PT95123A - Processo de producao de factor citotoxico oligodendrocitico (ocf) e de anticor-pos monoclonais contra ocf - Google Patents

Description

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MENÓRIA DESCRITIVA

Campo_do Invento 0 presente Invento refere-se a um novo factor inibitório/citotóxico ol igodendrodtico capaz de provocar uma redução no número de oligodendrócitos que contenham projecções. 0 novo factor é útil para aumentar a regeneração de nervos danificados do sistema nervoso central de mamíferos.

Antecedentes do Jjnvento

No sistema nervoso central (SNC) dos mamíferos, os neurónios não regeneram espontaneamente os axónios cortados, enquanto os neurónios de peixes e anfíbios regeneram rapidamente os seus axónios. A incapacidade de regeneração do SNC dos mamíferos não parece resultar de uma propriedade intrínseca dos seus neurónios do SNC, uma vez que esses neurónios são capazes de efectuar um "recrescimento" considerável de axónios, iri vivo, numa ponte nervosa periférica. Em preparações in_ vitro, os axónios danificados do SNC de mamíferos, não crescem em, ou como, segmento de nervo óptico de mamífero, mas crescerão em, ou como um, nervo óptico de peixe ou para um nervo periférico de mamífero. Assim, as diferenças devem residir nos diferentes meios envolventes; o meio envolvente do SNC dos mamíferos, não apoia o crescimento, enquanto o meio envolvente dos nervos periféricos ou dos nervos ópticos dos peixes apoia, de facto, o crescimento. 0 nervo óptico é um modelo favorável para o estudo do papel de células gliais na regeneração axonial, uma vez que estão ausentes corpos celulares neurónicos e o nervo está acessível para ser lesionado. De entre os componentes celulares do nervo óptico da ratazana estão macroglia (astróci tos e oligodendrócitos) e microglia (microglia amibóide e ramificada). Os astrócitos dividem-se em dois tipos que podem distinguii—se através de marcadores antigénicos: os astrócitos protoplãsmicos, ou do tipo 1, são Ran2+, 6FAP+, e Â2B5--, enquanto os astrócitos fibrosos, ou do tipo 2, são Ran2-, 6FAP + e A285+ (Miller and 71 454 I/793 «

Raff» 1984; astróci tos progenitora A linhagem progenitora

oligodendrócitos produzem a mieiina e os astrócitos do tipo 2 contribuem para a estrutura dos nodos de Ranvier. Pode fazer-se com que as células progenitoras Q-2A se diferenciem, ijn vitro, em oligodendrócitos ou em astrócitos do tipo 2, na dependência do meio de cultura. Os astrócitos do tipo 1 têm uma célula progenitora diferente.

Raff and Mil ler, 1894), Os ol igodendrócitos e os do tipo 2 têm uma célula progenitora comum (a 0-2A), a qual possui o fenótípo Ran2-, GFAP- e oligodendrócito/astrócito do tipo 2 (resultante da 0-2A) é especializada na mielinizaçáo de axónios: os

As células nSo-neurónicas contribuem para o meio envolvente do SNC e foram implicadas no falhanço da regeneração do SNC, em mamfferos. Estas células incluem astrócitos que se hipertrofiam formando cicatrizes fibrosas em resposta a lesões e oligodendrócitos que são inibidoras do crescimento axonial. A cicatriz astrocitica é composta, em grande parte, por astrócitos do tipo 1 e tem sido considerado que impede o crescimento por formação de uma barreira física. Contudo, o período de formação da cicatriz é longo e parece improvável que uma barreira formada pela cicatriz impeça o crescimento axonial regenerativo, no período imediato pós-traumático. Mostrou-se que astrócitos do tipo 1, no nervo óptico de ratazana, expressam pre-natalmente, laminina, uma molécula implicada no apoio ao crescimento axonial durante a formação do nervo óptico. Normalmente, os astrócitos do tipo 1 do cérebro de mamíferos adultos não expressam laminina, excepto transientamente, depois de um dano no cérebro. Em contraste, a laminina é expressa continuamente no nervo óptico regenerativo do peixe. Em preparações in_ vitro, os axónios crescem em contacto intimo com os astrócitos do tipo-1.

Pensa-se agora, que os oligodendrócitos maduros são não--permissivos do crescimento axonial. Os axónios em crescimento evitarão contactar ol igodendrócitos maduros, ijn vitro. Durante o desenvolvimento, a maior parte do crescimento axonial no nervo óptico, ocorre antes do nascimento, antes que qualquer oligodendrócito se tenha diferenciado. Portanto, parece que a

71 454 Τ/793 -4~ regeneração axonial em mamíferos é obstruída pela presença d® oligodendrócitos maduros, que são não-permissivos do crescimento axonial e pela de astróeitos reactivos'do tipo 1, que carecem de ©lemento(s) de apoio, em contraste com o nervo óptico dos peixes.

Trabalho anterior dos presentes inventores e de outros, mostrou que o SNC dos invertebrados inferiores, especificamente, nervo óptico em regeneração, de peixe é uma fonte de factores que, quando aplicados no momento apropriado e em quantidades apropriadas a nervos ópticos danificados de mamíferos adultos, podem apoiar o crescimento axonial regenerativo, (Schwartz et a ] . , 1985; H a d a n i et ai, , 1984; L a v i e et ai,, 1897 e C o h e n et ai,, 1989).

Robbins et §1 , , 1.987, relataram que a estimulação de astrócitos de ratazana, in........vitro, resultava na produção de um factor citotóxico, que é funcional mente semelhante ao factor da necrose tumoral. Também relataram que o factor da necrose tumoral, humano, recombinante, tem actividade citotóxica, dirigida contra oligodendrócitos de ratazana. Selmaj et al., 1988, referiram-se ao teste do factor da necrose tumoral, humano, recombinante (rhTNF) relativamente ao seu efeito sobre culturas mielinizadas de tecido de espina 1-medu1 a de ratinhos. Verificaram que o rhTNF induzia o começo retardado da necrose dos ol "igodendrócitos e um tipo de dilatação mielínica.

Apesar dos substânciais esforços de investigação, em todo o mundo, não foram ainda desenvolvidos meios seguros e eficazes que provoquem a regeneração do SNC em mamíferos e, particularmente, nos humanos. Um tal meio, par ti cu 1 ar mente um produto farmacêutico que pudesse ser injectado no local da regeneração desejada, seria muito desejável para aliviar paraplegia pós--traumática ou quadriplegia, cegueira, surdez, axotomia associada com cirurgia, etc,

Sumário do invento 0 invento diz respeito a um factor citotóxico oligodendrocítico, aqui designado por QCF,'que revela um efeito rm

71 454 T/793 -5 citotóxico selectivo sobre a linhagem oligodendróclta, mas não sobre outras células, tais como astrócitos do tipo 1 ou células fibrob1ást1cas. 0 Invento, também diz respeito a sais, precursores, fragmentos e/ou homólogos do OCF e a derivados funcionais do OCF ou de seus fragmentos e/ou homólogos. 0 Invento também diz respeito a um processo para Isolar o OCF a partir de diferentes fontes, tais como nervos ópticos em regeneração, de peixe, macrófagos e outras fontes celulares, e à sua purificação.

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Numa outra concretização, o Invento diz respeito a anticorpos pollclonals e monoclonals contra o OCF.

Numa outra concretização, o Invento proporciona a produção do OCF por técnicas de engenharia genética. 0 invento também diz respeito ao uso do OCF, seus sais, precursores, fragmentos e/ou homólogos e de derivados funcionais do OCF ou de seus fragmentos ou homólogos, para a preparação de composições farmacêuticas dteis para a regeneração de nervos do SNC, em mamíferos, e às composições farmacêuticas assim obtidas,

Descrição.....das.......figuras

J A Figura 1 mostra o efeito de CM-R de peixe sobre células 04 positivas de adultos, em culturas de nervos ópticos danificados de ratazanas adultas. Prepararam-se as células a partir de nervos ópticos de ratazanas adultas os quais foram esmagados 3 dias antes da excisão e foram semeados em lamelas revestidas com poli-L-1isina, em meio definido. Coraram-se as culturas, para imunorreactividade para 04, às 96 h in vitro, através de um método de imunofluorescência indirecta, que foi realizado tal como se segue: primeiro, incubaram-se as células com anticorpos de ratinho, anti-04 durante 30 minutos, seguindo-se uma incubação de 30 minutos com IgM de cabra, anti-ratinho conjugada com f "luoresceina. No final da segunda incubação, as células foram lavadas e fixadas com metanol frio (~20°C), durante 10 minutos. Os quadros (a) e (b) mostram, respectivamente, micrografias de fluorescência e de fase das células de controlo em meio definido 71 454 -6- sem qualquer tratamento- Os quadros (c), (e) , (f) e (g) mostram células 04 positivas, em culturas tratadas com CM-R (12 μ9 de proteina/ml), durante 48 h, antes de serem coradas. Os quadros (c) e (d) representam micrografias de flurescência e de fase das mesmas células. As imagens foram recolhidas a partir de uma experiência cujos resultados se reproduziram em duas experiências adicionais.

J A Figura 2 mostra o efeito de CM-R sobre o desenvolvimento In vitro de células Gale positivas, de cérebro de ratazana pós-natal com 1 dia. Dissecaram-se e dissociaram-se cérebros de ratazanas recém-nascidas, de acordo com o procedimento de McCarthy e DeVellis, Depois de 8 dias in vitro, retiraram-se os oligodendrócitos e semearam-se em lamelas revestidas com poli-L--lisina (10^ células/alvéolo, numa placa de microtitulação).

Coraram-se as culturas às 24, 48 e 7 2 h in_______vitro, para

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imunorreactividade para Gale, através da técnica de imunof luorescêrtcia directa, usando IgM de cabra, anti-ratinho conjugada com f1uoresceina. Nas culturas experimentais, adicionou-se CM-R (í, 2 e 12 μ9 de proteina/ml) no momento indicado após sementeira (assinalado com uma seta), Em cada caso, contou-se o número real de células Gale positivas sobre toda a lamela (números acima do gráfico diário). Na cultura de controlo, o número de células Gale positivas permaneceu relativamente constante ao longo da experiência (24-72 h) e foi de cerca de 700-850 células. Note-se a falta de efeito inibitório no desenvolvimento de oligodendrócitos maduros, em todos os períodos de cultura, quando foi adicionado CM-R, numa concentração de 1,2 μ9 de proteina/ml , ao meio de cultura, no momento da sementeira. Observou-se um efeito inibitório pronunciado (mais de 50%), quando se adicionou CM-R a 12 pg de proteina/ml, no momento da sementeira. Quando se adicionou CM-R, ès 24 h i_n.....vitro depois da sementeira, houve quase 50% de inibição da maturação dos oligodendrócitos, depois de mais 24 h in vitro, se bem que este efeito pareça ser transiente. Repetiu-se esta experiência duas vezes e obtiveram-se os mesmos resultados qualitativos (M.E.-não executado). A Figura 2 também 71 454 T/793 -7- inostra que o efeito Inibitório era, também, reprodutível quando o número de células Gale positivas era monitorizado por ELISA, em vez de por Imunofluorescência. A Figura 2 também mostra uma curva de dependência da dose, da actlvldade Inibitória, como uma função da quantidade de CM-R aplicado.

J A Figura 3 mostra uma comparação entre os efeitos do CM-R e do CM-N, sobre o desenvolvimento de células Galo positivas, em culturas de olIgodendrócltos de cérebro d© ratazanas neonatais. Prepararam-se culturas de ol1godendrócitos como acima, e semearam~se em mui ti alvéolos (10® células) placa de mlcrof1tu1 ação), Depois de 24 h 1n vltro, foram adicionados CM-R ou CM-N nas concentrações Indicadas. Quarenta e oito horas depois, as células, foram examinadas Incubando primeiro com anticorpos contra Gale a 37°C, durante 30 minutos, seguindo-se peroxldase de rábano-sllvestre conjugada com anti-corpos de cabra antl-ratlnho (HRP-GocM, Bio-Makor, Israel), durante mals 30 minutos a 37°C. Obteve-se a determinação da quantidade de antl--corpos ligados por lavagem das células e adição de 100 μΐ de substrato (sulfato de 2,2'-az 1no~di(3-et11benztiazolina)), (Sigma) a cada alvéolo. Registou-se a absorção num Tltertech Multlskan MMC a 405 nm, com um comprimento de onda de referência de 630 nm. Cada barra representa uma média (± SD) de 3 alvéolos.

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0 gráfico Inserido para comparação mostra resultados obtidos através de contagem do número de células Gale positivas, por lamela, em culturas tratadas, ou com CM-R (12 pg/ml), ou com CM-N (12 pg/ml), adicionados às 24 h In vltro e examinadas 48 h depois. A Figura 4 mostra uma comparação entre os efeitos de PDGF e de CM-R sobre olIgodendrócltos do cérebro de ratazanas recém--nascldas. Obtiveram-se culturas de ol1godendrócitos de cérebros de ratazanas neonatals, tal como na Figura 2. Semeou-se um número Idêntico de células em todas as culturas, Às 48 h In vltro, as culturas foram coradas, para células Gale positivas ou para células A2B5 positivas. Nas culturas tratadas adicionou-se ou PDGF (5 ng/ml, Sigma), ou CM-R (12 pg de protelna/ml) no momento da sementeira. Como controlo, usámos culturas mantidas em melo definido que não foram tratadas. As micrograflas de 71 454 Τ/793

-8- fluorescência, mostram células coradas com anticorpos monoclonais Â2B5, de ratinho, em culturas de controlo (b) , culturas tratadas com PDGF (a), ou culturas tratadas com CM-R (d). 0 gráfico de barras em (c) mostra o número real de células A2B5. ou Gale, positivas, contado nas lamelas de cada tratamento (escala ~ 10 pm) . A Figura 5 mostra o efeito da aplicação combinada de CM-R e de PDGF sobre o desenvolvimento de células Gale positivas. Prepararam-se culturas de oligodendrócitos cerebrais, tal como nas Figuras 2 e 3, Adicionaram-se PDGF (5 ng/ml) ou PDGF juntamente com CM-R (5 ng/ml e 12 pg/ml respectivamente), a oligodendrócitos de cérebro de ratazana neonatal, 24 h depois da sementeira. Nos momentos subsequentes indicados (24, 48, 96 h) , as culturas foram coradas para células Gale positivas. Os números representam o número absoluto de células Gale positivas por lamela. Note-se a redução no número de células Gale positivas, quando tratados com uma combinação de PDGF e CM-R. A Figura________6 mostra que o CM-R afecta sei ecti vamen te os oligodendrócitos em culturas mistas d© astrócitos © de ol igodendrócitos de ratazanas recém-nascidas. Foram dissociadas células gliais misturadas de cérebros de ratazanas recérn--nascidas, como se descreve na Figura 2 e foram semeadas, de imediato, em lamelas revestidas com poli-L-lisina (10^ células/lamela). Mantiveram-se essas células invitro, durante 6 dias, em DMEM suplementado com 5% de FCS, que se mudou todos os 2 dias. No dia 6 mudou- se o meio para meio definido e suplementou-se com CM-R (10 pg/ml) ou com CM-N (10 pg/ml). Âs 72 e 96 h 1n_.......vitro, as células foram duplamente, marcadas com anticorpos monoclonais de ratinho contra Gale, e anti-GFAP de coelho, seguindo-se-lhes 1963 de cabra anti-ratinho, conjugada com rodamina, e de cabra anti-coelho, conjugada com fluoresceina, específicos, respectivamente. A micrografia de fluorescência (a) mostra células coradas com anti-GFAP © não afectadas pelo tratamento com CM-R após 72 h in......vitro. A micrografia (b) mostra o número de células Gale positivas, nas lamelas de cada tratamento, às 72 e às 36 h in......vi tro. Os resultados, representam

71 454 Τ'/? 93 -9- a média * SD de 2 lamelas. As micrografias (c) e (d) são micrografias de fase de células gliais misturadas típicas, de culturas não-tratadas (d) e de culturas tratadas com CM-R (c). Note-se que a monocamada formada pelas células não-sensiveis a CM-R, é corada por GFAP . As células sensíveis a CM-R, do controlo, formam cachos (d, marcados por setas) e são coradas com Â2B5 (dados não apresentados). Essas células representam, provavelmente, as progenitoras 0-2A, cuja proliferação é estimulada pelos astrócitos do tipo 1 que formam uma mono-camada. A Figura 7 mostra macrófagos transportados pelo sangue nas culturas de nervo óptico de peixe. Esses macrófagos eram muitíssimo abundantes em culturas de nervos que tinham sido danificados alguns dias antes da sua excisao. As células que se vêem aqui foram cultivadas em meio L-15 suplementado com 10% de FCS. (A) mostra um macrófago 7 dias após a colocação em placa, corado com' Giesma e visto por contraste de fase. (8) e (C) são células 5 dias após a colocação em placa, sendo (8) um contraste de fase e sendo (C) marcado com 602, após fixação. Vale a pena salientar que (C) mostra os vacúolos do macrófago cheios de miei iria. Esses vacúolos também foram corados positivamente com estearase não especifica (Figura 8). Todas as micrografias são 500 x. A Figura 8 mostra macrófagos positivos para estearase não especifica. Cultivaram-se células do nervo óptico de peixe--dourado tal como se descreveu, (A), (B) e (C) mostram macrófagos que, presumivelmente, são derivados do sangue. Estes eram raros em culturas de nervos ópticos de peixe que tinham sido cultivadas em orgãos antes da sua dissociação, mas eram abundantes em culturas de nervos ópticos de peixe que tinham sido esmagados alguns dias antes da sua excisão. Esses macrófagos são tipicamente, de forma circular, e as suas vesículas também se dispõem, tipicamente, numa forma circular. Essas vesículas são 602 positivas (Figura 7 B, C) o que é indicativo da actividade fagodtica da mielina dessas células. Em (D) a (G) podem ver-se macrófagos residentes. Observou-se uma diversidade de formas, desde longos e de tipo fibroblástico (F), até uma aparência mais 71 454 Τ/793 -10- arredondada (D e 6). As vesículas dessas células distribuem-se uniformemente por todo o citoplasma e também são 6D2 positivas. A Figura 9 mostra macrófagos residentes em culturas de nervos ópticos de peixe que foram cultivadas em orgios antes da dissociação. A figura mostra diferentes morfologias dos macrófagos residentes, desde as mais arredondadas - (A) a (D) -até à aparência alongada, de tipo fibroblástico (E) . Observou-se contacto entre os macrófagos residentes e os macrófagos transportados pelo sangue, tal como se vê em (F) e (G) . Também se observou contacto entre os ol igodendrócitos e ambos os tipos

J de macrófagos tal como se vê em (H) e (I). A natureza desse contacto, pode ser o englobamento das células, (H) e (I). (A), ÇC), (E), (F) e (H) são contrastes de fase e todas as outras micrografias estão marcadas com 6D2. Todas as micrografias são 500 x.

Descriçãodetalhada do invento

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0 novo factor citotóxico oligodendrocítico (OCF) do invento pode ser obtido a partir de nervos danificados em regeneração de vertebrados inferiores, tais como peixes. Está presente no meio condicionado de nervos ópticos em regeneração,de peixe e pode ser dele isolado e, depois, purificado. Também pode ser isolado a partir de macrófagos, uma fonte muito mais disponível, ou de qualquer outra fonte celular adequada. É isolado a partir do meio condicionado das ditas fontes celulares e, a seguir, é purificado. 0 termo "meio condicionado" (CM), tal como se usa na presente especificação e reivindicações, refere-se a um meio condicionado por nervos ópticos em regeneração, de peixe, preparado por incubação de segmentos de nervos ópticos de peixe, removidos 8 dias após esmagamento, num meio isento de soro durante 1,5-3 h, à temperatura ambiente, recolhido e filtrado. 0 CM obtido está isento de qualquer tecido. São exemplos de meios isentos de soro, que podem ser usados, o meio de Eagle modificado com Dulbecco (DMEM; 4 nervos ópticos por 300 μ.1 de meio), o meio de Leibowitz, U-15, etc. Quando se estabelece uma comparação -11- 71 454 Τ/793 entre meio condicionado de nervos em regeneração e de nervos intactos, usa-se, então, CM-R, para CM de nervos em regeneração e CM-N para CM de nervos intactos. A actividade citotóxica do OCF é medida pela sua capacidade para reduzir o número de oligodendrócitos maduros em culturas de cérebro de ratazana. 0 número de olIgodendrócitos é determinado usando anti-corpos dirigidos contra o cerebrosido (8alc), que marca os oligodendrócitos maduros. Uma redução no número de células ©ale positivas, indica uma redução no número de oligodendrócitos maduros. Descreve-se o teste com mais detalhes nos Procedimentos Experimentais e nos Exemplos, aqui incluidos. A actividade citotóxica do OCF é especifica para a linhagem 01 1 godendrocitica , Assim, ele inibe a diferenciação de progenitoras da linhagem oligodendrócitica em astrócitos do tipo 2 e oligodendrócitos maduros. Não possui efeito citotóxico sobre outras células, tais como astrócitos do tipo 1 ou células fibroblásticas.

Verificou-se que o OCF está presente no CM de nervos ópticos danificados em regeneração, de peixe, mas não no CM de nervos ópticos não-danificados de peixe. Também não está presente no CM de nervos ópticos danificados de mamifero. 0 OCF derivado de nervos ópticos em regeneração, de peixe reduz o número de oligodendrócitos maduros em culturas de nervos de mamifero, tais como culturas de nervos de ratazana. 0 OCF é solúvel em água e sensivel ao calor, perdendo a sua actividade após 30 minutos a 56° C. A 100°C o OCF perde a sua actividade apôs 10 minutos. 0 OCF é sensivel a proteases, perdendo actividade por digestão com tripslna. 0 invento compreende o factor citotóxico oligodendrocítico OCF, seus sais, precursores, fragmentos e homólogos e derivados funcionais do OCF ou de seus fragmentos ou homólogos, contando que possuam, pelo menos, uma porção substancial da acti.vidade biológica do OCF, isto é, da sua capacidade para reduzir o número 71 454 T/793 -12 de oligodendrócitos maduros.

Um "homólogo", é uma molécula substancialmente semelhante ao QCF ou a um seu fragmento ou a um seu precursor, obtida por delecção, adição ou substituição dos residuos de aminoãcido na molécula do OCF- Pode ser executada qualquer combinação de delecção, adição ou substituição, desde que a molécula final possua a actividade desejada. Por exemplo, uma vez conhecida a sequência do OCF e isolado o gene que a codifica, a partir de uma biblioteca de AON, podem executar-se todas essas modificações, usando técnicas bem conhecidas de AON recombinante,

J 0 invento também compreende modificações do OCF e/ou de seus precursores, fragmentos e homólogos, 0 que inclui moléculas associadas ou agregadas ou residuos ai ligados, por exemplo, residuos de fosfatos ou açúcares.

Tal como aqui é usado o termo "sais" refere-se, a sais de grupos carboxilicos e a sais de adição de ácidos de grupos amino da molécula polipeptidica.

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Os sais de um grupo carboxilo podem ser formados por meios conhecidos na arte e incluem sais inorgânicos, por exemplo, sais de sódio, de cálcio, de amónio, férricos ou de zinco, e similares, e sais de bases orgânicas tais corno os formados, por exemplo, com aminas, tais como trietanolamina, arginina ou lisina, piperidina, procaina e similares. Os sais de adição de ácidos incluem, por exemplo, sais de ácidos minerais tais como, por exemplo, ácido clorfdrico ou ácido sulfdrico, e sais da ácidos orgânicos tais como, por exemplo, ácido acético ou ácido oxálico. "Derivados funcionais", tal como aqui se usa, abrange derivados que possam ser preparados a partir dos grupos funcionais que ocorrem como cadeias laterais nos residuos dos grupos dos terminais N ou C, por meios conhecidos na arte e que são incluidos no invento desde que se mantenham farmaceuticamente aceitáveis, isto é, não destruam a actividade do polipéptido, não confiram propriedades tóxicas às composições que os contenham e

71 454 Ϊ/793 -13- não afectem adversamente as suas propriedades antigénicas.

Esses derivados podem incluir, por exemplo, ésteres ©lifáticos dos grupos carboxi, amidas dos grupos carboxilo, por reacção com amoniaco ou com aminos primárias ou secundárias, derivados N-acilo de grupos amino livres dos residuos de minoácido, formados com porções acilo (por exemplo, grupo® carbociclico-aroilo ou alcanoilò), ou derivados O-acilo de grupo® hidroxi livres (por exemplo, os dos residuos serilo ou treonilo)» formados com porções acilo.

J "Precursores" são compostos que .se formam antes do OCF e nele se convertem, no corpo humano ou do animal. 0 factor do invento é isolado a partir do CM de nervo® óptidos em regeneração, de peixe, ou do CM de macrófogos ou de qualquer outra fonte adequada e, a seguir é purificado, por processos bioquímicos convencionais, tais como cromatografia de permuta iónica, cromatografia de exclusão dimencional HPLC, etc.

J A regeneração de axónios do SNC de nervos ópticos de peixe, ocorre na presença de OCF, o qual é um factor derivado do meio envolvente desses nervos danificados. Q OCF inibe a. maturação de oligodendrócitos © partir das suas progenitoras e provoca uma redução no número de oligodendrócitos maduros com projecções, quando se adiciona a um sistema de um mamífero. Verificam-se que o OCF é activo em culturas de ratazanas. Assim, este factoppode proporcionar uma via para evitar o efeito repressivo, ou não-permissivo, dos oligodendrócitos maduros, sobre a regeneração no SNC de mamíferos adultos. Durante o desenvolvimento não são necessários factores como o OCF, uma vez que os axónios em desenvolvimento não encontram oligodendrócitos produtores de mielina totalmente diferenciados, os quais se sabe terem um efeito não-permissivo sobre o crescimento axonial, 0 efeito de substâncias derivadas de nervos ópticos em regeneração, de peixe observado sobre o número de ol1godendróc1 tos de mamífero cultivados, implica que o crescimento axonial em nervos ópticos danificados de coelho t 71 454 T/7 93 -14- tratados com CM de nervos ópticos em regeneração, de peixe (Lavie et ai., 1987), possa ser devido aos possíveis efeitos in vivo desses componentes na modulação da população de oligodendrócitos, em adição ao seu efeito sobre as propriedades dos astrócitos (Cohen e Shwartz, 1989). 0 efeito inibitório do OFC observado não é mediado por PDCF ou por CNTF o que provoca, indirectamente, uma redução no número de oligodendrócitos maduros (Noble et al., 1988; Lillien et al. , 1988). Relatórios recentes, têm referido que os astrócitos activados podem ser uma fonte de factores que podem inibir a maturação dos oligodendrócitos (Rosen et________al.,

J 1988) ou o factor da necrose tumoral (INF) (Robbins et al., 1987) e que o INF tem uma actividade citotóxica sobre culturas em orgãos mielinizados de tecido da espinal-medula de ratinhos (Seimaj e Ramie, 1988). Por isso, considerou-se a possiblidade de que a actividade observada seja mediada por factor funcionalmente semelhante ao INF. Para se avaliar a relação entre o OCF do presente invento e o INF, foram usados anticorpos dirigidos contra INF, humano, recombinante e mostraram não neutralizarem o efeito do CM-R observado.

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A regeneração dos nervos ópticos de peixe ocorre espontaneamente depois do dano. Nervos ópticos normais, de peixe, podem proporcionar, in vitro, um meio envolvente permissivo à emissão de neuritos por neurónios do SNC de mamíferos. É possível que os nervos ópticos normais, de peixe, estejam isentos de inibidores do crescimento neurónico associados à mielina, observados em mamíferos, ou que os possuam mas a um nível baixo» Se os peixes não tiverem inibidores do crescimento axonial, ou os tiveram a um nível baixo, isso implicaria que os peixes e os mamíferos diferem nos seus oligodendrócitos, ou que- (um) factor (es) inibidor(e^/citotóxico(s) estaria (m) a regular a expressão desses inibidores do crescimento axonial, associados à mielina. Uma tal possiblidade é compatível com os baixos níveis dos factores inibidores/citotóxicos encontrados nos nervos ópticos intactos, de peixe» 0 sistema visual dos peixes é invulgar no facto de haver uma adição contínua de células, ao longo da vida, pelo que o nervo óptico contêm sempre um contingente 71 454 Τ/793

15-de axónios ópticos em crescimento. Assim, há a possiblidade de que também esteja presente no nervo óptico não-danifiçado de peixe, um mecanismo de'crescimento num meio envolvente adulto, mas em muito menor grau. Isto sugere que os mamiferos, ou perdem a acessibilidade imediata, pós-traumática, no momento apropriado, a esses factores, ou não possuem de todo esses factores.

J 0 efeito citotóxico detectado nos nervos ópticos em regeneração, de peixe pode depender, directa ou indirectamente, de macrófagos, células microgliais residentes, activadas ou astrócitos activados. Se os macrófagos invadissem rapidamente o nervo óptico danificado de peixe, tal como fazem em nervos periféricos em regeneração, de mamiferos, poderiam ser responsáveis pela actividade aumentada que se observa em CM-R, em relação a CM-N, e por contribuirem para a eliminação dos oligodendrócitos maduros não-permissivos. Isto criaria um meio envolvente permissivo para o crescimento, enquanto os neurónios estivessem ainda num modo de crescimento induzido por um dano.

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Observou-se que, em culturas de nervos que foram danificados 2 dias antes da sua excisão, estavam presentes muitos macrófagos, mas só poucos oligodendrócitos. Em contraste, em culturas de nervos ópticos não danificados, que tinham sido cultivados em orgãos durante 2 dias, antes da sua dissociação, foram observados poucos macrófagos, mas um número relativamente elevado de oligodendrócitos. Esta relação inversa entre o número de ol igodendrócitos e de macrófagos, sugere um papel para os macrófagos na regulação do número de oligodendrócitos depois do dano, 0 presente invento compreende ainda anticorpos contra o factor do invento. Os anticorpos policlonais são derivados de soros de animais imunizados com uma preparação antigénica que contêm o OCF do invento, enriquecido ou purificado.

Os anticorpos monoclonais são preparados por processos bem conhecidos na arte. Imunizam-se animais com uma preparação bruta de OCF, enriquecida ou purificada, e as células do baço e/ou de nódulos linfáticos do animal imunizado fundem-se com células de 71 454 Τ/793

16-mieloma adequadas. 0 rastreio de sobrenadantes de hibridoma positivos é executado através do bio-teste para o OCF, aqui descri to.

Os anticorpos manoclonais contra OCF são usados para a purificação do OCF por cromatografia de afinidade, de acordo com processos bem conhecidos.

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Os anticorpos contra OCF, policlonais, e monocTonais, podem ainda ser usados para o rastreio de uma biblioteca de ADNc, para moléculas de ADN que codifiquem o OCF, os quais serão depois inseridos em vectores de expressão adequados e transfectados em células hospedeiras. A cultura dessas células' hospedeiras transfectadas produzirá OCF recombinante em grandes quantidades.

Uma das formas de usar o factor do invento para induzir a regeneração de nervos danificados do SNC, em mamíferos, consiste em implantar uma preparação do factor noorgão alvo. Por exemplo, pode usar-se um implante longitudinal do factor solúvel activo, ao longo do nervo, para aumentar a acessibilidade à substância aplicada: mini-bomba para fornecimento continuo do factor.

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Ma extensão que possa ser julgada necessária, para completar a descrição deste caso, todas as publicações referidas e citadas na especificação, são aqui incorporadas, por referência, no seu conjunto.

Ilustrar-se-á, agora, o invento através de experiências e exemplos seguintes, que se apresentam de um modo não-limitativo.

Procedimentos Experimentais a ._______D a n i f i ca ç ão p o r_____e s magamen to________de_______nervo óptico___de._____pei xe_______e preparação de CM .(Meio Condicionado)

Par® preparar 300 μΐ de CM , foram anestesiadas profundamente quatro carpas (Cyprinus carpio, 800-1200 g), com metanossulfonato de tricalna a 0,05%, (Sigma). Esmagaram-se, intraocularmente, os nervos ópticos e os animais foram recolocados no seu tanque. Oito dias depois, reanestes1 aram-se os peixes, os nervos esmagados em regeneração foram dissecados, transferidos para 300 71 454 Τ/793

-17 μ.1 de meio isento de soro (QMEM,Gibco) e incubadas durante 1,5 h, è temperatura ambiente, Os meios foram, então, .recolhidos, filtrados e armazenados a -80°C. Determinou-se o teor proteico dos meios pelo método de Bradford (Bradford M., 1976),

Efectuou-se como se segue uma digestão enzimática com tripsina: equi1ibrou-se tripsina ligada a agarose com PBS e incubou-se durante 4h, a 37°C, com CM- A solução foi centrifugada (1000 x g ; 5 minutos); no final da incubação o sobrenadante recuperado foi testado in____vi tro, nas culturas descritas abaixo- Os CM foram tratados pelo calor, a 100°C, durante 10 minutos. b. Danificação do.nervo óptieo de ratazana, por esmagamento

Anestesiaram~se ratazanas (250-350g) com Rompum (10 mg/kg, intraperitonealmente) e Vetalar (50 mg/kg, intraperitonealmente). Executou-se uma cantotomia lateral, com um microscópio binocular de operações, e fez-se uma incisão na conjuntiva, lateralmente, em relação ã córnaa, depois da separação dos músculos retractores do globo-ocular. Identificou-se o nervo óptieo e expôs-se perto do globo-ocular, através de dissecação sem corte. A dura-máter permaneceu Intacta. Esmagou-se o nervo, usando um fórcipe de acção cruzada, calibrado, a 1 mm de distância do olho, durante um per iodo de 30 s. Suturou-se a cantotomia e permitiu-se que o animal recuperasse. No momento próprio, reanestesiaram-se os animais e o.s nervos ópticos foram excisados. c .........Preparação de culturas, a partir.....de.....nervos.......ópticos danificados de ratazanas adultas

Para preparar as culturas de células gliais, foram usados cinco nervos ópticos de ratazanas adultas, em cada experiência. Os nervos ópticos foram esmagados como se descreveu, acima e, 3 dias depois, foram excisados, picados e incubados em meio L-15 de Leibowitz (Oibco) , que continha 500 U/ml de colagenase (Sigma). Depois de 60 minutos, a 37°C, adicionou-se um volume igual de tripsina (30000 U/ml), durante mais 15 minutos. Centrifugou-se a suspensão (500 x g , 5 minutos), o sobrenadante 71 454 T/793 “18 foi removido e, a seguir, o tecido foi ressuspenso, e tratado novamente, durante 15 minutos, com tripsina (15000 U/ml), numa solução que continha EDTA 0,25 mM em DMEM isento de ® Mg^+-

J A digestão foi terminada por adição de um volume igual de solução de inibidor da tripsina, de soja (5000 U/ml, Sigma), ADNase 1 de pâncreas de bovino (74 U/ml, Sigma), albumina de soro de bovino (BSA, fracção V, 3 mg/ml, Sigma), seguindo-se uma centrifugação. 0 sobrenadante foi substitufdo pela modificação de Raff et al., 1983) de meio definido de Bottenstein e Sato (Bottenstein e Sato, 1978), seguindo-se trituração do tecido. Colocaram-se em placa cinquenta μΐ da suspensão de células resultante, em cada lamela revestida por poli-L-1 isina (PLL, 20 pg/ml, (as células de um nervo óptico foram semeados em 3 lamelas). Depois de 30 minutos a 37°C, as células aderentes foram lavadas e foram adicionados 500 pl de meio definido. Adicionou-se 48 h depois CM de nervos ópticos em regeneração, de peixe, (12 pm/ml), às amostras da experiência. Examinaram-se as células, após mais 48 h, através de marcação por imunofluorescência indirecta. d. Culturas de células de cérebro de ratazana.......recé:m3jnasc i d a

Prepararam-se células gliais a partir de córtex cerebral de ratazanas Sprague-Dawley recém-nascidas (McCarthy e DeVellis, 1980). Para análise de culturas mistas de células gliais, 2

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colocaram—se as células em balões revestidos com PLL (85 mm , Nunc) ou em lamelas revestidas com PLL (10® células/lamela. ). As células foram cultivadas em DMEM suplementado com 5% de soro de bovino fetal (FBS, Sigma), que foi mudado cada 2 dias. e. Preparação de culturas de oligodendrócitos,_enriquecidas

Após 8 dias in vitro, o balão que continha populações mistas de células gliais de cérebros de ratazanas recém-nascidas, foi submetido a agitação, durante a noite e colocam-se as células não-aderentes em lamelas revestidas com PLL, com 10^ células/lamela, aproximadamente, excepto se especificado de outro modo. Permitiu-se que as células aderissem durante 30 minutos e a seguir, foram alimentadas com modificação de Raff de meio definido de Bottenstein e Sato, para encorajar o desenvolvimento 71 454 Τ/793

19-de oligodendróci tos. Trataram-se as células, a diferentes perfodos de tempo após a sementeira e submeteram-se a coloração de imunofluorescência indirecta ou ELISA, normalmente após 48 h, excepto se especificado de outro modo. f. Marcação por imunofluorescência indirecta

Imunomarcaram-se células cultivadas com os anticorpos seguintes: anticorpos monoclonais IgM de ratinho, (Â2B5

J sobrenadante de hibridoma diluído 1:1), que marcam astrócitos do tipo 2 maduros e progenitoras perinatais dos oligodendrócitos e dos astrócitos do tipo 2 (progenitores perinatais, 0-2A) (Eisenbarth et al_. , 1979; Raff et a]., 1983); anticorpos monoclonais IgM de ratinhos, 04 (sobrenadante de hibridoma concentrado, diluído 1:100), que marcam oligodendrócitos imaturos (Sommer e Shachner, 1981) e progenitoras adultas, 0-2A (ffrench--Constant e Raff, 1986a); anticorpos monoclonais anticerebrósido (Gale) de ratinho sobrenadante de hibridoma, diluído 1:10), que marcam oligodendrócitos maduros (Raff et________al,, 1978); proteína acídica fibrilosa anti-glial de coelho (GFÂP, soros inteiros, diluídos 1:1000), que marca astrócitos maduros do tipo 1 e do tipo 2 (Bignami et......al., 1972); anticorpos monoclonais de ratinho

J 6D2, que marcam oligodendrócitos de peixe (Jeserich e Romen, 1989). Segundos anticorpos conjugados com rodamina ou com f1uoresceína, foram adquiridos em diferentes origens: IgM de cabra anti-ratinho (diluída 1:50, (Jackson Immunoresearch Laboratories) ; IgGj de' cabra, anti-ratinho (diluído 1:50, Serotec); IgG de suíno, anti-coelho (diluído 1:50, Dakopatts). A imunomarcação dos antigénios da superfície (A2B5, 04 e

Gale), foi realizada, primeiro, por incubação de cada um dos anticorpos requeridos com as células, num volume de 50 μΐ, durante 30 minutos, a 37°C. A seguir, as células foram lavadas diversas vezes, com solução de sal equilibrada de Hank, contendo 2% de FBS inactivada pelo calor, e foram incubadas novamente durante 30 minutos, nos segundos anticorpos, conjugados com rodamina ou com fluoresceína, apropriados diluídos em OMEM. As células foram lavadas e fixadas em metanol a -20°C, durante 10 -20- Τ/793 minutos. Quanto aos antigétiios Intracelulares (6FAP) , as células foram, primeiro, fixadas e, a seguir, imunomarcadas. Em algumas experiências, as culturas foram duplamente marcadas, em simultâneo, com anticorpos A2Bg e 6alc, seguidos por IgM anti--ratinho (rodamina) e IgGg anti-ratinho (f luoresceina) . Em todos os casos, as lamelas foram lavadas, depois da imunomarcação, montadas com uma gota de glicerol, que continha 22 mM de 1,4--diazobiciclo(2,2)octaina (Sigma), para impedir o desvanècimento, foram seladas e examinadas num microscópio Zeiss Universal, equipado para contraste de fase e epifluorescência (para detecção de rodamina e f1uoresceina), e com sistema óptico e máquina fotográfica. Contou-se o número real de todas as células imunomarcadas em todas as lamelas. g. ELISA em células vivas

Prepararam-se culturas enriquecidas para oligodendrócitos como se descreveu acima. Semearam-se as células em placas rnul ti-al veolares de micro titulação (5 x 10^ células/al véolo, Mune). Após 24 h invitro, adicionaram-se CM, derivados, ou de nervos em regeneração, ou de nervos intactos, nas concentrações indicadas.. Quarenta e oito horas depois, as células foram examinadas por incubação com anticorpos contra Gale, durante 30 minutos, a 37°C, e, seguidamente, com peroxidase de rábano--silvestre conjugada com anticorpos de cabra anti-ratinho (BioMakor, Israel), durante mais 30 minutos, a 37°C, Obteve-se a determinação da quantidade de anticorpos ligados, lavando as células e adicionando a cada alvéolo 100 μΐ de substrato [sulfato de 2,2-azino-di (3-eti Ibsnzotiazol ina) , Sigma], suplementado com 0,003% de H2O2* Registou-se a absorção num Titertech Multiskan MMC, a 405 nm, com um comprimento de onda de referência de 630 nm. h. ........Coloração não-especifica.......pela estearase

Coraram-se células usando o processo da α-nafti 1 acetato--estearase, bem como o processo de inibição por fluoreto, utilizando um conjunto da Sigma. Adicionou-se nitrato de sódio (50 μ!; 0,1 M) a 50 μΐ de azul-rápido ("fast-blue"), (15 mg/ml, em HC1 0,4 M) . Deixou-se a mistura à temperatura ambiente 71 454 T/793

J durante 2-3 minutos. Acticlonaram-se-lhe 2 ml de água desionizada, a 37°C, seguida de 250 μΊ de concentrado tampão 7,6 Trizmal, seguido por 50 μΐ de solução de acetato de a-naftilo. Para a inibição pelo fluoreto, também se adicionaram 50 μ! de fluoreto de sódio ¢0,2 g/ml). A seguir, fixaram-se as células num fixador de citrato-acetona-formaldeldo (25 ml de solução de citrato, rnais 65 ml de acetona, mais 8 ml de formaldeido a 37%), durante 30 s, à temperatura ambiente. As células foram, então, profundamente lavadas em água, depois do que foram incubadas, durante 30 minutos, com a solução de reacção de acetato de cc--naftilo, a 37°C. Depois de terem sido lavadas profundamente, as células foram submetidas a uma contra-coloração, durante 2 minutos, com solução de Hematoxi1ina. A seguir, as lamelas foram lavadas e montadas em lâminas de microscópio, com glicerol, para observação. i. Anâ1ise estat1stica

Executou-se a análise estatística dos resultados utilizando o Teste das Classes, de Friedman ("Friedman Rank Test"). Neste teste estatístico, trata-se cada experiência como um bloco separado e determina-se a diferença significativa dos resultados (controlo versus tratado com CM) de acordo com o número de blocos.

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EXEMPLOS

Exemplo.......1.

Este exemplo mostra que os meios condicionados por nervos ópticos em regeneração,de peixe, contendo OCF, provocam redução nos oligodendrócitos com projecções , em culturas de nervos ópticos danificados, dissociados, de ratazanas adultas.

As Fig. 1a, b mostram células 04 positivas com projecções em culturas derivadas de nervos ópticos de ratazanas adultas, que foram danificados 3 dias antes da sua remoção. Na presença de meio condicionado (CM), derivado de nervos ópticos em regeneração, de peixe (CM-R; 12 pg de protefna/ml), adicionado a essas culturas 48 h depois da sementeira, o número de células 04

J positivas que aparecem à.s 96 h in vitro (Fig., 1c-g) era muito mais baixo do que em culturas não tratadas mantidas no meio de controlo (Fig. 1a,b). As células 04 positivas que permaneceram nas culturas tratadas com CM-R, tinham poucas projecções e, portanto, identificaram~se como oligodendrócitos imaturos (Fig. 1c~g), Obtiveram-se os mesmos resultados quando se repetiu a mesma experiência, usando anticorpos dirigidos contra oligodendrócitos maduros, tais como anticerebrosido (Gale), em vez de anticorpos contra 04. De acordo com isso, em culturas tratadas com CM de nervos em regeneração,de peixe (CM-R), apenas 42% das células se desenvolveram em células Gale positivas maduras, em relação ao total de células Gale positivas no meio definido. Estes resultados sugerem a presença de um factor(es) solúvel(e1s) nos meios condicionados por nervo óptico em regeneração , de peixe, o(s) qual(ais) pode(m) ser citotóxico(s) e/ou pode(m) inibir a maturação de oligodendrócitos a partir das suas progenitoras.

Exemplo 2

Este exemplo mostra que os meios condicionados por nervos ópticos em regeneração , de peixe, contendo OCF, afectam a maturação de células Gale positivas em culturas de oligodendrócitos de ratazana recém-nascida.

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Para se estudar melhor a natureza deste factor inibitório/citotóxico e o seu possível envolvimento na regeneração, procurámos, primeiro, uma fonte de oligodendrócitos mais rica e examinámos a possibilidade de se usarem culturas de cérebros de ratazana recém-nascida, em vez de nervos ópticos danificados, de ratazana adulta, uma vez que proporcionam uma fonte rica e uma população mais homogénea de oligodendrócitos.

Obtiveram-se oligodendrócitos de cérebro de ratazana recém--nascida e as suas progenitoras perinatais, no conjunto seguinte de experiências, pelo método de McCarthy e DeVellis, 1980. Semearam-se os oligodendrócitos em lamelas revestidas com poli-L-1isina. Adicionou-se CM de nervos ópticos em regeneração, de peixe (CM-R), a essas culturas enriquecidas a essas com 71 454 T/793

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J olIgodendrócltos de cérebro de ratazana recém-nascida (12 pg/ml), quer no momento da sementeira, quer 24 h e 48 h depois., Em todos os casos, semeou-se o mesmo número de olIgodendrócltos que nas culturas não tratadas de controlo. Tal como se pode ver na Figura 2, o número de células Gale positivas com muitlprojecções era mals baixo (cerca de 50%), em todas as culturas tratadas com CM, 24 h depois da aplicação do CM, do que em culturas paralelas não tratadas. Parece que, se o CM afectar apenas a maturação de olIgodendrócltos a partir das suas progenitoras, o número baixo de células Gale positivas, observado po.de ser, pelo menos em culturas tratadas 24 h ou 48 h depois da sementeira, um reflexo de morte espontânea de células, sob condições em .que é Inibida a renovação de células a partir das progenitoras. Em alternativa, o CM de nervo óptlco em regeneração, de peixe, pode afectar os olIgodendrócltos maduros, em acréscimo ao seu efeito sobre as progenitoras. Na Figura 2, também se mostra a dependência do efeito Inibitório em relação ã quantidade de CM aplicada. Assim, enquanto 12 pg de protefna/ml foram eficazes, 1,2 pg de protetna/ml foram Ineficazes. Tal como se mostra na Tabela I, 24 h depois da aplicação de CM—R, o número de células Gale positivas com projecções já era 40,3 ± 6,4% mals baixo, em relação ao seu número em culturas de controlo não tratadas (Tabela I). Ferver o CM-R ou tratá-lo com trlpslna, resultou numa diminuição do(s) seu(s) efelto(s) Inlbltórlo/cltotóxlco (Tabela II), o que sugere que o factor tem uma natureza proteica. 71 454 Τ/793

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Tabela I* Ο CM-R provoca uma redução no número de oligoden™ drócito de cérebro de ratazana

Tipo de células * Horas de pós™ -tratamento -** % do controlo *** (média * SD) Número de experiências (n) 011godendróci tos 24 40,3± 6,4 3 01 i g od en d r 6c 11 os 48 14,4*10,4 12 Células gliais misturadas 48 25,7± 4,7 4 * Nestas experiências, o número de oligodendrdcitos (células Gale positivas) contados nas culturas de controlo, por lamela, foi entre 350-1700 células. ** Adicionou-se CM-R com 12 pg de proteina/ml .. *** Calculou-se a percentagem de inibição em cada experiência tomando por 100% o número de células contadas nas culturas não-tratadas, de controlo.

J -25- Τ/793

Tabela II. Ο efeito inibitório/citotóxico de CM-R sobre oligodendrócitos é lébil ao calor e à tripsina.

Tratamento

Controlo Número de células Gale positivas (média ± SEM) 1427*247 CM-R 361* 17 * CM-R(fervida) 1474± 70 ** CM-R(tratado com tripsina) 1087± 10 **

Nesta experiência, cultivaram-se oligodendrócitos de cérebro de ratazana, como na Fig, 2- Às 24 h depois da colocação em placa, adicionou-se CM-R (fervido ou tratado com tripsina, 20 ng/ml). Quarenta e oito horas depois da adição de CM-R, determinou-se o número de células Gale positivas com projecções, contando as células imunofluorescentes. São dados os resultados de uma experiência, conduzido em triplicado. Reproduziram-se esses resultados em duas experiências adicionais. valor de p * 0,025 Não se observaram diferenças significativas, entre as culturas de controlo e culturas tratadas com CM-R, fervido ou tripsinado.

71 454 T/793 -26-

ExernpJ o.,3

Esta experiência mostra que a actividade inibitória/citotóxic® do OCF está associada com a regeneração dos nervos ópticos de peixe.

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Par® se determinar se o nível, ou a actividade, do factor inibitório/citotóxico está correi acionado com a regeneração dos nervos ópticos de peixe, comparámos o efeito do CM-R com o de meios condicionados por nervos ópticos não danificados de peixe, normais (CM-N). Foram adicionados, 24 h depois da sementeira CM-R ou CM-N, nas mesmas concentrações proteicas, a oligodendrócitos de cérebro de ratazana recém-nascida * 0 efeito resultante foi monitorizado com anticorpos anti-Galc, usando contagens de células Gale positivas, marcadas por imunof1uorescência indirecta. A Fig. 3 compara o número de células Gale positivas, em culturas tratadas com CM-N, com o seu número numa cultura tratada com CM-R. 0 efeito do CM-N foi menor, isto é, os nervos não danificados não têm actividade inibitória na maturação de oligodendróci tos.

Exemplo......4

Esta experiência, mostra que o OCF compreendido no CM-R, não mimetiza o efeito de PDGF.

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Mostrou-se, recentemente, que a diferenciação de oligodendrócitos é regulada por um factor de crescimento derivado das plaquetas (PDGF), (Noble et al . , 1988, Raff et ai . , 1988 e

Richardson et a 1 1988). A adição de PDGF a culturas de progenitoras de oligodendrócitos retarda, transientemente, a sua diferenciação, devido à sua actividade mitogénica.

Para aprofundar o possível mecanismo subjacente à inibição observada, pelo menos aquela que se relaciona com a maturação de oligodendrócitos a partir das suas progenitoras, comparámos a actividade de CM de nervos ópticos em regeneração, de peixe (CM-R), com a de PDGF. A adição de PDGF a culturas de cérebro no momento da sementeira, resultou numa redução nítida no número de células Gale positivas, às 48h in vitro. Contudo, o efeito foi 71 454 T/793 -27-

J marcadamente Inferior, quando comparado com o de CM-R (Fig. 4). 0 número nitidamente ma is baixo de células Gale positivas, observadas em culturas tratadas com POGF, em relação às células não tratadas, do controlo, foi um reflexo da proliferação das suas progenitoras, coradas com anticorpos A2B5. Isto foi evidente, a partir do número acrescido de células A2Bg positivas em culturas tratadas com PGDF. Tal como se pode ver na Figura 4, houve um aumento no número de. progenitoras 0~2A, coradas com anticorpos 'A2B5 (Fig. 4a,b,c), nas culturas tratadas com PDGF, tal como se esperava. Em contraste, nas culturas tratadas com CM, houve uma redução no número de células A2B15 positivas (Fig. 4c,d). Estes resultados sugerem que os CM-R afectam, não apenas oligodendrócitos adultos, mas também as suas progenitoras. Estas observações excluem a possibilidade de que o efeito observado do CM-R sobre o desenvolvimento de células Gale positivas a partir das suas progenitoras, seja mediado por PDGF ou por qualquer outro mitogénio. Isto, é corroborado pela Figura 5, a qual mostra que a adição do CM-R conjuntamente com PDGF, resultou numa redução das células Gale positivas, como seria esperado da aplicação apenas de CM-R. 0 factor neurotrófico ciliar (CNTF) é outro factor que se mostrou, recentemente, ser eficaz na linhagem de cél ul as 0'-2A, por induzir a diferenciação de astrócitos do tipo 2 e, por isso,

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provoca, indirectamente, uma redução no número de oligodendrócitos Gale positivos, maduros (Lillien et al, 1988).

Uma vez que o CM-R não provocou um aumento no número de células coradas com anticorpos A2Bg e, por isso, não aumentou nem as progenitoras, nem os astrócitos do tipo 2, é improvável que o efeito do CM-R seja mediado pelo CNTF.

Exemplo5

Esta experiência mostra a especificidade do efeito inibitório/citotóxico do OCF sobre oligodendrócitos, por meios condicionados com nervos ópticos em regeneração, de peixe.

Para se examinar se o efeito iriibitório/citotóxico do CM era unicamente em relação aos oligodendrócitos, aplicámos o CM-R a 71 454 T/793 -28- uma população mista de astrócitos e de oligodendrócitos. A Figura 6 mostra que o efeito inibitório observado não é devido a um efeito tóxico não-especifico, antes sendo selectivo \

J para os oligodendrócitos. Trataram-se culturas de populações mistas de células gliais, dissociadas de cérebro de ratazana recém-nascida, com CM de nervos em regeneração ou intactos (CM-R e CM-N, respectivamente). Essas condições são as mais favoráveis para a diferenciação de oligodendrócitos semeados sobre a monocamada formada pelos astrócitos. Mesmo sob estas condições, o efeito inibitório-do CM~R foi pronunciado, enquanto o CM-N tinha apenas uma actividade inibitória marginal, às 72 e 96 h, in yitro (Fig. 6b). Em contraste com o efeito inibitório do CM regenerativo sobre os oligodendrócitos, a sobrevivência e a diferenciação de células não-oligodendrócitas, que estavam presentes nessas culturas mistas e se coraram com proteina acidica fibrilar glial ( um marcador para astrócitos), não foram afecta-das pelo CM-R (Fig. 6a). A densidade aparente da monocamada de astrócitos, formada em culturas tratadas e não tratadas, era semelhante (Fig. 6c versus Fig. 6d) . 0 efeito inibitório obser vado do CM-R, não é portanto devido a um efeito tópico não-especif ico, antes sendo selectivo para a linhagem oligodendrócita (Fig. 6).

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Exemplo 6

Estas experiências mostram que existe uma relaçao inversa entre os números de oligodendrócitos e de macrófagos.

Na primeira experiência usaram-se peixes-dourados comuns. Preparou-se o meio condicionado com meio de Eagle modificado com Dulbecco (DMEM, 4 nervos ópticos por 300 pl/meio). A comparação entre as populações de células obtidas depois da dissociação de nervos, que foram mantidas em cultura em orgãos e as de nervos esmagados segundo as regras (isto é, OC-3 e PC-3 em ratazana e 0C-2 e PC-2 em peixe), poderá indicar se o comportamento dessas células após o dano era intrinseco do nervo óptico, ou se era afectado por algum factor externo, tal como r 71 454 T/793

29 monócitos do sangue. Todos esses factores externos estariam ausentes nas culturas em orgãos, desde que o nervo óptlco fosse retirado no momento do dano. j

Em culturas de nervos óptlcos de peixe, dissociados, que foram cultivados em orgãos, durante 2 dias, antes da dissociação (culturas QC-2), observou-se um número relatlvamente elevado (65 células por lamela) de olIgodendrócltos (células 6D2 positivas), mas apenas se viram uns poucos macrófagos, Em contraste, em culturas de nervos óptlcos dissociados, que foram exclsados 2 dias depois da sua lesão (culturas PC-2), desenvolveram-se muitos macrófagos, mas somente uns poucos olIgodendrócltos. Os poucos ol 1godendrócltos que foram observados em culturas de nervos esmagados (PC-2), eram multo mals pequenos e tinham projecções multo mais curtas do que os ol Igodendrócltos nas culturas OC-2. Estes resultados sumarlzam-se na Tabela III.

Paralelamente ao aparecimento dos ol1godendrócltos nas células dissociadas de nervos cultivados em orgãos, havia uma ausência completa de macrófagos, ou de células de tipo macrófago, nessas culturas. Mesmo depois de 7 cilas em cultura, não se viu nenhuma dessas células (por essa altura, essas células atingem um tamanho enorme, em culturas PC-2).

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71 454 Τ/793 -30-

Tabela III - Número de oligodendrócitos em culturas dissociadas de nervos óptlcos de peixe, que foram esmagados 2 dias antes da exclsão e da dissociação (culturas PC-2) & em culturas de nervos óptlcos de peixe que foram cultivados em orgãos durante 2 dias, antes da dissociação (culturas QC~2)^. NS de oligodendrócitos Cultura Exp. 1 Exp. 2 Exp, 3 Méd i a ±SD OC-2 65(±3) 93(±25) 40(±12) 66(±26) PC-2 3 (±1) 2 (±1) 15(±5) 7 (±6) * Em cada experiência usou-se o mesmo número de peixes, de tamanho aproximadamente Igual, para as culturas PC-2 e OC-2. As células foram, também por fim, semeadas, num número igual de lamelas. Desta forma, foram reduzidas ao mfnlmo as variações devidas ao processo experimental. Cada experiência foi realizada em triplicado. Contou-se o número total de olIgodendrócitos (células 6D2 positivas) nas lamelas e os números que se apresentam são as médias d© três ensaios.

Ao contrário da situação no peixe, na ratazana, o número de oligodendrócitos maduros que foi observado em culturas de nervos danificados e de nervos cultivados em orgãos, foi semelhante. Em culturas de nervos óptlcos de ratazana, que tinham sido cultivados em orgãos durante 3 dias (culturas OC-3), foram observadas três populações principais de células. Λ semelhança de culturas de nervos óptlcos de ratazana esmagados (Fig 3), uma grande proporção dessas culturas eram ol igoderidrócitos com 8 8 *

71 454 T/793 ‘ -31 - projecções que tinham sido marcados por Gale depois de 96 h em cultura, e constituíam perto de 40% do número total de células. Uma outra grande população de células (cerca de 40%) , assemelhava-se morfologicamente a macrófagos.

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Nas experiências seguintes, cultivaram-se células de nervo óptico de peixe-dourado em meio L-15 de Leibowitz, suplementado com 1-2% de FCS ou em meio L-15 suplementado com os mesmos aditivos usados na modificação de Raff do meio definido de Bottenstein e Sato, mais 1-2% de FCS. A cultura em orgão, de nervos ópticos de peixe, foi realizada em meio L-15 suplementado com os mesmos aditivos usados na modificação de Raff do meio definido de Bottenstein e Sato, mais 1-2% de FCS.

Preparou-se meio condicionado por nervos ópticos de peixe--dourado em regeneração (CM), de modo semelhante ao do CM-R definido acima, incubando segmentos de nervos ópticos de peixe--dourado, removidos 8 dias depois do esmagamento, em meio L-15 (10 nervos ópticos de peixe-dourado por 500 μΐ de meio, durante 3 h, â temperatura ambiente).

J

Os macrófagos nas culturas de peixe, incluíam macrófagos derivados do sangue, bem como macrófagos residentes. Os dois tipos de macrófagos eram discerniveis por critérios morfológicos: os macrófagos derivados do sangue eram, tipicamente, circulares e as suas vesículas também estavam dispostos de um modo circular; por outro lado, os macrófagos residentes tinham uma forma irregular e as suas vesículas estavam distribuídas ao acaso por todo o citoplasma. Além disso, nas culturas de nervos ópticos excisados alguns dias depois do dano de esmagamento, abundavam células reminiscentes dos macrófagos derivados do sangue (Fig. 7), mas eram raras em culturas de nervos ópticos cultivados em orgãos depois da excisão. Ambos os tipos de macrófagos, fagocitavam detritos miellnicos activamente, tal como é evidenciado pelos vacúolos marcados com 6D2, em células pré--fixadas (os vacúolos não são marcados por nenhum outro anticorpo utilizado, nem pelo próprio segundo anticorpo). Os macrófagos aparentemente derivados do sangue desenvolveram-se melhor quando 71 454 T/793 -32- 0 meio era suplementado com 10% de FCS ©, depois de uma semana em cultura, tinham crescido até dimensões muito grandes, comparados com as outras células da cultura (Fig. 7A). A Fig. 7C mostra um maerófago cujos vacúolos estão marcados com grandes quantidades do anticorpo 6D2. Esses macrófagos, também foram corados positivamente por estearase não especifica (Fig. 8A-C).

As células que foram consideradas como macrófagos residentes, apareciam sob muitas formas, mas puderam ser divididas em dois grupos principais: as que tinham um aspecto

J linear, idêntico a fibroblasto (Fig* 8F e Fig. 9E) e as que eram ma is redondas e ma is grossas e que, por vezes, possuiam projecções (Fig. 9A-D). Observou-se contacto entre os macrófagos derivados do sangue e os macrófagos residentes (Fig. 9F-8) e entre ambos os tipos de macrófagos e os oligodendrócitos (Fig. 9H-I). A natureza desse contacto parece ser englobamento de célula; os oligodendrócitos parecem ser englobados por ambos os tipos de macrófagos. Estes macrófagos residentes, também eram positivos com estearase não-especifica (Fig, 8D-8),

Devido à relação inversa entre os números de

J

01 igodendrócitos e de macrófagos e ao efeito que o CM tem sobre oligodendrócitos de ratazana, examinámos se as substâncias solúveis derivadas de nervos ópticos em regeneração, de peixe (i.e. derivados de CM), seriam responsáveis pela regulação, pós--dano, dos oligodendrócitos. Quando se adicionou CM a culturas de nervos ópticos dissociados, que tinham sido cultivados em orgãos durante 2-3 dias, o número de oligodendrócitos decresceu. Devido ao baixo número de oligodendrócitos por lamela a experiência foi repetida por diversas vezes. 0 teste estatfstico mostrou que o efeito do CM sobre o número de oligodendrócitos é significativo. Estes resultados, são apresentados na Tabela IV. -33- Τ/793

Tabela IV Efeito de meio condicionado por nervos ópticos em regeneração, de peixe (CM) sobre o número de oligodendrócitos, em culturas de nervo óptico de peixe®. b Experiência nS Número de oligodendrócitos c (±S,D.)d Controlo Tratados com CMe 1 24,5 ± 2,0 13 ± 1,5 2 57 ±16 30 ± 3,5 3 35 ±8,0 26 ±12 4 24 ± 4,0 19 ± 4,0 5 19 ± 3,0 3,5 ± 2,5 6 13,5 ± 0,6 4,5 ± 0,6 7 15 ± 3,5 7 ± 5,0 a Os nervos ópticos foram excisados e cultivados em orgão, durante dois dias. Os nervos ópticos foram, a seguir dissociados e colocados em placas. Nesta fase, adicionou-se o meio condicionado dos nervos ópticos em regeneração,de peixe (CM), aos alvéolos apropriados, k Devido ao pequeno número de células, a experiência foi repetida por diversas vezes. c Fez-se cada experiência em triplicado, cuja média é dada. d Desvio padrão dos triplicados, e Adicionou-se o CM para dar uma concentração final de 40 μg/m^. 0 teste das classes, de Friedman ("Friedmam Rank

Test"), que se utilizou para a análise estatistica dos resultados, deu um valor p = 0,0001 , para a diferença significativa entre as lamelas do controlo e as tratadas com CM. 0 teste da série de classe, de Friedmam ("Friedmam block rank test"), que se usou para analizar os resultados, mostrou que ~34~ Τ/793 a diferença significativa entre as lamelas de controlo (não--tratadas) e tratadas com CM era igual a 0,01% (p=0,00G1). Quando se adicionou, do mesmo modo, meio condicionado por nervos ópticos de peixe-dourado, que não estavam em regeneração (normais) (CMN), às culturas, não se observou nenhum efeito sobre o número de oligodendrócitos, como se mostra na Tabela V,

Tabela V Efeito de meio condicionado por nervos ópticos de peixe normais (CMN) sobre o número de oligodendrócitos de peixe, comparado com o de meio condicionado por nervos ópticos em regeneração, de peixe (CM)a. Número de oligodendrócitos (±S.D.)b Controlo Tratados com CMe Tratados com CMNe 92 ±22° 50 ±6C 103 ±15C 46 d ND 45 d a A experiência foi conduzida como se descreve na tabela I. b Desvio padrão de triplicados. c Cada experiência foi feita em triplicado, fornecendo—se a média. a d A experiência foi conduzida em duplicados. Por isso, não é dado o SD. e Adicionaram-se CM e CMN, para dar uma concentração final de 40 pg/ml.

Exemplo.......7

Esta experiência, mostra a sensibilidade do QCF do invento a um tratamento a 56°C. 71 454 Τ/793 *35- Α determinação das células 6alc positivas em culturas de células de cérebro de ratazana recém-nascida, emriquecidas para oligodendrócitos é realizada por ELISA, como se descreveu nos Procedimentos Experimentais, Como se pode ver da Tabela VI, há uma redução do número das células 6alc positivas, a 560C, como é evidenciado pela redução da densidade óptica medida.

Tabela VI Sensibi1 idade à temperatura do GCF compreendido no meio condicionado (CM), tal como foi medido por ELISA

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Densidade óptica média *SD

Concentração4

Temperatura ambiente 56° Cb

0,752±Q,076C CM(200 pg/ml) 0,555*0,008 0,738*0,040 CM( 20 ug/ml) 0,546*0,029 0,709*0,016 a Concentração final do CM. b Aqueceu-se a cultura a 56°C, durante 30 minutos.. c Experiência executada em 4 ensaios, cuja média é dada,

Exemplo 8

Esta experiência mostra o efeito do meio condicionado de macrófagos de sangue de peixe sobre oligodendrócitos.

Preparou-se, como se segue, uma cultura rica em macrófagos.

contendo PBS

Recolheu-se sangue de peixe em heparine/, e, a seguir, pos-se em camadas sobre um gradiente de Hypaque-Ficoll, produzido por mistura de 70,6 ml de Ficoll, a 12%, p/v, (Sigma), com 29,4 ml de diatriozato de sódio, a 32,8%, p/v,(Sigma). Pôs-se uma camada de 10 ml de sangue sobre 5 ml de Hypaque-Ficoll, num tubo de poliestireno de 15 ml. Centrifugaram-se os tubos, a 100g, durante

X 71 454 T/793 “36~ 25 minutos, a 10°C. Removeu-se a capa cor de couro que continha linfócitos e monócitos, e lavou-se uma vez com PBS. As células foram recolhidas e ajustadas a 20 x 10® células/ml. Depois de 1 h a 16aC, lavaram-se as células 3- vezes com PBS para remover as células frouxamente aderentes e as células não-aderentes, A seguir, adicionou-se meio L-15 às células.

J

Preparou-se meio condicionado por uma cultura rica em macrófagos, incubando as células num meio isento de soro durante 8 h, ou num meio contendo 1 ipopol issacáridos. Este meio condicionado foi adicionado a culturas de oligoderidrócitos e o número de oligodendrócitos foi determinado por contagem das células imunoflurescentes Gale positivas, como se descreveu nos Procedimentos Experimentais. Na primeira expriência, o número de células Gale positivas, contado., na presença do condicionado da cultura rica em maerôfagos foi de 420, em comparação com 839, no controlo. Ma segunda experiência existiam 24 células Gale positivas, em comparação com 62 no controlo.

Exemp1 o......9

Composições farmacêuticas

J

0 factor citotóxico oligodendròcitfco OCF do invento é útil como ingrediente activo de composições farmacêuticas, para uso na regeneração de nervos do sistema nervoso central. De preferência, será administrado localmente ao orgão alvo. Podem usar-se quaisquer sais, precursores, fragmentos e/ou homólogos do OCF ou derivados funcionais do OCF ou de seus fragmentos ou homólogos, ou misturas destes, para o mesmo fim, desde que tenham a actividade do OCF. 0 OCF é usado numa quantidade e numa pureza suficientes para facilitarem a regeneração de axónios do SNC em mamíferos, particularmente em humanos. 0 OCF é administrado por qualquer maneira que se calcule levar o factor para a vizinhança dos axónios danificados, a regenerar. De preferência, o OCF é injectado num suporte líquido farmaceuticamente aceitável, directamente no local. Em 71 454 T/793 * -37- alternativa, pode inserii—se cirurgicamente uma implantação, que contenha o OCF. Tal implantação, pode consistir de qualquer material, tal como nitrocelulose, que absorva o OCF como uma esponja e que o liberte, lentamente, no local da implantação. Outros meios de distribuição serão evidentes aos peritos nesta arte e pretende-se que estejam compreendido© no âmbito do presente invento.

J A quantidade do OCF a ser administrada a um dado paciente, depende de uma diversidade de factores, tais como do dano em tratamento, do sitio dos axónios danificados que se pretendem regenerar e do estado do paciente. Contudo, o OCF é tipicamente administrado numa dose de cerca de 100 unidades, como uma única i n j e c ç ã o , ou como i n j e cções múltiplas, em redor do local danificado, ou vai embeber nitrocelulose ou qualquer outro suporte adsorvivel. As dosagens precisas serão determinadas empi ri camente. 0 OCF é preferi velmente administrado tão cedo quanto possivel, depois do dano em tratamento. Assim, usa-se, preferencialmente, para danos agudos em vez de para danos crónicos. Quanto mais longo o pertodo de degeneração que tenha existido, mais dificil será facilitar a regeneração em conformidade com o presente invento.

J

Se bem que a administração do OCF isolado revele bons resultados, pode combinar-se esse tratamento, com qualquer tipo de terapia concomitante que possa tender a aumentar o© seus efeitos. Por exemplo, a irradiação do local do dano com laser de baixa energia, de preferência laser de He-Ne (5 minutos/dia, 35 mW), pode retardar o processo pós-traumático da degeneração e, desta forma, retardar a formação de cicatriz (Assia et_al., Brain Res., 476, 205-212 1988). São incontáveis os diversos danos que podem ser tratados em conformidade com o presente invento e rapidamente se tornarão evidentes aos que possuam um conhecimento médio da arte. Sem que sejam limitativas, podem mencionar-se danos na espinal medula, danos do nervo óptico ou dos nervos auditivos, etc, Qs danos de 71 454 T/793 -38” neurónios do SNS durante neuro-cirurgia, ou provocados por tumores, também podem ser tratados por meio do presente invento.

Para os fins do presente invento, o OCF pode ser formulado com todos os suportes ou excipientes f armaceuti carnente aceitáveis, 0 OCF, pode ser apresentado como uma solução aquosa, por exemplo na forma de uma solução aquosa estéril. Pode estabilizai—se uma solução ou um pó contendo OCF por meio de um agente estabi1izante. Adiministra-se a composição no local do dano, numa quantidade eficaz para facilitação da regeneração dos axónios lesionados.

J

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J

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Claims (1)

1. 71 454 T/793 -41- REI V......INDICAÇÕES 1ã. - Processo de produção de um factor citotóxico oligodendrócito (OCF), dos seus sais, precursores, fragmentos e/ou homólogos e dos derivados funcionais de OCF ou dos seus fragmentos e/ou homólogos, os quais são tóxicos selectivamente para a linhagem oligodendrocítica, caracterizado por se submeter meio condicionado de nervos em regeneração, de vertebrados inferiores, ou de macrófagos, a um procedimento de separação, preferivelmente a uma cromatografia. J 2 a _ - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a toxicidade do referido factor ser medida pela sua capacidade de reduzir o número de oligodendrócitos maduros em culturas de nervos danificados. 3â. - Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por o referido factor inibir a diferenciação dos progenitores da linhagem de oligodendrócitos, em oligodendrócitos maduros e em astrócitos do tipo 2. 4§, - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por o referido factor ser solúvel em água e sensível ao calor, perdendo a sua actividade quando aquecido a 56° C. J

   5sL. - Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4, caracterizado por o referido factor ser sensível à protease e perder a sua actividade por digestão com tripsina, 6i. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por o referido factor ter as seguintes características: i. ser selectivamente tóxico para a linhagem oligodendrocíti ca, mas não para outras células tais como astrócitos do tipo 1 e células fibroblãsticas; ii. reduzir o número de ol igodendrócitos maduros em culturas de nervos danificados, de vertebrados inferiores e de mamíferos; i i i. inibir a diferenciação de progenitores da linhagem o"i igodendrocítica em ol igodendrócitos maduros e em astrócitos do 42- 71 454 Τ/793 tipo 2; iv. ser solúvel em água; v. ser sensível ao calor, perdendo a sua actlvldade quando aquecido a 56° C; v1. ser sensível à protease, perdendo a sua actlvldade por digestão com trlpslna; vil, estar presente nos meios condicionados de nervos danificados em regeneração de vertebrados Inferiores, tal como de peixe, mas não estar presente nem nos meios condicionados de nervos Intactos de vertebrados Inferiores nem nos meios condicionados de nervos Intactos ou danificados de mamíferos; vlll. estar presente nos meios condicionados de macrófagos; 1x. ser purlflcével a partir dos meios condicionados de nervos danificados em regeneração, de vertebrados Inferiores, ou de macrófagos. 71. ~ Processo para a preparação de anticorpos monoclonals, contra o factor cltotóxlco olIgodendrodtlco, obtenível de acordo com o processo de qualquer das reivindicações 1 a 6, caracteriza-do por compreender os passos de fundir células do baço Isoladas de um mamífero, preferivelmente um roedor, preferivelmente um rato, imunizado com o referido factor, com uma linha de células de mieloma e selecdonar um hibridoma produzindo o referido anticorpo monoclonal. Lisboa, Por YEDA RESEARCH AND DEVELOPiMEMT COMPANY LIMITED - 0 AGENTE OFICIAL -

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