PT95687A - Processo para a obtencao de peptido,anticorpo contra esse peptideo e metodo para potenciar a actividade da somatotropina porcina - Google Patents

Description

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CfiHPO DQ 1Ν¥ΕΜΤΟ

Este invente* está relacionado com 3 identificação de três fragmentos · peptídicas sc-snacatropina porcina CpSí) qu© podem ser usados para gerar anticorpos anti-pST, anticorpos são administradas juntamsnte com pST* Q animal é aumentado relativamente ao conseguido com a çSo de pST sóainha,

Quando estes c resciÍBsn to administrai·-

FUKPftHEWTP DO INVENTO A hormona de crescimento pST é nativa para porcos e é responsável pelo crescimento do animal, incluindo o aumento da velocidade de crescimento e a proporção de carne magra para gordura. As quantidades endógenas de pST são pequenas? assim concentraram-se esforços para a preparação de pST exógeno para usar em larga escala em agricultura.

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Um aspecto destes esforças foi a determinação da sequência de aminoácidos completa de pST. Encontrou-se que pST é um polipeptídeo de cadeia simples de 191 aminoâcidas com duas pontes dissulfureto ligando os resíduos 53-164 e 181-189, respec-tivamente (Abdel-Meguid, S.S», st ai», ProcNatl. Acad. Sei.. 84, 6434-6437 <1987)).

Dirigiram-se esforços no senti peotídeos consistindo e:n pequenas f ra aminoácidos da somatotropina de vária objestiva aumentar a ae: ti v idade destas ho Pedido de Patente Europeia publicado 13/r, de um fragmenta de 7 K.d do extremo C da humano ChBH>» Injectaram-se ratinhos do da identificação de cçSes da sequência de s espécies tendo como rraonas de crescimento» 0 234 descreve a clivagem hormona de crescimento com o fragmento e os \ / -atinhas produziram anticorpos inticorpos for ato administrados a.

ratinhos em combinação com hfcSH. Q Pedida de a preparação de um aminaácidas 35-53 de

Patente Europeia, publicado 28454Θ6 descreve fragmento correspondendo aos resíduos de pSTO fragmento pST fo.i administrado a

J porcos- e gerados anticorpos anti-pBT. Reali semelhante com um fragmento de sarnatotropin último caso, os anticorpos auti-bST gerados trados juntemente com bST Intacta a oh actividade de bBT„ zou-se uma experiência a bovina sfatsT)» Neste foram então adminis— servcu-se aumentar a

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Se bem que trabalhos de outros autores descritos atrás proporcionem informação acerca de certas regiões da somatotropina de outras espécies, incluindo porcina, que aumentam a actividade promotora de crescimento de tais hormonas, estas trabalhos não proporciofíam resultados acerca de outros possíveis fragmentos das hormonas que possam ter sítios ecs.it4picos, nem foram apresentados dados comparativos comparando actividade promotora de crescimento de an t.icoroos contra tais fraomentas»

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Assim, constitui um objectivo dests ;to identificar fragmentos adieionais e sangue quente gerem pST incluem peptídeos das seguintes fracçSes de pST que, quando administrados anticorpos contra pST =. Tais fra tendo sequências de aminoácidos de pSTs 98-11Θ, .110-118 e 155-1 a anima grnentos homóloq e é ainda um objectivo deste invento melhorar o cresci— mento através do tratamento de animais de sangue com anticorpos gerados por tais fragmentos de pST em combinação com pSTb Tais anticorpos podem. ser polic1onais ou mofíoc 1 ona i.s b promotora do crescimento esteja presente

administr

Constitui ainda um outro objectivo deste ar anticorpos geradas por tais fragmentos de i π vento animais de sangue animais sSo depois cia de aminoácidos quente e medir o crescimento quando tratados com pST« Tal pST pode ter uma nativa ou modificada, desde que a sua aqueles ssqufn— função è ainda um outro aumento de crescimento animal juntamente com anticorpos de invento é também dirigido a o b j ec t i v o d e s t e i π v en t o resultante da administra d .1 ΐ eren te s f r a gmen t os sequências de aminoácidos comparar o çSa de pST de pST* 0 que sej am

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Estes obj estivas invento que se seque» cnseguidos na descrição do

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J * Ή·

HKEVE DEóRiuãO Dfí-bi FIlãORAS A Figura i descreva a sequfncia de aminoácídos de pST e sete fragmentes peotídicos de pST, incluindo os peptídeos designados 8s 9 a 11 os quais slo o tema deste invento» A Figura 2 descrve a pureza do peptídeo #8 conforme mostrado por cromatografia liquida de alta resolução analítica»

J A Figura. 3 descreve a purificação da fracção de imuno-globulina do soro por fraccionamento do soro numa coluna de afir?idade com Proteína. A» . lina conforme mostrado por electroforese em gel de dodecilsu.lfato de sódio-poliacrilamida íSDS-PAGE)* A Figura. 4 descreve o efeito no crescimento de ratos, a que foi removida a hipófise., tratados com pST sózinha ou pST em combinação com anticorpos de porco contra peptídeos de pST» Soro normal de pOr ϊ- Ο <NP5> que conta- pequenas quantidades píóf endógeno, foi usado como testemunha neciatíva.

J A Figura 5 descreve o efeito no crescimento de ratos aos quais foi retirada a hipófise tratados com pST em combinação £>iperi'ínc: com anticorpos de suíno contra peptídeos de p£ separada da descrita? ns Figura 4» Usou-se a mesma testemunha negativa usada na hxgura 4» A Figura 6A descreve a dose—resposta, da administração do anticorpo de suíno contra o peptídeo #8 de p-ST (aminoácidos 98-11¾¾} mais pST no crescimento de ratos aos quais foi retirada a hipófise» mais pSi no cr ri i-.igu.ra /η aescrevs um estue comparando o efeito no crescimento de removida a hipófise, da tratamento com combinação com o anticorpo de suíno conti <aminoácidos 98~11Θ> ou sem tratamanta»

• -Λ Λί.:\ sta da admini straça α do ΠΓ í a m i noácido s 110— 118) i se» iqosta da a dm inístr ação i pST #11 (acninoâc idas sem hi pDT o lo ao longo do t .empa ratos. aos quais foi pST sázinha r, pST em •a o ps otídeo *8 de pBT A Figura 7B descreve um estudo ao longo do tempo qua ται comparando o efeito no crescimento de ratos, ao removida a hipófise, do tratamento com pST sózinha, ρ-ST em combinação com o anticorpo de suíno contra o peptídeo #9 de pST (aminoácidos 110-118) ou sem tratamento. A Figura 7C descreva um estudo ao longo do tempo comparando o efeito no crescimento de ratos, aos quais foi removida a hipófise, do tratamento com pST sóz.inha, pST em combinaçSo com o anticorpo de suíno contra o peptídeo 412 2 de pST (aminoácidos 155-163) ou sem tratamento» A Figura 8 descreve o efeito no crescimento de ratos, aos quais foi retirada a hipófise, tratadas com pST sázinha ou com anticorpos de suíno contra peptídeos de p87 sózinhos (não combinados com pST)= A Figura 9 descreve o. efeito no crescimento de ratos, aos quais to.i retirada a hipófise, tratados com pST sázinha ou em combinação com anticorpos de coelho contra peptítíeos de pSl A Figura 1Θ descreve o efeito no crescimento de ratos, aos quais foi retirada a hipófises tratados ct em combinação com anticorpos de coelho contí numa experiência separada da descrita na Figura 9. Como nha negativa usou-se soro normal de coelho (NRB)5 o qu; pequenas quantidades de somatotropina endógena de coelho.

J ;_ío7 sózin ha ou pep tideos dê? pBT o Como ies 10 (Tf u.— i 'i ' ‘‘ 5 o qual c on tem £3 C* oe1ho» A Figura ii descreve o efeito no crescimento de ratos» aos quais foi retirada a hipófise,, tratados com pST sósinha ou com anticorpos de coelho contra peptídeos de p-ST sozinhos ínio combinados com pST>= * 1

Este invento é dirigido à identificação de epitopos antigènicas de pSTr, na forma de fragmentos peptídicos que sao capazes de induzir respostas imunc-lógicas em animais de sangue quente através da geração de anticorpos anti-pST especificas de epítopo. Tais anticorpos foram então administrados juntamen te com pST a animais para aumentar o seu crescimento» Como alternativa9 estes anticorpos são administrados a animais que são depois tratadas com pST«

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Os três peptideos pST deste invento são designados por números e as suas sequências da aminoácidos <aa> são as seguintes s #8 (aa 98—11β > s !re-Asn-Ssr-Lsu-Val-ren-bii-Trs-Ser-ftsp-ftrq-

Val-Tir iaa 110-11B>s si r-81u-Lis-Lsu-Lís-ftsp-Lsu-Slu~Blu #ií (aa 155-163)s Leu-Leu-Lis-Asn-Tir—Sli-Leu-Leu-Ser»

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Estes três peptideos têm sequências d-e aminoácidos que são homólogas das fracçSes correspondentes de pST.

Este invento também tíxrxgxtía peptideos •pnríf sequências de aminoácidos que são antigénicamente equivalentes âs acabadas de descrever para os peptideos # 8,, 9 e 11« Tais peptideos pode-se dizer que são antígénicamente equivalentes aos peptideos tendo sequências de aminoácidos homólogas das correspondentes fracçSes de pST se as suas sequências de aminoácidos diferirem apenas em delecções mínimas ou tiverem substituições conservadas reiativamente è.s sequências de pST de tal forma que i as configuraçSes ter

de pST possam ser mente inalteradas gerados ancicorocti em relação às das contra aqueles p fracções ptideos u

Para fins comparativos, construiram-se çieotídeas de pST com sequências de aminoácidos descritas no Pedido de Patente Europeia 284,406s quatro outros baseadas nas

J #2 Ç 3.S 35-52)5 A1a-Ti r-11e~P ro-81n-Asn-A1a--81n- •Slu-SX i-Sln-Arg—T ir- -Ala-Ala-Fen #3 ( 3.5. 36-44)s Tir-Il s~P ro-b' I u.~ -81i-Bln-Arg-Tir-Ser #4 ( &£ã 46—5.3) s 81n-Asn-A1a-B1n~ -A1a—A1a—Fen-Cis #6 ( EE 35-43)s fi1a—Ti r—Ϊ1e-Pr o- -SIu-81 i—Sln—Arg-T ir

Estes sete peptideos podem ser construídos por técnicas conhecidas incluindo, mas não estando limitados, síntese química, utilização da umsintetizador de peptideos de fase sólida e expressão de uma sequência de nuclsotídeos de DMA num hospedeiro adequado» Qs peptideos são então purificados por meios adequados tais como cromatografia de filtração em gel m cromatografia liquida de alta resolução em fase reversa CHPLC)« A pureza dos peptideos .foi demonstrada pela análise da composição em aminoáci-dDS»

Para aumentar a formação de anticorpos in vivo, um peptídea deste invento é de preferência ligado a uma macromolécu-la que funciona como veiculo para o peptideo., Por exemlo, o peptídeo pode ser conjugado com uma proteína como seja a hemocia-nina de lapa ÍKLH)» Outros veículos dentro do âmbito deste invento incluem os conhecidostais como albumina sérica bovina. a Ç< í\ Λ e toxinas bacterianas» sintéticas tais como .—i isina . .Τι iog i chinas, fS~qa 1 ac tasidase, pen ic i 1 anase Os veicules pedem também ~·ργ moléculas muit,i—poli—DL—alanil-polϊ~1~~Ι isina e poli-i

Numa outra, realização deste invento, anticorpos pol ία lonais contra estes peptideos são geradas e purificadas a partir de anmais de sangue quente, como sejam suínos ou coelhos, imunizadas. Numa outra realizaç3o deste invento, anticorpos monoclanais contra estes peptideos podem ser preparados usando técnicas convencionais.

Os anticorpos policlonais são gerados por imunização de animais com os peptideos deste inventa sázinhos ou na forma conjugada. Ds peptideos podem ser administrados por vias convencionais tais como in j ecçao suisciiuâita, injecção inu amuscular s intravenosa, assim como administração transdérmica e oral. Prefere-se administrar os pepvídeos (ou seu·» conjugados) em associação com um veículo contendo um adjuvante, como seja adjuvante completo de Frsund» ε pai· vicu,ísí-issenve yi eierido usar u.m regime de dosagem em que uma administração inicial dos peptideos é seguida de uma ou roais AnjecçSes ds memória dos mesmas pepti-deos em intervalos de tempo regulaies»

Os primeiro uma anticorpos policlonais são rec« amostra de sangue a partir de uma psradas animal obtendo Minimizado após decorrer um tempo suficiente desde a imunização que perfflita a formação de anticorpos» 0 soro <que contem os anticorpos) p isolada par meias convencionâAs tziis camu cantriTugaçâo. 0 soro é separado em fracçSes contendo bulina (não-Ig) por exemplo imunoglobulma <Ig) e sem imunoglo-por meio de cromatografia uquida rápida tíe proteínas {FPi-O» Apenas contra as peptideos. Os anticorpos da fracção de Ig por SDS-^ABr.« a fracção Ig contem ani-. foram então isoladas a ft pureza dos anticorpos .1 corpos partir cíS-SÍ. fíi

isolados é superior nível do título de imunossorvent ligado 98% conforme determinado por SDS-FASE. 0 anticorpos foi testado usando um ensaio a enzima (ELISA) de acordo com processos convenc ior,a.xs >,

Os anticorpo xmursizaçSo de ratxnho.s removendo so becos dos ; fnnnoclonais foram preparados através da com um dos trfs novos peptídeos de pST,, ratinhosf preparando suspensões de iinfó--

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eitos5 fundindo estes 1infócitos com células de mieloma de ratinho9 cultivando as células e colhendo os- sobrenadantes dos hibridomas sobreviventes por despiste de anticorpos usando ELISA em fase sói ida hibridomas que produzem os anticorpos preten didos -am ainda subclanados e injectados em ratinhos, Colheram- —se ent'So as ascites dos ratinhos e purificou—se taçaa com sulfato de amónio ou numa coluna de proteína A em FPLC. Amostras de Ig assim pu

Ig por prsci.pi.““ a f i n i d ads com rificadas foram testadas contra antigénios usando tLISA para identificar anticorpos formados.

J s=.stes anticorpos (policlonais ε monoclonais) podem ser usados de duas formas para patenciar e aumentar a activitíade promotora do crescimento de pST„ Em primeiro lugar5 um anticorpo é administrado a um arriai de sangue quente juntamente com pST„ Como alternativa o animal é tratado com uma ou mais doses de um anticorpo ant.i--pST e é subssquentementa tratado com pSTL Em ambos os processos5 pode ser usado mais do que um anticorpo, ftssims o invento também contempla a administração de combinações de anticorpos anti-pST #8,, 9 e íí ou seus equivalentes antigénicos. A actividade biológica destes anticorpos foi testada em ;i removida a hipófise Cnípox),, Os ratos hipox sSo deficientes no crescimento como resultado da remoção cirúrgica das suas glândulas da pituitária,, Os ratos hipox servem ratos aos quais pituitária

COflíO um modelo útil para o c resc imenta (Srpesbeck, 2582-2590 (1987)» estudo do efeito da somatotropina no H.D» e Parlow, A» F», E n d o c r i η o1od v ?. 120? O tramento destes ratos hipoK coo uma. comçinação de pST e anticorpos contra peptídeos do presente invento aumenta o efeito promotor do crescimento de pST. A pBT usada pode ser isolada a partir de fontes naturais ou pode ser preparada usando técnicas de DMA rece-minante tais como as descritas nos Pedidos de Patente Europeia publicadas 104,920 ou 111,389» As fontes e o método de isolamento/preparação da própria pBT não fazem parte deste invento» Os anticorpos podem também ser usadas juntamente com pST recombinante em que a sequência de aminoácidos da pBT nativa foi modificada usando uma técnica como a mutagénese dirigida, desde que se mantenha a função promotora do crescimento de pST» Mer, por exemplo, o Pedido de Patente Europeia publicado A imunoreactividade dos anticorpos contra peptídeos de pST foi examinada em porcos e coelhos» Como se mostra nas Tabelas 2 b 3 abaixo, encontrou-se que a maior parte das anticorpos gerados por estes peptídeos sSo altamenté específicos para os respectivos antigénios. Nd entanto, o anticorpo contra o peptídeo #2 (aa = 35-52) e '#8 (aa - 98-11Θ) em porcos e contra o peptídeo #3 (aa - 36-44) em coelhos parecem possuir um espectro largo de imunoreactivida.de» Este efeito para os peptídeos #2 e #3 deve ser explicada pelas sobreposições das sequ'§nc.ias de aminoácidos do peptídeo #2 (aa. = 35-32) e #3 (aa = 36-44)» A reactividade cruzada do anticorpo anti-peptideo #6 (aa - 35-43) com o peptídeo #2 (aa — 35—32) em ambas as esoécies deve ser devido á mesma possibiladade. Não ê claro o motivo porque o peptídeo #8 (aa -98-110) induz anticorpo com especificidades múltiplas em porcos, mas não dá origem a anticorpos que reconhecem todos os peptídeos \> '· ; ς A y> ^ - S, ν' Vi V .- a serem testados em coelhos» é de salientar que todos os anticorpos induzidos por peptídeos reconhecem pBT, enquanto o anticorpo anti-pST n-Io é reactivo com peptídeos, exceptuando o peptídeo #2 em coelhos» Conforme esperado5 os animais normais não produzem anticorpos contra pST e seus fragmentos» 0 tratamento diário de ratos hipoK com pST restaura marcadamente a sua capacidade de crescimento» 0 efeito somatogé-nico è potenciada quando p-BT é administrado juntemente com os anticorpos contra os peptídeos pST anteriorments descritos (ver Figuras 4 e 5) » Tais anticorpos têm especificidade para epítopos de pST» Estes anticorpos não só patenciam a efeito como também aceleram a acçSo de pST (ver Figuras 7A, TB e 70»

Resultados de uraa série de experiências (apresentados nas Figuras 4 e 5) demonstram que os anticorpos de suíno contra o peptídeo #2 (aa = 35-52), #8 íaa = 98-11«), 9 íaa = 110-118) e #11 (aa = 155-163) potenciam a activitíade promotora do crescimento de pST» Mo entantos estes anticorpos nSo são eficazes quando administrados na ausência de pBT» Ainda, Ig normal de suíno (NFS), anticorpo anti-pST e anticorpos contra os peptídeos #3 (aa = 36—44), #4 (aa — 46—53) e #6 (aa — 35—43) não têm efeito estatisticamente significativo» Os estudos de dose—resposta mostrados nas Figuras 6ft» 68 e 60 indicam que a acçSo dos anticorpos contra peptídeos #8, 9 e 11 ê rápida e apresenta uma curva de dose -resposta bi-fásica»

Os anticorpos de porco promotores do crescimento incluem os que reog-^pdem às sequências de aminoácidos de -pST 35-52, 98-11®, 110-118 e 155-163» Cada um destes anticorpos não é activo quando empregue na ausência de pSTp eles necessitam de ρΒΤ para aumento da actividade» A sua acçaa é muito rápida e também apresenta uma curva de dose-resposta bi-fásica. -ν

i p.

Os anticorpos da coalho foram testados de modo semelhante· {Figuras 9 s 10) „ Apenas d anticorpo que responde á sequfncia de aminoácidos de pST 110-118 (peptídeo #9) potência significativamsnte o efeito de pST. Considerados en conjunto, os presentes resultados indicam que os anticorpos com certas· especi- para ep-I .topos de pST são capazes de aumentar a somato- pST» No entanto. as an t ic0r pos an ti - p •eatídea #2 Caa - ' \ cãcS 98-110) C # X Ί / „ ... <f SLI ei* ή t *? \ À v -ZÁ-ZÁ i-Jcí J. Ov* / de coelhos não duplicam o efeito observado com anticorpos de porco,

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Se bem que o mecanismo de acção destes anticorpos não seja claro, os requerentes sugerem vários mecanismos possíveis» Sem estar condicionado pela teoria, os mecanismos podem ser como se segues 1) prolongamento do tempo de semi—vida da. somatotrapina em circulação, 2) melhoramento da libertação de somatotropína para as células do fígado, 3) aumento da eficácia de internaicação de somatotropina por polimarizaçSo na superfície da célula alvo, 4) aumento do tempo de interacção da somatotropina com receptores por retardamento do processo de internaiizaçáo iendo-citose), 5> restrição dos efeitos da somatotropina na somatogéne--se e 6) alteração da configuração da somatotropina mais adequada è. interacção com receptores relacionadas com o crescimento»

J dades 1—4 os anticor

Os resultados dos requerentes sejam os menos prováveis pois. sugerem apesar jcaaos reagirem imunologicaments que as possibilido facto de todos ' com pS í j} sρsn3.s DOS alguns aumentam o efeito promotor do cresci ou. t r o a po i o a o que foi dite* •â t rás é proporei anticorpo indu eido contra a mo1ácu la de pST Y~ fcfâu. XÍ VQ C lj {Tc Γ,ςτ « 9 £.* Ç*.* {"íC-wt ·«· »> :n que n ao mostre crescimento» Por outro regiSas da molécula d

lado, a ligação de pST pode alterar mento ds pST. Ainda, orsada p3 lo fac to de o intac ta ser al tamen te sfei * X.D proeno tor do antx» cor c?oí5 a certas a con for mação e uâ X c * reorisntação pode f< receptcres adequados

Este pedido actuaçSo no crescimento A imunização activa de apresenta uma abordagem para melhorar a animal na indústria de produção de carne· animais com certos peptídeos- de pST que contêm epitopos antigénicos, tais como aa = 98-110, aa conduz à geração de anticorpos nos animais

J hospedeiros» Estes anticorpos ca de somatotropina endógena novos peptideos e anticorpos amplificam a E‘ pod actividade somatogéni- xógena. Como alternativa, estes » também ser usados para induzir anticorpos anti-idiotípicos por ra Tais anticorpos anti-idiotipicos io de técnicas convencionais» podem mostrar—se úteis como potenciais vacinas» ser melhor compreendido, seguem» 0 exemplo tens considerado como limitam-

Para que este invento possa são estabelecidos os exemplos que se apenas fins ilustrativos e não deve ser ta do âmbito do invento»

J EXEMPLO í 1« Preparação de Psctítieos pci

Os peptideos foram sintetizados manual mente ou. usando u.iTi sinietisador de peptideos em fase sólida. Biosearch 9600 ÍMiligen Biosearch, Burlington» MA)» Os aminoácidos ligados a um grupo protectnr N-t-butiloxicarfeonilo (Boc), nomeadamente Boc- -Ala, Boc-81i, Bac-Va1» Boc-Leu 5 Boc-Pro5 Buc-Ser ÍOBzl), Boc — i re ÍDBzl ), Boc—Asp (OBzl). Boc-Tir (2-Brz), Boc—Arg íTos), Boc—Lis í 2—Cl :·:), Boc-Asn < Xan), Í3Ul.“Uil! (Xan) e Boc-Cis < 4-MeBzl ) foram adquiridos à Advanced Chemtech, Louisville, KY, e empregues para síntese» Como suporte sólido usou-se uma resina Merrifield < 1Ύ, de divinilbenzeno-estireno interligados* Bac hem Bioscience Inc», Fhiladalphia, PA)« 0 peptideo montada foi clivado da. resina usando ácido hidrofluórico a i% de anisole a 6°C durante uma. hora» iodos as peptideos foram purificados numa coluna de filtração cor-' gel B-25 (Pharniac ia3 Piseataway, Mew lersey) e HPLC preparativa em T cS*Z>0 Γ* fcd V' *c*s r* s s. (coluna C,„= 11? acetonitrilo/água contendo 0,1% de TFA 3 usando um gradiente de Θ a 9ΘΧ de acetoni— trilo durante 45 min)» A pureza destes peptideos foi determinada por HPLc analítica e um analisador de aminaácidos» Um exempla da análise por HPLC está apresentado para o peptideo #8 íaa = 98-110) na Figura 2« 0 pica principal na Figura 2 sugere claraaente que a pureaza do peptideo #3 é superior a 95%» ft qualidade dos pepti-deos deste inventa fai ainda apoiada pela análise da composição Bffl aminoàcidos como indicado na Tabela ls

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Con_i uqacSo dos peptádeos dg oST cosa Hemoc ian ina de Lapa Buraco de Fechadura (KHL)

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Os peptádeos foram dissolvidos em tampão de fosfates salino (PBS) ÍGIBCQ, Grand Island, MY5 a misturados com KHL (Sigma Chemical Co = = St. Louis, HO) numa proporção molar aproximada de 25 para 1. Adicionou-se giutaraldeldo ( = ,57.) como agente de acoplamento e a mistura foi incubada à temperatura ambiente durante 15 a 6Θ minutos. Adicionou-se- suhsequentemente NaB-Hr) s a

*T mistura de conjugação foi extensivamente dialisada contra PBS. Os agrgados foram removidos por centrifugação a alta velocidade C i© ΘΘ0 g) e a concentração foi determinada num espsetofotémetro de UV num comprimento de onda de 2ΒΘ nm. 3« Imunização de Animais com Psolideos pSi

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Conjugados de peptídeos pST-KLH (1 mg) foram emulsiona-dos com um volume igual de adjuvante completo de Freund (CFA, SIBCO) antes da administraçãoa porcos e coelhos. Porcos femea (Duroc x Yorkshire X Hampshire), com 3-5 meses de idade, pesando 30-5© Kg, foram obtidos de colónias de cruzamento da American Cyanamid Ccmpany, Princeton, N.J» Os porcos foram injactados subcutSneamente com €>,5 mg de conjugados de peptítíeo—KLH em dois sítios diferentes na área do pescoço atrás das orelhas. Coelhos brancos fêmeas e machos New Zelando com 1©—15 semanas de idade, pesando 2-3 : kg, foram adquir idos à Skippack Farm, Skippack, r m u Os coelhos foram imunizados i de modo semelhante par 1 injecção dos conj ugados nas pernas trassi ras. A todos os animai s foram dadas repetitivamente injecçces de memória contendo os mesmos antigé-nios de quatro em quatro serranas. 4» Preparação de Anticorpo Foliclonal

Colheu-se sanou-e dos animais 7—14 dias após cada injecçSo de memória com antigánio» 0 sangue foi colhido da veia jugular do porco e da veia da orelha dos coelhos» Após coagularão , o soro foi isolada por centrifugação» Todas as amostras de a,·, /tm -i g 11 c ma, pH 8»9) e aplicado r ruma coluna preparac^. vcs de rrot&í HS H Superose HR 16/5 num sistema de FPLC (Pharmacia ·., Piscata^ays NJ) para puri .fie * v— . WV f Ig do soro» H fracção sem Ig foi eluida por

J lavagem da coluna com o tampão de ligação (Figura 3). A fracção de Ig ligada foi suhsequentemente colhida por lavagem da coluna com ácido cítrica 0,1M, pH 3. Neutralizou-se imediatamente para ρΗ 7-B com tampão Tris 2 H, pH8,2 e concentrou—se por ultrafil-traça.o (Amicon, Danvers, MA), fí fracçSa e Ig geralmente contribui com aproximadamente 30% da proteína total do soro» A pureza da fracção de Ig é superior a 98% conforme determinado por SDS-FAGE (Figura 3A) como se segue.

J ,-· f·. por csntrifuga ção G B, r B. 50% com tanipão de

As amostras de Ig foram aplicadas num gel de 1Θ% de SDS-PA8E e a slectrofores-e efsctuada a 8 jr.A durante a noite» O gel foi corado com azul Coomassie e as bandas de proteína, foram anlisadas num varridor de géis após descoloração» Os marcadores de peso molecular incluem fosforila.se B (97,4. ktíí, albumina da soro bovina (6S kd>, ovalbumina (43 kd) e a—quimotripsinogènio (25.7 kd>» Após diâlise extensiva contra PBS, o anticorpo foi dividido em amostras s guardado a -20 °C até ser usado»

Ensaio Imuno-sorvente Ligado a Encima (ELISA) em Fase Sólida

Preparou-se o antigénio em PBS e adcionou-se um μα em 100μ1 a cada cavidade de uma placa de 96 cavidades de fundo plano ε:« ροΐistireno» Aoós ser incubada

s. í ·:·. C > placa íurante uma ' hora, a fai (.-¾ V/F; % de T ween—2Θ usando um ; i r n (T:\ /nat ech Wash II, Cl ian~ [st c av i Idade 2t-;H;?ul de 2%. B3A (Sigma)» A placa foi incubada novamente durante mais uma hora. As amostras de soro foram adicionadas e testadas numa concentração final de 5% nas cavidades. A placa foi incubada durante 3Φ coelho anti-IgG de porca au saso ds cabra anti-IgG Fíab5),_, de coelho conjuoados com fosfatase alcalina íZymed Laboratories,

J

South San Francisco, CA) numa diluição de η ρχ ac a roí lavada novamante após 3Θ minutos de incubação e adicionou-se 1ΘΘ μΐ de p-nitrofenilfosfato (1 mg/ml,, Sigma) em @5iM dietanolamina, pH 1 &r,3? corno substrato para o desenvolvimento de cor, Finalmen-te, a resposta colorimétrica foi registada como densidade óptica nm. 0 processo de incubação é sempre realizado a 37 °C* 6. Imuno—reactividade de Anticorpos contra pST e seus Peptideos e c oe· i hos

Induziram—se anticorpos contra peot.ideos pST e a imuno-reactividade destes anticorpos foi

'J

Sprague—Dawley? 21 dias de idade, pesando b©—ó< adquiridas à Taconic Farm, Germantown, N,Y.)« ractor oito π pST em porcos foi Zã V aminada •, L h i pensaia h ’ !·; f». ·. i Kw Λ (ratos gr amas cada. Apá Hj S πtrega« -1© dia ,s para •ama de compu— .dos g ru .pos de : inclui dos ess todas as s;·;per.1 encias„ Q primeiro grupo consiste s.-n ratos hipo?·; não tratadas que servem como testemunha negativa, 0 outro grupo testemunha consiste em ratos hipo;·; que receberam uma dose mínima -X \"fr eficaz de de j .. Γ*4 “f UD I (5 μα) síu n r;-as pO •sitivas B 0 pST Λ. O. tempera tu.r· * UW μ\·; Ui UI C. »U ^ i uu u»c:: registado como ganho de peso durante a experiência

J s - í> V í ^ - 5 s 1 mg) foi mistu rado com ΗΠ fc© uma hora e adm inistra- . jl. 3 κ Todos os rato 5 TOrSÍTJ . tes tar suqcu tdn eamen te n a ís an imais foi contr olâOCf S , eKp eriência. Γ*£?31 içada pel a anál ise dos .siri bu.içSes a Ú 3C*3S· a usando r 2 t». do Sister a de Análise

Estatística» Os resultados dos testes de iniuno-reactividads usando anticorpos gerados ss porcos estão apresentados na 'Tabela

J

J

pi 0 σ Ρ =tfc 3fc =8= =8= =8= 3fc =tfc *0 _ Μ V0 03 03 W ÍU ω > Η ►3 3 rt t- —& σ Η -·—V X -—X «»—χ .«—'Χ -- -—X Η Φ φ Φ Ρ Ρ Ρ Ρ Ρ Ρ Ρ θη Η· 3 03 Ρ Ρ Ρ Ρ Ρ Ρ Ρ Φχ Cf oq 03 cf 3 3 3 Ρ Η Η Ι£> U Α ω L0 Η· 3 ο Η· ο. U1 Η 03 υι σι σι U1 0 Ρ Ρ 3 Ο U1 Ο 1 1 I 1 1 Vw' ω <! ο 1 1 Η 4^ (J1 U1 Ο Η Η· 03 3 Η Η Η W W #»· ÍU S ο. Ο- 3 σι !-> Ο '— — — G η> Ρ 3 3 U) C0 • « • · 3 ο. ο Ρ *· Ο ο Φ 3 t · • · 1 ο 3 ο. Μ ·· Ρ Ο Η Η- 03 ίο 03 φ Ο + 1-3 + 3 α Η + Ρι φ * 1 1 1 1 + 0 <3 r° Ο + cη Η + ι-3 Ο cf Pi > —Λ 3 3 σ Μ Ρ Μ κι Ο cf Ρ ρ. + + 1 + 1 + + + =tt cu 3= 3 σ Ο- φ ι-3 Μ 3 ο Η + 03 Η η > + οη 1 I 1 1 1 + 1 + 8= ω Ο 3

ο UI οιγ> ο ΓΌ 1

I I I I I I I I 11 + 11 + + + + + + + +

I I I I + ++ Τ3 Ηο ο ο Ο W Ο 'Ή 3 ο >-3 ω W ίο 4fc 03

=8= VD σ Μ Ρω G Η Sο + + =8= Μ Η

I

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v>\

Os resutatíos na ϊ abei a 2 indicam =: porco induzidos contra vários pepti.deos reagi an ti génios 5 e>;ceptuando o anticorpo anti-46-53)= Os anticorpos contra os peptideos #2 íae. (aa - 98-ÍÍô) reagem de forma cruzada com au.< reconheçam pST íntacta = anticorpo contra pBT não reage com qualquer um dos seus peptideos» Xg todo „

J . ív< · S f os an ticorpos de C Q\* OS respec ti vos íptideo #4 C aa •se = 35-52) e #8 tod os os antigé- pos sã o ©s pec i. f j.*~* > >:on x. r* a peptid ©OS as parco nonsai não reage de

Os anticorpos de coelho foram testados de forma semelhante quanto è. sua reactividade e os resultados estão apresenta- JUi

Tabela

J Λ d s Vj ΟZ Η I I I I 1 I I | =8=

J o ffi j σι Cd =8= O o

Cd Q 00 =8=

on d J Cd CQ a! H

Ui OctiO, cr ·=ϋ o k Φ O H =«= h a Η O S O <

O Pd Ou q ce o Cd O Q H ^r =8=

J

a! Q H > H Eh U -=¾ Cd « I O s D S H n =8= CN 8fc

B* UiQ

+ + I I I I I I + +

+ + + I

+ + I I I I I I I + + + + + + i i + i i i + + I I I I I I I + + + + + + + + + in o

+ + + I I 1

Ό + + + + I I I I I I ·· o CO f—í • Ψ cn vo CN D n H H H 'õ in 1Λ 8· «H 1 1 •H 1 1 1 1 1 o tn c LD VO co in co rH IO '<U d (D n m n CTi rH rH d d d d d d d Cr d d d d d d d i -P c H H < Ui CN r> ·=}· co co σι H 'w* (X =8= =8= =8= =8= =8= =8= =8= I •μ ιη ο + isa. r LTl O Ο ω ,— Ό !-i to C d o + c Ό + •H Cfl r •P to ·- O cu Ο !Cd P - o 00 cfl o P !Cfl -p c Ε C + 0) ra + o •H + c cfl Ε o E o P Ο O ω Ω CO c T3 s ctí α> d w Ό TJ C o •Η Λ > (0 o 1—1 (ti Ό <u ο Ρ cO o 3 P o bO -Ρ W 3 •Η (D ω 0) Eh Q J d Λ Ο Τ3 •V; χ ο " $ £ v1 ^ -.

Os peotídeos #2 (aa ~ 35-32>, #6 (aà = 35—43) =, #9 <aa — 110-118) s #11 (aa = 5-163) induzem anticorpos que reconhecem os respectivos antigénios.Os anticorpos de coelhos imunizados com com o peptídeo «6 dão rsacçSo cruzada fraca com- α peptideo #2» Qs anticorpos gerados pelo oeotítíeo #3 (aa - 3ó~44) expressam um > j espectro largo de raactividade cruzada com as peptídeas #2,, %& e ^Bb Os oeo c..i.dsos #4 (aa — 4c*—5o) e ff O (aa. — 9ó ilt·) nao induzem qualquer titulo de anticorpo detestável contra eles próprias» Se bsst que todos os anticorpos reconheçam a molécula de pST Intacta., o anticorpo induzido por pST reage apenas com pST, fracamente com o oeotideo #2, mas não com outros peotideos» 7» Aumento do Crescimento pelos Anticorpos de Suíno 0 efeito p romoto r do cr esc i men ti o de an fc ,i corpos conjun--· ente com pST foi aval i ado sm ratos h •í rurr v tt T odos DS animais a:’? tr •atad OS CCS! 5 iin de J— Z? **“ pST au. 5 μο ds pST j LU"! tamente com i mg antic orpo de suín o dur ante 1 V~7 consecu ti VOS R 0 peso tí o corpo foi medido e o efeito do anticorpo na actividade de pST foi calculado como a percentagem como a percentagem de ganho de peso relativamente às testemunhas que receberam oST sózinho. Qs

J

ionstrãm que os anticorpos contra DS #8 (aa - 98—110), #9 (aa = 110—118) & ílCfi j.1 i*_ ativamente ; o efeito ds pST. Os uindo X q normal de suíno3 antico! *"*pO anti-pST e anticorpos contra os outros peptídeas, não são signi-f i c a t. i v a men te eficazes» 0 efeito dos anticorpos contra alguns destes peptldeos foi novamente testado numa experiência separada e os resultados estão apresentados na Figura 5» Os ratos hidg·;··; receberam tratamentos com 5 p.q de pST juntamente com anticorpo contra peptídeos #8 (055 mg>5 #9 (í nig) a #11 (1 mg) durante quatro dias novamen te, ST 0X110 QS mg/dia não ratos consecutivos. Q crescimento destes ratos foi medido e» os tr‘ê's anticorpos aumentaram significativamente o accxvxdade de poT » Ig de porcos- normais numa. dose ds 1 o conseguiu»

Real icou-se um estuda de dose-resposta por tratamento de ratos hipox com várias doses do anticorpo anti-peptideo #8 juntamente· com 5 μα de pST durante quatro dias» Os dados na Figurai 6A demonstram que o efeito de pico do anticorpo an ti-pep--tideo #8 para aumentar a actividade de pST é de ®s25 mg/dia» Ele diminui em doses de Θ, 5 a 2 mg/d ia,, mas o efeito máximo torna a aparecer ás 4 mg/dia* A curva de dose·-resposta bifásica foi também observada com o anticorpo anci—peptídeos #9 e li» As doses óptimas são S»5 e 2 mg/dia para o anti-peptideo #9 e sã:o de &,25 e 1 mg/dia para o anti-peot.ídeo #11 (Figuras 6B e 60, respectiva-mente)»

Foi também realizado um estudo cinético da imunicaçao passiva cam anticorpos contra os peptideos» Ele Indicou que os ratos hipox t£m defeitos no processo normal de crescimento (ver Figuras 7AS 7B e 70? linha designada «Sem tratamento»)» No entanto, as injecçSes diárias com 5 pg de pBT durante 1Θ dias restaura marcadamente a sua capacidade de ganhar peso» Uma combinação de pBT com o anticorpo anti-peptideo #8 (ô,5 mg/dia) melhora ainda α aumento de crescimento <Figura 7A)» 0 aumento significativo pelo anticorpo torna-se detectável dois dias após o tratamento, sugerindo uma acçSo rápida» Observações semelhantes foram também obtidas com anticorpos contra peptideos- #9 e #11 (ver Figuras /8 e /U, respectivamente)»

Este efeito de aumento dos anticorpos de suino observado atrás resulta apenas em conjunção com pST? porque estes anticorpos não estimulam o crescimento- de ratos hipox quando 29

administrados sózinhos sem pS í (Figura 8)=, Canfonne antecipado, pST sózinhD promove o crescimento de ratos hipoK» S, ftutaentodo Crescimento por Anticorpos de Coelho

Prepararam-se anticorpos de coelho contra psptideos pST e testaram-se de modo semelhante em ratos hipox» Cada um dos anticorpos testados foi misturado separadamente com pST (5 ug) durante urna hora à temperatura ambiente e injectados subcutânea-mente em ratos durante quatro dias consecutivos»

Nas Figuras 9 e i€> estão apresentados os resultados de duas experiências separadas» á claro que os anticorpos de coelho contra o peptideo #9 de pST (aa = i1Θ-Ί18) potenciam significativamente o efeito de pST na promoção do crescimento» Os restantes, incluindo 'íg normal de coelho, anticorpo contra pST e anticorpos-contra outras sequências peptidicas são menos eficazes» Ainda, os anticorpos de coelho contra o peptideo #7 n-=Co afectam o crescimento dos ratos hipox quando administrados na ausência de pST (Figura 11)» Movaments pST sézinho estimula um aumento significativo do crescimento nestes animais» EXFMFLQ 2

1 - Geração de Anticorpos Monoclpnais contra Psptideos de pST

Ratinhos Ba lh/C, com 6 a 10 sem ad q u i r i d os à C ha r 1 e s Ri ver Breed in-g Laborat Estes ratinhos foram iffiuni zados com 1Θ0 pg um dos psptideos #-3, 9 ou 11, prepar •ada de com acordo com o processo do Exemplo 1, na presença de de adjuvante completo de Freund. Os animais receberam injecçSas de memória de 5Θ μα do mesmo peptideo de três em três semanas» Os seus baços foram removidos três dias após a última injecçSa de memória e prepararam-se· suspensões de - 29

3. .in fóc.itas« Estes lin tácitos foram fundidos CQÍR células de {Tsieloma de ratinho PS2/D sem h i p ο κ a n 11 n a - í os f or r i ho s s 1 -1 r a η s f g r a -se (HPRT-negativa) com 5®% de p o lie t i 1 e n og 1 .i. c ο I, suspensas em φ©1α mínimo essencial de Dulbeccc contenda -cfe»/. de soro fetal de

J vitela, 0,175 mg/ml de aminapterina, 13s6 mg/ml de hipoxantina, 3 ? SB mg/ml de timidina e 5® mg/ml de gentanucina e final mente distribuído em placas da cultura de 96 cavidades. Após cultura durante 1Φ-14 dias, os sohrenadantss dos hibridomas que sobreviveram devido ao fenóiipo HPRT-positivo dos linfócitos foram colhidos para despiste de anticorpos numa ELISA de fase sólida. Os encontrados a produzir os anticorpos pretendidos foram poste-riormente subclonados pelo processo de diluição limite. Os clones âssim seleccionados foram .injectados intraperitonealments em ratinhos Balb/C que foram préviamente injectados com pristano para a produção de ascistes contendo anticorpos. 2« Preparação de Anticorpos Monoclonais

J

Colheram—se ascites das cavidades peritoneais de ratinhos e purificou-se Ig pela técnica de precipitação com sulfato de amónio a 5β%„ Como alternativa, as amostras foram diluídas para 5Θ% com tampão de ligação (3M NaCl, i?5H glicina, pH S,9) e aplicadas numa coluna preparativa de Protein A Superose HR 16/5 num sistema de FF‘LC (Pharmacia, Piscataway, N.J.). A fracção sem Ig foi eluida da coluna com o. tampão de ligação. A Ig ligada foi subsequentemente colhida por lavagem da coluna com ácido cítrica @,i M? pH 3. A Ig ligada foi imediatamente neutralizada para pH 7—B com tampão Tris 2M, pH 8,2. 0 anticorpo preparado por ambos os processos foi extensivamente dialisado contra tampão de tostatos salino (PBB), concentrado por ultrafil-tração \Amicon, Danvers. MA), distribuído em pequenas porçSes e finalmente guardado a “2©°C até ser usado.

A imursa—reac tivida.de e a aumenta da crescimento provocado pelos anticorpos rcortaclanais desta: Exemplo toam determinadas usando os processos descritos no Exemolo 1.

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J

Claims (1)

1. .½ X REIVINDICAÇÕES .½ X

   •i p __ 7 Ç·» - Processo para a obtenção de um psptidec rizatío por se incorporar no referido peptídeo uma sequência de aminoácidas homóloga de uma fracção de somatotropina porcinaíp-ST) seieccionada de entre as seguintes sequências; ia) pST 98-3.10,= <&> pST 110-118, J (c > pST 155“ 163 ;i ou suas sequências antigenicamente equivalentes,, 2ã~ Processa de acardo com a Reivindicação 1 ,= carac-terizado por obter u:n peptídeo que tem a sequência de aminoé.cidos Tre-Asn-Ser—Leu-Ma 1 -Ferv-G 1 i-Tre—Ser-Asp-Arq-val-Tir, Tir—81 u—Lis-L.eu“Lis~-Asp--L.eu.-“G 1 u—81 u. ou Leu-Leu-Lis-Asn-Tir-Gli—Leu—Lau~Sar ou uma sua sequência antige-nicdsmsríte equivalente» 3§, Processo de acordo com a Reivindicação CcU'”cíC“ i J terizado por por se obter veículo» um eptídeo que está. ligado a um seieccionada entre 4ã-« - Anticorpo caracierisado por ser contra, um peptí— deo em que α peptídeo tem uma sequência de aminoácidos homóloga de uma. fracção da somatoiropina porcina <pST) as seguintes sequências? (a) pST 98-110 - -V -V ν s--¾¾ Ο .ν'1' .··'··· *b) pST 11^-118, / \ ζ^-τ i cr ter·| /. -~jt \ U. ι pdc i £> JJ“* À ‘*50 £ ou. suas sequências antigenicamente equivalentes,. 5â„ - Anticorpo de acordo com a Reivindicação 4, caracterizado por ser um anticorpo policlcmal. 6â„ ~ Anticorpo de acordo com a Reivindicação 4, caracterizado por ser um anticorpo monoclonal. 7ã„ - Anticorpo contra um peptírfeo de acordo com a Reivindicação 6, caracterizado por o peptldso ter & sequência, de aminoácidos T re-ftsn-Ser—Leu—Vai—Fen—BIi—T re—Ser—Arq—Vai—T ir,, Xi r—B1 u.—i— is—Leu™uis—As*q-** oau—L5X u—8 Xu ou Leu—Leu-Lis-ftsn-Tir-Bli-Leu—Leu-Ber ou uma sua sequência aniiqe-nicamente equivalente. tividade de pST, a um animal de e uma quantidade eptidao em que o qa de uma fracçlo ntre as seguintes 8ã, - Método para a potenciação da ac caracterizado por compreender a administração., sangue quente,, de uma quantidade eficaz de pBt eficaz de de utn ou maia anticorpos contra um p peptídeo tem uma sequência de aminoácidos hor-ólo de somatotropina porcina (pST) selsccionada ds s 50C| ϋ £* Π C L -£l S- 3 (a) pST 98-110, (b) pBT 110—118,

   a Reivindicação 8carscts-serem administrados j unta-icorpos serem administrados a Reivindicação S» caracte-QuSncis de emϊncáci.uqs que ou suas sequências antiqanicamente equivalentes 9§» ~ Método de acordo coo rezado por (a) um cu mais anticorpos mente coe pBTp cu (b) um cu mais ant antes da administração de pST» !€*§» ~ Método de acordo com rizadc por a pST usada ter uma se difere da sequência nativa» Lisboa» 25 de Outubro de 1990 J