PT94905B - Plantas com flores sementes ou embrioes modificados - Google Patents

Description

PLANT_ÇENETIÇ__SYSTEMS_X_N_XV_X

PLANTAS COM FLORES, SEMENTES OU EMBRIÕES MODIFICADOS

A presente invenção diz respeito a uma planta com esteri. lidade feminina e ao seu material reprodutor (por exemplo, semen tes), no qual as células foram transformadas de tal modo que uma sequência de ADN estranho se encontra estavelmente integrada no seu genoma nuclear. A sequência de ADN estranho da presente invenção contém um primeiro ADN estranho a seguir designado o ADN de esterilidade feminina) que: 1) codifica um primeiro ARN, pro teína ou polipéptido que, quando produzido ou hiper-produzido na célula de uma flor, particularmente num órgão feminino pertencente a essa flor, ou numa semente, ou num embrião dessa planta, per turba significativamente o metabolismo, o funcionamento e/ou o de senvolvimento da célula da flor e/ou da semente e/ou do embrião em causa; e 2) que se encontra na mesma unidade transcricional de, e sob o seu controlo, um primeiro promotor que é capaz de dirigir a expressão do ADN da esterilidade feminina de maneira selectiva, nas células das flores, particularmente em um ou mais dos seus or gãos femininos, ou das sementes ou dos embriões dessa planta. Em particular, a presente invenção diz respeito a uma dessas plantas com esterilidade feminina nuclear e ao seu material reprodutor no' qual a sequência de ADN estranho a que se refere a presente invenção é uma sequência de ADN quimérico estranho que pode também conter um segundo ADN estranho (o marcador de ADN) que: codifica um segundo ARN, proteína ou polipéptido que, quando se encontra presente pelo menos num tecido específico ou em células específicas

da referida planta, torna a totalidade de planta facilmente sepa rãvel de outras plantas que não contêm o segundo ARN, proteína ou polipéptido pelo menos nesse tecido especifico ou nessas células específicas; 2) e que se encontra na mesma unidade transcricional de, e sob o controlo de, um segundo promotor que é capaz de dirigir a expressão do ADN marcador pelo menos no tecido específico ou nas células específicas da planta em causa; e 3) que se encontra no mesmo locus genético do genoma nuclear das células da planta que o ADN da esterilidade feminina.

A presente invenção também diz respeito a uma sequência de ADN quimérico e estranho que contém pelo menos um ADN de esterilidade feminina sob o controlo de pelo menos um primeiro promotor e que pode também conter, adjacente ao(s) ADN(s) de esterilidade fe minina e ao(s) primeiro(s) promotor(es) pelo menos um marcador de ADN sob o controlo de pelo menos um segundo promotor.

A presente invenção também diz respeito a um vector que contém uma sequência de ADN estranho desta invenção e que é adequa da para a transformação de uma célula vegetal, graças ao que a sequência de ADN estranho se integra de maneira estável no genoma nu clear da referida célula.

A presente invenção diz ainda respeito ãs células duma ·’ planta ou a culturas de células vegetais, cujos genomas nucleares se encontram transformados com a sequencia de ADN estranho.

A presenLe invenção diz ainda respeito a um processo para produzir uma planta com esterilidade feminina e fertilidade mascu-3-

lina de origem nuclear e ao seu material reprodutor, que contém a sequência de ADN estranho, no qual o ADN de esterilidade feminina:

1) se encontra sob o controlo de um primeiro promotor; 2) se encontra estavelmente integrado no genoma nuclear das células vegetais dessa planta; 3) pode ser expresso selectivamente em células de cada flor, particularmente nas células dè um órgão feminino per tencente a essa flor, ou em cada semente ou em cada embrião da plan ta sob a forma de um primeiro ARN, uma proteína ou um polipéptido; e opcionalmente 4) se encontra no mesmo locus genético do ADN mar · cador sob o controlo do segundo promotor.

A presente invenção também diz respeito a um processo para produzir sementes híbridas, que se desenvolvem para formar plan tas híbridas, graças ao cruzamento de 1) uma planta com esterilidade feminina da presente invenção que pode incluir, no seu genoma nuclear, o marcador de ADN, codificando preferencialmente uma proteína que confira uma resistência a um herbicida a essa planta; e

2) uma planta com fertilidade feminina sem o ADN marcador no seu genoma. A presente invenção particularmente diz respeito a um processo tal que sirva para produzir sementes híbridas em escala comercial, preferencialmente numa população substanciálmente aleatõ ria, sem necessidade de muita mão-de-obra.

Antecedentes da Presente Invenção

A hibridação de plantas é reconhecida como um importante processo para se conseguir uma descendência que tenha uma combina ção das características desejáveis das plantas progenitoras. A des cendència híbrida resultante tem frequentemente a capacidade de

ultrapassar as palntas progenitoras em relação a diferentes características, tais como a produção, a adaptabilidade a mudanças do ambiente e a resistência a doenças. Esta capacidade é chamada he terose ou vigor híbrido. Como consequência, a hibridação tem sido largamente utilizada para melhorar as culturas principais, tais como o milho, a beterraba sacarina e o girassol. Por um certo número de razões, principalmente relacionadas com o facto de a maior parte das plantas serem capazes tanto de auto-polinização co mo de polinização.cruzada, a polinização cruzada controlada de plantas sem auto-polinização significativa, para produzir uma co lheita de sementes híbridas, tem sido difícil de conseguir em esca la comercial válida.

Na natureza, a grande maioria das plantas das searas produ zem órgãos reprodutores masculinos e femininos na mesma planta, de um modo geral próximos uns dos outros na mesma flor. Isto favorece a auto-polinização. Algumas plantas, todavia, são excepções, como resultado de uma morfologia particular dos seus órgãos reprodutores que favorece a polinização cruzada. Essas plantas produzem uma descendência híbrida com vigor e adaptabilidade aumentados. Tal tipo de morfologia que pode ser encontrado na Cannabis ssp. (canha mo) implica a existência de órgãos reprodutores masculinos e femininos em plantas separadas. Outra morfologia desse género, que se encontra no Zea mays (milho) implica a presença de órgãos reprodutores masculinos e femininos em diferentes partes da mesma planta. Outra morfologia desse tipo encõntra-se na Elaeis guineensis (palmeira) , implicando a existência de gâmetas fertéis masculinos e femininos que se tornam ferLéis em ocasiões diferentes do dcsenvol vimento da planta.

Algumas outras espécies vegetais, tais como a do Ananas comosus (ananás) favorece a polinização cruzada através de uma fisiologia particular dos seus órgãos reprodutores. Essas plantas desenvolveram aquilo a que se chama um sistema de auto-incompatibilidade, graças ao qual o pólen de uma planta não é capaz de fer tilizar o gãmeta feminino da mesma planta ou de outra planta com o mesmo genõtipo.

Hã ainda outro tipo de espécies vegetais que favorecem a polinização cruzada por exibirem espontaneamente a característica genósica designada por esterilidade masculina. Graças a esta ca racterística, as anteras da planta degeneram antes de o pólen pro duzido por essas anteras atingir a maturidade. Ver: Male-Sterility in Higher Plantes, M.L.H. Kaul 1987, in Monographs on Theoreti. cal and Applied Genetics 10, Edit. Springer Verlag. Tal caracterís^ tica de esterilidade masculina natural é supostamente devida a uma grande gama de mutações naturais, na maior, parte dos casos envolvendo deficiências recessivas, e essa característica não pode fa- > cilmente ser mantida numa espécie vegetal que predominantemente se auto-poliniza, dado que em condições naturais não se produzirão se mentes.

Algumas outras plantas favorecem a polinização cruzada por naturalmente exibirem a característica da esterilidade feminina devida a um deficiente funcionamento ou do gametófito feminino, do gãmeta feminino, do zigoto feminino ou da semente. Estas plantas não produzem sementes viãveis. Hã muitas mutações diferentes que podem levar a este tipo de esterilidade, envolvendo todas as fases de desenvolvimento de um tecido específico do órgão reprodutor fe-6-

minino. Esta característica distingue a esterilidade feminina do mais generalizadamente conhecido fenómeno de esterilidade masculi_ na e de auto-incompatibilidade. Apesar de reduzir o número de des^ cendências que uma espécie pode produzir, a característica da este rilidade feminina tem algumas vantagens evolutivas na natureza para certas plantas, especialmente para as perenes. Nas plantas pere nes, o ritmo do crescimento vegetativo é em grande parte determina do pela distribuição da biomassa entre os tecidos vegetativos e re produtores da planta. As plantas com esterilidade feminina tendem a crescer mais vigorosamente do gue as plantas com fertilidade fe minina.

Apesar de as mutações que induzem a esterilidade feminina provavelmente ocorrerem tão frequentemente como as mutações que in duzem a esterilidade masculina, as mutações que induzem a esterili_ dade feminina sêo muito menos utilizadas na técnica de cultivo das plantas e de produção das sementes e foram consequentemente muito menos estudadas, e existem apenas alguns escassos exemplos dessas

Uma ilustração bem documentada da esterilidade feminina ocorre nas palmeiras (Elaeis guineensis) em que a doença designada por pisifera se caracteriza pela incapacidade de a semente em desenvolvimento produzir um invólucro duro. Como resultado disso, a semente em desenvolvimento aborta numa fase precoce e nenhum fru to maduro se vem a formar. 0 gene que codifica o genõtipo da pisifera actua como um alelo semi-dominante. A planta que seja homozi. gõtica para tal alelo não será capaz de produzir um invólucro duro para a semente e, consequentemente, não terã nem frutos maduros nem

sementes. As plantas heterozigõticas para este alelo produzem fru tos maduros e sementes com uma casca pouco espessa (0,5 a 2 mm), ao passo que as plantas de tipo selvagem (que não são portadoras do referido alelo) produzem frutos maduros e sementes com cascas de 2 a 6 mm de espessura. Estes dois genótipos são impossíveis de distinguir no que diz respeito ã produção de sementes, e o seu genótipo é determinado pelo da planta feminina progenitora. Ao fazer -se a cultura de palmeiras, o tipo pisifera é utilizado como planta progenitora masculina em todas as produções de sementes co merciais. Pelo cruzamento do põlen das palmeiras de tipo pisifera com plantas progenitoras femininas do tipo selvagem, obtém-se uma população com sementes híbridas Fl homogénea, que produzem frutos com cascas finas.

Outro exemplo de uma planta com esterilidade feminina natural, utilizado para a produção comercial de sementes híbridas, é a alfalfa. A alfalfa ê bem conhecida por ter genes de esterilidade masculina, mas ao testar-se um sistema de produção de sementes hl bridas em que as plantas com esterilidade masculina e .fertilidade masculina são semeadas em filas separadas, foi visível que apenas uma quantidade insignificante de sementes híbridas foi produzida. Esta baixa produção foi devida ao facto de as abelhas, responsáveis pela polinização, terem baixa afinidade para as plantas com esterilidade masculina, favorecendo a auto-polinização das plantas com fertilidade masculina. Para obter uma boa semente, foi necessá rio fazer uma plantação cruzada muito próxima uma da outra (e de£ te modo não em fileiras separadas) das plantas progenitoras com fertilidade masculina e esterilidade masculina. Isto foi possível quando um gene de esterilidade feminina foi descoberto e cultivado

*5» por integração nas plantas com fertilidade masculina. Consequentemente, as únicas sementes que podiam ser produzidas nos canteiros onde se tinha efectuado uma sementeira aleatória eram sementes hi_ bridas obtidas por polinização cruzada entre as plantas progenito ras com esterilidade feminina e as plantas progenitoras com esteri. lidade masculina.

No que diz respeito a outras culturas, a esterilidade fenvi nina foi já^: reportada, tal como sucede com o sorgo (Casady et al.,

J. Hered., 51 (1960) 35-38), o algodão (Tustus e Meyer, J. Hered., 54 (1963) 167-168), o tomate (HOnma e Pratak J. Hered., (1964) 143-145) , o trigo (Gotzov e Dzelepov Gen. Plant Breed. , ]_ (1974) 480-487) , e o milho miúdo (Hanna e Powel, J. Hered., 65 (19 74) 247-249) . Hã todavia, diversos problemas que têm a ver com a manutenção das linhas com esterilidade feminina e, por essa razão, essas linhas não são usadas de maneira importante ã escala comercial.

Em comparação com as plantas com esterilidade masculina, o uso das plantas com esterilidade feminina oferece algumas outras vantagens para a produção de sementes híbridas. A esterilidade feminina permite a produção de frutos sem sementes e o aumento de produção da biomassa vegetativa e pode, em certos casos, induzir maior produção de flores dentro de uma mesma estação do ano.

Sumário da Presente Invenção

De acordo com a presente invenção, proporciona-se uma célu la de uma planta em gue o gcnoma nuclear contém, integrado de manei ra estável na sua estrutura, uma sequência de ADN estranha, prefe-9-

rencialmente uma sequência de ADN estranha de natureza quimérica, caracterizada por:

(a) Um ADN indutor da esterilidade feminina que codifica a estrutura de um primeiro ARN, proteína ou polipéptido que, quando produzido ou hiper-produzido numa célula de uma flor, particularmente nas células de um órgão feminino dessa mesma flor, numa semente num embrião dessa planta, perturba significativa mente o metabolismo, o funcionamento e/ou o desenvolvimento da célula da flor, da semente, ou do embrião; e (b) Um primeiro promotor capaz de dirigir a expressão do ADN que induz a esterilidade feminina de maneira selectiva em células das referidas flores, particularmente num seu órgão feminino, nas sementes, ou nos embriões da planta; estando o ADN capaz de induzir a esterilidade feminina na mesma unidade transcricional desse primeiro promotor e sob o seu controlo.

A sequência estranha de ADN no genoma nuclear da célula transformada pode também compreender, preferencialmente no mesmo locus genético do ADN da esterilidade feminina:

(c) Um marcador de ADN que codifica a estrutura de um segundo ARN, proteína ou polipéptido que, quando se encontra presente em pelo menos um tecido específico ou em células específicas da planta, torna a planta referida facilmente separável de outras plantas que não contêm o segundo ARN, proteína ou polipéptido, pelo menos no tecido especifico ou nas células específicas; e

-lOj(d) Um segundo promotor capaz de dirigir a expressão do marcador de ADN em pelo menos um tecido especifico ou em células espe cif icas; estando o marcador de ADN, naste caso, na mesma uni. dade transcriciónal do segundo promotor e sob o seu controlo.

A presente invenção proporciona também uma sequência estra nha de ADN de natureza quimérica que compreende o ADN de esterilidade feminina e o primeiro promotor e que pode também compreender o marcador de ADN e o segundo promotor, bem como pelo menos um ADN adicional que codifica: um péptido de trânsito capaz de transportar a primeira proteina ou o primeiro polipéptido e/ou a segunda prote/ na ou o segundo polipéptido para dentro de um cloroplasto ou de uma mitocõndria de uma célula vegetal, na qual a sequência de ADN estra nho de tipo quimérico é objecto de expressão do seu citoplasma; e/ou um péptido de sinal secretõrio capaz de segregar a primeira proteína ou o primeiro polipéptido e/ou a segunda proteína ou o segundo polipéptido para fora de uma célula vegetal ou de um tecido vegetal, no qual a sequência de ADN estranho de natureza quimérica é expresso .

Ainda de acordo coma presente invenção, proporciona-se:

uma planta com esterilidade feminina e fertilidade masculina e uma cultura de células vegetais, sendo cada uma constituídapor células que contêm a sequência de ADN estranho; um fruto de uma planta com •z esterilidade feminina sementes híbridas e plantas híbridas produz/ das pelo cruzamento da planta com esterilidade feminina com uma plan ta com fertilidade feminina; e um processo para a produção de sementes híbridas, bem como frutos sem sementes.

Ainda, de acordo com a presente invenção, proporcionam-se primeiros promotores específicos do estiiete, do estigma, do ovário, das sementes e dos embriões da planta em causa.

Descrição pormenorizada da presente invenção

De acordo com a presente invenção, produz-se uma planta com esterilidade feminina e fertilidade masculina a partir de uma célula única de uma planta pela transformação da célula vegetal, de um modo bem conhecido, para inserir de maneira estável no geno ma nuclear da célula, a sequência de ADN estranho a que se refere a presente invenção. A sequência estranha de ADN compreende pelo menos um ADN da esterilidade feminina e que se encontra sob o con trolo do primeiro promotor e com ele fundido na sua extremidade 5' e que se encontra ligado na sua extremidade 3' a uma sequência adequada de sinais de terminação (ou regulação) da transcrição, incluindo um sinal de poliadenilação. Por consequência, o primeiro ARN, a primeira proteína ou'6 primeiro polipéptido é produzido ou hiper-produzido selectivamente nas células de todas as flores, particularmente nas células de um ou mais orgãos femininos a ela pertencentes, e/ou em todas as sementes e/ou em todos os embriões da planta, de maneira a tornar essa planta estéril sob o ponto de vista feminino. A sequência estranha de ADN pode também compreen-

der	pelo menos um marcador	de	ADN que	se	encontra sob o controlo
do	segundo promotor e	com	ele	fundido	na	sua	extremidade 5' e	que
se	encontra ligado na	sua	extremidade	.3'	aos	sinais adequados	de

terminação da transcrição, incluindo um sinal de poliadenilação.

genético que o ADN da esterilidade feminina, pelo que o segundo

O marcador de ADN encontra-se preferencialmente no mesmo locus

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ARN, a segunda proteína, ou o segundo polipéptido é produzido pe lo menos no tecido específico ou nas células especificas da plan ta com esterilidade feminina, de tal modo que a planta possa ser facilmente distinguida e/ou separada de outras plantas que não contêm o segundo ARN, proteína ou polipéptido no tecido específi. co ou nas células específicas. Isso garante, com um elevado grau de certeza, a segregação simultânea de ambos o ADN da esterilida de femininae do marcador de ADN na descendência da planta.

De acordo com a presente invenção, a célula de uma planta (particularmente de uma planta susceptível de ser infectada com Agrobactérium) ê preferencialmente transformada pela utiliza, ção de um vector que ê um plasmídeo-Ti desarmado que contêm a se' quência estranha de ADN e ê transportado pelo Agrobactérium. Essa transformação pode ser efectuada pela utilização de processos des^ critos, por exemplo, nas publicações das patentes de invenção eu ropeias 0116718 e 0270822. Os vectores de plasmídeos-Ti preferidos, contêm a sequência estranha de ADN entre as sequências limitrofes, ou pelo menos têm-na localizada ã esquerda da sequên cia limítrofe da direita, do ADN-T do plasmídeo-Ti. Como é evidente, podem ser utilizados outros tipos de vectores para trans formar a célula vegetal, utilizando processos tais como o de transferência directa de genes (tal como foi descrito, por exemplo, na publicação da patente de invenção europeia n° 0223247), a transformação mediada pelo pólen (tal como foi descrita, por exemplo, na publicação da patente de invenção europeia nQ 0270356, na publicação PCT WO85/01856, e na publicação da patente de invenção europeia n9 0275069), a transformação in· vitro de protoplastos (tal como foi descrita·, por exemplo, na patente de

invenção norte-americana nQ 4684611), a transformação mediada por vírus de ARN vegetal (tal como foi descrita, por exemplo, na publicação da patente de invenção europeia nS 0067553 e na patente de invenção norte-americana nQ 4407956) e a transformação mediada por lipossomas (tal como foi descrita, por exemplo, na patente de invenção norte-americana nQ 4536475).

De preferência, uma planta com esterilidade feminina e fertilidade masculina de origem nuclear, de acordo com a presente invenção, ê proporcionada pela transformação de uma célula ve getal com um vector de plasmideo-Ti desarmado que contém a sequên cia estranha de ADN com um ADN de esterilidade feminina sob o con trolo de um primeiro promotor e, preferencialmente, um ADN marcador sob o controlo de um segundo promotor. O ADN marcador pode en contrar-se a montante ou a jusante do ADN de esterilidade feminina no vector do plasmídeo-Ti mas, preferencialmente, os dois serão adjacentes um em relação ao outro e localizam-se entre as se quências limítrofes ou pelo menos encontram-se localizados ã esquerda da sequência limítrofe da direita do vector de plasmldeo-Ti, de tal modo que eles são simultaneamente transferidos juntos, de maneira adequada, para o genoma nuclear da célula vegetal. Todavia, se desejado, a célula pode inicialmente ser transformada com uma sequência estranha de ADN que contenha o ADN da esterili. dade feminina e um primeiro promotor e pode ser subsequentemente transformada com um ADN marcador e. um segundo promotor, inseridos no locus genético do ADN de esterilidade feminina no genoma nucle ar da célula ou próximo dele, ou esta transformação pode ser efectuada por ordem inversa. Os vectores adequados para este propósito são os mesmos que foram discutidos anteriormente para efectu

-14ar a transformação vector preferido ê de células com a sequência estranha de ADN. um vector plasmideo-Ti desarmado.

A selecção do ADN da esterilidade feminina da presente in venção não é crítica. O ADN da esterilidade feminina adequado pode ser selecionado e isolado de maneira bem conhecida, de tal modo que ele codifique a estrutura de um primeiro ARN, duma primeira proteína, ou dum primeiro polipéptido que significativamente perturba de modo adverso o metabolismo normal; e/ou o funcionamento e/ou o desenvolvimento de qualquer célula de uma flor e/ou de uma semente e/ou de um embrião em que o ADN de esterilidade feminina se encontra expresso, preferencialmente levando por esse processo ã morte dessa célula. Exemplos preferenciais de ADN(s) de esterilidade feminina codifica: RNases, tais como a RNase Tl (que degra da as moléculas de ARN por hidrólise da ligação após qualquer resíduo de guanina) e a Barnase; DNases, tais como uma endonoclease (por exemplo, EcoRi); ou proteases, tais como a papaína (por exem pio, o zimogéneo da papaína e a proteína activa da papaína). Outros exemplos preferenciais dos ADN(s) da esterilidade feminina co dificam: ribonucleases como a T₂ (Kawata et al., Eur. J. Biochem, 176 (1988) 683-697) ou a Rh (Horiuchi et al., J.. Biochem., 103 (1988) 408-418); ou glicoproteínas, tais como sao codificadas pe los alelos Sl, S2, S3, S6 e S7, particularmente os da Nicotiana alata (McClure et al., Nature, 342 (1989) 955-957).

Outros exemplos dos ADN(s) de esterilidade feminina codi.

ficam a estrutura de enzimas que catalisam a síntese de fito-hoj:

monas, tais como: a isopentil-transferase, que é uma enzima que catalisa a primeira etapa da biossíntese da citoquinina e que. é

k.

codificada pelo gene 4 do ADN-T do Agrobacterium; ou uma ou ambas as enzimas envolvidas na sintese da auxina e cuja estrutura é codificada pelo gene 1 e pelo gene 2 do ADN-T do Agrobacterium. Outros exemplos ainda de ADN(s) de esterilidade feminina .codificam: glucanases; lipases, tais como fosfõlipase A₂ (Verheij et al. , Rev. Biochem. Pharmacol., 91 (1981) 92-203); lipoperoxidases; ou inibidores da membrana celular das células vegetais. Outros exemplos suplementares de ADN(s) de esterilidade feminina codificam proteínas tóxicas para as células vegetais, tais como a toxina bacteriana (por exemplo, o fragmento A da toxina diftêrica ou a toxina botulínica).

Outro exemplo ainda de ADN de esterilidade feminina corres ponde ao ADN anti-sentido: i) que codifica um cordão ADN complemen tar de um cordão de ADN que é endógena em relação às células da flor, da semente ou do embrião da planta em causa e naturalmente nelas transcrito, de acordo com a presente invenção ii) que se encontra sob o controlo de um promotor endógeno, tal como foi descrito, por exemplo, na publicação da patente de invenção, europeia nQ 0223399. Tal ADN anti-sentido pode ser transcrito numa sequên cia de ARN capaz de se ligar ã porção que codifica e/ou ã porção que não codifica um ARN naturalmente produzido na célula da flor, da semente, ou do embrião em causa, de tal modo que iniba a tradu ção do ARN produzido naturalmente. Exemplos de tal ADN anti-sent_i do são so ADN(s) anti-sentido de: genes tipo STMG, tais como o ge ne STMG07, o gene STMG08, o gene STMG4B12 e o gene STMG3C9 do Exem pio 2 da presente invenção; o gene KTI3 (Jofuku e Goldberg, The Plant Cell, (1989) 1079-1093); um gene que codifique uma proteí..

na de armazenagem específica da semente, tal como uma albumina 2S \

-16(Krebers et al., Plant physol., 87 (1988) 859-866; Altenbach et al., Plant Molecular Biol., J3 (1987) 239-250; Scolfield e Crouch

J. Biol. Chem., 262 (1987) 12202-12208); ou um gene que correspon de ao clone pMON9608 do ADNc ^: (Gasser et al., The Plant Cell, / (1989) 15). Tais ADN(s) anti-sentido podem ser naturalmente express sos nas células da flor, da semente ou do embrião da planta sob o controlo do promotor endógeno do cordão (ou gene) de ADN endógeno complementar dessa planta, por exemplo: no estilete (com o ADN an ti-sentido dos genes STMG07, STMG08, STMG4B12 ou STMG3C9); no eixo do embrião (com ADN anti-sentido do gene KTI3); nas sementes (com o ADN anti-sentido do gene que codifica uma estrutura de albu mina 2S); nas células do óvulo (com o ADN anti-sentido do PMON9608) Um outro exemplo de um ADN da esterilidade feminina é o que codifica uma enzima específica do ARN (como, por exemplo, a denominada ribozima), capaz de uma clivagem altamente especifica sobre uma sequência alvo, tal como ê descrito por Haseloff e Gerlach, Nature, 334 (1988) 585-591. Uma ribozima desse tipo é, por exemplo, a ribo zima dirigida contra o ARN codificado pelo gene STMG07, o gene STMG08, o gene STMG4B12, o gene STMG3C9, o gene KTI3, o gene que codifica a proteína de armazenagem específica da semente do tipo da albumina 2S ou o gene correspondente ao clone pMON9608 do ADNc.

Outros exemplos suplementares de ADN(s) que codificam a esterilidade feminina são os que codificam produtos que podem tor nar as flores, as sementes, e/ou embriões susceptíveis a uma doença específica, tal como uma infecção por fungos. Esse ADN da esterilidade feminina pode ser utilizado numa planta, em que todas as outras células ou tecidos, nus quais o ADN de esterilidade femini na não se exprimiu, são resistentes ã doença específica.

Outro exemplo ainda de um ADN que codifica a esterilidade feminina compreende uma combinação de: 1) um primeiro gene que codifica a estrutura de uma ARN polimerase dependente de um vírus, tal como a replicase TNV (Meulewater et al., Virology, 177 (1990) 1-11), sob o controlo de um primeiro promotor de acordo com a pre sente invenção; e 2) um cordão de espiral negativa (por exemplo, o ADN anti-sentido) de um segundo gene: i) que codifica uma primei, ra proteína ou um primeiro polipéptido de acordo com a presente invenção que, quando produzido ou hiper-produzido na célula vegetal da presente invenção, perturba significativamente o metaboli^ mo celular, o desenvolvimento celular e/ou o funcionamento celular, ii) que se encontra fundido na sua extremidade 3' com uma sequência de reconhecimento e replicação de ARN virai também designada por promotor virai sub-genómico, tal como o promotor sub-genómico TNV (Lexis et al., J. of Virology, 63 (4) (1990)

1726-1733); e iii) que se encontra fundido na sua extremidade 5' com (e sob o seu controlo) outro pormenor adequado, tal como um pr_i meiro promotor da presente invenção, que seja capaz de dirigir a expressão da espiral negativa na célula vegetal da presente inven ção. A sequência do promotor virai sub-genómico é especificamente reconhecida pela ARN polimerase dependente do vírus que é codi. ficada pelo primeiro gene. Este reconhecimento leva à replicação repetida da espiral de ADN negativa do segundo gene, tal como se fosse uma espiral provida de sentido, o que leva ã síntese da pri. meira proteína ou do primeiro polipéptido. Tanto o primeiro gene como a espiral negativa são fornecidas ao genoma nuclear da célu la vegetal da presente invenção. Isto pode ser conseguido por um evento de transformação; por dois eventos consecutivos de trans^ formação, ou pelo cruzamento de uma planta que tenha o primeiro gene inserido no seu genoma com tuna planta que tenha a espiral

negativa de ADN inserida no seu genoma.

Por estranho no que diz respeito ã sequência estranha de ADN da presente invenção pretende-se dizer que a sequência es tranha de ADN contém um ADN estranho que codifica a esterilidade feminina e/ou um primeiro promotor estranho. Por estranho em relação a um ADN, tal como, por exemplo, o ADN que codifica a esterilidade feminina e um· primeiro promotor, bem como um ADN marca dor um segundo promotor ou qualquer outro ADN que se encontre na sequência estranha de ADN pretende-se dizer que tal ADN não se en contra no mesmo ambiente genómico numa célula vegetal, transforma da com esse ADN de acordo com a presente invenção, tal como é esse ADN quando ele existe naturalmente na célula da planta, da bactéria, do animal, do fungo, do vírus ou de qualquer outra estrutu ra semelhante, a partir do qual tal ADN é originado.

Isto quer dizer, por exemplo, que um ADN estranho que cod_i fica a esterilidade feminina ou um marcador de ADN pode ser: 1) um ADN nuclear numa planta de que ele é originário; 2) um ADN endõ geno em relação à célula vegetal transformada (isto ê, por exemplo, originário de uma planta de origem com o mesmo genótipo que a plan ta que estã a ser objecto de transformação; e 3) que se encontra dentro da mesma unidade transcricional que o seu próprio promotor endógeno e os seus sinais da regulação da transcrição da sua extre midade 3' (pertencentes ã planta de origem) na sequência estranha de ADN de acordo com a presente invenção na célula vegetal transformada; mas 4) que se encontra inserido num lugar diferente do genoma nuclear da célula vegetal transformada e não no lugar em que se encontrava na planta de origem, de tal modo que ele se não en-19-

contra circundado na célula vegetal transformada pelos genes que o envolviam no genoma da sua planta de origem. Um marcador de ADN ou um ADN estranho que codifica a esterilidade feminina pode também, por exemplo, ser: 1) um ADN nuclear na sua planta de origem; e 2) um ADN endógeno em relação â célula vegetal transformada; mas 3) que se encontra na mesma unidade transcricional que um promotor endógeno diferente (ou seja, que não é o seu próprio promotor) e/ou os seus sinais de regulação da transcrição ligados ã sua extremidade 3' numa sequência estranha de ADN de ti po quimérico, de acordo com a presente invenção, numa célula vege tal transformada. Um ADN estranho que codifique a esterilidade fe minina ou um ADN marcador pode também, por exemplo, ser: 1) um ADN nuclear na sua planta de origem; e 2) um ADN endógeno em relação ã célula vegetal transformada; mas 3) que se encontra na mesma unidade transcricional que um promotor heterõlogo e/ou os sinais de regulação da transcrição do terminal 3' numa sequên cia estranha de ADN de tipo quimérico, de acordo com a presente in venção, numa célula vegetal transformada. Um ADN marcador ou estra nho que codifique a esterilidade feminina pode ser também, por exemplo, heterõlogo em relação à célula vegetai transformada e en contrar-se ha mesma unidade transcricional que o promotor endógeno e/ou os sinais de regulação de transcrição da sua extremidade 3' (por exemplo, pode pertencer ao genoma nuclear de uma planta com o mesmo genótipo que a planta que está a ser transformada) fazendo parte da sequência estranha de ADN de tipo quimérico, de acordo com a presente invenção, numa célula vegetal transformada. Um exem pio de um ADN estranho que codifica a esterilidade feminina pode ser o que corresponde ao genoma nuclear de uma planta com o mesmo genótipo que a planta que está a ser transformada e que codifique

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a estrutura de uma enzima catalítica, tal como uma protease ou uma rlbonuclease, que ê endógeno em relação ãs células das flores, das sementes e/ou dos embriões da planta que estã a ser transformada, de tal modo que a enzima é hiper-produzida nas células transformadas das flores, das sementes e/ou dos embriões, de maneira a perturbar significativamente o seu metabolismo, o seu funcionamento e/ou o seu desenvolvimento. Preferencialmente, o ADN que codifica a esterilidade feminina e o ADN marcador são individualmente heterõlogos em relação ã célula vegetal que estã a ser transformada.

Por heterólogo em relação a um ADN, tal como o ADN que codifica a esterilidade feminina, um primeiro promotor, um ADN marcador, um segundo promotor ou qualquer outro ADN que se encon tre na sequência estranha de ADN, de acordo com a presente inven ção, pretende-se dizer que tal ADN se não encontra naturalmente no genoma nuclear das células de uma planta com o mesmo genõtipo que a planta que estã a ser transformada. Os exemplos de ADN(s) heterõlogos incluem os ADN(s) de cloroplastos e de mitocõndrias que são obtidos a partir de uma planta com o mesmo genotipo que a planta que estã a ser transformada, mas os exemplos preferidos são os ADN(s) de cloroplastos, de mitocõndrias ou os ADN(s) nucleares de plantas que têm um genõtipo diferente daquele que é exibido pela planta que está a ser transformada, ADN(s) obtidos a partir de genomas animais e bacterianos e ADN(s) cromossõmicos e de plasmídeos obtidos a partir de genomas de fungos e de vírus.

Por quimérico, em relação ã sequência estranha de ADN de acordo com a presente invenção, pretende-se dizer que pelo menos

-21um dos ADN(s) que codifica a esterilidade feminina: 1) não se encontra naturaimente sob o controlo do seu primeiro promotor pa ra um dos ADN(s) que codifica a esterilidade feminina; e/ou 2) não se encontra naturalmente no mesmo locus genético que pelo menos um dos seus ADN(s) marcadores. Exemplos de sequências estranhas de ADN de tipo quimérico de acordo com a presente invenção compreendem: um ADN que codifica a esterilidade feminina de origem bacteriana sob o controlo de um primeiro prómotor de origem vegetal; e um ADN que codifica a esterilidade feminina de origem vegetal sob o controlo de um primeiro promotor de origem vegetal e que se encontra no mesmo locus genético que um ADN marcador de origem bacteriana.

Por flor entende-se a totalidade de um órgão de uma flor, bem como um ou mais dos seus elementos individuais, tais como o seu eixo de rebentos, as suas sépalas, as suas pétalas, os seus órgãos reprodutores masculinos (ou estames) e/ou os seus órgãos reprodutores femininos (ou carpelos), cujo desenvolvimento, parcial ou totalmente, retardado ou mesmo interrompido, de acordo com a presente invenção, impede o desenvolvimento de sementes viã veis na flor mas não o desenvolvimento e a propagação dos seus gã metas masculinos; por orgão feminino entende-se a totalidade do órgão de uma flor que estã envolvido na produção dos gâmetas femi. ninos e/ou de sementes viáveis e/ou de embriões viáveis, bem como um ou mais dos seus elementos ou partes individuais, tais como o seu óvulo, ovário, estilete, estigma, corola, disco, septo, cálice, e o seu tecido placentário; e por embrião entende-se a totalidade do embrião de uma planta, bem como uma ou mais das suas partes individuais, tais como o seu eixo embrionário e os cotilédones do

-22embrião.

A fim de que o ADN que codifica a esterilidade feminina, de acordo com a presente invenção, seja expresso selectivamente em células das flores, particularmente nas células de um ou mais dos seus órgãos femininos, em células das sementes e/ou em células dos embriões das plantas, de acordo com a presente invenção, dá-se preferência a que o primeiro promotor, que controle o ADN que codifica a esterilidade feminina, na sequência estranha de ADN, seja um promotor capaz de dirigir a expressão dos genes sele ctivamente em células das flores, das sementes e/ou dos embriões da planta. Tal promotor específico de flores, de sementes e/ou de embriões pode ser um promotor endógeno ou um promotor exógeno e pode ser extraído do genoma nuclear ou do genoma mitocondrial ou do genoma cloroplástico de uma célula vegetal. Em qualquer dos casos, o primeiro promotor ê estranho ao genoma nuclear da célula vegetal que está sendo transformada. De preferência, o primeiro promotor dã origem a que o ADN que codifica a esterilidade femini^ na seja expresso apenas nas células de um ou mais tecidos especi. ficos das flores, preferencialmente de um ou mais tecidos dos seus órgãos femininos ou das sementes ou dos embriões, especialmente nas células do estilete, nas células do ovário, nas células do se pto, nas células das membranas envolventes da semente, nas células endospêrmicas, nas células do eixo embrionário e/ou nas células dos cotilédones embrionários.

primeiro promotor de acordo com a presente invenção pode ser seleccionado e isolado de maneira bem conhecida a partir de uma planta, que será tornada estéril sob o ponto de vista femjL

-23nino, de tal maneira que o primeiro promotor dirige a expressão do ADN da esterilidade feminina selectivamente nas células das flores, das sementes e/ou dos embriões da planta, de modo a que aniquile ou torne incapazes as flores da planta, as suas sementes e/ou os seus embriões e torne a planta incapaz de produzir gãmetas femi-ninos férteis, sementes viáveis e/ou embriões viáveis. O primeiro promotor é preferencialmente também seleccionado e isola^ do, de modo que ele é eficaz para impedir a expressão do ADN de es terilidade feminina noutras partes da planta que não estão impli_ cadas na produção de gãmetas femininos férteis, de sementes viáveis e/ou de embriões viáveis, especialmente nos órgãos masculinos das flores, de tal modo que a planta se mantenha fértil sob o ponto de vista masculino. Por exemplo, um primeiro promotor adequado que seja específico da flor (preferencialmente específico de um órgão reprodutivo feminino), específico da semente ou específico do embrião pode ser identificado e isolado numa planta, que será tornada estéril sob o ponto de vista feminino, através dos seguin tes passos:

1. pesquisa de um ARNm que se encontre presente na planta apenas durante o desenvolvimento das suas flores, sementes, ou embriões, preferencialmente no seu ovário, estilete, placenta, cálice, escutelo, septo, membrana da semente, célula endospêr mica, ou nos seus cotilédones embrionários;

2. isólar este ARNm específico da flor, específico da semente ou específico do embrião;

preparar o ADNc a partir deste ARNm;

-244.

utilizar este ADNc como uma sonda para identificar as regiões do genoma da planta que contêm ADN que codifica a estrutura deste ARNm especifico; e então

5. identificar a porção do genoma da planta que se encontra a mon tante (isto é, a extremidade 5') em relação ao ADN que codifica a estrutura especifica deste ARNm e que contém o promotor deste ADN.

Exemplos de um primeiro promotor de acordo com a presente invenção são os promotores dos genes do tipo STMG da Nicotiana tabacum descritos no Exemplo 2, que são promotores específicos do e£ tilete e/ou do_;estigma. Outros primeiros promotores específicos do estilete e/ou do estigma de outras espécies vegetais podem ser iso lados a partir do seu <genoma, utilizando os genes do tipo STMG como sonda durante o passo 4 anteriormente descrito. Em condições de h_i bridização, essa sonda hibridará a sua estrutura com a do ADN que codifica um ARNm específico do estilete-estigma numa mistura de sequências de ADN do genoma da outra espécie vegetal (Maniatis et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Ed. Cold Spring Harbour Laboratory (1982). Em seguida, tal como se descreveu antes no passo 5, um outro primeiro promotor específico do estilete-estigma pode ser identificado. Outros promotores específicos do estilete podem ser isolados dos genes de auto-incompatibilidade, tais como um gene S, por exemplo, tal como se isola a partir da Nicotiana alata (McClure et al., Nature, 342 (1989) 955-957). Ou tros promotores, específicos dos órgãos femininos, podem ser iden tifiçados UtilizandO-se outros ADNc(s) específicos dos órgãos femininos, tais como o clone de ADNc pMON9608 (Gasser et al., The

-25Plant Cell, (1989) 15) que se híbrida exclusivamente com um ge ne expresso apenas nos óvulos das plantas do tomate.

Outros exemplos de primeiros promotores deste tipo são: o promotor do gene KTI3 (jofuku e Goldberg The Plant Cell, Γ (1989) 1079-1093), que é um promotor específico do eixo embrionário; os promotores específicos das sementes que são derivados dos genes que codificam as proteínas de armazenagem específicas das sementes, tais como os promotores PAT2S, por exemplo PAT2S1, PAT2S2, PAT2S3 e PAT2S4 que são promotores dos quatro genes da albumina 2S (genes AT2S) da Aribidopsis thaliana (Krebbers et al., Plant Physiol., 87 (1988) 859-866) .

Se mais do gue um ADN que codifica a esterilidade feminina se encontrar presente na sequência estranha de ADN de acordo com a presente invenção, todos os ADN(s) que codificam a esterilidade fe minina podem encontrar-se sob o controlo de um único promotor, mas preferencialmente cada ADN que codifica a esterilidade feminina se encontrará sob o controlo do seu próprio primeiro promotor isolàdo. Nos - ca sos em que a pluralidade dos ADN(s) que codificam a esterilidade feminina se encontra presente na sequência estranha de ADN, cada ADN que codifica a esterilidade feminina pode codificar o mesmo ou diferente primeiro ARN, polipéptido ou proteína. Por exemplo, quan do o ADN da esterilidade feminina codifica a estrutura de uma RNase tal como a RNase Tl, ê preferível que pelo menos 3, em particular 4 a 6, cópias do ADN da esterilidade feminina e do seu primeiro promotor sejam proporcionadas na sequência estranha de ADN. Em tal caso é também preferível que todos os ADN(s) de esterilidade feminina e os seus primeiros promotores se encontrem adjacentes uns em

relação aos outros na sequência estranha de ADN e em qualquer ve ctor usado para transformar as células vegetais com a sequência estranha de ADN. Se a pluralidade dos ADN(s) que codificam a este rilidade feminina codificar produtos diferentes, tais como o gene 1 e o gene 2 ou tais como a replicase TNV e uma RNase, DNase ou protease, pode ser preferível que os ADN(s) que codificam a este rilidade feminina se não encontrem adjacentes uma em relação aos outros e talvez nem estejam sequer presentes no mesmo vector utili. zado para transformar as células vegetais com a sequência de ADN estranho ou nem sequer presentes na mesma planta progenitora da planta com esterilidade feminina de acordo com a presente invenção.

A selecção do ADN marcador da presente invenção também não ê crítica. Um ADN marcador adequado pode ser seleccionado e isola do de uma maneira bem conhecida, de tal modo que codifique um se gundo ARN, proteína ou polipéptido que permita ãs plantas ou aos seus tecidos, ãs suas sementes ou até ãs suas células, a expressão do ADN marcador, de modo a ser facilmente distinguida e separada de plantas ou dos seus tecidos, das suas sementes ou até das célu las mesmo que não exprimam um segundo ARN, proteína ou polipéptido. São exemplos desses ADN marcadores os que codificam proteínas que podem proporcionar uma cor fãcil de distinguir âs células das plan tas, tais como o gene AÍ que codifica a di-hidro-quercetina-4-redu tase (Meyer et al., Nature, 330 (1987) 677-678) e do gene da gluco ronidase (Jefferson et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA (PNAS) 83 (1988) 8447) , ou que facultam uma característica. morfológica específica ã planta, tal como sucede com o crescimento anão ou uma for ma diferente das folhas. Outros exemplos de ADN marcadores são os

que conferem às plantas tolerância ã tensão fisiológica, tal como é proporcionado pelo gene que codifica a superõxido-dismutase, conforme é descrito no pedido de patente de invenção europeia ηθ 88/402222.9; resistência a doenças ou parasitas, conforme é possível conseguir com um gene que codifica uma endotoxina do Bacillus thuringiensis e que confere resistência a insectos, conforme é descrito no pedido de patente de invenção europeia nQ 86/300291.1; ou um gene que codifica um péptido bacteriano que confere resistên cia a bactérias, conforme é descrito no pedido de patente de inven ção europeia 88/401673.4.

Os ADN marcadores preferidos codificam segundas proteínas ou polipéptidos que inibem ou neutralizam a acção de herbicidas, tais como: o gene sfr e o gene sfrv que codificam enzimas que con ferem resistências aos inibidores da glutamina sintetase, tais co mo o Bialaphos e a fosfinotricina, conforme ê descrito no pedido de patente de invenção europeia nQ 87/400544.0; e genes que codificam enzimas modificadas que servem de alvo para certos herbicidas que têm uma menor afinidade para os herbicidas do que as enzimas endógenas produzidas naturalmente, tal como sucede com a glutamina sintetase modificada que serve de alvo ã fosfinotricina, conforme é descrito na publicação da patente de invenção europeia nQ 0240792, e uma 5-enolpiruvil-shikimato-3-fosfato sintate modificada que serve de alvo ao glifosato, conforme é descrito na publicação da patente de invenção europeia nQ 0218571. Outros exemplos são os seguintes: ADN(s) marcadores que codificam a estrutura de proteínas que neutralizam a acção do herbicida bromoxinil (Stalker et al., in: Genetic Improvements of Agriculturally important Crops., Ed: R.T. Fraley, N.M. Frey e J. Schell, Cold

Spring Harbor Laboratories); o herbicida sulfonilureia (Lee et al., Embo Jj. , Ί_ (1988) 1241-1248) e o herbicida 2,4-D (apresentado no Segundo Simpósio Internacional de Biologia Molecular das Plantas, Jerusalém, 13-18 Novembro 1988) .

segundo promotor de acordo com a presente invenção, que controla o ADN marcador, pode também ser seleccionado e iso lado de maneira bem conhecida, de tal modo que o ADN marcador seja expresso ou selectivamente em um ou mais tecidos específicos ou células especificas, ou expresso constitutivamente na to talidade da planta, conforme desejado, consoante a natureza do segundo ARN, proteína ou polipéptido codificado pelo ADN marcador. Por exemplo, se o ADN marcador codificar uma resistência a um herbicida, pode ser útil ter o ADN marcador expresso em todas as células da planta, utilizando um segundo promotor constitutivo forte, tal como o promotor 35S (Odell et al., Nature, 313 (1985) 810-812), um promotor 35S'3 (Hull e Howell Virology, 86 (1987) 482-493), o promotor do gene da nopalina-sintetase (PNOS) do plasmídeo-Ti (Herrera-Estrella, Nature, 303 (1983) 209-213) ou o promotor do gene da octopina sintase. [POCS (De Greve et al.,

J, Mol. Appl. Genet., 1^ (6) (1982) 499-511)]. Se o ADN marcador codificar uma proteína que confira resistência a uma doença, po de ser útil fazer com que o ADN marcador se encontre selectivamente expresso em tecido lesionado mediante utilização, por exem pio, de um promotor TR como, por exemplo, o promotor TRI' ou TR2' do plasmídeo Ti (Velten et al., Embo J. , _3 (1984)· 2723-2730).

Se um ADN marcador codificar uma resistência a um herbicida, pode também ser Util ter um ADN marcador selectivamente expresso cm te eido verde mediante utilização, por exemplo, do promotor do gene

-29que codifica a pequena sub-unidade do Rubisco (pedido de patente de invenção europeia nQ 87/400544.0). Se o ADN marcador codificar um pigmento, pode também ser útil ter esse ADN marcador expresso em células específicas, cano, por exemplo, as células das pétalas, as células das folhas ou as células das sementes, preferencialmente na camada mais externa da membrana envolvente da semente.

Pode-se identificar e isolar de maneira bem conhecida, um segundo promotor especifico de um tecido para uma planta que tem de se tornar dotada de esterilidade feminina e facilmente distin guível de plantas não transformadas por:

1. pesquisa de um ARNm que se encontra presente na planta apenas durante o desenvolvimento de um certo tecido, tal como o das suas pétalas, das suas folhas ou das suas sementes;

isolamento deste ARNm específico desse tecido;

3. preparação do ADNc deste ARNm específico de um tecido;

4. utilização deste ADNc como uma sonda para identificar as re giões do genoma. da planta que contêm o ADN que codifica o ARNm específico do tecido referido; e então,

5. identificação da porção do genoma da planta que estã a montante do ADN que codifica a estrutura do ARNm específico do tecido em causa e que contêm o promotor para o referido ADN.

/ c

-30fc fc

Se mais do que um marcador de ADN se encontrar presente na sequência de ADN estranha a que se refere a presente invenção, todos os ADN marcadores podem estar sob o controlo de um único se qundo promotor mas, preferencialmente, cada ADN marcador deverá estar sob o controlo do seu próprio segundo promotor, isolado dos outros. Ainda mais preferencialmante, cada ADN marcador encontrar-se-ã sob o controlo do seu próprio segundo promotor e codifica a estrutura de um segundo ARN, proteína, ou polipéptido diferente, o que facultará ã planta transformada diferentes cara cterísticas todas elas distinguíveis umas das outras. Em alguns casos, pode ser preferível que os ADN marcadores e o(s) segundo(s) promotor(es) se encontrem adjacentes uns em relação aos outros e também em relação a um ou vários ADN(s) que determinam a e.sterili dade feminina, e que se encontram contidos na sequência estranha de ADN a que se refere a presente invenção, e em qualquer vector utilizado para transformar as células da planta com a sequência estranha de ADN. Noutros casos, pode ser preferível que os marca dores de ADN se não encontrem adjacentes uns em relação aos outros e/ou em relação aos ADNs que determinam a esterilidade feminina.

Em geral, dã-se preferência a que o primeiro ARN, protejL na ou polipéptido, cuja estrutura é codificada pelo ADN que deter mina· a esterilidade feminina, interfira significativamente com o metabolismo, com o funcionamento e/ou o desenvolvimento das células das flores e/ou das sementes e/ou dos embriões através de uma acção realizada no citoplasma ou no núcleo dessas células. Todavia, quando se deseja que a primeira proteína ou o primeiro pol_i péptido e/ou a segunda proteína ou o segundo polipéptido sejam transportados do citoplasma para os cloroplastos ou para as mito

-31cõndrias das células das plantas transformadas, a sequência de ADN estranho pode suplementarmente incluir um primeiro ADN estra nho adicional que codifique a estrutura de um péptido de trânsito. 0 primeiro ADN adicional estará localizado entre o ADN que determina a esterilidade feminina e o primeiro promotor se a pri. meira proteína ou o primeiro polipéptido tiver de ser desse modo transportada e encontrar-se-á entre o ADN marcador e o segundo promotor se a segunda proteína ou o segundo polipéptido tiver de ser desse modo transportada. Por péptido de trânsito èntende-se um fragmento polipeptídico qué normalmente se encontra asso ciado a uma proteína ou a uma sub.-unidade de uma proteína de um cloroplasto ou de uma mitocõndria que é produzida na célula como um precursor da proteína codificada pelo ADN nuclear da referida célula. O péptido de trânsito é responsável pelo processo de trans locação da proteína ou da sub-unidade de proteína do cloroplasto ou da mitocõndria, cuja estrutura é codificada a nível nuclear, para dentro da estrutura do cloroplasto ou da mitocõndria, e durante esse processo, o péptido de trânsito é separado ou proteo líticamente removido da proteína ou da sub-unidade de proteína do cloroplasto ou da mitocõndria. Um ou vários desses primeiros ADNs adicionais podem ser fornecidos como parte integrante da estrutura da sequência estranha de ADN de que trata a presente invenção para transportar uma ou mais primeiras ou segundas prote_i nas ou polipéptidos, conforme genericamente descrito nos pedidos de patente de invenção europeias nQ 85/402596.2 e 88/402222.9 e ainda em: Van den Broeck et al., Nature, 313 (1985) 358-363; Schatz, Eur. J. of Bioch., 165 (1987) 1-6; e Boutry et al., Nature, 328 (1987) 340-342. Uiu exemplo de um péptido dc trânsito ade quado para o transporte para dentro da estrutura dos cloroplastos ê o péptido de trânsito da pequena sub-unidade da enzima RUBP carboxilase (pedido de patente de invenção europeia nQ 85/402596.2), e um exemplo de um péptido de trânsito para o transporte para dentro da estrutura da. mitocõndria é o péptido de trânsito da enzima Mn-superõxido dismutase (veja-se O Exemplo 10 do presente pedido de patente de invenção e o pedido de patente de invenção europeia nQ 89/401194.9). De um modo qeral, também se dá preferência a que o primeiro ARN, proteína ou poli, péptido, cuja estrutura é codificada pelo ADN responsável pela esterilidade feminina, actue intra-celularmente, de tal maneira que interfira com o metabolismo da célula, seu funcionamento e/ou o seu desenvolvimento na planta. Todavia quando se torna deseja vel que a primeira proteína, ou polipéptido e/óu a segunda proteína ou polipéptido sejam segregados para fora das áreas intercelulares das células da planta, nas quais eles são expressos, ou para fora do tecido, no qual eles são expressos, a sequência estranha de ADN pode incluir suplementarmente um segundo ADN estranho adicional que codifique a estrutura de um péptido de s_i nal secretório. O segundo ADN estranho adicional localiza-se entre o ADN da esterilidade feminina e o primeiro promotor no caso da secreção da primeira proteína ou do primeiro polipéptido e entre o ADN marcador e o segundo promotor no caso da secreção da segunda proteína ou do segundo polipéptido. Por péptido de sinal secretório entende-se um fragmento de um polipéptido natural que durante a translocação,. particularmente nas células eucarióticas, se encontra associado ãs proteínas que normalmente são segregadas para fora das células ou a um fragmento de um poli péptido artificial que, durante a translocação, se se associa a uma proteína ou a um polipéptido, provoca a sua secreção pelas

-33células. Exemplos de péptidos de sinal secretório adequados es^ .¾ tão bem definidos em: Von Heijne, NAR, 14 (11) (1986) 4683-469U;

Denecke et al., The Plant Cell, 2^ (1990) 51-59; e Chrispeels e Taque, International Revi.ew of Cytology, (19 90) , no prelo.

Na sequência estranha de ADN a que se refere a presente invenção, os sinais de terminação da transcrição na extremidade 3' e os sinais de poliadenilação podem ser seleccionados de maneira convencional de entre aqueles que são capazes de proporcio nar a terminação da transcrição e a poliadelinização do ARNm de maneira correcta nas células das plantas. De sinais de terminação da transcrição e de poliadenilação podem ser dos que naturalmente estão associados ao gene que tem de ser transcrito mas podem também ser estranhos ou heterõlogos. Exemplos de sinais de terminação da transcrição e de poliadenilação heterõlogos e adequados são os do gene da octopina sintase (Gielen et al., Embo J. , .3 (1984) 835-845) e do gene 7 do ADN-T (Velten e Schell, Nucleic Acids Research (Nar) 13 (1985) 6981-6998).

Também de acordo com a presente invenção, as culturas de células vegetais, que contenham a sequência estranha de ADN de acordo com a presente invenção, podem ser utilizadas para regene rar plantas homozigóticas dominantes dotadas de esterilidade feminina e fertilidade masculina efectuando as necessárias transformações em culturas celulares diplóides (Chuong e Beversdorf Plant Sei., 39 (1985) 219-226) ou em culturas celulares aplóides, seguindo-se (nestes casos das culturas celulares aplóides) a duplicação do numero de cromossomas por técnicas bem conhecidas (por exemplo, com a colchicina); veja-se: Plant Tissue and Cell

Culture, Plant Biology, _3 (1987), A.R. Liss, Inc. N.Y. Por tal processo, a sequência estranha de. ADN encontrar-se-a sob a forma homozigótica no genoma nuclear de cada uma das células vegetais deste modo transformadas. Este é o processo a que se dá preferên cia para as culturas de células vegetais que contenham um ADN da esterilidade feminina sob o controlo de um primeiro promotor que comanda a expressão dos genes durante uma determinada fase do dg senvolvimento dos gãmetas femininos da planta, como, por exemplo, os óvulos, especialmente após a meiose, ou em célulàs derivadas dos gãmetas femininos, tais como as células das sementes ou dos embriões, de tal maneira que o ADN responsável pela esterilidade feminina se encontra presente e pode ser expresso em todos os gâ metas femininos ou em todas as células vegétais derivadas deles.

Também : de acordo com a presente invenção, se proporcionam os processos necessários para se produzirem sementes híbridas que podem ser objecto de crescimento até formarem plantas hi. bridas. Estes processos envolvem o cruzamento, de modo convencio nal, de: a) uma planta com esterilidade feminina e fertilidade masculina codificada a nível nuclear, de acordo com a presente invenção, em que o primeiro ARN, proteína, ou polipéptido, é expresso selectivamente nas flores, preferencialmente em pelo menos um órgão feminino a elas pertencente, ou em embriões; com b) uma planta dotada de esterilidade masculina e fertilidade feminina.

As plantas com esterilidade masculina e fertilidade feminina adg quadas encontram-se descritas no pedido de patente de invenção europeia nQ 89/401194.9 como tendo um genoma nuclear, no qual se encontram estavelmente integrados:

(a) um ADN que induz a esterilidade masculina que codifica um ARN, uma proteína ou um polipéptido que ao ser produzido ou hiper-produzido nas células dos estames de uma planta, perturba significativamente de maneira adver sa o metabolismo, o funcionamento e/ou o desenvolvimento das células dos estames; e (b)

(c)

um promotor capaz de dirigir a expressão do ADN responsável pela esterilidade.masculina de maneira selectiva nas células dos estames da planta, de preferência nas anteras, no polén e/ou nos filamentos, particularmente nas células do tapetum e/ou da epiderme das anteras; en contrando-se este ADN responsável pela esterilidade mas culina na mesma unidade transcricional que esse promotor e sob o seu controlo, e no qual opcionalmente se pode en contrar no mesmo locus genético:

outro ADN marcador que codifica um ARN, uma proteína ou um polipéptido que, quando presente em pelo menos um te eido específico ou em pelo menos células específicas da referida planta, torna a planta facilmente separável de outras plantas que não contenham este ARN, esta proteína ou este polipéptido, pelo menos no tecido específico ou nas células específicas; e (d) outro promotor capaz de dirigir a expressão de outro ADN marcador pelo menos no tecido específico ou nas células específicas e que se encontra na meema unidade transcricional que o outro ADN marcador e exercendo controlo sobre ele.

-36As plantas com esterilidade feminina e as plantas com esterilidade masculina são plantadas ao acaso, próximas umas das outras para aumentar as probabilidades da polinização cruzada, sem que haja necessidade de plantar segundo padrões precisos. A semente colhida, que é capaz de germinar, será o resultado da fertilização das plantas com esterilidade masculina pelas, plantas com esterilidade feminina e serã 100% híbrida. Quando as se quências de ADN estranho responsáveis pelas características de esterilidade feminina e de esterilidade masculina estiverem pre sentes em forma heterozigõtica no genoma nuclear das respectivas plantas progenitoras, as plantas que crescerem de tal semente hí_ brida serão: 25% férteis, 25% com esterilidade feminina, 25% com esterilidade masculina e 25% estéreis. Quando a sequência estranha de ADN que codifica a esterilidade feminina se encontra presente no genoma nuclear de uma planta progenitora com fertilidade masculina sob a forma homozigõtica - que é preferida quando o primeiro promotor ê um promotor específico dos óvulos, ou das se mentes, ou dos embriões - todas as plantas que crescerem a partir das sementes híbridas descritas serão também dotadas de esterilidade feminina.

Suplementarmente e de^: acordo com a presente invenção, proporciona-se processos para produzir frutos sem sementes, atra vés do cruzamento de tipo convencional de: a) uma planta com es terilidade feminina e fertilidade masculina codificadas a nível nuclear e de acordo com a presente invenção, em que o primeiro ARN, proteína ou polipéptido é expresso selectivamente nas semen tes e ent que a sequência dc ADN estranho, que codifica o primeiro ARN, proteína ou polipéptido, se encontra preferencialmente sob a forma homozigótica no genoma nuclear da com b) uma planta com esterilidade masculina minina.

-37referida planta;

e fertilidade feAs plantas, uma vez transformadas com o ADN que induz a esterilidade feminina e em alguns casos preferencialmente também com o ADN marcador que codifica a resistência a um herbicida, e_s tavelmente integrado nos genomas nucleares das plantas e transmissível através das gerações como alelos dominantes de acordo com a presente invenção, constituem alternativas e podem até apresentar vantagens sobre os sistemas actualmente utilizados para se cultivar e produzir colheitas híbridas através de sistemas de esterilidade masculina codificada a nível citoplásmico e nuclear. A este respeito, as plantas com esterilidade feminina e fertilidade masculina podem facultar: 1) uma formação da semente inibida ao nível das colheitas, 2) sementes híbridas para colheitas que não são fãceis de polinizar de maneira cruzada, e

3) mais fãcil cultura de estirpes vegetais tais como elas são discutidas a seguir.

1. Inibição da formaçao de sementes

Existe uma grande variedade, de culturas cultivadas pelo homem em que a semente é um sub-produto indesejável:

a) quando o produto com validade económica de uma planta consiste na sua parte vegetativa. Pela inibição da produção de sementes, a energia da planta pode ser dirigida para a produção da biomassa vegetativa. São exemplos

as plantas perenes (por exemplo, as ervas utilizadas pa ra forragem, os legumes utilizados para forragem e as plantas da borracha), certas plantas anuais (por exemplo, a cana de açúcar e a batata), e especialmente todas as culturas que normalmente floresceriam e produziriam semente antes do produto realmente válido sob o ponto de vista económico ser colhido. Outros exemplos são os das plantas, que se podem obter através de engenharia genética, que produzem no seio dos seus tecidos vegetativos, proteínas, polipéptidos ou outros metabolitos para usos farmacêuticos ou industriais;

b)

quando o produto de valor económico de uma planta ê o seu fruto e é desejável que o fruto seja desprovido de sementes, ou porque hã preferências nesse sentido por parte dos consumidores (como, por exemplo, nos tomates, nos melões e nos citrinos) ou porque a formação da semen te utiliza recursos da biomassa que poderiam de outro mo do ser armazenados no fruto (por exemplo, para proporcio nar maior teor de sólidos nos tomates que hão-se ser pro cessados). Dado que tais culturas necessitam da formação de frutos, a situação de ausência de semente, que usualmente faz com que os frutos abortem, tem de ser compensa da pela possibilidade de obter um conjunto de frutos via partenocãrpica. Os genes que induzem a produção dos frutos partenocãrpicos naturais existem em algumas culturas, tais como as do tomate e as do melão;

c) quando a planta não é cultivada para se obterem as suas sementes, mas em que os propágulos remanescentes depois da colheita podem dar origem ã formação das sementes. 0 crescimento posterior a partir destas sementes pode cons tituir um problema considerável de ervas infestantes na cultura seguinte. Este problema de ervas infestantes é particularmente bem conhecido em relação ã beterraba açucareira;

d) quando a planta é cultivada para se obterem as suas flores (por exemplo, as flores de corte, as plantas em vaso ou as plantas ornamentais de jardim). Em relação a estas espécies, é em geral ou pelo menos frequentemente desejável que se evite o aparecimento das sementes. No caso das flores de corte e das plantas de vaso a fertilização das plantas frequentemente induz uma senescência acelerada das pétalas. No caso das plantas ornamentais de jardim, a formação dos frutos e das sementes reduz o período da floração e a sua intensidade.

2. Produção de sementes híbridas

A esterilidade feminina obtida por engenharia genética é útil como um instrumento de produção de sementes em combinação com os sistemas de esterilidade masculina naturais de codificação cito plásmica ou nuclear ou com os sistemas de esterilidade masculina obtidos por engenharia genética que incidem sobre o genoma nuclear para que haja produção de sementes híbridas de valor comercial em culturas em que a semente não é produto de cultura economicamente válida e que não são objecto de fácil polinização cruzada (por

Α

exemplo, no que diz respeito a ervas de forragem, legumes de for ragem, beterraba açucareira e muitos vegetais usados como legumes) . A cultura das plantas com esterilidade feminina de tipo nuclear com plantas com esterilidade masculina faculta um melhor controlo da qualidade da semente hibr.ida (por exemplo, não se colhem por erro as filas de cultura de plantas masculinas) e uma produção maior de sementes por se favorecer a polinização cru zada, no seio de plantações inter-penetradas ao acaso, de plantas progenitoras com esterilidade masculina e de outras com esterilidade feminina que, por outro lado, não precisa da utilização de um restaurador da fertilidade. Uma estratégia para tal produção de sementes híbridas (por exemplo, o caso da beterraba açucareira) pode incluir ose seguintes passos (EM significa esterilida de masculina, EF significa esterilidade feminina e H represen ta resistência a herbicida):

A. Desenvolvimento de uma linhagem feminina progenitora A

Aa) Transformar a linhagem A com um ADN estranho que inclua ADN de esterilidade masculina sob o controlo de um promotor específico dos estames e adjacente na estrutura a um ADN marcador que codifica a resistência a um herbicida de acordo com o pedido de patente de invenção europeia 89/401.194.9, dando origem a

50%- A^M§^fV^!nsh (esterilidade masculina, herbicida resistente) e 50% ^^ms^/^Ins^¹ (férti, herbicida sensitivo) .

Ab)

Manter a linhagem A

MSH/msh através de cruzamentos com a li

-linhagem _A ^msh/^msh. i_sto dá:

50% de A^MSH/^msh (com esterilidade masculina e resistência ao herbicida) e

50% de _Amsh/msh (fértil com sensibilidade ao herbicida).

Desenvolvimento de uma linhagem masculina progenitora B

Ba) Transformara linhagem B com a sequência de ADN quimérico de acordo com a presente invenção que inclua um ADN capaz de.induzir esterilidade feminina sob o controlo de um primeiro promotor que dirige a expressão dos genes selectivamente nas células do órgão feminino da planta e que se encontra adjacente na estrutura ao ADN marcador que codifica a resistência ao herbicida, dando origem a _DFSH/fsh

O

Bb)

FSH/fsh

Manter a linhagem B ' graças aos cruzamentos com _Bfsh/fsh , _m0<j_{o a} g_{Ue se} produza:

pcu/f qh

50% de B (com esterilidade feminina e resistência ao herbicida) e

50% de (fértil, sensível ao herbicida).

C. Produção da cultura com as sementes híbridas

Ca) Plantar ao acaso as sementes obtidas em Ab) e Bb).

-424., *

Cb) Eliminar, através da-pulverização'com herbicida, o genótipo indesejável antes que ocorra a polinização cruzada e a auto-polinização.

Cc) Deixar que ocorra a polinização cruzada:

_AMSH/msh _{oom B}FSH/fsh que dá origem a sementes híbridas a 100% com os seguintes

genótipos:
25% AB MSH/msh?	FSH/fsh
25% AB MSH/mSh;	fsh/fsh
25% AB msh/msh!	FSH/fsh
msh/msh;	fsh/fsh
25% AB

Isto representa a semente comercialmente vendida.

3. Cultura facilitada

a) Sem um ADN marcador

A capacidade de obter hapióides duplos derivados de micro-esporos na maior parte das culturas permite a produção de linhagens homozigõticas com uma esterilidade feminina de origem nuclear de maneira mais ou menos directa (Choung e Beversdorf Plant Sei., 39 (1985) 219-226. Isto torna desnecessária, em mui.

tos casos, a utilização de um ADN marcador dentro do mesmo locus genético do genoma nuclear das células da planta em que se encon

tra o ADN que induz a esterilidade da planta. Isto é especialmente verdade se a planta com esterilidade feminina for homozigótica e puder multiplicar-se por via vegetativa (por exemplo, muitos dos legumes).

b) Com um ADN marcador

No caso em que um ADN que induz a esterilidade feminina se encontra no mesmo locus genético do genoma nuclear da planta transformada que um ADN marcador (por exemplo, que codifica a resistência a um herbicida), as plantas homozigõticas com esteri^ lidade feminina serão tecnicamente superiores a muitas outras li_ nhagens, como plantas progenitoras que servem de teste em progra mas de avaliação de linhagens. Este caso torna-se particularmen te nítido quando se trata de culturas em que a semente não é a colheita economicamente válida e que possam facilmente ser objec to de polinização cruzada. Na verdade, estas plantas com esteri lidade feminina permitirão que se proceda ao teste de muitas linhagens com fertilidade feminina e fertilidade masculina que se encontrem fisicamente próximas umas das outras enquanto tornam fácil a eliminação de qualquer semente que tenha sido obtida por auto-polinização realizada a partir das diferentes linhagens de plantas que estão a ser testadas, e separã-la das sementes que resultam de cruzamentos entre as diferentes linhagens.

Fig. IA ilustra a sequência de ADNc do gene STMGO7 do ExemOs exemplos seguintes ilustram a presente invenção. As figuras referidas no decurso desses Exemplos são as seguintes:

-44-.

pio 1.

Fig. IB ilustra a sequência de ADNc do gene STMG08 do Exem pio 1.

Fig.	2A	ilustra a	sequência	de	ADNc	do	gene STMG4B12 do
Exemplo 1	•
Fig.	2B	ilustra a	sequência	de	ADNc	do	gene STMG3C9 do Exem

pio 1.

Fig. 3

Fig. 4 ilustra um mapa do vector pMGlOO ilustra um mapa do vector pMGlOl do Exemplo 4.

do Exemplo 6.

ilustra um mapa do vector pMglO2 do Exemplo 8.

Fig. 6 ilustra um mapa do vector pMG103 do Exemplo 8.

Fig. 7 ilustra um mapa do vector pMG104 do Exemplo 10.

Fig. 8 ilustra um mapa do vector pMG105 do Exemplo 10.

A menos que especificamente sc diga o contrário nos exemplos, todos os processos para se produzir e manipular o ADN recombinante foram efectuados por processos normalizados descritos no livro de Maniatis et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, 1982. O vector seguinte, utilizado nos Exemplos, foi depositado no Deutsche Sammlung Fíír Mikroorganismen und Zellculturen (DSM), Mascheroder Weg IB, D-330Ó Braunschweig, Alemanha, sob as provisões do tratado de Budapeste:

Vector	NQ de Acesso ao DSM	Data
pGSC1700	, 4469	21 de Março de 1988 —

Exemplo 1 - Isolamento de ADNc(s) específicos do estilete-estigma a partir da Nicotiana tabacum Petit Havana SRI

Utilizando-se processos bem conhecidos (Maniatis et al, 1982), isolou-se ARNm total a partir dos seguintes tecidos do ta baco: tecidos do estilete-estigma de flores no estádio 3 a 7 (de acordo com Goldberg, Science, 240 (1988) 1460-1467; tecidos do estilete-estigma na fase dita de crescimento juvenil de uma flor que não tinha grãos de pólen na fase 8 a 11 (de acordo com Goldberg, 1988); tecido do ovário designado como sendo da fase senescente de flores em fase juvenil; tecido do ovário de flores em fase senescente ; e tecido de peciolos, raízes e folhas de plântulas cultivadas in vitro. Os ADNc(s) foram sintetiza dos a partir de tecidos juvenis e senescentes do estilete-estigma utilizando o estojo da Amrsham (Amersham International PLC,

Buckinghamshire, Inglaterra), o sistema de síntese de ADNc Plus-RPN 1256, Y/Z, de acordo com as instruções que vêm exaradas no estojo para a sua utilização. Os ADNc(s) foram objecto de clona gem no vector Lambda gtlO utilizando o estojo Amersham, ADNc Cio ning System-lambda gt 10-RPN 1257, de acordo com as instruções que acompanham o estojo. A partir da biblioteca de ADNc(s) assim obtida, foi possível proceder a uma triagem diferencial com sondas de ADNc obtidasa partir de plãntulas, por um lado, e com ADNc(s) utilizados como sondas obtidas a partir de tecidos do estilete-estigma, por outro lado. Os clones seleccionados foram sub-clonados em pGEMl (Promega, Madison, Wisconsin, USA). As son das de cada um destes sub-clones foram preparadas e primeiro verificadas quanto ã sua especificidade em manchas Northern com 10 y do ARNm total obtido a partir de diferentes tecidos do tabaco (raízes, pecíolos, folhas, sépalas, pétalas, anteras, tecido estilete-estigma em fase juvenil, tecido estilete-estigma em fase senescente, e ovãrios em fase senescente). Os sub-clones, que especificamente hibridaram nos testes das manchas de Northern com ARNm, do estilete-estigma foram de novo objecto de hibridação em manchas de Northern com 2 jig de ARNm poli-A⁺ isolado dos tecidos supracitados, incluindo ovãrios juvenis, sementes e folhas infec tadas por vírus. Os clones, designados pMG07 e pMG08, contendo inserções de 0,963 kb e 0,472 kb, respectivamente, mostraram ser sequências de ADN específicas do estilete-estigma. Estes clones foram sequenciados e as suas sequências de ADNc apresentam-se nas Fig. IA e Fig. IB, respectivamente. A sequência de ADN do pMG07 revela a presença de um quadro aberto deleitura rea ding-frame (ORF) ao longo de uma sequência de 800 nucleõtidos. A sequência do pMG08 revela uma ORF que engloba a sequência na sua totalidade.

Obtiveram-se os seguintes elementos do Prof. Goldberg da Universidade da Califórnia, Los Ángeles (UCLA): dois ADNc(s) específicos do estilete-estigma da Nitcotiana tabacum (4B12 e 3C9) clonados como um fragmento PstI - Smal no pGEM 3zf (-) (promega, Madison, Wisconsin, U.S.A.). Estes clones continham inserções de 0,748 kb e 1,046 kb, respectivamente. Sondas destes dois clones foram hibridadas em manchas de Northern com 10 yug de ARNm total de diferentes tecidos do tabaco (raízes, pcíolos, folhas, sépalas , anteras, tecido do estilete-estigma em fase juvenil, tecido do es; tilete-estigma em fase senil e ovários em fase senil) de maneira a verificar as respectivas especifidades. Estes métodos de mancha Northern confirmaram a especificade dos clones e revelaram que a transcrição do 4B12 é de 0,8 kb e que a do 3C9 é de 1,2 kb. Os dois clones foram subclonados em pGEl (Promega), sendo esses sub-clones designados pMG4Bl2 no que diz respeito ao clone 4B12 e pMG3C9 no que diz respeito ao clone 3C9. Os sub-clones foram outra vez verificados quanto ã sua especifidade pelo método das manchas de Northern com 2 yug de ARNm poli-A⁺ isolado a partir dos tecidos anteriormente referidos, incluindo ovários juvenis, semen tes e folhas infectadas com vírus. Os clones pMG4B12 e pMG3C9, contendo inserções de 0,748 kb e 1,046 kb, respectivamente, mostra ram serem sequências específicas dos tecidos estilete-estigma. Esses clones, foram objecto de sequenciação e as sequências dos seus ADNc(s) representam-se nas Fig. 2A e Fig. 2B, respectivamente .

.¼

Exemplo 2 - Isolamento de genes específicos do estilete-estigma (genes do tipo STMG) correspondendo aos clones de

ADNc do estilete-estigma

Recorrendo a processos conhecidos (Maniatis et al., 1982), utilizou-se uma sonda de cada um dos clones de ADNc do Exemplo 1 de sequências específicas dos tecidos do estilete-estigma para iso lar a sequência de genes genómica correspondente que se encontra especificamente expressada nos tecidos do estilete-estigma do ór gão feminino da planta do tabaco. De acordo com o protocolo forne eido pela Promega, o ADN genómico do tabaco foi parcialmente dige rido com Sau3A, e os fragmentos de restrição foram objecto de cio nagem para dentro do vector fágico lambda GEM.12 (Promega), digeridos com Xho I, de modo a produzir clones genómicos chamados lambda STG07, lambda STG08, lambda STG4B12 e lambda STG3C9. Subsequentemente, estes clones genómicos foram subclonados em pGEMl (Promega) de acordo com o processo descrito pela Promega.

Os subclones foram outra vez analisados através das manchas de Southern, utilizando os clones de ADNc respectivos como sondas para se identificar os clones que continham as sequências de ADN especificas do estilete-estigma. Estes subclones, designados, res pectivamente, pSTG07, pSTG08, ”pSTG4B12 e pSTG3C9 foram objecto de sequenciação (Maxam e Gilbert, Pnas, 74 (1977) 560). A orientação destes clones foi determinada pelo método de análise das manchas de Northern com ribossondas em ambos os sentidos. A comparação de cada sequência de ADNc com a sua sequência de clones genómicos respectiva levou ã identificação da região de homologia. Na extremidade 5' de cada região, identificou-se o codão ATG e a sequência TATA de consenso. A caixa TATA faz parte do

promotor do gene e isso é confirmado pela extensão elementar (Mcknight et al., Cell, 25 (1987) 385). Os genes específicos do estilete-estigma, isolados utilizando-se o ADNc do estilete-estigma como sonda, foram designados de maneira genérica como genes de tipo-STMG. Ao gene específico do estilete-estigma do pSTG07 chamou-se STMG07, o do pSTG08 foi designado STMG08, o do pSTG4B12 foi designado STMG4B12 e o do pSTG3C9 foi designado como STMG3C9.

Exemplo 3 -Construção das cassetes de promotor (PSTMG) derivadas dos respectivos genes do tipo STMG.

Para construir as sequências de ADN quimérico que contêm as sequências reguladoras 5', incluindo o promotor de um gene de tipo STMG, na mesma unidade transcricional que um primeiro ADN que de termina a esterilidade feminina de tipo heterólogo e que sobre ele exerce controlo, procedeu-se ã construção de cassetes por sub -clonagem de um fragmento de ADN que incluia um promotor no interior da estrutura poli-receptora do pMAC 5 - 8 (pedido de patente de invenção europeia n° 87/402348.4). Assim se produzem os respectivos vectores que podem ser utilizados para isolar ADN de cordão único para utilização na mutagénese dirigida a sítios.

Recorrendo ã mutagénese dirigida a sítios (pedido de paten te de invenção europeia nQ 87/402348.4), a sequência que envolve o codão de iniciação ATG de cada um dos genes é modificada de tal maneira que a mutação cria uma determinada sequência que é um sítio de reconhecimento unico para uma determinada enzima de restrição. Os plasmideos daí resultantes contêm, cada um deles,

um novo sítio de restrição assim criado. A sequência de nucleõtidos exacta que contém o sítio de restrição acabado de criar é determinada, de maneira a confirmar-se que ela apenas difere da sequência 5' do gene de tipo STMG correspondente pela substituição, que cria o novo sitio de restrição. As cassetes de promoção acabadas de criar, compreendendo cada uma um promotor, uma extremidade 5' não traduzido de um gene do tipo STMG atê ao seu codão de iniciação ATG, e um novo sitio de restrição, são de um modo gene rico chamadas PSTMGs. O PSTMG que contém o promotor e a extrenvi dade 5' do STMG07 é designado por PSTMGO7”, o do STMG08 é designado por PSTMG08, o do PSTMG4B12 ê designado por PSTMG4B12 e o do STMG3C9 ê designado por PSTMG3C9.

Exemplo 4 - Construção de sequências de ADN quiméricas de um PSTMG e de um gene Tl de RNAase

Os plasmídeos chamados pMGlOO, que se ilustram na Fig. 3, são construídos, cada um deles, pela adição dos seguintes fra gmentos de ADN bem conhecidos com um fragmento diferente oriundo dos PSTMGs do Exemplo 3:

1. um fragmento de um vector incluindo as sequências limite de ADN-T, do pGSC1700 em que o gene da ^-lactamase que codifica a estrutura de ampicilina foi inactivado por in serção no sítio Saci; localizados entre as sequências Li mite encontram-se os seguintes fragmentos 2-4 de ADN:

uma sequencia quimérica que contém o promotor SSU da Arabidopsis Rubisco (PSSU ou PSSUARA), um gene sfr que

2.

confere resistência a um herbicida (pedido de patente de invenção europeia nQ 87/400544.0) e os sinais da extreini dade 3' (isto é, de terminação de transcrição) de um gene de ADN-T 7 (Velten e Schell, NAR, 13 (1985) 6981);

3. uma sequência quimérica que contém um fragmento EcoRI/SacI do pSGFR401 que contém um promotor da nopalina sintetase (PNOS), um neo gene que codifica a resistência â Canamicina e os sinais da extremidade 3' de um gene da octopina sintetase (OCS) (pedido de patente de invenção eu ropeia nQ 87/400544.0), em que o pSGFR401 se designa como pSGR4; e

4. uma sequência quimérica, que contêm uma das cassetes prq motoras do PSTMG do Exemplo 3, fundida no quadro com um gene sintético que codifica a estrutura da RNase Tl de A. Orhyzae (Quaas et al.,Biosphosphates and their Analogues-Synthese, Structure, Metabolism and Activity, Amesterdão, Elsevier Science Publisher B.V., 1987; Quaas et al., Eur.

J. Biochem., 173 (1988) 617-622) e os sinais da extremidade 3' de um gene da nopalina sintetase (NOS) (An et al., EMBO J:, 4 (2) (1985)‘277) .

Cada pMGlOO é um vector de ADN-T de tipo binário que con têm, entre as sequências limite do ADN-T, três sequências quiméricas A PSSU-sfr e a PNOS-neo que são ADNs marcadores, respect^ vamente, com o PSSU e o PNOS como segundos promotores; e um gene Tl da PSTMG-RNase que é um ADN que induz esterilidade feminina sob o controlo de um PSTMG como primeiro promotor. A expressão do >r

ADN que induz a·esterilidade feminina sob o controlo do promotor PSTMG produzirá RNase Tl selectivamente nas células do estiiete e/ou do estigma. Isto tornar-se-ã letal para as células do estilete e/ou do estigma, dado que a RNase Tl causará a degradação das moléculas de ARN que são indispensáveis para o metabolismo dessas células.

Exemplo 5 - Introdução de cada uma das sequências de ADN quimérico do Exemplo 4 no tabaco e da alfafa

Constrói-se uma estirpe de Agrobacterium recombinante me diante a mobilização de cada pMGlOO (de acordo com o Exemplo 4) μ

de E. coli para o Agrobacterium tumefaciens C58C1 Rif que contêm pMP90 (Koncz e Schell, Mol. Gen. Genetics, 204 (1986) 383-396).

A estirpe de Agrobacterium daí resultante, albergando o pMP90 e o pMGlOO, é utilizada para transformação de discos das folhas do tabaco (N. tabacum Petite Havane SR1) mediante processos normalizados, tais como os descritos, por exemplo, no pedido de patente de invenção europeia n° 87/400544.0, e para a transfor mação da alfafa de acordo com o processo descrito por D'Halluin et al., Crop Science, 30 (1990), no prelo. Utiliza-se a carbenicilina para aniquilar as estirpes de Agrobacterium após a co-cul_ tura.

Os caules transformados são selecionados num substrato que contém 5 mg/1 de fosfinotricina e 100^ig/ml de Canamicina, e os caules resistentes são regenerados de modo a transformar-se em plantas. Após a indução de rebentos e de raízes, o que prova que ⁵³Χ\ há crescimento normal das plantas apesar da presença do gene da RNase Tl, transferem-se as células e as plantas jã transformadas para uma estufa onde crescera atê que floresçam. Examinam-se as flores e verifica-se que não possuem nenhuma formação normal de estilete-cstigma. Após a polinização não se forma nenhuma semente viável. As plantas transformadas são dotadas de esterilidade feminina .

Exemplo 6 - Construção de sequências de ADN quimérico de um PSTMG e de um gene Barnase.

Os plasmideos nomeados pMGlOl, cuja estrutura se ilustra na Fig. 4, são construídos, cada um, pela montagem dos seguintes fragmentos de ADN bem conhecidos com um outro fragmento diferente dos PSTMGs de acordo com o Exemplo 3:

um fragmento vector, que inclui as sequências limite de ADN-T, derivado do pGSC1700, tal como se descreveu no Exem pio 4 e com os seguintes fragmentos de ADN 2-4 entre as suas sequências limite;

2. a sequência quimérica (nQ 2) do Exemplo 4, que contém o promotor PSSU, o gene sfr que confere resistência ao herbicida e o gene 7 de ADN-T da extremidade 3';

3. a sequência quimérica (nQ 3) do Exemplo 4, que contém o promotor PNOS, o gene neo que codifica a resistência ã Canamicina e os sinais da extremidade 3' do gene OCS; e

4.

a sequência quimérica, que contém um dos PSTMGs de acor do com o Exemplo 3, fundida no seu quadro (frame) com o gene da Barnase obtido a partir do Bacillus amiloliquefaciens (Hartley e Rogerson, Preparative Biochemistry, 2^ (3) (1972) 243-250) e a extremidade 3' do gene NOS de acordo com o Exemplo 4.

Cada pMGlOl é um vector de ADN-T de tipo binário que contém, entre as suas sequências limite do ADN-T, três sequências quiméricas: o PSSU-sfr e o PNOS-neo que são ADNs marcadores com, respectivamente, o PSSU e o PNOS como segundos promotores; e o gene PSTMG-Barnase que é um ADN que induz esterilidade feminina sob o controlo de um PSTMG no papel de primeiro promotor. A expressão do ADN que induz a esterilidade feminina sob o controlo do promotor PSTMG produzirá Barnase selectivamente nas células do estilete e/ou do estigma. Isto será letal para as células do estji lete e/ou do estigma, dado que a Barnase degradará as moléculas de ARN e desse modo interferirá com o metabolismo dessas células.

Exemplo 7 - Introdução de cada sequência de ADN quimérico do Exemplo 6 no tabaco e na alfafa

Tal como se descreveu no Exemplo 5, constrõi-se uma estir pe de Agrobacterium recombinante pela mobilização de cada pMGlOl £ (do Exemplo 6) de E. Coli para o Agrobacterium C58C1 Rif que con tém pMP90 (Koncz e Schell, Mol. Gen. Genetics, 204 (1986) 383-396). A estirpe que daí resulta, que alberga o pMP90 e o pMGlOl, ê utilizada para a transformação de discos das folhas de tabaco e para a transformação da alfafa. Os calli tansformados e os rebentos trans

formados são seleccionados utilizando-se 5 mg/litro de fosfinotriclna e 100 yig/ml de canamicina. Demonstra-se que o gene da Bar nase não é objecto de expressão nos caules e rebentos transforma dos resistentes ao herbicida pelo crescimento dessas estruturas.

Os rebentos da planta transformada são preparados para formar raizes, transferidos para o solo dentro da estufa e crescem até que floresçam. As flores tanto do tabaco como da alfafa são examinadas e obsérva-se nas plantas transformadas essencialmente o mesmo fenótipo que se observa nas plantas transformadas descritas no Exemplo 5 (ou seja, não há formação de estilete-estigma normal). As plantas transformadas são dotadas de esterilida de feminina.

Exemplo 8 - Construção de sequências de ADN quimérico de um PS1MG e de um gene que codifica a estrutura da papaína

Os plasmídeos chamados pMG102, cuja estrutura se encontra ilustrada na Fig. 5, são construídos, cada um, pela montagem de uma estrutura que contêm fragmentos de ADN bem conhecidos e um outro fragmento diferente que ê um dos PSTMGs de acordo com o Exemplo 3:

1. um fragmento vector, que inclui as sequências limite de

ADN-T, derivado do pGSC1700 tal como se descreveu no Exemplo 4 e com os seguintes fragmentos de ADN 2-4 entre as suas sequências limite;

-56.

2. a sequência quimérica (nQ 2) do Exemplo 4, que contém o promotor PSSU, o gene sfr da resistência ao herbicida e o gene 7 de ADN-T da extremidade 3¹;

3. a sequência quimérica (nQ 3) de acordo com o Exemplo 4, que contém o promotor PNOS, o gene neo e a extremidade 3' do gene OCS; e

4.

uma sequência quimérica, que contém um dos PSTMGs Exemplo 3, fundida no seu quadro (frame) com:

do

a) um gene que codifica a estrutura da papaina do fruto Carica papaya, que codifica o zimogêneo da papaina que é uma endopeptidase vegetal (Cohen et al., Gene, 48 (1986) 219-227) capaz de atacar ligações peptidicas, bem como de ésteres; as seguintes modificações são introduzidas na sequência de ADN do gene da papai_ na de acordo com Cohen e colaboradores (1986) , utilizando um processo de mutagénese dirigida a um sítio tal como se descreveu no Exemplo 3:

i. o nucleótido A, na posição 1 a montante do primei, ro codão ATG, é objecto de mutação transformando-se num nucleótido C de maneira a obter um sítio Ncol adequado para clonagem; e ii. os codões GAA que codificam a estrutura do glutamato nas posições 47, 118 e 135 são objecto de mia tação, transformando-se em codões CAA que codificam a glutamina ; e

b) a extremidade 3' do gene NOS do Exemplo 4.

Cada pMG102 é um vector de ADN-T de tipo binário que con tém, entre as sequências limite de ADN-T, três sequências quiméricas: o PSSU-sfr e o PNOS-neo, que são ADN marcadores que codificam os marcadores seleccionãveis dominantes para a transformação das plantas sob o controlo, respectivamente, do PSSU e do PNOS, a funcionar como segundos promotores; e o gene do PSTMG do zimogéneo da papaína que é um ADN que induz, esterilidade feminina sob o controlo de um PSTMG actuando como primeiro promotor. A ex pressão do ADN que induz a esterilidade 'feminina sob o controlo do promotor PSTMG produzirá selectivamente nas células do estile te e/ou do estigma, uma endopeptidase (o zimogéneo da papaína) que clivará as proteínas nas células do estilete e/ou do estigma, levando assim ã morte destas células.

Os plasmídeos designados pMG103-, cuja estrutura se ilus tra na Fig. 6, são também construídos, cada um, pela montagem dos seguintes fragmentos bem conhecidos de ADN com um outro fragmento de ADN que é um dos PSTMGs do Exemplo 3:

1. um fragmento vector, que inclui as sequências limite de ADN-T, derivadas do pGSC1700, tal como se descreveu no Exemplo 4, e com os seguintes fragmentos de ADN 2-4 entre as suas sequências limite;

2. a sequência quimérica (ηθ 2) do Exemplo 4, que contém o promotor PfiSIJ, o gene sfr da resistência ao herbicida e o gene 7 de ADN-T da extremidade 3';

-58a sequência quimérica (ηθ 3) do Exemplo 4, que contêm o promotor PNOS, o gene neo e a extremidade 3' do gene

OCS; e

4. uma sequência quimérica, que contém um dos PSTMGs do

Exemplo 3, fundido num seu quadro (frame) com :

a) um gene da papaína obtido do fruto da Carica papaya, que codifica a proteína activa do zimogéneo da papai, na; são introduzidas na sequência de ADN do gene da papaína de acordo com Cohen e colaboradores (1986) as modificações que se seguem, utilizando-se um processo de mutagénese dirigida a um sítio, tal como se descre veu no Exemplo 3:

i. o Asn que codifica o codão AAT, a montante do pr_i meiro resíduo Ile da primeira proteína activa, é objecto de mutação passando a ser um codão GAT, que faculta um sítio EcoRV adequado a clonagem (GAT ATC). 0 sítio EcoRV que foi obtido por engenharia genética é então fundido directamente com o PSTMG de modo a obter uma fusão directa no quadro (frame) do promotor com a sequência que codifica a estrutura da proteína activa do zimogé neo da papaína; e ii. os codões GAA que codificam a estrutura do glutamato nas posições 47, 118 e 135 são objecto de mu tação, transformando-se em codões CAA que codifi-59cam a estrutura da glutamina; e

b) a extremidade 3' do gene NOS do Exemplo 4.

Cada pMG103, tal como cada pMG102, é um vector de ADN-T de tipo binário que contém, entre as suas sequências limite de ADN-T três genes quiméricos: o PSSU-sfr e o PNOS-neo que codificam a estrutura de marcadores seleccionáveis dominantes para a transformação de plantas; o gene PSTMG da proteína activa da papaína, que é um ADN que induz esterilidade feminina e que se encontra sob o controlo de um PSTMG actuando como primeiro promotor e que codifica uma endopeptidase que vai clivar as proteínas dumas células do estilete e/ou do estigma, levando assim selectivamente ã morte dessas células.

Exemplo 9 - Introdução de cada sequência de ADN quimérico do Exemplo 8 no tabaco e na alfafa

Tal como se descreveu no Exemplo 5, cada pMG102 e pMG103 (de acordo com o Exemplo 8) é mobilizado a partir de E. coli para uma estirpe da Agrobacteria C58C1 Rif que transporta um pMP90. As estirpes daí resultantes, que albergam o pMP90 com o pMG102 e o pMP90 com o pMGlO3, são utilizadas para transformar a planta do ta baco e a planta da alfafa segundo os processos anteriormente descritos no Exemplo 5. Demonstra-se que os genes da papaína não são objecto de expressão nos caules, rebentos e raízes transformados, resistentes ao herbicida e resistentes ã canamicina, pelo crescimen to dessas estruturas.

As plantas transformadas são então transferidas para a estufa onde crescem no solo atê que floresçam. As flores tanto do tabaco como da alfafa são examinadas, e essencialmente observar-se-ão nas plantas transformadas os mesmos fenótipos que se encontram nas plantas transformadas de acordo com o Exemplo 5 (ou seja, não hã formação normal de estilete-estigma). As plantas transformadas são dotadas de esterilidade feminina.

Exemplo 10 - Construção de sequências de ADN quimérico de um PSTMG e um gene que codifica a estrutura EcoRI

Os plasmídeos designados pMG104, cuja estrutura se ilustra na Fig. 7, são construídos, cada um deles, pela montagem dos seguintes fragmentos de ADN bem conhecidos com um fragmento diferente que é um dos PSTMGs de acordo com o Exemplo 3:

1.

2.

um fragmento vector, que inclui as sequências limite de ADN-T, derivado do pGSC1701A2 (pedido de patente de inven ção europeia n© 87/115985.1); e localizados entre as sequências limite encontram-se os seguintes fragmentos de

ADN 2-5;

a sequência quimérica (n© 2) do Exemplo 4, que contém o promotor PSSU, o gene sfr da resistência ao herbicida e a extremidade 3' do gene 7 do ADN-T;

a sequência quimérica (n© 3) de acordo com o Exemplo 4, que contém o promotor PNOS, o gene neo e a extremidade

3' do gene OCS;

3.

vr uma sequência quimérica acordo com o Exemplo 3, com:

que contém um dos PSTMGs de fundida no seu quadro (frame)

a) um gene que codifique a endonuclease de restrição EcoRI obtida a partir do E. coli (Green et al., J. Biol. Chem., 256 (1981) 2143-2153; Botterman e Zabeau, Gene, 37 (1985) 229-239) que é capaz de reco nhecer e de clivar, a sequência alvo GAATTC num ADN de codão duplo; introduzem-se as seguintes modifica ções na sequência de ADN do gene de acordo com Green e colaboradores (1981) por um processo de mutagénese dirigida a um sítio, tál como se descreveu no Exemplo

3:

i. os nucleótidos do codão de iniciação ATG são subs; tituídos por uma estrutura ATGCA, criando-se assim um sítio Nsil no codão de iniciação e produzindo-se as seguintes sequências de nucleótidos: ATGCA, TCT, AAT...; e ii. um fragmento HindiI-HindIII do gene EcoRI clonado em pEcoRl2 (Botterman e Zabeau, 1985) que é clona da no vector PMAC5-8 de mutagénese dirigida a um sítio; e

b) a extremidade 3'

4; e um gene que do gene NOS de acordo com o Exemplo codifica a metilase EcoRT, sob o con trolo do seu promotor natural (Botterman e Zabeau ν*

1985), que é capaz de inibir a actividade do EcoRI de E. coli ou do Agrobacterium, de maneira a ultra passar-se a potencial expressão imperfeita do gene

EcoRI nos microrganismos.

Cada pMG104 é um vector de ADN-T de tipo binário que con tém, entre as suas sequências limite de ADN-T, três sequências quiméricas: o PSSU-sfr e o PNOS-neo que são ADN marcadores sob o controlo, respectivamente, do PSSU e do PNOS que desempenha o papel de segundos promotores; e o gene do PSTMG-endonuclease EcoRI que é um ADN que induz esterilidade feminina sob o controlo do PSTMG que actua como primeiro promotor. A expressão do ADN que in duz a esterilidade feminina sob o controlo do promotor PSTMG far-se-ã selectivamente nas células do estilete e/ou do estigma e produzirá a endonuclease da restrição EcoRI que vai clivar o ADN de cordão duplo nos sítios GAATTC (ver, para revisão dos sistemas de modificação das restrições de tipo II: Wilson, TIG, £ (11) (1988) 314-318) nas células do estilete e/ou do estigma, originan do assim a morte dessas células.

Os plasmídeos designados pMG105 também são construídos, cada um deles, por montagem dos seguintes fragmentos de ADN bem co nhecidos com um outro fragmento diferente de um dos PSTMGs de acor do com o Exemplo 3:

1. um fragmento vector, que inclui sequência limite do ADN-T, derivado do pGSC1701A2; localizado entre as sequências limite encontram-se os seguintes fragmentos de ADN

2-5;

-6j

2. a sequência quimérica (nQ 2) do Exemplo 4, que contém o promotor PSSU, o gene sfr da resistência ao herbicida e a extremidade 3' do gene 7 do ADN-T;

3.

a sequência quimérica que contém o promotor neo do gene OCS;

(nQ 3) de acordo com o Exemplo 4, PNOS, o gene neo e- a extremidade 3 '

4.

uma sequência quimérica, que contém um dos PSTMGs de acordo com o Exemplo 3, fundida no seu quadro (frame) com:

a) um fragmento do gene que codifica a estrutura do pé ptido de trânsito da Mn-superóxido dismutase (Mn-SOD) que é um fragmento NcoI-PstI de um fragmento Hpal-HindIII derivado do pSODl (Bowler et al., Embo J. , (1989) 31-38); introduzem-se as seguintes modificações na estrutura do ADN do fragmento do gene de acordo com Bowler e colaboradores (1989) utilizan do um processo de mutagênese dirigida a um sítio, tal como se descreveu no Exemplo 3:

i. os nucleõtidos AA localizados a montante das posições -2 e -1 do codão de iniciação ATG são modificados para nucleõtidos CC criando-se assim um sitio Ncol no codão de iniciação, o que produz as seguintes sequências de nucleõtidos:

- CCATGGCACTAC

Ncol

-64ii. os nucleótidos T, TCG, CTC localizados imediata mente a jusante do sítio onde se faz o processa mento do péptido de trânsito são transformados em C, TGC, AGC, criando-se um sítio PstI atrás do sítio do processamento, o que produz as seguintes sequências de nucleótidos:

CTC,CGC,GGC,

L -Q T F S L

TTG,CAG,ACC,TTT,TCG,CTC

CTC,CGC,GGC,

TTG,CAG,ACC,TTC,TGC,AGC

PstI em que a seta indica o sítio do processamento da sequência do péptido de trânsito e a linha superior a sequência de aminoácidos que corresponde ã sequência que codifica a estrutura da Mn-SOD; o fragmento NcoI-PstI é também objecto de fusão no interior do quadro (trame) com um gene que codifica a endonuclease de restrição EcoRl obtida a partir de E. coli (Green et al., J. Biol. Chem., 256 (1981) 2143-2153; Botterman e Zabeau, Gene, (1985) 229-239) e que é capaz de induzir o re conhecimento e a clivagem da sequência alvo GAATTC num ADN de cordão duplo, tal como se encon tra no pMG104; e

b) a extremidade 3' do gene NOS de acordo com o Exemplo

4; e

5. um gene que codifica a estrutura da metilase EcoRI sob o controlo do seu promotor natural (Botterman e Zabeau, 1985), que é capaz de inibir a actividade do EcoRI no E. coli ou no Agrobacterium, de modo a ultrapassar a expres são potencialmente imperfeita do gene EcoRI nos microrga nismos, tendo este gene sido inserido no fragmento do ve ctor fora das sequências limite.

Cada pMG105 é um vector de ADN-T de tipo binário que con tém entre as suas sequências limite, três sequências quiméricas: PSSU-sfr e PNOS-NPTII que são ADNs marcadores sob o controlo, res pectivamente do PSSU e do PNOS que actuam como segundos promotores; e o gene do PSTMG-péptido de trânsito-endonuclease EcoRI que é um ADN indutor de esterilidade feminina que tem o PSTMG a funcionar como primeiro promotor e uma sequência que codifica a estrutura do péptido de trânsito entre eles. A expressão do ADN que induz a esterilidade feminina sob o controlo do promotor PSTMG selectivamente exercida nas células do estilete e/ou do estigma produzirá uma endonuclease de restrição que vai ser dirigida ãs mitocondrias das células do estilete e/ou do estigma de modo a clivar o ADN de cordão duplo nos sítios de GAATTC dessas mesmas células. Isto levara ã morte dessas células.

Exemplo 11 - Introdução de cada sequência quimérica de ADN de acordo com o Exemplo 10 na estrutura do tabaco e da alfalfa

Tal como se descreveu no Exemplo 5, cada pMG104 e pMG105 (de acordo com o Exemplo 10) é mobilizada a partir de E. coli para a estrutura das Agrobacterias C58C1 Rif que transportam pMP90. Es

sas estirpes daí resultantes, albergando o pMG104 com o pMP90 e o pMG105 com o pMP90, são utilizadas para transformar o tabaco e a alfalfa de acordo com os processos descritos no Exemplo 5. De monstra-se que os genes endonuclease EcoRI não são objecto de expressão nos caules, nos rebentos e nas raizes transformados resis^ tentes ao herbicida e resistentes ã canamicina, pelo crescimento dessas estruturas.

As plantas transformadas são transferidas para uma estufa e aí crescem no solo até florescerem. As flores, tanto a do ta baco como a da alfalfa, são examinadas, e observar-se-ão nas plan tas transformadas essencialmente os mesmos fenótipos que se obser varam nas plantas transformadas descritas no Exemplo 5 (ou seja, não há nenhuma formação normal do estilete/estigma). As plantas transformadas são dotadas de esterilidade feminina.

Como ê escusado dizer, a presente invenção não se limita ãs transformações específicas de algumas plantas determinadas. A presente invenção refere-se a qualquer planta cujo genoma nuclear possa ser transformado com um ADN que induza esterilidade feminina sob o controlo de um primeiro promotor que pode dirigir a expressão do ADN que induz a esterilidade feminina de maneira sele ctiva nas células das flores, em particular nas células de um orgão feminino pertencente às flores, ou das sementes ou dos embriões da planta, graças ao que a planta pode ser simultaneamente objecto de auto-polinização e de polinização cruzada.

A presente invenção também não se encontra limitada aos plasmídeos e vectores específicos descritos nos Exemplos anterio-67-

res, mas antes compreende e engloba quaisquer vectores e plasmí. âeos que contenham o ADN que induz a esterilidade feminina sob o controlo do primeiro promotor.

Além disso, a presente invenção não se encontra limitada aos promotores PSTMG específicos, descritos nos Exemplos contidos na presente invenção, antes engloba qualquer sequência de ADN que codifique a estrutura de um promotor capaz de dirigir a expressão do ADN que induz a esterilidade feminina de modo selectivo nas cé lulas das flores, particularmente em um ou mais dos seus respectj^ vos órgãos femininos e/ou das sementes e/ou dos embriões da referida planta.

Em adição, a presente invenção não se encontra limitada aos ADNs que induzem a esterilidade feminina especif icamente dess critos nos Exemplos nela contidos; antes pelo contrário, engloba qualquer sequência de ADN que codifique a estrutura de um primeiro ARN, proteína ou polipéptido que significativamente perturbe de ma neira adversa o metabolismo, o funcionamento e/ou o desenvolvimento de uma célula de uma flòr, de um embrião ou de uma semente de uma planta na qual ele é produzido, sob o controlo de um primeiro promotor.

Também, a presente invenção se não encontra limitada aos ADNs marcadores descritos especificamente nos Exemplos, mas antes engloba qualquer sequência de ADN que codifique a estrutura de um segundo ARN, proteína ou polipéptido que confira a pelo menos um tecido específico da planta ou a células específicas da planta, na qual tal sequência de ADN é expressa, uma característica que o(s)

distinga quando comparado(s) com esse mesmo tecido específico ou essas mesmas células especificas da planta em que tal sequência de ADN não seja expressa.

Claims (51)

1. REIVINDTCACÕES

   1. - ADN que contém um primeiro ADN quimérico, caracterizado pelo facto de compreender:

   (a) um ADN de esterilidade feminina que codifica um primeiro ARN, uma primeira proteína ou um primeiro polipeptido, o qual ao ser produzido em células de um órgão reprodutor feminino da referida planta é capaz de as aniquilar ou incapacitar para evitar a produção de gãmetas femininos férteis e de sementes viáveis; e

   03) um primeiro promotor capaz de dirigir a expressão deste ADN selectivamente em células dos órgãos reprodutores femininos da referida planta, em que o referido ADN da esterilidade feminina se encontra na mesma unidade transcricional do referido primeiro promotor e sob o seu controlo.
2. 2. - ADN de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o referido primeiro promotor ser capaz de dirigir a expressão do referido ADN da esterilidade feminina especialmente nas células dos estiletes, nas células dos estigmas, nas células dos ovários, nas células dos óvulos e/ou nas células do septo.
3. 3. - ADN de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o referido primeiro promotor ser capaz de dirigir a expressão do referido ADN da esterilidade feminina especialmente nas células dos estiletes e/ou dos estigmas.

   .../...
4. 4. - ADN de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo facto de se seleccionar o referido primeiro promotor entre o grupo constituído por PSTMG07 que é o promotor de um gene endógeno do tabaco que codifica um ARNm a partir do qual é possível preparar o ADNc da figura 1 A; PSTMG08 que é o promotor de um gene endógeno do tabaco que codifica um ARNm a partir do qual é possível preparar o ADNc da figura IB; PSTMG4B12 que é o promotor de um gene endógeno do tabaco que codifica um ARNm a partir do qual é possível preparar o ADNc da figura 2A; PSTMG3C9 que é o promotor de um gene endógeno do tabaco que codifica um ARNm a partir do qual é possível preparar o ADNc da figura 2B.
5. 5. - ADN de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo facto de o referido primeiro promotor ser um promotor de um gene que corresponde ao clone de ADNc pMON9608.
6. 6. - ADN de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo facto de o referido ADN da esterilidade feminina codificar uma ribonuclease, particularmente aRNase Tl.
7. 7.caracterizado pelo Bamase.

   ADN de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 5, facto de o referido ADN da esterilidade feminina codificar uma
8. 8. - ADN de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo facto de o referido ADN da esterilidade feminina codificar uma DNase, especialmente uma endonuclease, em particular a EcoRI: uma protease, especialmente a papaína, em particular o zimogénio da papaína ou a proteína activa da papaína; uma glucanase; uma lipase, em particular a fosfolipase A2; uma peroxidase dos lipidos; um inibidor da parede celular; uma toxina bacteriana; ou uma ribozima, em

   3 c /3 particular uma ribozima contra o ARNm codificado por qualquer dos genes dc tipo STMG, ou por um gene correspondente ao clone de ADNc pMNO9608; ou pelo facto de altemativamente o referido ADN da esterilidade feminina codificar uma ribonuclease, em particular a T2 ou a Rh; codificar uma glicoproteína codificada pelos alelos Sl, S2, S3, S6 ou S7, em particular da Nicotiana alaía', ou ser um ADN anti-sentido, em particular um ADN anti-sentido que codifica um ARN que é complementar do ARNm de um gene de tipo STMG.
9. 9. - ADN de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo facto de o referido ADN da estirilidade feminina codificar uma enzima que catalisa a síntese de uma fito-hormona, em particular a enzima codificada pelo gene 4 do ADN-T do Agrobacterium ou uma enzima codificada pelo gene 1 e/ou gene 2 do ADN-T do Agrobacterium.
10. 10. - ADN de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo facto de o referido ADN da esterilidade feminina codificar uma polimerase do ARN dependente virai, em particular uma replicase do VNT, sob o controlo do referido primeiro promotor; e um cordão negativo de um gene que codifica a referida primeira proteína ou o referido primeiro polipéptido; em que o referido gene se encontra na mesma unidade transcricional de um promotor e sob o seu controlo, tal como outro primeiro promotor, capaz de dirigir a expressão do referido cordão negativo na célula; em que o referido gene está também fundido na sua extremidade 3’ com um promotor subgenómico virai tal como o promotor subgenómico do VNT, o qual é especificamente reconhecido pela referida polimerase do ARN dependente virai.
11. 11.- ADN de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo facto de o referido ADN exógeno compreender ainda:

    (e) um primeiro ADN que codifica um péptido de trânsito capaz de transportar a referida primeira proteína ou o referido primeiro polipéptido para dentro de um cloroplasto ou mitfí côndrio das referidas células dos órgãos reprodutores femininos; em que o referido primeiro ADN se encontra na mes ma unidade transcricional do referido ADN da esterilidade feminina e do referido primeiro promotor e entre esse ADN da esterilidade feminina e esse primeiro promotor.
12. 12. - ADN de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo facto de o referido ADN exógeno compreender também:

    (e) um terceiro ADN que codifica um péptido sinal secretório capaz de segregar a referida primeira proteína ou o referido primeiro polipéptido fora da célula de um órgão reprodutor feminino de uma planta; em que o referido terceiro ADN se encontra na mesma unidade transcricional do referido ADN da esterilidade feminina e do referido primeiro propromotor e localizado entre esse ADN da esterilidade femi nina e esse primeiro promotor.
13. 13. - ADN de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo facto de compreender também um segundo ADN quimérico adjacente ao referido primeiro ADN quimérico, em que esse segundo ADN quimérico compreende:

    (c) um ADN marcador que codifica um segundo ARN, uma se girada proteína ou um segundo polipéptido que, ao estar presente pelo menos num tecido específico ou pelo menos em células específicas de uma planta faz com que essa plan ta seja facilmente separável de outras plantas que não contenham esse segundo ARN, essa segunda proteína ou esse segundo polipéptido nesse tecido específico ou nessas células específicas; e um segundo promotor capaz de dirigir a expressão do referido ADN marcador pelo menos no referido tecido específi co ou nas referidas células específicas;

    em que o referido ADN marcador está na mesma unidade transcricional do referido segundo promotor e sob o seu controlo.
14. 14. - ADN de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo facto de o referido ADN marcador codificar uma proteína que inibe ou neutraliza a acção de um herbicida.
15. 15. - ADN de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo facto de o referido ADN marcador ser um gene de resistência aos herbicidas, em particular um gene que confere resistência a um inibidor da glutamina-sintetase tal como a fosfinotricina.
16. 16. - ADN de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo facto de o referido ADN marcador ser um gene sfr ou sfrv.
17. 17. - ADN de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo facto de o referido ADN marcador ser um gene que codifica uma enzima modificada destinatária de um herbicida e cuja afinidade com esse herbicida seja reduzida, em particular uma 5-enol-piruvil-chiquimato-3-fosfato-sintase modificada enquanto alvo /< . X rr para o glifosato ou uma glutamina-sintetase modificada enquanto alvo para um inibidor da glutamina-sintetase tal como a fosfmotricina.
18. 18. - ADN de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo facto de o referido ADN marcador ser um gene que codifica uma proteína ou um polipeptido que confere uma cor pelo menos ao referido tecido específico ou às referidas células específicas, em particular o gene Al ou o gene GUS; um gene que codifica uma proteína ou um polipeptido que confere a essa planta uma tolerância à fadiga, em particular o gene que codifica a Mn-superóxido-dismutase; ou um gene que codifica uma proteína ou um polipeptido que confere uma resistência a doenças ou pragas, em particular um gene que codifica uma endotoxina do Bacillus thuringiensis que confere resistência aos insectos ou um gene que codifica um péptido bactericida que confere uma resistência bacteriana.
19. 19. ADN de acordo com uma qualquer das reivindicações 13 a 18, caracterizado pelo facto de o referido segundo promotor ser um promotor constitutivo, em particular um promotor PNOS ou um promotor POCS; um promotor induzível em lesões, em particular um promotor TRI’ ou TR2’; um promotor que dirige a expressão do gene selectivamente nos tecidos das plantas que possuam actividade de fotossíntese, ou um promotor que dirige a expressão do gene selectivamente em células das folhas, em células das pétalas ou em células das sementes, em particular nas células da cutícula das sementes.
20. 20. - ADN de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo facto de o referido segundo promotor ser um promotor 35S ou um promotor SSU.
21. 21. - ADN de acordo com uma qualquer das reivindicações 13 a 20, caracterizado pelo facto de o referido ADN exógeno compreender ainda:

    (h) um segundo ADN que codifica um péptido de trânsito capaz de transportar a referida segunda proteína ou o referido segundo polipéptido para dentro de um cloroplasto ou mito côndrio pelo menos desse tecido específico ou dessas células específicas; em que o referido segundo ADN se encontra na mesma unidade transcricional do referido ADN marcador e do referido segundo promotor e entre esse ADN marcador e esse segundo promotor.
22. 22. - ADN de acordo com uma qualquer das reivindicações 13 a 20, caracterizado pelo facto de o referido ADN exógeno compreender ainda:

    (f) um quarto ADN que codifica um péptido sinal secretório capaz de segregar a referida segunda proteína ou o referido segundo polipéptido pelo menos fora desse tecido especifico ou dessas células específicas; em que o referido quarto ADN se encontra na mesma unidade transcricional do referido ADN marcador e do referido segundo promotor e loca Iizado entre esse ADN marcador e esse segundo promotor.
23. 23. - ADN, caracterizado pelo facto de compreender o ADN-T ou o pMGlOO da Figura 3, o pMGlOl da Figura 4, o pMG102 da Figura 5, o pMG103 da Figura 6, o pMG104 da Figura 7 ou o pMG105 da Figura 8.
24. 24. - ADN de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 23, caracterizado pelo facto de ser ADN nuclear de uma célula de uma planta ou de uma

    .../...

    semente.
25. 25. - Vector, caracterizado pelo facto de conter o ADN de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 23.
26. 26. - Célula de uma planta, caracterizada pelo facto de conter o ADN de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 24.
27. 27. - Célula de uma planta, caracterizada pelo facto de conter estavelmente integrado no seu ADN nuclear o ADN de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 23.
28. 28. - Célula de acordo com as reivindicações 26 ou 27, caracterizada pelo facto de poder ser regenerada dentro de uma planta com esterilidade feminina.
29. 29. - Cultura de células vegetais, caracterizada pelo facto de conter células vegetais de acordo com uma qualquer das reivindicações 26 a 28.
30. 30. - Planta, caracterizada pelo facto de conter o ADN de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 24.
31. 31.- Planta, caracterizada pelo facto de conter o ADN de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 24 em todas as suas células.
32. 32. - Planta de acordo com as reivindicações 30 ou 31, caracterizada pelo facto de possuir esterilidade feminina.
33. 33. - Planta de acordo com uma qualquer das reivindicações 30 a 32, caracterizada pelo facto de ser uma planta híbrida.

    .../...
34. 34. - Planta com esterilidade feminina, caracterizada pelo facto dc conter um ADN exógeno incorporado no genoma nuclear das suas células, em que o referido ADN exógeno compreende:

    (a) um ADN de esterilidade feminina que codifica um primeiro ARN, uma primeira proteína ou um primeiro polipeptido, que ao ser reproduzido nas células de um órgão reprodu tor feminino dessa planta é capaz de as aniquilar ou incapacitar para evitar a produção de gâmetas femininos férteis e sementes viáveis;

    e (b) um primeiro promotor capaz de dirigir a expressão deste ADN selectivamente em células dos órgãos reprodutores fg mininos da referida planta, em que o referido ADN da estg rilidade feminina está na mesma unidade transcricional do referido primeiro promotor e sob o seu controlo, desde que no caso de o referido primeiro promotor ser um promotor capaz de dirigir a expressão do referido ADN de esterilidade feminina selectivamente em gâmetas femininos ou em células derivadas de gâmetas femininos o genoma nuclear da referida planta seja homozigótico.
35. 35. - Planta de acordo com uma qualquer das reivindicações 30 a 34, caracterizada pelo facto de se seleccionar entre o grupo constituído por alfalfa e tabaco.
36. 36. - Semente de planta, caracterizada pelo facto de conter o ADN de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 24.
37. 37. - Fruto sem sementes dc uma planta, caracterizado pelo facto de conter o ADN de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 24.
38. 38. - Processo para a produção de uma planta com esterilidade feminina e de material reprodutor dessa planta, caracterizado pelo facto de:

    a) se introduzir o ADN exógeno de uma qualquer das reivindicações 1 a 23 dentro do genoma nuclear de uma célula de planta para se obter uma célula vegetal transformada;

    b) se regenerar a referida planta com esterilidade feminina a partir da referida célula vegetal transformada e; facultativamete,

    c) se obter o referido material reprodutor a partir da referida planta com esterilidade feminina que contém o referido ADN exógeno.
39. 39. - Processo de acordo com a reivindicação 38 em que o referido material reprodutor é uma semente, em particular uma semente híbrida, caracterizado ainda pelo facto de:

    a) se proporcionar uma planta que contém o ADN de uma qualquer das reivindicações 1 a 23 incorporado no ADN nu clear de todas as suas células e a qual possui esterilidade feminina;

    b) se efectuar a polinização cruzada entre i) a referida planta com esterilidade feminina e ii) uma planta com fertilidade feminina, e

    c) se recuperar a referida semente a partir dessa planta com fertilidade feminina.
40. 40. - Processo de acordo com a reivindicação 38 em que o referido material reprodutor é uma semente, em particular uma semente híbrida, caracterizado pelos passos seguintes:

    a) proporcionar uma planta que contém o ADN de uma qualquer das reivindicações 13 a 23, incluindo tanto o referido segundo promotor como o referido ADN marcador, incorporado no ADN nuclear de todas as suas células e a qual possui esterilidade feminina;

    b) efectuar a polinização cruzada entre i) a referida planta com esterilidade feminina e ii) uma planta com fertilidade feminina sem o referido ADN marcador e/ou sem o referido segundo promotor, e

    c) recuperar a referida semente a partir dessa planta com fertilidade feminina, caracterizando-se ainda o referido processo facultativamente pelo facto de se remover as plantas indesejadas com fertilidade feminina com base na ausência de expressão do ADN marcador nessas plantas com fertilidade feminina.
41. 41. - Processo para a produção de uma semente, caracterizado pelos passos seguintes:

    a) proporcionar uma planta que contém o ADN de uma qualquer das reivindicações 13 a 23 incorporado no ADN nuclear de todas as suas células, a qual possui esterilidade feminina e na qual o referido ADN marcador é um gene com resistência aos herbicidas, em particular um gene que confe re resistência a um inibidor da glutamina-sintetase tal como um gene sfr ou sfrv. ou um gene que codifica uma enzima modificada destinatária de um herbicida e cuja afinidade com um herbicida c reduzida, cm particular uma 5-enol-piruvil-chiquimato-3-fosfato-sintase modificada enquanto alvo para o glifosato ou uma glutamina-sintetase modificada enquanto alvo para um inibidor da glutamina-sintase tal como a fosfinotricina,

    b) polinização cruzada entre i) a referida planta com esterilida de feminina e ii) uma planta com fertilidade feminina sem o referido ADN marcador e/ou o referido segundo promotor, e

    c) recuperação da semente a partir da referida planta com fertilidade feminina, caracterizando-se ainda o referido processo pelo facto de se remover as plantas indesejadas com fertilidade feminina por aplicação desse herbicida, particularmente um herbicida que incorpore fosfinotricina.
42. 42.- Processo de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo facto de a referida semente ser uma semente híbrida.

    e
43. 43. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 41 ou 42, caracterizado pelo facto de a referida planta com esterilidade feminina, para além de conter o referido gene que confere resistência a um herbicida, possuir pelo menos outro ADN marcador estavelmente integrado no genoma nuclear das suas células no mesmo local genético do referido ADN da esterilidade feminina e pelo facto de a referida planta com fertilidade feminina não conter esse outro ADN marcador.
44. 44. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 39 a 43, caracterizado pelo facto de a planta com fertilidade feminina possuir esterilidade masculina.
45. 45. - Processo de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo facto de a referida planta com fertilidade feminina e com esterilidade masculina possuir nm ADN exógeno incorporado no genoma nuclear das suas células, em que o referido ADN exógeno compreende:

    (a) um ADN de esterilidade masculina que codifica um terceiro ARN, uma terceira proteína ou um terceiro polipéptido, que ao ser produzido(a) nas células dos estames da referida planta é capaz de as aniquilar ou incapacitar para impedir a produção das células dos estames;

    (b) um terceiro promotor capaz de dirigir a expressão do gene selectivamente nas células dos estames da referida planta, em que o referido ADN da esterilidade masculina está na mesma unidade transcricional do referido terceiro promotor e sob o seu controlo, desde que no caso de o terceiro promotor ser um promotor capaz de dirigir a expressão do referido ADN de esterilidade masculina selectivamente em células de pólen o genoma nuclear da referida célula da planta transformada seja homozigótico.
46. 46. - Processo de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo facto de o referido ADN exógeno da referida planta com fertilidade feminina e esterilidade masculina compreender também:

    (d) um segundo ADN marcador que codifica um quarto ARN, uma quarta proteína ou um quarto polipéptido que ao estar presente pelo menos num tecido específico ou pelo me14

    7 tf is nos em células específicas da referida planta faz com que essa planta seja facilmente separável de outras plantas que não contenham o referido quarto ARN, a referida quarta proteína ou o referido quarto polipéptido nesse tecido específico ou nessas células específicas; e (e) um quarto promotor capaz de dirigir a expressão do referido segundo ADN marcador pelo menos no referido tecido específico ou nas referidas células específicas, em que o sg gundo ADN marcador está na mesma unidade transcricional do referido quarto promotor e sob o seu controlo.
47. 47. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 45 ou 46, caracterizado pelo facto de o referido ADN exógeno compreender também:

    (f) um quinto ADN que codifica um péptido de trânsito capaz de transportar a referida terceira proteína ou o referido terceiro polipéptido para dentro de um cloroplasto ou mitocôfl drio das referidas células dos estames, em que o referido quinto ADN está na mesma unidade transcricional do referi do ADN da esterilidade masculina e do referido terceiro promotor e entre esse ADN da esterilidade masculina e esse terceiro promotor; e/ou (g) um sexto ADN que codifica um péptido de trânsito capaz de transportar a referida quarta proteína ou o referido quarto polipéptido para dentro de um cloroplasto ou mitocôndrio pelo menos desse tecido específico ou dessas células específicas, em que o referido sexto ADN está na mesma unidade transcricional do referido segundo ADN marcador e do referido quarto promotor e enfie esse segundo ADN marcador e esse quarto promotor.
48. 48. - Par de plantas progenitoras para a produção de sementes, caracterizado pelo facto de ser constituído por: a) uma planta progenitora com esterilidade feminina que contém o ADN de uma qualquer das reivindicações 1 a 23 incorporado no ADN nuclear de todas as suas células e b) uma planta progenitora de fertilidade feminina.
49. 49. - Par de acordo com a reivindicação 48, caracterizado pelo facto de a referida planta progenitora de esterilidade feminina e a referida planta progenitora de fertilidade feminina pertencerem a linhagens diferentes.
50. 50. - Par de acordo com a reivindicação 48, caracterizado pelo facto de a referida planta progenitora de esterilidade feminina e a referida planta progenitora de fertilidade feminina provirem da mesma linhagem congénita.
51. 51. - Par de acordo com uma qualquer das reivindicações 48 a 50, caracterizado pelo facto de a referida planta progenitora de fertilidade feminina possuir esterilidade masculina.