PT93894B

PT93894B - Processo para a estabilizacao de esterase de carboxilo e de preparacao de esterase de carboxilo estabilizada

Info

Publication number: PT93894B
Application number: PT93894A
Authority: PT
Inventors: Wilhelmus Johannes Quax; Johanna Henrica Gerdina Maria; Cornelis Jacobus Van Der Laken; Cornelis Petrus Broekhuizen
Original assignee: Gist Brocades Nv
Priority date: 1989-04-28
Filing date: 1990-04-27
Publication date: 1996-10-31
Also published as: HU904504D0; NZ233459A; FI100888B; CN1093880C; CN1046935A; WO1990013635A1; CA2018345A1; ZA903242B; HU210677B; IL94238A0; JPH03505678A; KR100204837B1; NO905415L; AU5633490A; AU621756B2; PT93894A; KR920700284A; CA2018345C; HUT59960A; EP0395181A1

Description

Descrição

Domínio da invenção

A presente invenção refere-se a estabilização de esterase de carboxilo.

Antecedentes e Literatura Relevante

A Pat. dos E.U.-4 886 750 descreve o uso de esterase na hidrólise estereosselectiva de esteres dos ácidos 2-arilpropiónicos. Neste documento é caracterizada a enzima responsável pela hidrólise de ésteres de (S)-naproxeno. 0 correspondente gene de esterase foi obtido a partir da estirpe de Bacillus subtilis Thai 1-8 (CBS 679). Este gene que codifica para a enzima responsável pela conversão estereosselectiva de éster de (R,S)-naproxeno foi clonado em E. coli e Bacillus subtilis. VeE.I

rificou-se que a actividade de esterase era melhorada por introdução de cópias múltiplas do gene em vários Bacillus subtilis (a.o. CBS 637.86). A adequabilidade do microorganismo e da enzima derivada deste para uso num processo para a hidrólise do éster de S-naproxeno foi por conseguinte também melhorada.

Na referida patente dos E.U. apenas são usadas baixas concentrações de substrato (naproxeno e iboprofeno). Em contraste, as aplicações comerciais exigem concentrações de produto elevadas no sentido de se obterem resultados economicamente atractivos. Contudo, durante os ensaios a concentrações de subs_ trato elevadas (condições comerciais) tem sido verificada a inactivação irreversível da enzima. Por exemplo, estearase de carboxilo obtida a partir de Bacillus Thai 1-8 foi quase completamente inactivada num período de uma hora quando se adicionaram 30 g/1 de éster de naproxeno (pH - 9, T = 40°C e meio Tween 80 (R)). A esterase como tal é estável a pH = 9 e T = 40^CC (com e sem Tween 80 (R)) durante várias horas. Durante a hidrólise estereosselectiva do éster de (R,S)-naproxeno, a enzima foi inactivada pelo naproxeno formado durante a hidrólise. Não se puderam obter por conseguinte rendimentos elevados de naproxeno .

A enzima esterase de carboxilo pode ser usada em várias outras reacções de hidrólise estereoespecifica por esterase. Contudo, verificou-se que o produto (o ácido) destas reacções inactiva muitas vezes a enzima quando a reacção tem lugar a concentrações de éster iniciais de interesse comercial.

A esterase de carboxilo pode ser usada na hidrólise estereoespecifica de ésteres de diclofop, dando como resultado o enantiómero (S) puro do ácido correspondente, processo este que é descrito em EP-A-0299559. 0 diclofop formado vai inactivar a enzima sob condições de conversão comercialmente atractivas.

Outros compostos que inactivam a enzima são, por exemplo, o ácido 2-naftoxi-acético, o ibuprofeno, o 2-naftol e o fenol.

Na literatura as enzimas são conhecidas por se tornarem inactivas devido à sua baixa estabilidade térmica. A temperaturas elevadas pode ter lugar o desdobramento da enzima. 0 aquecimento provoca especialmente a quebra das ligações de hidrogénio (ver por exemplo R.D. Schmid, Advances in Biochemical Engineering 12, Ghose, Fielchler & Blakebrough (Eds), Springer, Berlin (1979) pp. 41-115). 0 desdobramento térmico das enzimas pode, contudo, ser diminuído por imobilização da enzima ou por estabelecimento de ligações cruzadas. Por exemplo, as ligações cruzadas com glutaraldéido melhoram a termoestabilidade da Papaina (Royer et al., FEMS Lett. 80 (1977) 1) e da subtilopeptidase (Boudrant et al. , Biotechnol. Bioeng. 18 ( 1976) 1719).

Mesmo o mecanismo da termoestabilização não é bem compreendido. E.T. Reese e M. Manders (biotechnol. Bioeng. 22 (2) 1980 pp. 326-336 mostraram que o estabelecimento de ligações cruzadas (tratamento por glutaraldéido) não tem como resultado um aumento da termoestabilidade e da actividade da celulase. resultados semelhantes foram verificados por N.W. Ugarova (Biokhimiya 42 (7), 1977 pp. 1212-1220) que relatou que a modificação da peroxidase com glutaraldéido deu uma diminuição de 2,5 vezes na termoestabilidade.

A técnica anterior apresenta apenas soluções muito específicas para problemas específicos (imobilização e técnicas de estabelecimento de ligações cruzadas) que não são de aplicação geral. Para além disso, verificou-se que a esterase de carboxilo não é inactivada termicamente nas condições normais de reacção (até 45°C) mas é apenas inactivada por certos compostos nas condições reaccionais. A técnica anterior não se refere a este tipo de inactivações.

Quando o resíduo de um ácido aminado que é a causa da inactivação da proteína é conhecido, é possível uma abordagem alternativa à modificação quimica. Neste caso é possível substituir o resíduo por outro meio de mutagénese dirigida, conforme descrito por exemplo por Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Son Inc., 1987, Nova Iorque). Deste modo, por exemplo a resistência à oxidação da protease de

serina de B. alcalophilus foi melhorada por substituição de um resíduo de metionina por um resíduo de serina (pedido de Patente Europeia 0328229).

As técnicas de estabilização conhecidas não podem ser aplicadas sem adaptação à presente enzima porque a natureza da inactivação é diferente quando a inactivação por compostos químicos tem influência.

Resumo da invenção

A presente invenção refere-se a uma esterase de carboxilo modificada que apresenta uma estabilidade aumentada na presença de compostos como o naproxeno e que pode ser utilizada para a hidrólise estereoespecífica destes compostos. Deste modo a presente invenção proporciona um processo para a hidrólise estereoespecífica de um substrato opticamente activo que comprende proceder à hidrólise do substrato na presença de uma esterase de carboxilo que apresenta uma estabilidade aumentada quando posta em contacto com 15 mg/ml de (S)-naproxeno a 40°C durante 1,5 horas, em comparação com o tipo selvagem. Esta esterase de carboxilo modificada pode ser obtida por substituição ou por modificação de pelo menos um resíduo de ácido aminado da esterase de carboxilo de tipo selvagem.

Breve descrição das figuras

A Figura 1 mostra a sequência nucleotídica da região de codificação do gene a esterase de carboxilo de Bacillus subtilis Thai 1-8 (CBS 679-85).

A Figura 2 mostra a actividade da esterase de carboxilo do tipo selvagem e de várias esterases de carboxilo mutantes;

- β - esterase de carboxilo do tipo selvagem

- + - mutante Lys 34 Glu

- * - mutante Lys 81 Glu

- X - mutante Lys 217 Glu

A Figura 3 mostra a influência de um tratamento por

formaldeído na actividade da esterase de carboxilo;

- · - após tratamento com formaldeído

- + - após tratamento com formaldeído e com naproxeno

A Figura 4 mostra a conversão do éster de naproxeno usando esterase de carboxilo e a esterase de carboxilo modifi-

cada;
- · —	enzima não	modificada
+	— modificada	por	anidrido glutárico
*	— modificada	por	anidrido succínico
- Q -	— modificada	por	glioxal
- x —	— modificada	por	aldeído glutárico
0	— modificada	por	f ormaldeído

A Figura 5 mostra a conversão do éster etilico de (R ,S)-diclofop usando esterase de carboxilo e esterase de carboxilo modificada, respectivamente.

Descrição das formas de concretização específicas

Na presente memória descritiva o uso da expressão esterase de carboxilo pretende significar uma esterase obtenível a partir de uma estirpe de Bacillus e capaz de hidrolisar de modo estereoespecífico o S-naproxeno.

A esterase de carboxilo é estável a temperaturas até 45°C. Na presença de compostos como naproxeno a enzima é rapidamente inactivada. A enzima perde substancialmente actividade num período de 1,5 horas na presença de 15 mg/ml de (S)-naproxeno a 40°C. A inactivação da enzima é acompanhada por agregação da enzima. Esta inactivação, ou destabilização, não é devida a termo-inactivação, mas verifica-se que está relacionada com o efeito químico de compostos como o naproxeno sobre a enzima. A presente invenção baseia-se na constatação de que resíduos de ácidos aminados com carga positiva na esterase de carboxilo estão relacionados com a destabilização. Possivelmente o naproxeno sob forma ácida reage com os grupos amina livres à superfície da enzima, permitindo deste modo que a fracção hidrofóbica do naproxeno ácido interfira com a dobragem da enzima. Este desdobramento é verificado por um aumento da suscepti5

bilidade da enzima à quebra proteolítica na presença de naproí xeno. Por substituição (engenharia de proteínas) ou por modificação química destes resíduos básicos, a carga positiva destes ácidos aminados pode ser eliminada ou invertida. Deste modo evitar-se-ia a ligação do naproxeno ácido à enzima. A este respeito é de notar que apenas podem ser usados para a modificação da enzima grupos químicos pequenos e não demasiado hidrofílicos. 0 benzaldeído, por exemplo, não tem um efeito positivo sobre a estabilidade da enzima. Também a alteração dos resíduos com carga positiva por outros resíduos com carga positiva mas menos susceptíveis à modificação química, como a lisina ou a arginina (ver por exemplo R.D. Schmid, Advances in Biochemical Engineering, Berlin (1979), 41-115), pode dar origem a uma estabilização da enzima.

Deste modo, um outro aspecto da presente invenção refere-se a uma esterase de carboxilo modificada que é produzida por tratamento da esterase de carboxilo do tipo selvagem com um composto que contém pelo menos um grupo que pode reagir com um resíduo de ácido aminado com carga básica na esterase de carboxilo. Deste modo são possíveis concentrações mais elevadas do produto e maiores rendimentos. São exemplos de compostos que podem ser usados para o tratamento da esterase de carboxilo alguns aldeídos (monoaldeídos ou dialdeídos), como formaldeído, glutaraldeído ou glioxal, e anidridos, como o anidrido do ácido glutárico ou o anidrido succínico.

Geralmente adiciona-se 0,05 a 10 v/v$ (calculado na mistura reaccional) do composto (agente de estabilização) à mistura reaccional contendo a esterase de carboxilo de tipo selvagem. Normalmente adiciona-se 0,1 a 5 v/v$ deste agente. Mantém-se o pH durante a estabilização da enzima em pelo menos pH=7, normalmente num pH de 7 a 10.

Verificou-se que substancialmente toda a esterase de carboxilo é estabilizada após adição de um composto como um aldeído ou um anidrido. 0 facto de que a estabilização pode ocorrer usando formaldeído, um monoaldeído, ou um anidrido indica que a enzima é realmente quimicamente modificada pelo formal6

- deído ou pelo anidrido e não se trata de uma reacção de estabelecimento de ligações cruzadas intramolecular.

De acordo ainda com um outro aspecto da presente invenção são proporcionadas novas enzimas, em particular esterases de carboxilo modificadas, que podem ser obtidas por expressão de genes que codificam para esta enzima, que difere da referida esterase de tipo selvagem em pelo menos um resíduo de ácido aminado presente na enzima correspondente de tipo selvagem e que apresenta propriedades melhoradas durante a aplicação. Foi surpreendente verificar que certos resíduos de lisina, arginina e histidina estão envolvidos na inactivação da esterase de carboxilo.

A presente invenção proporciona em consequência uma enzima estabilizada ou modificada, especialmente uma esterase estabilizada ou modificada, que é preparada por substituição de pelo menos um resíduo de um ácido aminado básico na enzima correspondente de tipo selvagem e por expressão do gene mutante ou cujos ácidos aminados básicos são modificados pela acção de certos compostos químicos.

Após determinação da sequência de ADN da esterase de carboxilo (ver exemplo 1), os resíduos de lisina, arginina e histidina da esterase podem ser substituídos por mutação do gene da esterase com a técnica da mutagénese dirigida a locais específicos (Ausubel et al., 1987, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Son Inc., Nova Iorque). Deste modo, os resíduos de lisina e/ou de arginina básicos com carga positiva podem, por exemplo, ser substituídos por resíduos neutros (sem carga) ou por resíduos com carga negativa (por exemplo glutamina, serina, ácido glutâmico). Do mesmo modo outros resíduos (por exemplo histidina), que estão implicados na estabilização da esterase de carboxilo, podem ser substituídos por outros resíduos.

A enzima modificada apresenta propriedades melhoradas durante a aplicação industrial, por exemplo na hidrólise do ester de naproxeno. Por propriedades melhoradas pretendemos si. gnificar, na presente memória descritiva, uma alta eficiência

na conversão proveniente da melhor estabilidade e especialmente uma estabilidade melhorada perante certos compostos químicos, em relação à enzima de tipo selvagem.

Por esterase de carboxilo enrende-se na presente memória descritiva uma esterase obtida a partir de uma estirpe de Bacillus, que é capaz de hidrolisar de modo estereoespecífico o ester de S-naproxeno. De preferência a enzima é substancialmente idêntica, ou é idêntica, à esterase obtida a partir de uma estirpe de Bacillus subtilis, de modo especialmente preferido a partir da estirpe Bacillus subtilis Thai 1-8 (CBS 679.85. Por uma enzima que é substancialmente idêntica à esterase obtenível a partir da estirpe Bacillus subtilis Thai 1-8 entende-se que a sequência de ADN que codifica para a esterase tem pelo menos 70% de homologia na sequência nucleotídica com a sequência de ADN que codifica para a esterase da estirpe Bacillus subtilis Thai 1-8.

A equação seguinte, que foi derivada da análise da influência de diferentes factores na estabilidade dos híbridos: Tm = 81 + 16,6 (log_w Ci) + 0,4 (% G + C) - 600/n - 1,5 (% de desemparelhamento) (Currente protocols in molecular biology 1987-1988, edited by Ausubel et al.) . n = comprimento da cadeia mais curta da sonda

Ci = força iónica (M)

G+C = composição base

Tm = temperatura de hibridação foi usada para determinar a homologia que foi possível detectar nas nossas experiências. Admitindo que a sonda tem um comprimento de 300 bases, fomos capazes de detectar um gene homólogo que apresenta pelo menos 67% de homologia no interior de um fragmento de 300 bases ou mais. Na determinação da percentagem de homologia admitimos que o conteúdo em CG do Bacillus é 50% (Normore, 1973, em Laskin e Lechevalier (ed.), Handbook of Microbiology, vol. II, CRC Press, Inc. , Boca Raton, Fia.). Esta circunstância significa que uma esterase de carboxilo modificada com pelo menos 70% de homologia com a esterase de carboxilo de Bacillus subtilis Thai 1-8 se encontra abrangida na presente invenção.

Todas as publicações e pedidos de patentes citados na presente memória descritiva são dados como aqui reproduzidos por referência como se se indicasse que cada publicação ou pedido de patente individual era dado como reproduzido por referência .

Se bem que a presente invenção seja descrita com algum pormenor por meio de ilustração e de exemplos com a finali-j dade de clareza e de elucidação, é obvio para os especialistas na matéria com uma formação regular que será possível introduzir algumas alterações e modificações respeitando o espírito e o âmbito das reivindicações em anexo.

Os exemplos que se seguem destinam-se a elucidar mais completamente a presente invenção.

Exemplo 1

Determinação da sequência de ácidos aminados da esterase de oarboxilo de Bacillus subtilis l-85/pNAPT-7 (CBS 673.86)

A sequência de ácidos aminados da esterase de carboxilo proveniente de Bacillus subtilis l-85/pNAPT-7 (CBS 673-86) descrita em US-4 886 750, foi determinada como se segue. Determinou-se a sequência nucleotidica do fragmento inserido HindIIJE -HindIII de 2,2 de pNAPT-7 pelo método de terminação de cadeia didesoxi conforme descrito por Sanger et al. , (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75 (1977), 5463). No interior da sequência apenas foi possível detectar um quadro de leitura livre de grande dimensão capaz de codificar para uma proteína de 30 KD. A partir da sequência nucleotidica deste quadro de leitura livre derivou-se a sequência de ácidos aminados desta esterase de carboxilo. A Fig. 1 mostra a sequência de ADN e a sequência de ácidos aminados derivada para esta esterase de carboxilo. 0 código de uma letra para os ácidos é explicado no quadro seguinte:

A=alanina L=leucina

R=arginina K=lisina

N=asparagina M=metionina

D=ácido aspártico F=fenilalanina

C=cisteina

Q=glutamina

E=ácido glutâmico

G=glicina

H=histidina

I=isoleucina

P=prolina

S=serina

T=treonina

W=triptofano

Y=tirosina

V=valina

Exemplo 2

Mutação de resíduos de lisina na esterase de carboxilo

Clonou-se o fragmento de ADN que codifica para a esterase de carboxilo em Bacillus subtilis Thai 1-8 (CBS 679.85) fragmento BclI-HindIII de 2,0 kb proveniente de pNAPT-2, ver EP-A-233656) no vector pTZl8R. Preparou-se ADN de cadeia simples de acordo com as instruções do fornecedor (Pharmacia). Submeteu-se este ADN de cadeia simples a mutagénese dirigida a um oligonucleótido conforme descrito (Ausubel et al. , ibid.). Efectuaram-se onze diferentes reacções de mutagénese a fim de substituir os onze resíduos de lisina da esterase de carboxilo (ver Figura 1) um de cada vez por um resíduo de glutamina. Para além disso, levou-se a efeito uma décima segunda reacção na qual se incluiu no protocolo de mutagénese uma mistura de onze oligonucleótidos diferentes, cada um codificando para uma mutação lisina —> glutamina diferente. A esterase mutante resultante das reacções 1 a 11 foi produzida em E. coli DHI (ATCC 33849) conforme descrito na EP-A-233656 (com a diferença de que se usou o vector pTZl8R em vez de pUN121) e verificou-se a estabilidade na presença de (S)-naproxeno (como descrito no Exemplo 3). Distribui-se a mistura de mutantes da reacção 12 em placas de microtitulação e verificou-se a sua estabilidade na presença de naproxeno usando uma análise de formação de cor em p-naftol e azul fixo para determinar a actividade residual das esterases mutantes. Usou-se um robot de pipetação automática para fazer uma busca em 20 000 mutantes candidatos. Seleccionaram-se as enzimas mutantes mais estáveis provenientes das onze reacções de mutagénese diferentes e usaram-se para uma caracterização mais completa.

Exemplo 3

Estabilidade das esterases de carboxilo mutantes

Ensaiaram-se esterases de carboxilo mutantes construídas conforme descrito no Exemplo 2 para verificação da estabilidade como se segue: Incubou-se a 40°C durante 15 minutos uma solução de 9 ml que continha 0,10 g de (S)-naproxeno antes da adição de 1 ml de uma solução que continha 24 U/ml de esterase de carboxilo. A composição da mistura final era 10 g/1 de naproxeno, MOPS 1 mM, glicina 20 mM e 2,4 U/ml de esterase de carboxilo a pH 8,75. Imediatamente após a adição da solução de enzima e da mistura, recolheu-se a primeira amostra de 50 pl (amostra do minuto 0). Recolheram-se amostras de 50 pl aos minutos 0, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 180 e 240 e diluiram-se imediatamente até 5 ml com tampão MOPS 100 mM de pH 8,75 que continha 0,2% de BSA. Analisou-se a actividade de esterase de carboxilo nestas amostras conforme descrito seguidamente de acordo com os Métodos analíticos.

Obtiveram-se diversas enzimas mutantes com estabilidade aumentada na presença de naproxeno, por exemplo mutantes em que a lisina 34, a lisina 81 e a lisina 217 foram substituídas por glutamina.

A maioria dos mutantes construídos apresentavam uma estabilidade mais baixa ou uma actividade mais reduzida, como era de esperar. No entanto, a observação de que a mutação de cada uma de três posições, de entre onze lisinas possíveis, pode dar origem a uma estabilidade aumentada conservando a actividade da enzima indica as possibilidades da mutagénese dirigida a locais determinados. Para além disso, neste Exemplo apenas se construiram mutações para glutamina. A substituição das lisinas por outros resíduos também pode dar resultados tão bons ou mesmo melhores. A este respeito, a substituição das lisinas por argininas seria preferida pelas seguintes razões:

1. A arginina tem a mesma carga positiva que a lisina

2. 0 grupo amina epsilon da arginina é menos susceptível de modificações por grupos alquilo ou carboxilo do que a

lisina.

Também é viável a construção de melhores mutantes por combinação baseada nos agora possíveis.

Mostram-se no Quadro 1 os perfis de inactivação, conforme determinação por análise da actividade enzimática após períodos crescentes de incubação da enzima com 10 g/1 de naproxeno, conforme descrito acima, para três mutantes lisina — glutamina e para a enzima do tipo selvagem.

Quadro 1

Tempo (min) Actividade residual (%)

	Tipo selvagem	Lys 34 Glu	Lys 81 Glu	Lys 217
0	100	100	100	100
15	79	93	67	87
30	56	81	63	71
45	43	81	54	60
60	34	75	49	53
90	24	68	42	38
120	14	61	25	26
180	6	49	13	15
240	4	38	8	8

Estes resultados são igualmente apresentados na Figura 2.

Métodos analíticos

A esterase de carboxilo é analisada em MOPS 0,1 M (ácido 3-[N-morfolino]-propanossulfónico) de pH 7,5 a 25°C na presença de 0,3 mg de éster metílico de (S)-naproxeno por ml, Tween 80 (MR) a 2$, 1 mg/ml de ASB) (Albumina de soro de bovino). 0 sistema de HPLC usado é constituído por uma coluna de fase inversa (cartuxo Novapak CN Radial Pak da Waters) eluída com acetonitrilo : fosfato 0,03 M (34:66) a pH 3,2 com um caudal de 1,5 ml/min. Os tempos de retenção determinados foram de

6,9 min para o éster metílico e 4,6 min para o naproxeno.

Unidade (U) é definida como a quantidade de enzima que hidrólisa 1 x 10 _moi de éster metílico de (S)-naproxeno por minuto sob as condições especificadas seguidamente.

Exemplo 4

Preparação de esterase de carboxilo a partir de Bacillus subtilis 1-85/pNAPT-7 e Bacillus licheniformis T9.

Cultivou-se Bacillus subtilis 1-85/pNAPT-7 (CBS 673.86) conforme descrito no pedido de Patente Europeia EP-A-233656. Isolou-se a enzima conforme descrito no Exemplo 14 deste pedido de Patente. 0 concentrado da ultrafiltração foi liofilizado. A actividade do produto seco era aproximadamente de 2400 U/g.

Numa outra experiência transformou-se Bacillus licheniformis T9 com pNAPT-7 usando um protocolo conforme descrito em EP-A-253455. Esta estirpe, que é negativa em relação à protease, à o(-amilase e à esporulação, é vantajosa para a fermentação e para a recuperação da esterase de carboxilo. A enzima foi obtida de modo análogo à esterase de Bacillus subtilis 1-85/pNAPT-7 e apresentava uma actividade semelhante. As actividades são determinadas de acordo com os Métodos analíticos do Exemplo 3·

Exemplo 5

Modificação da esterase de carboxilo por formaldeído.

Prepararam-se soluções de esterase de carboxilo (proveniente de Bacillus subtilis 1-85/pNAPT-7 (CBS 673.86)) que continha 40 mg/ml de enzima liofilizada, MOPS (ácido 3-[N-morfolinoj-propanossulfónico) 250 mM de pH 7,5 e concentrações crescentes de formaldeído (0,01 a 10%). As concentrações do agente de modificação são dadas em % v/v da mistura reaccional. Deixaram-se as soluções em repouso a 20°C durante 1 hora. Em seguida, usou-se uma parte da amostra para determinação directa

da actividade enzimática e incubou-se uma parte da enzima em I primeiro lugar com 15 mg/ml de (S)-naproxeno a 40°C durante 1,5' horas antes da determinação da actividade enzimática. Os resultados são dados no Quadro 2.

A actividade residual significa a actividade que fica depois de um certo tratamento químico, em relação à actividade sem tratamento químico. As actividades são determinadas de acordo com os Métodos analíticos do Exemplo 3·

Quadro 2

Formaldeído	Actividade residual após tratamento por formaldeído (em 1)	Actividade residual após tratamento por formaldeído e incubação com naproxeno (em 1o)
0	100	2
0,01	105	7
0,025	99	7
0,05	100	8
0,1	95	20
0,25	93	45
0,5	87	60
1 ,o	64	61
2,5	47	45
5,0	36	41
10,0	11	16
Os resultados	são também apresentados na	Fig. 3· Mostra-se que
a enzima não	tratada é completamente inactivada por incubação
com naproxeno	durante 1,5 horas a 40 C.	0 tratamento da estera
se com formaldeído dá origem a uma perda	parcial de actividade
No entanto, a	enzima modificada, tratada	com concentrações de

formaldeído de 1 % ou mais elevadas, é oompletamente estável na incubação com naproxeno (15 mg/ml) durante 1,5 horas a 40°C.

Exemplo 6

Modificação da esterase de carboxilo com formaldeído

Agitou-se uma solução de esterase de carboxilo (proveniente de Bacillus subtilis 1-85/pNAPT-7 (CBS 673.86)) que continha 10 mg/ml de enzima liofilizada, MOPS 250 mM a pH 7,5 e 25? de formaldeído a 20°C durante uma hora. Submeteu-se a amostra a diálise contra MOPS 100 mM a pH 7,5. Determinou-se a actividade de esterase de acordo com os Métodos analíticos do Exemplo 3; a actividade residual era de 60%.

Exemplo 7

Modificação da esterase de carboxilo com glutaraldeído

Agitou-se uma solução de esterase de carboxilo (proveniente de Bacillus subtilis 1-85/pNAPT-7 (CBS 673-86)) que continha 10 mg/ml de enzima liofilizada, MOPS 250 mM a pH 7,5 e 2% de glutaraldeído a 20°C durante uma hora. Submeteu-se a amostra a diálise contra MOPS 100mM a pH 7,5. Determinou-se a actividade de esterase de acordo com os Métodos analíticos do Exemplo 3; a actividade residual era de 68%.

Exemplo 8

Modificação da esterase de carboxilo com glioxal

Agitou-se uma solução de esterase de carboxilo (proveniente de Bacillus subtilis 1-85/pNAPT-7 (CBS 673.86)) que continha 20 mg/ml de enzima liofilizada, carbonato 250 mM a pH 9,2 e 2% de glioxal a 20°C durante uma hora. Submeteu-se a amostra a diálise contra carbonato 250 mM a pH 9,2. Determinou-se a actividade de esterase de acordo com os Métodos analíticos do Exemplo 3; a actividade residual era de 45%.

Exemplo 9

Modificação da esterase de carboxilo com anidrido succínico

Agitou-se uma solução de esterase de carboxilo (proveniente de Bacillus subtilis 1-85/pNAPT-7 (CBS 673-86)) que continha 10 mg/ml de enzima liofilizada, MOPS 0,5 M a 'pH 8,0 e 0,3% de anidrido succínico a 20°C durante uma hora. Determinou-se a actividade de esterase de acordo com os Métodos analíticos do Exemplo 3; a actividade residual era de 62%.

Exemplo 10

Modificação da esterase de carboxilo com anidrido glutárico

Agitou-se uma solução de esterase de carboxilo (proveniente de Bacillus subtilis 1-85/pNAPT-7 (CBS 673.86)) que continha 10 mg/ml de enzima liofilizada, MOPS 0,5 M a pH 8,0 e 0,3% de anidrido glutárico a 20°C durante uma hora. Determinou-se a actividade de esterase de acordo com os Métodos analíticos do Exemplo 3; a actividade residual era de 72%.

Exemplo 11

Conversão do éster metílico do (R ,S)-naproxeno com a esterase de carboxilo modificada.

Adicionaram-se 300 mg de éster metílico do (R,S)-naproxeno a 10 ml de Tween 80 (R) a 2%. Ajustou-se o pH a 9,0. Em seguida adicionaram-se 5,5 U de enzima modificada, preparada conforme descrito nos Exemplos 6 a 10.

Conservou-se o pH no valor 9,0 por titulação com hidróxido de amónio 2,5 Μ. A reacção foi efectuada a 40°C. 0 grau de conversão foi seguido durante a reacção por HPLC. Como referência usou-se uma conversão com enzima não modificada. Os resultados, apresentados na Figura 4, mostram que as enzimas modificadas alcançam um grau de conversão muito mais elevado do que a enzima não tratada.

Conversão do éster etílico do (R ,S)-diclofop com a esterase de carboxilo modificada por glutaraldeído.

Adicionaram-se 750 mg de éster etílico do (R,S)-diclofop a 25 ml de Tween 80 (R) a 1%. Ajustou-se o pH a 9,0.

Em seguida adicionaram-se 10 U de enzima modificada, preparada conforme descrito no Exemplo 7 com a diferença de que apenas se usaram 0,15% de glutaraldeído. Conservou-se o pH no valor 9,0 por titulação com NaOH 0,1 Μ. A temperatura era de 20°C. 0 grau de conversão foi seguido durante a reacção por HPLC. Como referência usou-se uma conversão com enzima não modificada. Os resultados, apresentados na Figura 5, mostram que a enzima modificada alcança um grau de conversão muito mais elevado do que a enzima não tratada.

Claims

REIVINDICAÇÕES

- 1ã _

Processo para a estabilização de uma esterase de carboxilo de tipo selvagem caracterizado por compreender uma fase de modificação ou de substituição de pelo menos um resíduo de um ácido aminado básico da esterase de carboxilo de tipo selvagem.

- 2§ Processo para a estabilização de uma esterase de carboxilo de tipo selvagem caracterizado por compreender um tratamento da referida esterase de carboxilo de tipo selvagem com um reagente capaz de neutralizar resíduos de ácidos aminados básicos.

- 3§ -

Processo de acordo com a reivindicação 2 ca- racterizado por drido. o referido reagente ser i um aldeído ou um ani- - _ Processo de acordo com a reivindicação 3 ca-

racterizado por o referido aldeído ser seleccionado de entre o grupo constituído por formaldeído, glutaraldeído e glioxal.

- 5ã _

Processo de acordo com a reivindicação 3 caracterizado por o referido anidrido ser anidrido glutárico ou anidrido succínico.

- 6â Processo para a preparação de uma esterase de carboxilo modificada com respeito a esterase de carboxilo de tipo selvagem caracterizado por compreender as fases de modificar o gene que codifica para a referida esterase de tipo selvagem a fim de substituir o codão para pelo menos um resíduo de um ácido aminado básico por um codão de outro resíduo de ácido aminado a fim de obter um gene modificado; e provocar a expressão do gene modificado resultante de modo a produzir a referida esterase de carboxilo modificada.

_ 7â _

Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 6 caracterizado por se obter uma esterase de carboxilo modificada que apresenta propriedades melhoradas em condições de aplicação em comparação com a esterase de carboxilo de tipo selvagem.

5j

Processo de acordo com qualquer das reivindi-, ι

cações 1 a 7 caracterizado por se obter uma esterase de carbo- | ι

xilo modificada que apresenta uma estabilidade melhorada quando contactada com 15 mg/ml de (S)-naproxeno a 40°C durante 1,5 horas, em comparação com a esterase de carboxilo de tipo selvagem .

- 9- Processo de acordo com qualquer das reivindicações 7 ou 8 caracterizado por a referida esterase de tipo selvagem ser codificada por um ADN homólogo em pelo menos 70% do ADN da Figura 1 ou por a referida esterase de carboxilo de j tipo selvagem ser pelo menos 70% homóloga da esterase de carbo-ι xilo de Bacillus subtilis Thai 1-8 e por a referida esterase de j carboxilo modificada diferir da esterase de carboxilo de tipo í

I selvagem em pelo menos um resíduo de um ácido aminado básico > presente na referida esterase de carboxilo de tipo selvagem.

- 10§ Processo de acordo com a reivindicação 9 caracterizado por o referido resíduo de ácido aminado básico ser um resíduo de lisina, arginina ou histidina.

- 11 a _

Processo de acordo com a reivindicação 10 caracterizado por o referido resíduo de ácido aminado básico ser Lys 34, Lys 81 ou Lys 217.

- 12ã Processo de acordo com qualquer das reivindicações 7 a 11 caracterizado por o referido resíduo de ácido a19 minado básico ser substituído por glutamina ou arginina.

- 13- Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 12 caracterizado por a esterase de tipo selvagem ser idêntica ou substancialmente idêntica à esterase de carboxilo que se pode obter a partir de uma estirpe de Bacillus subtilis, de preferência da estirpe Bacillus subtilis Thai 1-8 (CBS 679.85) .

- 14§ Processo para conduzir uma hidrólise estereoespecífica de uma esterase de carboxilo caracterizado por compreender uma fase de fazer contactar o referido éster com uma quantidade de uma esterase de carboxilo modificada quando obtida de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 13 eficaz para provocar a referida hidrólise estereoespecífica.

- 15§ Processo de acordo com a reivindicação 14 caracterizado por se hidrolisar um (R,S)-éster do ácido propiónico substituído em 2, de preferência um éster de naproxeno, ibuprofeno ou diclofop, de modo a obter predominantemente o (S)-ácido enantiomérico correspondente.