PT94066B - Processo para a producao de vectores de adn de cadeia dupla e de um sistema de clonacao compreendendo os referidos vectores - Google Patents

Description

PATENTE DE INVENÇÃO Nq 94 066

NOME: SCRIPPS CLINIC AND RESEARCH FOUNDATION

EPÍGRAFE: Processo para a produção de vectores de ADN de cadeia dupla e de um sistema de clonação compreendendo os referidos vectores

INVENTORES: William D. Huse

Reivindicação do direito de prioridade (ao abrigo do artigo 4q da Convenção de Paris de 20 de Março de 1883) : Estados Uni dos, da América em 16 de Maio de 1989 sob os nSs. 07/353,235 e 07/352,927, 17 de Maio de 1989 sob os n2s. 07/353,241 e 07/ /352,884, 20 de Setembro de 1989 sob os nSs. 07/410,735, 07/ /410,868, 07/410,749 e 07/410,716, 21 de Setembro de 1989 sob o n2. 07/411,058, 4 de Dezembro de 1989 sob ο ηδ. 07/446,333 e 20 de Março de 1990 sob o n2. 07/497,106

027

SCR0286P

PATENTE NP. 94 066

Processo para a produção de vectores de ADN de cadeia dupla e de um sistema de clonação compreendendo os referidos vectores para que

SCRIPPS CLINIC AND RESEARCH FOUNDATION, pretende obter privilégio de invenção em Portugal.

RESUMO presente invento refere-se a um processo para a produção de um vector de expressão de ADN de cadeia dupla, linear, contendo um promotor 5’ terminal controlando a expressão de um primeiro e de um segundo polipéptidos, a partir de um primeiro e de um segundo genes, respectivos, sendo os referidos primeiro e segundo polipéptidos capazes de formar um receptor heterodimérico de especificidade predeterminada, caracterizado por compreender:

(a) o isolamento de uma primeira população diversa, de primeiros genes contendo um gene codificando o referido primeiro polipéptido, sendo a referida primeira população constituída por moléculas de ADN de cadeia dupla, linear, definindo um sitio de restrição reconhecido por uma endonuclease, estando o referido sitio de restrição localizado 5’ terminal em relação aos referidos genes mas 3’ terminal em relação a um promotor controlando a expressão dos referidos genes;

(b) o isolamento de uma segunda população diversa, de segundos genes contendo um gene codificando o referido segundo polipéptido, sendo a referida segunda população constituída por moléculas de ADN de cadeia dupla, linear, definindo o referido

027

SCR0286P

-2sitio de restrição, estando o referido sitio de restrição localizado 3’ terminal em relação aos referidos segundos genes, estando os referidos segundos genes localizados 3’ terminais em relação a um promotor controlando a expressão dos referidos segundos genes;

(c) a clivagem das referidas moléculas de ADN de cadeia dupla, quando presentes nas referidas populações, com a referida endonuclease para produzir fragmentos de restrição possuindo um terminal coesivo e um dos referidos primeiros genes ou um dos referidos segundos genes; e (d) a ligação aleatória dos referidos fragmentos de restrição uns aos outros, através do referido terminal coesivo de cada um, para produzir uma população diversa de vectores de expressão de ADN, linear, de cadeia dupla, possuindo um dos referidos primeiros genes e um dos referidos segundos genes, em tandem, na mesma cadeia de ADN e sob o controlo de um único promotor;

(e) o isolamento de um vector de expressão capaz de exprimir o referido receptor heterodimérico de especificidade predeterminada, a partir . da referida população diversa de vectores de expressão de ADN de cadeia dupla.

presente invento refere-se também a um processo de produção de um sistema de clonação compreendendo os referidos vectores.

027

SCR0286P

-3MEMORIA DESCRITIVA

Campo da invenção presente invento refere-se a um processo para a produção de polímeros com actividade pré-seleccionada.

Antecedentes

Os fenômenos de ligação entre ligandos e receptores desempenham muitos papeis cruciais em sistemas biológicos. Exemplos destes fenómenos são, a ligação de moléculas de oxigénio à desoxi-hemoglobina, para formar a oxi-hemoglobina, e a ligação de um substrato a uma enzima, que actua no referido substrato, tal como a ligação entre uma proteína e uma protease, tal como a tripsina. Exemplos adicionais de fenómenos de ligação biológicos

incluem,	ainda, a ligação de um antigénio a um	anticorpo e a
ligação	do	componente de	complemento C3 ao,	assim	chamado,
receptor	CRI	-
Crê·	-se	também que	muitas drogas e	outros	agentes

terapêuticos estão também dependentes de fenómenos de ligação. Por exemplo, referiu-se que os opiáceos, tais como a morfina, se ligam a receptores específicos no cérebro. Referiu-se que os agonistas e antagonistas de opiáceos competem com drogas, tais como a morfina, por esses sítios de ligação.

Os ligandos, como drogas produzidas pelo homem, tal como a morfina e os seus derivados, e os que estão naturalmente presentes em sistemas biológicos, tais como as endorfinas e as hormonas, ligam-se a receptores que estão, naturalmente, presentes em sistemas biológicos e serão aqui tratados em conjunto. Esta ligação pode conduzir a um número de fenómenos biológicos, incluindo, particularmente, a hidrólise de ligações amida e éster, quando as proteínas são hidrolisadas nos polipéptidos constituintes por uma enzima, tal como a tripsina ou a papaina, ou quando uma gordura é clivada em glicerina e em três ácidos carboxilicos, respectivamente. Adicionalmente, esta ligação pode conduzir â formação de ligações amida e éster na formação de proteínas e de gorduras, bem como à formação de ligações

027

SCR0286P

-4carbono-carbono e carbono-azoto.

Um exemplo de um sistema produtor de receptores em vertebrados é o sistema imunológico. 0 sistema imunológico de um mamífero é um dos sistemas biológicos mais versáteis onde, se podem produzir, provavelmente, mais do que 1,0x10? especificidades de receptor, na forma de anticorpos. De facto, grande parte da pesquisa biológica e médica, contemporânea, é dirigida no sentido de identificar este reportório. Durante a última década, tem-se verificado um aumento dramático na capacidade de aproveitar os efeitos de um vasto reportório imunológico. 0 desenvolvimento da metodologia do hibridoma, por Kohler e Milstein, tem tornado possível produzir anticorpos monoclonais, i.e., uma composição de moléculas de anticorpos de especificidade única a partir do reportório de anticorpos induzidos durante uma imuno-resposta.

Infelizmente, os métodos actuais para gerar anticorpos monoclonais não são capazes de pesquisar eficientemente toda a resposta de anticorpos induzida por um imunogénio particular. Num animal individual existem, pelo menos, 5-10000 clones de células B, diferentes, capazes de gerar anticorpos únicos, em relação a pequenos imunogénios relativamente rigidos, tais como, por exemplo, o dinitrofenol. Adicionalmente, devido ao processo de mutação somática, que se verifica durante a geração da diversidade de anticorpos, pode ser gerado um número essencialmente ilimitado de moléculas de anticorpos únicos. Em contraste com este vasto potencial para anticorpos diferentes, com as actuais metodologias de hibridoma obtêm-se apenas algumas centenas de anticorpos monoclonais, diferentes, por fusão.

Outras dificuldades na produção de anticorpos monoclonais, com a metodologia do hibridoma, incluem a instabilidade genética e a baixa capacidade de produção de culturas de hibridoma. Um dos meios pelo qual a arte tem tentado ultrapassar estes dois últimos problemas, tem sido clonar os genes produtores de imunoglobulina, de um hibridoma particular de interesse, num sistema de expressão procariótico. Ver, por exemplo, Robinson et al., Publicação PCT

027

SCR0286P

-5n2. W0 89/0099; Winter et al., Patente Europeia n2. 0239400;

Reading, Patente dos E.U.A. n2. 4 714 681; e Cabilly et al.. Patente Europeia n2. 0125023.

Verificou-se, recentemente, que o reportório imunológico dos vertebrados contém genes que codificam imunoglobulinas com actividade catalitica. Tramontano et al., Sei.. 234:1566-1570 (1986); Pollack et al., Sei.. 234:1570-1573 (1986); Janda et al., Sei., 231-1188-1191 (1988); e Janda et al., Sei.. 244:437-440 (1989). A presença de, ou a capacidade de induzir o reportórioa produzir, moléculas de anticorpos capazes de catalisar uma reacção química, i.e., de actuarem como enzimas, tinha sido, previamente, postulada, quase há 20 anos, por W. P. Jencks em Catalysis in Chemistry and Enzymology, McGr aw-Hi11, N. Y. (1969).

Crê-se que, uma das razões pela qual a arte não conseguiu isolar, mais cedo, anticorpos catalíticos do reportório imunológico, e o facto de não conseguir isolar, até à data, muitos destes anticorpos, mesmo apôs as descobertas actuais, resulta da incapacidade de testar uma grande porção do reportório quando à actividade desejada. Crê-se que outra razão é a tendência das técnicas de ensaio actualmente disponíveis, tais como a técnica de hibridoma, em relação à produção de anticorpos de afinidade elevada concebidos para participação no processo de neutralização, em oposição à catálise.

Breve sumário da Invenção presente invento proporciona um novo método para o ensaio de uma maior porção, de um reportório de genes conservados, codificando receptores, quanto à presença de receptores com uma actividade pré-seleccionada, do que tem, até agora, sido possível, ultrapassando deste modo os inconvenientes anteriormente mencionados da técnica de hibridoma.

Numa concretização sintetiza-se uma biblioteca de genes conservados, codificando receptores contendo uma porção substancial do reportório de genes conservados, codificando receptores. Em concretizações preferidas, a biblioteca de genes conservados, codificando receptores , contém, pelo menos, cerca

027

SCR0286P

-6de IO*, preferivelmente, pelo menos, cerca de 10^ e, mais preferivelmente, pelo menos cerca de 10^ genes, codificando receptores, diferentes.

A biblioteca de genes pode ser sintetizada por qualquer um de dois métodos, dependendo do material de partida.

Quando o material de partida é uma pluralidade de genes codificando receptores, o reportório é sujeito a duas reacções de extensão com iniciador, distintas. A primeira reacção de extensão com iniciador usa um primeiro iniciador de sintese de polinucleótido capaz de iniciar a primeira reacção, por hibridação com uma sequência de nucleótidos conservada (partilhada por uma pluralidade de genes) no reportório. A extensão do primeiro iniciador produz complementos de homólogos, codificando receptores, conservados, diferentes (cadeias de ácido nucleico, complementar dos genes no reportório).

A segunda reacção de extensão com iniciador produz, usando os complementos como modelo, uma pluralidade de homólogos de ADN conservados, codificando receptores, diferentes. A segunda reacção de extensão com iniciador usa um segundo iniciador de sintese de polinucleótido que é capaz de iniciar a segunda reacção por hibridação com uma sequência de nucleótidos conservada entre uma pluralidade de complementos.

Quando o material de partida é uma pluralidade de complementos dos genes conservados, codificando receptores, sujeita-se o reportório à segunda reacção de extensão com iniciador, descrita acima. Claro que, se estão presentes tanto um reportório de genes conservados codificando receptores, como os seus complementos, podem-se usar ambas as aproximações, em combinação.

Um homólogo de ADN conservado, codificando um receptor, i.e., um gene codificando um receptor capaz de se ligar a um ligando pré-seleccionado, é depois segregado da biblioteca, para produzir o gene isolado. Tipicamente, isto é realizado ligando operativamente, para expressão, uma pluralidade de homólogos de ADN conservados, diferentes, codificando um receptor, da

027

SCR0286P

-7biblioteca, a um vector de expressão. Os vectores de expressão de receptor assim produzidos, são introduzidos numa população de células hospedeiras compatíveis, i.e., células capazes de exprimir um gene ligado, operativamente, ao vector para expressão. Os transformantes são cultivados sob condições adequadas para a expressão do receptor codificado pelo homólogo de ADN codificando o receptor. Os transformantes são clonados e testados quando à expressão de um receptor que se liga a um ligando pré-seleccionado. Podem-se usar quaisquer dos métodos adequados, conhecidos na arte, para detectar a ligação de um ligando a um receptor. Um transformante exprimindo a actividade desejada é, depois, segregado da população para produzir o gene isolado.

Noutra concretização, o presente invento contempla uma biblioteca de genes compreendendo uma mistura isolada de, pelo menos, cerca de 10^, preferivelmente, pelo menos, cerca de 10^ e, mais preferivelmente, pelo menos 10^ homólogos de ADN conservados, codificando receptores, uma pluralidade dos quais partilha um determinante antigénico conservado. Preferivelmente, os homólogos estão presentes num meio adequado para manipulação in vitro. tal como âguã; solução salina tamponada com fosfato e semelhantes, que mantêm a actividade biológica dos homólogos.

É também contemplado um receptor com uma actividade pré-seleccionada, preferivelmente, actividade catalítica, produzido por um processo do presente invento, preferivelmente, um monómero ou um dimero, tal como aqui se descreve.

Breve descrição dos Desenhos

Nos desenhos, que constituem parte da presente descrição:

Figura_____1 Ilustra um diagrama esquemático da molécula de mostrando as principais caracteristicas área, dentro dum circulo, na cadeia pesada representa a região variável (Vq), um polipéptido contendo uma porção biologicamente activa (ligação a ligando) dessa região e um gene codificando esse polipéptido, produzidos pelos processos do presente invento.

imunoglobulina estruturais. A

027

SCR0286P

-8Figura 2A É um esquema em diagrama de uma cadeia H da IgG humana (subclasse IgGl). A numeração é do terminal N, à esquerda, para o terminal C, ã direita. É de notar a presença de quatro domínios, contendo, cada um, uma ligação dissulfureto (S-S) intracadeia, englobando aproximadamente 60 resíduos aminoácidos. 0 símbolo CHO representa carbo-hidrato. A região V da cadeia pesada (H) (V|_|) assemelha-se à região Vj_ por possuir três CDR hipervariãveis (não mostrados).

Figura 28 É um esquema em diagrama de uma cadeia K humana (Painel 1). A numeração é do terminal N, á esquerda, para o terminal C, à direita. É de notar a ligação dissulfureto (S-S) intracadeia, englobando, aproximadamente, o mesmo número de resíduos aminoácidos nos domínios V|_ e 0 Painel 2 mostra as localizações das regiões determinantes da complementaridade (CDR) no domínio V(_. Os segmentos fora das CDR são os segmentos da estrutura (framework).

Figura 5 Ilustra as sequências de aminoácidos das regiões Vh de 19 anticorpos monoclonais de ratinho, com especificidade para a fosforilcolina. A designação HP indica que a proteína é o produto de um hibridoma. 0 restante são proteínas de mieloma. (De Gearhart et al., Nature. 291=29, 1981).

Figura 4 Ilustra os resultados obtidos da amplificação, por PCR, de ARNm, obtido a partir do baço de um ratinho, imunizado com FITC. As faixas R17-R24 correspondem a reacções de amplificação com iniciadores 5’ únicos (2-9, Tabela 1) e com o iniciador 3’ (12, Tabela 1), R16 representa a reacção, por PCR, com o iniciador 5’ contendo inosina (10, Tabela 1) e com o iniciador 3’ (12, Tabela 1). 2 e R9 são os controlos de amplificação; o controlo 2 envolve a amplificação de V^ a partir de um plasmideo (PL.R2) e R9 representa a amplificação das regiões constantes de ARNm de baço, usando iniciadores 11 e 13 (Tabela 1)

Figura__5 As sequências de nucleótidos são clones da biblioteca de ADNc das regiões V^, amplificadas por PCR, em Lambda 2AP. Estão aqui indicadas 110 bases N-terminais e os nucleótidos sublinhados representam a CDR1 (região determinante

027

SCR0286P

-9de complementaridade). As sequências L03, L35, L47 e L48 não puderam ser classificadas em quaisquer subgrupos pré-definidos.

codificando Shine-Dalgarno,

Figura 6 Mostra-se a sequência da inserção de ADN sintética inserida no Lambda ZAP para produzir os vectores de expressão Lambda Zap II (Painel A) e Lambda Zap V|_ (Painel B). As várias caracteristicas para este vector exprimir os homólogos de ADN e V|__, incluem, o sítio de ligação de ribossoma uma sequência lider para dirigir a proteína expressa para o periplasma, tal como é descrito por Mouva et al., J. Biol, Chem.. 255:27, 1980, e vários si tios de enzimas de restrição usados para ligar operativamente os homólogos V^ e Vl ao vector de expressão. A sequência do vector de expressão de V^ contêm, também, uma sequência curta de ácido nucleico que codifica aminoácidos que se encontram, tipicamente, na cadeia pesada das regiões variáveis (esqueleto de V^). Este esqueleto de V|_| está, imediatamente, a montante e na cadeia de leitura correcta, tal como os homólogos de ADN de que estão ligados operativamente nos sitios Xho I e Spe I. Os homólogos de ADN de Vl estão ligados operativamente na sequência V|_ (Painel B) nos sítios das enzimas de restrição Nco I e Spe I e, assim, a região de esqueleto de V^ é deleccionada quando os homólogos de ADN de V_L são ligados operativamente no vector de Vl.

Figura 7 Mostram-se as características principais do vector de expressão bacteriana Lambda Zap II (vector de expressão de V,_|). Mostra-se, no topo, a sequência de ADN sintética da Figura 6, conjuntamente com o promotor de polimerase T3 do Lambda Zap II. Mostra-se a orientação da inserção no Lambda Zap II. Os homólogos de ADN de V)_) estão inseridos nos sitios das enzimas de restrição Xho I e Spe I. 0 ADN de V^ está inserido nos sitios Xho I e Spe I e a leitura por transcrição produz o decapéptido epitopo (tag) que está localizado, imediatamente, 3’ em relação aos sitios de clonação.

Figura 3 Mostram-se as características principais do vector de expressão bacteriana Lambda Zap II Vl (vector de expressão de Vl). Mostra-se, no topo, a sequência sintética da Figura 6,

027

SCR0286P

-10conjuntamente com o promotor de polimerase T3 do Lambda Zap II. Mostra-se a orientação da inserção no Lambda Zap II. Os homólogos de ADN de V(_ estão inseridos no fagomideo que é produzido pelo protocolo de excisão in vivo descrito por Short et al., Nucleic Acids Res. , 16:7583-7600, 1988. Os homólogos de ADN de Vj_ estão inseridos nos sitios de clonação Nco I e Spe I do fagomideo.

Figura__9 Representa-se um vector de expressão bacteriana modificado Lambda Zap II V|_ II. Este vector é construído inserindo esta sequência de ADN sintética,

TGAATTCTAAACTAGTCGCCAAGGAGACAGTCATAATGAA

TCGAACTTAAGATTTGATCAGCGGTTCCTCTGTCAGTATTACTT

ATACCTATTGCCTACGGCAGCCGCTGGATTGTTATTACTC6CTG

TATGGATAACGGATGCCGTCGGCGACCTAACAATAATGAGCGAC

CCCAACCAGCCATGGCCGAGCTCGTCAGTTCTAGAGTTAAGCGGCCG

GGGTTGGTCGGTACCGGCTCGAGCAGTCAAGATCTCAATTCGCCGGCAGCT no Lambda Zap II que tinha sido digerido com as enzimas de restrição Sac I e Xho I. Esta sequência contém a sequência Shine-Dalgarno (sitio de ligação de ribossoma), a sequência lider para dirigir a proteína expressa para o periplãsma e a sequência de ácido nucleico apropriada para permitir que os homólogos de ADN de V|_ se liguem operativamente nos si tios das enzimas de restrição Sac I e Xba I proporcionados por este vector.

Figura___10 Representa-se a sequência do segmento de ADN sintético inserido no Lambda Zap II para produzir o vector de expressão lambda Vl_II. Mostram-se as várias caracteristicas e os vários sitios de reconhecimento de endonucleases de restrição.

Figura_11 Mostram-se os vectores para a expressão de e de Vj_, separadamente ou em combinação. Mostram-se os vários componentes essenciais destes vectores. 0 vector de cadeia leve, ou vector de expressão de Vj_, pode ser combinado com o vector de expressão de para produzir um vector de combinação contendo o V_H e o V_L, ligados, operativamente, para expressão, ao mesmo promotor.

027

SCR0286P

-11Figura 12 Mostram-se as proteínas marcadas, imunoprecipitadas a partir de E. coli, contendo um homólogo de ADN de e de Na faixa 1, mostram-se as proteínas residuais, imunoprecipitadas a partir de E. coli. que não contêm um homólogo de ADN de Vh ou de V|_. A faixa 2 contém a proteína imunoprecipitada a partir de E. coli contendo apenas um homólogo de ADN de V^. Nas faixas 3 e 4, mostra-se a co-migração de uma proteína V^j e de uma proteína Vl , imunoprecipitadas a partir de E. coli. contendo os homólogos de ADN de V^ e de Vl . Na faixa 5 demonstra-se a presença da proteína Vh e da proteína Vl, expressas a partir dos homólogos de ADN de e de Vl, pelas duas espécies de proteína distinguíveis. A faixa 5 contém as proteínas residuais imunoprecipitadas por anticorpos anti-E. coli presentes no fluido ascitico do ratinho.

Figura 13 Mostram-se as fórmulas do análogo do estado de transição (fórmula 1) que induz os anticorpos para hidrólise do substrato de carboxamida (fórmula 2). 0 composto de fórmula 1, contendo um espaçador de glutarilo e um apêndice ligante de N-hidroxissuccinimida, é a forma usada para acoplar o hapteno (fórmula 1) aos transportadores de proteína KLH e BSA, enquanto que o composto de fórmula 3 é o inibidor. A funcionalidade de fosfonamidato é umamimetização das características estereoelectrónicas do estado de transição da hidrólise da ligação amida.

Figura_14 Ilustra-se a amplificação, por PCR, das regiões

Fd e kappa de ARNm de baço de um ratinho imunizado com NPN. A amplificação foi realizada como se descreve no Exemplo 17, usando híbridos de ADNc/ARN obtidos por transcrição inversa do ARNm com iniciador especifico para amplificação das sequências de cadeia leve (Tabela 2) ou de cadeia pesada (Tabela 1). As faixas F1-F8 representam o produto de reacções de amplificação da cadeia pesada com cada um dos oito iniciadores 5* (iniciadores 2-9, Tabela 1) e com o iniciador 3’ único (iniciador 15, Tabela 2). Nas faixas F9-F13 mostram-se as amplificações da cadeia leve (k) com os iniciadores 5’ (iniciadores 3-6, e 12, respectivamente, Tabela 2) e com o iniciador 3’ apropriado (iniciador 13, Tabela 2). Em todas as faixas pode-se observar uma banda de 700 pb

027

SCR0286P

-12indicando a amplificação bem sucedida das regiões Fd e k.

Figura 15 Ilustra-se a pesquisa das bibliotecas de fago para determinar a ligação de antigénio, de acordo com o Exemplo 17C. Testaram-se colheitas de placas, em duplicado, de bibliotecas de expressão de Fab (filtros A, B), da cadeia pesada (filtros E, F) e da cadeia leve (filtros G, H) contra BSA marcado com 125j conjugado com NPN para uma densidade de, aproximadamente, 30 000 placas por prato. Os filtros C e D ilustram a pesquisa secundária, em duplicado, de um teste positivo de um filtro primário A (setas) tal como se discute no texto.

A pesquisa utilizou métodos, de colheita das placas, convencionais·. As células Azuis XL1 infectadas com fago, foram incubadas em pratos de 150 mm, durante 4 h a 372C, e induziu-se a expressão de proteína cobrindo os pratos com filtros de nitrocelulose embebidos em tiogalactosido de isopropilo 10 mM (IPTG) e incubando os pratos a 252C durante 8 h. Obtiveram-se filtros em duplicado durante uma segunda incubação empregando as mesmas condições. Os filtros foram então bloqueados numa solução de 1% de BSA em PBS, durante 1 h antes da incubação, com agitação, a 252C durante 1 h, com uma solução de BSA, marcada com 125i, conjugada com NPN (2x10^ cpm ml“l; concentração de BSA 0,1 M; aproximadamente 15 NPN por molécula de BSA) em 1* de BSA em PBS. 0 fundo foi reduzido por pré-centrifugação de uma solução de reserva de BSA radiomarcada, a 100 000 x g durante 15 minutos, e pré-incubação de soluções com colheitas de placas de pratos contendo bactérias injectadas com um fago sem inserção. Após a marcação, lavaram-se os filtros, repetidamente com PBS/0,05% de Tween 20 antes do desenvolvimento de autorradiografias durante a noite.

Figura_16 Ilustra-se a especificidade da ligação de antigénio, tal como se mostra por inibição competitiva, de acordo com o Exemplo 17C. As colheitas dos filtros de placas positivas foram expostas a 125j_ggA_NpN _na presença de concentrações crescentes do NPN inibidor.

Neste estudo mancharam-se um número de fagos correlacionados

027

SCR0286P

-13com a ligação de NPN, como na figura 15 (cerca de 100 partículas por mancha) directamente nos tapetes bacterianos. 0 prato foi depois coberto com um filtro embebido em IPTG e incubado durante 19 ha 259C. 0 filtro foi depois bloqueado em 1% de BSA em PBS, antes da incubação em 125i-bSA-NPN, como se descreveu anteriormente na Figura 15, com a excepção da inclusão de quantidades variáveis de NPN na solução de marcação. As outras condições e procedimentos foram como na Figura 15. Na figura mostram-se os resultados, em duplicado, para um fago de afinidade moderada. Para quatro outros fagos obtiveram-se resultados similares, com algumas diferenças nas gamas de concentração de inibidor eficazes.

Figura 17 Ilustra-se a caracterização de uma proteína de ligação de antigénio de acordo com o Exemplo 18D. 0 sobrenadante bacteriano, purificado parcialmente, concentrado de um clone, ligando NPN, foi separado por filtração em gel e aplicaram-se aliquotas de cada fracção a placas de microtitulo revestidas com

BSA-NPN. A adição, quer dos anticorpos anti-decapéptido (---) quer dos anticorpos anti-cadeia kappa (-), conjugados com fosfatase alcalina, foi seguida pelo desenvolvimento de cor. A seta indica a posição de eluição de um fragmento Fab conhecido. Os resultados mostram que a ligação de antigénio é uma propriedade de uma proteína de 50 kD contendo ambas as cadeias pesada e leve.

Recolheram-se placas simples de dois clones NPN-positivos (Figura 15) e excisou-se o plasmídeo contendo as inserções de cadeia leve e de cadeia pesada. Inocularam-se culturas de 500 em caldo L, com 3 ml de uma cultura saturada contendo plasmídeos excisados, e incubaram-se durante 4 h a 372C síntese de proteínas foi induzida pela adição de IPTG concentração final de 1 mM e as culturas foram incubadas 10 ha 259C. Concentraram-se 200 ml de sobrenadante de até 2 ml e aplicaram-se a uma coluna T5K-G4000. aliquotas de 50 μΐ das fracções eluidas por ELISA.

ml os

A até uma durante células

Testaram-se

Para a análise ELISA, revestiram-se placas de microtitulo

027

SCR0286P

-14com BSA-NPN, com 1 ug/ml, adicionaram-se amostras de 50 ul misturadas com 50 ul de PBS-Tween 20 (0,05%)-BSA (0,1 %) e incubaram-se as placas durante 2 h a 252C. Após lavagem com PBS-Tween 20-BSA, adicionaram-se 50 ul de concentrações apropriadas de um anticorpo de ratinho anti-decapéptido (20) e um anticorpo de cabra anti-cadeia leve kappa de ratinho (Southern Biotech), conjugado com fosfatase alcalina e incubou-se durante 2 h a 252C. Após lavagem adicionaram-se 50 ul de fosfato de p-nitrofenilo (1 mg/ml em tris 0,lM, pH 9,5 contendo MgCl2 50 mM) e incubaram-se as placas durante 15-30 minutos antes da leitura do valor de D0 a 405 nm.

Descrição detalhada da Invenção

A. DEFINIÇÕES

Nucleótido: é uma unidade monomérica de ADN e de ARN consistindo de uma unidade de açúcar (pentose), um fosfato e uma base heterociclica azotada. A base está ligada à unidade açúcar através do carbono glicosidico (carbono 1’ da pentose) e essa combinação de base e de açúcar é um nucleósido. Quando o nucleósido contém um grupo fosfato ligado à posição 3’ ou 5’ da pentose, é designado por nucleótido.

Par de bases (pb): é uma associação de adenina (A) com timina (T), ou de citosina (C) com guanina (G) numa molécula de ADN de cadeia dupla. No ARN a timina é substituída por uracilo (U).

Ácido Nucleico: é um polímero de nucleótidos, quer de cadeia simples, quer de cadeia dupla.

Gene: é um ácido nucleico cuja sequência de nucleótidos codifica um ARN ou um polipéptido. Um gene pode ser, quer ARN quer ADN.

Bases_______complementares: são nucleótidos que, normalmente, se emparelham quando o ADN ou o ARN adopta uma configuração de cadeia dupla.

Sequência de nucleótidos complementar: é uma sequência

027

SCR0286P

-15de nucleótidos numa molécula de ADN ou de ARN de cadeia simples que é suficientemente complementar com a de outra cadeia simples para se hibridar especificamente com essa outra cadeia com consequente ligação de hidrogénio.

Conservada = uma sequência de nucleótidos é conservada em relação a uma sequência (de referência) pré-seleccionada se se hibridar não aleatoriamente com um complemento exacto da sequência pré-seleccionada.

Hibridação: é o emparelhamento de sequências de nucleótidos (cadeias de ácido nucleico), substancialmente complementares, para formar um duplex ou um heteroduplex pelo estabelecimento de ligações de hidrogénio entre pares de bases complementares. É uma interacção especifica, i.e., não aleatória, entre dois polinucleótidos complementares que pode ser competitivamente inibida.

Análogo de Nucleótido: é um nucleótido de purina ou de pirimidina que difere estruturalmente de A, T, G, C ou U, mas que é suficientemente similar para substituir o nucleótido normal numa molécula de ácido nucleico.

Homólogo de ADN? é um ácido nucleico possuindo uma sequência de nucleótidos conservada, pré-seleccionada, e uma sequência codificando um receptor capaz de se ligar a um ligando pré-seleccionado.

Anticorpo: o termo anticorpo, nas suas várias formas gramaticais, é aqui usado para designar moléculas de imunoglobulina e porções imunologicamente activas de moléculas de imunoglobulina, i.e., moléculas que contêm um sitio de combinação de anticorpos ou paratopo. Exemplos de moléculas de anticorpos são as moléculas de imunoglobulina intactas, moléculas de imunoglobulina substancialmente intactas e porções de uma molécula de imunoglobulina, incluindo as porções conhecidas na arte por Fab, Fab’, F(ab’)2 e F(v).

Sitio de combinação de_____anticorpos: um sítio de combinação de anticorpos é a porção estrutural de uma molécula de

027

SCR0286P

-16anticorpo, constituída por uma região variável de cadeia pesada e de cadeia leve e por uma região hipervariável, que se liga especificamente (imunorreage com) um antigénio. 0 termo imunorreagir, nas suas várias formas, significa a ligação especifica entre uma molécula contendo um determinante antigénico e uma molécula contendo um sitio de combinação de anticorpos, tal como uma molécula de anticorpo inteira ou uma sua porção.

Anticorpo monoclonal: a expressão anticorpo monoclonal, nas suas várias formas gramaticais, refere-se a uma população de moléculas de anticorpo que contém apenas uma espécie de sitio de combinação de anticorpos , capaz de imunorreagir com um antigénio particular. Um anticorpo monoclonal apresenta assim, tipicamente, uma afinidade de ligação única para qualquer antigénio com o qual imunorreage. Deste modo, um anticorpo monoclonal pode conter uma molécula de anticorpo com uma pluralidade de sitios de combinação de anticorpos, cada um imunoespecífico de um antigénio diferente, p.e., um anticorpo monoclonal biespecifico.

B PROCESSOS presente invento contempla um processo de isolamento, de entre um reportório de genes conservados, de um gene codificando um receptor possuindo uma actividade pré-seleccionada, preferivelmente, uma actividade catalítica. 0 receptor pode ser um polipéptido, uma molécula de ARN, tal como um ARN de transferência, um ARN apresentando actividade enzimática, e semelhantes. Preferivelmente, o receptor será um polipéptido capaz de se ligar a um ligando, tal como uma enzima, uma molécula de anticorpo ou uma sua porção imunologicamente activa, um receptor celular ou uma proteína de adesão celular, codificada por um dos membros de uma família de genes conservados, i.e., genes contendo uma sequência de nucleótidos conservada de pelo menos cerca de 10 nucleótidos de comprimento.

Exemplos de famílias de genes conservados são os que codificam as imunoglobulinas, os antigénios, do complexo de histocompatibilidade principal, da classe I ou II, receptores de

027

SCR0286P

-17linfocitos, integrinas e semelhantes.

Um gene pode ser identificado como pertencendo a um reportório de genes conservados usando vários métodos. Por exemplo, pode-se usar um gene isolado como sonda de hibridação, sob condições pouco rigorosas, para detectar outros membros do reportório de genes conservados, presentes no ADN genómico, usando os métodos descritos por Southern, J. Mol. Biol.. 98:503 (1975). Se o gene usado como sonda de hibridação se hibrida com múltiplos fragmentos de endonucleases de restrição esse gene é um membro de uma familia de genes conservados.

Imunoglobulinas

As imunoglobulinas, ou moléculas de anticorpos são uma grande familia de moléculas que inclui vários tipos de moléculas tais como IgD, IgG, IgA, IgM e IgE. A molécula de anticorpo é constituida, tipicamente, por duas cadeias, pesada (H) e leve (L), com uma região variável (V) e uma região constante (C) presentes em cada cadeia. Várias regiões diferentes de uma imunoglobulina contêm sequências conservadas úteis para isolamento de um reportório de imunoglobulina. Resultados extensivos de sequenciação de aminoácidos e de ácidos nucleicos apresentando exemplos de sequências conservadas, foram compilados para moléculas de imunoglobulinas por Kabat et al., em Sequences of Proteins of Immunological Interest. National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987.

A região C, da cadeia H, define o tipo de imunoglobulina particular. Deste modo, a selecção de sequências conservadas, tal como aqui se definem, da região C da cadeia H, resulta na preparação de um reportório de genes de imunoglobulina possuindo membros do tipo de imunoglobulina da região C seleccionada.

A região V das cadeias H ou L compreende, tipicamente, quatro regiões de estrutura (framework)) (FR), cada uma contendo graus relativamente menores de variabilidade, que inclui comprimentos de sequências conservadas. 0 uso de sequências conservadas das regiões de estrutura (framework) FR1 e FR4 (região J) da cadeia V_H é um exemplo de uma concretização

027

SCR0286P

-18preferida e é aqui descrito nos Exemplos. As regiões de estrutura (framework) são, tipicamente, conservadas através de vários ou de todos os tipos de imunoglobulina e, assim, as sequências conservadas ai contidas são particularmente adequadas para a preparação de reportórios com vários tipos de imunoglobulina.

Complexo de Histocompatibilidade Principal complexo de histocompatibilidade principal (MHC) é um grande locus genético que codifica uma extensa família de proteínas que inclui várias classes de moléculas designadas por moléculas MHC da classe I, da classe II ou da classe III. Paul et al., em Fundamental Immunology, Raven Press, NY, pp. 303-378 (1984).

As moléculas MHC da classe I são um grupo polimórfico de antigénios de transplantação representando uma família conservada na qual o antigénio é constituído por uma cadeia pesada e por uma cadeia leve não codificada no MHC. A cadeia pesada inclui várias regiões, designadas por regiões N, Cl, C2, de membrana e citoplásmica. As sequências conservadas úteis no presente invento encontram-se, principalmente, nas regiões N, Cl e C2 e são identificadas como sequências continuas de “resíduos invariantes em Kabat et al., supra.

As moléculas MHC da classe II compreendem uma família conservada de antigénios polimórficos que participam na imuno-resposta e que compreendem uma cadeia alfa e uma cadeia beta. Os genes que codificam a cadeia alfa e beta incluem, cada um, várias regiões que contêm sequências conservadas, adequadas para a produção dos reportórios das cadeias alfa e beta da classe II de MHC. Exemplos de sequências de nucleótidos conservadas incluem as que codificam os resíduos aminoácidos 26-30 da região Al, os resíduos 161-170 da região A2 e os resíduos 195-206 da região de membrana, todas da cadeia alfa. Estão também presentes sequências conservadas nas regiões Bl, B2 e de membrama, da cadeia beta, nas sequências de nucleótidos que codificam os resíduos aminoácidos 41-45, 150-162 e 200-209, respectivamente.

027

SCR0286P

-19Receptores de Linfócito e Antigénios de Superfície Celular

Os linfócitos contêm várias famílias de proteínas nas suas superfícies celulares, incluindo o receptor de células T, o antigénio Thy-1 e numerosos antigénios de superfície de células T, incluindo os antigénios definidos pelos anticorpos monoclonais 0KT4 (leu3), 0KUT5/8 (leu 2), 0KUT3, 0KUT1 (leu 1), OKT 11 (leu5), 0KT6 e 0KT9. Paul, supra nas págs. 458-479.

A designação receptor de células T é um termo usado para uma família de moléculas de ligação de antigénios que se encontram na superfície das células T. 0 receptor de células T, como família, exibe especificidade de ligação polimórfica similar à das imunoglobulinas, na sua diversidade. 0 receptor de células T maduras é constituído por cadeias alfa e beta, cada uma possuindo uma região variável V e uma região constante (C). As semelhanças que o receptor de células T têm em relação às imunoglobulinas em organização genética e em função, mostra que o receptor de células T contém regiões de sequência conservada. Lai et al., Nature. 331:543-546 (1988).

Exemplos de sequências conservadas incluem as que codificam os resíduos aminoácidos 84-90 da cadeia alfa, os resíduos aminoácidos 107-115 da cadeia beta, e os residuos aminoácidos 91-95 e 111-116 da cadeia gama. Kabat et al., supra, p. 279.

Integrinas e Adesinas

As proteínas adesivas envolvidas na ligação de células são membros de uma grande família de proteínas relacionadas, designadas por integrinas. As integrinas são heterodimeros constituídos por uma subunidade beta e por uma subunidade alfa. Membros da família da integrina incluem o receptor de plaquetas de glicoproteinas da superfície celular GpIIb-IIIa, o receptor de vibronectina (VnR), o receptor de fibronectina (FnR) e os receptores de adesão de leucócitos LFA-1, Mac-1, Mo-1 e 60.3. Roushahti et al., Science. 238:491-497 (1987). Os dados das sequências de ácidos nucleicos e de proteínas existem regiões de sequências conservadas nos demonstram que membros destas famílias, particularmente entre a cadeia beta de GpIIb-IIIa, VnR

027

SCR0286P e FnR e entre a subunidade alfa de VnR, Mac-1, LFA-1, FnR e GpIIb-IIIa. Suzuki et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 83=8614-8618, 1986; Ginsberg et al., J. Biol. Chem.. 262:5437-5440,

1987.

A discussão seguinte ilustra o processo do presente invento aplicado ao isolamento de um gene codificando um receptor, conservado, do reportório do gene da imunoglobulina. Esta discussão não deve ser -tomada como limitativa, mas sim como aplicação ilustrativa dos princípios que podem ser usados para isolar um gene de qualquer família de genes conservados, ) codificando receptores relacionados funcionalmente.

Geralmente, o processo combina os elementos seguintes:

1. Isolamento de ácidos nucleicos contendo uma porção substancial do reportório imunológico.

2. Preparação de iniciadores de polinucleótido para a clonação de segmentos de polinucleótido contendo os genes das regiões Vh e V(_ de imunoglobulina.

3. Preparação de uma biblioteca de genes contendo uma pluralidade de genes Vh e V(_ diferentes, a partir do reportório.

4. Expressão dos polipéptidos Vh e Vl num hospedeiro adequado, incluindo hospedeiros procarióticos e eucarióticos, ) quer separadamente, quer na mesma célula e quer no mesmo quer em vectores de expressão diferentes.

5. Pesquisa dos polipéptidos expressos quanto a uma actividade pré-seleccionada, e a segregação de uma combinação de genes codificando Vh e Vj_, identificada pelo processo de pesquisa.

Um anticorpo produzido pelo presente invento assume uma conformação possuindo um sitio de ligação especifico, tal como é evidenciado pela sua capacidade para ser inibido competitivamente, de um ligando pré-seleccionado ou predeterminado tal como um antigénio, um substrato enzimático e similares. Numa concretização, um anticorpo do presente invento forma um sitio de

027

SCR0286P

-21ligação com antigénio que se liga, especificamente, a um antigénio pré-seleccionado para formar um produto de imunoreacção (complexo), possuindo uma ligação suficientemente forte entre o antigénio e o sitio de ligação para o produto de imuno-reacção a ser isolado. Tipicamente, o anticorpo possui uma afinidade ou uma avidez que, geralmente, é superior a 10® , mais usualmente, superior a 10^ e, preferivelmente superior a 10® l-T¹.

Numa outra concretização, um anticorpo do presente invento liga-se a um substrato e catalisa a formação de um produto a partir do substrato. Embora a topologia do sítio de ligação de ligando de um anticorpo catalítico seja provavelmente, . mais importante, para a sua actividade pré-seleccionada, do que a sua afinidade (constante de associação ou pKa) pelo substrato, os presentes anticorpos catalíticos têm uma constante de associação para o substrato pré-seleccionado geralmente superior a 10^ , mais usualmente, superior a 10® ou 10^ e, preferivelmente, superior a 10? M“l.

Preferivelmente, o anticorpo produzido pelo presente invento, é heterodimérico e, deste modo, é constituído, normalmente, por duas cadeias diferentes de polipéptido, que em conjunto assumem uma conformação possuindo uma afinidade de ligação ou uma constante de associação para o anticorpo pré-seleccionado que é diferente, preferivelmente, superior à afinidade ou â constante de associação de qualquer dos polipéptidos sozinho, i.e., os monómeros . Uma ou ambas as cadeias de polipéptido diferentes são derivadas da região variável das cadeias leve e pesada de uma imunoglobulina. Tipicamente, os polipéptidos compreendendo as regiões variáveis leve (Vq) e pesada (Vq) são utilizados conjuntamente para ligação do anticorpo pré-seleccionado.

Um Vq ou um Vq produzido pelo presente invento pode ser activo na forma monomérica bem como em formas muitiméricas, quer homoméricas, quer heteroméricas, preferivelmente, heterodiméricas. Um polipéptido Vq e Vq de ligação a ligandos produzido pelo

027

SCR0286P

-22presente invento pode ser vantajosamente combinado num heterodimero (molécula de anticorpo) para modular a actividade de qualquer um dos polipéptidos ou para produzir uma actividade única do heterodimero. Os polipéptidos de ligação a ligando, individuais, serão designados por Vp e Vp e o heterodimero será designado por molécula de anticorpo.

Contudo, será de notar que um polipéptido de ligação Vp pode conter, para além do Vp, substancialmente toda ou uma porção da região constante da cadeia pesada. Um polipéptido de ligação Vp pode conter, para além do Vp, substancialmente toda ou uma porção da região constante da cadeia leve. Um heterodimero constituído por um polipéptido de ligação Vp, contendo uma porção da região constante da cadeia pesada, e por um polipéptido de ligação Vp, contendo substancialmente toda a região constante da cadeia leve, é designado por fragmento Fab. A produção de Fab pode ser vantajosa em algumas situações, em virtude das sequências adicionais da região constante contidas num Fab, em comparação com um Fy, poderem estabilizar a interacção Vp e Vp. Esta estabilização pode fazer com que o Fab tenha uma maior afinidade pelo antigénio. Adicionalmente, o Fab é mais vulgarmente usado na arte e, assim, existem mais anticorpos disponíveis, comercialmente, que reconhecem especificamente um Fab.

Os polipéptidos individuais Vp e Vp terão, geralmente, menos do que 125 resíduos aminoáeidos, mais usualmente, menos do que cerca de 120 resíduos aminoáeidos, enquanto que terão, normalmente, mais do que 60 resíduos aminoáeidos, usualmente, mais do que cerca de 95 resíduos aminoáeidos, mais usualmente, mais do que cerca de 100 resíduos aminoáeidos. Preferivelmente, o Vp terá entre cerca de 110 e cerca de 125 resíduos aminoáeidos de comprimento, enquanto que o Vp terá entre cerca de 95 e cerca de 115 resíduos aminoáeidos de comprimento.

existirão, 60 a 75

As sequências de resíduos aminoáeidos variarão, grandemente, dependendo do idiotipo particular envolvido. Usualmente pelo menos, duas cisteinas separadas por de cerca de resíduos aminoáeidos e ligadas por uma ligação

027

SCR0286P

-23dissulfureto. Os polipéptidos produzidos pelo presente invento serão normalmente, cópias substanciais de idiotipos das regiões variáveis das cadeias pesada e/ou leve de imunoglobulinas mas, em algumas situações, um polipéptido pode conter mutações aleatórias nas sequências dos resíduos aminoácidos de modo a melhorar vantajosamente a actividade desejada.

Em algumas situações, é desejável proporcionar uma ligação cruzada covalente dos polipéptidos Vp e V[_, que pode ser realizada proporcionando resíduos cisteína no terminal carboxilo. 0 polipéptido será preparado, normalmente, sem as regiões constantes da imunoglobulina, mas contudo, pode-se incluir uma pequena porção da região J como resultado da selecção vantajosa dos iniciadores de sintese de ADN. A região D será normalmente, incluída na cópia do V^.

Noutras situações é desejável proporcionar um ligante de péptido para ligar o V|_ e o V|_|, para formar uma proteína de ligação a antigénio, de cadeia simples, contendo um Vp e um Vç. Esta proteína de ligação a antigénio, de cadeia simples, seria sintetizada como uma única cadeia de proteína. Estas proteínas de ligação a antigénio, de cadeia simples, foram descritas por Bird et al., Science. 242=423-426 (1988). A concepção de regiões de ligantes de péptido adequadas é descrita por Robert Landner na Patente dos E.U.A. n2. 4 704 692.

Este ligante de péptido pode ser concebido como parte das sequências de ácido nucleico contidas no vector de expressão. As sequências de ácido nucleico codificando um ligando de péptido estariam entre os homólogos de ADN de Vp e V[_ e os sitios de endonuclease de restrição usados para ligar operativamente os homólogos de ADN de Vp, e V|_ ao vector de expressão.

Este ligante de péptido pode também ser sequências de ácido nucleico que são parte dos polinucleótido, usados para preparar as várias codificado por iniciadores de bibliotecas de genes. A sequência de ácido nucleico codificando o ligante de péptido pode ser construída por ácidos nucleicos ligados a um dos iniciadores ou a sequência de ácidos nucleicos codificando o

027

SCR0286P

-24ligante de polipeptido pode ser obtido a partir de sequências de ácido nucleico que estão ligadas a vários iniciadores de polipeptido usados para criar as bibliotecas de genes.

Tipicamente, a região do terminal C dos polipéptidos Vh e Vl terá uma maior variedade de sequências do que a do terminal N e, com base na presente estratégia, pode ser ainda modificada para permitir uma variação das cadeias V^ e Vl de ocorrência natural. Pode-se usar um polinucleótido sintético para variar um ou mais aminoácidos numa região hipervariável.

1· Isolamento do Reportório

Para preparar uma composição de ácidos nucleicos contendo uma porção substancial do reportório de genes imunológico, é necessária uma fonte de genes codificando os polipéptidos Vh e/ou Vl- Preferivelmente, a fonte será uma população heterogénea de células produtoras de anticorpos, i.e., linfócitos B (células B), preferivelmente, células B rearranjadas tais como as que se encontram na circulação ou no baço de um vertebrado. (As células B rearranjadas são aquelas nas quais ocorreu a translocação do gene da imunoglobulina, i.e., o rearranjo, tal como é evidenciado pela presença, na célula, de ARNm com os transcritos das regiões V, D e J do gene da imunoglobulina ai localizados, de um modo adjacente ).

Em alguns casos é desejável fazer tender o reportório para uma actividade pré-seleccionada, por exemplo, usando, como fonte de ácido nucleico, células (células fonte) de vertebrados em qualquer um de vários estados de idade, saúde e resposta imunológica. Por exemplo, a imunização repetida de um animal saudável antes da colheita de células B rearranjadas, resulta na obtenção de um reportório enriquecido em material genético produzindo um polipeptido, que se liga a ligandos, de elevada afinidade. Inversamente, a colheita de células B rearranjadas de um animal saudável,cujo sistema imunológico não foi recentemente desafiado, resulta na produção de um reportório que não está vocacionado em relação à produção de polipéptidos e/ou Vl de elevada afinidade.

027

SCR0286P

-25Será de notar que quanto maior for a heterogeneidade genética da população de células a partir das quais se obtêm os ácidos nucleicos, maior será a diversidade do reportório imunológico que ficará disponível para pesquisa, de acordo com o método do presente invento. Assim, as células de diferentes indivíduos, particularmente, de indivíduos possuindo uma diferença de idade imunologicamente significativa, e as células de indivíduos de diferentes estirpes, raças ou espécies, podem ser vantajosamente combinadas para aumentar a heterogeneidade do reportório.

com um procura

Assim, numa concretização preferida, as células de fonte são obtidas a partir de um vertebrado, preferivelmente, de um mamífero, que foi imunizado ou parcialmente imunizado ligando antigénico (antigénio) contra o qual se actividade, i.e., um ligando pré-seleccionado. A imunização pode ser realizada de um modo convencional. Pode-se ir analisando o titulo de anticorpos no animal, para determinar o estado de imunização desejado, estado este que corresponde à quantidade enriquecimento ou de inclinação do reportório desejado, animais parcialmente imunizados recebem apenas, tipicamente, uma imunização e as células são colhidas dos animais logo após se detectar uma resposta. Os animais totalmente imunizados tam um titulo de pico, que é atingido com uma ou mais repetidas do antigénio no mamífero hospedeiro, normalmente com intervalos de 2 a 3 semanas. Usualmente, três a cinco dias após o último desafio, o baço é removido e o reportório genético dos esplenocitos, cerca de 90% dos quais são células B é isolado usando procedimentos convencionais.

de

Os apreseninjecções rearranjadas, Ver Current

Protocols in Molecular Biology. Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, NY. Os ácidos nucleicos codificando os polipéptidos Vj_| e V(_ podem ser obtidos a partir de células produzindo IgA, IgD, IgE, IgG ou IgM, muito preferivelmente, de células produzindo IgM e IgG.

Os processos para a preparação de fragmentos de ADN genómico, a partir dos quais os genes das regiões variáveis de imunoglobulina podem ser clonados como uma população diversa, são

027

SCR0286P

-26benri conhecidos na arte. Ver, por exemplo, Herrmann et al. ,

Methods_____In Enzymol., 152:180-183, (1987); Fri scha uf, Methods In

Enzymol.. 152:183-190 (1987); Frischauf, Methods In_Enzymol..

152:190-199 (1987); e DiLella et al., Methods In Enzymol.. 152:199-212 (1987). (Os ensinamentos das referências aqui citadas são aqui incorporados como referência).

reportôrio de genes desejado pode ser isolado, quer a partir do material genómico contendo o gene exprimindo a região variável quer a partir do ARN mensageiro (ARNm) que representa um transcrito da região variável. A dificuldade em usar o ADN genómico de outras células, que não os linfócitos B não rearranjados, está em justapor as sequências codificando a região variável, quando as sequências estão separadas por intrões. 0(s) fragmento(s) de ARN contendo os exões apropriados tem(têm) de ser isolado(s), os intrões excisados e os exões depois reunidos, na ordem adequada e na orientação adequada. Para a maior parte isto será dificil, pelo que a técnica alternativa usando células B rearranjadas será o método preferido,porque as regiões dos genes de imunoglobulina C, D e J foram translocadas para se tornarem adjacentes, de modo que a sequência é continua (isenta de intrões) para as regiões variáveis completas.

Quando se usa ARNm as células serão lisadas sob condições de inibição da ribonuclease. Numa concretização, o primeiro passo consiste em isolar o ARNm celular total, por hibridação com uma coluna de oligo-dT-celulose. A presença de ARNm codificando os polipéptidos de cadeia pesada e/ou leve pode, depois, ser avaliada por hibridação, com cadeias simples de ADN, dos genes apropriados. Convenientemente, as sequências codificando a porção constante do Vq e do Vq podem ser usadas como sondas de polinucleótido, sequências estas que podem ser obtidas a partir de fontes disponíveis. Ver, por exemplo, Earlye Hood, Genetic Engi neer ing, Setlow and Hollaender, eds., Vol. 3, Plenum Publishing Corporation, New York, (1981), pages 157-188; e Kabat et al., Sequences of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, MD, (1987). Em concretizações preferidas, a preparação contendo o ARNm celular total é, primeiramente,

027

SCR0286P

-27enriquecida em ARNm codificando e/ou V[_. Tipicamente, o enriquecimento é realizado sujeitando a preparação de ARNm total, ou o seu produto de ARNm parcialmente purificado, a uma reacção de extensão de iniciador empregando um iniciador de sintese de polinucleótido do presente invento.

2- Preparação de iniciadores de polinucleótido termo polinucleótido, tal como é aqui usado em referência a iniciadores, sondas e fragmentos ou segmentos de ácido nucleico, a serem sintetizados por extensão do iniciador, refere-se a uma molécula constituída por dois ou mais desoxirribonucleótidos ou ribonucleótidos, preferivelmente mais do que 3. 0 seu tamanho exacto dependerá de muitos factores, que por sua vez dependem das condições finais de uso.

termo iniciador, tal como é aqui usado, refere-se a um polinucleótido, quer purificado a partir de um digerido de restrição de ácido nucleico quer produzido sinteticamente, que é capaz de actuar como ponto de inicio de sintese quando colocado sob condições nas quais se induz a sintese de um produto de extensão de iniciador, que é complementar a uma cadeia de ácido nucleico, i.e., na presença de nucleótidos e de um agente para polimerização, tal como ADN-polimerase, transcriptase inversa e similares, e a uma temperatura e a um pH adequados. Preferivelmente, o iniciador é de cadeia simples, para uma eficiência máxima mas, alternativamente, pode ser de cadeia dupla. Se for de cadeia dupla, o iniciador é tratado, em primeiro lugar, para separar as suas cadeias, antes de ser usado para preparar produtos de extensão. Preferivelmente, o iniciador é um polidesoxirribonucleótido. 0 iniciador tem de ser suficientemente longo para iniciar a sintese de produtos de extensão na presença dos agentes para a polimerização. Os comprimentos exactos dos iniciadores dependerão de muitos factores, incluindo a temperatura e a fonte de iniciador. Por exemplo, dependendo da complexidade da sequência desejada, o iniciador de polinucleótido contém, tipicamente, 15 a 25, ou mais, polinucleótidos, ainda que possa conter menos nucleótidos. As moléculas iniciadoras curtas

027

SCR0286P

-28requerem, geralmente, temperaturas mais frias para formar complexos hibridos suficientemente estáveis com o molde.

Os iniciadores aqui usados são seleccionados para serem substancialmente complementares com as diferentes cadeias de cada sequência especifica a ser sintetizada ou amplificada. Isto significa que o iniciador tem de ser suficientemente complementar para se hibridar não aleatoriamente com a sua cadeia molde respectiva. Deste modo, a sequência de iniciador pode não reflectir a sequência exacta do molde. Por exemplo, um fragmento de nucleótidos não complementares pode estar ligado à extremidade 5’ do iniciador, sendo o restante da sequência de iniciador substancialmente complementar com a cadeia. Estes fragmentos não complementares codificam, tipicamente, um sitio de restrição de endonuclease. Alternativamente, bases não complementares ou sequências mais compridas podem ser intercaladas no iniciador, a sequência de iniciador tenha complementaridade com a sequência da cadeia a ser sintetizada ou amplificada, para com ela se hibridar não aleatoriamente e formar, assim, um produto de extensão nas condições de síntese de polinucleótidos.

desde que suficiente

Os iniciadores de polinucleótidos podem ser preparados usando qualquer método adequado, tal como, por exemplo, os métodos do fosfotriéster ou do fosfodiéster; ver Narang et al., Meth. Enzymol.. 68:90, (1979); U.S. Patent N2. 4 356 270; e Brown et al-, Meth. Enzymol., 68:109, (1979).

A escolha de uma sequência de nucleótidos de iniciador depende de factores tais como a distância, no ácido nucleico da região codificando o receptor desejado, o seu sitio de hibridação no ácido nucleico, em relação a qualquer segundo iniciador a ser usado, o número de genes no reportório com os quais se vai hibridar e similares.

Por exemplo, para produzir homólogos de ADN, codificando V_H, por extensão de iniciador, a sequência de nucleótidos de um iniciador é seleccionada para se hibridar com uma pluralidade de genes da cadeia pesada de imunoglobulina num sitio substancial71 027

SCR0286P

-29mente adjacente a uma região de codificação de V_H de modo a obter uma sequência de nucleótidos codificando um polipéptido funcional (capaz de se ligar). Para se hibridar com uma pluralidade de cadeias de ácido nucleico codificando V^ diferentes, o iniciador tem de ser um complemento substancial de uma sequência de nucleótidos conservada entre as diferentes cadeias. Estes sitios incluem sequências de nucleótidos na região constante, qualquer das regiões de estrutura (framework) da região variável, preferivelmente, a terceira região de estrutura, a região lider, a região promotora, a região J e similares.

Os iniciadores do presente invento podem também conter uma sequência de promotor de ARN-polimerase, dependente de ADN, ou o seu complemento. Ver, por exemplo, Krieg et al., Nucleic Acids Research, 12:7057-70 (1984); Studier et al., 189=113-130 (1986);

e Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition,

Maniatis et al., eds. Cold Spring Harbor, NY (1989).

Quando -polimerase, cadeia de se usa um iniciador contendo um promotor de ARNdependente de ADN, o iniciador é hibridado com a

ADN a ser amplificada e a segunda cadeia de polinucleótido do promotor de ARN-polimerase, dependente de ADN, é completada usando um agente indutor, tal como a ADN-polimerase ^{1 de} E. coli ou o fragmento Klenow de ADN-polimerase I de E. coli. 0 polinucleótido de ARN complementar é, então, produzido adicionando uma ARN-polimerase, dependente de ARN. 0 polinucleótido de partida de um polinucleótido de ARN é amplificado alternando-se a produção de um polinucleótido de ARN e de um polinucleótido de ADN.

Se se pretende produzir os homólogos de ADN, codificando V^ e codificando V|_, por amplificação de reacção em cadeia com polimerase (PCR), têm de se usar dois iniciadores para cada cadeia de codificação de ácido nucleico a ser amplificada. 0 primeiro iniciador torna-se parte da cadeia nonsense (menos ou complementar) e hibrida-se com uma sequência de nucleótidos conservada entre as cadeias V^ (mais) no reportório. Para produzir homólogos de ADN codificando V^, os primeiros

027

SCR0286P

-30iniciadores são, deste modo, escolhidos para se hibridarem com (i.e., serem complementares com) regiões conservadas na região 3, na região CHI, na região de articulação, na região CH2, ou na região CH3 de genes de imunoglobulina e similares. Para produzir um homólogo de ADN codificando V[_, os primeiros iniciadores são escolhidos para se hibridarem com (i.e., serem complementares com) uma região conservada na região J ou na região constante de genes de cadeia leve de imunoglobulina e similares. Os segundos iniciadores tornam-se parte da cadeia (mais) de codificação e hibridam-se com uma sequência de nucleótidos conservada entre as cadeias menos. Para produzir os homólogos de ADN codificando V^, os segundos iniciadores são, deste modo, escolhidos para se hibridarem com uma sequência de nucleótidos conservada na extremidade 5’ do gene de imunoglobulina codificando V^, tal como na área codificando a região lider ou a primeira região de estrutura (framework). Será de notar que, na amplificação de ambos os homólogos de ADN codificando e V[_, a sequência de nucleótidos 5’ conservada do segundo iniciador, pode ser complementar de uma sequência adicionada exogenamente usando a desoxinucleotidilo-terminal-transferase tal como é descrito por Loh et al., Sei. Vol 243:217-220 (1989). Um ou ambos os primeiros e segundos iniciadores podem conter uma sequência de nucleótidos definindo um sitio de reconhecimento de endonuclease. 0 sitio pode ser heterólogo do gene de imunoglobulina a ser amplificado e, tipicamente, aparece na extremidade 5’ ou próximo da extremidade 5’ do iniciador.

3. Preparação de uma biblioteca de genes

A estratégia usada para a clonação i.e., para reproduzir, substancialmente, os genes V^ e/ou Vj_ contidos no reportório isolado, dependerá, como é bem conhecido na arte, do tipo, complexidade e pureza dos ácidos nucleicos que constituem o reportório. Outros factores dependerão de se pretender ou não amplificar ou mutar os genes.

Numa estratégia, o objectivo é clonar os genes codificando Vh e/ou V_L de um reportório constituído por cadeias de

027

SCR0286P

-31codificação de polinucleótido, tais como ARNm e/ou a cadeia de sentido (sense strand) de ADN genómico. Se o reportório está na forma de ADN genómico de cadeia dupla, usualmente, ê em primeiro lugar desnaturado, tipicamente, por fusão em cadeias simples. 0 reportório é sujeito a uma primeira reacção de extensão primária por tratamento (contacto) do reportório com um primeiro iniciador de síntese de polinucleótido possuindo uma sequência de nucleótidos pré-seleccionada. 0 primeiro iniciador é capaz de iniciar a primeira reacção de extensão de iniciador, por hibridação com uma sequência de nucleótidos, preferivelmente, com pelo menos cerca de 10 nucleótidos de comprimento e, mais preferivelmente, com pelo menos cerca de 20 nucleótidos de comprimento, conservada no reportório. 0 primeiro iniciador é por vezes aqui designado por iniciador de sentido (sense primer) porque se hibrida com a cadeia de codificação ou de sentido de um ácido nucleico. Adicionalmente, o segundo iniciador é por vezes aqui designado como iniciador anti-sentido(anti-sense primer) porque se hibrida com uma cadeia, de não codificação ou anti-sentido de um ácido nucleico, i.e., uma cadeia complementar de uma cadeia de codificação.

A extensão do primeiro iniciador é realizada misturando primeiro iniciador, predeterminada, com quantidade repor tór io, preferivelmente, uma sua os ácidos nucleicos do preferivelmente, com uma sua quantidade predeterminada, para formar uma mistura reaccional de extensão do primeiro iniciador.

A mistura é mantida sob condições de síntese de polinucleótidos, por um período de tempo, que é, tipicamente, predeterminado, suficiente para a formação de um produto de reacção de extensão do primeiro iniciador, produzindo-se assim uma pluralidade de complementos de homólogos de ADN codificando V(_| diferentes. Os complementos são então sujeitos a uma segunda reacção de extensão de iniciador por tratamento com um segundo iniciador de síntese ae polinucleótido possuindo uma sequência de nucleótidos pré-seleccionada. 0 segundo iniciador é capaz de iniciar a segunda reacção por hibridação com uma sequência de nucleótidos, preferivelmente com pelo menos cerca de 10 nucleótidos de

027

SCR0286P

-32cornpr i mento e, mais pr ef er i velmente , com pelo menos cerca de 20 nucleótidos de comprimento, conservada entre uma pluralidade de diferentes ccntplenentos de genes codificando V^, tais como os produzidos, por exemplo, pela primeira reacção de extensão de iniciador. Isto é realizado misturando o segundo iniciador, preferivelmente uma sua quantidade predeterminada, com os ácidos nucleicos complementares, preferivelmente, com uma sua quantidade predeterminada, para formar uma mistura reaccional de extensão do segundo iniciador. A mistura é mantida sob condições de sintese de polinucleótidos por um periodo de tempo, que ê, tipicamente, predeterminado, suficiente para a formação de um produto da reacção de extensão do primeiro iniciador, produzindo-se assim uma biblioteca de genes contendo uma pluralidade de homólogos de ADN, codificando e/ou Vj_, diferentes.

Pode-se usar, em cada amplificação, uma pluralidade de primeiros iniciadores e/ou uma pluralidade de segundos iniciadores, ou um par individual de primeiro e de segundo iniciador. Em qualquer dos casos, os produtos de amplificação de amplificações usando as mesmas ou diferentes combinações de primeiro e de segundo iniciadores, podem ser combinados para aumentar a diversidade da biblioteca de genes.

Numa outra estratégia, o objectivo é clonar os genes codificando e/ou Vj_ de um reportório proporcionando um complemento de polinucleótido do reportório, tal como a cadeia anti-sentido de ADN genõmico ou o polinucleótido produzido sujeitando o ARNm a uma reacção de transcriptase inversa. Os métodos para produzir estes complementos são bem conhecidos na arte. 0 complemento é sujeito a uma reacção de extensão de iniciador, similar ã reacção de extensão do segundo iniciador, descrita acima, i.e., uma reacção de extensão de iniciador usando um iniciador de síntese de polinucleótido capaz de se hibridar com urna sequência de nuc]eótidosconservada entre uma pluralidade de comprimentos de genes codificando diferentes.

A reacção de extensão de iniciador é realizada usando qualquer método adequado. Geralmente, realiza-se numa solução

027

SCR0286P

-33aquosa tamponada, preferivelmente, a um pH de 7-9, muito pref er i velmente ,<3e cerca de 8. Pr ef er i velmente, mistura-se um excesso molar (para ácido nucleico genómico, usualmente,cerca de 10⁶:l, de iniciador:molde) do iniciador com o tampão, contendo a cadeia de molde. Prefere-se um grande excesso molar para melhorar a eficiência do processo.

arrefecer hibridação

Os trifosfatos de desoxirribonucleótido dATP, dCTP, dGTP e dTTP são, também, misturados com a mistura reaccional de extensão de iniciador (síntese de polinucleótidos) em quantidades adequadas e a solução resultante é aquecida a cerca de 902C-1002C, durante cerca de 1 a 10 minutos, preferivelmente, de 1 a 4 minutos. Após este per iodo de aquecimento, deixa-se a solução até à temperatura ambiente, que é preferível para a do iniciador. À mistura arrefecida adiciona-se um agente apropriado, para induzir ou catalisar a reacção de extensão do iniciador, e deixa-se a reacção ocorrer sob condições conhecidas na arte. A reacção de síntese pode ocorrer a uma temperatura compreendida entre a temperatura ambiente e uma temperatura acima da qual o agente indutor já não funciona eficazmente. Assim, por exemplo, se se usa ADN-polimerase como agente indutor, a temperatura não é, em geral superior a cerca de 402C.

agente indutor pode ser qualquer composto ou sistema que funcionará para realizar a sintese de produtos de extensão de iniciador, incluindo enzimas. Enzimas adequadas para este propósito incluem, por exemplo, a ADN-polimerase de E.çoli, o fragmento Klenow de ADN-polimerase I de E. çoli, a ADN-polimerase T4, outras ADN-polimerases disponíveis, a transcriptase inversa, e outras enzimas, incluindo enzimas estáveis ao calor, que facilitarão a combinação dos nucleótidos de uma maneira adequada para formar os produtos de extensão de iniciador que são complementares com cada cadeia de ácido nucleico. Geralmente, a síntese será iniciada na extremidade 3’ de cada iniciador e prosseguirá na direcção 5’, ao longo da cadeia molde, até a síntese terminar, produzindo-se moléculas de comprimentos diferentes. Podem existir agentes indutores, contudo, que iniciem

027

SCR0286P

a síntese na extremidade 5’ e que prossigam na direcção anterior, usando o mesmo processo como se descreveu acima.

agente indutor pode ser também um composto ou sistema, que funcionará para realizar a síntese de produtos de extensão de iniciadores de ARN, incluindo as enzimas. Em concretizações preferidas, o agente indutor pode ser uma ARN-polimerase dependente de ADN, tal como ARN-polimerase T7, ARN-polimerase T3 ou ARN-polimerase SP6. Estas ARN-polimerases iniciam a síntese de um promotor contido num iniciador do presente invento. Estas polimerases produzem um polinucleótido de ARN complementar. A elevada velocidade de regeneração (“turn-over) da ARN polimerase amplifica o polinucleótido de partida, tal como foi descrito por Chamberlin et al., The Enzymes, ed., P. Boyer, pp 87-108, Academic Press, NY (1982). Outra vantagem da ARN-polimerase T7 consiste em se poderem introduzir mutações na síntese de polinucleótido, substituindo uma porção do ADNc por um ou mais oligodesoxinucleótidos (polinucleótidos) e transcrevendo directamente o molde, parcialmente desajustado tal como anteriormente foi descrito por Joyce et al., NucleicAcid Research, 17:711-722 (1989).

Se o agente indutor é uma ARN-polimerase dependente de ADN e, deste modo, incorpora trifosfatos de ribonucleõtido, misturam-se quantidades suficientes de ATP, CTP, GTP e UTP com a mistura reaccional de extensão de iniciador e a solução resultante é tratada como se descreveu acima.

A cadeia acabada de sintetizar e a sua cadeia de ácido nucleico complementar formam uma molécula de cadeia dupla que pode ser usada nos passos seguintes do processo.

Pode-se usar, vantajosamente, a reacção de extensão do primeiro e/ou do segundo iniciador para incorporar, no receptor, um epitopo pré-seleccionado, útil na detecção e/ou isolamento, imunológicos, de um receptor. Isto é realizado usando um primeiro e/ou segundo iniciador de síntese de polinucleótido ou um vector de expressão, para incorporar uma sequência de resíduos aminoácidos predeterminada na sequência de resíduos aminoácidos do receptor.

027

SCR0286P

-35Após produzir os homólogos de ADN codificando Vq e/ou Vj_, para uma pluralidade de genes codificando V_H e/ou V_L diferentes no reportório, tipicamente, os homólogos são amplificados. Enquanto que os homólogos de ADN codificando Vq e/ou Vj_ podem ser amplificados por técnicas clássicas, tais como a incorporação num vector de replicação autónoma, prefere-se amplificar em primeiro lugar os homólogos de ADN, sujeitando-os a uma reacção em cadeia com polimerase (PCR) antes de os inserir num vector. De facto, em estratégias preferidas as reacções de extensão do primeiro e/ou segundo iniciador, usadas para produzir a biblioteca de genes, são as reacções de extensão do primeiro e do segundo inciador na reacção em cadeia com polimerase.

simultaneamente, numa mistura, as reacções de primeiro e do segundo iniciador acima descritas, compreendendo a síntese de polínucleótidos desnaturação dos polínucleótidos de cadeia dupla métodos e os sistemas para amplificar um homólogo descritos nas Patentes dos E.U.A. n2. 4 683 195 e ní ambas de Mullis et al..

, realizando,
extensão	do
cada ciclo
seguida	da
formados.	Os
de ADN	são
'. 4 683	202,
reacção	de
de segundo
reacção	de
amplificações
le pares	de

Em concretizações amplificação, apenas se iniciadores.

amplificação diferentes, preferidas, para cada usa um par de primeiro e Combinam-se depois os produtos de obtidos de uma pluralidade de cada uma, usando uma pluralidade iniciadores diferentes.

Contudo, o presente invento contempla também a produção de um homólogo de ADN por co-amplificação (usando dois pares de iniciadores) e amplificação multiplex (usando até cerca de 8, 9 ou 10 pares de iniciadores).

Os homólogos de ADN, codificando Vq e V[_, produzidos por amplificação de PCR estão, tipicamente, na forma de cadeia dupla e possuem, numa posição contígua ou adjacente a cada um dos seus terminais, uma sequência de nucleótidos definindo um sitio de restrição de endonuclease. A digestão dos homólogos de ADN,

027

SCR0286P

codificando V^ e Vj_, possuindo sítios de restrição nos seus terminais ou próximo dos seus terminais, com uma ou mais endonucleases apropriados resulta na produção de homólogos com terminais coesivos de especificidade predeterminada. Em concretizações preferidas, o processo de PCR é usado, não apenas para amplificar os homólogos de ADN codificando Vjq e/ou Vl da biblioteca, mas tarrbém, para induzir mutações na biblioteca e proporcionar assim uma biblioteca possuindo uma maior heterogeneidade. Em primeiro lugar, será de notar que o processo de PCR é, ele próprio, inerentemente, mutagénico, devido a uma variedade de factores bem conhecidos na arte. Em segundo lugar, para além da mutação, induzindo variações, descrita na Patente dos E.U.A. n2. 4 683 195 anteriormente referenciada, podem-se usar outras variações de PCR induzindo mutações. Por exemplo, a mistura reaccional de PCR, i.e., as misturas reaccionais combinadas de extensão do primeiro e do segundo iniciador, podem ser formadas com diferentes quantidades de um ou mais dos nucleótidos a serem incorporados no produto de extensão. Sob estas condições, a reacção de PCR prossegue para produzir substituições de nucleótidos no produto de extensão como resultado da escassez de uma base particular. Similarmente, podem-se incorporar quantidades molares dos nucleótidos aproximadamente iguais, na mistura reaccional de PCR inicial, numa quantidade para desempenhar eficientemente, um número X de ciclos e, depois, para submeter a mistura a um número de ciclos em excesso de X, tal como, por exemplo, 2X. Alternativamente, as mutações podem ser induzidas durante a reacção de PCR incorporando, na mistura reaccional, derivados de nucleótido, tais como inosina, que não se encontram, normalmente, nos ácidos nucleicos do reportório que está a ser amplificado. Durante a amplificação subsequente in vivo, o derivado de nucleótido será substituído por um nucleótido substituto induzindo uma mutação pontual.

Expressão de homólogos de ADN de .VH..-e.Zpú._-de_Vl

Os homólogos de ADN, codificando V^ e/ou Vl, contidos na biblioteca produzida pelo método acima descrito podem ser ligados

027

SCR0286P

-37operativamente a um vector para amplificação e/ou expressão.

Tal como é aqui usado, o termo vector refere-se a uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar, entre diferentes ambientes genéticos, outro ácido nucleico ao qual foi operativamente ligada. Um tipo de vector preferido é um epissoma, i.e., uma molécula de ácido nucleico capaz de replicação extra-cromossómica. Os vectores preferidos são aqueles que são capazes de replicação autónoma e/ou expressão de ácidos nucleicos aos quais estão ligados. Os vectores capazes de dirigir a expressão de genes aos quais estão operativamente ligados são aqui designados por vectores de expressão.

A escolha do vector ao qual o homólogo de ADN codificando Vq e/ou V_L está operativamente ligado depende, directamente, como é bem conhecido na arte, das propriedades funcionais desejadas, p.e., de replicação ou de expressão de proteína, e da célula hospedeira a ser transformada, sendo estas limitações inerentes à arte de construir moléculas de ADN recombinante.

Em concretizações preferidas, o vector utilizado inclui um replicão procariótico, i.e., uma sequência de ADN possuindo a capacidade de dirigir a replicação autónoma e a manutenção da molécula de ADN recombinante extra-cromossomicamente numa célula hospedeira procariótica, tal como uma célula hospedeira bacteriana, com ela transformada. Estes replicões são bem conhecidos na arte. Adicionalmente, essas concreti2ações que incluem um replicão procariótico incluem também um gene cuja expressão confere uma vantagem selectiva, tal como resistência a drogas, a um hospedeiro bacteriano com ele transformado. Genes bacterianos, de resistência a drogas, tipicos, incluem os que conferem resistência à ampicilina ou à tetraciclina.

Os vectores que incluem um replicão procariótico podem também incluir um promotor procariótico capaz de dirigir a expressão (transcrição e tradução) dos homólogos codificando e/ou V_L numa célula hospedeira bacteriana, tal como E. _coli, com ele transformada. Um promotor è um elemento de controlo de expressão, formado por uma sequência de ADN, que permite que a

027

SCR0286P

-38ligação de ARN-polimerase e a transcrição ocorram. As sequências de promotor compatíveis com hospedeiros bacterianos são, tipicamente, fornecidas em vectores plasmídeo, contendo sitios de restrição convenientes para inserção de um segmento de ADN, do presente invento. Exemplos típicos destes plasmideos vectores incluem pUC8, pUC9, pBR322 e pBR329, disponíveis nos BioRad Laboratories, (Richmond, CA, E.U.A.) e pPL e pKK223, disponíveis de Pharmacia, (Piscataway, NJ, E.U.A.).

Podem-se também usar vectores de expressão compatíveis com células eucarióticas, preferivelmente, os compatíveis com células de vertebrados. Os vectores de expressão de células eucarióticas são bem conhecidos na arte e estão disponíveis em várias fontes comerciais. Tipicamente, estes vectores são fornecidos contendo os sítios de restrição convenientes para inserção dos homólogos de ADN desejados. Exemplos tipicos destes vectores incluem pSVL e pKSV-10 (Pharmacia), pBPV-l/PML2d (International Biotechnologies, Inc.), e pTDTl (ATCC, N°. 31255).

Em concretizações preferidas, os vectores de expressão de células eucarióticas incluem um marcador de selecção que é eficaz numa célula eucariótica, preferivelmente, um marcador de selecção de resistência a drogas. Um marcador de resistência a drogas preferido é o gene cuja expressão resulta na resistência à neomicina, i.e., o gene da neomicina-fosfotransferase (neo). Southern et al., J.___Mol. Appl, Genet., 1=327-341 (1982).

É também contemplado o uso de vectores de expressão retrovirais para exprimir os genes dos homólogos de ADN codificando e/ou Vj_. Tal como é aqui usado, o termo vector de expressão retroviral refere-se a uma molécula de ADN que inclui uma sequência de promotor derivada da região de repetição terminal longa (LTR) de um genoma de retrovirus.

Em concretizações preferidas o vector de expressão é, tipicamente, um vector de expressão retroviral que é, preferivelmente, incompetente na replicação em células eucarióticas. A construção e o uso de vectores retrovirais foi descrita por Sorge et al., Mol. Cel. Biol., 4=1730-1737 (1984).

027

SCR0286P

-39Uma variedade de métodos foi desenvolvida para ligar operativamente ADN a vectores, via terminais coesivos complementares. Por exemplo, os terminais coesivos complementares podem ser ligados por engenharia genética aos homólogos de ADN codificando V^ e/ou V(_, durante a reacção de extensão de iniciador, pelo uso de um iaiciador de síntese de polinucleótido apropriadamente concebido, como anteriormente se discutiu. 0 vector, e se necessário o homólogo de ADN, é clivado com uma endonuclease de restrição para produzir terminais complementares dos do homólogo de ADN. Os terminais coesivos, complementares do vector e do homólogo de ADN são, depois, ligados operativamente (unidos) para produzir uma molécula de ADN de cadeia dupla uni tár ia.

Em concretizações preferidas, os homólogos de ADN codificando V^ e Vl diversas bibliotecas são combinados aleatoriamente in vitro para expressão policistrónica a partir dos vectores individuais. Isto é, produz-se uma população diversa de vectores de expressão de ADN de cadeia dupla, na qual cada vector exprime, sob o controlo de um único promotor, um homólogo de ADN codificando V^ e um homólogo de ADN codificando Vl, sendo a diversidade da população o resultado de diferentes combinações de homólogos de ADN codificando Vp e/ou Vl- A combinação aleatória in vitro pode ser realizada usando dois vectores de expressão, distintos um do outro, pela localização, em cada um deles de um sitio de restrição comum a ambos. Preferivelmente, os vectores são ADN de cadeia dupla linear, tal como um vector derivado do Lambda Zap, tal como aqui se descreve. No primeiro vector , o sitio está localizado entre urri promotor e um poli-ligante, i.e., 5’ terminal (a montante em relação à direcção de expressão) em relação ao poli-ligante, mas 3’ terminal (a jusante em relação á direcção de expressão). No segundo vector, o poli-ligante está localizado entre um promotor e o sitio de restrição, i.e., o sitio de restrição está localizado 3’ terminal em relação ao poli-ligante, e o poli-ligante está localizado 3’ terminal em relação ao promotor.

Em concretizações preferidas, cada um dos vectores define

027

SCR0286P

-40uma sequência de nucleótidos codificando uma ligação de ribossoma e um lider, estando a sequência localizada entre o promotor e o poli-ligante, mas a jusante (3’ terminal) do sitio de restrição par tilhado)se esse sitio está entre o promotor e o poli-ligante. São também preferidos os vectores contendo um codão de paragem a jusante do poli-ligante, mas a montante de qualquer sitio de restrição partilhado» se esse sítio está a jusante do poli-ligante. 0 primeiro e/ou o segundo vector podem definir também uma sequência de nucleótidos codificando um péptido tag. A sequência tag está localizada, tipicamente a jusante do poli-ligante mas a montante de qualquer codão de paragem que possa estar presente. Em concretizações preferidas, os vectores contêm marcadores seleccionáveis de modo a que a presença de uma porção desse vector, i.e., de um braço lambda particular, possa ser seleccionado a favor ou seleccionado contra. Os marcadores seleccionáveis típicos são bem conhecidos dos peritos na arte. Exemplos destes marcadores incluem genes de resistência a antibióticos, marcadores seleccionáveis geneticamente, supressores de mutação, tais como supressores âmbar e similares. Os marcadores seleccionáveis estão localizados, tipicamente, a montante do promotor e/ou a jusante do segundo sitio de restrição. Em concretizações preferidas, um marcador seleccionável está localizado a montante do promotor no primeiro vector contendo os homólogos de ADN codificando Υμ. Um segundo marcador seleccionável está localizado a jusante do segundo sitio de restrição no vector contendo os homólogos de ADN codificando V|_. Este segundo marcador seleccionável pode ser o mesmo ou diferente do primeiro, desde que, quando os vectores codificando Vj_) e os vectores codificando Vj_ são combinados aleatoriamente através do primeiro sitio de restrição, os vectores resultantes contendo V(_| e V[_ e ambos os marcadores seleccionáveis, possam ser seleccionados.

Tipicamente, o poli-ligante é uma sequência de nucleótidos que define um ou mais, preferivelmente, pelo menos dois, sítios de restrição, cada um único do vector e, preferivelmente, não partilhado pelo outro vector, i.e., se está presente no primeiro

027

SCR0286P

-41vector, não está presente no segundo vector. Os sítios de restrição do poli-ligante estão orientados de modo a permitir a ligação de homólogos de ADN codificando Vq ou V_L no vector na mesma cadeia de leitura que qualquer sequência lider, tag ou de codão de paragem, presente.

A combinação aleatória é realizada ligando homólogos de ADN codificando no primeiro vector, tipicamente, num sitio ou em sítios de restrição no poli-ligante. Similarmente, os homólogos de ADN codificando V|_ são ligados no segundo vector, criando-se assim duas populações diversas de vectores de expressão. Não importa qual é o tipo de homólogo de ADN, i.e., V_H ou V_L que se liga a qual, vector. mas prefere-se, por exemplo, que todos os homólogos de ADN codificando V|_( estejam ligados, quer ao primeiro, quer ao segundo vector e que todos os homólogos de ADN codificando V|_ estejam ligados ao outro do primeiro ou do segundo vector. Os membros de ambas as populações são depois clivados com uma endonuclease no sítio de restrição partilhado, tipicamente, digerindo ambas as populações com a mesma enzima. 0 produto resultante é duas populações diversas de fragmentos de restrição cujos membros de uma têm terminais coesivos complementares com os terminais coesivos dos membros da outra. Os fragmentos de restrição das duas populações são ligados aleatoriamente uns aos outros, i.e., realiza-se uma ligação, interpopulação, aleatória, para produzir uma população diversa de vectores, possuindo, cada um, um homólogo de ADN codificando e codificando Vj_ na mesma cadeia de leitura e sob o controlo do promotor do segundo vector. Claro que se podem efectuar recombinações subsequentes por clivagem no sitio de restrição partilhado, que é, tipicamente, formado de novo, por ligação de membros das duas populações, seguida de re-ligações subsequentes.

A construção resultante é depois introduzida num hospedeiro apropriado para proporcionar amplificação e/ou expressão dos homólogos de ADN codificando e/ou V(_, quer separadamente, quer em combinação. Quando co-expressos no mesmo organismo, quer no mesmo, quer em vectores diferentes, produz-se um Fv funcionalmente activo. Quando se exprimem os polipéptidos ^{e em}

027

SCR0286P

-42organismos diferentes, os polipéptidos respectivos são isolados e depois combinados num meio apropriado para formar um Fv. Os hospedeiros celulares nos quais se introduziu uma construção contendo homólogo de ADN codificando Vp e/ou V^, são aqui referidos como tendo sido transformados ou como transformamtes .

A célula hospedeira pode ser quer procariótica quer eucariótica. As células bacterianas são células hospedeiras procarióticas preferidas e, tipicamente, são uma estirpe de E._ coli tal como, por exemplo, E. coli da estirpe DH5 disponível nos Bethesda Research Laboratories, Inc., Bethesda, MD, E.U.A.. As células hospedeiras procarióticas preferidas incluem células de levedura e de mamifero, preferivelmente, células de vertebrado tais como as de linhas de células de ratinho, de ratazana, de macaco ou humanas.

A transformação de hospedeiros celulares apropriados como uma molécula de ADN recombinante do presente invento é realizada por métodos que, tipicamente, dependem do tipo de vector usado. Em relação à transformação de células hospedeiras procarióticas, ver, por exemplo, Cohen et al., Proceedings National Academy_____of

Science_t USA, Vol. 69, P. 2110 (1972); e Maniatis et al.,

Molecular______Cloning,________a______Laboratory.......Manual . Cold Spring Harbor

Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, E.U.A. (1982). Rm relação à transformação de células de vertebrado com vectores retrovirais contendo ADNr, ver, por exemplo, Sorge et al., Mol.Cell.Biol,, 4:1730-1737 (1984); Graham et al., Virol., 52:456 (1973); e

Wigler et al., Proceedings.....National......AcademyofSciences, USA,

Vol. 76, P. 1373-1376 (1976).

5- Pesquisa para determinar......a.....expressão de polipéptidos _ Vp| e/ou V[_

As células transformadas com sucesso, i.e., as células contendo um homólogo de ADN codificando Υμ, e/ou V^, ligado operativamente a um vector, podem ser identificadas por qualquer técnica adequada, bem conhecida para a detecção da ligação de um receptor a um ligando ou para detectar a presença de um

027

SCR0286P

-43polinucleótido codificando o receptor, preferivelmente, o seu sitio activo. Os ensaios de detecção preferidos incluem aqueles onde a ligação do ligando pelo receptor produz um sinal detectãvel, quer directa, quer indirectamente. Estes sinais incluem, por exemplo, a produção de um complexo, a formação de um produto de reacção catalítica, a libertação ou a incorporação de energia e similares. Por exemplo, podem-se clonar células de uma população sujeita a transformação com um dado ADNr para produzir colónias monoclonais. As células que formam essas colónias podem ser colhidas, lisadas e pode-se examinar o seu conteúdo em ADN quanto à presença do ADNr usando um método tal como o descrito por Southern, J. Mol. Biol., 98:503 (1975) ou por Berent et al. , Biotech. 3:208 (1985).

Para além de pesquisar directamente a presença de um homólogo de ADN codificando V^ e/ou Vl, a transformação bem sucedida pode ser confirmada por métodos imunológicas bem conhecidos, especialmente, quando os polipéptidos V^ e/ou Vl produzidos contêm um epitopo pré-seleccionado. Por exemplo, testam-se amostras de células, suspeitas de terem sido transformadas, quanto à presença do epitopo pré-seleccionado, usando um anticorpo contra o epitopo.

6- Bibliotecas de genes codificando e/ou Vl presente invento contempla uma biblioteca de genes, preferivelmente, produzida por uma reacção de extensão de iniciador ou por uma combinação de reacções de extensão de iniciadores, tal como aqui se descreve, contendo pelo menos cerca de 10^, preferivelmente, pelo menos cerca de 1θ4 e, mais pref er ivelmente, pelo menos, cerca .de 10^ homólogos de ADN diferentes codificando V|_j e/ou V(_ . Os homólogos estão, preferivelmente, numa forma isolada, isto é, substancialmente isenta de materiais tais como, por exemplo, agentes e/ou substratos de reacção de extensão, de iniciador, de segmentos de ADN genómico e similares.

Em concretizações preferidas, uma porção substancial dos homólogos presentes na biblioteca estão ligados operativamente a

027

SCR0286P

-44um vector, preferivelmente, ligados operativamente para expressão a um vector de expressão.

Preferivelmente, os homólogos estão presentes num meio adequado para manipulação in vitro. tal como água, água contendo sais tamponantes e similares. 0 meio deverá ser compatível com a manutenção da actividade biológica dos homólogos. Adicionalmente, os homólogos deverão estar presentes numa concentração suficiente para permitir a transformação de uma célula hospedeira com eles compatível, com frequências razoáveis.

Prefere-se, ainda, que os homólogos estejam presentes em células hospedeiras transformadas com eles compatíveis.

D - Vectores de......expressão presente invento contempla também vários vectores de expressão úteis na realização inter alia dos processos do presente invento, Cada um dos vectores de expressão é um novo derivado do Lambda Zap.

- Lambda Zap II

Lambda Zap II é preparado substituindo o gene Lambda S do vector Lambda Zap pelo gene Lambda S do vector Lambda gtlO, tal como se descreve no Exemplo 6.

- Lambda Zap II Vq

Lambda Zap II Vq é preparado inserindo as sequências de ADN sintético, ilustradas na Figura 6A, no vector Lambda Zap II acima descrito. A sequência de nucleótidos inserida proporciona, vantajosamente, um sitio de ligação de ribossoma (sequência de Shine-Dalgarno) para permitir a imitação adequada da tradução de ARNm em proteína, e uma sequência lider para dirigir eficazmente a proteína traduzida para o periplasma. A preparação do Lambda Zap II Vq é descrita, com mais detalhe, no Exemplo 9, e as suas caracteristicas são ilustradas nas figuras 6A e 7.

3. Lambda ZapII Vq

Lambda Zap II Vq é preparado como se descreve no

027

SCR0286P

Exemplo 12 inserindo, no Lambda Zap II, a sequência de ADN sintético, ilustrada na Figura 68. As caracteristicas importantes do Lambda Zap II V|_ estão ilustradas na Figura 8.

4. Lambda Zap II V|_____II

Lambda Zap II Vj_ II é preparado como se descreve no Exemplo 11, inserindo, no Lambda Zap II, a sequência de ADN sintético, ilustrada na Figura 10.

Os vectores acima descritos são compatíveis com hospedeiros

E.______coli. i.e., podem exprimir, para secreção para o periplasma, proteínas codificadas por genes aos quais foram ligados operativamente para expressão.

Exemplos

Pretende-se que os exemplos seguintes ilustrem mas não limitem o âmbito do presente invento.

1. Se1ecção de polinuc1eótidos

As sequências de nucleótidos codificando CDR’s de proteína de imunoglobulina são altamente variáveis. Contudo, ' existem várias regiões de sequências conservadas que flanqueam os domínios V^· Por exemplo, contêm sequências de nucleõtidos substancialmente conservadas, i.e., sequências que se hibridarão com a mesma sequência de iniciador. Deste modo, construiram-se iniciadores de síntese de polinucleótidos (amplificação) que se hibridam com as sequências conservadas e que incorporam sítios de restrição, no homólogo de ADN produzido, que são adequados para ligar, operativamente, os fragmentos de ADN sintetizados a um vector. Mais especificamente, inseriram-se os homólogos de ADN no vector Lambda Zap II (Stratagene Cloning System, San Diego, CA, E.U.A. ) nos sítios Xho I e EcoR I. Para amplificação dos domínios V|~), o iniciador 3’ (iniciador 12 da Tabela 1) foi concebido para ser complementar com o ARNm na região Em todos os casos, os iniciadores 5’ (iniciadores 1-10, Tabela 1) foram escolhidos para serem complementares com a primeira cadeia de ADNc na região do terminal N conservada (cadeia anti-sentido). Inicialmente a

027

SCR0286P

-46amplificação foi realizada com uma mistura de 32 iniciadores (iniciador 1, Tabela 1) que eram degenerados em cinco posições. 0 ARNm de hibridoma pôde ser amplificado com iniciadores mistos, mas as tentativas iniciais para amplificar o ARNm de baço conduziram a resultados variáveis. Deste modo, compararam-se várias alternativas de amplificação usando os iniciadores 5’ mistos.

A primeira alternativa consistiu em construir iniciadores únicos, oito dos quais se mostram na correspondentes aos membros individuais do lote de i mistos. Os iniciadores individuais 2-9 da Tabela construídos incorporando qualquer dos dois nucleótidos em três das cinco posições degeneradas.

múltiplos Tabela 1, niciadores foram possíveis

A segunda alternativa consistiu em construir um iniciador contendo inosina (iniciador 10, (Tabela 1 ) em quatro das posições variáveis com base no trabalho, publicado, de Takahashi, et al., Proc. Natl.Acad. Sei. (U.S.A.). 82:1931-1935, (1985) e de Ohtsuka et al., J, Biol. Chern., 260: 2605-2608, (1985). Este iniciador tem a vantagem de não ser degenerado e, ao mesmo tempo, minimiza os efeitos negativos de não ajustamento nas posições não conservadas, tal como discutido por Martin et al., Nuc._ Acids Res.. 13:8927 (1985). Contudo, não se sabia se a presença de nucleótidos de inosina resultaria na incorporação de sequências não desejadas nas regiões Vq clonadas. Deste modo, a inosina não foi incluída na única posição que permanece nos fragmentos amplificados após a clivagem dos sítios de restrição. Como resultado, a inosina não estava presente na inserção clonada.

Conceberam-se iniciadores de amplificação Vq, adicionais, incluindo o iniciador 3’ único para serem complementares com uma porção do primeiro domínio da região constante do ARNm de cadeia pesada gama 1 (iniciadores 15 e 16, Tabela 1). Estes iniciadores produzirão homólogos de ADN contendo polínucleótidos, codificando aminoácidos dos domínios Vq e da primeira região constante, da cadeia pesada. Estes homólogos de ADN podem,deste modo,ser usados para produzir fragmentos Fab em vez de um Fy.

027

SCR0286P

-47Como controlo para amplificação, a partir de ARNm de baço ou de hibridoma, construiram-se um conjunto de iniciadores que se hibridam com uma região altamente conservada no gene de cadeia pesada, da região constante de IgG. 0 iniciador 5’ (iniciador 11, Tabela 1) é complementar do ADNc na região 0^2 enquanto que o iniciador 3’ (iniciador 13, Tabela 1) é complementar com o ARNm na região Cjq3. Crê-se que não existiam desajustamentos entre estes iniciadores e os seus moldes.

sequências de nucleótidos codificando as CDR de são variáveis. Contudo, existem conservadas que flanqueiam os as regiões J[_, estrutura

Deste modo, construiram-se se hibridam com as sequências de restrição que permitem fragmentos amplificados no vector pBluescript SK-, cortado com Nco I e Spe I. Para amplificação dos domínios CDR de Vj_, o iniciador 3’ (iniciador 14 na Tabela 1) foi concebido para ser complementar com o ARNm nas regiões Ji_. 0 iniciador 5’ (iniciador 15, Tabela 1) foi escolhido para ser complementar do ADN da primeira cadeia na região do terminal N conservada (cadeia anti-sentido).

altamente sequências incluindo lider/promotor V|_ amplificação que incorporam sitios varias regiões domínios CDR de (framework) V|_ iniciadores conservadas de

V_L e

de e

a clonação de

Concebeu-se um segundo conjunto de iniciadores de amplificação para amplificação dos domínios CDR Vj_, iniciadores 5’ (iniciadores 1-8 na Tabela 2), para serem complementares com o ADNc da primeira cadeia na região do terminal N conservada. Estes iniciadores introduziram também um sítio de endonuclease de restrição Sac I para permitir que o homólogo de ADN de V|_ fosse clonado no vector de expressão Vj_ II. 0 iniciador 3’ de amplificação de Vç (iniciador 9 na Tabela 2) foi concebido para ser complementar com o ARNm nas regiões J_L e para introduzir o sitio de endonuclease de restrição Xba I requerido para inserir o homólogo de ADN de V[_ ^no vector de expressão II (Figura a).

Conceberam-se iniciadores 3’ de amplificação de V|_ adicionais, para se hibridarem com a região constante do ARNm

027

SCR0286P

-48kappa ou lambda (iniciadores 10 e 11 na Tabela 2). Estes iniciadores permitem que se produza um homólogo de ADN, contendo sequências de polinucleótidos codificando os aminoácidos da região constante da cadeia kappa ou lambda. Estes iniciadores tornam possível produzir um fragmento Fab em vez de um Fy.

Pelo menos na Tabela 2, mostram-se os iniciadores usados para a amplificação de sequências de cadeia leve kappa, para construção de Fab. A amplificação com estes iniciadores foi realizada em 5 reacções separadas, cada uma contendo um dos iniciadores 5’ (iniciadores 3-6 e 12) e um dos iniciadores 3’ (iniciador 13). 0 iniciador 3’ restante (iniciador 9) foi usado para construir fragmentos Fy. Os iniciadores 5’ contêm um sitio de restrição Sac I e os iniciadores 3’ contêm um sitio de restrição Xba I.

Pelo menos na Tabela 1, mostram-se os iniciadores usados para amplificação de fragmentos Fd de cadeia pesada, para a construção de Fab. A amplificação foi realizada em oito reacções separadas, cada uma contendo um dos iniciadores 5’ (iniciadores 2-9) e um dos iniciadores 3’ (iniciador 15). Os iniciadores 5’ restantes foram usados para a amplificação numa única reacção e são, quer um iniciador degenerado (iniciador 1) quer um iniciador que incorpora inosina em quatro posições degeneradas (iniciador 10, Tabela 1, e iniciadores 17 e 18, Tabela 2). 0 iniciador 3’ restante (iniciador 14, Tabela 2) foi usado para construir fragmentos Fy. Muitos dos iniciadores 5’ incorporam um sitio Xho I, e os iniciadores 3’ incluem um sitio de restrição Spe I.

Na Tabela 2 mostram-se também os iniciadores de amplificação de V_L concebidos para amplificar regiões variáveis, de cadeia leve, humanas, de ambos os isotipos lambda e kappa.

Todos os iniciadores e polinucleótidos sintéticos aqui usados e que se mostram nas Tabelas 1-4 ou foram adquiridos no Research Genetics em Huntsville, Alabama, E.U.A. ou foram sintetizados num sintetizador de ADN da Applied Biosystems, modelo 381A, usando as instruções do fabricante.

02/ SCR0286P

E| ffi| -p|		OT	ro
ro o. «i-		ο ro	c
•P 03 (0 «-H		η -ο c ro	o
•P CL		ro ρ	χσ o
ro ω e		+> ro	O>X
ρ ό ro		c c	ro c
ro ro		o ro	O -P
o. o ro		ο σι	P -P
oro ro		ro Ο Ό	u_ ro •P P
Ό Ό P		Ή	·—<
ro ro		ro m	O. o
PO Q.		ρ ro	E Ό
ro iro		ro ιο	ro
C O		c ο	P
ω σι xo		GJ ·Η	ro cj
οι ω > -p		σι ro	p cn
ro p^ c		m ο	O i—i
η Ό		Ό CL	CL
			ro
-oro-		* <t	- Ό
ΙΛ > IA	X	ΙΛ	IA
o «ro	=>	E	CM
(4 XO -P (4		p ro	P X
O O> Ρ O	ο	□	O u
n ro ro -o	•ο	ό ro	Ό
ro o > ro		ro c	ro o
mH ·Η «Ή	ο	Ή ·Η	•P «0
o u. ro υ	ira	u η	O -p
•Η -Η Ό ·Ρ	ο	•Ρ O	•p on
c ρ ro c	ro	C C	c ro
>-ι Q. 0) ι-ι	ο	HM Ή	HM ÍM

o	o	ro c	o	o	ri ·;4 U- 4->	•PI ro| ς_ PP
xo	xo		xo		xo		•p ro	•P p
o	o	o	L>		o		p ro p	ro ro o
ro	ro -	xo o	ro		ro		CLU	a-o E-P
o	Ο ro	o«x	o		u		E O	E ro -p
•P	•P	ro c	•P		•P		ro ©x>	(q ro σι p
b-	b- 1—1	O «P	U-		b_		-P	-p ro
•P	•P	•P -P	•P		•P		O PP	ro n o
»—1	p ro	o- ro	P		P		ro	ro-p ro
CL	CL o.	•P P	CL		CL		ro o. ro	ro ac-o
E	E ω	P	E		E		ρ E	p «
ro	ro	CL O	ro		ro		ro o ro	ro o-p o
ro	o	E Ό					Ο.Ό CT	Ο.Ό m xo
ro -P	ro	ro		ro		c	c c P
	-P	P					o-p ro	op ο o«
ro	ro «p	ro co	ro		ro		O 3-P	□ □oro
P	p m	P CT	P		P		•Pp c	•pp P
ro	ro	(0 IP	ro		ro		coro	C O o
CL	CL o	CL	o.		CL		«□Cd	«o cxo ro
		ro					-ρ m	•Ρ P
—	- o	- Ό	—				- c	- σ> ro
tO	Κι Ό	rO	ro		IA		ro xo	ro _jm
	c	rO					=» o	> P o
P	ρ ro	P X	P		P		P	P -C
o	o ro	o <_>	o		O		o ro ro	o o ro c
Ό	x» □	Ό	Ό		Ό		OOP	Ό ό Ρ P
ro	ro	ro o	ro		ro		ro -ρ	ro
•P X-P X	•P xo	P		•P		P O CD	.ρ o ro ro
o =>	o =>	o -P	o >	O=>	0X0 E	οχο ε p
•P	•P	•ρ σι	•H		•H		ρ op o	•P OiP °
c ro	c o	c ro	c	ro	C	o	c ro p x	c π p roxo
IP Ό	Ip Ό	P P	HM	n	HM *	o	IP O CL C	I_t □ Ο.Ό O

LU

CD «X

O <

O

Eh <

H \

O

Eh <

\

O <

<

u \

o

E-<

V) u

<

O	to	to	to	co	co	to	co
O	0	O	O	O	o	O	O
O	0	U	O	O	O	U	O
Η	<	H	<	H	<	Eh	<
U	0	U	u	U	O	O	O
H	H	H	Η H	H Eh	H
0	O	O	O	O	O	O	O
	<	<	<	<	<	<	<
o	O	O	O	o	O	o	0
0	υ	u	O	u	u	u	0
E-i	H	H	H	H	Eh	Eh	Eh
O	U	U	U	U	O	U	0
0	O	H	H	O	o	H	Eh
Η	H	H	H	Η H	Eh	H
0	U	U	O	U U	U	0
0 <	O <	O <	O	ssss
0	u	u	u	u	u	U	0
u	u	u	u	o	u	U	0
H	H	H	H	H	Eh	H	Eh
O	O	O	O	O	O	□	0
0	u	o	u	O	O	U	0
<	<	<	<	<	<	<	<
in	in	in	in	IP	in	tn	in

CM Π ΤΓ in VD r~ co c\

	co	n
			<
		0	0
		0	0
		0	0
		0	0
		0	0
		0	0
		Eh	Eh
		Eh	Eh
		0	0
		0	0
		0	0
		Eh	Η
—		0	0
co		0	0
		Eh	Eh
<		0	0
	—	<	<
Eh	n	0	0
«—·		<	<
0	0	<	<
Eh	0	Eh	Eh
0	<	0	0
<	0	0	0
0	Eh	0	0
0	0	<	<
Eh	0	<	<
0	Eh	0	Eh
P	0	Eh	0
H	Eh	Eh	<
0	<	<	Eh
H	0	2	0
<	0	0	<
H	<	<	<
H	<	Eh	Eh
Eh	0	Eh	Eh
0	0	<	<
0	0	Eh	Eh
<	0	0	0
in	tn	in	in
			<
o	P	CM	ÍN
•H	P	P	rH

	co
	ro 0		to 0 0 0 Eh 0	Eh Eh Eh Eh < < 0 < 0 0 0 0 EH 0
	0	to	0	0
	Eh Eh	0	Eh 0	0 Eh
—	0	Eh	0	<
to	0	<	Eh	<
0	<	0	0	0
0	<	0	<
0	0	0	Eh	0
Eh	Eh	0	Eh	0
0	Eh	Eh	0	<
Eh	Eh	<	0	<
Eh	<	0	<	0
0	0	<	0	<
0	Eh	0	Eh	Eh
Eh	Eh	0	0	0
0	Eh	0		<
0	Eh	0	Eh	E-
Eh	0	0	0	0
<	<	Eh	<	<
Eh	Eh	<	Eh	<
0	0	0	Eh	0
<	<	0	H	0
0	Eh	0	Eh	H
Η	0	<	<	<
0	0	0	<	£h
-	-
m	in	in	in	in
ro	TT	in	\o	r*

027

SCR02B6P

50.

ro|	ra|
o	o
•P	•P
b-	b-
•H	•P
	Ή
Q.	□.
E	E
(0	(0
to	(0
to	(0
P	(4
(0	(0
CL	CL
□	o
o	υ
•H	•H
c	c
	'□
ΙΛ
P _J	P —I
O >	o =>
Ό	n
to ω	co o
•ρ n	•Ρ X3
o = = = = = = =	o
•Ρ O	•Ρ O
C K0	C RO
►—ι t>	n o

	IO|	C0|	to|
1 1	O 1	o	o
C0 (0	•P (0	•P	•P
o c	b_ C	b.	b_
Ρ O	-Ρ O	•P	•P
b_ O	ri O		rp
•P	CL	CL	CL
•P O	Ε O	E	E
cxjra	tO ICO	co	(0
Ε ·Ρ	•P
to cn	co cn	to	co
m	o
(0 (4	C0 P	to	to
(4	P	P	P
(0 (0	(0 co	(0	(0
CL	CL	CL	CL
o	O
O Ό	O O	O	O
u c	ω c	o	υ
•Ρ *P	•Ρ -P	•P	•P
C □	c □	c	c
O Π	<J —1	'□	»□
υ	O
- c	- c o	a	a
Kt -P (0	ΤΛ -Ρ Ό	m	tn
CL	XJ
P _1 Q.	t* _lE	P _l	P —I
02» 10	O > (0	o	o=»
Ό	O rH	o	o
tO (D	to (D	(0 o	to o
•PO m	•Ρ Ο O	•P O	Ρ Ό
O -P	U -P	u	υ
•Ρ O C	•Ρ O C	•Ρ o	•P o
CJtO (0	c n co	c g0	cito
1-4 O-P	•Ί O-P	ι—ι O	tp O

CM

TABELA

o	η η η η n r> n	n
Ei	0 < < < < < <	0
0	0 0 0 0 U < <	0
E	0 O O O 0 0 0	0
<	0 Ε Ε Ε Ε Ε E	E
<	0 0 O 0 0 0 <	E
u		0
o	0 0 0 0 0 < 0	0
<	<<<<<(<<	<
0	0 0 0 0 0 0 0	0
El	0 0 0 0 0 0 0	0
0	0 0 0 0 0 0 0	E
<	<<<<<<<	0
u	0 0 0 0 0 0 <	0
E	Ε Ε Ε Ε Ε E E	<
0	Ei 0 < < < < <	0
E	0 0 0 0 0 0 0	E
Ei	Ε Ε < Ε Ε Ε E	E
0	0 0 0 0 0 E 0	E
0	0 0 0 0 0 0 0	0
E	Ε Ε Ε Ε Ε Ε E	<
0	0000000	0
0	0000000	<
<	<<<<<<<	E
0	0 0 0 0 0 0 0	0
0	0 0 0 Ε Ε Ε E	E
0	0000000	E
E	Ε Ε Ε Ε Ε Ε E	<
E	HEiH<<<<	0
0	0 0 0 0 0 0 0	0
<	<<<<<<<	<
U	0 0 0 0 0 0 0	0
0	0 0 0 0 0 0 0	0
-	» » * * « w *	a
tn	in in in m in m m	in
	_______
•P	*m r> M· ιη Ό p> co	φ

•	*		0
r>	n	0	<
E	E		<
0	0	<	0
0	<	0	E
<	0	0	E
< 0	<	E	0
0	0	E
E	<	E	0
E	0	0	0
0	<	<	E
E	0	0	Et
0	0	<	<
0	<	0	0
E	0	<	Et
E	0	0	0
<	E	E	<
0	0	<	0
E	E	0	<
0	E	E	<
<	<	0	E
0	0	0	E
<	<	E	<
<	<	0	<
0	0	0	0
<	<	<	<
E	E	0	E
0	0	0	0
E	E	0	E>
0	0	E	0
0	0	E	0
0	0	0	0
0	0	<	0
0	0	0	0
0	0	0	0
in	in	in	in
		j_
0	•P	nj	0
<1	fp

CTATTAACTAGTAACGGTAACAGTGGTGCCTTGCCCCA

A» I

SCR0286P

ο xo

L>

(0

C •Η

4J c

o u

o	o	•P |
xo	xo	to
l>	o	O
(0	0	C
o	u	•P
•P Cb.	•P b.	O
•P	-P	Ό
•P	•P	C
a	Q.	Φ
E	E	-P 10
(0	0	C 0
(0	0	Ο T3 CJ 0
(0	0	P O Φ
P	P	Ό C
(0	0	0 φ
a	a	P tn
o	o	φ φ C Ό
o	o	Φ
•P	•P	tn to
c	C	φ Φ
o	*□	Ό «O
	to	U> “ Ή
r\	m	IPl 10
P	P	O p a
o	o	o
Ό	T3	Ό
0	0	0
•P X	•P _J	•P E
O í»	O =>	o φ
•P	•P	•P
c O	C O	c 0
·-— n	i-— Ό	►-< c

CM «

UI m

ex

u	U
<	E-
u	E-	—
u	O	r»	n
o	Ε-
o	υ	U	U
Ε-	U	U	U
υ	E-	Ε-	*C
u	E-	υ	u
u	<	Ε-	Ε-
E-	U	Ο	υ
<	Ε-	<	<
<	υ	u	u
u	*C	u	u
<	U	Ε-	Ε-
μ		υ	υ
u	<	Ht	H
<	U	Ε-	Ε-
Ε-	<	Ο	υ
υ	Ε-	Hl	w
<	Ο	<	<
E-	Ε-	Hl	H
Ε-	υ	H	Hl
υ	u	Ε-	Ε-
U	u	υ	υ
u	u	U	u
<	u	<	<
			e.
in	«Λ	in	tn
in	vo	r»	CD
ρ	•P	^4	rM

027

SCR0286P

-522 Produção de um reportôrio codificando Vq enriquecido____em proteínas que se ligam ao FITC receptores hemocianina isotiocianato de fluoresceina (FITC) foi seleccionado como ligando para a ligação a receptor. Decidiu-se ainda enriquecer, por imunização, o reportôrio de genes imunológicos, i.e., reportórios de genes codificando Vq e Vq, em genes codificando anti-FITC. Isto foi realizado ligando FITC a de lapa Fissureia (KLH) usando as técnicas descritas em Antibodies A Laboratory Manual. Harlow and Lowe, eds., Cold Spring Harbor, New York, E.U.A. (1988). Resumidamente, adicionaram-se 10 miligramas (mg) de hemocianina de lapa Fissurela e 0,5 mg de FITC a 1 ml de tampão contendo carbonato de sódio 0,1 1*1 a pH 9,6, e agitou-se durante 18 a 24 horas a 4 graus C (42C). 0 FITC não ligado foi removido por filtração de gel através de Sephadex G-25.

Preparou-se o conjugado de KLH-FITC para injecção de ratinhos adicionando 100 ug do conjugado a 250 ul de solução salina tamponada com fosfato (PBS). Adicionou-se igual volume de adjuvante de Freund completo e emulsionou-se toda a solução durante 5 minutos. Injectou-se um ratinho 129 6ιχ₊ com 300 ul da emulsão. As injecções foram administradas subcutaneamente, em vários locais, usando uma agulha calibre 21. Duas semanas mais tarde administrou-se uma segunda imunização com KLH-FITC. Esta injecção foi preparada como se segue. Diluiram-se 50 ng de KLH-FITC em 250 ul de PBS e com esta solução de KLH-FITC misturou-se um volume igual de alúmem. 0 ratinho foi injectado intraperitonealmente com 500 ul da solução, usando uma agulha calibre 23. Um mês mais tarde, aos ratinhos, foi administrada uma injecção final de 50 ug do conjugado KLH-FITC diluídos até 200 ul em PBS. Esta injecção foi administrada intravenosamente, na veia lateral da cauda, usando uma agulha de calibre 30. Cinco dias após esta injecção final os ratinhos foram, sacrificados e isolou-se o ARN celular total dos seus baços.

Cultivou-se o hibridoma PCP 8D11, produzindo um anticorpo imuno-específico para o éster de fosfonato, em meio DMEM (Gibco

027

SCR0286P

-53Laboratories Grand Island, New York, E.U.A.) contendo 10 por cento de soro de vitelo fetal, suplementado com penicilina e estreptomicina. Recolheram-se cerca de 5χ10θ células de hibridoma e lavaram-se duas vezes em solução salina tamponada com fosfato. 0 ARN celular total foi preparado a partir destas células de hibridoma isoladas.

3- Preparação de um reportório de genes codificando Vg 0 ARN celular total foi preparado a partir do baço de um no instruções isolamento solução citrato usando único ratinho imunizado com KLH-FITC, como se descreveu Exemplo 2, usando os métodos de preparação de ARN descritos por Chomczynski et al., Anal Biochem., 162=156-159 (1987) usando as do fabricante e o conjunto experimental para de ARN, produzido por Stratagene Cloning Systems, La

Jolla, CA. Resumidamente, imediatamente após a remoção do baço do ratinho imunizado, o tecido foi homogeneizado em 10 ml de uma desnaturante, contendo isotiocianato de guanina 4,0 1*1, de sódio (0,25 M) a pH 7,0 e 2-mercaptoetanol 0,1 M, um homogeneizador de vidro. Com o baço homogeneizado misturou-se 1 ml de solução de acetato de sódio a uma comcentração de 2 1*1 a pH 4,0. Com a solução desnaturante, contendo o baço homogeneizado, misturou-se também um ml de fenol que tinha sido previamente saturado com H2O. A este homogeneizado adicionaram-se 2 ml de uma mistura de clorofórmio:álcool isoamilico (24:1 v/v).

Agitou-se vigorosamente o homogeneizado durante dez segundos e manteve-se em gelo durante 15 minutos. 0 homogeneizado foi depois transferido para um tubo de centrífuga de polipropileno de 50 ml, de parede espessa (Fisher Scientific Company, Pittsburg, PA, E.U.A.). A solução foi centrifugada a 10 000 x g durante 20 minutos a 42C. A fase aquosa superior, contendo ARN, foi transferida para um tubo de centrífuga de polipropileno de 50 ml, novo, e misturada com um volume igual de álcool isopropilico. Esta solução foi mantida a -202C durante pelo menos uma hora para precipitar o ARN. A solução contendo o ARN precipitado foi centrifugada a 10 000 x g durante vinte minutos a 42C. 0 ARN celular total sedimentado foi recolhido e dissolvido em 3 ml da solução desnaturante descrita acima. Ao ARN celular total,

027

SCR0286P

-54ressuspendido, adicionaram-se 3 ml de álcool isopropílico e agitou-se vigorosamente. Esta solução foi mantida a -202C durante pelo menos 1 hora, para precipitar o ARN. A solução, contendo o ARN precipitado, foi centrifugada a 10 000 x g durante de2 minutos a 42C. 0 ARN sedimentado foi lavado uma vez com uma solução contendo etanol a 75%. 0 ARN sedimentado foi seco sob vácuo, durante 15 minutos, e depois suspenso de novo em H₂0 tratada com pirocarbonato de dimetilo (DEPC), (H2O-DEPC).

ARN mensageiro (ARNm) enriquecido em sequências contendo tractos poli A longos foi preparado a partir do ARN celular total usando métodos descritos em Molecular Cloning A Laboratory Manual. Maniatis et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory, New York, E.U.A. (1982). Resumidamente, ressuspendeu-se metade do ARN total, isolado a partir do baço de um único ratinho imunizado, em um ml de H₂O-DEPC e manteve-se a 652C durante cinco minutos. Ao ARN em suspensão adicionou-se um ml de tampão com uma carga de sais duas vezes mais elevada, consistindo de Tris-HCl 100 mM, cloreto de sódio 1 M, ácido etilenodiaminatetraacético dissódico (EDTA) 2,0 mM a pH 7,5 e 0,2% de dodecilsulfato de sódio (SDS) e deixou-se a mistura arrefecer até à temperatura ambiente. Depois, aplicou-se a mistura a uma coluna de oligo-dT (Tipo 2 ou Tipo 3 da Collaborative Research) que tinha sido previamente preparada lavando o oligo-dT com uma solução contendo hidroxido de sódio 0,1 M e EDTA 5 mM e, depois, equilibrando a coluna com H2O-DEPC. 0 eluido foi recolhido num tubo esterilizado de polipropileno e aplicado de novo à mesma coluna após aquecimento do eluido durante 5 minutos a 652C. A coluna de oligo-dT foi depois lavada com 2 ml de tampão com uma elevada carga de sais consistindo de Tris-HCl 50 mM a pH 7,5, cloreto de sódio 500 mM, EDTA 1 mM a pH 7,5 e 0,1% de SDS. A coluna de oligo-dT foi depois lavada com 2 ml de um tampão de médio teor em sais 1 X consistindo de Tris-HCl 50 mM a pH 7,5, cloreto de sódio 100 mM, EDTA 1 mM e 0,1% de SDS. 0 ARN mensageiro foi eluido da coluna de oligo-dT com 1 ml de tampão consistindo de Tris-HCl 10 mM a pH 7,5, EDTA 1 mM a pH 7,5 e 0,05% de SDS. 0 ARN mensageiro foi purificado por extracção desta solução com fenol/clorofórmio,

027

SCR0286P

-55seguida por uma extracção simples com clorofórmio a 100%. 0 ARN mensageiro foi concentrado, por precipitação em etanol, e ressuspendido em H2O-DEPC.

ARN mensageiro isolado pelo processo anterior contém uma pluralidade de polinucleótidos codificando V|_j diferentes, i.e., mais do que cerca de 10^ genes codificando Vp| diferentes.

4. Preparação de um polinucleótido codificando um único -ΪΗ

Os polinucleótidos codificando um único V|_| foram isolados de acordo com o Exemplo 3 com a excepção de o ARN celular total ter sido extraído de células de hibridoma monoclonais preparadas no Exemplo 2. Os polinucleótidos isolados deste modo codificam um único V^.

5· Preparação de homólogo de ADN

Na preparação para amplificação por PCR, o ARNm, preparado de acordo com os exemplos anteriores, foi usado como molde para a sintese de ADNc por uma reacção de extensão de iniciador.

em de do durante 5 até uma

Tipicamente, numa mistura reaccional de transcrição de 50 ul, primeiro lugar, hibridaram-se (temperaram-se) 5-10 ug de ARNm baço ou de hibridoma em água, com 500 ng (50,0 pmole) iniciador 3’ de Vq (iniciador 12, Tabela 1) a 652C, minutos. Subsequentemente, ajustou-se a mistura concentração 1,5 mM de dATP, dCTP, dGTP e dTTP, 40 mM de Tris-HCl a pH 8,0 8 mM de MgCl2, 50 mM de NaCl e 2 mM de espermidina. Adicionou-se transcriptase inversa de virus de leucemia Moloney-Murina (Stratagene Cloning Systems), 26 unidades e manteve-se a solução durante 1 hora a 372C.

A amplificação por PCR foi reali2ada num meio reaccional de 100 ul contendo os produtos de reacção da transcriptase inversa (aproximadamente, 5 ug do híbrido ADNc/ARN), 300 ng de iniciador 3’ de V|_j (iniciador 12 da Tabela 1), 300 ng de cada um dos iniciadores 5’ de Vpj (iniciadores 2-10 da Tabela 1), 200 mM de uma mistura de dNTP, 50 mM de KC1, 10 mM de Tris-HCl pH 8,3, 15 mM de MgCl2, 0,1% de gelatina e 2 unidades de ADN-polimerase Taq. A mistura foi espalhada conjuntamente com óleo mineral e

027

SCR0286P

-56submetida a 40 ciclos de amplificação. Cada ciclo de amplificação envolveu desnaturação a 922C durante 1 minuto, têmpera a 522C durante 2 minutos e síntese de polinucleótidos por extensão de iniciador (elongação) a 722C durante 1,5 minutos. As amostras contendo homólogo de ADN codificando amplificado foram extractadas duas vezes com fenol/clorofórmio, uma vez com clorofórmio, precipitadas com etanol e armazenadas a -702C num meio 10 mM em Tris-HCl, (pH 7,5) e 1 mM em EDTA.

Como se mostra na Figura 3, faixas R17-R24, usando iniciadores 5’ únicos (2-9, Tabela 1) conseguiu-se a síntese e a amplificação, eficientes, do homólogo de ADN codificando Vq a partir de ARNm de baço. Observa-se o ADNc amplificado (homólogo de ADN codificando V^) como uma banda principal com o tamanho esperado (360 pb). As intensidades do fragmento de polinucleótido, codificando V^, amplificado, em cada reacção, parecem ser similares, indicando que todos estes iniciadores são, aproximadamente, igualmente eficientes na iniciação da amplificação. 0 rendimento e a qualidade da amplificação com estes iniciadores eram reprodutíveis. 0 iniciador contendo inosina sintetizou também homólogos de ADN, codificando V^, amplificador, a partir de ARNm de baço, de um modo reprodutível, conduzindo à produção do fragmento com o tamanho esperado, de uma intensidade similar ã de outros ADNc amplificados (Figura 4, faixa R16). Este resultado indicou que a presença de inosina permite também a síntese e a amplificação eficientes do homólogo de ADN, indicando claramente quão úteis são estes iniciadores na geração de uma pluralidade de homólogos de ADN codificando V^. Os produtos de amplificação obtidos a partir dos iniciadores da região constante (iniciadores 11 e 13, Tabela 1) foram mais intensos indicando que a amplificação foi mais eficiente, possivelmente, em virtude de um maior grau de homologia entre o molde e os iniciadores (Figura 4, faixa R9). Com base nestes resultados, construiu-se uma biblioteca de genes codificando a partir dos produtos de oito amplificações, cada uma realizada com um iniciador 5’ diferente. Misturaram-se porções iguais dos produtos de cada reacção de extensão de iniciador e usou-se

027

SCR0286P

-57depois o produto misto para gerar uma biblioteca de vectores contendo homólogos de ADN codificando VhOs homólogos de ADN do V|_ foram preparados a partir do ARNm purificado preparado como descrito acima. Na preparação para amplificação por PCR, o ARNm preparado, de acordo com os exemplos acima, foi usado como molde para a sintese de ADNc. Tipicamente, numa mistura reaccional de transcrição de 50 ul, temperaram-se, em primeiro lugar 5-10 ug de ARNm de hibridorna ou de baço, em agua, com 300 ng (50,0 pmole) do iniciador 3’ de V_L (iniciador 14, Tabela 1), a 652C durante cinco minutos. Subsequentemente ajustou-se a mistura a uma concentração 1,5 mM de dATP, dCTP, dGTP e dTTP, 40 mM de Tris-HCl a pH 8,0, 8 mM de MgCl2, 50 mM de NaCl e 2 mM de espermidina. Adicionaram-se 26 unidades de transcriptase inversa de virus de leucemia Moloney-Murina (Stratagene Cloning Systems) e manteve-se a solução durante 1

hora a 372C.	A amplificação por	PCR foi realizada numa	mistura
reaccional de	100 wl contendo,	aproximadamente, 5 ug	do	híbrido
de ADNc/ARN,	produzido como	se descreveu acima,	300	ng	do
iniciador 3’	de Vl (iniciador 14 da Tabela 1),	300	ng	do
iniciador 5’	de Vl (iniciador	15 da Tabela 1), 200	mM	de	uma
mistura de dNTP, 50 mM de KC1,	10 mM de Tris-HCl, pH	8,3	, 15	mM

de MgCl2, 0,1% de gelatina e 2 unidades de ADN-polimerase Taq. A mistura reaccional foi espalhada conjuntamente com óleo mineral e submetida a 40 ciclos de amplificação. Cada ciclo de amplificação envolveu desnaturação a 922C durante 1 minuto, têmpera a 522C durante 2 minutos e elongação a 722C durante 1,5 minutos. As amostras amplificadas foram extractadas duas vezes com fenol/clorofõrmio, uma vez com clorofórmio, precipitadas em etanol e foram armazenadas a -702C num meio 10 mM em Tris-HCl a pH 7,5 e 1 mM em EDTA.

Inserção de homólogos de ADN em vectores

Na preparação para clonação de uma biblioteca enriquecida em sequências de V^, digeriram-se produtos amplificados por PCR (2,5 mg/30 ul de meio 150 mM em NaCl, 8 mM em Tris-HCl (pH 7,5) 6 mM em MgSO^, 1 mM em DTT, 200 mg/ml de albumina de soro de bovino

027

SCR0286P

-58(BSA)), a 372C, com as enzimas de restrição Xho I (125 unidades) e EcoR I (10 U) e purificaram-se num gel de agarose a 1%. Em experiências de elonação, que requereram uma mistura dos produtos das reacções de amplificação, combinaram-se volumes iguais (50 Ul, concentração de 1-10 ug) de cada mistura reaccional, após amplificação mas antes da digestão de restrição. Após electroforese em gel do ARNm de baço, amplificado por PCR, digerido, excisou-se a região do gel contendo fragmentos de ADN de, aproximadamente, 350 pb, electroeluiu-se para uma membrana de diálise, precipitou-se em etanol e ressuspendeu-se em meio 10 mM em Tris-HCl, pH 7,5 e 1 mM em EDTA, até uma concentração de 10 ng/ul. Ligaram-se, depois, quantidades equimolares do inserido, de um dia para o outro, a 52C, a 1 ug de vector Lambda Zap(^R) II (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA, E.U.A.) previamente cortado por EcoR I e Xho I. Uma porção da mistura de ligação (1 ul) foi empacotada durante 2 horas à temperatura ambiente usando extracto de empacotamento Gigapack Gold (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA, E.U.A.) e o material empacotado foi colocado, em placa, em células hospedeiras Azuis XLl. Determinou-se que a biblioteca consistia em 2x10? homólogos de cora menos do que 30% de produto residual não recombinante.

vector usado acima, o Lambda Zap II, é um derivado do Lambda Zap original (ATCC # 40 298) que mantém todas as características do Lambda Zap original, incluindo 6 sítios de elonação únicos, expressão de proteínas de fusão, e a capacidade de excisar rapidamente o inserido na forma de um fagomideo (Bluescript SK-) mas não tem a mutação SAM 100, permitindo o crescimento em muitas estirpes Não-Sup F, incluindo a Azul XLl. 0 Lambda Zap II foi construído como se descreve em Short et al., Nucleic Acids Res.. 16:7583-7600, 1988, mas substituindo o gene Lambda S contido num fragmento de ADN de 4254 pares de bases (pb) produzido pela digestão do Lambda Zap com a enzima de restrição Ncol. Este fragmento de ADN, de 4254 pb, foi substituído pelo fragmento de ADN de 4254 pb contendo o gene Lambda S, isolado a partir do Lambda gtlO (ATCC # 40 179), após digestão do vector com a enzima de restrição Ncol. 0 fragmento de ADN de 4254 pb,

027

SCR0286P

isolado a partir do lambda gtlO, foi ligado no vector Lambda Zap original, usando ADN-ligase T4 e protocolos convencionais, para estes procedimentos, descritos em Current Protocols in_______Molecular

Biology, Ausubel et al., eds., John Wiley and Sons, New York, E.U.A., 1987.

Na preparação de clonação de uma biblioteca enriquecida em sequências Vl, digeriram-se 2 ug de produtos amplificados por PCR (2,5 mg/30 ul de meio 150 mM em NaCl, 8 mM em Tris-HCl (pH 7,5), 6 mM em MgS04, 1 mM em DTT, 200 mg/ml de BSA) a 372C, com as en2imas de restrição Nco I (30 unidades) e Spe I (45 unidades). Os produtos amplificados por PCR digeridos foram purificados num gel de agarose a 1%, usando a técnica de electroeluição convencional descrita em Molecular Cloning A Laboratory Manual. Maniatis et al., eds., Cold Spring Harbor, New York, E.U.A. (1982). Resumidamente, após electroeluição em gel de produto amplificado por PCR digerido, excisou-se a região do gel contendo o fragmento de ADN, codificando Vl, com o tamanho apropriado, electroeluiu-se para uma membrana de diãlise, precipitou-se com etanol e ressuspendeu-se, até uma concentração final de 10 ng por ml, numa solução contendo 10 mM de Tris-HCl, a um pH de 7,5 e 1 mM de EDTA.

Ligou-se uma quantidade molar igual de ADN, representando uma pluralidade de homólogos de ADN, codificando Vl, diferentes, a um vector fagomideo pBluescript SK- que tinha sido previamente cortado com Nco I e Spe I. Uma porção da mistura de ligação foi transformada, usando as instruções do fabricante, em células competentes Epicuian Coli Azuis XL1 (Stratagene Cloning Systems), La Jolla, CA). Determinou-se que a biblioteca transformante consistia de 1,2 x 10-^ unidades formando colónias/ug de homólogos de Vl, com menos do que 3¾ de produto residual não recombinante.

- Sequenciação___de_____plasmideos____da___biblioteca__de ADNc codificando Vq

Para analisar os clones de fago Lambda Zap II, os clones foram excisados do Lambda Zap para plasmideos, de acordo com as instruções do fabricante (Stratagene Cloning Systems, La Jolla,

027

SCR0286P

-60CA, E.U.A.). Resumidamente, as placas de fago foram nucleadas em pratos de agar e transferidas para tubos de microcentrifugadora estéreis, contendo, 500 ul de um tampão 50 mM de Tris-HCI, a pH 7,5, 100 mM de NaCl, 10 mM de MgSO4, e 0,01¾ de gelatina e 20 ul de clorofórmio.

Para as excisões incubaram-se 200 ul da reserva de fago, 200 ul de células Azuis XLl (A^qq = 1,00) e 1 ul de fago auxiliar R408 (1 x 10¹¹ ufp/ml), a 372C durante 15 minutos. Os plasmideos excisados foram infectados em células Azuis XLl e colocados em pratos de LB, contendo ampicilina. 0 ADN de cadeia dupla foi preparado a partir de células contendo o fagomideo de acordo com os métodos decritos por Holmes et al., Anal, Biochem.. 114:193, (1981). Os clones foram, em primeiro lugar, pesquisados, relativamente ás inserções de ADN, por digestão de restrição, quer com Pvu II, quer com Bgl I e os clones contendo o inserido putativo foram sequenciados, usando transcriptase inversa, de acordo com o método geral descrito por Sanger et al., Proc. Natl.

Acad.___Sei., USA. 74 = 5463-5467, (1977) e com as modificações, específicas deste método, fornecidas nas instruções do fabricante no conjunto experimental de sequenciação com transcriptase inversa, AMV, usando ^Sg-çjAjp, de stratagene Cloning Systems, La

Jolla, CA, E.U.A..

8· Caracterização do reportório de Vp| clonado

Os produtos amplificados que foram digeridos com Xho I e com EcoR I e clonados no Lambda ZAP, resultaram numa biblioteca de ADNc com 9,0 x 10^ ufp. De modo a confirmar que a biblioteca consistia de uma população diversa de homólogos de ADN codificando V|_j, as 120 bases do terminal N de 18 clones, seleccionados ao acaso da biblioteca, foram excisadas e sequenciadas (Figura 5). Para determinar se os clones tinham origem no gene de V^, as sequências clonadas foram comparadas com sequências de V|_| e com sequências de V[_, conhecidas. Os clones exibiram uma homologia de 80 a 90¾ com sequências com origem em cadeias pesadas conhecidas e uma pequena homologia com sequências com origem em cadeias leves, quando comparadas com as sequências

027

SCR0286P

-61disponiveis em Sequences of Proteins of Immunological Interest by Kabot et al., 4th ed., U.S. Dept. of Health and Human Sciences, (1987). Isto demonstra que a biblioteca foi enriquecida na sequência Vq desejada, de preferência relativamente a outras sequências tais como as sequências de cadeia leve.

A diversidade da população foi determinada classificando os clones sequenciados em subgrupos pré-definidos (Figura 5). As sequências de Vq de ratinho são classificadas em onze subgrupos (Figura 5). As sequências de Vq de ratinho são classificadas em onze subgrupos [I (Α,Β,), II (A,B,C), III (A,B,C,D) V (Α,Β)] com base nas sequências de aminoácidos da estrutura descritas em Sequences of Proteins of Immunological Interest por Kabot et al., 4th ed., U.S. Dept. of Health and Human Sciences, (1987); Dildrop, Immunology Today, 5:84, (1984); e Brodeur et al., Eur. J. Immunol.. 14; 922, (1984). A classificação dos clones sequenciados demonstrou que a biblioteca de ADNc continha sequências de Vq de, pelo menos, 7 subgrupos diferentes. Adicionalmente, uma comparação, par a par, da homologia entre os clones sequenciados mostrou que não existiam duas sequências idênticas em todas as posições, sugerindo que a população é variada, na medida em que é possível caracterizá-la por análise e sequência.

Seis dos clones (L 36-50, Figura 5) pertencem à subclasse III B e tinham sequências de nucleótidos muito similares. Isto pode reflectir uma preponderância de ARNm derivado de um ou de vários genes variáveis relacionados em baço estimulado, mas os resultados não permitem pôr de parte a possibilidade de uma tendência no processo de amplificação.

9.	Construção do vector de expressão de Vw
0	critério principal usado	na escolha de	um	sistema	de
vector	foi a necessidade de gerar	o maior número	de	fragmentos
Fab que	pudesse ser pesquisado	directamente.	0	lambda	de

bacteriofago foi seleccionado como vector de expressão por três razões. A primeira, é que o empacotamento in vitro do ADN de fago é o método mais eficiente de re-introduzir ADN nas células de

027

SCR0286P

-62hospedeiro. A segunda razão, é que é possível detectar a expressão de proteína ao nível de placas de fago simples. Por último, a pesquisa de bibliotecas de fago envolve, tipicamente, menos dificuldade com a ligação não especifica. A alternativa, os vectores de clonação de plasmideo são apenas vantajosos na análise de clones após terem sido identificados. Esta vantagem não se perde no presente sistema devido ao uso do lambda Zap, permitindo, deste modo, a excisão de um plasmideo contendo as inserções exprimindo a cadeia pesada, a cadeia leve ou o Fab.

Para exprimir a pluralidade de homólogos de ADN codificando um Vh numa célula hospedeira de E._coli. construiu-se um vector que colocou os homólogos de ADN codificando o Vh na cadeia de leitura apropriada, forneceu um sitio de ligação a ribossomas tal como se descreve em Shine et al., Nature. 254:34, 1975, forneceu uma sequência lider para dirigir a proteína expressa para o espaço periplasmático, forneceu uma sequência de polinucleótidos que codificava um epitopo conhecido (epítopo tag) e forneceu também um polinucleótido que codificava uma proteína espaçadora entre o homólogo de ADN codificando Vh e o polinucleótido codificando o epitopo tag. Construiu-se uma sequência de ADN sintético, contendo todos os polinucleótidos e as caracteristicas anteriores, concebendo segmentos de polinucleótidos de cadeia simples de 20-40 bases que se hibridam, umas com as outras, e formam a sequência de ADN sintético de cadeia dupla que se mostra na Figura 6. Na Tabela 3 mostram-se os polinucleótidos, de cadeia simples, individuais (N^-N^)Os polinucleótidos 2, 3, 9-4’, 11, 10-5’, 6, 7 e 8 foram quinasados adicionando 1 ul de cada polinucleótido (0,1 ug/úl) e 20 unidades de polinucleótido-quinase T4 a uma solução contendo 70 mM de Tris-HCl, a pH 7,6, 10 mM de MgCl₂, 5 mM de DTT, 10 mM de 2 ME e 500 microgramas por ml de BSA. A solução foi mantida a 372C durante 30 minutos e a reacção foi parada mantendo a solução a 65QC durante 10 minutos. Adicionaram-se os dois polinucleótidos restantes, 20 ng de polinucleótidos NI e de polinucleótidos N12, à solução reaccional de quinase, conjuntamente com um volume 1/10 de uma solução contendo 20,0 mM de Tris-HCl, a pH 7,4, 2,0 mM de

027 SCR02B6P

-63MgCl2 ^θ 50,0 mM de NaCl. Esta solução foi aquecida até 709C durante 5 minutos e deixou-se arrefecer até a temperatura ambiente, aproximadamente, 252C, durante 1,5 horas num copo de 500 ml de água. Durante este período de tempo todos os 10 polinucleótidos se ligaram para formar o inserido de ADN sintético, de cadeia dupla, que se mostra na Figura 6A. Os polinucleótidos individuais foram ligados covalentemente uns aos outros, para estabilizar o inserido de ADN sintético, adicionando 40 μ.1 da mistura reaccional anterior a uma solução contendo 50 mM de Tris-HCl, a pH 7,5, 7 mM de MgCl2, 1 mM de DTT, 1 mM de trifosfato de adenosina ATP e 10 unidades de ADN-ligase T4. Esta solução foi mantida a 372C durante 30 minutos e, depois, a ADN-ligase T4 foi desactivada mantendo a solução a 652C durante 10 minutos. Os polinucleótidos restantes foram quinasados misturando 52 ui da mistura reaccional anterior, 4 ul de uma solução contendo 10 mM de ATP e 5 unidades de polinucleótido-quinase T4. Esta solução foi mantida a 372C durante 30 minutos e, depois, a polinucleótido-quinase T4 foi desactivada mantendo a solução a 652C durante 10 minutos. 0 inserido de ADN sintético, completo, foi ligado directamente num vector lambda Zap II que tinha sido previamente digerido com as enzimas de restrição Not I e Xho I. A mistura de ligação foi empacotada, de acordo com as instruções do fabricante, usando extracto de empacotamento Gigapack II Gold disponível dos Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA, E.U.A.. A mistura de ligação empacotada foi colocada em placa em células Azuis XLl (Stratagene Cloning Systems, San Diego, CA, E.U.A.). As placas de lambda Zap II individuais foram nucleadas e os inseridos foram excisados de acordo com o protocolo de excisão in vivo fornecido pelo fabricante, Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA, E.U.A.. Este protocolo de excisão in vivo move o inserido clonado do vector lambda Zap II para um vector de plasmídeo para permitir a fácil manipulação e sequenciação. A exactidão dos passos de clonação anteriores foi confirmada por sequenciação do inserido usando o método do didesoxido de Sanger descrito em Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sei_USA, 74:5463-5467, (1977) e usando as instruções do fabricante no conjunto de sequenciação de ^^S-ATP de transcriptase inversa, AMV, de

027

SCR0286P

-64Stratagene, Cloning Systems, La Jolla, CA, E.U.A.. A sequência do vector de expressão de Vq resultante è mostrada na Figura 6A e na

Figura 7.

NI )

N2)

N3)

N4)

N5)

N6)

N7)

N8)

N9-4)

Nll)

N12)

N10-5)

Tabela 3

5’ GGCCGCAAATTCTATTTCAAGGAGACAGTCAT 3’

5’ AATGAAATACCTATTGCCTACGGCAGCCGCTGGATT 3’

5’ GTTATTACTCGCTGCCCAACCAGCCATGGCCC 3’

5’ AGGTGAAACTGCTCGAGAATTCTAGACTAGGTTAATAG 3’

5’ TCGACTATTAACTAGTCTAGAATTCTCGAG 3’

5’ CAGTTTCACCTGGGCCATGGCTGGTTGGG 3’

5’ CAGCGAGTAATAACAATCCAGCGGCTGCCGTAGGCAATAG 3’ 5’ GTATTTCATTATGACTGTCTCCTTGAAATAGAATTTGC 3’

5’ AGGTGAAACTGCTCGAGATTTCTAGACTAGTTACCCGTAC 3’ 5’ GACGTTCCGGACTACGGTTCTTAATAGAATTCG 3’

5’ TCGACGAATTCTATTAAGAACCGTAGTC 3’

5’ CGGAACGTCGTACGGGTAACTAGTCTAGAAATCTCGAG 3’

10. Construção do vector de expressão de V|_

Para exprimir a pluralidade de polínucleótidos codificando um V[_ numa célula hospedeira de E. col i. construiu-se um vector, que colocou o polinucleótido codificando o V|_ na cadeia de leitura apropriado, forneceu um sitio de ligação a ribossomas tal como se descreve em Shine et al., Nature. 254:34, (1975), forneceu uma sequência lider que dirige a proteína expressa para o espaço periplasmático e forneceu também um polinucleótido, que codificava uma proteína espaçadora, entre o polinucleótido de V|_ e o polinucleótido codificando o epitopo tag. Construiu-se uma sequência de ADN sintética contendo todos os polínucleótidos e as caracteristicas anteriores, concebendo segmentos de polinucleótidos de cadeia simples com 20-40 bases que se hibridam uns com os outros e que formam a sequência de ADN sintético, de cadeia dupla, que se mostra na Figura 6B. Na Tabela 3 mostram-se os polínucleótidos, de cadeia simples, individuais (N^-Nq).

Os polínucleótidos N2, N3, N4, N6, N7 e N8 foram quinasados adicionando 1 μΐ de cada polinucleótido e 20 unidades de

027

SCR0286P

-65polinucleótido-quinase T4 a uma solução contendo 70 mM de Tris-HC1, a pH 7,6, 10 mM de MgCl₂, 5 mM de DTT, 10 mM de 2 ME e 500 microgramas por ml de BSA. A solução foi mantida a 372C durante 30 minutos e a reacção foi parada mantendo a solução a 652C durante 10 minutos. Os dois polinucleótidos restantes, 20 ng de polinucleótidos Ní e de polinucleótidos N5, foram adicionados à solução reaccional de quinase, conjuntamente com um volume 1/10 de uma solução contendo 20,0 mM de Tris-HCl, a pH 7,4, 2,0 mM de MgCl₂ e 50,0 mM de NaCl. Esta solução foi aquecida a 702C durante 5 minutos e deixou-se arrefecer até ã temperatura ambiente, aproximadamente 252C, durante 1,5 horas, num copo de 500 ml de água. Durante este per iodo de tempo todos os polinucleótidos se ligaram para formar o inserido de ADN sintético de cadeia dupla. Os polinucleótidos individuais foram ligados covalentemente, uns aos outros, para estabilizar o inserido de ADN sintético, adicionando 40 pl da mistura reaccional anterior a uma solução contendo 50 uM de Tris-HCl, a pH 7,5, 7 mM de MgCl₂, 1 mM de DTT, 1 mM de ATP e 10 unidades de ADN ligase T4. Esta solução foi mantida a 372C durante 30 minutos e, depois, a ADN-ligase T4 foi desactivada mantendo a solução a 652C durante 10 minutos. Os polinucleótidos restantes foram quinasados misturando 52 pl da mistura reaccional anterior, 4 pl de uma solução contendo 10 mM de ATP e 5 unidades de polinucleótido-quinase T4. Esta solução foi mantida a 372C durante 30 minutos e, depois, a polinucleótido-quinase T4 foi desactivada mantendo a solução a 652C durante 10 minutos. 0 inserido de ADN sintético, completo, foi ligado direetamente num vector lambda Zap II que tinha sido previamente digerido com as enzimas de restrição Not I e Xho I. A mistura de ligação foi empacotada, de acordo com as instruções do fabricante, usando um extracto de empacotamento Gigapack II Gold, disponível no Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA, E.U.A.. A mistura de ligação empacotada foi colocada em placa em células XL1 Azuis (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA, E.U.A.). As placas de lambda Zap II individuais foram nucleadas e os inseridos foram excisados de acordo com o protocolo de excisão, in vivo. fornecido pelo fabricante, Strategene Cloning Systems, La Jolla, CA, E.U.A., e descrito em Short et al., Nucleic Acids

027

SCR0286P

-66Res., , 16:7583-7600, 1988. Este protocolo de excisão in vivo move o inserido clonado do vector lambda Zap II para um vector de fagomídeo, para permitir a fácil manipulação e sequenciação, e produz também a versão de fagomídeo dos vectores de expressão de V|__. A exactidão dos passos de clonação anteriores foi confirmada por sequenciação do inserido usando o método do didesóxido de Sanger descrito por Sanger et al., Proc. Natl. Acad.Sc i. USA. 74:5463-5467, (1977) e usando as instruções do fabricante no conjunto de sequenciação, de ^^S-dATP de transcriptase inversa, AMV, de Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA, E.U.A.. Na Figura 6 e na Figura 8 mostra-se a sequência do vector de expressão de V|_ resultante.

vector de expressão de V(_, usado para construir a biblioteca de V^, foi o fagomídeo, produzido para permitir a determinação do ADN do vector de expressão de V|_. 0 fagomídeo foi produzido, como acima se descreve, detalhadamente, pelo processo de excisão in vivo a partir do vector de expressão Lambda Zap V|_ (Figura 8). A versão de fagomídeo deste vector foi usada devido ao sitio de enzima de restrição Nco I ser único, nesta versão, e poder, assim, ser usado para ligar operativamente os homólogos de ADN de V_L no vector de expressão.

1¹ - Construção do vector de expressão V|__II

Para exprimir a pluralidade de homólogos de ADN, codificando V(_, numa célula de hospedeiro de E. coli. construiu-se um vector que colocou os homólogos de ADN, codificando V^, na cadeia de leitura apropriada, forneceu um sitio de ligação a ribossomas, como é descrito por Shine et al., Nature. 254:34, 1975, forneceu a sequência lider do gene Pel B, que tinha sido usada previamente com sucesso para segregar fragmentos Fab em E. coli por Lei et al-, J- Bac., 169:4379 (1987) e Better et al., Science. 240:1041 (1988), e forneceu, também, um polinucleótido contendo um sitio de endonuclease de restrição para clonação. Construiu-se uma sequência de ADN sintético, contendo todos os polinucleótidos e características anteriores, concebendo segmentos de polinucleótidos de cadeia simples de 20-60 bases que se hibridam

027

SCR0286P

-67uns com os outros e formam a sequência de ADN sintética de cadeia dupla que se mostra na Figura 10. Na Tabela 4 mostra-se a sequência de cada um dos polinucleótidos, de cadeia simples individuais (01-08) na sequência de ADN sintético de cadeia dupla.

Os polinucleótidos 02, 03, 04, 05, 06 e 07 foram quinasados adicionando 1 ul (0,1 ug/ul) de cada polinucleótido e 20 unidades de polinucleótido-quinase T4 a uma solução contendo 70 mM de Tris-HCl, a pH 7,6, 10 mM de cloreto de magnésio (MgCl2), 5 mM de ditiotreitol (DTT), 10 mM de 2-mercaptoetanol (2 ME) e 500 microgramas por ml de albumina de soro de bovino. A solução foi mantida a 372C durante 30 minutos e a reacção foi parada mantendo a solução a 652C durante 10 minutos. Adicionaram-se 20 ng de cada um dos dois polinucleótidos restantes, 01 e 08, à solução reaccional de quinase anterior, conjuntamente com um volume 1/10 de uma solução contendo 20,0 mM de Tris-HCl, a pH 7,4, 2,0 mM de MgCl2 e 15,0 mM de cloreto de sódio (NaCl). Esta solução foi aquecida até 702C durante 5 minutos e deixou-se arrefecer até ã temperatura ambiente, aproximadamente 252C, durante 1,5 horas num copo de 500 ml de ãgua. Durante este período de tempo todos os 8 polinucleótidos se ligaram para formar o inserido de ADN sintético, que se mostra na Figura 9. Os polinucleótidos individuais foram ligados, covalentemente, uns aos outros, para estabilizar o inserido de ADN sintético, adicionando 40 ul da mistura reaccional anterior a uma solução contendo 50 mM de Tris-HCl, a pH 7,5, 7 mM de MgCl₂, 1 mM de DTT, 1 mM de ATP e 10 unidades de ADN-ligase T4. Esta solução foi mantida a 372C durante 30 minutos e, depois, desactivou-se a ADN-ligase T4 mantendo a solução a 652C durante 10 minutos. Os polipéptidos restantes foram quinasados misturando 52 ul da mistura reaccional anterior, 4 ul de uma solução contendo 10 mM de ATP e 5 unidades de polinucleótido-quinase T4. Esta solução foi mantida a 372C durante 30 minutos e, depois, a polinucleótido-quinase T4 foi desactivada mantendo a solução a 652C durante 10 minutos. 0 inserido de ADN sintético, completo, foi ligado directamente num vector Lambda Zap II que tinha sido previamente digerido com os

027

SCR0286P

-68enzimas de restrição Not I e Xho I. A mistura de ligação foi empacotada, de acordo com as instruções do fabricante, usando um extracto de empacotamento Gigapack II Gold, disponível da Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA, E.U.A.. A mistura de ligação empacotada foi colocada em placa em células Azuis XL1 (Stratagene Cloning Systems, San Diego, CA, E.U.A.). As placas Lambda Zap II individuais foram nucleadas e os inseridos foram excisados de acordo com o protocolo de excisão in vivo. fornecido pelo fabricante, Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA, E.U.A.. Este protocolo de excisão in vivo move o inserido clonado do vector Lambda Zap II para um vector de plasmídeo para permitir a fácil manipulação e sequenciação. A exactidão dos passos de clonação anteriores foi confirmada pela sequenciação do inserido, usando as instruções do fabricante, no conjunto de sequenciação de -^^s-dATP de transcriptase inversa, AMV, da Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA, E.U.A., Na Figura 9 e na Figura 11 mostra-se a sequência do vector de expressão de Vq II, resultante.

TABELA 4

01) 5’ TGAATTCTAAACTAGTCGCCAAGGAGACAGTCAT 3’

02) 5’ AATGAAATACCTATTGCCTACGGCAGCCGCTGGATT 3’

03) 5’ GTTATTACTCGCTGCCCAACCAGCCATGGCC 3’

04) 5’ GAGCTCGTCAGTTCTAGAGTTAAGCGGCCG 3’

05) 5’ GTATTTCATTATGACTGTCTCCTTGGCGACTAGTTTAGAATTCAAGCT 3’

06) 5’ CAGCGAGTAATAACAATCCAGCGGCTGCCGTAGGCAATAG 3’

07) 5’ TGACGAGCTCGGCCATGGCTGGTTGGG 3’

08) 5’ TCGACGGCCGCTTAACTCTAGAAC 3’

- Construção da Biblioteca de Vq 4 Vq

Para preparar uma biblioteca de expressão enriquecida nas sequências de Vq, prepararam-se homólogos de ADN enriquecidos em sequências de Vq, de acordo com o Exemplo 6, usando o mesmo conjunto de iniciadores 5’ mas com o iniciador 12A (Tabela 1) como iniciador 3’. Estes homólogos foram depois digeridos com os enzimas de restrição Xho I e Spe I e purificados num gel de

027

SCR0286P

agarose a 1%, usando a técnica de electroeluição padrão descrita em Molecular Cloning A Laboratory Manual, Maniatis et al., eds., Cold Spring Harbor, New York, E.U.A. (1982). Estes homólogos de ADN de V|_| preparados foram depois inseridos directamente no vector de expressão de que tinha sido previamente digerido com Xho I e Spe I.

A mistura de ligação contendo os homólogos de ADN de foi empacotada de acordo com as especificações do fabricante, usando o Extracto de Empacotamento Gigapack Gold II (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA, E.U.A.). As bibliotecas de expressão estavam então prontas para serem colocadas em placa em células XL1 Azuis.

Para preparar uma biblioteca enriquecida em sequências de V(_, prepararam-se produtos, amplificados por PCR, enriquecidos em sequências de V[_, de acordo com o Exemplo 6. Estes homólogos de ADN de Vl foram digeridos com os enzimas de restrição Nco I e Spe I. Os homólogos de ADN de V[_ digeridos foram purificados num gel de agarose a 1¾ usando técnicas de electroeluição convencionais descritas em Molecular Cloning A Laboratory Manual. Maniatis et al., eds., Cold Spring Harbor, NY, E.U.A. (1982). Os homólogos de ADN de V|_ preparados foram inseridos, directamente, no vector de expressão de V[_ que tinha sido previamente digerido com os enzimas de restrição Nco I e Spe I. Usou-se a mistura de ligação, contendo os homólogos de ADN de V[_, para transformar células competentes XL-1 azuis usando as instruções do fabricante (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA, E.U.A.).

Inserção dos homólogos de ADN codificando V_L no___vector de expressão de V|

Na preparação, para clonação, de uma biblioteca enriquecida em sequências de V|_, digeriram-se os produtos amplificados por PCR (2,5 ug/30 ul de meio contendo 150 mM de NaCl, 8 mM de Tris-HC1 (pH 7,5), 6 mM de MgS04, 1 mM de DTT, 200 ug/ml de BSA) a 372C, com os enzimas de restrição Sac I (125 unidades) e Xba I (125 unidades) e purificaram-se num gel de agarose a 1%. Nas experiências de clonação que requereram uma mistura dos produtos

027

-70das reacções de amplificação, combinaram-se volumes iguais (50 Wl, concentração de 1-10 wg) de cada mistura reaccional, após a amplificação electroforese digerido, a de restrição. Após amplificado por PCR, fragmentos de ADN de endonucleases misturaram-se mas antes da disgestão em gel do ARNm de baço, região do gel, contendo aproximadamente 350 pb, foi excisada, electroeluida para uma membrana de diãlise, precipitada com etanol e ressuspendida numa solução de TE contendo 10 mM de Tris-HCl, pH 7,5, e 1 mM de EDTA, até uma concentração final de 50 ng/wl.

vector de ADN de expressão de Vj_ II foi preparado para clonação, misturando 100 wg deste ADN, com uma solução contendo 250 unidades de cada uma das endonucleases de restrição Sac I e Xba I (ambas da Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN, E.U.A.) e um tampão recomendado pelo fabricante.

Esta solução foi mantida a 372C durante 1,5 horas. A solução foi aquecida a 652C, durante 15 minutos. para desactivar as de restrição. A solução foi arrefecida até 302C e com a solução, 25 unidades de fosfatase (HK) desactivãvel pelo calor (Epicenter, Madison, Wl ) e CaCl2, de acordo com as especificações do fabricante. Esta solução foi mantida a 302C durante 1 hora. 0 ADN foi purificado, extraindo a solução com uma mistura de fenol e de clorofórmio seguindo-se a precipitação com etanol. 0 vector de expressão II estava agora pronto para ligação aos homólogos de ADN de Vj_, preparados nos exemplos anteriores.

Os homólogos de ADN enriquecidos em sequências Vj_, foram preparados de acordo com o Exemplo 5 mas usando um iniciador 5’ de cadeia leve e um iniciador 3’ de cadeia leve, que se mostram 2. As reacções de amplificação individuais foram usando cada um dos iniciadores 5’ de cadeia leve em com o iniciador 3’ de cadeia leve. Estas misturas reaccionais separadas, contendo homólogo de V|_, foram misturadas e digeridas com as endonucleases de restrição Sac I e Xba I, de acordo com o Exemplo 6. Os homólogos de V[_ foram purificados, num gel de agarose a 1% usando a técnica de electroeluição na Tabela realizadas combinação

027

SCR0286P

convencional descrito em Molecular Cloning A Laboratory Manual. Maniatís et al., eds., Cold Spring Harbor, New York, E.U.A. (1982). Estes homólogos de ADN de Vl preparados foram depois inseridos, directamente, no vector de expressão V_L II, clivado com Sac I - Xba I, que foi preparado anteriormente, ligando 3 moles de inseridos de homólogo de ADN de V(_, com cada mole do vector de expressão V(_ II, de um dia para o outro, a 52C. Obtiveram-se 3,0 x 10^ unidades formando placas, após empacotamento do ADN com Gigapack II Bold (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA, E.U.A.) e 50% eram recombinantes.

14. Combinação aleatória dos homólogos de ADN de Vig e de

Vi_, no mesmo vector de expressão

A biblioteca de expressão de V|_ II, preparada no Exemplo 13, foi amplificada e prepararam-se 500 ug de ADN de fago, da biblioteca de expressão de Y[_ II, a partir da reserva de fago amplificado, usando os procedimentos descritos em Molecular

Cloning··_A Laboratory Manual. Maniatís et al. , eds., Cold Spring

Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, E.U.A. (1982). Mantiveram-se 50 ug deste ADN de fago, da biblioteca de expressão de V|_ II, numa solução contendo 100 unidades da endonuclease de restrição MLuI (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN, E.U.A.) em 200 ul de um tampão fornecido pelo fabricante de endonuclease, durante 1,5 horas a 372C. A solução foi depois extraída com uma mistura de fenol e de clorofórmio. 0 ADN foi depois precipitado em etanol e re-suspendido em 100 ul de água. Misturou-se esta solução com 100 unidades da endonuclease de restrição EcoR I (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN, E.U.A.), num volume final de 200 ul de tampão, contendo os componentes especificados pelo fabricante. Esta solução foi mantida a 372C durante 1,5 horas e a solução foi depois extraída com uma mistura de fenol e de clorofórmio. 0 ADN foi precipitado em etanol e re-suspendido em TE.

A biblioteca de expressão de Vp preparada no Exemplo 12 foi amplificada e prepararam-se 500 ug de ADN de fago, da biblioteca de expressão de V|_|, usando os métodos descritos acima.

027

SCR0286P

-72Mantiveram-se 50 ug do ADN de fago, da biblioteca de expressão de Vh> numa solução contendo 100 unidades da endonuclease de restrição Hind III (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN, E.U.A.), em 200 ul de um tampão, fornecido pelo fabricante de endonuclease, durante 1,5 horas a 372C. A solução foi depois extraída com uma mistura de fenol e de clorofórmio saturada com Tris-HCl 0,1 M a pH 7,5. 0 ADN foi depois precipitado em etanol e re-suspendido em 100 ul de água. Esta solução foi misturada com 100 unidades da endonuclease de restrição EcoR I (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN, E.U.A.) até um volume final de 200 ul de tampão, contendo os componentes especificados pelo fabricante. Esta solução foi mantida a 372C durante 1,5 horas e a solução foi depois extraída com uma mistura de fenol e de clorofórmio. 0 ADN foi precipitado em etanol e re-suspendido em TE.

Ligaram-se as bibliotecas de expressão de V_H e de V_L II, digeridas com endonuclease de restrição. A mistura reaccional de ligação consistia de 1 ug de e de 1 ug de ADN de biblioteca de fago de V|_ II, num meio reaccional de 10 ul, usando os reagentes fornecidos num conjunto experimental de ligação adquirido na Stratagene Cloning Systems (La Jolla, Califórnia, E.U.A.). Após ligação durante 16 h a 42C, empacotou-se 1 ul do ADN de fago, ligado, com extracto de empacotamento Gigapack Gold II e colocou-se em placa em células XL 1 Azuis preparadas de acordo com as instruções do fabricante. Usou-se uma porção dos 3 x 10^ clones obtidos, para determinar a eficácia da combinação. Na Figura 11 mostra-se o vector de expressão de V_H e V_L resultante.

Os clones contendo ambos os vectores de e foram excisados do fago para o pBluescript usando o protocolo de excisão in vitro descrito por Short et al., Nucleic__Acid

Research. 16:7583-7600 (1988). Os clones escolhidos para excisão exprimiram o decapéptido tag e não clivaram o X-gal na presença de 2 mM de IPTG, permanecendo assim brancos. Os clones com estas características representavam 30% da biblioteca. Tal como se determinou por análise de restrição, 50% dos clones escolhidos para excisão continham um e um V|_. Uma vez que aproximadamente 30% dos clones na biblioteca de exprimiram o decapéptido tag e

027

SCR0286P

50% dos clones na biblioteca de V_L II continham uma sequência V_L, concluiu-se que não mais do que 15% dos clones na biblioteca combinada conteriam ambos os clones Vh e Vj_. 0 número real obtido foi de 15% da biblioteca, indicando que o processo de combinação era muito eficiente.

15. Segregação dos_____homólogos de ADN de___uma proteína_de ligação a um antigénio

Para segregar os clones individuais contendo os homólogos de ADN, que codificam uma proteína de ligação a um antigénio V^, determinou-se o titulo da biblioteca de expressão de V^, preparada de acordo com o Exemplo 11. Esta titulação da biblioteca foi realizada usando métodos bem conhecidos dos peritos na arte. Resumidamente, realizaram-se séries de diluições da biblioteca para um tampão contendo 100 mM de NaCl, 50 mM de Tris-HCl, a pH 7,5, e 10 mM de MgS04. Adicionaram-se 10 ul de cada diluição a 200 ul de células de E. coli em crescimento exponencial e mantiveram-se a 372C durante 15 minutos, para permitir a absorção do fago pelas células bacterianas, com 3 ml de ágar de topo consistindo de 5 g/1 de NaCl, 2 g/1 de MgS04, 5 g/1 de extracto de levedura, 10 g/1 de NZ amina (hidrolisado de caseína) e 0,7% de agarose fundida a 502C. 0 fago, as bactérias e o ágar de topo, foram misturados e depois distribuídos equitativamente sobre a superfície de um prato de ágar bacteriano pré-aquecido (5 g/1 de NaCl, 2 g/1 de MgS04, 5 g/1 de extracto de levedura, 10 g/1 de NZ amina (hidrolisado de caseína) e 15 g/1 de ágar Difco). Os pratos foram mantidos a 372C, durante 12 a 24 horas, período de tempo durante o qual as placas lambda se desenvolveram na camada bacteriana. As placas lambda foram contadas para determinar o número total de unidades formando placas por ml, na biblioteca original.

A biblioteca de expressão titulada foi depois colocada em prato de modo a prepararem-se filtros réplicas da biblioteca. Os filtros réplicas serão depois usados para segregar os clones individuais na biblioteca que exprimem as proteínas de ligação a antigénios de interesse. Resumidamente, adicionou-se um volume da

027

SCR0286P

-74biblioteca titulada, de modo a terem-se 20 000 placas por prato de 150 mililitros, a 600 ul de células de E. coli em crescimento exponencial, e manteve-se a 372C durante 15 minutos, para permitir a absorção do fago nas células bacterianas. Depois, misturaram-se 7,5 ml de ãgar de topo com a solução contendo as células bacterianas e distribui-se, equitativamente, o fago absorvido e toda a mistura, sobre a superfície de um prato de ágar bacteriano pré-aquecido. Este processo foi repetido, um número de vezes suficiente, para colocar em prato um número total de placas pelo menos igual à dimensão da biblioteca. Estes pratos foram depois mantidos a 372C durante 5 horas. Estes pratos foram depois sobrepostos com filtros de nitrocelulose, que tinham sido pré-tratados com uma solução contendo 10 mM de isopropi1-beta-D-tiogalactopiranosido (IPTG) e mantiveram-se a 372C durante 4 horas. A orientação dos filtros de nitrocelulose em relação ao prato foi marcada fazendo um buraco com uma agulha, mergulhada em tinta ã prova de água, através do filtro e nos pratos de bactérias em vários pontos. Os filtros de nitrocelulose foram removidos com fórcepes e lavados uma vez com uma solução de TBST contendo 20 mM de Tris-HCl, a pH 7,5, 150 mM de NaCl e 0,05¾ de monolaurato de polioxietileno-sorbitano (Tween 20). Um segundo filtro, que tinha também sido embebido numa solução contendo 10 mM de IPTG, foi reaplicado nos pratos de bactérias para produzir filtros duplicados. Os filtros foram, adicionalmente, lavados com uma solução fresca de TBST, durante 15 minutos. Os filtros foram depois colocados numa solução bloqueante, consistindo de 20 mM de Tris-HCl a pH 7,5, 150 mM de NaCl e 1¾ de BSA e agitaram-se, durante 1 hora, à temperatura ambiente. Os filtros de nitrocelulose foram transferidos para uma solução bloqueante fresca, contendo uma diluição 1 para 500 do anticorpo primário, e agitou-se suavemente, durante pelo menos 1 hora, à temperatura ambiente. Depois, os filtros foram agitados na solução contendo o anticorpo primário, os filtros foram lavados 3 a 5 vezes em TBST, durante 5 minutos de cada vez, para remover o anticorpo primário residual não ligado. Os filtros foram transferidos para uma solução contendo solução bloqueante fresca e uma diluição de 1 para 500 a 1 para 1 000 de anticorpo secundário conjugado com

027

SCR0286P

-75fosfatase alcalina. Os filtros foram agitados suavemente, na solução, durante pelo menos 1 hora, à temperatura ambiente. Os filtros foram lavados 3 a 4 vezes numa solução de TBST, durante pelo menos 5 minutos de cada vez, para remover qualquer anticorpo secundário residual não ligado. Os filtros foram lavados uma vez numa solução contendo 20 mM de Tris-HCl, a pH 7,5, e 150 mM de NaCl. Os filtros foram removidos desta solução e o excesso de humidade foi removido com papel de filtro. A cor foi desenvolvida colocando o filtro numa solução contendo 100 mM de Tris-HCl, a pH 9,5, 100 mM de NaCl, 5 mM de MgCl2, 0,3 mg/ml de nitro Azul de Tetrazólio (NBT) e 0,15 mg/ml fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo (BCIP) durante, pelo menos, 30 minutos à temperatura ambiente. A solução de desenvolvimento de cor residual, foi removida por lavagem do filtro com uma solução contendo 20 mM de Tris-HCl, a pH 7,5, e 150 mM de NaCl. O filtro foi depois colocado numa solução de paragem consistindo de 20 mM de Tris-HC1, a pH 2,9, e 1 mM de EDTA. 0 desenvolvimento de uma cor púrpura intensa indica um resultado positivo. Os filtros são usados para localizar a placa de fago que produziu a proteína desejada. Essa placa de fago é segragada e depois cultivada para análise adicional.

Usaram-se várias combinações, diferentes, de anticorpos primários e de anticorpos secundários. A primeira combinação com um anticorpo primário imunoespecifico de um decapéptido, que apenas será expresso se a proteína de ligação ao antigénio Vq for expressa na cadeia de leitura apropriada, para permitir a leitura através da tradução, para incluir o epitopo de decapéptido ligado covalentemente à proteína de ligação ao antigénio Vq. Este epitopo de decapéptido e um anticorpo imunoespecifico deste epitopo de decapéptido foram descritos por Green et al., Cell

28:477 (1982) e por Niman et al., Proc. Nat. Acad.__Sci_.___U. S. A.

80:4949 (1983). Na Figura 11 mostra-se a sequência do decapéptido reconhecido. Um equivalente funcional do anticorpo monoclonal, que é imunoespecifico do decapéptido, pode ser preparado de acordo com os métodos de Green et al., e de Niemann et al.. 0 anticorpo secundário usado com este anticorpo primário era uma

027

IgG de cabra anti-ratinho (Fisher Scientific). Este anticorpo é imunoespecifico da região constante da IgG de ratinho e não reconhece qualquer porção da região variável de cadeia pesada. Esta combinação particular de anticorpos primários e secundários, quando usada de acordo com o protocolo anterior, determinou que entre 25¾ e 30% dos clones exprimiam o decapéptido e, deste modo, assumiu-se que estes clones exprimiam também uma proteína de ligação ao antigénio ν^.

Noutra combinação usou-se o anticorpo monoclonal de ratinho anti-decapéptido, como anticorpo primário e, como anticorpo secundário usou-se uma Ig de cabra anti-ratinho, purificada por afinidade, disponível comercialmente como parte de um conjunto de imuno-ensaio picoBlue da Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA, E.U.A.. Esta combinação resultou num grande número de clones falsos positivos porque o anticorpo secundário imunorreagiu também com o da cadeia pesada. Deste modo, este anticorpo reagiu com todos os clones, exprimindo qualquer proteína V^, e esta combinação de anticorpos primários e secundários não detectou especificamente clones com o polinucleótido de na cadeia de leitura apropriada, permitindo assim a expressão do decapéptido.

Usam-se várias combinações de anticorpos primários e secundários, onde o anticorpo primário está conjugado com isotiocianato de fluoresceina (FITS) e assim a imunoespecificidade do anticorpo não é importante, porque o anticorpo é conjugado com o antigénio pré-seleccionado (FITC) e é esse antigénio que se deverá ligar às proteínas de ligação ao antigénio Vj_| produzidas pelos clones na biblioteca de expressão. Após este anticorpo primário ter sido ligado em virtude de ser o anticorpo monoclonal de ratinho p2 5764 (ATCC # HB-9505) conjugado com FITC. 0 anticorpo secundário usado com este anticorpo primário é uma Ig^ de cabra anti-ratinho (Fisher Scientific, Pittsburg, PA, E.U.A.) conjugado com fosfatase alcalina, usando o método descrito em Antibodies A Laboratory Manual. Harlow and Love, eds., Cold Springing Harbor, New York, E.U.A. (1988). Se um clone particular, na biblioteca de expressão de V^, exprime uma

027

SCR0286P

proteina de ligação de que se liga ao FITC acoplado, de um modo covalente ao anticorpo primário, o anticorpo secundário liga-se especificamente e, quando desenvolvida, a fosfatase alcalina provoca a formação de uma cor púrpura distinta.

A segunda combinação de anticorpos do tipo usa um anticorpo primário que é IgG de coelho anti-humana (Fisher Scientific Pittsburg, PA) conjugada com FITC. 0 anticorpo secundário, usado com este anticorpo primário é uma IgG de cabra anti-coelho conjugada, com fosfatase alcalina, usando os métodos descritos em Antibodies A Laboratory Manual. Harlow and Lane, eds., Cold Spring Harbor, New York, E.U.A. (1988). Se um clone particular na biblioteca de expressão de V^, exprime uma proteína de ligação de V|_| que se liga ao FITC conjugado com o anticorpo primário, o anticorpo secundário liga-se, especificamente e, quando desenvolvida, a fosfatase alcalina provoca a formação de uma cor púrpura distinta.

Outro anticorpo primário foi o anticorpo monoclonal de ratinho p2 5764 (ATCC 4 HB-9505) conjugado com FITC e ^^1. 0 anticorpo será ligado, por quaisquer das proteínas de ligação ao antigénio V^, expressas. Depois, uma vez que o anticorpo está também marcado com , faz-se um autorradiograma do filtro, em vez de usar um anticorpo secundário que está conjugado com fosfatase alcalina. Esta produção directa de um autorradiograma permite a segregação dos clones na biblioteca que exprimem uma proteína, de ligação a um antigénio Vq, de interesse.

¹6. Segregação de homólogos de ADN para um V_H e para um______V_L que formam Fy de ligação a antigénio

Para segregar os clones individuais contendo os homólogos de ADN que codificam um e um Vj_ que formam um Fy que se liga a um antigénio, titulou-se a biblioteca de expressão de V|_| e de V[_, de acordo com o Exemplo 15. A biblioteca de expressão, titulada, foi depois pesquisada quanto à presença do decapéptido tag expresso com o V|_j, usando os métodos descritos no Exemplo 15. 0 ADN foi então preparado, a partir dos clones, para exprimir o decapéptido tag. Este ADN foi digerido com a endonuclease de restrição Pvu

027

SCR0286P

-78II, para determinar se estes clones continham, também, um homólogo de ADN de V_L. A migração mais lenta de um fragmento de endonuclease de restrição Pvu II indicou que o clone particular continha ambos os homólogos de ADN de Vq e de V_L.

Os clones contendo ambos os homólogos de ADN de Vq e de V|_, foram analisados para determinar se estes clones produziam uma molécula de proteína Fy reunida, a partir dos homólogos de ADN de Vq e de V_L.

O fragmento de proteína Fy, produzido em clones contendo Vq e V|_, foi visualizado por imunoprecipitação de proteína radiomarcada expressa nos clones. Inoculou-se uma cultura de 50 ml de caldo LB (5 g/1 de extracto de levedura, 10 g/1 de triptona e 10 g/1 de NaCl, a pH 7,0), contendo 100 wg/wl de ampicilina, ^com E· coli compreendendo um plasmideo contendo um Vq e um V[_. A cultura foi mantida a 372C, com agitação, até a densidade óptica, medida a 550 nm ser de 0,5. A cultura foi centrifugada a 3 000 x g, durante 10 minutos, e depois ressuspendeu-se em 50 ml de meio M9 (6 g/1 de Na₂HP0₄, 3 g/1 de KH₂P0₄, 0,5 g/1 de NaCl, 1 g/1 de NH₄C1, 2 g/1 de glucose, 2 mM de MgSO₄, 0,1 mM de CaCl₂) suplementado com aminoácido sem metionina ou cisteina. Esta solução foi mantida a 372C durante 5 minutos e depois adicionaram-se 0,5 mCi de 355, na forma de HS0₄~ (New England Nuclear, Boston, MA, E.U.A.) e a solução foi ainda mantida a 372C durante 2 horas adicionais. A solução foi depois centrifugadsa a 3 000 x g e rejeitou-se o sobrenadante. 0 sedimento de células bacterianas resultante foi congelado e descongelado e, depois, ressuspendeu-se numa solução contendo 40 mM de Tris, pH 8,0, 100 mM de sacarose 1 mM de EDTA. A solução foi centrifugada a 10 000 x g durante 10 minutos e rejeitou-se o sedimento resultante. O sobrenadante foi misturado com 10 wl de anticorpo monoclonal anti-decapéptido e mantido durante 30-90 minutos em gelo. Misturaram-se 40 wl de proteéna G, acoplada a pérolas de Sepharose (Pharmacia, Piscataway, NJ, E.U.A.) com a solução, e manteve-se esta solução durante 30 minutos em gel para permitir a formação de um imunoprecipitado. A solução foi centrifugada a 10 000 x g durante 10 minutos e ressuspendeu-se o sedimento

027

SCR0286P

resultante em 1 ml de uma solução contendo 100 mf-1 de Tris-HCl, a pH 7,5, e centrifugou-se a 10 000 x g durante 10 minutos. Repetiu-se este procedimento duas vezes. 0 sedimento imunoprecipitado resultante foi carregado num gel, PhastGel Homogenous 20 (Pharmacia, Piscataway, NY, E.U.A.), de acordo com as instruções do fabricante. 0 gel foi seco e usado para a exposição de filme de raios X.

Na Figura 12, mostra-se o autorradiograma resultante. Pode-se observar a presença de moléculas de Fy reunidas pela presença de V|_ que foi imunoprecipi tado pois estava ligado ao V^,-decapéptido tag reconhecido pelo anticorpo precipitante.

Geração de uma grande biblioteca combinatória do reportõrio de imunoglobulina em fago

Nas Figuras 7 e 9 apresentam-se em diagrama, vectores adequados para expressão de sequências de V^, V,_, Fv e Fab. Como previamente se discutiu, os vectores foram construídos, por modificações do Lambda Zap, por inserção de oligonucleótidos sintéticos no sitio de clonação múltiplo. Os vectores foram concebidos para serem anti-simétricos em relação aos sitios de restrição Not I e EcoR I que flamqueiam as sequências de clonação e de expressão. Como a seguir se descreve, esta assimetria na colocação de sitios de restrição num vector linear, tal como o bacteriõfago, é a caracteristica essencial que permite a combinação de uma biblioteca, exprimindo cadeias leves, com uma exprimindo cadeias pesadas, para construir bibliotecas de expressão de Fab combinatórias. 0 Lambda Zap II V_L II (Figura 9) é concebido para servir como vector de clonação para fragmentos de cadeia leve e o Lambda Zap II νμ, (figura 7) é concebido para servir como vector de clonação, para sequências de cadeia pesada no passo inicial de construção da biblioteca. Estes vectores são construídos para clonarem, eficientemente, os produtos de amplificação por PCR com sitios de restrição específicos incorporados em cada extremidade.

A - Amplificação por PCR de fragmentos de anticorpo

A amplificação por PCR de ARNm isolado de células de baço

027

SCR0286P

-80com oligonucleótidos, que incorporam sítios de restrição nas extremidades do produto amplificado, pode ser usada para clonar e exprimir sequências de cadeia pesada, incluindo sequências de cadeia Fd e kappa. Os iniciadores de oligonucleótido usados para

2.

sucesso, conjunto

Os no de estas amplificações são apresentados nas Tabelas iniciadores são iguais aos que foram usados com Exemplo 5, para amplificação de sequências Vh- 0 iniciadores 5’ para a amplificação da cadeia pesada foi idêntico ao previamente usado para amplificar Vh e os usados para amplificação da cadeia leve foram escolhidos com base princípios similares, Sastry et al., Proc. Natl. Acad. Sei.

em

USA.

8G: 5728 (1989) e Orland et al., Proc. Natl

Acad.

Sei. USA,

8G:3833 (1989). Os iniciadores 3’ únicos das sequências de cadeia pesada (IgGl) e leve (k) foram escolhidos para incluir as cisteinas envolvidas na formação da ligação dissulfureto cadeia pesada - cadeia leve. Nesta fase não se construiu qualquer iniciador para amplificar as cadeias leves lambda, uma vez que constituem apenas uma pequena fracção de anticorpos murinos.

fragmentos Fv foram construídos usando um é complementar com o ARNm da região J (de reunião) (aminoácido 128), e um conjunto de iniciadores 5’ únicos, que são complementares com o ADNc da primeira cadeia na região do terminal N conservada da proteína processada. As sequências de reconhecimento de endonuclease de restrição são incorporadas nos iniciadores, para permitir a clonação do fragmento amplificado num vector de fago lambda, numa cadeia de leitura predeterminada, para expressão.

Adicionalmente, os iniciador 3’, que

B Construção da biblioteca

A construção de uma biblioteca combinatória foi realizada em dois passos. No primeiro passo, as bibliotecas da cadeia pesada e leve foram construídas em Lambda Zap II Vh e Lambda Zap II V|_ II, respectivamente. No segundo passo, estas duas bibliotecas foram combinadas nos sítios EcoR I anti-simétricos presentes em cada vector. Este procedimento resultou numa biblioteca de clones cada um dos quais co-exprime potencialmente uma cadeia pesada e uma cadeia leve. As combinações reais são aleatórias e não reflectem,

027

SCR0286P

-81necessariamente, as combinações presentes na população de células B no animal original. Usou-se o vector de expressão Lambda Zap II V(_| para criar uma biblioteca de sequências de cadeia pesada a partir do ADN obtido por amplificação por PCR de ARNm isolado a partir do baço de um ratinho 129 G£_X + , previamente imunizado com fosforamidato de p-nitrofenilo (NPN), antigénio 1, de acordo com a fórmula I (Figura 13) conjugado com hemocianina de lapa Fissurela (KLH). 0 conjugado NPN-KLH foi preparado por mistura de 250 ul de uma solução contendo 2,5 mg de NPN de acordo com a fórmula 1 (Figura 13) em dimetilformamida, com 750 ul de uma solução contendo 2 mg de KLH em tampão de fosfato de sódio 0,01 M (pH 7,2). As duas soluções foram misturadas por adição lenta da solução de NPN â solução de KLH, mantendo a solução de KLH agitada com uma barra de agitação rotativa. Depois, a mistura foi mantida a 42C durante 1 hora com a mesma agitação para permitir o prosseguimento da conjugação. 0 conjugado NPN-KLH foi isolado do NPN e da KLH não conjugados por filtração em gel através de Sephadex G-25. 0 conjugado de NPN-KLH isolado foi usado em imunizações de ratinho como se descreve no Exemplo 2.

ARNm de baço, resultante das imunizações anteriores, foi isolado e usado para criar uma biblioteca principal de sequências de gene V|_| usando o vector de expressão Lambda Zap II V^- A biblioteca principal contém 1,3 x 10⁶ ufp e foi pesquisada quanto à expressão do decapéptido tag, para determinar a percentagem de clones exprimindo sequências Fd. A sequência deste péptido apenas fica em cadeia para expressão após a clonação de um fragmento Fd (ou V^) no vector. Pelo menos 80¾ dos clones na biblioteca exprimem fragmentos Fd, com base na imunodetecção do decapéptido tag.

A biblioteca da cadeia leve foi construída da mesma forma que a da cadeia pesada e verificou-se que contém 2 x 10^ membros. Um ensaio das placas, usando um anticorpo anti-cadeia kappa indicou que 60¾ da biblioteca continha inseridos de cadeia leve expressos. Esta percentagem relativamente pequena de inseridos resultou, provavelmente, da desfosforilação incompleta do vector após clivagem com Sac I e Xba I.

027 SCR02S6P

-82cadeia I, as contendo as De um modo fragmentos duplicado

Uma vez obtidas, as duas bibliotecas foram usadas para construir uma biblioteca combinatória, pelo seu cruzamento no sitio EcoR I. Para realizar o cruzamento, em primeiro lugar, purificou-se o ADN de cada biblioteca. A biblioteca de leve foi clivada com endonuclease de restrição Mlu extremidades 5’ resultantes foram desfosforiladas e o produto foi digerido com EcoR I. Este processo clivou o braço esquerdo do vector em vários bocados, mas o braço direito, sequências de cadeia leve, permaneceu intacto.

paralelo, o ADN da biblioteca de cadeia leve foi clivado com Hind III, desfosforilado e clivado com EcoR I, destruindo o braço direito mas deixando o braço esquerdo, contendo as sequências de cadeia pesada, intacto. Os ADN assim preparados foram então combinados e ligados. Após a ligação, apenas os clones que resultaram da combinação de um braço direito de clones, contendo a cadeia leve, com um braço esquerdo de clones, contendo a cadeia pesada, reconstituiram com fago viável. Após ligação e empacotamento, obtiveram-se 2,5 x 10? clones. Estes constituem a biblioteca de expressão de Fab combinatória que foi pesquisada para identificar clones possuindo afinidade por NPN. Para determinar a frequência dos clones de fago que co-exprimem os de cadeia leve e pesada, testaram-se amostras em das bibliotecas de cadeia leve, de cadeia pesada e combinatória, como anteriormente, para determinar a expressão da cadeia leve e pesada. Neste estudo de, aproximadamente, 500 fagos recombinantes, aproximadamente 60% co-exprimiram proteínas de cadeia leve e pesada.

C- Ligação de antigénio

Analisaram-se todas as três bibliotecas, de cadeia leve, de cadeia pesada e Fab, para determinar se continham fago recombinante que exprimia fragmentos de anticorpo que se ligavam ao NPN. Num procedimento típico colocaram-se 30 000 fagos em prato e ensaiaram-se amostras em duplicado, com nitroceiulose, para determinar a ligação a NPN acoplado a BSA marcado com ¹²⁵I (Figura 15). Ensaios em duplicado de 80 000 fagos recombinantes, da biblioteca de cadeia leve, e um número similar da biblioteca

027

SCR0286P

-83de cadeia pesada, não identificaram quaisquer clones que se ligavam ao antigénio. Em contraste, o ensaio de um número similar de clones da biblioteca de expressão de Fab identificou muitas placas de fago que se ligavam ao NPN (Figura 15). Esta observação indica que, sob condições nas quais muitas cadeias pesadas, em combinação com cadeias leves, se ligam ao antigénio, as mesmas cadeias pesada e leve, sozinhas, não o fazem. Deste modo, no caso do NPN, crê-se que existem muitas cadeias pesadas e leves que apenas se ligam ao antigénio quando estão combinadas, respectivamente, com cadeias leves e pesadas especificas.

Para determinar a capacidade para pesquisar grandes números de clones e para obter uma estimativa mais quantitativa da frequência de clones de ligação a antigénio, na biblioteca combinatória, pesquisaram-se um milhão de placas de fago e identificaram-se aproximadamente 100 clones que se ligavam ao antigénio. Para seis clones que se pensava que se ligavam ao NPN, uma região do prato contendo os positivos e aproximadamente 20 placas de bacteriófago circundantes foi nucleada, colocada de novo em prato e pesquisada com amostras em duplicado (Figura 15). Como se esperava, aproximadamente um em vinte fagos ligava-se, especificamente, ao antigénio. Os núcleos das regiões do fago em prato, que se pensava serem negativos, não deram resultados positivos quando foram colocados de novo em placa.

Para determinar a especificidade da interacção antigénio anticorpo, a ligação de antigénio competiu com antigénio livre não marcado, como se mostra na Figura 16. Os estudos de competição mostraram que os clones individuais podiam ser distinguidos com base na afinidade pelo antigénio. A concentração de haptenos livres rquerida para a inibição completa da ligação variou entre 10-100 x 10^ M sugerindo que os fragmentos Fab expressos tinham constantes de ligação na gama dos nanomolares.

D. Composição dos clones e dos seus produtos expressos

Na preparação para caracterização dos produtos de proteína capazes de se ligarem ao NPN, como se descreve no Exemplo 18C, um plasmideo contendo os genes da cadeia pesada e leve foi excisado

027

SCR0286P

-84a partir da placa de bacteriofago nucleada apropriada usando fago auxiliar M13mp8. Determinação do mapa do plasmídeo excisado padrão de restrição consistente, demonstrou i ncorporação um

Os com a produtos de sequências de cadeia pesada e leve de proteína de um dos clones foram analisados por ELISA e por manchas Western, para estabelecer a composição da proteína de ligação ao NPN. Concentrou-se um sobrenadante bacteriano, após a indução por IPTG, e submeteu-se a filtração em gel. Reuniram-se as fracções com peso molecular na gama de 40-60 kD, concentraram-se e submeteram-se a uma separação, por filtração em gel, adicional. Como se ilustra na Figura 17, e análise ELISA das fracções eluentes demonstrou que a ligação de NPN estava associada a uma proteína de peso molecular de cerca de 50 kD, cuja detecção imunológica mostrou que continha ambas as cadeias leve e pesada. Uma mancha Western (que não se mostra) de uma preparação de sobrenadante bacteriano concentrado, sob condições não redutoras, foi desenvolvida com anticorpo anti-decapéptido. Esta revelou uma banda de proteína com um peso molecular de 50 kD. Tomados em conjunto, estes resultados são consistentes com o facto da ligação de NPN ser uma função de fragmentos Fab nos quais as cadeias pesada e leve estão ligadas de um modo covalente.

E- Comparação das propriedades do reportório in vivo versus biblioteca combinatória de fago

Neste exemplo preparou-se uma biblioteca relativamente restrita, porque apenas se usou um número limitado de iniciadores para a amplificação por PCR de sequências Fd. Espera-se que a biblioteca contenha apenas clones kappa/gama 1. Contudo, esta não é uma método, uma vez que se podem adicionar exprimindo sequências limitação inerente do iniciadores adicionais para amplificar qualquer classe ou subclasse de anticorpo. Apesar desta restrição, foi possível isolar um grande número de clones de ligação a antigénios.

Uma questão central que resulta deste trabalho é a de como uma biblioteca de fago, preparada como aqui se descreve, se

027

SCR0286P

compara com o reportório de anticorpos in vivo em termos de tamanho, caracteristicos de diversidade e facilidade de acesso.

tamanho de reportório de anticorpos de mamífero é dificil de avaliar mas é muitas vezes proposto um número de ordem de 10^-10® especificidades de antigénio diferentes. Com algumas das reservas que a seguir se discutem, pode-se construir facilmente uma biblioteca de fago deste tamanho, ou maior, por uma modificação do corrente método. De facto, uma vez construída uma biblioteca combinatória inicial, as cadeias pesadas e leves podem ser rearranjadas, para obter bibliotecas com números excepcionalmente grandes.

Em princípio, espera-se que as caracteristicas de diversidade do reportório nativo (não imunizado), in vivo e da biblioteca de fago correspondente sejam similares, pelo facto de envolverem ambas uma combinação aleatória de cadeias leves e pesadas. Contudo, existem diferentes factores que actuarão para restringir a diversidade expressa por um reportório in vivo e pela biblioteca de fago. Por exemplo, uma modificação fisiológica tal como a tolerância, restringirá a expressão de certas especificidades antigénicas do reportório in vivo. mas estas especificidades podem ainda aparecer na biblioteca de fago. Por outro lado, uma tendência no processo de clonação pode introduzir restrições na diversidade da biblioteca de fago. Por exemplo, pode-se esperar que a representação de ARN para as sequências expressas por células B estimuladas predomine sobre as de células não estimuladas devido a niveis de expressão mais elevados. Tecidos de diferentes fontes (p.e., sangue periférico, medula óssea ou nódulos linfáticos regionais) e diferentes iniciadores de PCR (p.e., os que se espera que amplifiquem diferentes classes de anticorpos) podem resultar em bibliotecas com caracteristicas de diversidade diferentes.

Outra diferença entre o reportório in vivo e a biblioteca de fago consiste no facto de os anticorpos, isolados a partir do primeiro, poderem ter sido beneficiados por maturação por afinidade, devido a mutações somáticas após a combinação das

027

SCR0286P

-86cadeias pesadas e leves, enquanto que o segundo combina, aleatoriamente as cadeias pesadas e leves maturadas. Numa dada de fago suficientemente grande, derivada de um in vivo particular, as cadeias leves e pesadas, originais, recombinar-se-ão. Contudo, uma vez que um dos potenciais benefícios desta nova tecnologia é o de obviar a necessidade de imunização pela geração de uma única biblioteca de fago genérica, altamente diversa, seria útil ter métodos para optimizar as sequências para compensar a ausência de mutação biblioteca repor tõr io maturadas.

somática de selecção clonal. Pelos processos do presente invento ficam facilmente disponíveis três procedimentos. Em primeiro lugar, a mutagénese de saturação pode ser realizada nas os Fab resultantes podem ser testados para determinar a

CDR e função cadeia aumentada. Em segundo lugar, podem-se recombinar uma pesada ou uma cadeia leve dum clone, que se liga a um antigénio, com as bibliotecas, inteiras, de cadeia leve ou pesada, respectivamente, num procedimento idêntico ao usado para construir a biblioteca combinatória. Em terceiro lugar, podem-se realizar ciclos iterativos dos dois procedimentos anteriores para optimizar adicionalmente a afinidade ou as propriedades catalíticas da imunoglobulina. Será de notar que os dois últimos procedimentos não são permitidos na selecção clonal de células B, o que sugere que os métodos aqui descritos podem realmente aumentar a capacidade de identificar sequências óptimas.

acesso é a terceira área onde tem interesse comparar o reportório de anticorpos in vivo e a biblioteca de fago. Em termos práticos a biblioteca de fago tem um acesso muito mais fácil. Os métodos de ensaio permitem pesquisar, pelo menos, 50 000 clones por prato de modo que, por dia, se podem examinar facilmente 10⁶ anticorpos. Este factor, por si só, deverá encorajar a substituição da tecnologia do hibridoma pelos métodos que aqui se descrevem. Os métodos de ensaio mais poderosos utilizam a selecção que pode ser realizada incorporando marcadores seleccionáveis no antigénio, tais como grupos rejeitáveis necessários para a replicação de estirpes bacterianas auxotróficas ou substituintes tóxicos susceptiveis de

027

SCR0286P desactivação catalítica. Existem também outras vantagens relacionadas com o facto de apenas se poder ter acesso ao reportório de anticorpos in vivo. através de uma imunização que ê uma selecção com base na afinidade de ligação. A biblioteca de fago não está restringida de um modo similar. Por exemplo, o único método geral para identificar anticorpos com propriedades catalíticas tem sido por pré-selecção, com base na afinidade do anticorpo por um análogo do estado de transição. Estas restrições não se aplicam á biblioteca i_n vivo onde a catálise pode, em principio, ser avaliada directamente. A capacidade para testar directamente grandes números de anticorpos, quanto à sua função, pode permitir a selecção de catalisadores em reacções onde não está bem definido um mecanismo ou onde a síntese do análogo do estado de transição é difícil. A determinação de catálise, directamente, elimina a inclinação do procedimento de pesquisa para certos mecanismos de reacção pejorativos para um análogo sintético e, deste modo, é possível para uma dada transformação química, a exploração simultânea de múltiplos percursos reaccionais.

Os processos aqui apresentados descrevem a geração de fragmentos Fab que são claramente diferentes, num certo número de aspectos, dos anticorpos intactos (inteiros). Existe indubitavelmente uma perda ou afinidade quando se têm ligantes, de antigénio, de Fab, monovalentes, mas isto pode ser compensado por selecção de ligantes adequadamente fortes. Para um certo número de aplicações tais como agentes de diagnóstico e biosensores, pode ser preferível ter fragmentos monovalentes. Para aplicações requerendo funções de efector Fc, já existe a tecnologia para a extensão do gene da cadeia pesada e expressão do anticorpo inteiro glicosilado em células de mamífero.

As ideias aqui apresentadas dirigem-se às questões fulcrais na identificação e avaliação de anticorpos. É agora possível construir e pesquisar, pelo menos, três ordens de grandeza, mais clones com mono-especificidades do que era anteriormente possível. As aplicações potenciais do processo deverão englobar a investigação básica e as ciências aplicadas.

027

SCR0286P

-88Pretende-se que a descrição anterior seja ilustrativa e não limitativa da presente invenção. Podem-se efectuar numerosas variações e modificações sem sair do verdadeiro espirito e âmbito do presente invento.

027

SCR0286P

Claims (9)

1. REIVINDICAÇÕES

   1 - Processo para a produção de um vector de expressão de ADN de cadeia dupla, linear, contendo um promotor 5’ terminal controlando a expressão de um primeiro e de um segundo polipéptidos, a partir de um primeiro e de um segundo genes, respectivos, sendo os referidos primeiro e segundo polipéptidos capazes de formar um receptor heterodimérico de especificidade predeterminada , caracterizado por compreender:

   (a) o isolamento de uma primeira população diversa, de primeiros genes contendo um gene codificando o referido primeiro polipéptido, sendo a referida primeira população constituída por moléculas de ADN de cadeia dupla, linear, definindo um sítio de restrição reconhecido por uma endonuclease, estando o referido sitio de restrição localizado 5’ terminal em relação aos referidos genes mas 3’ terminal em relação a um promotor controlando a expressão dos referidos genes;

   (b) o isolamento de uma segunda população diversa, de segundos genes contendo um gene codificando o referido segundo polipéptido, sendo a referida segunda população constituída por moléculas de ADN de cadeia dupla, linear, definindo o referido sitio de restrição, estando o referido sitio de restrição localizado 3’ terminal em relação aos referidos segundos genes, estando os referidos segundos genes localizados 3’ terminais em relação a um promotor controlando a expressão dos referidos segundos genes;

   (c) a clivagem das referidas moléculas de ADN dupla, quando presentes nas referidas populações, com a endonuclease para produzir fragmentos de restrição um terminal coesivo e um dos referidos primeiros genes referidos segundos genes; e de cadeia referida possuindo ou um dos restrição cada um, expressão refer idos (d) a ligação aleatória dos referidos fragmentos de uns aos outros, através do referido terminal coesivo de para produzir uma população diversa de vectores de de ADN, linear, de cadeia dupla, possuindo um dos primeiros genes e um dos referidos segundos genes, em

   71 027

   SCR0286P

   -90tandem, na mesma cadeia de ADN e sob o controlo de um único promotor;

   (e) o isolamento de um vector de expressão capaz de exprimir o referido receptor heterodimérico de especificidade predeterminada, a partir da referida população diversa de vectores de expressão de ADN de cadeia dupla.
2. 2 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por os referidos primeiros genes serem homólogos de ADN codificando o primeiro polipéptido e por o referido isolamento compreender:

   (a) a separação das cadeias de um reportório de genes codificando o primeiro polipéptido, compreendendo o referido reportório ácidos nucleicos de cadeia dupla, contendo, cada um, uma cadeia codificando o primeiro polipéptido, temperada (annealed) com uma cadeia complementar;

   (b) o tratamento das referidas cadeias separadas sob condições adequadas para amplificação, por reacção em cadeia com polimerase, com primeiros e segundos iniciadores de síntese de polinucleótidos, possuindo cada um dos referidos primeiros iniciadores uma sequência de nucleótidos capaz de se hibridar com uma sequência conservada entre as referida cadeias codificando o primeiro polipéptido, e possuindo cada um dos referidos segundos iniciadores uma sequência de nucleótidos capaz de se hibridar com uma sequência conservada entre as referidas cadeias complementares, sendo os referidos primeiros e segundos iniciadores capazes de iniciar a amplificação de uma pluralidade de homólogos de ADN diferentes, codificando o primeiro polipéptido, de entre o referido reportório de genes codificando o primeiro polipéptido, produzindo o referido tratamento uma pluralidade de homólogos de ADN diferentes codificando o primeiro polipéptido; e (c) a ligação operativa a um vector de expressão para a expressão, sob o controlo de um promotor, de cada um, de uma pluralidade dos referidos homólogos de ADN diferentes, codificando o primeiro polipéptido.

   71 027

   SCR0286P

   -913 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por os referidos segundos genes serem homólogos de ADN codificando o segundo polipeptido e por o referido isolamento compr eender:

   (a) a separação das cadeias de um reportório de genes codificando o segundo polipeptido, compreendendo o referido reportório ácidos nucleicos de cadeia dupla, contendo, cada um, uma cadeia codificando o segundo polipéptido, temperada.com uma cadeia complementar;

   (b) o tratamento das referidas cadeias separadas sob condições adequadas para amplificação, por reacção em cadeia com polimerase, com primeiros e segundos iniciadores de sintese de polinucleótidos, possuindo cada um dos referidos primeiros iniciadores uma sequência de nucleótidos capaz de se hibridar com uma sequência conservada entre as referidas cadeias codificando o segundo polipéptido, e possuindo cada um dos referidos segundos iniciadores uma sequência de nucleótidos capaz de se hibridar com uma sequência conservada entre as referidas cadeias complementares, sendo os referidos primeiros e segundos iniciadores capazes de iniciar a amplificação de uma pluralidade de homólogos de ADN diferentes, codificando o segundo polipéptido, de entre o referido reportório de genes codificando o segundo polipéptido, produzindo o referido tratamento uma pluralidade de homólogos de ADN diferentes codificando o segundo polipéptido; e (c) a ligação operativa a um vector de expressão para a expressão, sob o controlo de um promotor, de cada um, de uma pluralidade dos referidos homólogos de ADN diferentes codificando o segundo polipéptido.
3. 4 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido primeiro polipéptido ser um V^, por os referidos primeiros genes serem homólogos de ADN codificando o e por o referido isolamento compreender' (a) a separação das cadeias de um reportório de genes codificando o compreendendo o referido reportório ácidos nucleicos de cadeia dupla, contendo, cada um, uma cadeia

   71 027

   SCR0286P

   -92codifiçando o V|_| temperada com uma cadeia complementar; e (b) o tratamento das referidas cadeias separadas sob condições adequadas para amplificação, por reacção em cadeia com polimerase, com primeiros e segundos iniciadores de sintese de polinucleótidos, possuindo cada um dos referidos primeiros iniciadores uma sequência de nucleótidos capaz de se hibridar com uma sequência conservada entre as referidas cadeias codificando o V^, e possuindo cada um dos referidos segundos iniciadores uma sequência de nucleótidos capaz de se hibridar com uma sequência conservada entre as referidas cadeias complementares, sendo os ) referidos primeiros e segundos iniciadores capazes de iniciar a amplificação de uma pluralidade de homólogos de ADN diferentes, codificando o V|_|, de entre o referido reportório de genes codificando V|_f, produzindo o referido tratamento uma pluralidade de homólogos de ADN diferentes codificando o Vh
4. 5 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido segundo polipéptido ser um V[_, por os referidos segundos genes serem homólogos do ADN codificando o V|_ e por o referido isolamento compreender:

   (a) a separação das cadeias de um reportório de genes codificando o V[_, compreendendo o referido reportório ácidos nucleicos de cadeia dupla, contendo, cada um, uma cadeia / codificando o Vj_ temperada com uma cadeia complementar; e (b) o tratamento das referidas cadeias separadas sob condições adequadas para amplificação, por reacção em cadeia com polimerase, com primeiros e segundos iniciadores de sintese de polinucleótidos, possuindo cada um dos referidos primeiros iniciadores uma sequência de nucleótidos capaz de se hibridar com uma sequência conservada entre as referidas cadeias codificando o V[_, e possuindo cada um dos referidos segundos iniciadores uma sequência de nucleótidos capaz de se hibridar com uma sequência conservada entre as referidas cadeias complementares, sendo os referidos primeiros e segundos iniciadores capazes de iniciar a amplificação de uma pluralidade de homólogos de ADN diferentes, codificando o V|_, de entre o referido reportório de genes codifi71 027

   SCR0286P cando o V_L, o referido tratamento produzindo uma pluralidade de homólogos de ADN diferentes codificando o primeiro polipéptido.
5. 6 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido primeiro polipéptido ser um V[_, por os referidos primeiros genes serem homólogos de ADN codificando o V(_ e por o referido isolamento compreender:

   (a) a separação das cadeias de um reportório de genes codificando o V[_, compreendendo o referido reportório ácidos nucleicos de cadeia dupla, contendo, cada um, uma cadeia codificando o V[_ temperada com uma cadeia complementar; e (b) o tratamento das referidas cadeias separadas sob condições adequadas para amplificação por reacção em cadeia com polimerase, com primeiros e segundos iniciadores de síntese de polinucleótidos, possuindo cada um dos referidos primeiros iniciadores uma sequência de nucleótidos capaz de se hibridar com uma sequência conservada entre as referidas cadeias codificando o V|_, e possuindo cada um dos referidos segundo iniciadores uma sequência de nucleótidos capaz de se hibridar com uma sequência conservada entre as referidas cadeias complementares, sendo os referidos primeiros e segundos iniciadores capazes de iniciar a amplificação de uma pluralidade de homólogos de ADN diferentes, codificando o V(_, de entre o referido reportório de genes codificando o V_L, o referido tratamento produzindo uma pluralidade de homólogos de ADN diferentes codificando o primeiro polipéptido.
6. 7 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido segundo polipéptido ser um Vq, por os referidos segundos genes serem homólogos de ADN codificando o Vq e por o referido isolamento compreender:

   (a) a separação das cadeias de um reportório de genes codificando o Vq, compreendendo o referido reportório ácidos nucleicos de cadeia dupla, contendo, cada um, uma cadeia codificando o Vq temperada com uma cadeia complementar; e (b) o tratamento das referidas cadeias separadas sob condições adequadas para amplificação, por reacção em cadeia com

   71 027

   SCR0286P

   -94polimerase, com primeiros e segundos iniciadores de síntese de polinucleótidos, possuindo cada um dos referidos primeiros iniciadores uma sequência de nucleótidos capaz de se hibridar com uma sequência conservada entre as referidas cadeias codificando o V|q, e possuindo cada um dos referidos segundos iniciadores uma sequência de nucleótidos capaz de se hibridar com uma sequência conservada entre as referidas cadeias complementares, sendo os referidos primeiros e segundos iniciadores capazes de iniciar a amplificação de uma pluralidade de homólogos de ADN diferentes, codificando ο V^, de entre o referido reportório de genes codificando V|_|, o referido tratamento produzindo uma pluralidade de homólogos de ADN diferentes codificando o V^.
7. 8 - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o referido segundo polipéptido ser um Vl, por os referidos segundos genes serem homólogos do ADN codificando o V|_ e por o referido isolamento compreender:

   (a) a separação das cadeias de um reportório de genes codificando o Vl, compreendendo o referido reportório ácidos nucleicos de cadeia dupla, contendo, cada um, uma cadeia codificando o Vl temperada com uma cadeia complementar; e (b) o tratamento das referidas cadeias separadas sob condições adequadas para amplificação, por reacção em cadeia com polimerase, com primeiros e segundos iniciadores de sintese de polinucleótidos, possuindo cada um dos referidos primeiros iniciadores uma sequência de nucleótidos capaz de se hibridar com uma sequência conservada entre as referidas cadeias codificando o Vl, e possuindo cada um dos referidos segundos iniciadores uma sequência de nucleótidos capaz de se hibridar com uma sequência conservada entre as referidas cadeias complementares, sendo os referidos primeiros e segundos iniciadores capazes de iniciar a amplificação de uma pluralidade de homólogos de ADN diferentes, codificando o Vl, de entre o referido reportório de genes codificando o Vl, o referido tratamento produzindo uma pluralidade de homólogos de ADN diferentes codificando o primeiro polipéptido.

   71 027

   SCR0286P
8. 9 - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por o referido segundo polipéptido ser um V_H, por os referidos segundos genes serem homólogos de ADN codificando o V|_, e por o referido isolamento compreender:

   (a) a separação das cadeias de um reportório de genes codificando o V^, compreendendo o referido reportório ácidos nucleicos de cadeia dupla, contendo, cada um, uma cadeia codificando o V^ temperada com uma cadeia complementar; e (b) o tratamento das referidas cadeias separadas sob condições adequadas para amplificação, por reacção em cadeia com polimerase, com primeiros e segundos iniciadores de sintese de polinucleótidos, possuindo cada um dos referidos primeiros iniciadores uma sequência de nucleótidos capaz de se hibridar com uma sequência conservada entre as referidas cadeias codificando o V|_,, e possuindo cada um dos referidos segundos iniciadores uma sequência de nucleótidos capaz de se hibridar com uma sequência conservada entre as referidas cadeias complementares, sendo os referidos primeiros e segundos iniciadores capazes de iniciar a amplificação de uma pluralidade de homólogos de ADN diferentes, codificando o V^, de entre o referido reportório de genes codificando νμ,, o referido tratamento produzindo uma pluralidade de homólogos de ADN diferentes codificando o V^.
9. 10 - Processo de produção de um sistema de clonação compreendendo os primeiros e segundos vectores de ADN de cadeia dupla, linear, caracterizado por se misturarem num meio aquoso, conjuntamente com uma endonuclease, definindo, cada um dos referidos vectores, um promotor, um sitio de restrição, clivável pela referida endonuclease, e um poli-ligante, estando o referido sitio de restrição localizado, entre o referido promotor e o referido poli-ligante, no referido primeiro vector, estando o referido poli-ligante localizado, entre o referido promotor e o referido sitio de restrição, no referido segundo vector, sendo o referido sitio de restrição clivável para produzir, a partir de cada um dos referidos vectores, primeiro e segundo fragmentos de

   -7)

   71 027

   SCR0286P

   -96restrição respectivos contendo poli-ligante, possuindo terminais complementares um do outro.

   Lisboa, «₆ MA1 1990

   Por SCRIPPS CLINIC AND RESEARCH FOUNDATION