PT95193A - Metodo para actividade da proteina c - Google Patents

Description

~2~ Ο presente invento fornece um novo método para activação da proteína C. 0 método fornece um meio simples e eficiente para a conversão da proteína C a partir da forma zimogénio na proteína C activada. Os métodos anteriores da arte para a activa-cão da proteína C envolvem o tratamento da forma zimogénio inactiva da proteína C com altos niveis de trombina em solução, ou trombina em conjunto com trombomodulina, ou outras enzimas caras para activação. 0 presente invento fornece um método para activacão da proteína C usando trombina imobilizada, evitando assim a necessidade de trombomodulina e originando uma molécula activada de vitamina C a qual pode ser facilmente purificada retirando o complexo de trombina C imobilizada. 0 Papel da Proteína C na Regulação da Coagulação Sanguínea A proteína C, uma vitamina K dependente da proteína do plasma, é de importância fisiológica fundamental no controlo da hemostase. A proteína C é sintetizada na forma de uma molécula inativa, aqui chamada proteiuna C nascente. A proteina C nascente sofre é submetida a um processo complexo, dando origem a um número de moléculas inactivas diferentes como é mais completamente descrito a seguir. As formas inactivas, segregadas de proteina C são aqui referidas como o zimogénio proteina C. A activacão da proteina C ocorre no sangue por reacção envolvendo um complexo trombomodulin-trombina. A proteina C activada, em conjunto com o seu co-factor de proteina S, é um anti-coagulante se importante significado fisiológico. A proteina C activada pode evitar a trombose intravascular e controlar a extensão dos coágulos existentes. 0 mecanismo da accão da forma de proteina C activada e o mecanismo de activação de zimogénio inactivo na protease activa tem sido clarificado em anos recentes Cpara revisão, ver -3- J. E. 6ardiner and J. H. Griffin, Progress in Hematology, Vol. XIII, pp. 265-278, ed. Elmer B. Brown, Qrune and Stratton, Inc., 1983). A activação da proteína C envolve trombina, a protease serina final na cascata de coagulação, e uma membrana endotelial celular associada com a glicoproteina chamada trombomodulina. A trombomodulina forma um complexo estequi©métrico apertado com a trombina. A trombomodulina, quando complexada com trombina, muda totalmente as propiedades as propriedades funcionais da trombina. A trombina coagula normalmente o fibrinogénio, activa as plaquetas, e converte os cofactores de coagulação V e VIII nas suas formas activadas, Va e VIIIa. Finalmente, a trombina açtiva a proteína C, mas só muito lentamente e ineficientemente. Em contraste, a trombina complexada com trombomodulina não coagula o fibrinogénio, activa as plaquetas, ou converte os factores de coagulação V e VIII nas suas contra partes activadas Va e VIIIa, mas não se torna um activador muito eficiente da proteína C. A constante de velocidade para activaçSo da proteína C por trombo— modulina-trombina é maior do que 1.000 vezes a constante de velocidade para a trombina sôzinha.

Para compreender como é que a proteína C activada desregula para baixo a coagulação do sangue, fornece-se uma breve descrição seguinte do sistema da enzima de coagulação. 0 sistema de coagulação é mais bem examinado como uma cadeia de reacção envolvendo a activação sequencial dos zimogênios nas proteases com serina activa. Esta reacção em cadeia produz eventualmente a enzima trombina, a qual através da proteólise limitada converte o fibrinogénio do plasma em gel fibrina insolúvel. Dois acontecimentos chave na cascata de coagulação são são a conversão do factor de coagulação X em Xa pelo factor IXa e a conversão da protrombina em trombina pelo factor de coagulação Xa. Ambas estas reacçdes ocorrem nas superfícies das células, mais provavelmente na superfície das plaquetas, e ambas as reacçfíes precisam de cofactores. Os cofsetores principais, factores V e VIΠ, no sistema circulam como precursores relativamente inactivos, mas quando as primeiras poucas moléculas de trombina são formadas, regressam os anéis de trombina e activam os cofactores através de proteólise limitada. Os cofactores activados, Va e VHIa, aeela-ram ambos a conversão da protrombina em trombina e também a conversão do factor X no factor Xa em aproximadamevtte cinco ordens de grandeza. A proteina C activada actua de preferencia, para degragar proteoliticamente, hidrolizar, e desrtuir irreversivelmente os cofactores de coagulação Va e VlIIa, as formas activadas dos factores de coagulação inactivos V e VIII. Em contraste, os factores de coagulação V e VIII, são substratos muito pobres para activarem a proteina C.

Um cofactor importante para activar a proteina C é a proteina S, outra vitamina K dependente da proteina do plasma. A proteina 8 aumenta substancialmente a hidrólise dos factores Va e VlIIa mediada por proteina C activada, em 25 vezes.

Proteina C como Agente Terapêutico A proteina C é reconhecida como um agente terapêutico valioso (ver, por exemplo, a Publicação da Patente Europeia No. 021S54S e a Patente U. S. No. 4.775.624, aqui incorporada para referencia). A proteina C activada é um novo agente antitrombô-tico com um indice terapêutico mais amplo do que os anticoagulan-tes disponíveis, tal como heparina e antieoaguiantes tipo hidro-xicouramina oral. Nem o zimogénio proteina C nem a proteina C activada é eficaz até se gerar a trombina, porque a trombina é necessária para converter os factores de coagulação V em Va e VIII em VIIlaj as formas activadas destes dois cofactores são o -5— substrato preferido para a proteína C activada. A trombina é também necessária para activar o zimogénio proteína C, porque sem o complexo trombomodulina-trombina, o zimogénio proteína C não é convertido na sua estrutura activa. A proteína C activada é um anti—coagulsnte com procura, porque a proteína C activada trabalha por inactivacã© dos cofsetores Va e VlIIa. Porque a trombina é necessária para convertes os factores V e VIII nas suas estruturas activadas Va e VlIIa, a proteína C actua somente como anticoagulante apôs se ter gerado a trombina. Os anticoagulantes convencionais, em contraste com a proteína C activada, mantém um estado anticoagulante constante através da circulação durante todo o tempo em que forem aplicados ao doente, aumentando assim substancialmente o risco de complicações de sangria em relação à proteína C ou á proteína C activada. A proteína C activada é portanto um anticoagulante com procura de ampla utilidade clinica para uso como alternativo à heparina e às h i drox i c oumar i nas.

Nalguns estados de doença, tal como deficiência hereditária de proteína C, o zimogénio proteína C é de grande importância terapêutica. Na deficiência congénita de proteína C homozigó-tica, os indivíduos afectados morem na infancia inicila de purpura fulminans, uma forma letal vulgar de coagulação intravascular disseminada. Na deficiência de proteína C heterozigótica, os indivíduos afectados sofrem de episodos severos, trombeembôii-cos repetidos. Está bem estabelecido cUnicamente que os concentrados de proteína do plasma projectados para tratar a hemofilia B ou a deficiência do factor IX, os quais contem a proteína C na forma de impureza, são eficazes na prevenção e tratamento d* coagulação intravascular em deficiência de proteína C heterozigá-tica. Os niveis de proteína C tem também sido observado como sendo anormalmente baixos nos estados trombóticos tal como -6- coagulaçáo intravascular disseminada e em estados de doença que predispfíem á trombose, tal como trauma principal, cirurgia principal e cancro.

Embora as formas zimogénio de proteína C sejam muito úteis para fins teraeuticos, alguns estados de doença podem ser tratados muito mais efectivamente por entrega da forma activada de proteina C ao doente. Por exemplo, em estados de doença tal como enfarte de miocárdio ou trombose profunda das veias (em especial tal como ocorre apôs cirurgia nas extremidades inferiores), os doentes tem niveis normais de zimogénio proteina C aida sem proteina C activada suficiente para evitar a geração de trombi ou para suportar a remoção do trombi existente. A incapacidade para gerar quantidades suficientes de proteina C activada pode ser proveniente de niveis indequados de trombomodulina, mas, seja qual for a causa, o tratamento efect-iv© dos estados de doença exige a admnistraçáo de proteina C activada e não do zimogénio. 0 presente invento fornece um novo método para activa-çKo da proteina C usando trombina imobilizada, em vez de um complexo trombina/trombomodulina.

A Sintese e Activacáo da Proteina Humana C A proteina nascente C pode ser representada esquemáticamente, como se mostra a seguir. |1 42]43 197I198 199i200 211|212 461

|pre-pro | LC | KR | AP | AHC <-HC-> pre-pro resíduos amino ácidos 1-42 de proteina C humana -7- nascente codificando a proteína C Humana e o sinal peptideo e propeptideo da proteína C humana, importante para dirigir a secreção e r-carboxilação da proteína C. LC - resíduos amino ácidos 43—197 de proteína nascente C, uma vez pos-transiacionaimente modificada, constituem a cadeia leve (LO de ambos os zimogénios de duas cadeias (formado a partir do zimogénio de uma cadeia por remoção do dipeptideo KR, como a seguir discutido) e formas activadas de proteína C. KR - resíduos amino ácidos 198-199 de proteína humana nascente Cj estes resíduos acredita-se serem removidos (com base na homologia com proteína C do boi), provavelmente num processo de duas etapas compreendendo uma primeira clivagem (quer entre os resíduos 197-198 ou 199-200) seguido por acção de carboxipeptidase ou aminopeptidase, para formar a proteína C de cadeia dupla.

AP - resíduos amino ácidos 200-211 de proteína nascente C constituem o peptideo de activação, o qual é removido das formas zimogénio da proteína C para obter a proteína C activada. AHC - resíduos amino ácidos 212-461 de proteína nascente C, uma vez pos-translacionalmente modificados, constituem a cadeia pesada activada (AHC) da proteína C activada. HC - a cadeia pesada das duas cadeias forma o zimogénio proteína C, uma vez pos-translacionalmente modificado, o qual constitue os resíduos amino ácidos 200-461, o AP e o AHC.

0 zimogénio proteína C humana é um precursor protease serina sintetizado no figado e presente no sangue. Para expressão da actividade biológica completa, a proteína C precisa de modificações pôs--transi aciona is para as quais é necessária a vitamina K. 0 zimogénio proteina C, maduro, de cadeia dupla, ligado ao dissulfureto, provem de um precursor de cadeia única por proteo-lise limitada. Esta proteolise limitada acredita-se incluir a clivagem e a remoção de um pre-pro peptideo formado por resíduos amino ácido 1-42 durante o processamento intracelular e a secreção do polipept-ideo nascente da célula e a remoção dos resíduos amino ácidos 198 e 199 para formar as duas cadeias observadas no zimogénio. A activação do zimogénio na pot-ease serina activa envolve a clivagem proteolítica de uma ligação peptidea ARG-LEU (resíduos 211 e 212). Esta última clivagem liberta um dodecapep-tideo (resíduos 200-2111 que constitui o amino-terminus da cadeia maior (pesada) da molécula zimogénio de cadeia dupla. A proteina C é significantemente glicolisadaj a enzima madura contem -"23% de carbohidrato. A proteina C também contem um número de amino ácidos não usuais, incluindo o ácido Γ-carboxiglutamico e ácido β-hidroxiaspârtico (eritro-L-B-hidroxi aspartato). 0 ácido Π-carboxiglutamico (gla) é produzido por Γ-glutamil carboxilaçã© a partir de resíduos de ácido glutamico com a ajuda de uma carboxilase microsomal hepática a qual precisa de vitamina K como um cofact-or. A activação da proteina C humana pode também ser esquematicamente representada e é represenatada a seguir. Os especialistas da arte reconhecem que a ordem das etapas apresentadas no esquema não refectem necessariamente o caminho in vivo.

P re-p ro-LC-KR-AP-AHC proteína nascente C modificação post-translacionai, i. e., Γ-carboxilaçáo dos resíduos específicos de ácido glutamico, β-hidroxilaçSo de um resíduo de ácido aspártico, e glicosilação secreção, a remoção dos resíduos 1-42, os quais podem envolver mais do que uma clivagem proteo1iti ca LC-KR-AP-AHC zimogénio de cadeia única remoção dos resíduos 198-193, cerca de SQ% do zimogénio proteina C observado no sangue humano está na forma de cadeia dupla <8-8® ligaçSo dissulfureto)

LC zimogénio de cadeia dupla

AHC-AP activaçSo por t r omb i na-1 rombomodu1i na -ΙΟ

LC S-S proteína C act-ivada

AHC 0 presente invento fornece um novo método para a activacSo do zimogénio proteína C usando trombina imobilizada.

Para os fins do presente invento, como divulgado e aqui reivindicado, os termos seguintes são definidos a seguir.

Os resíduos amino ácidos em proteínas ou Peptideos aqui descritos sSo abreviados como se segue!

Abreviatura de ires letras

Residuo Amimo Ác ido

Abreviatura de uma letra PHE Fenilalanina f LEU Leucina L ILE Isoleucina Z MET Metionina M VAL Vaiina V SER Se ri na »“· PRO Prolina P THR Treonina T ALA Alanina A TYR Tirosina Y HIS Histidina H GLN Glutamina <3 ASN Asparagina N LYS Lisina K ASP Acido Aspart-ico D GLU Ácido Glutamico E CYS Cisteina C TRP Triptofan w ARG Arginina R GLY Glicina Θ

Enh ou amplificador - o amplificador do virus BK. P-carboxilaçáo - uma reacçáo que adiciona um grupo carboxilico aos ácidos glutamicos no carbono Γ. proteína r-carboxilada - uma proteína na qual alguns resíduos de ácidos glutamicos sofreram r-carboxilaçSo. -1

Proteína nascente - o polipeptideo produzido apôs translação de um transcrito rnRNA, antes de quaisquer modificações pós-translacionais. No entanto* as modificações transiacionais tal como a Γ-carboxilação dos resíduos de ácido glutamico e hidroxilação dos resíduos de ácido aspártico podem ocorrer antes de uma proteína estar completamente transladado de uma cópia mRNA.

Actividade da proteína C - qualquer propriedade da proteína humana responsável pelas actividades proteoiiticas, amidoliticas, estereoliticas, e biológicas Canticoagulante ou profibrinoliticas). Os métodos para o teste da actividade da proteína anticoagulante são bem conhecidos na arte, i.e., ver Qrinnell et al., 1987, Bioteehnology 5:1189.

Zimogénio - um precursor enzimáticamente inactivo de uma enzima proteolitiea. Zimogénio proteína C, conforme aqui usado, refere-se a formas inaetivas, segregadas, com uma cadeia ou duas cadeias, de proteína C. 0 presente invento fornece um novo método para activa-ção da proteína C, compreendendo o referido método as etapas de: a> contacto da proteína C inactiva com a trombina imobilizada, e b) purificação da proteína C activada de modo a ficar livre de trombina imobilizada e outros contaminantes.

Embora tenham sido descritos vários métodos para a produção de zimogénio proteína C inactivada e proteína C humana nascente inactivada Cver a publicação da Patente Europeia 215548 —. 1 Ο e a Patente U. S. No. 4.775.624, cujas técnicas são aqui incorporadas para referencia), as divulgações não fornecem métodos para a activação da proteína C usando trombina imobilizada. Em vez disso, os zimogénios proteína C produzidos até agora foram tratados com substancias tal como oc-trombina em solução, trip-sina, factor activador X de veneno de víbora de Russell, ou uma mistura de trombina e irombomodulina para obtermos a proteína C activada. Todos estes métodos de activação introduzem ineficiência, risco de contaminação, e custos mais altos para a produção recombinante de proteína C humana activada. Algumas das reacedes de activação devem ser vigiadas de perto de modo que a proteólise para após a clivagem proteolitica do peptideo de activação— de outro modo, a proteína C activada produzida é clivada e tornada inactiva. Além disso, a «-trombina tende a auto-digerir-se quando mantida em solução, necessitando portanto de uma adição continua de «-trombina à mistura reagente. 0 presente método de activacão da proteina C usando proteína imobilizada remove o problema da auto-digestão da trombina, bem como a necessidade de trombomodu-lina. 0 método do presente invento pode ser usado não somente para a activação dos zimogénios de proteina C humana formados por tecnologia DNA recombinante, mas também para activação da proteina C humana de ocorrência natural isolada do plasma do sangue. Kisiel, W., 1973, J. Clin. Invest. 64;761-763, cujos ensinamentos são aqui incorporados para referencia, divulga um tal método para o isolamento da proteina C do plasma. Além disso, o método do presente invento pode também ser usado para os derivados de proteina C activada, tal como os descritos por Bang et al., European Patent Publication No. EP-0-323 149. As moléculas de proteina C humana recombinante, as quais compreendem novas configurações de glicosilação, podem também ser activadas usando o novo método de trombina imobilizada do presente invento. -14-

Em geral, o método do presente invento é praticado por imobilização da trombina a qualquer suporte resina. 0 tipo de trombina usado é dependente de um número de factores, e mais particularmente do custo e segurança. A trombina de boi é em geral a preferida porque é menos provável de ser contaminada com o virus humano, embora a trombina do homem, cavalo, rato ou ratazana seja também comercialmente disponível. Várias classes de trombina, tal como «-trombina, β-trombina e 6-trombina são também disponíveis e são úteis no presente invento, embora a «-trombina seja a preferida.

Podemos usar muitos tipos diferentes de suportes sólidos para imobilizar a trombina usada para activar a proteína C, embora a sefarose e a agarose sejam os preferidos. Um suporte com afinidade para a agarose com esteres N-hidroxisuccinimida <NHS> como reagentes de ligação cruzada é o mais preferido. A trombina contem residuos de lisina, cujo grupo epsilon amino esté ligado à coluna num tampão não amino tal como HEPES. © tampão HEPES é fabricado com um pH de cerca de 7,6 de modo a manter a estabilidade da trombina e de tal modo que os residuos de lisina se tornam suficientemente desprotonados. 0 átomo de carbono encontrado no ester sofre o ataque nucleofilico pela lisina desprotonada, permitindo assim a substituição do ester com o residuo lisina sobre a trombina. Esta reacção é muito suave e a trombina permanece estável.

Logo que a trombina esteja ligada ao suporte, a trombina imobilizada pode ser equilibrada com o tampão apropriado e a proteína C pode ser adicionada para activação. A trombina imobilizada pode ser contactada com a proteína C numa reacção descontinua, ou a proteína C pode ser passada através de uma coluna contendo a trombina imobilizada. A proteína C pode ser passada através de uma coluna longa ou recirculada através de uma coluna curta e ensaiada para activação em qualquer ponto dado no esquema reaccional. 0 método da trombina imobilizadac é mais eficiente do que o método anterior da trombina solúvel, porque a trombina imobilizada não se degrada tão prontamente como a trombina em solução. As colunas de trombina imobilizada são reusáveis, tanatas vezes quantas quinze cargas. 0 método da trombina imobi-lizada é mais eficiente do que o método anterior da trombina imobilizada/trombomodulina porque a trombomodulina usada no método trombina/trombomodulina não estã covaientemente ligada ao suporte imobilizado e tende a contaminar o eluido finai da proteína C activada. Tal combinação cruzada não é significante (menos do que uma parte por milhão) quando usamos só trombina imobilizada. A actividade da proteína C activada pode ser vigiada por uma variedade de métodos, embora o mais comum seja o ensaio de coagulação de uma etapa do factor Xa ou o ensaio de coagulação Activated Partial fhromboplastin (APTf), ambos os quais são descritos por ârinnell et al. , Í9.97, Biotechnology 5:1199-1192. o ensinamento total dos quais é aqui incorporado para referencia. Os métodos de activação são também divulgados in Bang et al., U. S. Patent No. 4.775.624, de 4 de Outubro de Í998, cujos ensinamentos totais são aqui incorporados para referencia. A primeira etapa na prática do método do presente invento é a dissolução de cerca de 50 mg de «-trombina de boi em cerca de 25 ml de tampão HEPES 50 mM, pH 7,6. Uma garrafa de 25 ml com pérolas Affi-Sel-10 é a seguir lavada com cerca de 500 ml de água altamente purificada, muito fria. Apôs drenagem do excesso de água das pérolas, as pérolas molhadas são adicionadas à solução de trombina e suavemente misturadas durante uma ou duas horas num meio rotativo a 4°C. Para bloquear os sitios que não

TM reagiram sobre a resina Affi-Sel-10 , juntamos 100 «1 de glicina -16-

1 li, pH 8,0, à solução e a rotação continuou durante mais uma a dezasseis horas a 4°C.

As pérolas de trombina <pérolas T) slo separadas em dois tubos de 50 ml de poliestireno estéril e centrifugadas a meia velocidade ou menos durante 30 a 60 segundos. Os tubos são colocados em gelo e deixamos assentar as pérolas T durante um a dois minutos, e a seguir as partes sobrenadantes são removidas e rejeitadas. Este processo de lavagem ê repetido 10 a 15 vezes, e a seguir a Actividade Amidolitica da ultima parte sobrenadante é verificada para detectar a trombina não ligada ou lexiviada. Se a variação da densidade óptica a 405 nm for menor do que 0,002/mi-nuto, então as pérolas T estão prontas para serem usadas. Se o 00 for muito elevado, o processo de lavagem deve ser repetido até obtermos o nivel próprio.

Logo que as partes sobrenadantes apresentem o nivel próprio de pureza, preparamos uma suspensão a 25% de pérolas T por adição de 3 ml de tampão de lavagem 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 200 mM NaCl por mililitro de pérolas T centrifugadas. As pérolas T podem ser armazenadas durante um período de tempo prolongado, se mantidas estéreis a 4Λ£ no tampão de lavagem. A suspensão de pérolas T é testada para a sua capacidade em activar a proteína C através de um ensaio de activação num tubo microcentrifugador de 1,5 ml de polipropileno a 37°C durante 2a 3 horas. A actividade funcional da proteína C pode ser ensaiada por ambos os processos amidoliticos 8-2238 e o processo de actividade anticoagulante divulgado por <âr innel1 et al., 1987, Biotechnology 5;1189-1192. 0 tubo microcentrifugador contendo a trombina proteína C imobilizada deixa-se rodar durante um intervalo de 30 a 60 minutos até a actividade funcional da proteina C atingir um patamar. 17- 0 invento é adicionalmente ilustrado pelos exemplos seguintes.

Exemplo 1

Imobi 1 izacão de «--trombina do boi

Uma garrafa (aproximadamente 50 mg) sem pirogénio, dissolvemos a trombina de boi (vendida por liiles Laboratories,

Inc., 1121 Myrtle, Box 2000, Elkhart, Indiana 46515 ou ICN

Pharmaceuticals, Inc., 26201 Miles Road, Cleveland, Ohio, 44128) em 25 ml de tampão HEPE8 50 mil, pH 7,6. Uma garrafa de 25 ml de

TM pérolas Affi-Sel-10 (Bio-Rad Laboratories, P. 0. Box 708, 220

Maple Avenue, Rockville Centre, New York 11571) foi lavada num funil de vidro cozido de 150 ml com cerca de 300 a 500 ml de água altamente purificada, muito fria. As pérolas foram voltadas a empapar após cada adição de água e foram de novo deixadas secar. As pérolas são muito frágeis e são facilmente desfeitas. A solução de trombina foi transferida para um tubo centrífugo estéril de 50 ml e juntamos as pérolas lavadas. 0 tubo

foi tapado e os conteúdos suavemente misturados por rotação a 4°C durante 1 a 2 horas num aparelho de mistura rotativo. A seguir, juntamos 100 jul de solução de glicina 1 M, pH 8,0, para bloquear ΓΜ os locais que não reagiram sobre a resina Affi-Gel-10 . Tapamos de novo o tubo e rodamos entre uma a dezasseis horas a 4°C. As pérolas de trombina (pérolas T) foram a seguir divididas entre dois tubos separados de poliestireno de 50 ml, os quais foram colocados num banho de gelo para arrefecimento adicionai. Os tubos foram centrifugados a metade ou menos da velecidade durante 60 segundos numa Centrifugadora Clinica modelo bancada de topo (cerca de 1000-2000 rpm). Os tubos foram cuidadosamente transferidos para um banho de gelo e deixamos ocorrer a sedimentação durante mais um a dois minutos. A parte sobrenadante foi a seguir removida de cada tubo com uma pipeta estéril, libertando 12,5 ml de pérolas T em cada tubo.

Juntamos aproximadamente 35 ml do Tampão de Lavagem das pérolas T <20 mM Tris-HCl <pH 7,4), 200 mM NaCl) a cada tubo, sendo os tubos apertadamente tapados e suavemente invertidos à mão até as pérolas t serem de novo suspensas. Os tubos foram centrifugados durante 60 segundos a meia velocidade, e a seguir colocamo-los num banho de gelo durante um a dois minutos antes das partes sobrenadantes serem retiradas com uma pipeta estéril. Este processo de lavagem foi repetido aproximadamente 10 a 15 vezes para remover as endotoxinas contaminantes, glicina e trombina. A parte sobrenadante foi a seguir verificada usando o Ensaio Amidolitico S-2238. Dissolvemos uma garrafa <25 mg) dos Laboratories Helena com o substrato S-2238 em 18 ml de Tris-HCl 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4 o qual foi esterilmente filtrado através de um filtro Acrodisc de 0,2 mm. Produzimos a seguir um Tampão de Diluição o qual é composto de Tris-HCl 20 mM CpH 7,4), 150 mM NaCl, 3 mM CaC^ © 1 mg/ml de Albumina de Soro de Boi (ASB). Para verificar as pérolas T em relação à lixiviação da trombina, efectuamos o protocolo seguinte. Numa microcuveta rejeitável, misturamos 100 μΐ das pérolas T sobrenadantes misturadas com 600 al de Tampão de Diluição e 300 jul da solução Substrato S-2238. A cuveta é coberta com um filme de parafina e a seguir invertida para misturar. Lemos a densidade ôptica a 405 m» durante 4 minutos. Se o /\0.D./minuto for 0,002 ou menos, as pérolas em T são suficientemente limpas. Se o /\0.D./minuto for maior do que 0,002, então o protocolo de lavagem deve ser -19- repetid© até as pérolas R estarem suficientemente livres de trombina lixiviada.

Uma vez as pérolas T limpas, usamos as graduaçdes laterais do tubo centrífugo para medir o volume relativo das pérolas T. Juntamos então tres volumes do Tampão de Lavagem das pérolas T para efectuar a diluição de í para 4 ¢25¾). As pérolas T podem ser armazenadas e mantidas a 4°C durante um periodo de tempo prolongado nesta solução, se mantidas estéreis.

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J

Para testar a capacidade das pérolas T para activar a proteína C, transferimos 400 jul das pérolas T resuspensas para um tubo microcentrifugador de polipropileno de 1,5 ml, centrifugamos a meia velocidade durante 60 segundos, e a seguir a parte sobre-nadante foi cuidadosamente removida. Juntamos uma amostra de -500 jul de proteína C humana recombinante não activada de alta qualidade <1 mg/ml) às pérolas T juntamente com 10 jul de EDTA 0,2 J1 pH 7,4 (para remover o Cálcio). 0 tubo foi tapado, suavemente invertido várias vezes e a seguir centrifugado como antes. Uma amostra de 100 jul foi removida da parte sobrenadante e misturada com 900 jul de Tampão de Diluição das pérolas T, e a seguir lemos ο Ο.Ο.^,ρ,φ nm para assegurar que a amostra era 1 mg/ml em Proteina Humana C recombinante < rHPC). 0 tubo de reacção foi de novo tapado e suavemente rodado a 37°C durante 2 a 4 horas. Ao fim de 30 minutos, 1 hora, 2 horas e 4 horas, o tubo foi centrifugado e removemos uma amostra de Í0 /jí . Esta amostra de 10 }A foi diluida para obtermos uma concentração final de 10 wg/ml rHPC. Esta amostra diluida em 50 jul foi então adicionada a 650 jul de Tampão de Diluição do Ensaio de Actividade e SOO ;ul do substrato S—2238, e a seguir misturamos suavemente por inversão. 0 Q.D.^g foi lido durante 4 -20- minutos. Qualquer mudança no 0.0. maior do que 0,1/minuto indica que o rHPC está completamente activo.

Exemplo 2 Activacão de rHPC 0 HPC recombinante foi preparado substancialmente de acordo com os ensinamentos de Bang et al., Patente U. S. No. 4.775.624 e Grinnell et al.. 1987, Biotecbnology 5!1189-1194.

Preparamos apropriadamente cem ml de resina Pharmacia Fast Flow Q (FFQ) como recomendado pelo fabricante. A resina FFQ foi a seguir equilibrada com uma solução tampão contendo Tris 20 mli, NaCl 0,15 M, EDTA 2 mM, benzamidina 2 mM CpH 7,4). A EDTA e a benzamidina foram adicionadas ás partes sobrenadantes da cultura celular até um volume final de 4 mM e 5 mM respectivamente. 0 meio de cultura foi passado através de uma coluna FFQ <3 x 16 cm) com um caudal -1 linear de 20 cm.h . A coluna foi lavada primeiro com 300 ml (3 volumes de coluna) de uma solução contendo Tris 20 mM, NaCl 0,15 M, EDTA 2 mM, benzamidina 2 mM CpH 7,4), e a seguir 300 ml (3 volumes de coluna) de uma solução contendo Tris 20 mM, NaCl 0,15 M, CaCl.., 10 mM e benzamidina 2 mM CpH 7,4). Este segundo eluido foi a seguir concentrado usando processos clássicos de permutação aniónica. A solução purificada contendo rHPC foi filtrada através de filtros Acrodisc 0,2 ;jm estéreis para um recipiente de poli-propileno. A concentração de rHPC está numa gama de 1-10 mg/ml em Tris 20 mM, pH 7,4, NaCl 0,15 M, e na ausência de CaCl^. CTampão de Pre-Activação). As pérolas T produzidas no Exemplo 1 foram lavadas com Tampão de Lavagem de pérolas T, e a seguir centrifu-gadas e a parte sobrenadante foi rejeitada. Cerca de 5 a 7 ml de 21“ Pérolas T são suficientes para activar até 45 ml de rHPC purificado. 0 rHPC no Tampão de Pre-Activação foi adicionado até uma concentração final de 0,5 mM. 0 tubo foi tapado e rodado suavemente a 37°C. As partes aliquotas foram periodicamente removidas e a Actividade Amidolitica foi ensaiada em acordo substancial com o ensinado no Exemplo í. A proteína C tratada por este método foi observado ficar 100% activada dentro de 2 horas.

Os especialistas da arte reconhecerão, ou serão capazes de descobrir, usando só a experimentação rotineira, numerosos equivalentes das substancias especificas e processos aqui descritos. Tais equivalentes são considerados como estando dentro do âmbito deste invento, e são cobertos pelas Reivindicacôes seguintes .

J

Claims (1)

1. -22— Reivindicações ii - Método para activação da proteína C, caracterizado por compreender as etapas deí a) contacto da proteína C inactiva com trombina imobilizada, e b) purificação da proteína C act-ivada por retirada da trombina imobilizada e outros contaminantes. 2§ - Método de acordo com a Reivindicação 1 caracteri-zado pelo facto da trombina ser seleecionada entre o grupo formado por trombina de boi, trombina de cavalo, trombina humana, trombina de rato e trombina de ratazana. 3ã - Método de acordo com a Reivindicação í caracteri-zado pelo facto da trombina ser seleecionada entre o grupo formado por «-trombina, β-trombina e gama-trombina. 4â - Método de acordo com a Reivindicação 1 caracteri-zado pelo facto da trombina ser imobilizada sobre agarose. Sã - Método de acordo com a Reivindicação 1 caracteri-zado pelo facto da trombina ser imobilizada sobre sefarose. 6ã - Método de acordo com a Reivindicação 1 caracteri-zado pelo facto da proteína C ser seleecionada entre o grupo formado por proteína C de boi, proteína C humana e derivados de proteína C humana. 7ã - Método de acordo com a Reivindicação 6 caracteri-zado pelo facto da proteína C ser proteína G humana. 23' 8â - Método de acordo com a Reivindicação 2 caracteri-zado pelo facto da trombina ser «-trombina d© boi. 9® - Método de acordo com a Reivindicação 2 caracteri-zado pelo facto da a—tombina d© boi ser imobilizada sobre asaro-se. 10® — Método de acordo com a Reivindicação 9 earacteri-zado pelo facto da proteina C ser proteína C humana. Lisboa, 4 de Setembro de 1390

   J. PEREIRA DA CRUZ Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 10-A 3.a 1200 LISBOA