PT96207A - Processo de preparacao de conjugados de aminoacidos ou poliaminoacidos e de uma fraccao de corynebacterium granulosum iv-86 e de composicoes farmaceuticas que os contem - Google Patents

Description

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Arte anterior é conhecido que certos microorganismos tais corno fiicobac-terium bovis. Corvnebacterium parvum. Corvnebacterium granulosum e monocitogenios Listeria são capazes de estimularem a funcionalidade do sistema imuno-competente normal ou deprimido. É também conhecido que a dita propriedade é determinada por compostos macromoleculares tais como peptido—glicanos e/ou glico-proteinas que constituem a membrana de microorganismos.

Foram isoladas várias fracçSes bacterianas consistindo em macromoleculas de tipo similar com actividade que se sohrep&e qualitativamente, mesmo que tenham uma característica fisico—química, diferente tal como a solubilidade, ou com um diferente grau de purificação.

De particular interesse é a fracção insolúvel, conhecida como P 40, obtida a partir de Corvnebacterium granulosum (P. Lallouette, B. Bizzini e R. Rynaud (NIB. li. 1975, 25, 13)).

Esta fracção demonstra uma larga gama de actividades biológicas* estimula o sistema reticulo-endotelial, aumenta a resistência a infecçffes bacterianas no ratinho, facilita a produção de anticorpos contra antigénios -solúveis e insolúveis e aumenta a resistência a vários tumores experimentais no ratinho (B. Bizzini, E.H. Relyveld e E. Henocq, Vaccine, 1985. 3, 153).

Esta fracção também demonstra efeitos sinérgicos na actividade de drogas antivirais íii. Fattal-Sermsn e B. Bizzini, Biomed and Pharmacotherap., 1988, 42, 79) potência os efeitos da vacina antigripe (li. Fattal—Serman, A. Berman e B. Bizzini, Biomed and Pharmacotherap., 1988, 42, 73), induz a produção de interferona (li. Kita, li. Yamajii, E.H. Relyverd, B. Bizzini e T. Kishide em Advances in Immunomodulation, Eds. B. Bizzini e E. Bonmasser, 1988, 153, Pythagora Press (Roma))- Não obstante esta actividade muito importante, a dita fracção demonstrou actividade apenas através de administração 71 904 TER.23 -3-

parentérica.

No entanto, ea terapia envolvendo drogas com actividade de imuno-modulação , a validade de uma forma farmacêutica para administração oral é de importância básica, visto que a dita terapia é dirigida a acontecimentos patológicos degenerativos recorrentes que requerem longos períodos da administração e é usada em lactentes e crianças.

Sumário do invento

Verificamos agora que derivados semi-sintáticos de imuno-mo— duladores de origem bacteriana podem ser administrados tanto parentéricamente como oralmente para proporcionar elevada actividade de imune-modulação. Os ditos derivados semi-sintéticos são obtidos por conjugação da fracção BV 88, isolada a partir da estirpe do Corvnebacterium aranulosum IV-86, ATCC 53966, com aminoácidos ou com poliaminoácidos, depois da activação da dita fracção com glutaraldeído ou da conjugação com carbodiimida.

Descrição detalhada do invento

As caracteristicas e vantagens dos derivados ssmjlsintéticos de imuno—moduladores de origem bacteriana de acordo com o presente invento e o processo para a sua preparação, são adicionalmente ilustrados no decurso da descrição detalhada apresentada a seguir.

Os ditos derivados são preparados pelos passos seguintess a) Isolamento a partir de material patológico de uma estirpe de Corvnebacterium aranulosum IV—86 contendo fracçãss com actividade de imuno—modulação, depositada na ATCC; com o NQ 539665 b) isolamento a partir da dita estirpe de uma fracção insolúvel que manifesta actividade de imuno—modulação e antitumoral quando administrada parentéricamente e conhecida como BVCSB? c) Conjugação da fracção BV 88 com aminoácidos ou poliaminoácidos depois de activação com glutaraldeído ou conjugação com carbodi— imida.

Deste modo são obtidos derivados semi—sintéticos com Λ' Jt

71 904 TER.23 —4— propriedades de imuna—modulação que são adequados para administração parentérica e para administração oral. A estirpe de Corvnebacterium oranulosum. ATCC 53966 tem as seguintes característicass bastonetes anaeróbicos, não esporogénica, gram—positiva; crescimento rápido em meios de cultura usuais; a adição de soro ao meio resulta em maior crescimento; produz colónias regulares em placas de ágar—sangue; não produz indolo;

J não reduz nitratos; não gera H2S; produz catálise; fermenta glucose mas não o manitol ou a lactose; produz estimulação não específica do sistema reticuteendotelial. A fracção BV SS é caracterizada quimicamente através dos seguintes métodos: — Análise da degradação enzimática da fracção: A fracção BV1 SS é assimilada por cimotripsina ou tripsina a 1% numa solução 0,1 li de NH4CO3H (pH 8). — Teste de solubilízação por acção química:

J O teste de solubilização é conduzido com uma mistura de NaOH Ο,ΙΝ/ácido fórmico a 9%/guanidina 6 H e Triton X-100. — Determinação da composição em aminoácidoss A análise foi conduzida em hidrolisato ácido usando um analisador de aminoácidos. A metionina e a cisteína são determinadas por oxidação per— fórmica (S. Moore, J. Biol. Chem., 1963, 238, 235) □ ácido diaminopimélico (DMP) foi determinado por análise automática por subtracçãc da metionina do teor em DAP + metionina. G ácido murámico foi determinado pelo sistema Spackman (Anal. Chem., 1958, 30, 1190). O triptofano foi determinado pelo método colariaátrico de

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Gaitande e Dovey (Biochem. J., 1970, 117, 907). - Determinação e identificação de glúcidos:

Os açucares neutros - foram determinadas pelo método da antrona (P.Albesheim e col.- Carbohydrate Res. 1967, 5, 340) e as hexosaminas pelo método de Elson e Morgan (Biochem» J,, 1933, 27, 1024). 0s resultados das análises químicas da fracção BV 88 são mostrados na Tabela 1. TABELA 1

Composição química da fracção BV 88 q/100 g (peso seco)

Aminoácido

HIS LYS ARG ASP THR SER GLU PR0 ALA GLY CYS VAL MET ILEU LEU TYR PHE TRY 1,30-1,85 2,39-3,31 2,95-3,15 3.0 -4,05 1,75-2,15 1,11—1,49 5.94- 6,51 0,89-1,16 3,04-3,52 3,02-3,47 0,27-0,34 2,64-3?03 0,96-1?27 1,52-1»97 2.95- 3»14 0,88-0, 2.0 -2?30 1,0 -l?17 2,51-3,74 12,12-14,21 9,32-10,44 8,92-11,74 0,5 -1

Acido diaminopimélico Açucares neutros Hexosaminas Acido murámico Cinza

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Em relação è, actividade biológica da fracção BV 88, foi efectuada unta avaliação da actividade do sistema retículo—endo— telial.

Este teste foi efectuado em ratinhos Suiços usando o método descrito por Halpern e col. (Ann. Inst. Pasteur, 1951, 80, 582\ 3. Reticuloendoth. Soe., 1964, 1, 77), sendo o indice fagocitico K/K0 calculado pelo método de Halpern e col. (Ann. Inst. Pasteur, 1951, 80, 5S2). A substância foi injectada no dia 0 e a eliminação das partículas de carbono colóidal foi monitorizada durante seis dias depois da administração.

Os resultados são apresentados na Tabela 2. TABELA 2

Efeito da fraccão BV 88 no índice fagocitico K/K„

Tratamento Dose K/KD

Controlos - 1 BV 88 250 pg/ratinho (determinado no 39 dia) 1,48 BV 38 250 pg/ratinho (determinado no 69 dia) 2,94

Para preparar os derivados semi—sintéticos de- acordo com o presente invento, fas-se reagir uma suspensão adequadamen te activada da fraeção BV 88 para conjugação com um aminoácido ou poliaminoácido. A fraeção BV SS pode ser activada por tratamento com um dialdeído CH0-(Ch*2)n-CHO, no qual n está entre 2 e 4, numa fase que precede a reacção de conjugação, ou por tratamento com carbodiimida na mistura de BV 88 e aminoácido, preparada para a reacção de conjugação. 0 dialdeído usado pode ser, por exemplo, glutaraldeído.

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Se a fracção BV 88 é activada com um dialdeldo, é preparada uma suspensão de BV SS em tampão de fosfato isotónico ÍPBS) de pH 7,4s tendo um teor em BV 88 entre 1 a 20 mg/ml, e é adicionada uma solução de dialdeldo no mesma tampão. A reacção de activação é conduzida a uma temperatura entre 4 e 37°C durante um período de tempo de 15 minutos a 4 horas. AIternativamente a activação de BV 88 com dialdeldo pode ser efectuada por tratamento da dita suspensão de BV S8 com uma solução de polifenilalanina-polilisina antes das operaçSes acima mencionadas» A fracção BV 88 activada com dialdeldo é usada para a reacção de conjugação com aminoácidos diaminomonocarboxllicos ou com poliaminoãcidos.

Esta reacção é conduzida tratando uma suspensão de BV 88 activada, em PBS, contendo entre 1 e 20 mg de BV 88 com uma solução de aminoácido, com uma concentração entre 1 e 20 mg/ml, ou com um poliaminoácido em forma de pó, elevando depois o pH para 9,5 com NaHC03/Na2C03 0,5 M, fazendo reagir durante 1-3 horas a uma temperatura entre 4 e 37°C s depois durante 12 horas a uma temperatura menor que 10° C.

Deste modo é obtido o derivado semi-sintático no qual a razão ponderai do aminoácido em relação à fracção BV 88 está entre 0,05:1 e 1,5:1 ou a razão ponderai do poliaminoácido em relação á fracção BV 88 está entre 0,001:1 e 0,05:1.

Os aminoácidos a serem usados no processo descrito são a lisina, a arginina, a glutamina e asparagina e os poliaminoãcidos são a polilisina, a poliarginina e a polilisina—arginina, com peso molecular entre 1000 e 15000 daltons.

Se a fracção BV 88 ê activada por conjugação com carbodiimi— da, adiciona—se uma solução de 0,1—10 mg/ml de um aminoácido em tampão de acetato de sódio 0,1 !i, de pH 5, a uma suspensão de 1--20 mg/ml da fracção BV 88, no mesmo tampão, e adiciona-se, â mistura obtida, uma solução de carbodiimida» A reacção de

71 904 TER.23 -f~ conjugação com o aminaácido é condiz ida à temperatura ambiente enquanto se mantém pH 5 por correcção com HC1 0,1 N.

Neste caso a razão ponderai do aminoácido em relação à fracção BV S8 está entre 0,05:1 e 0,3:1. Os aminoácidos a serem usados com este tipo de activação são os ácidos monoaminomonocar-boxilicos e monoaminodicarboxílicos tais como a leucina e o ácido aspártico. O processo para a preparação dos derivados semi—sintéticos da fracção BV SS de acordo com o presente invento é ilustrada pelos exemplos seguintes. EXEMPLO 1

Preparação do derivado 1/BV

Suspendem-se 10 mg de BV SB em 2 ml de tampão PBS. Adicionam-se 2 ml de uma solução de glutaraldeído a 2%, no mesmo tampão, e a mistura é agitada durante 2 horas a 37®C. A fracção BV SS activada deste modo (BV SS—Glutã) é recolhida em centrífuga e lavada tr?s vezes por centrifugação em PBS, após o que é preparada uma suspensão de BV SS-Gluta em PBS a uma concentração de 10 mg/ml (suspensão A).

Separadamente, é preparada uma solução de hidrocloreto de L-lisina em solução fisiológica, com uma concentração em L—lisina de 10 mg/ml e o pH é ajustado a 7 com MaOH IN (Solução B). A reacção de conjugação é conduzida misturando 1 volume de solução B com 1 volume de solução A, adicionando 0,1 volumes de tampão NaHC03/Na2C03 0.5 M (pH 9,5) e deixando a mistura reagir durante 2 horas a 37®C enquanto se agita e, depois, durante 12 horas a 4°C.

Depois da reacção o derivado é sedimentado por centrifugação e lavado ' duas vezes por ressuspensão em solução fisiológica e centrifugação. 0 produto obtido deste modo é rsssuspenso em solução fisiológica a uma concentração de 10 mg/ml e, depois, liofili-zado. 71 904 TER.23

Deste modo, obtém-se o derivado semi-sintético da fracção BV 88 com Usina, designado 1/BV, com uma raslo ponderai de aminoácido em relação à fracção BV 88 de Isl. O rendimento é quantitativo. EXEMPLOS 2 a 4

Preparação dos derivados 2/BV. 5/BV e 4/BV

J

Estes exemplos são conduzidos seguindo o procedimento do Exemplo 1 mas com a diferença que são adicionados 0,5, 0,25 e os 0,125 volumes da solução Ba 1 volume da solução A, respecti— vsmente, perfazendo-se o volume total com solução fisiológica.

Deste modo, são obtidos os derivados semi-sintéticos da fracção BV 88 com L-lisina, designados 2/BV, 3/BV e 4/BV, com uma razão ponderai de aminoácido em relação à fracção BV 08 de 0,5s1, 0,25sl e 0,125sl, respectivamente. 0 rendimento é quantitativo. EXEMPLO 5

Preparação do derivado 5/BV

J

São adicionados 0,1 volumes de tampão NaHC03/Na2LG:3 0,5 Ϊ1 (pH 9,5} a 1 volume de suspensão A obtida como descrito no Exemplo 1, e são adicionados 20 mg de poli-L-lisina na forma de hidrobrometo em pó de P.H. 1000-4000, por grama de fracção BV 88. A mistura é deixada reagir durante 2 horas a 37°0 com agitação e, depois, durante 12 horas a 4oC. 0 produto obtido é lavado duas vezes por centrifugação em solução fisiológica e o sedimento é ressuspenso em solução fisiológica atá uma concentração de 10 mg/ml e depois liofiliza— do.

Deste modo é obtido o derivado semi-sintético da fracção BV 88 com poli-L-lisina, designado 5/BV, com uma razão ponderai de aminoácido em relação à fracção BV 88 de 0,02'sl. EXEMPLOS & e 7

Preparação dos derivados &/BV e 7/BV -10.- TER «23

Estes exemplas são conduzidos seguindo o procedimento do Exemplo 5, mas com a diferença de serem adicionados à suspensão A 5 e 2 mg de poli-L-Iisina, respectivamente. por grama de fracção BV 80,

Deste modo sao obtidos os derivados semi—sintéticos da fracção BV 88 com poli—L—lisina, designados ó/BV e 7/BV, com uma razão ponderai de aminoácido em relação à fracção BV SS de 0,005:1 e 0,002:1, respectivamente. EXEMPLO 8

Presaracão do derivado S/BV é preparada uma solução de L-leucina, 0,5 mg/ml, em tampão acetato de sódio 0,1 Si (pH 5). é preparada separadamente uma suspensão da fracção BV 88, 10 mg/ml, no mesmo tampão e são misturados 0,5 ml desta suspensão com 2 ml da solução de L-leucina. São adicionados à mistura 2 mg de i-etil—3-{3-dimetilamino-propil)-carbodiimida dissolvidos em 0,5 ml de água destilada, o que é, então, mantido sob agitação contínua durante 4 horas, ajustando constantemente o pH a 5 por adição de HC1 0,1 N á temperatura ambiente.

Depois da reacção, a mistura é cantrifugada e o sedimento é lavado duas vezes por ressuspensão em solução fisiológica e centrifugação. 0 precipitado é finalmente retomado em solução fisiológica numa concentração de 10 mg/ml e liofilizado.

Deste modo, é obtido o derivado semi—sintético da fracção BV 38 com * L-leucina, designado S/BV, com uma razão ponderai de aminoácido em relação à fracção BV 88 de 1:5. EXEMPLO 9

Preparação do derivado 9/BV

Para este exemplo é seguido o procedimento do exemplo 8, 71 904 TER.23 -11:- usando como aminoácido o ácido L-aspártico numa razão ponderai em relação à fracção BV SS de is 10.

Deste modo é obtido o respectivo derivado semi-sintático, designado 9/BV.

Parte experimental farmacológica

J

Os derivados semi—sintéticos obtidos nos exemplos anteriores foram estudados num ensaio para determinar a sua actividade de imuno-modulação e antitumoral, após administração oral e parentérica em comparação com a fracção BV 88 inicial. 0 método operativo e os resultados do ensaio são dados sob os seguintes cabeçalhos. A) Capacidade dos derivados da fracção BV 88 para estimular a função do sistema retículo—endotelial.

Este teste foi conduzido pelo método de Halpern e col. (ΑΡη,. Inst. Pasteur 1951, 80, 582).

J

Para análise dos efeitos que se seguem á administração parentérica (intravenosa), as substâncias foram administradas numa dose única de 500 pg/ratinho no tempo O, ao passo que para análise dos efeitos que se seguem à administração oral, elas foram administradas por sonda gástrica durante 6 dias numa dose de 1 mg/ratinho/dia. 0 exame da funcionalidade do sistema reticulo-endotelial (índice K/K0) foi feito 6 dias após o tratamento.

Ds resultados são dados na Tabela 3. *

-.12- TABELA 3

Efeito dos derivados semi-sintéticos da fraoçlo BV 88 sobre aetividade do sistema reticulo—endotelial Cíndice K/KD)

J

J COlTi posto Método de adfiiin istr aç So Dose K/K0 controlo - - 9 JL BV 8S iv 500 pg/ratinha 4,06 oral 1 mg/ratinho durante 6 d ias 1 s 37 1/BV iv 500 pg/ratinho 3,96 oral 1 mg/ratinho durante 6 dias 1 s 50 2/BV XV 500 μα/ratinho 3 7<o> oral i mg/ratinho durante 6 dias i ? 66 3/BV iv 500 μ/ratinho 3 5 82 oral ± mg/ratinho durante 6 dias 1,90 4/BV iv 500 pg/ratinho 3 5 87 oral 1 mg/ratinho durante 6 dxas 2 5 05 5/BV iv 500 pg/ratinho 3,6 oral 1 mg/ratinho durante 6 dias i ,49 6/BV iv 500 pg/ratinho 3,08 oral 1 mg/ratinho durante 6 dias 1,74 7/BV iv 500 pg/ratinho 4,02 oral i mg/ratinho durante 6 dias 1,97 8/BV XV 500 pg/ratinho 3,90 oral i mg/ratinho durante 6 dias 1,68 9/BV iv 500 pg/ratinho 3,89 oral i mg/ratinno durante & dias 1,72 «

71 904 TER.23 --13- B) Efeito dos derivados da fraccão BV 88 sobre infeeeão experxmenta 1 por monocitooenirscg Listaria no ratinho A infecção sk per imen ta1 foi induzida no ratinha por administração i.v. de 1,2 x 104 bactérias em 0,2 ml de uma cultura de 18 horas. 0 tratamento Toi feito através de sonda gástrica, administrando 1 mg dos vários derivados, por dia, durante tr@s dias antes da infecçSo experimental.

J A Tabela 4 mostra a percentagem de protecção contra a morte devida à infecçãa, obtida por exame dos animais 8 dias após a infseção. TABELA 4

Efeito dos derivados da fraeção BV 88 sobre a infecçãa experimental Composto no ratinho, induzida por tratamento monocitogénios Listeria % de protecção contra a morte BV 88 1 mg/ora1/3 dias 10% 1/BV 1 mg/oral/3 dias 30% 2/BV 1 mg/ora1/3 dias 30% 3/BV 1 mg/oral/3 dias 40% 4/BV i mg/oral/3 dias 45% 5/BV 1 mg/oral/3 dias 25% Ó/BV 1 mg/oraX/3 dias 25% 7/BV 1 mg/oral/3 dias 40% 8/BV 1 mg/oral/3 dias 30% 9/BV 1 mg/oral/3 dias 22%

7 dias invento A fracçSo BV 88, administrada numa dose de 1 mg i.v. antes da infseção, dá 80% de protecçãoρ os derivados do comportam—se analogamente na administração i.v. y * j

71 904 TER.23 —.14- O Efeito dos derivados da fracção BV 85 sobre a infeccão experimental por HSV-1 na ratinho A infecção experimental foi induzida no ratinho por administração i.v. do viras HSV-1 cultivado em células VERO, num volume de 0,5 ml de uma diluição is 1000 de uma cultura contendo 3,2 x 108 DICC50. 0 tratamento foi dado oralmente durante tr'i's dias antes da infecção, numa dose de i mg/ratinho/dia. Os resultados são dados na Tabela 5. TABELA 5

Efeito do tratamento com derivados da fracção BV SS sobre a infecção experimental no ratinho, induzida por HSV-1

Composto tratamento % protecção BV SS 1 mg/oral/3 dias 7% 1/BV 1 mg/oral/3 dzas 137. 2/BV 1 mg/oral/3 dias 277. 3/BV 1 fflg/oral/3 dias 34% 4/BV 1 mg/oral/3 dias 47% 5/BV 1 mg/oral/3 dias 33% 6/BV 1 mg/oral/3 dias 34% 7/BV 1 mg/oral/3 dias 40% 8/BV 1 mg/oral/3 dias 13% 9/BV 1 mg/oral/3 dias 20% D) Efeito dos derivados da fracção BV SS sobre células NK esplénicas no ratinho. 0s ratinhos foram tratados durante 5 dias, ora!mente, com 1 mg de derivados em 0,5 ml de água.

Dez dias após o tratamento, a actividade assassina natural (células NK) foi determinada usando esplenócitos originários dos animais tratados como células efsctoras e células tumorais YAC-I marcadas cam Cr 51 como alvo. A actividade foi medida em duas razoes diferentes tíe células efectoras em relação às células alvo (50ϊ1 e lOOsi).

Os resultados são dados na Tabela 6. TABELA 6

Efeito dos derivados da fracção BV 88 sobre a actividade das células NK esplénicas no ratinho

Composto tratamento/ratinho citotoxidadde específica {%} 50 51 iOOsl

Controlo — 13,4 17,8 BV/8S 1 mg/oral/5 dias 16,5 19,2 1/BV mg/oral/5 dlâS -3 T -* Jt / , -3 20,8 2/BV 1 mg/oral/5 dias 177,:0 19,2 3/BV 1 mg/oral/5 dias 17,6 24,9 4/BV 1 mg/oral/5 dlâS 20,2 27,8 5/BV 1 mg/oral/5 dias 11,3 15,0 Ó/B V 1 mg/oral/5 dias 13,5 19,2 7/BV 1 mg/oral/5 dias 20,4 30,3 8/BV 1 mg/oral/5 dias 14,5 19,0 9/BV 1 mg/oral/5 dias 14,5 21,6 E) Efeito dos derivados de BV 88 sobre o crescimento do tumor sólido de Lewis induzido no ratinho C 57 BL/6 0 tumor foi induzido por injecçSo i.m. de lo4 células tumorais. 0 tratamento foi conduzido por administração oral e!s 1 mg de derivado em 0,5 ml de água todos os 2 dias durante 10 dias. 71 904 TER.23

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Os tempos de survevivência comparados com os controlas são mostrados na Tabela 7. TABELA 7

Efeito dos derivados de BV SB sobre o crescimento do tumor sólido de Lsmis>

Composto tratamento tempo para atingir 100% de mortalidade

Controlo — 36 dias BV SS 1 mg/ora 1/10 dl asem dias alternados 33 St 1/BV 99 39 99 2/BV 99 33 9B 3/BV SB 40 II 4/BV 59 38 £1 5/BV S! 45 n ó/BV SZ 43 99 7/BV 91 43 29 8/BV 99 37 SI 9/BV ÍS 37 xt

Em virtude das caracteristicas determinadas a partir dos ensaios dados atrás, os derivados do presente invento podem ser usados para preparação de compostos farmacêuticos com acitividade de imuno-modulação e anti-tumoral para administração perentórios e oral.

Claims (1)

1. β 71 904 TER.23 lã. Processo de preparação de dereivados semi—sintéticos com actividade de imuno-modução para administração parentérica ou oral, consistindo em conjugadas de aminoâcidas ou de poliamino-ácidos com uma fracção insolúvel designada por BV 88 que é isolada partir da estirpe de Corvnsbacterium granulosum IV-86, ATCC 53966, e que consiste em péptido-g1icanos e g1icoproteimas, caracterizado por se fazer reagir uma suspensão da fracção BV 88, activada com um dialdeído CH0-(CH2)n-CH0 onde n está entre 2 e 4 ou conjugada com carbodiimida, com um aminoácido ou poliaminoáci-do, para conjugação. 2ã. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a activação com o dialdeído ser efectuada por tratamento de uma suspensão de 1-20 mg/ml de BV 88 em solução tampão de pH 7,4, com uma solução de dialdeído no mesmo tampão. J 3ã. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a reacção para conjugação da fracção BV 88, se activada com dialdeído, ser efectuada por tratamento de uma suspensão de BV 88 activada, contendo entre 1 a 20 mg/ml de BV 88, com uma solução de aminoácido tendo uma concentração entre i e 20 mg/ml ou com um poliaminoácido em forma de pó a um pH de 9,5, a uma temperatura entre 4 e 37°0. 4ã. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por os aminoácidos usados para conjugação com BV 88, se activada com dialdeído, serem aminoácidos diaminomonocarbQKílicos. 5ã« Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por os poliaminoácidos usados para conjugação com BV 88, se activada com dialdeído, terem um peso molecular entre 1000 e 15000 daltons. 6ã> Processa de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o dito dialdeído ser glutaraldeído. 7ã. Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por os ditos poliaminoácidos serem polilisina, polisrginina e po1i1isina—argin ina.

   71 904 TER.23 Sã. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por, no caso de a fracção BV SS estar conjugada com carbodiimida, se adicionar uma solução de 0,1—10 mg/ml de um aminoácido em tampão de pH 5, a uma suspensão de 1—20 mg/ml da fracção BV SS no mesmo tampão e por se adicionar à mistura obtida uma solução de carbodiimida. 9ã» Processa de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por, no caso de a fracção BV 88 estar conjugada com carbodiimida, a reacção de conjugação com aminoácido ser conduzida a pH 5, à temperatura ambiente. lOã. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por os aminoácidos usados para conjugação com BV SS e carbodiimida sem aminoácidos monoaminomonocarboKílicos e monoaminodicar-boxilicos. liê. Processo de acordo com as reivind icaçBes 4 ou 10, caracterizado por os ditos aminoácidos serem lisina, arginina, glutamina, asparagina, leucina ou ácido aspártico. 12â. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por, nos derivados semi-sintáticos preparados, a razão ponderai entre o aminoácido contido e a fracção BV SS estar entre 0,05:1 e 1,5:1. 13ã. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por, nos derivados semi-sin táticos preparados, a razão ponderai entre o poliaminoácido contido e a fracção BV 88 estar entre Ο,ΟΟΙϊΙ e 0,05:1 14ã. Processo de preparação de composiçães farmacêuticas com actividade de imuno-modulação e anti—tumoral para administração psrentérica e oral, caracterizado por se associar um derivado semi—sintático, consistindo em conjugados de aminoác idos ou poliaminoácidos com uma fracção insolúvel designada por BV 88 que é isolada a partir da estirpe de Corvnebacterium granulosum IV— -36, ATCC 53966, e consiste em páptido-g1icanos ε g1icoprotelnas, com veículos e/ou portadores farmacsiiticaments aceitáveis. -22- 'ψ i 71 904 TER.23 Lisoosi U. DEZ. 1990 Pqí·- LABORATOIRE MEDIDOM 5.A. - Ο A6EMTE OFICIí

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