300 pb. e 2500 pb. e dialisam-se contra o tampão 50 mM Tris HC1 pH 8,0, 1 mM EDTA a 4°C. Concentra-se o ADN mediante precipitação com etanol. Ligam-se, então, cerca de 400 ng deste ADN a 1 jjjg do ADN do vector gtil [Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 80, 1194-1198 (1983)] cortado pela Eco Rl e desfosforilado (Protoclone de Promega Biotec), em um volume de 10 ^zzâ, (em tampão 50 mM Tris HC1 pH 8,0, 10 mM MgC^, 20 mM DTT, 1 mM ATP, 50 ^ug/ml de albumina de soro bovino) por 1 U T4 ADN ligase (Biotec).

Os compostos da ligação foram colocados no envelope in vitro nos extractos de E. coli preparados a partir das estirpes bacterianas construídos por B. Hohn (Methods Enzymol. 68, 299), de acordo com a técnica descrita por Maniatis e colab. [Molecular cloning, a laboratory manual, p. 264, Cold Spring Harbor Laboratory (1982)].

Foram obtidos cerca de 7 milhões de bacteriófagos recombinantes .

2) CRIVAÇÃO IMUNOLÓGICA DO BANCO

Espalhou-se os bacteriófagos recombinantes sobre um meio de cultura contendo a bactéria indicadora Y 1090, com uma densidade de 50.000 plagas por caixa de Petri de 90 mm e incubou-se a 42°C durante 3 horas.

-37Deposita-se um filtro de nitrocelulose (Schleicher & Schuell, BA 85) saturado com 0,01 M IPTG isopropil-b-tiogalactopiranosido (Sigma) sobre as caixas e incuba-se a 37°C durante 3 horas. Uma vez terminadas estas incubações retiram-se os filtros de nitrocelulose e conservam-se as caixas de Petri a 4°C.

Colocam-se os filtros de nitrocelulose em um banho de tampão TL : 50 mM tris HC1 pH 8,0, 150 mM NaCl, 5% de leite desnata do, 0,05Z Tween 20 (Sigma). Incubam-se os filtros durante 15 horas á 4°C em tampão TL, depois 2 vezes durante 15 minutos a 20°C. Incubam-se então durante uma hora com uma porção pool de antisoros humanos imunos-dirigidos contra os antigénios de todos os estádios de desenvolvimento do P. falciparum, tratada previamente para o separar dos anticorpos anti-E. coli de acordo com técnica descrita por Ozaki e colab. (J. Immunol. Methods, 89, 213-219, 1986). A pool de antisoros humanos utiliza-se na dilu ição de 1/200, em tampao TL. A incubaçao faz-se durante 1 hora a 20°C. Lavam-se os filtros 4 vezes com o tampao TL e incubam-se, depois, com anticorpos anti-imunoglobulinas humanas conjugadas 125 com a peroxidase de raifort (Biosys) e iodadas com iodo I, du rante 1 hora a 20°C. Após várias lavagens com tampão TL, depois com tampão 50 mM Tris HC1 pH 8,0, 150 mM NaCl, revela-se a actividade enzimãtica da peroxidase (Ozaki e Colab., anteriormente citado), secam-se os filtros ao ar livre e auto-radiografam-se sobre película Kodak Royal X-OMat AR, com uma tela amplificadora.

Constituí-se uma colecção de cerca de 1200 clones de bacte riofagos recombinantes mediante colheita das plages de lise cor-

respondendo aos sinais positivos. Submetem-se em seguida estes clones a um segundo ciclo de crivação imunológica, utilizando desta vez um dos três soros humanos anteriormente descritos e sem ou com poucos anticorpos dirigidos contra as formas eritroci tárias de P. falciparum e com um título elevado contra as formas hepáticas do parasita. Esta crivação imunológica efectua-se de acordo com o protocolo descrito antes. Este soro reage somente com 15Z dos clones produtores de um antigénio específico de P. falciparum (120 em 1200 testados) e entre os clones mais activos, seleccionaram-se 60 eestudaram-se como se segue.

Purificam-se os anticorpos humanos que reagem com as determinantes antigénicas expressas pelos clones recombinantes, mediante afinidade sobre as proteínas recombinantes, de acordo com a técnica descrita por Ozaki e Colab. (anteriormente citada). Incu bam-se estes anticorpos específicos com preparações de parasitas em diferentes estádios de desenvolvimento (esporozoito, estádio hepático ou estádios eritrocitários), e estuda-se a reacção med^ ante imunofluorescência indirecta e imunotransferência. Estudou-se o clone reeombinante sobre o qual ficam retidos por afinidade os anticorpos específicos do estádio hepático e do estádio eí> porozoito e, por conseguinte, que exprimem determinantes próprias destes estádios : trata-se do clone DG 671. Estes anticorpos específicos deste clone reagem especificamente

a) por um lado com os esquizontes hepáticos, tais como os que se podem obter após infecção dos hepatócitos humanos ou de macacos por esporozoitos de P. falciparum; determinou-se a lo9calização da fluorescência como sendo igual à da considerada característica dos antigènios do estádio hepático;

b) por outro lado, com a superfície dos esporozoitos da e£ tirpe plasmodial NF54, mas não a do clone parasitário 3D7 e com a de 2 dos 8 isolados de origem tailandesa ensaiados. Esta reactividade com os antigènios de superfície demonstra-se no ensaio IFI utilizando esporozoitos ditos húmidos ou em suspensão, que estão ligados a uma lâmina de vidro por intermédio de uma película de Poli-L-lisina de acordo com a técnica IFI descrita por DRUILHE e Colab. [Infection and Immunity, (1986) 53, 393-397]. A localização do antigénio com o qual os anticorpos reagem na superfície dos esporozoitos foi, além disso, confirmada ao nível ultra-estrutural mediante revelação da fixação dos anticorpos por um segundo anticorpo anti-imuno-globulinas humanas ligado a grãos de ouro coloidal. Por outro lado, em um ensaio IFI utilizando esporozoitos secos e fixados pela acetona, estes anticorpos reagem igualmente bem com os esporozoitos da estirpe NF54, que provêm do clone parasitário 3D7. Finalmente, em um ensaio de imunotransferência (Immunoblotting) utilizando proteínas extra idas com SDS dos estádios esporozoitos, estes anticorpos revelam um polipeptido de peso molecular igual a 70 Kilodaltons na estir pe NF54, o clone parasitário 3D7 é uma das duas estirpes tailandesas positivas ensaiadas. Pelo contrário, não se revelou, nas mesmas condições, nenhum polipeptido nos extractos de esporozoitos de estirpes com as quais este ensaio IFI foi negativo. Sobressai destas considerações que o antigénio revelado por estes anticorpos pode estar presente de forma interna, quer dizer no

citoplasma do estádio esporozoito, mas não na superfície, quer simultaneamente de modo interno e na superfície, quer ausente.

Como consequência das características a) e b) referidas an tes, o antigènio codificado pela sequência nucleica do clone DG671 denomina-se SALSA (Sporozoite and Liver Stage Antigen).

A especificidade da espécie e do estádio do clone DG671 foi testada da seguinte maneira. Primeiramente, verificou-se que os mesmos anticorpos purificados por afinidade e que reagem medi^ ante IFA ( ou ainda que são IFA positivos) com os antigénios do estádio hepático e os esporozoitos, não reagem com os antigénios dos estádios sanguíneos, quer sejam ensaiados mediante IFA com parasitas fixados à acetona, quer mediante imunotransferência (immunoblotting) utilizando proteínas extraídas com SDS. Os anticorpos purificados mediante afinidade não reagem com os anti génios do estádio esporozoito de P. yoelii de P. berghei e de P, vivax nem com estes antigénios do estádio hepático de P. yolii, nem com os esquizontes hepáticos de P. vivax preparados a partir de macacos Saimiri sciurcus.

Em segundo lugar, as proteínas recombinantes de DG 671 não reagem com os soros provenientes de dois pacientes com malária (paludismo causado por P. falciparum) mediante transfusão acidental e que, por definição, não tem, por conseguinte, anticorpos contra os antigénios específicos dos estádios anteriores (e£ porozoitos e antigénios do estádio hepático). Estas proteínas não reagem com dois anticorpos monoclonais que reconhecem o tetrapeptido CS, com os soros de murganhos imunizados com os anti-41

génios CS recombinantes R^têt^ [YOUNG J.F. e colab., Science, 228, 957-958 (1986)], nem com soros de coelhos imunizados com as regiões I e II da proteína CS. Além disso, as proteínas recombinantes não reagem com antisoros humanos dirigidos contra P. vivax (ainda que os soros sejam positivos com os esquizontes hepá ticos de P. vivax), P. ovale e de P. cynomolgi [Ann. Soc. Belg. Med. Trop., 60 , 348 (1980)] quando ensaiados pela técnica de manchas de imunotransferência (immunodot blots), enquanto são positivos com todos os soros humanos anti-P. falciparum en saiados.

Purifica-se e reclona-se o inserato de 261 pares de bases de P. falciparum no interior do plasmideo pUC13 [Nucleic Acids Research, 9, 309-321 (1981)]. Determina-se então a sequência de ADN e a organizaçao genõmica do gene SALSA. A figura 1 mostra que o clone DG 671 contém um fragmento de ADN constituído comple tamente por um motivo de 261 pares de bases sem repetição.

Somente uma fase de leitura estã em fase com o gene lac Z da ^-galactosidase, uma característica esperada visto que o cl£ ne produz uma proteína de fusão que transporta os epitopos reconhecidos pelo soro humano. A sequência em aminoácidos correspondendo a este fragmento estã representada na figura 2. É constitu ida por uma cadeia de 87 aminoácidos rica em ácido glutâmico, . lisina e serina mas não contém nem metionina, nem cisteína. A análise informática desta sequência indica que ela tem uma grande probabilidade de possuir uma estrutura em hélice ao nível dos aminoácidos compreendidos entre as posições 10 a 50. Além disso, não se detectou nenhuma homologia entre as sequências de ADN de P. falciparum conhecidas até hoje e a sequência de ADN que codifica para a referida proteína, mediante análise dos bancos de dados Los Alamos e NBRF. Pelo contrário, existe entre a sequência de ADN que codifica para a referida proteína SALSA e a sequência de um ΑϋΝθ (ADN complementar) de origem hepática humana uma homologia de 60,2%. Esta homologia ao nível nucleotídico não se traduz por uma homologia real ao nível peptídico (com efeito, este grau de homologia é apenas de 20 a 30%). Isto está de acordo com a especificidade do estádio hepático e do estádio esporozoito da proteína SALSA.

Análises mediante transparência de acordo com o método de Southern utilizando o fragmento de 261 pares de bases clonado no pUC 13 indicam que este fragmento se híbrida com 2 fragmentos Eco RI. Está presente nas duas estirpes de P. falciparum examinadas até este momento, localizado no cromossoma ηθ 2. Esta localização permite concluir que o géne correspondente é diferente do da proteína CS dos esporozoitos e diferente da do antigénio LSA anteriormente descrito.

Os estudos de hibridação do ADN do clone DG 671 com o subconjunto de 120 clones de ADN descrito anteriormente e que codi ficam provavelmente para os antigénios do estádio pré-eritrocitário, revelaram que a estrutura do clone DG 671 é única neste sub-conjunto : o ADN de DG 671 apenas hibrida com ele próprio e não híbrida com o ADN dos outros 119 clones.

-43/ ·»

Como os epitopos repetitivos parecem ser uma característica frequente dos antigénios de P. falciparum [Nature, 306, 751-756 (1983); Nature, 311, 382-385 (1984) Science, 225, 593-599 (1984); Science, 227, 1595-1597 (1985) ; Cell, 40, 775-783 (1985)], é importante sublinhar que o polipeptido SALSA, ainda que seja altamente imunogénio no homem não possui estrutura repetitiva.

A grande prevalência de anticorpos contra o antigénio SALSA é uma das suas características importantes. A presença de anticorpos nos indivíduos expostos ao paludismo e provenientes de 3 regiões de África diferentes pelo nível de transmissão da ma lária, foi estudada mediante imunotransferência sobre nitro-celu lose das proteínas recombinantes produzidas nos colibacilos após separaçao mediante electroforese. Observou-se uma prevalência que varia entre 90 e 955S dos indivíduos estudados de acordo com a zona. Estes resultados são particularmente significativos se se compararem com os resultados obtidos com outros antigénios de ''P. falciparum.

Assim, na zona de menor transmissão, (o menor número de pi cadas infecciosas) a prevalência de anticorpos contra a proteína CS (determinada mediante ELISA com o péptido R^têtál) é apenas de 27^ contra os 65Z para os antigénios dos estádios sanguíneos (determinada mediante IFI sobre esfregaços de glóbulos vermelhos parasitados), ou contra 75% para o antigénio LSA (determinado me diante imunotransferência), ou contra 81Z para o LSA sintético (determinado mediante ELISA com o péptido sintético de 41 aminoác eidos contendo 2,5 repetições de 17 aminoácidos), ou contra 97% para o SALSA (em imunotransferência). 0 quadro I, a seguir, representa a comparação dos resultados obtidos em uma experiência do mesmo tipo, mediante imunotransferência com o antigênio DG 671 SALSA e o antigênio LSA (WB SALSA, WB LSA), em relação aos obtidos mediante ELISA com o tetrapeptido repetitivo da circum-esporozoito proteína (ELISA NAN P), e mediante imunofluorescência com esquizontes hepáticos de P. falciparum (IFA, LS, LS correspondente â abreviatura Liver Stage ou seja estádio hepático) .

-44QUADRO I

IDADE	ELISA NANP	ZONA DE FRACA ENDEMIA	W.B. SALSA
IFA LS	W.B. LSA
0-10	0/12	12/12	8/12	11/12
10-20	0/5	5/5	4/5	5/5
> 20	7/13	13/13	12/13	11/13
total	7/30	30/30	24/30	27/30

-45Face a estes resultados e ã presença inconstante dos epito pos contidos na proteína recombinante SALSA nos esporozoitos de diversos isolatos, pode-se formular a hipótese que os epitopos são mais frequentemente expressos ao nível do estádio hepático do que do estádio esporozoito.

A análise da conformação da sequência de aminoácidos de acordo com a técnica de Chou e Fassman [Prediction of Protein Conformation, Biochemistry, vol.13, ηθ 2, 222-245 (1974)] permi. te vaticinar que 3 zonas da molécula SALSA têm uma forte tendência para se organizar em hélice tf , uma compreendida entre os aminoácidos 25 a 51, as outras duas compreendidas entre os amino ácidos 52 a 87. Como consequência,prepararam-se pêptidos sintéticos representando as seguintes sequências :

- SAEKKDEKEASEQGEESHKKENSQESA denominada SALSA1,

- NGKDDVKEEKKTNEKKDDGKTDKVQEKVLEKSPKEF denominada SALSA2.

Estes foram purificados e utilizados em diversos ensaios imunológicos.

Em ELISA, soros de sujeitos vivendo em zona de fraca endemia reagem especif icamente com cada um destes pêptidos . Em três gru pos de indivíduos, pertencentes a todas as classes de idades, a prevalência de anticorpos anti-SALSA 1 ou 2 varia entre 25% e 60%. Existe um paralelismo não restrito das respostas face ã pro teína recombinante DG 671. Realizou-se um estudo da re-positivação do sangue (reaparecimento dos parasitas), depois de uma cura radical do paludismo, e das respostas aos péptidos SALSA 1 e 2, da seguinte maneira :

um grupo de 250 indivíduos recebeu uma cura radical de cloroquina (dose = 25 mg/Kg, suficiente para irradicar todos os parasitas presentes, com o objectivo de suprimir qualquer parasitémia pré-existente. Foram, em seguida, seguidos clinicamente e parasi^ tologicamente durante 3 meses da época da transmissão do paludi^ mo pelo anophele para detectar o reaparecimento do parasita no sangue. Seleccionaram-se dois grupos de 40 indivíduos cada um, uns não apresentando parasitémia durante o tempo de seguimento, os outros tendo um exame de sangue positivo para P. falciparum (esfregaço e gota espessa corados com giemsa). Nos indivíduos cujo exame de sangue continuou negativo, a prevalência e os títu los médios de anticorpos face aos péptidos SALSA 1 e 2, sao significativamente mais elevados do que nos que apresentaram uma parasitémia. Pelo contrário, a prevalência de respostas e as taxas de anticorpos em relação a um antigénio testemunha, o tetrapeptido repetitivo NANP da circum-esporozoito proteína são iguai nos dois grupos. Estes resultados sugerem que a resposta imunitá ria ao DG 671-SALSA interfere com o desenvolvimento da fase de multiplicação intra-hepática do parasita. Pelo contrário, não existe nenhuma indicação de que a resposta ã circum-esporozoito proteína possa ter o mesmo efeito. Por outras palavras, estes resultados sugerem que o desenvolvimento de uma imunidade contra a molécula SALSA pode ter um efeito protector no homem contra a infecção provocada por Plasmodium falciparum.

A resposta proliferativa dos linfócitos de indivíduos expo£ tos ao paludismo foi estudada em relação ao antigénio peptídico SALSA 1. Os resultados demonstram que esta sequência peptídica comporta um epitodo reconhecido pelos linfócitos T em uma proporção importante de indivíduos expostos.

Os linfócitos CD4⁺ de 7 dos 10 sujeitos estudados prolifera ram na presença do péptido SALSA 1 (1 e 10 yjLg/ml) e na presença de interleucina-2 (IL-2). 0 aumento da proliferação em relação à testemunha IL-2 isolada é superior a 10. Este resultado demonstra que os sujeitos geneticamente capazes de responder ao péptido SALSA 1 são mais frequentemente reencontrados na zona endémica do que os capazes de responder aos epitopos T do circum-esporozoito. Por outras palavras, os epitopos T do polipeptido SALSA são menos geneticamente restritos que os da circum-esporozoito proteína.

A presente invenção diz ainda respeito aos ácidos nucleicos recombinantes contendo a sequência que codifica para o polipeptido SALSA, assim como os microrganismos, particularmente as bactérias E. coli transformadas por estes ácidos nucleicos recombinantes e capazes de exprimir o dito polipeptido.

A presente invenção diz respeito a estas sequências de ãci dos nucleicos ou sequências equivalentes que podem ser sintetiza das e que codificam para os mesmos aminoácidos.

Torna-se imediatamente evidente para o entendido na matéria que, nestas sequências, se pode substituir certos nucleotidos por outros devido ã desgenerescência do código genético sem que por isso os péptidos codificados sejam modificados. Todas estas sequências nucleotídicas, assim como as que codificam para polipeptidos que diferem dos anteriores por um ou vários aminoácidos sem que a sua actividade imunogénica própria seja modifica da de forma semelhante, fazem parte da presente invenção. 0 mesmo acontece, naturalmente, com as sequências nucleotídicas que podem ser reconstituídas e que são capazes de codificar para oli gómeros tais como os definidos antes. Os motivos monoméricos estão ligados directamente extremidade a extremidade ou por intermédio de sequências peptídicas sem efeito sobre as propriedades imunogénicas dos oligómeros assim formados.

Finalmente, a presente invenção diz respeito aos vectores modificados por estes microrganismos, estando estes vectores naturalmente dotados de elementos de regulação e de terminação antes e depois das sequências nucleicas indicadas antes, que permi tirão a expressão destas últimas nos organismos celulares competentes .

Bactérias albergando o referido clone DG 671 foram depositadas na Collection Nationale des Cultures de Microorganismes do Instituto Pasteur de Paris (CNCM), com a data de 3 de Abril de 1989 sob o número 1-855.

Claims (17)

1. REIVINDICAÇÕES

   1.- Processo para a preparação de um polipeptido comportando pelo menos uma sequência peptídica portadora de um, ou vários, epitopo(s) característico(s) de uma proteína produzida no estádio esporozoito e nos hepatocitos infectados por P. falciparum, comportando esta sequência uma sucessão de cerca de 10 aminoácidos do número máximo de aminoácidos do seguinte encadeamento peptídico:

   Glu-Phe-Arg-Val-Ser-Thr-Ser-Asp-Thr-Pro-Gly-Gly-AsnGlu-Ser-Ser-Ser-Ala-Phe-Pro-Gln-Phe-Ile-Trp-Ser-AlaGlu-Lys-Lys-Asp-Glu-Lys-Glu-Ala-Ser-Glu-Gln-Gly-GluGlu-Ser-His-Lys-Lys-Glu-Asn-Ser-Gln-Glu-Ser-Ala-AsnGly-Lye-Asp-Asp-Val-Lys-Glu-Glu-Lys-Lys-Thr-Asn-GluLys-Lys-Asp-Asp-Gly-Lys-Thr-Asp-Lys-Val-Gln-Glu-LysVal-Leu-Glu-Lys-Ser-Pro-Lys-Glu-Phe, caracterizado pelo facto de, partindo-se de preferência do aminoãcido C-terminal, se condensar sucessivamente, dois a dois, os aminoacilos sucessivos na ordem requerida, ou aminoacilos e fragmentos previamente formados e contendo já vários resíduos aminoacilos na ordem apropriada, ou ainda vários fragmentos previamente assim preparados, entendendo-se que se terá o cuidado de proteger previamente todas as funções reactivas transportadas por estes aminoacilos ou fragmentos com excepção das funções amina de um e carboxilo do outro, ou vice-versa, gue devem normalmente intervir na formação das ligações peptídicas, normalmente depois da activação da função carboxilo, de acordo com os métodos conhecidos na síntese dos péptidos, e assim sucessivamente, gradualmente, até ao aminoácido N-terminal.
2. 2, - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se.preparar um polipeptido constituído por um péptido monomérico, constituído, ele próprio, por 87 aminoácidos do encadeamento peptídico da reivindicação 1.
3. 3, - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se preparar um polipeptido representado pela totalidade ou parte do seguinte encadeamento de aminoácidos:

   Ser-Ala-Glu-Lys-Lys-Asp-Glu-Lys-Glu-Ala-Ser-Glu-GlnGly-Glu-Glu-Ser-His-Lys-Lys-Glu-Asn-Ser-Gln-Glu-SerAla.

   -514.- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se preparar um polipeptido representado por todo ou parte do seguinte encadeamento de aminoácidos:

   Asn-Gly-Lys-Asp-Asp-Val-Lys-Glu-Glu-Lys-Lys-Thr-AsnGlu-Lys-Lys-Asp-Asp-GLy-Lys-Thr-Asp-Lys-Val-Gln-GluLys-Val-Leu-Glu-Lys-Ser-Pro-Lys-Glu-Phe.
4. 5. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se preparar um polipeptido comportando entre cerca de 10 aminoácidos e 87 aminoácidos, e que codifica para todo ou parte do ãcido nucleico representado a seguir:

   GAATTCCGAGTAAGTACTAGTGATACTCCTGGAGGAAATGAATC

   TTCAAGTGCTTTCCCCCAATTTATCTGGTCAGCAGAAAAAAAGG

   ATGAAAAAGAAGCTTCTGAACAAGGAGAAGAAAGTCATAAAAAA

   GAAAATTCCCAAGAAAGCGCGAATGGTAAGGATGATGTTAAAGA

   AGAAAAAAAAACTAATGAAAAAAAAGATGATGGAAAAACAGACAA

   GGTTCAAGAAAAGGTTCTAG

   AAAAGTCTCCAAAGGAATTC

   2Í2 ²⁶¹
5. 6. - Processo para a preparação de uma sequência nucleotídica comportando uma cadeia de nucleótidos que codifica para os polipeptidos definidos em uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo facto de compreender as seguintes etapas:

   - incubação do ADN genómico, isolado a partir de uma estirpe âe Ρ.falciparum, com a ADNase I, seguida de adição de EDTA e purificação mediante extracção com a mistura fenol/clorofórmio/ ^álcool isoamílico (25/24/1) e depois com éter,

   - tratamento do ADN assim extraído pela Eco Ki metilase na presença de DTT e purificação mediante extracção tal como descrita antes,

   - incubação do ADN assim purificado com os 4 desoxinucleotidos trifosfatos dATP, dCTP, dGTP e dTTP na presença da T^ ADN poli, merase e da ADN ligase de *’E. coli, seguida de purificação de acor do com o método descrito antes,

   - clonagem dos ãcidos nucleicos assim obtidos em um vector apropriado e recuperação do ãcido nucleico pretendido com uma sonda apropriada.
6. 7.- Processo para a preparação de uma sequência nucleotídica comportando um encadeamento de nucleótidos que codifica para os polipeptidos definidos em uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo facto de compreender as seguintes etapas:

   . quando o ãcido nucleico a preparar compreender no máximo 200 nucleótidos;

   - a síntese do ADN utilizando um método automatizado das P -cianetil-fosforamidites, _ clonagem dos ãcidos nucleicos assim obtidos em um vector apropriado e recuperação do ãcido nucleico mediante hibridação com uma sonda apropriada;

   . e quando o ãcido nucleico a preparar compreender mais de

   200 nucleótidos:

   - a ligação dos oligonucleotidos sintetizados quimicamente, comportando nas suas extremidades sítios de restrição diferentes, cujas sequências são compatíveis com o encadeamento em amino-ãcidos do peptido natural,

   - clonagem dos ãcidos nucleicos assim obtidos em um vector apropriado e a recuperação do acido nucleico pretendido mediante hibridação com uma sonda apropriada.
7. 8. - Processo de acordo com a reivindicação 6, ou a reivindicação 7, caracterizado pelo facto de se preparar uma sequência de nucleótidos compreendendo toda ou parte da sequência nucleotídica indicada na reivindicação 5.
8. 9. - Processo de acordo com a reivindicação 6, ou a reivindicação 7, para a preparação de uma sequência de nucleótidos capaz de se hibridar com a sequência nucleotídica indicada na reivindicação 5, ou a sequência complementar desta última nas seguintes condições:

   - pré-tratamento (pré-hibridação) do filtro de nitrocelulose que suporta o fragmento do ãcido nucleico a ensaiar com um tampão de hibridação, (constituído por 6 x SSC, £5% de leite, 0,5% de SDS), sendo esta operação efectuada a 65°C durante 1 hora;

   - substituição do tampão de hibridação em contacto com o su-

   -54porte, sobre o qual o fragmento de ãcido nucleíco estã agora fixado, por um tampão de hibridação da mesma composição (compreendendo além disso o ADN de salmão desnaturado), e adição da sequência indicada na reivindicação 5 como sonda) especialmente marcada radioactivamente, e previamente desnaturada mediante um tratamento a 100°C durante 5 minutos)

   - incubação do referido fragmento de ãcido nucleico fixado sobra o suporte neste tampão de incubação com a sequência indicada na reivindicação 5 a 65°C durante 16 a 24 horas;

   - eliminação do tampão contendo a sonda não fixada, mediante

   3 lavagens sucessivas de 5 minutos cada uma com 2 x SSC, 0,1%

   SDS a 65%, seguidas de 3 lavagens sucessivas de 5 minutos cada uma com 0,1 x SSC, 0,1 % SDS a 65°C.
9. 10. - Processo de acordo com a reivindicação 6 ou a reivindicação 7, caracterizado pelo facto de se preparar uma sequência nucleotidica utilizável como iniciador do ADN ou do ARN, constituí, da por cerca de 10 a 25 nucleótidos, iguais aos 10 a 25 primeiros nucleótidos da sequência de nucleótidos que codifica para uma sequência peptídica de acordo com uma das reivindicações 1 a 5, ou iguais aos 10 a 25 últimos nucleótidos da referida sequência.
10. 11. - Processo de acordo com a reivindicação 6 ou a reivindicação 7, caracterizado pelo facto de se preparar uma sequência nucleotidica utilizável como iniciador do ADN ou do ARN, constituída por cerca de 10 a 25 nucleotidos complementares dos 10 a 25 primeiros nucleotidos da sequência nucleotídica que codifica para uma sequência peptídica de acordo com uma das reivindicações

    1 a 5, ou complementar dos 10 a 25 últimos nucleotidos da referida sequência de nucleotidos.
11. 12. - Processo de acordo com a reivindicação 6 ou a reivindicação 7, caracterizado pelo facto de se preparar uma sequência nucleotídica utilizável como iniciador do ADN ou do ARN constituída por cerca de 10 a 25 nucleotidos capazes de se hibridar com os 10 a 25 primeiros nucleotidos ou com os 10 a 25 últimos nucleotidos da sequência de nucleotidos que codifica para uma sequência peptídica de acordo com uma das reivindicações 1 a 5, nas condições de hibridação definidas na reivindicação 9.
12. 13. - Processo para a preparação de uma sonda nucleotídica de detecção constituída por < ? a <[ ? nucleotidos da sequência de nucleotidos indicada na reivindicação 5, ou a sua sequência complementar, caracterizado pelo facto de se efectuar a síntese do ADN utilizando o método automatizado das cianetilfosforamidites.
13. 14.- Processo para a detecção de uma seguência de nucleotidos tal como definida nas reivindicações 6 a 11, caracterizado pelo facto de se efectuar, com uma sonda de acordo com a reivin-56dicação 13, uma hibridação nas condições definidas na reivindicação 9.
14. 15.- Processo para a preparação de um polipeptido definido em uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo facto de compreender as seguintes etapas:

    - eventualmente, amplificação prévia de acordo com a técni ca PCR da quantidade de sequências de nucleótidos que codificam para o referido polipeptido com um iniciador de ADN definido na reivindicação 10, e de um iniciador de ADN definido na reivindicação 11, ou a reivindicação 12, escolhidos de modo gue um destes iniciadores seja igual aos 10 ou 25 primeiros nucleótidos da sequência nucleotídica gue codifica para o referido polipeptido enquanto o outro iniciador é complementar dos 10 a 25 últimos nucleótidos (ou hibrida-se com estes 10 a 25 últimos nucleótidos) da referida sequência nucleotídica, ou inversamente, de maneira que um destes iniciadores seja igual aos 10 a 25 últimos nucleotidos da referida sequência, enquanto o outro iniciador é complementar dos 10 a 25 primeiros nucleótidos (ou hibrida-se com os

    10 a 25 primeiros nucleótidos) da referida sequência nucleotídica, seguida da introdução das referidas sequências de nucleótidos assim amplificadas em um vector apropriado,

    - cultura, em um meio de cultura apropriado, de um hospedeiro celular previamente transformado por um vector apropriado contendo um ãcido nucleico recombinante constituído por uma se-57guência de nucleótidos definida em uma das reivindicações 6 a 9, precedida de um promotor sob o controlo do qual a transcrição da referida sequência é susceptível de se efectuar e, eventualmente, seguida de uma sequência que codifica para sinais de terminação da transcrição, e

    - recuperação, a partir do referido meio de cultura, do polipeptido produzido pelo referido hospedeiro celular transformado.
15. 16.- Método para o diagnóstico in vitro'¹ do paludismo em um indivíduo susceptível de estar infectado pelo P.falciparum caracterizado pelo facto de compreender as seguintes etapas:

    - eventualmente, amplificação prévia da quantidade de sequências de nucleótidos definida em uma qualquer das reivindicações

    6 a 9, susceptíveis de estar contidas na amostra biológica colhida no referido indivíduo, com um iniciador de ADN de acordo com a reivindicação 10 e de um iniciador de ADN de acordo com a reivindicação 11 ou 12, e escolhidas de acordo com a maneira indicada na reivindicação 15, contacto da amostra biológica mencionada anteriormente com uma sonda nucleotídica definida na reivindicação 13, ou com qualquer sequência definida nas reivindicações 6 a 9 utilizável como sonda, nas condições que permitam a produção de um complexo de hibridaçâo formado entre a referida sonda e a referida sequência de nucleótidos,

    - detecção do complexo de hibridaçâo mencionado antes even-

    -58tualmente formado,
16. 17. - Método para o diagnóstico in vitro do paludismo em um indivíduo susceptível de estar infectado pelo P.falciparum caracterizado pelo facto de compreender o contacto de um tecido / ou de um fluido biológico pré-colhido no indivíduo com um polipeptido de acordo com uma das reivindicações 1 a 5, nas condições que permitam uma reacção imunolõgica ¹¹ in vitro entre o referido polipêptido e os anticorpos eventualmente presentes no tecido biológico, e a detecção in vitro do complexo antigénio-anticorpo eventualmente formado.
17. 18. - Processo para a preparação de uma composição de vacina dirigida contra o paludismo, caracterizado pelo facto de se mis) turar um ou vários polipêptido(s) tal(is) como definido(s) em uma das reivindicações la 5, com um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico,

    Lisboa, 12 de Abril de 1990

    -59PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE MOLÉCULAS COMPORTANDO

    PELO MENOS UMA SEQUÊNCIA PEPTlDICA PORTADORA DE UM, OU VÃRIOS, EPITOPO(S) CARACTERlSTICO(S) DE UMA PROTEÍNA PRODUZIDA POR ”P.FALCIPARUM AO NÍVEL DO ESTÁDIO ESPOROZOITO E NOS HEPATOCITOS

    Descreve-se um processo para a preparação de um polipeptido comportando pelo menos uma sequência peptídica portadora de um, ou vários, epitopo(s) característico(s) de uma proteína produzida no estádio esporozoito e nos hepatocitos infectados pelo P.Falciparum, comportando esta sequência uma sucessão de cerca de 10 aminoãcidos do número máximo de aminoácidos do seguinte encadeamento peptídico:

    Glu-Phe-Arg-Val-Ser-Thr-Ser-Asp-Thr-Pro-Gly-Gly-AsnGlu-Ser-Ser-Ser-Ala-Phe-Pro-Gln-Phe-Ile-Trp-Ser-AlaGlu-Lys-Lys-Asp-Glu-Lys-Glu-Ala-Ser-Glu-Gln-Gly-GluGlu-Ser-His-Lys-Lys-Glu-Asn-Ser-Gln-Glu-Ser-Ala-AsnGTy-Lyç-Asp-Aep-v»l-Lys-Glu-Glu-Lys-Lys-Thr-Asn-Gl«Lys-Lys-Asp-Aep-Gly-Lys-Thr-Asp-Lys-Val-Gln-Glu-LysVal-Leu-Glu-Lys-Ser-Pro-Lys-Glu-Phe.

    caracterizado pelo facto de, partindo-se de preferência do aminoácido C-terminal, se condensar sucessivamente dois a dois os aminoacilos sucessivos na ordem requerida, ou aminoacilos e fragmentos previamente formados e contendo já vários resíduos aminoacilos na

    -60ordem apropriada, ou ainda vários fragmentos previamente assim preparados, entendendo-se que se terá o cuidado de proteger previamente todas as funções reactivas transportadas por estes aminoacilos ou fragmentos com excepção das funções amina de um e carboxilo do outro, ou vice-versa, que devem normalmente intervir na formação das ligações peptídicas, normalmente depois da activação da função carboxilo, de acordo com os métodos conhecidos na síntese dos péptidos, e assim sueessivamente, gradualmente, até ao aminoãcido N-terminal.

    Diz igualmente respeito à utilização destes polipeptidos, assim como das sequências nucleotídicas que codificam para estes polipeptidos, nos métodos de diagnóstico ¹¹ in vitro do paludismo sobre uma amostra biológica proveniente do indivíduo a que se pretende despistar a doença.

    GAATTCCGAGTAAGTACTAGTGATACTCCTGGAGGAAATGAATC

    TTCAAGTGCTTTCCCCCAATTTATCTGGTCAGCAGAAAAAAAGG

    ATGAAAAAGAAGCTTCTGAACAAGGAGAAGAAAGTCATAAAAAA

    GAAAATTCCCAAGAAAGCGCGAATGGTAAGGATGATGTTAAAGA

    AGAAAAAAAAACTAATGAAAAAAAAGATGATGGAAAAACAGACAA

    GGTTCAAGAAAAGGTTCTAG

    AAAAGTCTCCAAAGGAATTC