PT95596A

PT95596A - Processo para a preparacao de decapeptidos terapeuticos

Info

Publication number: PT95596A
Application number: PT95596A
Authority: PT
Inventors: David Howard Coy; Jacques-Pierre Moreau
Original assignee: Univ Tulane
Priority date: 1989-10-13
Filing date: 1990-10-15
Publication date: 1991-09-13
Also published as: GR900100752A; IE903671A1; EP0448687A4; EP0448687A1; ZA908179B; WO1991005563A1; US5003011A; CA2044137A1

Description

5 15.0171990., rjuL$ 15

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 20 62768

Ref: Biomeasure-LHRH Antagoniat II CIP k (00537/019006) AUTECELSITES M IHVEUÇAQ Esta invenção refere-se a peptidos terapêuticos Tem-se descrito um número grande de análogos de hormonas (LH-RH) de libertação de hormona com luteína que i nibem a libertação de LH-RH, uma hormona de peptido possuin do a fórmula pG-lu-His-Trp-Ser-Tyr-G-ly-Leu-Arg-Pro-Gly- UHg. Estes análogos chamam-se antagonistas de LH-RH. Por exemplo, Ooy et al., Patente Americana nS 4 431 635, aqui incorporada por referência, descreve análogos de LH-RH possuindo a fórmula geral X-R1-R2-R3-Ser-Tyr-R4-Leu-Arg-Pro-R5-NH0, em 14 ^ que X pode ser Ac} R e R , independentemente, podem ser D- 3 5 -Trp ou L-p-X-Phe} R pode ser D-Trp; e R pode ser Gly ou D-Ala. RESUMO M INVEUÇÍO Em geral, a invenção descreve um decapeptido da fórmula: N-Ac-A^-A^-A^-Ser^-A^-A^-A^ -A8-a9-A10, 12 3 25

em que A , A e A , independentemente, é D-β -Uai, D-p-X--Phe (em que X é halogéneo, H, HH0, H0o, OH ou alquilo C. por exemplo metilo, etilo ou n-propilo/j AJ ê p-X-Phe (em que X é halogéneo, H, BHg, U02, OH ou alquilo 0^^); A6 ê D-Lys, D-Arg, J3-Ual, D-p-Ual, L-Trp, D-p-X-Phe (em que X é halogéneo, H, HHg, 10^, ou alquilo °IJl D-Lys-€-UH-R (em que R é H, uma cadeia linear ou ramificada ou um grupo ciolo-alquilo C^O-^q, por exemplo metilo, etilo, isopropilo, heptilo, butilo ou ciclopentilo ou um gràp© arilo, por exem pio benzilo, ρ-01-benzilo ou 0H2-naftilo)} A^ é p-X-Phe (em que X ê halogéneo, H, UHg, U02, OH, ou alquilo G-^)» ciclo-hexil-alanina ou Trp} l A8 é Arg, Lys ou Lys-4-HH-R (em que R é H, uma cadeia linear ou ramificada, ou um grupo ciclo-alquilo C^O^q, por exemplo metilo, etilo, isopropilo, heptilo, butilo ou ciclopentilo ou um grupo arilo, por exem 35 1 1

62768

Re?;;} Biomeasure-LHRH Antagonist II CIP (OO537/OI9OO6) 5 10 15

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 20 pio, benzilo, p-Cl-benzilo ou CH^-naftilo)j A^ é Pr o; e A^ é D-Ala-SHr,? Grly-IJH,,, D-Ser ou D-Ser-IíH0i com a condição de, c *· o 3 ^ pelo menos, um de A A ou A ser D-Phe ou D-Tyr; e ainda 6 8 com a condição de, pelo menos, um de A e Â ser o seguinte: A^ ser D-Lys-e-IH-R (em que E é ura grupo ciclo-alquilo Q ΟχΟ^ο)» Α·Ό deve ser lys-e-NH-R (em que R é um grupo cielo--alquilo 0χ0χ0), ou um sal aceitável sob o ponto de vista farmacêutico. (β-Nal refere-se a β-naftilalaninaj quando nenhuma designação I»- ou D- for proporcionada aqui, pretende-se o isdmero L; E-Ac refere-se ao grupo protector K-ace-til, isto é um grupo acetilo ligado ao resíduo de aminoáci-do terminal no azoto da aminai halogéneo refere-se a fláor, cloro ou bromo). Os decapeptidos preferidos incluem aqueles em que A^ é P-Lys-€-UH-R (em que R é o grupo ciclo-alquilo Οχ- - 10)? Os outros decapeptidos preferidos são aqueles 1 10 em que A -A é I-acetil-D-/?-ííal-D-Phe-D-Phe-Ser-Tyr-D-(ci-clopentil)Iiys-Phe-Arg-Pro-D-Ala-M2; N-acetil-D-|3-Ial-D-Phe-I)-Phe-Ser“Tyr-D-(ciclopentil)Lys-Phe -(ciclopentil)Ly s-Pr o -D-Ala-HHg. A invenção também descreve os decapeptidos da seguinte fdrmula: 25

N-aeetil-P-P-Ial-P-Phe-D-Phe-Ser-Syr-P-Arg-Phe-íisopropil) D-Lys-Pro-P-Ala-HHgJ N-acetil-D-p-Nal-P-Phe-P-Phe-Ser-!i)yr-P-(benzil)iíys-Phe-Arg- -Pro-P-Ala-IH2i 30 N-acetil<-D-0-IJal-D-Phe-D-Phe-Ser-5)yr-D-(Cl-benzil)Lys-Phe--Arg-Pro-D-Ala-HHgi N-acetil—D-jB-Mal-D-Phe-D-Phe—Ser-3}yr-!D- (heptil)Lys-Phe-Arg--Pro-D-Ala-KH2i 35 ?T-acetil-P-0-Ial-P-Phe-P-Phe-Ser-!Tyr-I)-Arg-Phe-(t-butilme-t i1)ly s-Pr o-D-Ala-HHg; W-acetil-P-/3-líal-P-Phe-D-Phe-Ser-Tyr-P-Arg-Phe-(4-metilben- -2- 10 15

Mod. 71 -10000 βχ. - 89/07 20 25 30 15. OIT 1990

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Refí Biomeasure-LHRH Antagonist II CIP k (00537/019006) zi1)ly s-Pr o-D-Ala-HHg} N-acetil-D-p-Nal-D-Phe-D-Phe-Ser-Iyr-D-Arg-Phe-(benzil)Lys- -Pro-D-Ala-NHg» SSr-aoetil-D-P-Hal-r-p-Ol-Phe-D-Irp-Ser-Tyr-D-p-IIHg-Plie-Phe-(i sopr 0 pi1)Lys-Pr o-D-Ala-NKg} N-acetil-D-p-iíal-E-Phe-D-PIie-Ser-Tyr-D- (heptil )Lys-Piie-(hep, til)Lys-Pro-D-Ala-NHg» N-acetil-L-/Mtfal-I)-Phe-l)~Phe-Ser-5yr-I)(l-butilpentil)Lys--Phe-(l-butilpentil)Lys-Pr o-D-Ala-HHg. Iíoutras formas de realização preferidas, uma quantidade eficaz de um decapeptido terapêutico da invenção e uma substância ou sal de veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico, por exemplo carbonato de magnésio ou lactose, em conjunto, formam uma composição terapêutica para inibição da libertação das hormonas sexuais, particular-mente LH, induzido por 1H-EH.

Esta composição pode estar sob a forma de uma pílula, comprimido, cápsula, líquido ou comprimido de libertação controlada para administração oral} um "spray" líquido para ad ministraçao nasal} ou um líquido para administração parente ral, tópica, vaginal, rectal, bucal (incluindo sublingual) ou intraperitonal.

Como se utiliza aqui o termo substância ou sais "aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico" refere-se a um veículo ou sal que retém a actividade biológiea desejada do composto principal e não provoca quaisquer efeitos toxi-cológieos indesejados. Exemplos de sais são (a) sais de adi ção de ácido formados por ácidos inorgânicos, por exemplo, ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido sulflrico, ácido fosfórico, ácido nítrico e análogos} e sais formados por á-cidos orgânicos tais como, por exemplo, ácido acético, ácido oxálico, ácido tartárico, ácido succínico, ácido málico, ácido ascórbico, ácido benzoico, ácido tânico, ácido pamoi- -3- 35

15

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 20 25 30 62768

Refí Biomeasure-LHRH Antagonist II CIP k (OO337/OI9006) 1 co, ácido algínico, ácido poliglutâmico, ácido naftaleno- -sulfdnico, ácido naf taleno-di-sulf <5nico, ácido poligalactá rdnico; (b) sais de adição de bases formados por eatiões de metal polivalente tais como zinco, cálcio, bismuto, bário, 5 magnésio, alumínio, cobre, cobalto, níquel, cádmio e análogos? ou por catião orgânico formado a partir de NjíP-diben-ziletileno-diamina ou etilenodiamina? ou (c) combinações de (a) e (b), por exemplo, um tanato de zinco e análogos. As vias mais apropriadas dependem da utilização, ingrediente 10 activo particular e assunto envolvido.

Uma outra forma preferida para administração é uma suspensão injeetável do peptido com uma matriz poliméri^ bioerosiva, biocompatível capaz de suster de modo eficaz a libertação do peptido. Outras formas apropriadas são os pejo tidos/implantes poliméricos, emplastos transdérmicos, emplastros de transmucosas (vaginal) e "spray" nasal e composições utilizáveis com técnicas intoforéticas.

Os decapeptidos da invenção são activos na inibição de LH-RH libertação induzida de LH e exibem uma duração longa de actividade, minimizando deste modo a quantidade e frequência de dosagens. Além do mais, o fabrico é rela tivamente simples e económico. Em adição, os peptidos têm a vantagem de serem administrados ovalmente, uma propriedade devido à sua elevada capacidade de liofilização e à sua ca pacidade de resistir à degradação enzimática por peptidase.

Os peptidos da invenção têm D-X-Phe ou D-Tyr em p" % pelo menos, numa das posições A ou A . Cem-se verificado que, D-X-Phe, D-Trp ou D-Tyr na posição A'’ são modificações de importância partieular em termos de actividade, enquanto o D-Phe na posição A proporciona ainda redução de custos com 2 parado com D-p-X-Phe na posição A sem perda significativa comparativa de actividade. A presença de D-Lys-e-IH-R na -4- 62768

Ref: Biomeasure-LHRH Antagonist II CIP k 15LQIT1990

(OO537/OI9006) /% ít (ΛΛ 6 8 1 posição A e Lys-e-M-R na posição A quando R é um grupo alquilo ou arilo diminui o efeito irritante do decapeptido. Presumivelmente isto é devido a uma diminuição observada na actividade de libertação de histamina. Acredita-se ainda 5 6 5 que a presença de Arg na posição e P-Tyr na posição A , conhecida por modificação de Hodgen, também diminui a actividade de libertação de histamina. A presença de p-X-Phe na posição A' é também particularmente vantajosa em termos de actividade. 10 15

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 20 25 30 íem-se verificado que os antagonistas LH-RH, em geral, e os decapeptidos, em particular, podem ser utilizados para tratar doentes imuno-repressivos quando administra dos como se descreveu atrás. Os antagonistas rejuvenescem o timo, que produz a seguir células 5) para substituir as célu las T perdidas como resultado da imunodeficiência.

Os peptidos antagonistas da invenção podem ser utilizados para tratar algumas formas de cancros derivados de hormonas incluindo os cancros da mama, prdstata e ovários. Algumas condiçSes benignas resultantes de uma superprodução de hormonas sexuais podem beneficiar do tratamento com um peptido da invenção, por exemplo, hiperplasia prostá tica benigna, endometriose ou liomas. Pescobriu-se também que os antagonistas LHEH da invenção podem exibir um efeito antitumoral directo nas linhas de células cancerosas da mama (poe exemplo MGP-7). Outras utilizaçSes incluem mas não se limitam ao seguinte: contracepção femininaj prevenção ou atraso da ovulação; fim da gravidez em animais domésticos e de estimação; indução de parto; sincronização da ovulação; supressão do estro; promoção no desenvolvimento em animais fêmeas; indução das regras menstruais, luteolise; terapia do síndroma prémenstrual; terapia da puberdade precoce; terapia do leiomioma uterino; antes do primeiro trimestre a-bortivo; terapia de endometriose; terapia para tumores e -5- 35 62768

RefJ Biomeasure-LHRH Antagonist II CIP k (00537/019006) 1 quistos mamáriog; terapia da doença/sindroma do ovário poli císticoí terapia do carcinoma uterinoi terapia da hipertrofia prostática "benigna e do carcinoma prostático» contracep> ção masculina} terapia da doença resultante da hormona gona 5 dal excessiva em qualquer sexo; castração funcional em animais macho de produção de alimento; supressão da descarga sanguínea na fase pro-sio em cães} vantagens de diagnóstico tais como predisposição para osteoporose} prevenção da hi-per-estimulação do ovário} preservação da fertilidade em ca 10 so de quimioterapia ou irradiação; e outras utilizações como descreve Vickery. B.H., Endocrlne Reviews» 7,:115 (1986) que 6 totalmente incorporado por referência aqui. 15

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Outros aspectos e vantagens da invenção aparecem na seguinte descrição das formas de realização preferidas e nas reivindicações.

Descrição das formas de realização · /· preferidas Antes de descrever a estrutura, síntese, teste e utilização das formas de realização preferidas da invenção, descrevem-se primeiro os desenhos.

Desenhos 25

Figura 1 ê uma curva de crescimento do tumor ma mário do rato ΚΧΪ em resposta à BIM-21003 agonista e BIIÍ--21009 antagonista. 30

Fig.2 é uma curva de crescimento do tumor mamário do rato ΜΪΧ em resposta às diferentes doses do BIH-21003 antagonista.

Fig.3 é uma curva de crescimento do tumor mamário do rato MXT em resposta a diferentes doses de BIM-2IOO9. -6- 35 62768

Refí Biomeasure-LHRH Antagonist II CIP k (OO537/OI9006) 1 Fig. 4 é uma curva de crescimento do adenocarci noma mamário MT/W9A-S em resposta a BIM-2IOO9.

Fig. 5 é uma curva de crescimento do tumor da próstata humano DU145/01 em resposta a BIM-21009.

Fig. 6 ê uma curva de crescimento do tumor da próstata R3327 de Dunning em rataeanas em resposta a BIM- -2IOO9. 10

Fig. 7 é uma curva de crescimento do tumor da próstata em ratasanas 2PR-121D(1)/S em resposta a BIM-21003 e BIM-21009.

Mod. 71 -10000 βχ. · 89/07

5 15 20 25 30

Fig. 8 é uma curva de crescimento do adenocarci noma da próstata em ratasanas 2PR-121I>(1)/R em resposta a BIH-21OO9.

Estrutura

Os decapeptidos da invenção têm a fórmula geral descrita atrás do Resumo da invenção. íDêm todos um grupo a-cetilo na extremidade amino terminal em adição a Ser na posição 4. A substituição de substituintes não naturais nas 2 3 7 posiçSes outras que não A , A e A pode ser utilizada para modificar as propriedades do composto e não evita que os 2 3/ 7 substituintes A , A e/ou A proporcionemos seus efeitos benéficos.

Os decapeptidos proporcionam-se sob a forma de sais aceitáveis sob 0 ponto de vista farmacêutico. Exemplos de sais preferidos são os que possuem ácidos orgânicos acei táveis sob 0 ponto de vista farmacêutico, por exemplo, ácido acético, ácido láctico, ácido raaleico, ácido cítrico, á-cido málico, ácido ascórbico, ácido succínico, ácido benzoi -7- 1 62768

Ref* Biomeasure-LHRH Antagonist IX CIP k (OO537/OI9006) co, ácido salicílico, ácido metano-sulfánico, ácido toluen£f -sulfdnico, ácido trifláoro-acético ou ácido pamotico, bem como, ácidos poliméricos tais como ácido tânico ou earboxi-metilcelulose e sais com ácidos inorgânicos tais como os á-cidos hidro-hálicos, por exemplo, ácido clorídrico, ácido salfárico ou ácido fosfórico. Síntese

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 20 25 30

Exemplo 1 A síntese de B-Ac-D-P-Nal-D-Phe-D-Phe-Ser-Tyr--Ώ-Arg-Phe-Arg-Pro-D-Ala-descreve-se a seguir. Outros decapeptidos da invenção podem ser prepa rados fazendo modificaçOes apropriadas do método sintético seguinte; 0 primeiro passo ê a preparação de resiná de E--Acetil-E^-Eal-P-Phe-D-Phe-benzil-Ser-ÍEyr-D-tosil-Arg-Plie--tosil-Árg-Pro-D-Ala-benzidrilamina como se segue. A resina de benzidrilamina-polistireno (Bachem, Inc.)(1,00 g, 0,3 mole) sob a forma de ião cloreto é coIocê da no vaso de reacção de um sintetizador de Beckman 990B de peptidos para realizar-se o seguinte ciclo de reacção; (a) OHgOlgi (b) de ácido trifluoro-acético em OE^Ol^ (2 vezes de 1 em 1 minuto e 25 em 25 minutos); (c) 0HoGl r (d) etanol; (e) OHgOlgj (f) trietilamina em 0HG1, 2^2’e (g) gh2oi2. A resina neutralizada ê agitada com alfa-t-buto xicarbonil (Boc)-B-Ala-e diisopropilcarbodiimida (1,5 mmole) em OHgClg durante 1 hora e a resina de aminoácido resultante é depois ciclizada através dos passos (a) a (g) no pro- -8- 35 62768

Refí Biomeasure-LHRH Antagonist II CIP k (OO537/OI9OO6) 1 grama de lavagem anterior..Os seguintes aminoácidos (lamino, le) são depois ligados sucecivamente pelo mesmo processo; Boc-Pro, Boc-Tosil-Arg-, Boc-Phe, Boc-Tosil-D-Arg-* =Boc-Tyr, Boc-benzil-Ser, Boc-D-Phe~e Boc-D-fB-Nal. 5

Apds remoção do grupo Boo l·!-terminal, a resina de peptido-benzidrilamina é neutralizada e acetilada pelo tratamento com áoido acético 5$ em OHgOlg. A resina comple-s ta é depois lavada com OH^OH e seca ao ar. 10 A partir da resina anterior prepara-se Ií-Ac-D-J3 -Nal-D-Phe-D-Phe-Ser-Tyr-D-Arg-Phe-Arg-Pro-P-Ala como se se gue. 15 Agita-se a 0°0 durante 45 minutos uma mistura

Mod. 71-10000 ex. - 89/07 da resina de decapeptido anterior (1,85 g, 0,5 mmole) e uma solução de 4 ml de anisol, 100 mg de ditiotreitol e 36 ml de fluoreto de hidrogénio. Evapora-se 0 excesso de fluoreto de hidrogénio rapidamente sob uma corrente de nitrogénio 20 seco, apds 0 que 0 peptido livre é precipitado e lavado com éter. 0 peptido é depois dissolvido num volume mínimo de 50$ de ácido acético e elutriado numa coluna (2,5 x 100 25 mm) de Sefadex G-25. As fraoçSes contendo 0 componente prin cipal, como determinado pela absorção u.v. e cromatografia de camada fina (tlc) são reunidas e evaporadas até um volume pequeno sob vácuo. Esta solução é aplicada a uma coluna (2,5 x 50 cm) de octadecilsilano-sílica (Whatman IRP-l, 15-30 -20 um de tamanho malha) que é elutriada com um gradiente linear de 15-50$ de acetonitrilo em 20$ de ácido acético em água. As fraoçSes são examinadas por tlc e cromatografia lí quida analítica de alta resolução (hplc) e reunidas para proporcionar uma pureza máxima. A liofilizaçao repetida da 35 solução a partir da água proporciona 117 mg do produto sob -9-

!3.0L!T199QV 5 10

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 20 62768

Refs Biomeasure-LHRH Antagonist II CIP k (OO537/O19OO6) 1 a forma de um pd branco com penugem.

Verifica-se que este material é homogéneo através de hplc e tlc. A análise de aminoácidos de um hidrolisa to ácido confirma a composição do decapeptido.

Preparou-se N-Ac-D-/3-Nal-D-p-Cl-Phe-D-Trp-Ser--Phe-D-Arg-Leu-Arg-Pro-B-Ala de acordo com a síntese descri ta atrás, substituindo Boc-D-p-Cl-Phe por Boe-D-Phe na posi 2 ^ ção A , Boc-D-Trp por Boc-D-Phe na posição A , Boc-Phe por

Boc-Tyr na posição A^ e Boc-Ieu por Boc-Phe na posição íJ.

Pr e p ar 0 u- s e lí-Ac-D-β -Hal-D-p-C l-Phe-D-Tyr - Ser --Phe-B-Arg-Ieu-Arg-Pro-B-Ala de acordo com a síntese descri ta atrás, substituindo Boc-D-p-Cl-Phe por Boe-3)-Phe na posi 2 ·ζ ~ ção A , Boc-D-'j}yr por Boc-B-Phe na posição Á , Boc-Phe por

Boc-3)yr na posição A'5 e Boc-Leu por Boc-Phe na posição A^.

Preparou-se H-Ac-B-B-Hal-D-Phe-D-Phe-Ser-Phe-D- -Arg-Ieu-Arg-Pro-D-Ala de acordo com a síntese descrita a- 5 trás substituindo Boc-Phe por Boc-Tyr na posição A e Boc- 7 -Leu por Boc-Phe na posição A *

Exemplo 2 25

Para sintetizar peptidos possuindo D-Lys-e-KH--R na posição A ou Lys-e-HH-R na posição A , onde R é um grupo alquilo ou arilo, utiliza-se 0 método descrito em Ooy et al., Patente Americana S.H. 879 348 pedida em 27 de Junho de 1986 incorporada aqui como referência. Em geral, a síntese envolve a reacção de um composto contendo um grupo carbonilo por exemplo, acetona ou formaldeído com um poli-peptido ligado a resina possuindo uma subunidade Lys ou D--Lys na presença de cianoboro-hidreto de sddio. 0 composto contendo carbonilo reage com um grupo livre e-UHg na cadeia -10- 35 13.0:71990 íi ? ! V l/\.s ·-— 5 10 15

Mod. 71 -10000 βχ. - 89/07 20 62768

Ref: Biomeasure-LHRH Antagonist II CIP 4 (00537/019006) 1 lateral da subunidade Lys ou D-Lys; a reacção com acetona produz uma porção C-I-isopropilo em que a reacção com for· maldeído produz uma porção £-I-metil. A síntese de Ac-D-/3-I'7al-I)-Phe-D-Phe-Ser-ri}yr-D-(isopropil)Lys-P]ie-(isopropil)Lys-Pro~D-illa-M2 está descri ta a seguir. A resina de Ac-D-P-Hal-D-Phe-D-Phe-Ser(Bzl)-fyr -D-Lys(MOO)-Phe-D-Lys(PMOC)-Pro-B-Ala-benzidrilamina(Bzl = =benzilj MOC = fluorenilmetiloxicarbonil) preparou-se por métodos padrão num sintetizador de Beckman 990B automático de peptidos utilizando TFA a 33$ (ácido trifluoroacético) para remoção dos grupos protectores °f-Boc. Os grupos proteç; tores e-FMOC nos resíduos Lys são completamente estáveis pa ra estas condiçSes ácidas e para os passes de neutralização subsequentes com 10$ de trietilamina em clorofórmio. A resi na foi depois tratada com 50 ml de uma solução a 50$ de pi-peridina DMF (dimetilformamida) durante cerca de 12 horas para remover os grupos protectores PMOC dos resíduos Lys.

Para se fazer reagir os grupos livres e-amino dos resíduos Lys, a resina (0,25 mmole) foi misturada com 5 ml de acetona e 1 mmole de cianoboro-hidreto de sódio em 25 DMF/l$ de ácido acético adicionado. A mistura de resina foi depois agitada até se tornar negativa para a reacção de ni-nidrina (cerca de 3 horas); a reacção de ninidrina negativa indicou que os grupos e-amino livres se converteram em grupos N-isopropil arnino. 30 A resina foi depois clivada a partir do suporte por tratamento com HF/anisol e purificada sob eondiçóes padrão para produzir 0 polipeptido desejado.

Ae-D-U al-D-Phe -D-Phe - S pr -2yr -D-Ly s(isopropil) -11- 1 5 62768 Ref: Siomeasure-LHRH Antagonist II CIP k (00537/019006)

U G05TÍ990rt . Cv

-*'A

Phe-Arg-Pro-D-Ala-amida> U-aoetil-D- -Nal-B-Phe-D-Phe-Ser-Tyr-B-(ciclopentil)Lys-Phe-Arg-Pro-I>-Ala-IH2; e I-aeI>-(ei-clopentil)lys-Phe-(ciclopehtil)liys-PrQ-I)-Ala-NH2 são preparados de um modo análogo utilizando modificaçdes apropriadas do processo descrito atrás.

Teste

Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08

Um dec&peptido da invenção pode ser testado pe-10 la sua capacidade de reduzir o tamanho de um ou mais dos se guintes tumores dependentes de hormonas* o tumor da mama hu mano MCP-7, o tumor ductal papilar de murina KXT ou ratasa-na MT/W9A-S e o adenocarcinoma da próstata R3327 de Dunning de ratasana ou DU/145 humano. Os námeros de código BIM-2000 15 utilizados nas Tabelas e Figuras referem-se aos seguintes deeapeptidos; 20 25 30 BBfc-21003; BIH-21006; BIM-21009: BIM-21011; BIH-21023: BIH-21024: BIM-21025: BIIí 21026; p-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arji -Pro-Sly-WHg p-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Phe-Ieu-Ar| -Pro-01y-m2 I-Ac-D-jB-Ial-D-P-01-Phe-D-Phe-Ser--Tyr-B-Arg-Phe-Arg-Pro-D-AIa-UH2 U-Ac-D-B-Ual-D-Phe-D-Phe-Ser-Tyr-D--Ar g-Phe-Ar g-Pr o-D-AIa-NHg H-Ac-D-β-Ual-B-p-01-Phe-D-Trp-Ser--Tyr-B-Ar g-Phe-Arg-Pr o-D-Ala-HHg U-Ac-D-fl-Nal-D-Phe-S-Phe-Sér-Phe-D--Ar g-Le u-Ar g-Pr o-D-Ala-HHg B-Ac-D-P-Ual-B-Phe-B-Phe-Ser-Tyr-B--Ly s (ben z41) -Phe -Ar g-Pr o-D-Ala-Díh2 Ií-Ac-I)-|3-Iíal-D-Phe-I)-Phe-Ser-Tyr--D-Lys(ciclopentil)-Phe-Iys(cielo-pentil)-Pro-D-AIa-HH2 35 -12- 62768

Ref: Biomeasure-LHRH Antagonist II CIP 4 (OO537/OI9OO6) BIM-230140 í D-Ial-Cys-Tyr-D-Trp-lys-Val-Cys- -Thr-HH2 BIH-21032i N-aeetil-B-P-Ial-B-Phe-D-Phe-Ser- -Tyr-D-(ciclopentil)Lys-Phe-Arg-Pro -D-Ala-HHgj

Tumor Mamário Humano HOP-7

Os ratinhos fêmea CDP-1 foram implantados oom 0 tumor mamário humano (MCF-7) sob as eápsulas dos rins no dia 0. Io dia 1, os animais foram infectados por via subcutânea com BIH-2IOO9 uma vez por dia durante 6 dias. 0 grupe de controle negativo recebeu veículo apenas e o de controle positivo foi ovariectomizado no dia 0. 0 Quadro 1 apresenta os resultados da experiência 1, em que as injecçêes subcutâneas diárias de BIM-210CK (25jig) durante um período de 6 dias decresceram 0 tamanho do tumor para 28$ (a menos que se estabeleça de outro modo, os resultados em percentagem são relativos ao controle tratado com veículo). Este efeito foi semelhante ao obtido poa ovariectomia (-33$)· 0 Quadro 2 apresenta os resultados da experiência 2, em que as injecçêes subcutâneas diárias de BIK-2100<i (10 ug) durante um período de 6 dias diminui 0 tamanho do tumor para 28$ do tamanho do tumor de controle tratado com 0 veículo. Hesmo para uma dose de 1 ng, BIS-21009 reduziu 0 tamanho do tumor para 53$ do tamanho do tumor de controle. Estes efeitos foram mais fraoos do que os efeitos de ovariectomia sobre o tamanho do tumor (redução do tumor pa ra 5$ do tamanho de controle). 0 Quadro 2 também mostra que, para uma dosagem elevada os superagonistas LHRH BIIí-21003 e BIH-21QQ6 não insensibilizam os receptores LHRH da pituitária do rato. -13- 62768

Ref; Biomeasure-LHRH Antagonist XX CIP 4 (00537/019006) 1 0 Quadro 3 apresenta os resultados da experiên cia 3 em que as injecçães subcutâneas diárias (25 ng) dos antagonistas LHRH BIM-21023, BIH-21024, BIE-21025 e BIM--21026 durante um período de 6 dias dão origem a um deeres-5 cimento da gama do tamanho do tumor de 29$, 11$» 12$ e 8$, respectivamente, do tamanho de controle.

Um peptido de controle que é uma somatostativa octapeptido análogo, Somatuline (BIM-23014C), para doses de 2 jug, 10 jug ou 50 jug reduziu o tamanho do tumor para 45$, 32$ e 10$, 10 respectivamente, 0 peptido BIM-21032 pode também ser tratado no sistema como se mostrou atrás. 15

Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08

25

Carcinoma Buctal Papilário Mamário de Kurina HXQ? ou Àdenocarcinoma de Rata·*7 sana MT/W9A-S

Os ratinhos fêmea ou ratasanas foram implantados por via sucutânea com carcinoma papilário ductal mamário de murina ΜΙΪ ou com adenocarcinoma mamário de ratasang MT/W9A-S, respectivamente, no dia 0 e injectou-se uma vez 9 diariamente por via subcutânea com várias doses de BIH-210C do dia 1 ao dia 37. Os grupos de controle negativo receberam o veículo apenas e os de controle positivo foram ova-riectomizados 5 dias antes de implantação do tumor. 0 Quadro 4 e a Rig. 1 mostram que BIK-21009 induziu um efeito inibitório de crescimento de tumor altamente significativo (-95$) sobre o carcinoma mamário sensível ao estrogeno ΜΧΪ no ratinho que foi melhor do que o efeitc de ovariectomia sobre o crescimento do tumor(-84$). Δ Fig. 1 também mostra o efeito estimulante do agonista BIH-21003 sobre o crescimento do tumor visto que os receptores LHRH da pituitária do ratinho não são insensibilizados pelo súper agonista LHRH quando em oposição para ratasanas ou humanos. -14- 35 1 5 10 15

Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08 20 25 30 62768 ítef: Biomeasure-LHRH Antagonist II CIP 4 (OO537/OI9OO6) 15.0o

0 Quadro 5 mostra que BIK-21009 induziu uma redução considerável no peso do átero (-27$) comparável à dos animais ovariectomizados (-85$). Os pesos dos ovários e da pituitária foram também significativamente reduzidos (-47$ e -35$, respectivamente). A 3?ig. 2 mostra que BIH-21009 pas*.· ra uma dose de 25 Ag reduziu de modo significativo o tamanho do tumor mas não a extensão de controle de castração e mostra que a dose de BIH-21009 é proporcional ao tamanho de redução do tumor. A Pig. 3 mostra que o tumor mamário de mu rina MXT sensível ao estrogeno escapa aos efeitos inibitórios de crescimento de castração e que BIH-21009 para uma dose de 50 Ag reduz o tamanho de tumor e retarda deste modo o escape. A Pig. 4 mostra que o adenocarcinoma mamário de ratasana sensível ao estrogeno MT/W9A escapa aos efeitos de ovariectomia e que uma dose muito elevada de BIH-21009 (250 Ag) reduz o tamanho de tumor e retarda deste nodo o escape.

Adenocarcinoma da Próstata R3327 de Dunning da Ratasana ou Humano PU/145 Implantaram-se ratinhos machos nás atímicos por via supercutânea com xeno-enxertos do tumor da próstata humana DU/145 e ratasanas de Copenhaga masculinas por via subcutânea com o tumor da próstata da ratasana de Dun-ning B3327. Os grupos de controle negativos receberam apenas veículos e os de controle positivo foram castrados no 3- dia ou 999 dia pds-implante, para 0 tumor humano ou de ratasana, respectivamente. Os níveis de testosterona de plasma foram determinados nos animais na altura do sacrifício. Os resultados na Pig. 5 mostram que, no dia 33 pós-implante, BIH-21009 para uma dose de 12,5 Ag diariamente durante 30 dias reduziu de modo significativo 0 tamanho médio do tumor da próstata humana, mesmo embora 0 tumor não seja sensível a castração. Os resultados no Quadro 6 e Pig. 6 mostram que BIH-21009 -15- 35 62768 η*!τ nn

Ref: Biomeasure-LHRH Antagonist II CIP U (OO537/OI9OO6)

f. administrado primeiro no 99δ dia pds-implante e depois diariamente, por via subcutânea, durante 68 dias a animais tolerando bem, estabeleceu 0 desenvolvimento dos tumore-s da prdstata de Dunning R3327, inibiu 0 crescimento de tumor em 41$ na dose mais elevada testada (20 ug/ratasana).

Os níveis de testosterona de plasma neste dois grupos foram nulos enquanto que para uma dose mais baixa (5 ng/ratasana) os níveis de hormona foram semelhantes aos obsevados nos -grupos tratados com veículo (0,87 Ug/ml e 0,71 ug/ml, res-pectivamente)} não se verifica nenhum efeito significativo no crescimento do tumor para esta dose.

Os resultados no Quadro 7 mostram que BIM-2IOO9 para uma dose de 20 jug reduziu 0 peso de toda a prdstata, da prdstata ventral e dos testes (-85$, -53$ e -68$, respec tivamente).

Os resultados no Quadro 8 mostram que , quando BIK-21009 foi em primeiro lugar administrado mais cedo às ratasanas de Copenhaga tolerando 0 tumor da prdstata R3327, isto é, em 15 dias em vez de 99 dias pds-implante (a castra ção de controle foi também realizada 15 dias pds-implante) 0 tamanho do tumor foi reduzido até uma extensão maior do que 0 do grupo de controle de castração 96 dias pds-implan-te.

Ias Pigs. 7 e 8, administrou-se ΒΙΜ-2ΙΟΟ9 diariamente durar te 10 a 30 dias pds-implante do tumor.

Os resultados mostrem que os tumores da prdstata da ratasa-na sensível ao androgeno (2PR-121I>(1)/S) e resistente ao an drogeno (2PR-121B(1)/E) respondem a BIK-2IOG9 para uma dose de 50 ug por redução no tamanho do tumor. Esta redução é:de um grau maior do que o observado para 0 grupo de controle de castração. -16- 1 5 10 15

Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08 20 62768

Refj Biomeasure-LHRH Ãntagonist II CIP 4 (00537/019006)

Utilização 15.0:71990^, 'LÁ

Quando administrados a um mamífero (por exemplo por via oral, intravenosa, parenteral, nasal ou através de ' supositório) os deeapeptidos são eficazes na inibição da lj bertação de 1H induzido por EH-RH.

Os deeapeptidos da invenção podem ser utiliza-dos para 0 tratamento da puberdade precoce, de tumores dependentes de hormona (por exemplo, tumores nos testículos, nos ovários , na mama, prostáticos malignos e benignos), hirsutismo, acne, amenorreia (por exemplo, amenorreia secur dária), endometriose e doenças císticas mamárias e de ovários; 0 deeapeptido particular descrito atrás é particularmente eficaz na prevenção do crescimento de tumores mamários. Os deeapeptidos podem também ser utilizados para regu lar a hormona (LH) de luteinização de gonadotropina da meno pausa humana e hormona estimuladora de folículo (FSH) durar te os períodos de perimenopausa e pós-menopausa na mulher. Os deeapeptidos podem também ser utilizados como contracep-tivos em fêmeas e como um abortivo.

Em geral, para as utilizações descritas atrás, os deeapeptidos podem estar em quantidades compreendidas en tre 0,001 e 5 mg/líg de peso de corpo. De preferência, para terapia humana, 0 ingrediente activo será administrado na gama compreendida entre cerca de 0,01 e 1 mg/Kg/dia, de pre ferência 25-250 mcg/Kg/dia; e para terapia animal, o ingrediente activo será administrado na gama compreendida entre 0,1 e 1 mg/Eg/dia. Esta administração pode ser acompanhada por uma simples administração, por distribuição durante várias aplicações ou por libertação lenta com vista a atingir os resultados mais eficazes. De preferência, para a interrupção do calor ou prevenção da gravidez em animais, a dose está compreendida entre cerca de 1 a 10 rag/Kg, administrada -17- 62768

Ref: Biomeasure-LHRH Antagonist II CIP 4 (OO537/OI9006) 1 como uma dnica dose.

8

Mod. 71 - 20.000 ex. 5 10 15 20 A dose exacta e 0 regimen de administração destes compostos e composiçSes dependem necessariamente das necessidades do assunto individual a ser tratado, tipo de tratamento, e grau de aflição ou necessidade. Em geral, a administração parenteral necessita de dosagem inferior à dos outros métodos de administração que são mais dependentes de absorção. Os decapeptidos e os antagonistas LH-RH em geral, podem também ser utilizados para tratar doentes imuno-deprimidos visto que a castração química pode restaurar o timo e depois estimular 0 sistema imune. Exemplos de antago nistas adicionais LH-RH são descritos em Ooy, U.S. Pat. n2 4- 647 653» incorporada aqui por referência e Ooy et al., U.S. Pat. ns 4 431 635> previamente incorporada por referêr cia. Os antagonistas LH-RH rejuvenescem o timo quando administrados como se descreveu atrás. 25 30

As composiçães podem ser administradas convenientemente sob a forma de dosagem unitária e podem ser preps.; radas por quaisquer dos métodos bem conhecidos na técnica farmacêutica, por exemplo, como se descreveu em Remington^ Pharmaceutical Sciences. Hack Publishing Oompany, Easton, PA., I97O. As formulaçSes para administração parenteral po-: dem conter como excipientes comuns água esterilizada ou so-luçães salina, alquileno glioois tais como propileno glicol, polialquileno glioois tais como polietileno glicol, dleos de origem vegetal, naftalenos hidrogenados, e análogos. For mulaçSes para administração vaginal ou rectal por exemplo, supositórios, podem conter como excipientes, por exemplo, polialquileno glioois, vaselina, manteiga de cacau e análogos. As formulaçSes para administração nasal podem ser sáli das e conter como excipientes, por exemplo, lactose ou dex- -18- 35 1 62768 •Ref: Biomeasure-LHRH Antagonist II CIP 4 (OO537/OI9006) 5 trano ou podem ser aquosas ou soluções oleosas para adninis tração sob a forma de gotas nasais ou "spra#** eom contador. Para administração bucal os excipientes típicos incluem açd cares, estearato de cálcio, estearato de magnésio, amido prégel&tinado e análogos. 10 15,n!r L0LT1990 t

E particularmente preferido a administração nasal dos nona-deeapeptidos. A absorção através da membrana da mucosa nasal é aumentada através de ácidos tensioactivos tais como por exemplo, ácido glicocdlico, ácido célico, áci do taurocélico, ácido colânico, ácido etocálico, ácido deso xicdlioo, ácido chenodesoxicélico, ácido de-hidroeélico e á eido glicodeoxi-cdlico. 16

Mod. 71 - 20.0«) «x. - 90/06 20

25 30

Um ou mais dos ácidos ou sais tensioactivos, mas de preferência, um ánieo sal ácido aceitável sob o ponto de vista farmacêutico pode ser adicionado ao antagonista LHRH em solução ou pd. Sais tensioactivos aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico são os sais que retêm o fendme-no do aumento de absorção do peptido, bem como das caraete-rístioas tensioaotivas dos compostos e que não são pernicio sas para o assunto em questão ou por outro lado eontra-indi cadas. A quantidade de agentes tensioactivos utilizados para a prática desta invenção serão algumas quantidades que aumentam a absorção dos peptidos LHRH acima dos outros ager tes tensioactivos que também podem aumentar a absorção dos peptidos até um certo grau. Verificou-se que essa quantidade está muitas vezes compreendida na gama entre 0,2 e 15$?« muitas vezes entre 0,2 e 5$ em peso/volume- da sclução.i Pre . fere-se que o agente tensioactivo esteja presente numa quar, tidade compreendida entre cerca de 0,5 e 4$ em peso/volume, de modo conveniente 1$ em peso/volume, de preferência 2$ en peso/volume.

Outras formas de realização encontram-se nas se, guintes reivindicações. -19- 10

Mod. 71-20.000 e1. - 90J08 62768 Kef: Biomeasure-LHRH Antagonist II CIP 4 (OO537/OI9OO6)

QUADRO 5.0ÍT1990

EFEITO DE BIH-21009 SOBRE 0 CRESCIMENTO DO OáROIUOhA HAMARIO HU1AI0 HOF-7 EH RA TOg 3-rtipo Dose Diária Variação no Ta- jo Variação por Rato manlio Ao Tumor (mm)

Veículo Q.6Q±0.54 15 Ovarieeto-Eiizado BIM-21009 25ag -0.20-0.462 -0.17-0.751 -33.33 -28.53 20 25 30 -20- 35 1 P 40.05 2 Ϊ3Ε P <0.01 62768

Ref! Biomeasure-LHRH Antagonist II CIP ^ (00537/019006) QUADRO 2

5 10 15

I V I 8 iv *O O 5 20 25 30

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Ref: Biomeasure-LHRH Antagonist II CIP 4 (OO537/OI9OO6)

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(00537/019006) 5 o o K ri cvS ϊ-*· o Ití

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Refí Biomeasure-LHRH Antagonist II CIP b (00537/OI9OO6) QUADRO 5 15,0lTt99| fy o EH -4 Pi ta o R ca o :¾ H Pi O Ό R Ê3 3 00 s tíJ Pi o CO O PI Pi ffl o ca cn O O (—1 CM I M '-4 H Rpq R o EH Hpq R pq EH X y H r4 9 £>' EH PI ca pq P4 o R < EH fvj O Ph m

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Refs Biomeasure-LHRH Antagonist II CIP 4 (00537/019006) QUADRO 6

EffEITO PE BIií-21009 SOBRE 0 ORESOIHEHJO DO ΑΡΕΜΟΟαΙΙΟΙΝΟΕΙΑ EA PR0SQ3AEA R3327 EH RATOS 0 id 0 d c- cr\ 0 •ri » H cn CM 1 * • * 3 0 0 > c •Φ CM I 1 1 0 O H 0 0 0 0 0 O CM •Φ r-i IV -P cj • • • • P 3 CM CQ V 0) E-l CM r-i 1—1 •a} LTi cr> CM (X) O 0 CM •Φ • • • • ΙΓΝ ur\ CM CM s CO + 1 + ! + 1 + 1 £ ri O O O 0 O co r-i σ\ d • • Λ • u •H •Φ r-i "Φ ω 0 P> ΚΛ CM CM CM EM O KS CO H Oc tá K\ CO ir\ CM • • * • 0 CM H CM t—1 Λ O + 1 +1 + 1 +1 Si cn o 0 0 0 d co φ 0 CM 0 d « • • • 3 Ή r-i ir> r-i r-4 em n r—i 1—1 r-i H d d β •ri d H ca *d d bO hO •ri +3 I 1 á á d i 1 P4 O LTV Q) CM ra u 0 0 O PI C7\ 0 O 0 tS O r-i d H 0 á 54 CM Pi 0 -P 1 lá Vi ca S R <u d H ζ±5 > 0 25 62768 15. OIT :990l %y iXXJ^r i /

Hef: Biomeasure-LHRH Antagonist II CIP 4 (00537/OI9006) 1 QUADRO 7 cn O O H LA LA ca H • CA CA CO 03 • i—! c—1 6,0 CA • cr» CA 0 • Ai 00 O rH CVJ d + 1 tv *H • +1 r-J + 1 • •H e 1 IA 1 VO 00 H AJ IA O 'Φ H P3 LA -M" Ai va 1—1 4- rH 1 CA 1 • d— 1 CA -v}- 5 co £3 'ca s

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o EH H R pi) R t- H o • va rH 00 C- O • d «4- rH 4-1 CM 0 0 4-1 1 -H 1 A 1 + 1 1 -H 1 Vi A 1 A 1 0 1 -Μ 1 A 1 ω VO A • Α « CM AJ A- m x3 H 1 0 cã cã Kã r-H Pt Pi kq hí cã O 43 O O P s_ 0 a Pi 43 ccã tí Kã ccd d ccã 0 0 0 ω 0 a> CO o> EH cã !> cã cã ca cã cã 0 •H •rl 6£ •H 02 •H •ri •H 0 cã Pi cã Pi Pi Cã cã Pi Pi X3 43 cã -P cã cã rH £ cã xã cã t> eJ r»· co í> d 0) í> 43 m 43 4= Φ TÍ 04 1 •H 0 co <L> CO 0) 43 0) tí 02 d 02 Ό -d Ό xi 02 •g <cd -d 43 0) Pi Pi 0) Η rl Ph Ph Ph EH '35. Ci3 Ph

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Ref: Biomeasure-LHRH Antagonist II CIP 4 (00537/019006) QUADRO 8 5

TUMOR DA PRÓSTATA 10

TAMANHO DO TUMOR 96 DIAS APÓS A IMPLANTAÇÃO DO -TUMOR AX-BIM-21009 INICIADO 15 DIAS APÓS A IMPLANTAÇÃO CASTRAÇÃO NO 152 DIA APÓS A IMPLANTAÇÃO - lOy > 15

90/06 - ·*» ΟΟΟ'Οε - U ’P°W 20 25 30 S 'ε i. PS'a, § o Q o M ' a í a

INTACTO CÍS^ADO ' B» * 1009 DO COM BIM-21009 35

Claims

62768

&ef: Siomeasure-LHRH Antagonist II CIP k (OO537/OI9OO6) -reiviidioaçOes- 1®. - Processo para a preparação de decapepti-dos da fórmula: I-Àc-A^A^A^-Ser 4-A5-A6-A7-A8-A9-A10 1 ? 3 em que cada A , A e A independentemente e D-p-Ual, D-p-X--Phe (em que X ê halogéneo, H, Mg, OH ou alquilo A^ é p-X-Phe (em que X é halogéneo, H, Mg» IOg, OH ou alquilo A^ é D-Lys, D-Arg, 0-Ial, D-P-Ial, D-Trp, D-p-X-Phe (em que X é halogéneo, H, Mg, NOg ou alquilo ou D- -Lys-€-UH-E (em que E ê H, uma cadeia linear ou ramificada 7 ou um grupo ciclé-alquilo ou um grupo arilo); A' é p-X-Phe (em que X é halogéneo, H, Mg, HOg, OH, OgP^ ou alquilo ciclo-hexilalanina ou Trp; v. A® é Arg, Lys ou Iys-€-NH-E (em que E é H, uma cadeia linear ou ramificada ou um grupo ciclo-alquilo G,-Oin ou um grupo arilo); LJ ê Ί Ω J. χυ Pr o; e Αχ é D-Ala-IH0, Gly-M0, D-Ser, ou D-Ser-EEL; com a fc Λ 2 £ condição de ,pelo menos, um de A ou Ar ser D-Phe ou D-Syr; fi Q e ainda oom a condição de , pelo menos, um de A e A ser o seguinte: A® ser Sriys-f-lH-E (em que E é um grupo cilclo- p -alquilo C-^-C^q); A ser Lys-e-IH-R (em que E é um grupo ci clo-alquilo ou um sal aceitável sob 0 ponto de vis ta farmacêutico correspondente, earacterizado por se fazer as modificaçêes apropriadas do seguinte método sintético pa ra a preparação de H-Ac-P-0-Ial-D-Phe-D-Phe-Ser-Tyr-S-Arg--Phe-Ar g-Pr 0-D-Ala: 1- preparação da resina N-acetil-D-P-ííal-D-Phe-D--Phe-benzil-Ser-£yr-I)-tosil-Arg-Phe-Tosil-Àrg-Pro-I>-Ala-ben zidrilamina colocando num vaso da reacção a resina bensidra lamina-ροlistireno sob a forma de ião cloreto para se obter 0 seguinte ciclo de reacção: (a) OHgOlgj (b) 33$ de ácido trifluoroacético em OHgOlg (2 vezes durante 1 a 25 minutos cada); (c) CHgClg; (d) etanol; (e) CHgClg; (f) trietilamina -28- 1 5 10 15 Mod. 71 - 20.000 ex. 20 25 30 Refí -^iomeasure-LHRH Antagonist II CIP 4 (00537/019006) 15.017^

em GllOly e (g) CHgClg.
2- agitação da resina neutralizada com alfa-t-but£ xiearbonil (BOe)-D-Ala e diisopropilcarbodiimida em OH^Olg durante 1 hora sendo a resina do aminoáoido resultante ci-clizada através dos passos (a) a (g) descritos atrás, 3- apds remoção do grupo H-termin&l Boc, a resina peptido benzidrilamina é neutralizada e acetilada mediante tratamento com 5$ de ácido acético em CHgC^· Á resina é de pois lavada com OH^OH e seca ao ar. 2®. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se misturar a resina de decapeptido prepa rada com uma solução de snisol, ditiotreitol e fluoreto de hidrogénio e se agitar a 0°G durante 45 minutos.
3®· - Processo de acordo com as reivindicações anteriores, caracterizado por se evaporar 0 fluoreto de hi« cLrogénio sob corrente de nitrogénio, se precipitar o peptido lavando-o de seguida com éter.
4®. - Processo de acordo com a reivindicação 1, 6 caracterizado por se preparar um peptido em que A é D-Lys--ê-IÍH-E (em que R é ura grupo ciclo-alquilo(C·^ iq) · 5®. - Processo de acordo com as reivindicações Q 1 ou 4, caracterizado por se preparar um peptido em que Á° é Lys-6-ΙΗ-Ε (em que E é um grupd ciclo-alquilo 0ρ“0ρφ)· 6®. - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por A1-^10 ser E-acetil-D-β-Hal-D-Phe-D-Phe--Ser-lV^-D-Iys (ciplopentilí-Phe-Ârg-Pro-D-Ãla-IHg. 7®· - Processo de acordo com as reivindicações 1 10 4 ou 5 > caracterizado por À -A ser I-acetil-B-fc-ITal-D--Phe-D-Phe-Ser-Iyr-B-Lys(ciclopentil)-Phe-Lys(eiolopentil)- -29- 10 15 Mod. 71 - 20.000 e*. 20 25 30 35 62768 RefS Biomeasure-LHRH &ntagonist II CIP k (OO537/OI9OO6) -Pr 0-D-Ala-HE^< ^.0171990 8a. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se preparar N-Aeetil-D-0-Nal-D-Phe-D-Phe--S er-2yr-D-Arg-phe-(i so propi1)-D-Lys-Pro-D-Ala-HHg. 9-· - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se preparar N-aeetil-D-0-Nal-D-Phe-D-?he--Ser-Tyr-D-Eys-£benzil)-Phe-Arg-Pro-D-Ala-IH2. 10». - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se preparar N-acetil-D-p-Nal-D-Phe-D-Phe-S er-Tyr-D-Ly s(cloro benzil)-Phe-Arg-Pro-D-Ala-HB^. 11a. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se N-acetil-D-jS-Nal-D-Phe-D-Phe-Ser-Pyr--D-Lys(heptil)-Phe-Arg-Pro-D-Ala-HHg. 12a. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se preparar I-acetil-D-JB-Hal-D-Phe-D-Phe--Ser-2yr-D-Arg-Phe-Lys(t-butilmetil)-Pro-D-Ala-NH2. 13a· - Processo de acordo cora a reivindicação 1, caracterizado por se preparar N-acetil-D-P-Nal-D-Phe-D-Phe- -Ser-^'r-D-Arg-Ph8-Lys(4-metil-benzil)-Pro-D-Ala-M2. 14a. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se preparar N-acetil-D-íi-Nal-D-Phe-Ser--Ty r-D-Arg-Phe-Ly s(benzi1)-Pr0-D-Ala-HHg. 15a. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se preparar N-acetil-D-Í3-Nal-D-p-Dl-Phe--D-Srp-Ser-Tyr-D-NHg-Phe-Phe-íisopropilJIys-Pro-D-Ala-IIHg. 16a. - Processo de acordo com a reivindicação 1, -30- 5 10 15 Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/06 20 25 ftef: Biomeasure-LHRH Açtagonist II CIP h (00537/OI9006) 1 oaraoterizado por se preparar I-acetil-D-P-Ial-D-Hie-D-Phe--Ser~Tyr-D-Lys(heptil)-Plie-Lys(heptil)-Pro-D~Ala-M2. 17ê. - Processo de acordo com a reivindicação 1, oaraoterizado por se preparar N-aoetil-B-P-Nal-D-Phe-D-Phe--Ser-Tyr-D-Ly s(1-butilpentil)-Phe-Lys^l-butilpenti1)-Ar g--Pr o-D-Ala-UHg. * 18ê· - Processo para a preparação de uma eomposi ção terapêutica para inibir a libertação induzida de 1H-RH de hormonas sexuais, oaraoterizado por se misturar uma quan tidade eficaz do decapeptido preparado de acordo com a reivindicação 1 cora um veio alo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico. 19-. - Processo de acordo com a·reivindicação 18, caracterizado por se utilizar uma quantidade eficaz de deca peptido compreendida entre 0,001 e 5 mg/kg de peso corporal de preferência entre 0,01 e 1 mg/líg/dia para terapia humana e 0,1 a 1 mg/kg/dia para terapia animal. 20ê. - Processo de acordo com a reivindicação an terior, oaraoterizado por a administração do composto acti-vo poder ser uma ánica administração, uma distribuição durante várias aplicaçdes e uma administração de libertação lenta com vista a obter os resultados raais eficazes. Lisboa, 15.01Τ:900 Por THE ASIIIIISTKATOES OF THE TULANE EDUCACIONAL PUNE 30 0 AGENTE QPIOIAL

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