PT95176A - Processo para a identificacao imunologica de analitos - Google Patents

Description

MEMÓRIA DESCRIΠVA 0 presente invento diz respeito a um processo para a identificação de anaHtos através de processos imunológieos.. Têm vindo a adquirir grande importância no diagnóstico clinico os processos de identificação que se baseiam no principie dv kiuno-ensaio. Através de processos imunológieos pode ser identificado um número muito grande de substâncias, de maneira precisa e especifica. Para este fim, sáo necessários anticorpos oue formem complexos com a substância a identificar, de maneira muito especifica, mas não com compostos de estruturas ·:: ν-··--.ιοΊ hantes, A obtenção de anticorpos específicos é portanto uma .-••ir-te muitc essencial na elaboração de novos processos de ickvitu í icsçac ou rc aperf©i çoamanto de processos conhecidos. 0 método de Koehler e Hilstein, com o qual é possível produzir cn-ricr vos monoclonais trouxe um aperfeiçoamento considerável . embora a produção de linhas de células de hibridomas, que Licem anticorpos monoclonais r já não apresente, em princípio, nenhuma dificuldade, o processo de selecção, através do qual são escolhidas as linhas de células produtoras de anticorpos específicos @ com alfa afinidade, adequadas para um dado caso, requer frequentemente muito trabalho. Quanto mais elevadas forem os exigências no que diz respeito ès propriedades do anticorpo moniclcnal , tanto mais vasto se torna também o trabalho de selecção e, eventua 1 mente, torna-se até impossível encontrar um ont iorno morioc Ί ona Ί individual adequado. As exigências nrincip-ais às quais deve responder um anticorpo sáo, por um lado, ume l cc afinidade pela qual o anticorpo se liga ac «seu» antigenio ou hapténo, e, por outro lado, uma grande c:'xç if 1 cidade através da qual o anticorpo reconhece o «seu» antigénio ou hapténc„ e, consequentemente, uma baixa reactividade o'ipsoci.. A afin idade do anticorpo regula-se pelas circunstâncias njssectlvas„ por exemplo a concentração do anal 1 to. Â rcacfivioade cruzzà* do anticorpo procurado em relação a «outros» an tigénios dev® situai—s© abaixo de determinados valores. Estes valores são fixados de modo que estes antigénios não efeetuam nenhuma alteração do sinal de medição que ultrapasse o limite de

1 1 ο u ·.: ui / 00-'ΡΤ -3- erro f,= v correspondente processo de identificação.

Frequentemente. da pesquisa de um anticorpo monoclonal ideal no que diz respeito à afinidade e è especificidade, não resulta nem um único anticorpo bom para um ensaio havendo no entanto, alguns gu® correspondem à maioria das exigências, mas não ® tcdas . 0 processo, de acordo com o nível actual da tecnologia, .· pns ·. ern variar as condições de ensaio (pH, concentração de cai temperatura, etc.) até se obterem, reactividades cruzadas com c arpncorpo monoclonal utilizado, toleráveis para um ensaio c i ir.-fco. Este processo é, no entanto, moroso, não conduzindo iras vezes ao resultado desejado. 0 objectivo do presente invento, foi entSo o de aperfeiçoar ,s processos competitivos de identificação imunológicos, através do fornecimento de receptores com uma maior especificidade.

Este problema resolvesse através de um processe para a identificação imunológica de analitos monov®1 entes, pela concorrência do anal 1 to a determinar com uma quantidade conhecida de analito marcado ou Imobilizado pelo sitio de ligação de um recep-b; ao· anal Ito, caractsrizado por se u t i 1 i z a r , como rec.spfcor, uma mistura de, pelo menos, dois anticorpos monoclonais oaoareo de se ligarem, de maneira especifica, ao analito, os quais têm uma reactividade cruzada diferente. õ.u r-,j rèén den temente, pela utilização de uma mistura de i·' ei :-:0(5 0¾ monoclonais, dos quais cada um por si só não . ·' .'*eseonde as exigências de especificidade e afinidade, : Oi iseoue pôr à disposição um sistema de ensaio que tem uma •o ví rdtcidade aperfeiçoada em relação às substâncias individuais

Para os processos competitivos de identificação imunológica ha muitas variantes universai mente conhecidas. Regra geral. preferem-se, para analitos monovalentes, sobretudo para hapténos, v;lo princípios de ensaio: o receptor, ligado a uma fase sólida, reage com a amostra e com o analito marcado, ou um receptor marcado reage com a amostra ® com um anal ito ligado à fase

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só 1 ida . No processo de acordo com o invento, o anticorpo é smpregu z , regra gera 1, numa quantidade aquimo lar ou numa -π isnt Idade relativa menor, É possível isolar os complexos formados e avaliar a marcação -λ maneira conhecida 0 processo de acordo com o invento oras um •íoarfeieo-amento para todas as variantes metódicas. £.;< dependência do processo empregue, é possível utilizar a ui 1 *» tura cie anticorpos de acordo com o invento, como reeeptor marcado, reieptor ligado a uma fase sólida, reeeptor aglutinante etc. Esc©1hsm-se para a mistura de anticorpos utilizada de •3'·. ".rd© com o invento, anticorpo© monoelonais com uma actividade que se encontra na zona óptima e que apresentam poucas reaccões cruzadas, sendo a reactividade cruzada maior do que o valor teórico. As reactividades cruzadas dos anticorpos utilizados na mistura são diferentes, quer isto dizer que os anticorpos reagem com vários compostos semelhantes à substância a identificar., Por outras palavras, um anticorpo pode ter reacçôes cruzadas com substâncias com as quais um outro anticorpo não reage nada ou, re i ': menos reage não de maneira detectáveT (e vice-versa) . A reactividade cruzada de um anticorpo em relação a uma determinada £'.ó?tancia é, neste caso, um valor medido, relativo e não absoluto., oue depende do respectivo sistema ds ensaio. 0 ponto <: · r e f e rencia é o analito a determinar, ao qual se liga -CP" ec 1 f ί ca mente o anticorpo, 0 sinal de medição atingido na tícvc com o anal ito, equivale (é equiparado) a 100% . Adiciona····©.-, a seguir, è solução de ensaio a substância de reactividade cruzada, em emeentrações diferentes. Obtem-se então um sinal de medição com a substância de reactividade cruzada, o qual corres-pcncle a uma determinada quantidade do anal ito propriamente dito. p?".....se a leitura na érea de maior precisão da curva de calibra- cao. Este sinal é também indicado em percentagem. Uma reacçáo cruzada de 10%, por exemplo, significa, portanto, que será precise aplicar dez vezes ma is de uma substância de reactividade -runada para obter um sinal igual ao que foi obtido com a quantidade simntês do analito. Num sistema de ensaio diferente, é rczsível zue se obtenha um outro valor para a substância de

1 ?so

503/00/PT -5- r···=.?;ct-ivTd.3cie cruzada-. As reacçoes cruzadas exigidas num ensaio f'volores teóricos) dependem da concentração da respectiva subs kãnc-ia de reactividade cruzada em relação ao anal i to, ccdu-ndo ser, portanto, muito diferentes. do processo de acordo com o invento podem ser utilizados anticcroos monoclonais com uma reactividade cruzada, em relação a uma determinada substância, até ao triplo do valor teórico superior de preferência até ao dobro. A ársa do valor teórico encontra-se entre o limite de identificação e o limite de erro admissível no teste correspondente. De acordo com o invento emprega-se uma mistura de, pelo menos, dois anticorpos monoclonais. É também possível utilizar misturas de mais de duas espocles de anticorpos monoclonais. Â proporção quantitativa dos anticorpos monoclonais individuais, na mistura, depende da sua ati n idade e especificidade. Em geral, o anticorpo co m a reo;tívidade cruzada mais baixa constituirá a maior parte. A -'repor·'·:: dos anticorpos Individuais é escolhida de acordo com as •:ir;u-'ictãncias. De preferência, uti 11za-se uma mistura de dois ·: i i corpos com uma proporção entre 0,1 e 10:1.

Devido ao facto de se misturarem pelo menos dois anticorpos, uo rom reacçoes secundárias perturbadoras, em relação a r rsípcstos diferentes, a reactividade cruzada é, globalmente, mais baixa . Esta descida ultrapassa, em geral, um efeito de diluição, de modo a verificar-se aparentemente um aumento sinérgico da a c ç a o - 0 processo de acordo com o invento torna possível utilizar anticorpos monoclonais não ideais no que diz respeito è foreci+ieldade. Â seleccão de tais anticorpos, só parcialmente apr :priados ao ensaio, apresenta menos riscos, e é, portanto, mais económico e mais rápido. É possível por â disposição do temas ae ensaio suficientemente específicos pela utilização d® \:mn mistura de dois ou mais anticorpos monoclonais, dos quais um, ror si só, não é apropriado para o ensaio, porque, pela mie '.ura de vários anticorpos com uma reactividade cruzada Λ i v:m.rÍ..a, e oossive'1 pôr à disposição um sistema que, responde

7 1 5 6 ΰ 7 U 7 / 0 Ο / Ρ 7 9 í"*be-lmente ôs exigências. 0 Invente· é ilustrado pelas figuras e exemplos seguintes. t í a u r a r ·, oura A f 'i g u r a 4 mostra um gráfico com reactividades cruzadas (normalizadas) obtidas para misturas diferentes dos dois anticorpos, 19.6.9 e 1.26.18; mostra um gráfico com rsactlvidades cruzadas íncrnia iizadas) obtidas para misturas diferentes dos deis anticorpos. IS.6.9 e 964,02; mostra um gráfico com reactividades cruzadas (norma11zadas) obtidas para misturas diferentes dos dois anticorpos, 8.15.1 e 700-03. mostra um gráfico com reactividades cruzadas (nornalizadas) obtidas para misturas diferentes dos dois anticorpos. 2.341.115 e 2.93.37. tomo as reactividades cruzadas com relevância clinica podem vr mu'Kv.: diferentes, por exemplo < 0,1% ou 20%, torna-se ma is d if ici · uma representação gráfica de valores indicados em cento vens. Para evitar este problema, a XP (reacti vi dade .v uzadal máxima, correspondente, de um anticorpo é equiparada, i v.··. í d,!fas 1 a 4_ a 1 (linha tracejada * XR norma 11 zada) .

1 ο I determinação de concentrações de esteróides em solução í r·r< n·; ίρι o de ensaio)

Pare determinação de esteróides num tampão ou em humores coro orai* (soro., plasma, urina etc.) utilizam-se ensaios enzi má ticos de acordo com o principio competitivo:;

Ma tepj. af s : ··· tubos de Luran sem revestimento - estreptavidlna *" a Ibum inõ de soro bovino (RSA) - -vnjçáo cie substrato; (100 mmol/l de tampão de fosfato-citrato a u m ρ H d e 4,4 -7 D υ

: · 3 ú υ /P T

3,2 mmol/1 de perborato d© sódio ÂBTS t (2 , 2 -3zino''di-[3-sti 1 o-benzo tiazolinsu1fonat©(6)] de diamónio) -- tampão de revestimento: 200 mmal/1 de tampão d® carbonato de sódio a um pH d® 9,6 - tampão de diluição: 50 mmol/Ί de tampão de fosfato de sódio a um pH de 6,8, e 0,3% de P$Â A biotinação dos ACh (-anticorpos monoclonais) realiza-se de d z zcm JACS 1 00 ( 1 973 ), 3585-3590 , com biotina, pe la transformação com biotina n-hidrcxisuccinimidica na proporção ’ Oeterm ínaçào._ com tubos revestidos de maneira directa

Oc tubos são incubados com uma preparação de solução de ant"í-.jnticorpos , purificada, (10 μ g/ml) num tampão de revestimento (carbonato/bicarbonato de sódio, 0,2 mol/i; com um pH de 9,6) à temperatura ambiente, durante uma hora. Dai resulta urna ligação espontânea deste anticorpo â parede dc tubo. Os tubos são a seguir pós-tratados com 50 mmol/1 tampão de fosfato e 0,3% de albumina durante 15 minutos, e lavados. Os anticorpos são adicionados ao tampão de diluição e incubados durante 60 minutes. Depois são adicionados 600 μ.1 da amostra (anal ito, substância de reactividade cruzada, etc,) e 500 ul de conjugado enzimâtioc· (esfrio! POD, actividade d® POD: 200 mU/ml e incubados durante 60 minutos, Para verificar a existência de reacção ,.r .j:;ada em relação a outro© esteróides, adicionam-se, â solução da amestra, quantidades diferentes do esteróide a examinar. Um aba ruam® -rç do sinal de medição através de outros esteróides índica una reaccào cruzada, cuja intensidade oode ser avaliada : a 1 a :· o m ::· a r anão com ® curva nornal izada com o anal ito moerlamente dito. Após uma outra lavagem, determina-se a -atividade da peroxldase, pela adição de solução de substrato, feendo sido realizada antes disso uma outra incubação (30 minutos) j. era a revelação do corante (1000 μΐ). A medição da coloração é rei ta através de um fotómetro, aos 422 nm.

/ ' :/60 .-. '· Πκ / 00 /0 ί --8 b '> Determinação por meio de.....tubos revestidos_com óst^eptavldlna

Os tubos são incubados com uma solução de estreptavidina no tampão de revestimento, durante 1 hora, á temperatura ambiente, e opoic tratados durante 15 minutos com 50 mmol/l tampão de (ocrato e 0,3 % de albumina, e lavados., ‘ ·· anticorpos são adicionados ao tampão de diluição # incubados durante 60 minutos. Depois são adicionados 600 μΐ da cós· !cia! ito, substância de reactividade cruzada etc,) e 500 ' de .;u jogado enzimático (estrio! POD, actividade de POD; 200 ί.'ϋ/ΐϊ e incubados durante 60 minutos. Para verificar a reacçã. ;ru::::ad3.. em relação a outros esteróides, adicionam-se à solução do aíMOcrç. quantidades diferente® do esteróide a examinar, Um aba ixamento do sinal de medição através de ou i:rcs esterõides cMca uma reacção cruzada, cuja intensidade pode ser avaliada l a comparação com a curva nornalizada com o analito or opr i amente dito. Após uma outra lavagem., determina-se a actividade da peroxidase, pela adição de solução de substrato. Lendo sido realizada antes disso uma outra incubação (30 minutos) *ara a revelação do corante (1000 μΐ) , A medição da coloração é ita através de um fotómetro, aos 422 nrn 5 X e m ρ 1 o 2

Oeterm in ação de reaeções cruzadas para misturas de r :: ·;. s tr 1 : Ί > ) x d .. 9 e AC M < es tr ί o 1 > ! , 2 o . 1 8 xxv.. jp-i CiS ; ~ con íugadc de ί£3 POD (o conjugado de E$ POD é produzido pela sxH-ejSo de estrio'!, através da posição 6, por hemisucoinato a e s te r1f i c a c ã o subsequente ecm succinlmida, o éster resultante é acoplado directamente è peroxidase) (actividade de POD 500 e 100 mU/ml) ACM<E3l19.6.9 fECACC 89082503) biotinado (100 ug/ml) ..... éCM rE3 > l .. 2:6 .. Ί 8 (ECACC 89082502) biotinado (1000 ug/ml)

Concentrações das substâncias de reactividade cruzada.

OS tr’ -i ;; 1 f ; : 0. 5 , 10 , 20, 40 ng/ml (no ensaio diluído 1:5.) -s:cesd1 o1 (£2) : 10, i 00 ng/ml es 'e-str el (£4) : 10, 100 ng/ml .:· -Õ.....£' ! 1 fato : 50, 100 n g ,/m 1 £5 -o -q ! uc cr ona to : 50, 100 ng/ml A determinação é realizada de acordo com o exemplo ifo.

Os resultados (figura 1) revelam que o ACM 19.6,9 tem fortes ' -acçoes cruzadas com esfradic-l e estetro! , enquanto que o AU i 1.26.13 as tem fortemente com estriol-3 sulfato e estr iol"3 yluccunato. Os anticorpos foram empregues em proporções de mistura diferentes,. Cem diferentes proporções de mistura alteram-se as reacçoes cruzadas respectivas, Resulta uma érea óptima e uma area d© preferência, ’ : ê i'n p 1 O 3 0 e t © r m i n a ç a o de rsacçoss cruzadas para misturas de óimeetr i c Ί: 1 9 .. 6.9 e ACPKestr iol >S84.02

Realiis-se a determinação de modo análogo à do exemplo ia. fu*'· ‘3 1. Oi c Produtor: IPL, Interpharm Laboratories Ltd. , Ness tlona '6i nj, Israel) tem fortes reaccoes cruzadas (de modo 0'.0 : Oo ) oD.lt) com E3-3 sulfato ® £3-3 glucoronato.

Tavvibém neste caso existe uma concentração de ACM em que a XR o nitidamente reduzida (ver a figura 2). £ e ffi ρ 1 c 4 0 e t ® rmi n a ea o das rsacções cruzadas para mIsturas de A0H--, festosterona>S . 15. Ί e ACM<testosterona 5700-03

Hat©riais: tubos de Lursn sem revestimento anticorpos noUclonais de carneiro (Ig6) contra Fc tf de rato í tu ug/mU para o revestimento dos tubos) crsteyna 0 tcnjuqado de POO de testosterona (o conjugado de P00 de

- I 0-- testosterona -2 produzido pela activaçao cie testcsterona tr><2s c!a Doíiçêo 3 , por meio de carboximeti loxima e a -a.'s f ícaeão com suec i ni mi da - 0 éster resultante á acoplado -·-frectamente à P00 (actividad© de POD* 100 mU/ml ) i . ’ , ' ·---. L. ’ . ! . i 1 a-andrc-steno-âi 7-dlona ™ androstenodiana • i - c e t o -1 e s t o s t e r o n a áCH·· fcestos terona>3 .15,1 (ECACC 39082501) AC m 2 tos tos ter on a > 7 0 0 ~ 0 3 (Produtor : Hedix Biotech Inc. , F ;ríter City, CA 94404, Estados Unidos; número para en íomenda : T-7 00· -03} Ccn :entraçõe® O; 1 c OO0 : das substâncias de rea ctividade c r u 2 a d a rrctcctví* 003 : 0 , 1,25, 2,5, 5, 10, 20, 40 nçj/ml o . ·..·..·· caion·.· . ς s > ~ Λ V·1 :v \J 5 10, 20, 40. 80, 160, 820, 640 n g / m 1 ' : -oeto-cestos terona :2,5, 5, 10, 20, 40, 80, 160, 320, 640 n g / m 1 dfe...; n a a.....se a de ter m Inação de modo análogo è do exemplo la. :-;,ceu 1 ta d o ("'s ACM 3.15.1 ® ACM 700-03 são anticorpos espec i A1 oos corre.* a testcsterona, apresentando, no entanto. XP reiailvamenie elevadas em relação à androstenodiona e à 11-ceto-testcsterona, respeotivamente.

Os anticorpos não acoplados foram empregues com proporções de mistura diferentes (comparar a figura 3). Â Xft cl a mistura de ACM contra a testcsterona pode ser íníiuene *ada pela forma da mistura, sendo possível encontrar urna xdítuna com uma proporção tal que todas as reacções cruzadas se > - >n trem abaixo dos valores esperados (figura 3). t 2 ,'t; O 1 O 5 neee-'mi na ;ao das raacçòes cruzadas para misturas de o1 rc. i ctã'" w”i ta 1 >2 - 34 ! . Ί i 5 c ACM- fenobarbital >2.93.37 11- c ο 1' ; ;J r: /ij ’< / j·' i Hâtsriaís: tubos da Luran sem revestimento

anticorpo policlonal de carneiro (IgG) contra Fcy de rato (10 ug/mlí par® o revestimento dos tubos) croteina C conjugado de POD de fenobarbita 1 (o conjugado de POD de fenobarbita 1 é produzido pela activação de fenobarbita 1 através do N n® posição 1, por meio de butirato e a esterificação com succinimida♦ 0 éster resiiltante é acoplado directamente à POD (actividade de POD: 100 mU/ml) fenobarbital secobarbital amobarbital pentobarbital cnííiidona ~ ACN<fenobarb1tal>2.341.115 (ECACC 90071903) ÃCM<fenobarbita1>2.93.37 (ECACC 90071904) 0 o n c e n t r a ç o e s d a s s u bstâncias de react i v i d ® d e c r u z a c! a , empregues: fenobarbital : 0, 7 ,8 , 15,6 secobarbital : 0,2, 1 ug/ml amobarbita 1 : 0,2, 1 l„ig /"m 1 pentobarbital : 0,2, 1 Ug/ml primidona : 1,5 f-ig/ml 125 ng/ml

Peaiiza~se a determinação de modo análogo è do exemplo la.

Kesu liado:

Os ACM 2.341.115 e ACM 2.93.,37 são anticorpos específicos contra fenobarbital, apresentando, no entanto» reacções cruzadas re·ativamente elevadas em relação â primidona (ACM 2,341.,115) per um fado., e à secobarbital, amobarbital» e pentobarbital (ACM 2.93.3?)-, por outro lado.

Os anticorpos são empregues com proporções de mistura diferentes (comparar a figura 4).

™Ί Ζ~ A reaeçao cruzada da mistura de ACM contra fenobarbital pede ser in Γ luenciada pela mistura, sendo possível encontra1- uma mistura cem uma proporção tal que todas as reações cruzadas se encontrem abaixo dos valores esperados (figura 4) .

Claims (1)

1. R......Ε.......I.......V.......I.......Ν......D........I.......Ç.......Α......C.......ο......Ε......S li, - Processo para & identificação imunológica de analitos moh·;.·/..?. 1 entes pela concorrência do analito a determinar ccm uma cuantidade conhecida da analito marcado, ou imobilizado, pelo o i t-o da ligação a um rsceptor para o analito, earacteripado por 'ío misturar., pelo menos, dois anticorpos monoclonais capazes de e 1'içarem de maneira especifica ao analito, os quais têm uma ! ct .'v idade cvujzada diferente, para uti l ização como recepior. do, - i'Tocssso de acordo com a reivindicação ! , caract.erirado por os dois anticorpos monoclonais serem misturados ruiiia proocroàc de 0,1 a 10:1. dê, - Processo de acordo com as rei vi nd i caçoes 1 ou 2, c 31* a c t e i ” i z a d por os anti corpos monoclonais aprese n tare m reactividade cruzada com uma ou várias substâncias, reaciividade c;ue se encontra no domínio entre o valor limite de identificação e o triplo do limite admissível na identificação respectiva. a, 31. í$a 1590 Por B0EHRIN8ER MANNHEIM 6mbH - 0 AGEMTE OFICIAL -