PT94204A - Processo para a producao de novos antibioticos de eteres policiclicos acidicos e microorganismos uteis na sua producao - Google Patents

Description

Este invento está relacionado com novos antibióticos de éteres policiclicos acidicos s seus sais caiiõnicos farmacêutica-menta aceitáveis. Este invento também está relacionado com novos microorganismos Aciinomadura roseorufa. Ainda, este invento relaciona-se com processos para a produção de novos antibióticos de éteres policiclicos acidicos UK-58,852. Este invento está também relacionado com métodos para o controle de iníecções coccidiais em aves, enterite em animais domésticos e disenteria em suínos através da administração dos novos antibióticos deste invento aos referidos animais. Este invento também se relaciona com composições em nutrientes para alimentos compreendendo os novos antibióticos deste invento e com métodos para a promoção do crescimento e/ou melhoramento da eficácia de utilização de alimentos em animais ruminantes ou monogãsiricos pela administração dos novos antibióticos deste invento.

Gs antibióticos de éteres policiclicos acidicos são uma ciasse de compostos caracterizados pelos seus efeitos no transporte de caiiões em miiocondrias. Esta família de antibióticos inclui agentes bem conhecidos tais como monsnsina; nigericina; grisorixina; dianemicina; saiinomicina; mutalomícína; ionomicina e leuseramicina. 0 tema foi revisto por Wesiley. •KPolyether Aniihioiics:*·, Adv. Appi . rlicrobiol., 22, 177, 1977.

Gs aniibiólicos de éteres policiclicos referidos imeoiatamente atrás são activos contra bactérias Sram-positivas, fungos e protozoários, Em particular, aqueles antibióticos apresentam potente aciividade anti-coccídsos. Eles têm pois, sioo usados com níveis de sucesso variáveis no tratamento de uma variedade de iníecções de animais. A coccidiose, doença bem conhecida causada por um protozoário, continua a ser um problema sério e o seu controle * *

reveste-s© da importânc ia económica em veterinária, ©spec iaimente na indústria ds aves. A cocci-tíiose resulta da infscçSo por uma ou mais espécies de Eimeriaou Isospora (para um resumo, consultar Lund s Farr em -«Disesses of Pouitry* Sã sd., Bisstsr s Sth^arte, Eds., lowa State University Press, Ames, Ia., I36S, PP. íOSS·"·103S). Existem seis espécies ds coccádeos que produzem morbidez facilmente discernívsl em aves suscaptíveis. Eimer ia I.· nscatrix, E. brune til, E. acervulina, E. mj^xima e £. mívati produzem danos directament© através da destruição de células spiteliais do tracto digestivo ou inoirectamente através da produção de toxinas. Três outras espécies ds protozoários pertencentes ao mesmo género são consideradas como sendo relati-· vamsnte inócuas; no entanto, E. mitis, E. hagani e E. pra&cox são capazes tíe reduzir o ganho de peso, baixar a eficácia dos alimentos e âíeciar adversamente a produção de ovos.

Face ás grandes per das económicas devido à cocc idí ose e as desvantagens conhecidas dos agentes anti--coccideos existentes, continua a procura ds melhores agentes anti-coccidiais. A enterite é uma outra doença que pode provocar graves per cias económicas aos produtores de animais. A enterite ocorre em galinhas, suínos, gado vacum s carneiros e é atribuída prínc ipal-mente a bactérias anaeróbias, particularmente Clostridium perfringeris e vírus. A enterotoxemia em ruminantes, um exemplo oa qual é a «doença de excesso de alimentação* em carneiros, é uma doença devida á infecção por C. perfringens. A disenteria em suínos é uma das doenças de porcos maís vulgarmente d i agnos t i c adas nos Estados Unidos. Por outro lado a doença prevalece em muitos outros países s anualmente causa psrdas consideráveis no «stock* de criadores cie suínos em todo o mundo. Foi recentemente descoberto que uma espiroqueta grande è o

» . organismo causador da doença. Este organismo, Treponsma hyodvsenterias, foi agora isolado s mostrou-se ser capaz de induzir a doença CHarris, D. L. et si., «Swine-Dysentery*-Í, Inoculation of Pigs wiih Trsponema hyodyssnieriae (New spsciss) and Eeproduction of ihe Dissass*, Vei. Hed/SAC, 67, 61-64, 19723. Dsvs-se notar que se desconhece se T. hyodysenleriae é o único organismo causador da disenteria em suínos. No entanto, a partir dos dados disponíveis, pode-se concluir que é a principal fonte de iníecç-fo. 0 aumento do rendimento (maior taxa de crescimento e/ou melhor eficácia da utilização de alimentos) em ruminantes tais como gado vacum , e em animais monogástrIcos tais como porcos, s um outro objectivo economicamente pretendido em veterinária, é as particular interesse a melhoria do rendimento conseguida aumentando a eficácia da utilização de alimentos. é conhecido o mecanismo de utilização da principal íraccão nutritiva dos alimentos de ruminantes. Os microorganismos no rumen dos animais degradam os açúcares para produzirem monossacáridos s depois converterem estes monossacáridos em compostos de piruvato. Os piruvatos são metaholizados por processos microbiológicos para formar acetatos, buiiratos ou propionatos, colectivaments conhecidos como ácidos gordos voláteis. rara uma discussão mais detalhada consultar Leng em «Physiology of Digestion and meiabo-lism in ihe Ruminani,» Phillipson et al . , Eds. , Driel Press, Newcastle-upon-Tyne, England, 1970, pp. 408-410. A sficácia relativa da utilização de ácidos gordos voláteis está discutida por ncCuIlouqh em -sFeedsiuí ís», 19 de Junho, 1971 página 19; Eskeiand ei al., em J. An. Sei., 83, 282, 1971; a Church et al., em «Digestiva Physioiiogy and Nutrition of Ruminante», Ool. 2, 1971, pp. 622 e 625. Se bem que os acetatos e outi ratos sejam utilizados, os propionatos são utilizados com maior eficácia. Ainda, quando existe demasiado pouco propíonaío os animais podem desenvolver ceiose. Portanto um composto benéfico estimula os animais no sentido de produziram uma proporção maís elevada de propionaios a partir de açúcares, aumentando pois a eficácia de utilização de açúcares e também reduzindo a incidência de cstose.

Ainda uma outra doença que provoca perdas económicas aos produtores de animais é causada pelo parasita protozoário Theileria parva . Aquela doença, teileriose, é também conhecida como «Febre da Costa Este:*·, «Febre Costeiras- ou «Febre da Carraça Rodesíanax. 0 parasita ;"hei ler ia invade mas náo destrói os eritróciios o que dá origem a infecçSes febris agudas ou crónicas. No gado vacum a doença é earacterizada por febre elevada, inchaço dos nódulos limfáticos, emagrecimento e mortalidade elevacla. A doença é um problema muito sério na África Este e Central. Consultar ainda «The Merck Veterinary Manuais, Sieqmund et ai., Eds., Merck & Co., Rah^ay, N.J., Séfed., pp. 431.....433 <. 1S73) . U.S. 4,746,650 descreve a produção do UK-S8,852 através da cultura de Ac tlnomadura roseorufa Huang Sp. Nov., AfCC 396S7 num meio nutritivo aquoso em condições de anaerobiose submersa. UK-58,852 á aqui descrito como um novo antibiótico de éter policiclico acidico da fórmula 7

(D ua fermentação da referida Aciinomadura rossorufa Huang sp. nov. ,

AfCC 33637, também sao produzidos dois componentes menores, gue estio relacionados, cada um cios quais é eficaz como antibiótico no controle da coccídiose. Os dois componentes menores sao oa fórmula <II>, abaixo, onde R é H e R" é CH....., o; © n s r< sao amoos

Ch.., , respec i i vamen te 3

(II)

Este invento diz respeito a dois novos antibióticos do éteres polícíclicos acídicos, aqui designados CP-91,243 e CP..... -•91,244; tendo a fórmula

(III) onde R é H para o antibiótico CP-31,243 s R é CH.-.. para o antibió™ tico CP-91,244. Estio também incluídos no âmbito deste invento sais catiónicos dos referidos antibióticos.

Ainda, este invento está relacionado com novos microo-gsnismos que sao mutantes obtidos a partir de Ac tinomadura roseorufa tendo as características de identificação de ATCC S3S38. Os novos microorganismos deste invento são capazes de produzir; atrvés de cultura, CP-31,243 e/ou CP-S1,244. íais novos microorganismos são Actinomadura roseorufa tendo as caracterastí-cas de identificaclo de ATCC 53883 e de ATCC S387. Este invento tamoém diz respeito a outros mutantes, transíormantss e recombi-viantes dos referidos novos microorganismos os quais são capazes os produzir, através da cultura, CP-91,243 e/ou 08-31,244. Ainda, este invento diz respeito a novos microorganismos que são mutantes obtidos a partir de Ac tinomadura roseorufa tendo as caracts..... rísiicas de ideniificaç$o de AíCC S3666 e ainda seus mutantes, iransformsnies e recombínantes todos eles além os produzirem CF-31,243, e/ou CP-91,244 quando cultivados, tamoém produzem UK-58,Θ&2. Ainda, este invento relaciona-se com processos para a produção de CP-91,243, CP-91,244 e o antibiótico conhecido de

éter policiclíco acídico UK-~S8,8S2 através da cultura dos novos microorganísmos deste invento. Este invento também diz respeito a métodos para o controle de infecçfies por coccideos em aves, enterite em animais domésticos tais como galinhas, suínos, gado vacum s carneiros e disenteria em suínos através da administração cie CP-31,243 e/ou CP-91,244 sòsinhos ou em combinado com U;<--58,852 ao referido animal. Estio também dentro do âmbito deste invento, métodos para a promoção do crescimento e/ou utilização ds alimentos em ruminantes e animais monogãstricos o qual se caracierisa pela administração, aos referidos animais , de €8--91,243 s/ou CP--2Í,244 individualmenis ou em combinação um com o outro e/ou UK-58,852. Ainda, este invento é dirigido a composições de nutrientes para alimentos que compreendem CP-S1,243 e/ou CP-S1,244 sozinhos ou em combinação com UK.58,852. 0 termo -«Actinomadura roseorufa tendo as característí·-cas de... - conforme aqui é usado e nas reivindicações apensas deverá incluir a cultura depositada na ATCC á qual tal termo se refere assim como quaisquer outros microorganísmos de Actinomadura roseorufa que tenham ao mesmas carac ter íst i ca?. de idsntificação oa cultura depositada referida por tal termo.

Os novos antibióticos de éteres policiclicos acídicos CP-31,243 e CP-31,244 são produzidos por microorganismos obiioos pela mutação de uma estirpe de Ac tinomadura roseorufa Huang sp. noy. tendo as características de ídentifícação de AfCC 53666 como descrito abaixo. Actinomadura roseorufa ATCC 53SS6 como descrito aoaixo. Actinomadura roseorufa ATCC 53666 foi depositada sob os termos do Tratado de Budapeste na American Type Culture Collection, Rockville, haryland em ligação com com o pedido os patente U.S. pendente do requerente n2 de série 113,563, entregue em 26 ds Outubro de 1987 s atribuído ao presente procurador. Todas as sobre a disponibi1 idade ao púolico do microorgsnismo

serão irrevogavslmente retiradas quandoda concessão da patente. N.....metiI-tr~nitro-N-nitrosoguanidina <NT8> foi usado como muiagé- nío. Colónias isoladas do microorganismo tratado foram então examinadas quanto ao seu perfil de produção. 0 processo geral compreendeu o crescimento de AfCC 53S6S num meio nutritivo aquoso em condições de aerobiose submersas com agitação a uma temperatura de 28‘~‘C. A escolha do meio para o estudo do crescimento não é crítico.

Um meio adequado consiste em cerelose 110,0 g), amido de milho <5, O g); melaço de milho <5,0 g>, iM-£ Amir.e YTF <5,0 g), (riarca Registada para a digestão enzimática de caseína, Humko Sneffisld Chemical Co. Inc.), e cloreto de cobalto <0,002 g> que foi suspenso em um litro de água, pH ajustado a 7,0 com hidróxido de sódio e colocado num frasco Fernbach. Após esterilização por autoclavagem, os frascos foram inoculados com uma suspensão oe crescimento em rampa ou com micélio vegetativo, depois mcuDaoo com agitação num agitador a cerca de 200 rsv/min e uma temperatura de 28'"'C durante sete a oito dias. Retirou-se então uma amostra de 50 ml s o micélio homogenizado num homogeniz-ador de tecidos com um pistão de Teflon seguido de sonicação . 0 micélio fragmentado foi então centrifugado, lavado para retirar o meio, ressus-penso em 50 ml de meio fresco num frasco Erienmeyr de 300 ml e incubado por agitação a 32^ durante duas horas. Em seguida as células foram novamente centriíugadas, lavadas para remover o meio e ressuspensas em 50 ml de tampão trÍ3<hidroximetii>-smino-mstano-malato, pH 9,0. Amostras desta suspensão foram tratadas com ΝΤΘ em concentrações de 750 jug/ml a 1500 ;jg/mi durante uma hora num agitador rotativo de banho-mar ia a 250 a 300 rev/min. © uma temperatura de 34'"'C. Após tratamento, as células foram centriíugadas, lavadas para remover o mutaqènio e amostras foram diluídas seriadamente, semeadas num meio nutritivo sólido e as placas incubadas a 28’~C até as unidades formadoras de colónias isrsm tamanho suficiente para a transferência para rampas. Um meio adequado para para as placas e rampas é o Meio ATCC IMS 172 com :Μ··-2 Amins Tvpe A (Humko Sheffield Chemical Co. Inc.) baixado

para 1,0 g/I. As rampas inoculadas foram deixaoas crescer a 28‘"'C durante 10 a 14 dias após o que eles estavam prontas para testar.

Isto foi feito por inoculação de frascos Erlenmeyer de 300 mi contendo 2SmJ. cie um meio adequado (um destes meios contem cerelo- se, 45,0 g; farinha de soja 10,0 gj melaço de milho 15,0 gj

Mn-SO., . , 0,1 g,‘ MgSO , . 7H,.,0, 0,1 g; cloreto de cobalto, 0,002 g; s carbonato de cálcio, 3,0 g; um litro de água e o ph do meio foi ajustado a 7,0). Apâs ssieri1izaçSo por suioclavagem durante 30 minutos a 121 C, os frascos foram inoculados com suspensões o individuais de crescimentos em rampas e incubados com agitaçio a 2Θ’”ΐηυ;ίέ agitador rotativo durante 7 dias. As culturas muiantes foram detectadas por examinação de extractos de meti 1isofauiiice -tona dos caldos totais colhidos após revelação das placas de cromatografia em camada fina (silica gel) por vaporização com reagente de vanilina e aquecimento a 100!“‘C durante cinco minutos. 0 sistema de revelação foi composto por 9 partes de clorofórmio para 1 parte de metanol que deu valores de Rf de aproximadamente 0,2 para CP—5*1,243, cerca de 0,4 para CP-31,244 e cerca de 0,7 para UK-58,852. Duas culturas muiantes foram assim obtidas produtoras de CP-S.1,243 CP-31,244 e UK-S8,852. Aqueles muiantes foram identifiçados na colecçâo de culturas da Pfeizer Inc. como F'ú 28455 e F0 2.3518. As caracteristicas morfológicas e de cultura oos muiantes assim obtidos são essencialmente as descritas para A. roseorufa ATCC S36SS. A característica que distingue estes muiantes é a sua capacidade para produzir uma mistura de CP-· -•91,243 e CP-31,244. A cultura dos muiantes e isolamento dos antibióticos CP.....91,243 e CP-31,244 pode ser efectuada em condições semelhantes ás empregues em fermentações anteriores que dão antibióticos de

éteres polícicIicos. Consultar, por exemplo, Patente U.S. 4,361,643. A cultura de preferência desenrola-se em meio nutri ti..... vo aquoso, de preferência em condições de aerobioss submersa com agitação a uma temperatura de 24’"'C a 36^0. Hei os nutritivos úteis para a cultura incluem uma fonte assimilável de carbono como sejam açúcares, amidos s glicerol; uma fonte de azoto orgânico como sejam caseína, produtos da digestão enzimáiica da caseína, farinha de soja, farinha de sementes de algodoeiro, farinha de amendoim, glúten de trigo, farinha de soja,farinha de sangue, farinha de carne e farinha de peixe. Podem também ser usada com resultados vantajosos uma fonte de substâncias de crescimento como seja grãos solubi1izados, farinha de peixe,farinha de sementes de algodoeiro s extracio de levedura assim como sais minerais como sejam cloreto de sódio e carbonato de cálcio e micronutrlentes tais como ferro, magnésio, cobre, zinco, cobalto e manganês. Se durante a fermentação se formar espuma excessiva, podem ser adicionados ao meio de fermentação agentes anti.....espuma tais como óleos vegetais ou si licones. 0 arejamento do meio em vasos para o crescimento submerso á de preferência mantido a uma velocidade de 1/2 a 2 volumes de ar estéril por volume de caldo da fermentação por minuto forçado para o caldo através de um puiverizador. A agitação pode ser mantida por meio oe agitadores oe um modo geral familiares para os que estão dentro da área cia fermentação. A velocidade de agitação depende do tipo de agitador empregue. Seralmsnte usa-se um balão de agitação agitado entre ISO e 300 ciclos por minuto enquanto que um fermeniador normalmente á agitado entre 300 e 1700 revoluções por minuto. Devem ser mantidas condições assépticas ao longo da transferência do microorganismo s durante o seu crescimento. 0 inôculo para a preparação dos antibióticos de acordo com este invento pode ser obtido empregando crescimento de uma rampa da cultura de microorganismo pretendida deste invento ou frascos Roux inoculados com a referida cultura ou uma suspensão ds micálio descongelado da referida cultura. Ur* meio solido adequado para o crescimento inicial do microorganismo em rampas s frascos Roux é o meio ATCC N2 172. 0 meio liquido anteriormsnts rever ido no estudo de mutação é adequado para preparar o mícélio vegsiaiivo antes da congelação. 0 crescimento resultante pocie ser usado para inocular frascos ds agitação ou vasos ds inóculo ou os frascos ds inóculo podem ser semeados a partir dos frascos ds agitação. 0 crescimento máximo em frascos de agitação é geraimen..... ts atingido em 4 a 8 dias, enquanto o inóculo em vasos de inóculo submersos estarão no seu período mais favorável em 4 a 5 dias. ϋ progresso da produção de antibiótico durante a fermentação pode ser controlado qualitativamente por cromatogra..... fia em camada fina após visualização por vaporização com reagente de vanilina conforme anieriormente descrito ou a placa revelada pode também ser coberta com agar de infusão de cérebro e coração semeado com 5ac i1lus subtilis e incubado a 37UC durante ÍS horas par® visualizar os antibióticos. A cromaiografia em camada fina ê também um método útil para a análise da composição ds materiais brutos e purificados extraídos a partir do caldo ds fermentação.

Os antibióticos CP-91,243, CP---9! , 244 e UKP-SS, 8S2 produzidos peia fermentação dos referidos muianies acumulam-se no micálio e no caldo a podem ser separados e recuperados por extracçso do caldo de fermentação não filtrado © colhido como um todo, i.e.,todo o caldo, com um solvente orgânico tal como clorofórmio, acetato de etiio, meti 1isooutiicetona ou butanol no pH naturalmente prevalecente. Como alternativa, para evitar proolemas graves de emulsão o micéiio ê separado © ele e o calco clarificado são extraídos individualmente com um solvente orgânico . Os extractos de solvente são concentrados para um xarope fino a oõtsm—se CP-9Í,243, CP-9Í,244 a UK-58,8S2 puros por cromatogra-tis em coluna.

Um método típico de separação e recuperação dos antibióticos deste invento é como se segue! A totalidade do caldo da fermentação do mutante foi extraído com meti 1isobuti 2 cetona. A evaporação do extras to in vácuo deu um õiao avermelhado que foi aplicado numa coluna de sílica gel. A coluna de silica gel foi então aluída com clorofórmio/metanol (13!í> e os eluaios examinados por cromaiograíia em camada fina. As fracç6es enriquecidas em CP.....91,243, CP-91,244 s UK-58,852 foram combinadas s concentradas ou evaporadas até secagem. Cada uma das fracçdes contendo anti™ bíóiico que tinha sido evaporada até à secagem foi então dissolvida em acetato de etilo e as fracçdes aplicadas em colunas individuais de silica gel. As colunas de silica gel foram então eiuidas com acetato de etilo e novamente os eluaios foram exami..... nados por cromatografia em camada fina. As fracçSes contendo CP-Si,243 e CP-31,244 foram cristalizadas a partir de acetato tis etilo enquanto que UK-58,852 foi cristalizado a partir de nexano.

Os antibióticos deste invento podem ser recuperaaos a partir da fermentação em associação com o mxcélio por evaporação do caldo total por métodos conhecidos, incluindo secagem por vaporização ou por separação do micélio do caldo por filtração ou centrifugação. Os produtos de micélio assim ooiiaos compreendem os antibióticos na superfície do micélio e nos seus interstícios tornando o micélio um veículo útil.

Os mutanies ideniif1cados na colecção de culturas da Pfizer Inc. como FD 28455 e FD 28518 foram depositados nos termos do Tratado de Budapeste na American Type Cuiture Collsciíon, Rockville, ílaryland, um depositário conhecido que garante a permanência dos depósitos e fácil acesso a eles pelo público se

_ i p _ for concedida patente a este pedido. A cultura FD £845Sfoi dada a designação d© Actinomadura roseorufa ATCC 53363. ã cultura r'0 28518 foi dada a designação Actinomadura roseorufa ATCC 53870. Os depósitos estão disponíveis durante a pendência deste pedido a alguém determinado peio Commissioner of th© United States Patent and Trademark Office a serem referidos como 37 C.F.R. í,14 e 35 U.S.C. 122 e de acordo com as leis estrangeiras sobre patentes em países em que tenham sido entregues as contrapartes deste pedido ou pedidos dele derivados. Todas as restrições sobre a disponibilidade ao público do mícroorganismo depositado serão irreversivelmente retiradas quando da concessão da patente.

As características de cultura de Actinomadura roseorufa ATCC 53368 s ATCC 53S70 são substancialment© as mesmas das de Actinomadura roseorufa 5366S com excepção de AfCC S38SS a AfCC 53870 produzirem ainda €3-31,243 e C'P-31,244.

As investigações taxonómicas de Actinomadura roseorufa ATCC 53666 foram efectuadas por L.H. Huang que forneceu as aescriçdes que se seguem. A cultura foi semeada numa rampa de caldo ATCC nSÍ/2 e cultivada durante quatro dias a 28°C num agitador. Centrifugou-se durante 20 minutos, lavou-se três vezes com água destilada estéril s semeou-se em meio normalmente usado para a identificação de membros das Actinomycetaies. A cultura foi incubada a 28VC © os resultados foram lidos a diferentes tempos mas de um modo geral foram tirados aos 14 dias. As cores estão descritas na terminologia vulgar, mas as cores exactas foram determinadas por comparação com tiras de cores do Color Harmony Ha nua 1Quarta edição. 0 método de análise de amínoácidos totais celulares é o descrito em Secfcer et ai.,

ftppl. Microbiol., 12, 421.....423; 1984. Os açúcares totais celulares foram analisados pelos métodos descritos em Lechevalier, Lab. klill,. MesL, 7±, 934-944, 1368] e em Staneck e Rofoeris, Ag^pl .

Microbiol . , 28,226-231, 1974. Para fins de comparação usou-se a cultura tipo de Ac tinomadura roseorufa AfCC 39,637.

Os grelos de identi f icação usados para a carac ter isação oss culturas e referências para a sua composição como se segue; 1. Caldo de !"ripiona-Extracto de Levedura - (meio 1SP #1, Difco). 2. Caldo de Exiracto de Levedura-Extracto de Malte («elo ISP #2, Difco> . 3. 4 . 0if co) .

Agar de rarinha de Agar - (meio ISP #3, Difco). Agar de Sais Ínorgánicos-Amido - <meio ISP #4,

Agar de SI1csro!-Asparagina - (meio ISP #5, 6. Agar de Peptona-Extracto de Levedura e Ferro (meio ISP #6, Difco). 7. Agar Czapek-Sacarose - S.A. yaksm&n, The Actinomyceles, Vol. 2, meio 1, p. 328, 1961. 8. Agar Slucose-Asparagina - Ibid, meio n2 2, p. 328. 3.

Agar de Bsnneii - Ibid, irei o n2 30, p. 331. 10.

Agar de Emerson - Ibid, meio n2 28, p. 331. 11. Agar Nutriente - loich meio n£ 14, p.330. 12. Agar com Tirosina ds Sordon s Smith - R.E. Gordon e n.ri. Smitb, J_,_ Elac teriol . 59 í 147--150, 1SSS. 13. Agar de Caseína - Ibid. 14. Agar de ria la to e Cálcio - 3. A. Waksman, Bac ir loi . Rav. 21; 1-29, 1357. 15. Gelatina - R.h. Gordon e J.li. Mihm, Jh. Bac ter iol . 73! 15--27; 1957. 15. Amido - Ibid. 17. Caldo de Nitrato Orgânico - Ibid. 18. Caldo de Nitrato s Dexirose - S.A. Waksman, lhe Actinomrcetss, Vol. 2, meio n2 I, p. 328, 1351, com por 30 g ds sacarose substituído por 3 g ds dextros® s omitido o agar. 19. Agar ds Batata s Cenoura - n.P. Lechevalier, J. Lab. and Clinicai Hsd. 71; 934-944, 1968, mas usando apenas 30 g ds batatas, 2,5 g de cenouras e 20 g ds agar. 20. Agar a 2¾ em água da torneira. 21. Agar Mineral #1 de Gause - 6.F. Gause et al. , Froblsms in the Classification of Antagonistic Actinomycetss, English Ed., p. 13, 1957. 22. Agar Orgânico #2 de Gsuza ·- Ibid. 23. Leite Desnatado - Difco. 24. Utilização de Celulose - a) H.L. Jsnssn, Proc . Linn. Soc. ím.S.W. 55; 231-248, 1930. b) H. Levine & H.W. Schoenlein, A Compilation or Cultura ftaúia , maio n£ 2-511, 1930. 25. Utilização de Ácidos Orgânicos - R.E. 6ordon et sl-, Int. J. Syst. Bacteriol. 24; 54-63, 1974. 26. Produção de Ácidos a partir de Açúcares - Ibid. 27. Hidrólise de Hipuraio e Esculina - Ibid. 28. Decomposição de Adenina, Hipoxanfcina, Xantina a

Ureia - Ibid. 29. Resistência â Lisozima - Ibid. 30 Utilização de Açúcares -· lisio C-2, H. Monomura s Y. Ohara, J_._ 31 Ferment. Technoi. 49; 887-834, 1971. Gama de Temperaturas - Heio ATCC 172 no ATCC

Cultura Coilection Catlogue, ISsed., p.608, 1882.

Uma descrição da cultura de Actlnomadura rosaoruta ATCC 53666

Asar da Exiracio de Levedura- Exiraeio de Ha lie - Bom crescimento vermelho rosado a vermelho (S i/2ia, 7ia, 61 ~·.,· srecio, ondulado, com micélio aéreo branco; face inferior verme-ina 17ia>; sem pigmentos solúveis.

Asa?1 de Farinha de Aveia -· Crescimento moderado, creme <2ca); 1 ígelramente levantado, liso ou aparecendo como colónias isoladas; micélio aéreo inexistente ou esparso, branco; face inferior creme C2ca> ; nenhum pigmento solúvel. fia&E......áftJSajll_Inorgãni cog-âfflido - Crescimento fraco a moderado, incolor a creme <2ca>, fino, liso; micélio aéreo inexistente a esparso, branco; face inferior igual á superfície; nenhum pigmento solúvel. ÚMãL______......Mjxerol,rAsparagin,a - Crescimento fraco a moderado, creme C2ca>, com pontos rosa s vermelho íbea, S í/2ga>; micélio aéreo inexistente a esparso, braiico,' face inferior incolor a creme <2ca>, com pontos vermelhos; sem pigmento solúvel .

Agar.......Czapek-Sacarose - Crescimento fraco a moderado, creme <2ca), com pontos rosa a vermelho <5ea,6 l/2iai; micélio aéreo inexistente ou esparso, branco; face inferior incolor a creme Í2ca); sem pigmento solúvel.

Agar de Ciucose-Asparaglna - Cr esc ime?ito moosrado a bom, rosado a vermelho (6 í/2ga, 6 l/2na>, erecioj liso, granulado a ondulado; micélio aéreo branco a rosa pálido <6ea>; face inferior vermelha (6 i/2ga, 6 í/2ia>; pigmento solúvel amarelado ciaro (3cai.

ftgSH: $e Il.ros.ina de eordon e Smith - Crescimento moderado a bom* rosa-Iaranja (Sea), moderadamente srscio, ondula do; micélio aéreo inexistente a esparso; branco; face inferior igual á superfície; pigmento solúvel amarelado C2ic>.

Agar de Halato e_____Cálcio ~ Crescimento fraco, incolor, fino, liso, nenhum micélio aéreo; face inferior incolorjsem pigmento solúvel.

Agar de Caseína - Crescimento moderado a bom, ross-la-ranja a laranja <4ia, Sia), moderadamente srscio, ondulado sem micélio aéreo;face inferior amarelada a rosa pálido (3ga, Saa)j-com pigmento solúvel castanho (3íc>.

Agar......de Sennett - Crescimento bom, vermelho a vermelho escuro (S l/2ne, 6 £/2ng), srscio, ondulado; micélio aéreo branco a rosa C6sa>; face infsrior vsrmslha (S com pigmento solúvel castanho <3ne>.

Agar de Emerson - Crescimento bom a excelente, laranja (51a, 5na), srscio, ondulado, com micélio aéreo branco;face infsrior laranja (Sic); sem pigmento solúvel.

Agar Nutriente - Crescimento moderado, laranja pálido (Sea, Sga), ligeiramente erecto, liso, ou aparecendo como colónias isoladas, sem micélio aéreo; face inferior laranja pálido (Sga); sem pigmento solúvel.

Agar de 6elalina - Crescimento moderado a bom, laranja pálido (4ga), moderadamente srecto, liso a ondulado; mícôsío aéreo esparso, branco;face inferior laranja pálido <4pa>; pigmento solúvel.

Agar de Amido - Crescimento moderado a bom, laranja pálido <5ga>, moderadamente erecto, liso a ondulado; micélio aéreo esparso, branco; face inferior igustl â superfície; sem pigmento solúvel.

Agar de Batata e Cenoura - Crescimento fraco a moderado, creme a rosa pálido <2ca, 4ca), fino a ligeiramente levantado; micélio aéreo esparso, branco; face inferior creme a rosa pálido (4ca>; sem pigmento solúvel.

Asar com Água da íorneira - Crescimento pobre, incolor a creme (1 i/2ca>, fino, liso,; micélio aéreo esparso, branco;face inferior igual à superfície; sem pigmento solúvel. neio Mineral______1 de 6auxe - Crescimento moderado, rosa a vermelho CSea, 61a). com pontos vermelhos CSíc), ligeiraments levantado, liso; micélio aéreo inexistente a esparso, branco; face inferior igual á superfície; sem pigmento solúvel. - Crescimento moderado a bom, rosa-laranja (Sga), moderadamsnie levantado, ligeiramente ondulado; micélio aéreo esparso, branco; face inferior igual á superfície; sem pigmento solúvel.

Propriedades Morfológicas - Apôs sete semanas de incubação, náo se observou esporos em qualquer um dos meios usados. Mo entanto, em agar de batata e cenoura produziram-se dilatações terminais ,laterais ou intercalares nas hifas; e eram singulares e lisas. Elas surgiram esféricas, ovais ou elípticas s mediam 1,2 a 2,5 mm de diâmetro ou 1,2-2,2 x 0,9-1,8 mm. Foram oossrvadas estruturas semelhantes em agar de exiracio de 1svsdura e exiracio de malte, aga de farinha de aveia, agar com água oa torneira, agar de gelatina, agar de Czapek-sacarose e agar minerai 1 de 6auze.

Propriedades Bioquímicas - Não produziu melanina; não produziu sulfito de hidrogénio,- liquefez a gelatina; não hidroli-zou o amido; reduziu nitrato para nitriio; crescimento ligeiro em caldo de celulose de Jensen mas ausência de crescimento em caldo de celulose de Levine e Schosnlsin; nenhuma desintegração em ambos os caldos de celulose; coagulação e pepionização em leite; digestão de malato de cálcio negativa; digestão de iirosina positiva; digestão de caseína positiva.

Utilização de açúcares; glucose, ramnose © sacarose são utilizados; arabinoss, frutos©, inositoi, manitol, rafinose e xilose não são utilizados.

Os testes positivos incluem- utilização de acetato, propionaio e piruvaio; produção de ácido a partir de glucose,ramnose , maitos© e trealose.

Foram negativos os seguintes testes; decomposição u© adenina, xaniina, hipoxantina e ureia; hidrólise de ©scuiína e mipurato; resistência è lisozima; utilização de benzoato, citrato. dextrina, lactato, malato, mucsio, oxalaio, fenoi e succinato; produção de ácido a partir de arabinose, frutos©, inositoi, manitol, rafinose, sacarose, xilose, adonitol, celobiose, dulci..... tol, erit-rit-ol, galac tose, gl icerol, lactose, manos©, melezítose, malioioss, alfa-metil-D-glucosido, riboss, salicina, soroitol, sorbose s amido.

Análise de Células Totais - Os hidrolisados de cá1u1as totais contem ácido mesodiaminopimelico, galactose, glucose, maduros©, riòos© © ramnose. 2|f C,„ „ O — ^•3 C._. 32Í..JL,. álliL,,. Cresc imento Crescimento Cresc imento Nenhum Moderado Som noderado Cresc imento

Actinomadura roseorufa ATCC 53S6S é caracierizado pela incapacidade para produzir melanina; micélio substrato rosa; rosa-laranja © laranja a vermelho; e a presença da ácido meso-di-amínopimsiico e maduros© como componentes de células totais. Apesar de um longo período de incubação até sete semanas, a cultura não produziu esporos apesar das dilatações das híías terem sido no mesmo meio.

Actinomariura roseorufa ATCC 53666 mostrou-se semelhante â Aciinomadura roseorufa Huang ATCC 39,697 (Psoido de Patente Europeia 169 001) na maior parte das caracierísiícas de cultura e em quase todas as propriedades bioquímicas. Em agar de gelatina e em agar de amido, as colónias de ATCC 53665 eram laranja pálido em vez de creme pálido. Em agar de iirosina e agar de Emerson, elas surgiram laranja em vez de castanho. ATCC 53666 ao contrário de £L_ roseorufa, coagulou o leite. Estas diferenças foram mínimas e portanto a cultura AfCC 53666 é considerada como uma nova estirpe de gn. roseorufa.

Também estio dentro do âmbito deste invento outros mutantes, transiormanies e recombinanies ds mutantes do microor™ ganismo Aciinomadura roseorufa o qual tem as csracterísticas de idsniificação de ATCC 53666 s os referidos mutantes do referido microorgavsismo incluem os que têm sa caracierisiicas de identificação de ATCC 53863 ou ATCC 53870. Tais outros mutantes podem ocorrer espontaneamente ou serem induzidos através de métodos bem conhecidos dos familiarizados com a matéria. De modo semelhante, os iranformanies e recombinanies dos microorganxsmos podem ser obtidos através ds uma variedade de técnicas clássicas s de b xo tecnologia bem conhecidas dos f ami 1 i ar i zados com a área. lodos esses outros rouianies, iraníormantes e recombinantes estão dentro do âmbito deste invento desde que eles produzam um ou ambos os antibióticos CP-31,243 s CP-~S1,244. Também estão dentro d o âmbito deste invento os referidos outros mutantes, t r ans í o rmant es e recombinantes os quais, além ds produzirem os antibióticos Cp-.-3j.243 s/ou CP~Sí,244, também produzem Ui<-S8,8S2 em cultura.

Os novos antibióticos ds éteres poiiciclicos acádicos deste invento são testados quanto â actividade aniiòacteriana m vi iro por métodos convencionais em que é medido as concentrações mxnxmas inifcidoras (MÍCs) em /..igml contra um ou mais microorganis— mos. Um desses processos é o recomendado pela International Collaoorative Siudy on Aniifoiotic Sensitivxty festxng (Erxccson s Sherrís, Ac ta ii ílicrobiologia Scandinav, Supp. 217, Seciion Bl 64--68 £ í 9713 >, e utiliza agar de infusão de coração e cérebrο (8HI1 s um sistema de irsnsferêncxa de inoculo. iubos ds crsscxmento durante a noite foram diluídos 100 vezes para usar como inóculo padrão (20 000-100 000 células em aproxxmarfamsnis 0,002 ml foram colocadas na superfície de agar; 2o ml de agar Bhl/placa). Usou-se doze diluições de 2 vezes da droga a testar com uma dxluição inicial de 200 . As colónias isoladas sso desprezaoas quando da leitura das placas após 18 horas a 37*'"*C. A suscspiibi1 idade (hlCl do organismo a testar ê aceite como a concentração mais baixa do composto capaz de produzir inibição completa do crescimento observado a olho nu.

Os resultados de eficácia para CP-31,243, CP-91,244 e seus sais contra infecções por coccádeos em galinhas é obtida como se segue. Srupos de 3 pintos brancos de 10 dias de idade não infectados foram alimentados com uma dieta de farelo contendo o

composto a estudar ou o seu sal de sódio s/ou potássio uniforme..... mente disperso. Após estarem com esta ração durante 24 horas cada pinto foi inoculado per os com oocistos da espécie particular os Ei mar ia a ser testada. Outros grupos de 3 pintos de dez dias cie idade foram alimentados com uma dieta de farelo semelhante sem o composto a testar ou os seus sais. Eles foram também infectados apôs 24 horas e serviram como testemunhas infectadas. Ainda um outro grupo de 3 pintos com dez dias de idade foi alimentado com a mesma dieta de farelo sem antibiótico e não foi infectado com coccadeos. Os resultados dos tratamentos foram avaliados seis dias mais tarde.

Os critérios usados para medir a actividade anticocci-dial consistem em pontuações de lesões de 0 a 4 de acordo com J.E. Lynch, *-A Ne^ M&ihod oí the Primary Evsiuation of Anticocci-dial Activity*, Am. -J. vei. Res. , 22, 324-326, 1361. A actividade foi medida dividindo a pontuação das lesões de cada grupo tratado pela pontuação de lesões da testemunha infectada. 0 valor dos alimentos ingeridos foi de um modo geral determinado directamente alimentando o animal. A Especificação os Patente Britânica N2 1,197,826 descreve deiaihadamente uma técnica de rumen jji vitro pela qual as alterações induzidas pelos microorganismos são medidas mais facilmente e com maior precisão na avaliação dos alimentos ingeridos pelos animais. Esta técnica envolve a utilização de um sistema em que os processos digestivos dos animais são conduzidos e estudados in vi tro. Os alimentos, inóculo do rumen e vários promotores do crescimento sao introdu..... zidos s retirados de uma uri idade de laboratório sob condições cuidadosamente controladas e as alterações decorrentes sãos estudadas criticamente e progressivamente durante o consumo dos alimentos pelo microorganismo. Um aumento no teor de ácido propiónico do fluido do rumen indica que se conseguiu uma uma resposta desejável na ruminação global de vida ao promotor de crescimento presente na composição de alimentos. A alteração do teor em ácido propióníeo é expressa como percentagem da quantidade de ácido propióníeo encontrado no fluido de rumsn testemunha. Usaram-se estudos de alimentação in. vivo a longo praz© para mostrar uma correlação reprodutível entre o aumento de ácido propióníeo no fluido do rumen s a melhoria da produção animal. 0 fluido de rumen s colhido de uma vaca fistulada alimentada com ração de engorda comercial mais forragem. 0 fluido ao rumen é imedíatamsnte filtrado através de um pano de queijo e adicionou-se 10 mi a um tubo cónico de 50 ml contendo 400 mg de substrato padrão (68% de amido de milho + 17¾ de celulose ··;· 15% de farinha de soja extraída), 10 ml de um tampa© a pH 5,8 e o composto a testar. Os frascos foram gaseados com azoto sem oxigénio durante cerca de dois minutos e incubados nua· banho mar ia com agitação a 39'~'C durante cerca de ÍS horas. Todos os testes foram efsetuados em triplicado.

Após incubação, misturou-se 5 ml da amostra com 1 ml de ácido metafosfórico a 25¾. Após Í0 minutos adicionou-se 0,25 ml cie ácido fórmico e a mistura -foi cenírifugada a 1 500 rpm durante iu minutos. As amostras foram então analisadas por croma tos r a í i a gás···liquido pelo método de D. W. Kellog, J. Dairy Science, 52, 1590, 1069. As alturas dos picos para os ácidos acético, propió-níco e butírico foram determinadas para amostras de frascos de incubação não tratados e tratados.

Para usar no tratamento de coccidiose em aves de capoeira, enterite em animais domésticos tais como galinhas, porcos, gado vacum e carneiros e disenteria de suínos, os compostos deste invento são administrados oralmente num veículo adequado. Conveníeniemente, a medicação é simplesmente deitada di5-sc ismente na água de beber, de preferência na forma de um líquido, concentrado solúvel sm água (como seja solução aquosa de um sal solúvel em água)ou adicionado directamenie nos alimentos, como tal; ou na forma de uma pré-mistura ou concentrado. Para a inclusão do agente nos alimentos normalmente emprega-se uma prè-misiura ou concentrado i&rapêuiico num veiculo, õs agentes adequados são líquidos ou sólidos, conforme se deseje, tais como água, várias farinhas; por exemplo farinha de óleo de soja, farinha de óleo de sementes de linho, farinha de tarouio de milho s misturas minerais tais como as normalmente empregues em rações para aves de capoeira. Um veiculo par ticularmsnte eficaz é o respectivo alimento do animal; ou seja uma pequena porção de tal alimento. Ainda, o mícélio pode ser usado como veiculo. 0 veiculo facilita a distribuição uniforme dos materiais aetivos no alimento acabado com o qual a pré-mistura ê misturada. Isto e importante porque apenas são necessárias pequenas proporções dos presentes agentes, é importante que que o composto seja bem misturado na pre-mistura e subsequentemente no alimento. Relativamente a isto, o agente pode ser disperso ou dissolvido num veiculo oleoso adequado como seja óleo de soja, óleo de milho, óleo de sementes da algodoeiro e similares, ou num solvente orgânico volátil e depois misturado com o veiculo, é óbvio que as proporções oe material activo no concentrado podem sofrer uma larga variação uma vez que a quantidade de agente no alimento acabado pode ser ajustada peia mistura da proporção adequada de pré-mistura com o alimento para se obter o nível pretendido de agente terapêutico.

Os concentrados de elevada potência podem ser misturados pelo fabricante dos alimentos com veiculo proteico como seja farinha de óleo de soja e outras farinhas, como descrito atrás, para produzir suplementos concentrados os quais sao adequados para alimentação directa de animais. Nestes casos permite-se que os aramais consumam a dista habitual. Como alternativa, tais

suplementos concentrados podem ser adicionados direciamenie ao alimento para produzir um alimento acabado nutricionalmente equilibrado contendo um nível terapêuticamenie eficaz do composto deste invento. As misturas slo bem homogenizadas por processos convencionais, como seja num misturador de invólucro duplo para assegurar homogeneidade.

Certamenie, será óbvio para os fami1iarizados com a área que os níveis de utilização do composto aqui descrito variarão de acordo com as circunstâncias. Por exemplo, no tratamento de coccidiose em aves de capoeira, msdicaçao de nível baixo durante o período de crescimento; ou seja durante as primeiras 6 a 12 semanas para as galinhas é uma medida profiláctica eficaz. No tratamento de infecções estabelecidas, podem ser necessários níveis mais elevados para ultrapassar a iníecçáo. 0 nível usado nos alimentos será de um modo geral na gama de 15 a 120 ppm. Quando administrado na água de beber o nível será o que proporciona a mesma dos© diária de medicação, i.e., 15 a 12Ú ppm, tendo em conta a proporção por peso do consumo médio diário de alimento em relação ao consumo médio diário de água.

Os antibióticos deste invento podem ser administrados como ácido livre ou como seus sais catiónícos. Por exemplo, podem ser empregues os sais de sódio ou potássio dos antibióticos, fais sais são formados por métodos bem conhecidos dos fami1iarizados com a área. Os antibióticos CP-31,243 e CP-91,244 podem ser administrados indívidualmente ou em combinação um com o outro e/ou com UK-58,85£. Os antibióticos CP-31,243, CP-S1,244 s UI<“"S8,8S2 podem ser usados na forma bruta ou como caldo cie fermentação seco contendo os antibióticos nas concentrações de potência pretendida. 0 presente invento é ilustrado pelos exemplos que se segues*. Mo entanto deverá ser entendido que o invento nSo está limitado aos detalhes específicos destes exemplos. EXEMPLO l

Fermentação de Actinomadura rossorufa FD 28455 (ATCC 53863) e Recuperação dos Antibióticos £E§£â£â£ia.....do.......Inâculo

Frsparow-ss um meio aquoso tendo a composição que se Í£âlâiZkl.lrP, 10,0 B, 0 S ; 0 5; 0 0 , 002

IjjãlMLãnM

Csrelose

Am i do de ri i 1 ha

Melaço de Milho :¾

Md Am i ne Y"í 1 Cloreto de Cobalto *(Marca registada para a digestão enzimática da caseína, Humko Sheffield Chemical Co. Inc.)

Após o pH ter sido ajustado a 7,0, o meio foi distri..... bui do (8<JQ ml) por frascos Fsrnbach os 2 800 ml, tendo rolha de algodão protegida por papel e esterilizado por autoclavagem ciurants 60 minutos a 121°C <ÍS p.s.i.3. Após arrefecimem-o, o meio foi inoculado com uma suspensão de células vegetativas a partir de uma rampa de Fu 28455. Os frascos foram agitados a 28'"'^ num agitador rotativo tendo um deslocamento de 1,5 a 2,5 polegadas s ISO a 200 ciclos por minuto durante 6 dias.

Fermentação e Isolamento de QEzM.,,243.......,........CPz9,L„243......St......Uj<ziefj*5g,

Um frasco de Fsrnbach contendo SOO ml da cultura crescida foi usado para inocular um vaso de fermentação de 14 litros contendo 8 litros de meio estéril ao qual foi adicionado 4 ml de um agente an ti "-espumante de silicons tendo a seguinte composi ção;

bS ; 0 iOf 0 15f 0 10; 0 0; 1 0; 1

Cersloss Farinha de Soja Melaço de Milho Farinha de Sangue MnSo,, . H.-/J M- a ngSO. 7H,,0 4 2

CoC J....... 8H.....G

Carbonato de Cálcio pH ajustado a 6;3-7=0 A fermentação foi eíeciuada a 30""'C com agitação a SOo revoluções por minuto e arejamento a 0,75 volume de ar por volume as caldo por minuto até se produzir aciividads suostancial. ΰ Cr-Si; 243/CP-Si, 244/UK--S8,8S2 no calo o s as recuperações foram visualizadas usando placas de cromatografía de camada fina em sílica gel desenvo!vidas com um sistema consistindo em S;i clorofórmio ,*metanol. As placas foram vaporizadas com reagente de vanilina (6 g de v&nilina em Í00 ml de eianoX e 3¾ de ácido •sulíúrico concentrado > e aquecidas a iOO^C durante 5 minutos, us antibióticos surgiram como manchas azul avermelhado. Como altsr..... nativa aplaca è coberta com agar semeado com 8^ subii 1 is.= ao qual foi adicionada ima solução de 0,4 ml de uma solução a 5% oe cloreto de 2,3, S-ir i f sni 1-21-1-te trazó! io e incuoada a 37'"'C durante IS horas para visualizar os antibióticos como áreas incolores contra um fundo vermelho.

Todo o caldo (15 1 itroslobtido por combinado dos caldos da fermentação de dois fermentadores da 14 litros foi agitado durante 20 minutos com um volume igual da meti 1isobuii1-catona. As fasas aquosa e d© solventa foram separadas, a fase aquosa foi rsjsitada © o solvente foi concentrado para dar um óleo (24 g). Este concentrado foi cromaiograíado numa coluna da 700g de sílica gel (70-230 mesh, Universal Absorvents) numa coluna de vidro de S,S cm x S cm usando ciorofórmio·:metanol ílSui) como eluato. 0 fluxo foi de 10 ml/minuto e colheu se uma fj'-acçao por minuto. Estas fracçâes foram examinadas por cromaio-grafia em camada fina (placas de sílica gsl 6F Anaiiech), desenvolvidas num sistema de cIorofórmiometanol < 9; 1 > e visualizadas por vaporizaçSo/aquecimento com reagente de vanílína como descrito atras. As fracçdes contendo principalmente CP-91,243, Cr- .....31;244 ou UK-5S;8S2 foram combinadas por antibiótico e concen..... iradas para dar 0,7 g de CP-91,243, 4,3 g de CP-91,244 e 3,S g de UK......58,852 . 0 concentrado contendo CP-91,244 foi novamente cromaio-grafado numa coluna de 200 g de silica gel (70-230 mesh, Univrsa! Adsorbsnts) numa coluna de vidro de 2,5 cm x 100 cm usando acetato de ©tilo como eluato. 0 fluxo foi de 10 ml/mín e coibida uma fracçlo por minuto. As íracções foram analisadas por cromaio-grafia em camada fina como descrito atrás e as fracçõ&s enriquecidas em CP-S1,244 foram combinadas, concentradas e cristalizadas a partir de acetato de ©tilo para dar 850 mg de CP-91,244.

As fracçôes com CP-91,243 e UK-58,852 foram cromatogra-raoas do mesmo modo para dar 280 mg de CP-91,243 que cristalizou

a partir de acetato de etiio e i;S g da UK~S8,8S2 pua foi cristalizado a partir de hexano.

As anêlises estruturais para CP™91,243 e CP-91,244 foram então feitas com base em C-Í3MÍ1R, análise elementai e FAB/rlS dos sais de sódio dos antibióticos por comparação com os antibióticos conhecidos UI<--S8,8S2 e UK~S 1,889. CP™91,243 deu o seguinte; mp i78-180^0, ι«3π™·'"''=···7 = S"'- (c = l, CH.-.0H3 e FAB/118 996 (M"i~Na3 ' ]

Anal. Cale. para %OH830Í8NsH201 C, 59,22] H, 8,47 Encontrado C, 59,22] H, 8,23 C--Í3 nmr £ desvio quimico(ppm) em CDCL-, (com duas descidas CD....003 com o número de hidrogénios entre parêntesisj ; 179,3 (0), 107,6(03, 103,3(1), 102,5(13, 93,0(0), 97,0(0), 87,1(13, 84,8(03, 84,3(03, 82,6(13, 32,4(13, 81,8(13, 81,0(13, 80,2(13, 76,0(13, 75,8(13, 73,4(13, 71,4(13, 70,9(13, 70,2(13, 67,9(13, 67,6(13, 59,6(33, 45,4(23, 44,7( 13, 39,9(13, 39,(3(23 , 36,6(23, 33,8(13, 33,8(23, 38,5(13, 33,5(23, 33,1(13, 32,3(2.·! . 32,3(23, 32,3(23, 31,4(23, 31,0(23, 27,5(33, 26,9(23, 2S;IÍ3Í; 23,2183, 18, 1 ( 3 3 , 17,9(33, 17,4(33, 2 b, 8 ( 3 3 , 12,3(33, 10,9(33 e 10,3(33. CP-91,244 deu o seguinte; mp 1S4™1S7'"'C, tccj (c — í , CrUOH3 e FA8/I1S 1010 <i1+Na)‘t']

Anal. Cale. para Cc., Hop01C!Na; C, 60,68] H, 8,59

Encontrado; C, 60,41] H, 8,58.

O· 13 nmr Ldesvio químico (ppm) em C0C1... com o número de hidrogénios entre parêntesis); 179,3(0), 107,6(0), 103,2(í) , 102,SCí) , 98,0(0), 97,0(0), 87,1(1) , 84,7(0) , 84,3(0), 82,6(1), 82,4<Ϊ), 81,8(1), 80,9(1), 80,3(1), 80,0(1) , 75,8(1), 74,7(1), 73,1(1), 71,7(1), 70,2(1), 67,8(19, 67,6<1) , 59,6(3), 56,8(3), 45,7(2), 44,8(1), 40,0(1), 39,0(2), 36,6(2) , 33,9(2), 33,7(1), 33,6(1), 33,6(2), 33,2(1), 32,6(2), 32,4(2) , 31,7(2), 31,5(2), 30,7(2), 27,7(3), 27,0(2), 26,9(2), 26,1(3) , 23,8(31, 18,4(3), 18,1(3), 17,5(3), 17,0(3), 12,4(3), 11,1(3) e 10,4(3).

Assim* a CP-31,243 a CP-91,244 foi atribuída a fórmula estrutura1

onda R é H em C'P-91,243 ©Ré CH0 emCP---91,244 . i^ioPLâ^.

Fermentação de Actinomadura roseorufa FD 28518 (ATCC 53870) e Recuperação dos Antibióticos

Seguindo o processo descrito no Exemplo 1, Aciinomadura roseorufa AfCC 53870 foi fermentada, o caldo <15 litros) foi extraído a a fase de solvente foi concentrada para dar um óleo <17 g). 0 concentrado foi cromatografsdo de acordo com o processo descrito no Exemplo 1. As fracçdss contendo principalmsnts CP-Si ;243; CP~91,244 olí UK-S8,3S2 foram combinadas por antibiótico e concentradas para dar S g de CP"~9í,243, 3,5 g de CP-91,244 e 2;S g de UK---58,852. Os concentrados foram ainda c romatograf acíos s cristalizados de acordo com o processo descrito no Exemplo i para os concentrados ali tratados para dar 1,2 g de CP-31,243, 480 mg de Cr-91,244 e 190 mg de Ui<--S8,8S2.

Claims (2)

1. REIVINDICAÇÕES lâ. ~ Processo para a produção de um antibiótico da fórmula I

   © os seus sais catiônicos farmacêuticamente aceitáveis em que R é H ou CH0, caracterizado por compreender a fermentação, num meio nutritivo aquoso contendo fontes assimiláveis de carbono, asoto e sais inorgânicos em condições de fermentação aeróbia submersa, de um mutante do microorganismo Actinomadura roseorufa» tendo o referido microorganismo as características de ádentificação da AfCC 53666, ou de um outro seu mutante, transformante ou recom~-binante, sendo o referido mutante, outro mutante, transformante ou recombinante capas de produzir o referido antibiótico.
2. 21·. - Processo para a produção de antibióticos h~. fórmula och3

   em que ft é H e/ou CH.~, que ss caracierizado por compreender a C* fsrnisntacá'0; nus meio nutritivo aquoso contendo fontes assimiláveis de carbono, azoto s sais inorgânicos em condições de fermen..... tacão serôdia submersa, de um muiante do microorganismo Aciinoma··-dura roseorufa, tendo o referido microorganismo as caracierisii-css de idsniificação da ATCC S36SS, ou de um outro seu muiante, transformante ou recombinanie, sendo o referido muiante, outro muiante, transformante ou recombinanie capaz de produzir os referioos antibióticos. 3ã. ~ Processo para a produção de um antibiótico oa fórmula ,,tOCH3

   caracteriza por compreender a fermentação, num meio nutritivo aquoso contendo fontes assimiláveis de carbono, azoto s sais inorgânicos em condiçSes de fermentação aerébia submersa, de um mutante do microorganismo Actinomadura roseofura= tendo o referido mieroorganismo as caracterásticas de identificação da ATCC 53SSS, ou de um outro seu mutante, transiormante ou recombinante, sendo o referido mutante, outro mutante, transformante ou recombinante capaz de produzir o referido antibiótico. 4§. - Processo de acordo com a reivindicação 1, 2 ou 3, cracterizado por se proceder à fermentação de Ac t i nomadura roseorufa. tendo as características de identificação da A 1"CC S3SS9 ou AfCC 53S70, ou de um seu mutante,transformante ou recombinante capaz de produzir, através de cultura, o referido antibiótico. Sã. - Processo de acordo com a reivindicação 1, 2, 3 ou 4, caracterizado por compreender ainda o isolamento do referido antibiótico. 6§. - Mutante do microorganismo Actinomadura roseorufa, caracterizado por o referido microorganismo ter as caracteristí™ cas de identificação da AfCC 53665 ou de um outro seu mutante, transf ormante ou recombinante, sendo o referido mutarste, outro mutante, transformante ou recomòinante capaz de produzir, através de cultura, um antibiótico de acordo com a reivindicado 1 ou um antíbiôíico de acordo com a reivindicação í e um antibiótico da fórmula

   7§. - Actinomadura roseofura de acordo com a reivindi-cação 2, caracterizada por ter as caracteristicas de identificado de A fCC 53869 ou A í"CC 53870, ou de um seu mutante, trsnsfor— mante ou recombinanie, sendo a referida Actinomadura roseofura ou seu mutante, transformante ou recombinante capaz de produzir, através de cultura, um antibiótico de acordo com a reivindicação 1 . Ba. - Método para o controlo de infecçôes coccidicas em aves de capoeira, caracterizado por compreender a administração, às referidas aves, de uma quantidade aniicoecidicamenie eficaz, de cerca de ÍS a cerca de 120 ppm, baseado na quantidade total de ração, de; (a) um antibiótico de acordo com a rei vindicado í; ou (b) os antibióticos de acordo com a rei vindicado 1; ou

   ic') um antibiótico de acordo com a reivindicação 1 e com Uí<“'58 852 · ou (tí) os antibióticos ds acordo com a reivindicação 1 s UK-S8 852. Sã. - Processo pra a preparação uma composição ds ração nutriente para aves de capoeira; caracterizado por se incluir na r-sferida composição; (a) um antibiótico de acordo com a reivindicação 1; ou <o> os antibióticos de acordo com a reivindicação 1; ou <c) um antibiótico de acordo com a reivindicação 1 s com UK--S8 852; ou <c!> os antibióticos de acordo com a reivindicaçfío 1 s UK-S8 8S2. numa quantidade eficaz para controlar infecçâss por coccltísos nas referidas aves de capoeira. lôsi. - método para o tratamento de enterite em animais domésticos, caracterizado por compreender a administração, aos referidos animais domésticos, de uma quantidade que trate a enterite, de cerca de 15 a cerca de 120 ppm, baseado na quantidade total de ração, de; (a) ua; antibiótico de acordo com a reivindicação 1; ou <b> os antibióticos de acordo com a reivindicação ;i; ou * ϊ * ϊ

   <c> um antibiótico d© acordo com a reivindicação 1 © com UK-58 852; ou (d> os antibióticos de acordo com a reivindicação í s UK-58 852. lis. - Processo par® a preparação de uma composição de ração nutriente para animais domésticos, caracierizado por se incluir na referida composição! is.j um antibiótico de acordo com a reivindicação í; ou <b) os antibióticos de acordo com a reivindicacao 1; ou <c> um antibiótico de acordo com a reivindicação í © com URP-S8 852; ou (dl os antibióticos de acordo com a reivindicação i e Uk:~S8 8S2. numa quantidade sficaz para tratar enterite nos referidos animais domes 13. cos . Í2â. - Método para o tratamento de disenteria em suínos, caracterizado por compreender a administração ao suíno, de cerca cie 15 a cerca de 120 Rpm, baseado na quantidade total de ração, de; Cal um antibiótico de acordo com a reivindicação i; ou <b> os antibióticos de acordo com a reivindicação ij ou Cc ) um antibiótico cie acordo com a reivindicação i e com U K ~ 6 S 8 ó 1-2} o u (tí) os antibióticos de acordo com a reivindicado I e UK-SS 8S2. Í3i. Método para promover o crescimento s/oy melhorar a eficácia de utilização de alimentos num animal ruminante ou monogâstrico, caracterizado por compreender a administração ao referido animal de uma quantidade que promova o crescimento e/ou melhore a eficácia da utilização de alimentos, de cerca de 15 a cerca de 120 ppm, baseado na quantidade total de ração, de; <a> um antibiótico de acordo com a reivindicado íl ou Co) os antibióticos de acordo com a reivindicação i; ou kc) um antibiótico de acordo com a reivindicação 1 e com UK"58 8*2; ou (d? os antibióticos de acordo com a reivindicação 1 s UK--S8 8S2. Lisboa, 30 de Maio de 1390

   Agente Oficial da Preprieánie Industrial RUA VICTGR C©l»ON, 10-A, 1,· 120Ô U6B©A