PT96060A

PT96060A - Processo para a preparacao de um novo derivado sulfatado do galactano extraido de klebsiella

Info

Publication number: PT96060A
Application number: PT96060A
Authority: PT
Inventors: Pierre Smets; Rene Zalisz
Original assignee: Roussel Uclaf
Priority date: 1989-12-04
Filing date: 1990-12-03
Publication date: 1991-09-30
Also published as: HU908032D0; RU2028381C1; EP0433127A3; HUT57236A; FR2655267A1; JPH04108801A; CN1062171A; CA2031320A1; EP0433127A2; AP281A; ZA909385B; AU642933B2; KR910011878A; AP9000229A0; FR2655267B1; US5182378A; AU6766490A; OA09899A; IE904342A1

Description

Descrição referente %. patente de invenção de ROUSSEL-UCLAF, sociedade anónima francesa, industrial e comercial, com sede em 55, Bd des Invalides, 75007 Paris, França, (inventores: Pierre Smets e René 2ãlisz, residentes na França), para "PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE UM NOVO DERIVADO SULFATADO DO GA1A0M0 EXTRAÍDO DE KLEBSIBILA".

Descrição A presente invenção refere-se a um processo para preparar um derivado do galactano extraído de Klebsiella. A Patente Francesa FR 2574429 descreve acil-gli-canos extraídos de Klebsiella constituídos por aproximada-mente 80$ de oses neutras, 20$ de lípidos, menos de 2$ de proteínas, possuindo um peso molecular de aproximadamente 12500 e contendo uma cadeia de galactoses ligadas em 1-3. Possuem propriedades anti-alérgicas e imuno-moduladoras. 0 pedido de Patente Francês n2 8909505 registado em 11 de julho de 1989, e 0 pedido de Patente Europeu nS 904019874 descrevem galactano de baixo peso molecular extraído de Kleb-siella, 0 seu processo de preparação e a sua aplicação em medicamentos, nomeadamente medicamentos imuno-estimulantes, A presente invenção refere-se a um processo para preparar um novo derivado sulfatado do galactano extraído de Klebsiella, a partir do galactano obtido anteriormente. Esta invenção tem também como objectivo um processo para preparar um novo derivado sulfatado de galactano extraído de Klebsiella, constituído, essencialmente, por oses neutras sulfatadas numa proporção de 20 a 90$ de hidroxilos. - 1 - A composição em oses neutras é determinada por cromatografia em fase gasosa depois de metanolise de acordo com o método de METTA J. Chromato. (1972) 69., p. 291 ou com o método de KAMEELIIG- (Biochem J. (1975), 1£1, p. 491).

Esta invenção tem, mais particulaimente, por ob-jectivo um processo para preparar um derivado sulfatado do galactano constituído, essencialmente, por oses neutras sulfatadas numa proporção 40 a 80% em hidroxilos.

Entre os produtos preparados segundo o processo da presente invenção, | preferido o derivado sulfatado do galactano constituído essencialmente por oses neutras sul-i fatadas numa proporção de 50 a 70% em hidroxilos. 0 derivado sulfatado do galactano obtido de acor-do com o processo desta invenção é constituído por uma cadeia linear de galactose em 1-3 e possui um peso molecular compreendido entre 5000 e 12000 e, de preferência, próximo de 7000.

Estes polissacarídeos estão isentos de lípidos e de proteínas. A composição em galactose é determinada por cromatografia em fase gasosa depois de redução e metanolise.

Os lípidos são doseados por cromatografia em fase gasosa depois de metanolise.

As proteínas são doseadas pelo método de 10WRY (J.B.C. (1951), 191, P· 265-273).

Asequência de cadeias de galactose é determinada pelos métodos clássicos de metilação, análise por cromatografia em fase gasosa ligada à espectrometria de massa, oxidação periódica, BMH de e 15C. Os resultados mostram que o galactano é formado por uma cadeia linear de radicais de galactose ligados por ligaçóes alfa (1-3) 50% e beta (1-3) 50%, com um grupo de repetição constituído por 8 radicais galacto-piranose num radical galacto-furanose. 0 derivado sulfatado do galactano obtido de acordo com os processos desta invenção pode preparar-se a partir de diferentes espécies de Klebsiella. É preferido, em ( particular, o derivado sulfatado do galactano proveniente de Klebsiella pneumonia e nomeadamente da espécie deposita-

I da no Institut Pasteur em Paris ou Colleetion Nationale de Culturè de lieroorganismes (CIC1) sob os números 52145 e 1-163 e na National Gulture Type Colleetion sob o número 5055. 0 processo desta invenção I caracterizado por se tratar um acil-glicano extraído de Klebsiella, essencialmente constituído por aproximadamente 80$ de oses neutras, 20$ de lípidos, menos de 2$ de proteínas'e possuindo um peso molecular de aproximadamente 12500, por hidrólise ácida suave, cromatografia de elevada capacidade sobre permutado-res de aniões, recuperar a fraeção não retida, se filtrar sobre gel, se recuperar a fraeção contendo o galactano de peso molecular compreendido entre 4000 e 10000, processo este caracterizado por se sulfatar a fraeção de galactano assim obtida, se purificar por diálise e se isolar o derivado sulfatado do galactano assim obtido.

J

0 acil-glicano extraído de ELebsiella de partida pode obter-se a partir de um extracto bacteriano hidrosso-lúvel de Klebsiella, por aquecimento e depois fraccionamen-to cromatográfico. Tais preparaçães foram já descritas no pedido de Patente Prançês PR 2574429 e no pedido de Patente Alemão DE 3543267. ; 0 extracto bacteriano hidrossolúvel de Klebsiella j prepara-se de acordo com os processos descritos nas Patentes PR 2490496 e EP 49182.

Para as condições preferidas, o processo desta invenção desenvolve-se como se segue; - A hidrólise acida suave do acil-glicano efectua se numa solução de ácido acético a 1$, por aquecimento a 100°C durante 90 minutos, eliminação do precipitado formado que contem a fraeção lipidica, por centrifugação, por exemplo, durante 30 minutos a 2000 R. Recolha do sobrenadante que contém o galactano e que posteriormente pode ser liofi- • lizado. ê . - 0 galactano é depois separado do sobrenadante - 3 - por fraccionamento cromatográfico. Recolhe-se a fracção constituída por oses neutra. - 0 fraccionamento efectua-se por cromatografia sobre permutadores de anibes, de preferência, por cromatogra fia de elevada capacidade, por exemplo, sobre Hagnum 9SAX Whatman. A cromatografia de elevada capacidade sobre permutadores de anibes consiste em separar o galactano por elui-ção com água. Determina-se a fracção que interessa, constituída por oses neutras, por detecção espectrofotometrica a 200 nm e 492 nm depois de coloração no ensaio de fenol-áci-do sulfúrico, de acordo com o método de DUBOIS (Anal. Chem. (1956) 28, p. 550). - Submete-se a referida fracção, constituída por oses neutras, a uma filtração sobre gel o que permite a recuperação da fracção contendo galactano de peso molecular compreendido entre 4000 e 10000. A filtração sobre gel efeç tua-se sobre suportes comercializados, por exemplo sobre Sephadex ou Biogel agarose; utiliza-se, de preferência, Biogel A-1,5 1. - A sulfatação da fracção de galactano efectua-se por meio de um ácido sulfónico tal como ácido cloro-sulfóni co no meio de uma amina tal como piridina ou por meio de um sulfonato tal como o ϊΓ-sulfonato de piperidina, funcionando por aquecimento do meio reaccional. A diálise efectua-se com água destilada. 0 derivado sulfatado do galactano obtido de acordo com o processo da presente invenção, possui propriedades farmacológicas muito interessantes; possui nomeadamente pro priedades imuno estimulantes importantes assim como uma boa tolerância. Possui ainda a propriedade de estimular a produção de 11^ e de ffl! ao nível dos macrofagor e sobretudo de estimular a geração de radicais livres (polinucle es). Permite igualmente o efeito sinérgico do GM-CSF (Oranulomo-nocito-Golony Stimulating Pactor).

Nota-se igualmente uma actividade notável anti--elastase, tanto contra a elastase pancreática bovina como contra a elastase leucocitária humana. Estes produtos apre- sentam igualmente uma actividade anti-coagulante.

Estas propriedades são ilustradas adiante na parte experimental.

Estas propriedades justificam a utilização do derivado sulfatado do galactano tal como atrás definido como medicamento.

Estes medicamentos podem, por exemplo, utilizar--se no tratamento ou na prevenção de imuno-depressSes, de doenças infecciosas causadas por bactérias ou vírus, e, em particular, pelo vírus da Sida no tratamento de doenças de parasitas, de tóxi-infecç9es, no tratamento de infecçOes pós-hospitalares, pós-cirúrgicas e de alergias de qualquer origem. Estes medicamentos podem igualmente utilizar-se, com vantagem, no tratamento de enxertos de medula óssea e de aplasias medulares pós-quimioterápicas. A dose normal varia de acordo com o produto utilizado, o indivíduo tratado, a afecção em causa, e pode, por exemplo, ser de 0,5 a 5 mg por dia por via oral.

Estes medicamentos podem igualmente utilizar-se por exemplo, em pneumologia, no tratamento de efisema, de pneumononias, bronquites, perturbações causadas pelo tabagismo ou pela poluição atmosférica, em cardiologia no tratamento de artites, assim como, por exemplo, em dermatologia no tratamento de psoríases, de queimaduras, de bolhas e do envelhecimento da pele, em gastroenterologia, no tratamento de pancreatites agudas, e, de uma forma geral, no tratamento de todas as afecções que ponham em causa o mau funcionamento da elastase, assim como, no tratamento de doenças trmbo-em-jbélicas. A dose normal, varia de acordo com o produto utilizado, o indivíduo tratado e a afecção em causa, e pode, por exemplo, ser de 1 a 500 mg, por dia, por via intravenosa, no homem. 0 derivado sulfatado do galactano extraído de Eleb siella tal como atrás definido pode utilizar-se para preparar composições farmacêuticas que o contêm como ingrediente , activo.

Para medicamentos, o derivado sulfatado do galac- ΐειηο extraído de-Klebsiella, tal como atrás definido, pode ser incorporado em composições farmacêuticas destinadas a via digestiva, parentérica ou-local.

As composições farmacêuticas correspondentes podem ser, por exemplo, sólidas ou líquidas e apresentarem-se sob as formas farmacêuticas normalmente utilizadas em medicina como, por exemplo, comprimidos, simples ou em drageias, granulados, soluções, xaropes, supositórios, preparações injectáveis liofilizadas ou não, óvulos, cremes, pomadas, locções, gotas, colírios e aerosóisj preparam-se de acordo com os métodos habituais. 0 ou os ingredientes activos podem ser incorporados em excipientes normalmente utilizados nestas composições farmacêuticas, tais como, talco, goma arábica, lactose, amido, estearato de magnésio, manteiga de cacau, veículos aquosos ou não, gorduras de origem animal ou vegetal, derivados parafínicos, glicóis, diversos agentes espumantes, dispersantes ou emulsionantes, e conservantes .

Apresentam-se em seguida, a título não limitativo exemplos do processo desta invenção.

Exemplo i; Derivado sulfatado do galactano extraído de Klebsiella. A piridina arrefecida a 0°C em gelo, adicionou-se um ácido cl oro-sul fónico (0,4 cm·^). Depois de voltar à temperatura ambiente, adicionou-se o galactano extraído de

Klebsiella pneumoniae (25 mg) em suspensão na piridina (24 3 o cnr). Aqueceu-se a mistura durante 5 horas a 80 C, arrefeceu-se à temperatura ambiente, dilui-se com água destilada (50 cm·^) e finalmente tratou-se com uma solução 2,5 M de hidróxido de sódio (5 cm^). Concentrou-se, sob vácuo, a solução obtida, fez-se a diálise com água destilada durante 3 dias, congelou-se e liofilizou-se.

Obteve-se o derivado sulfatado de galactano extraído de Klebsiella.

No produto obtido os hidroxilos são sulfatados

numa proporção de 60%« 0 peso molecular é próximo de 7000. Preparação do galactano extraído de Hebsiella pneumoniae

Solubilizaram-se 334 mg de acil-glicanos de Hebs iella obtido como indicado no exemplo 1 do pedido de Patente Françês nS 2574429 a partir da espécie depositada no Institut Pasteur sob o n2 1-163) em 33,4 cm·5 de solução de ácido acético a 1%, e aqueceu-se a 100°C durante 90 minutos. Depois de arrefecimento, separou-se o precipitado que continha a fracção lipídica por centrifugação a 2000 R durante 30 minutos, liofilizou-se o sobrenadante e isolaram-se 200 mg do resíduo que se redissolveu em 4 cm·5 de água. Fez-se a cromatografia, por fracçães de 1 cm , sobre uma coluna de cromatografia de elevada capacidade de permutador de aniães Whatman Magnum 9 SAX (9,4 cm *50 cm), luida por água durante 30 minutos, com um caudal de 2 cm3/minuto com detecção a 200 nm. Isolou-se a fracção que continha as oses neutras determinadas a 492 nm, depois do ensaio ao fenol-sulfúrico. Isolaram-se por liofilização 55 mg de fracção neutra. Isolamento do galactano

Dissolveu-se o liofilisado anterior num tampão de água-ácido acético-piridina (973-7-20), e depois submeteu--se a uma filtração sobre gel por cromatografia em coluna de Biogel A.1.5M (2 cms1.5m), equilibrada com o mesmo tampão. Recolheu-se a fracção detectada pelo ensaio de fenol--sulfúrico. Esterilizou-se por filtração sobre membrana de 0,22 micra, e depois liofilizou-se e obtiveram-se 22 mg do galactano pretendido.

Exemplo 2: Derivado sulfatado do galactano extraído de Kleb-siella A piridina arrefecida a 0°C em gelo, adicionou-se ácido cloro-sul fónico (4 cm-5). Depois de voltar á temperatura ambiente, adicionou-se o galactano extraído de KLebsielle pneumoniae (preparado como indicado na preparação dada no exemplo 1) (85 mg), em suspensão na piridina (24 cm3). Aque-• ceu-se a mistura durante 2 horas a 80°C, arrefeceu-se a . temperatura ambiente e diluiu-se com água destilada (30 cm3) - 7 - 9

levou-se o pH da mistura de reacção a 6 por adição de uma solução de hidroxido de sodio 2,5 M. Fez-se a diálise, com agua. destilada, da solução obtida, congelou—se e liofilizou -se. Obtiveram-se assim 32 mg do derivado sulfatado de ga-lactano extraído de Klebsiella pneumoniae.

Exemplo 5:

Prepararam-se comprimidos com a fórmula: - Produto do exemplo 1............................ 1 mg í - Excipiente q.b. para um comprimido acabado com.. 100 mg (composição do excipiente: lactose, amido, talco, estearato de magnésio).

Exemplo 4;

Prepararam-se comprimidos com a fórmula: - Produto do exemplo 2............................ 1 mg - Excipiente q.b. para um comprimido acabado com.. 100 mg (composição do excipiente: lactose, amido, talco, estearato de magnésio).

Exemplo 5:

Prepararam-se aerosóis que libertavam doses con tendo cada uma: - Produto do exemplo 1......................... 0,5 mg - Emulsionante................................. 0,15 mg I - Propulsor.................................... 50,00 mg

Exemplo 6;

Preparou-se um creme com a fórmula: -Produto do exemplo 2.............................. 1 mg -Excipiente: álcool 2-octil-dodecanol, álcool cetostearili-co, sulfato de sódio, parathidroxi-benzoato-de metilo e de propilo, água pura.......................................... 10 mg.

Estudo bioquímico:

Determinou-se a actividade do derivado sulfatado 8

de galactano extraído de Iílebsiella por medição da inibi-ção de sincítia (G-ruters et al Nature Yol 330 pág. 74-77, 5» Novembro 1987) e pela determinação da actividade pro— tectora exercida relativamente a determinadas culturas celulares . A) Preparação e titulação do vírus 1- Preparação do vírus. -Sobrenadante de células H 9 Ili-g (infectadas de forma crónica pelo ΗΓΥ), cultivadas durante 48 horas a partir de 10^ células/cm·^. -Sobrenadante centrifugado, filtrado a 0,45 micromoles, em aliquotas e armazenando a -80°C. 22 Titulação do vírus. -Transcriptase inversa (RT).

Sobre o sobrenadante fresco 4,0x10 cpm/cnr.

Depois de descongelação 4,5xl06 cpm/cm^.

Ensaio MT4/MTT-têcnicai 100 microlitros de diluiçSes, em série, de vírus numa placa de micro-titulação. -Adição de 100 microlitros de suspensão celular contendo 5-10^ células MT4. -Cultura de 7 dias a 37°C, 5% C02· -Adição do MTT (sal de tetrazólio, colorante de viabilidade) . -Incubação durante 4 horas a 37°C. -Paragem da reacção por adição de uma solução de ácido clorídrico em isopropano. -Leitura da densidade óptica (D) a 540 nm (depois de dissolução dos cristais).

Resultados

Determina-se a relação entre a dendidade óptica de células infectadas (citotoxidade virai = DO fraca) e a densidade óptica das células infectadas (viabilidade e DO máximas) em função da diluição de vírus (média sobre 3 tubos) .

Quanto mais as células estão infectadas mais esta - 9 - relação é fraca. B) Actividade protectora do derivado sulfatado de galactano extraído de Klebsiella 1. Inibição de Sincitia

Efectua-se uma co-cultura de células H 9 III (infectadas de forma crónica, 10^ cllulas/cm^) com as células SUP TI (não infectadas: 2x10^ células/cm-5).

Formam-se sincitia que se contam ao microscópio. Cada tipo de células é ou não pré-incubado com o produto estudado, durante uma noite a 37°C.

Quando não há pré-incubação, o produto estudado adiciona-se as células no momento em que se efectua a cultura.

Sempre que haja uma inibição da formação de sincitia nãs células tratadas relativamente as células de controlo, o produto estudado é protector.

Os resultados obtidos apresentam-se adiante: QUADRO 1 co-cultura com o produto estudado sem incubação prévia

Produto Exemplo 1 em microgramas /cm ^ Percentagem ensaio 12 1 de inibição ensaio ff2 2 1 0 10 10 42 17 100 100 100 QUADRO 2 ,j pré-incubação com o produto estudado durante 1 noite a 27°C antes da co-cultura - 10 -

Produto Exemplo 1 em micogra-mas /cm Percentagem célula H 9 III de inibição célula Sup Ti 1 17 23 10 23 27 100 100 100

; 2. Ensaio MT4/MTT ! Utilizaram-se células MT4 a 10^ células/cm·^. Di- luiram-se a metade com ou sem produto estudado, em concentrações diferentes. Introduziram-se- sobre uma placa de micro-titulação 100 microlitros de vírus HIV em diferentes diluições e 100 microlitros de suspensão celular pré-trata-da«

Incubaram-se a 37°0 durante 7 dias, adicionou-se o MTT e efectuou-se uma leitura no espectrofotómetro.

Determinou-se a percentagem de inibição da infecç das células MT4.

Os resultados obtidos apresentam-se adiante: j QUADRO 3

Produto Percentagem de inibição Exemplo 1 em microgramas/cm-^ 1 74 10 99 100 84

3- Ensaio H9

Utilizaram-se células H9 que se trataram com po-libreno, lavaram-se e recuperaram-se em 100 microlitros do meio, com ou sem o produto estudado a diferentes concentrações. Incubaram-se durante 2 horas a 37°C, adicionaram--se 100 microlitros de vírus HIV a 1/10, mantiveram-se 1 hora a 37°C e lavaram-se.

Recuperaram-se as células em 1 cm·^ do meio com ou sem o produto estudado, dividiram-se em 2 tubos, 500 microlitros por tubo e 2x10^ células por tubo.

Em J + 4 adicionaram-se 500 microlitros de meio de cultura com ou sem o produto estudado.

Em J +8, substituiu-se a porção do sobrenadante por meio novo.

Em J +11, efeetuou-se uma dosagem de transcri-Ptase inversa sobre o sobrenadante e uma determinação de imuno-fluorescência sobre as células.

Os resultados obtidos apresentam-se adiante; QUADRO 4

Transcriptase Inversa Imuno-fluorescência cpm/cm·^ X 104 Ío de inibição Ío de células fluorescentes fo de inibição Células não infectadas 1,68 0 Células infectadas 291 51 Rroduto exemplo 1 (concentração em microgramas/cm3 - 12

Claims

1 6,42 76 3 94 10 1,16 100 0 100 100 1,12 100 0 100 Os resultados obtidos nos diferentes ensaios mostram que o produto estudado inibe de forma muito importante a formação de sincitia e que protege a célula estudada da infecção causada pelo vírus HIY. Estudo da actividade anti-élastase. Determinou-se a actividade anti-élastase por dosagem espectrofotométrica relativa a llastase leucocitária humana (por uma técnica análoga à descrita por Boudier et al. Clin. Chim. Acta. 132, 309-315 (1983). Produto do exemplo Elastase leucocitária humana 1 Ei : 1 x 10~8M J REIVINDICAÇÕES - lê - frocesso para preparar um novo derivado sulfatado do galactano extraído de Klebsiella, que é essencialmente constituído por oses neutras sulfatadas numa proporção de 20 a 90% dos hidroxilos, caracterizado por se tratar um acil-glicano extraído de Klebsiella, essencialmente constituído por cerca de 80% de oses neutras, 20% de lípidos, menos de 2% de proteínas e possuindo um peso molecular de cerca de 12500, por hidrólise ácida suave, cromatografia de . elevado rendimento sobre um permutador de anibes, por se - 13 -

* recuperar a fracção não retida, se submeter a uma filtração sobre gel, por se recuperar a fracção contendo o galactano de peso molecular compreendido entre 4000 e 10000, por se sulfatar a fracção de galactano assim obtido, se purificar por diálise e se isolar o derivado sulfatado do galactano assim obtido. - 2* - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a sulfatação da fracção de galactano ser efec-tuada por meio de um ácido sulfónico tal como o ácido cloro -sulfonico no seio de uma amina como a piridina ou por meio de um sulfonato como o N-sulfonato de piperidina efectuando o aquecimento do meio de reacção e a por se efectuar a diálise contra água destilada. — — Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por se sulfatar 40 a 80$ dos hidroxilos. - 4& - Processo de acordo com as reivindicações 1, 2 ou 3, caracterizado por se sulfatar 50 a 70$ dos hidroxilos. - - Processo de acordo com qualquer das reivindica-çSes de 1 a 4, caracterizado por se sulfatar um galactano escolhido de tal maneira que se obtém um derivado sulfatado do galactano constituído por uma cadeia linear de galactano de 1 a 3 e um peso molecular entre 5000 e 12000. - 6* - 14 - Processo de acordo com qualquer das reivindicações de 1 a 5» caracterizado por se utilizar como composto de partida um acil-glicano extraído de Klebsiella pneumo-niae. - 7& - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por se utilizar como composto de partida um acil--glicano proveniente da estirpe depositada no Instituto Pasteur em Paris ou na Collection Nationale de Culture de Microorganismes (CNCM) sob os números 52145 e 1-165 e na National Culture Type Collection sob o ns 5055. - 8i - Processo para a preparação de eomposiçOes farmacêuticas, caracterizado por se incorporar como ingrediente activo pelo menos um dos derivados sulfatados do galactano tal como definido na reivindicação 1 sob a forma destinada a essa utilização. A requerente reivindica a prioridade do pedido françês apresentado em 4 de Dezembro de 1989, sob o n^. 89-15972. Lisboa, 31 de Dezembro de 1990

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