PT96741B

PT96741B - Processo para a preparacao de um reagente litico diferencial apropriado para a numeracao automatica de leucocitos basofilos do sangue em aparelhos de medida por variacao da resistividade

Info

Publication number: PT96741B
Application number: PT96741A
Authority: PT
Inventors: Didier Lefevre; Henri Champseix
Original assignee: Abx Sa
Priority date: 1990-02-13
Filing date: 1991-02-11
Publication date: 1998-07-31
Also published as: AU6994191A; JPH04230854A; US5196346A; FI910705A0; NO910534L; JP3049371B2; FI98248C; DE69108757T2; CA2035793A1; EP0442776B1; DK0442776T3; IE910323A1; ATE121193T1; DE69108757D1; CA2035793C; FR2658300A1; NO910534D0; FI98248B; FI910705L; AU631289B2

Description

PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE UM REAGENTE LÍTICO DIFERENCIAL

APROPRIADO PARA A NUMERAÇÃO AUTOMÁTICA DE LEUCÓCITOS BASÓFILOS

DO SANGUE EM APARELHOS DE MEDIDA POR VARIAÇÃO DA RESISTIVIDADE

A presente invenção diz respeito à análise de fórmulas sanguíneas mediante contagem e discriminação de pelo menos uma sub-população leucòcitária e diz mais particularmente respeito a um reagente e a um método de utilização deste para a numeração dos granulócitos basófilos em citometria de fluxo por medida da resistividade.

A importância diagnóstica da determinação precisa das diferentes populações leucocitárias é reconhecida há muito tempo; com efeito, o aparecimento de relações leucocitárias anormais pode ser correlacionado com o aparecimento de diversas doenças.

Os métodos tradicionais de coloração específica e a observação ao microscópio permitem já distinguir todos os tipos de leucócitos, quer dizer os granulócitos (basófilos, eosinófilos e neutrófilos) e os agranulócitos (monócitos e linfócitos), mas a sua realização ê muito demorada.

Diversos aparelhos automáticos são já comercializados permitindo a contagem das diferentes populações leucocitárias do sangue total e diversos reagentes e corantes foram afinados

-2para serem utilizados nestes aparelhos.

Pode-se assim medir o tamanho das células, apôs lise diferencial do seu citoplasma, quer mediante determinação de variações de resistividade (de acordo com o descrito, por exemplo, na patente de invenção WO 84/03771) quer mediante medida da difracçao ôptica (de acordo com o descrito na patente de invenção norte-americana N- 3 740 143); pode-se, igualmente, efectuar colorações (enzimáticas ou não) específicas dos diferentes tipos celulares, e particularmente dos três tipos de granulócitos, e medir depois os tamanhos e densidades ôpticas das células para diferentes comprimentos de onda (patente de invenção norte-americana N² 3 740 143).

A contagem dos granulôcitos basófilos é particularmente delicada devido ao facto de este tipo de células apenas representar 0,5 a 1% dos glóbulos brancos.

Os granulôcitos basófilos distinguem-se pelo seu elevado conteúdo em heparina, um polissacárido sulfatado que pode ser revelado por corantes da família dos ftalocianetos como o

Bleu Alcian ou o Bleu Astra.

A coloração dos granulôcitos basófilos com vermelho neutro, classicamente utilizado no método manual, pode, igualmente, ser combinada com o tratamento de lise diferencial dos leucócitos para ser utilizada em aparelho automático (patente de invenção norte-americana N² 3 740 143).

O pedido de patente de invenção europeia N² 0 177 137 descreve um reagente lítico que permite a destruição progressiva

-3de todas as células sanguíneas com excepção dos basófilos. Este reagente danifica as membranas celulares o que leva à fuga do citoplasma. Com diferentes intervalos de tempo vê-se desaparecer os diferentes tipos de células, quer dizer sucessivamente os eritrócitos, os linfócitos, os eosinófilos, os neutrófilos e os monócitos. Depois de 80 segundos, só os basófilos conservam ò seu tamanho e a sua morfologia normais. O ingrediente activo deste reagente é uma mistura de agente tensioactivo e de ácido diluído. Esta mistura deve ser utilizada em uma gama estreita de pH compreendida entre 1,8 e 2,3.

Este reagente dá bons resultados nos aparelhos de contagem mediante leitura óptica mas não está adaptado às determinações por resistividade; em particular, põe um problema importante de engorduramento do orifício de contagem do aparelho, não sendo a destruição das membranas das hemácias completa.

O princípio de numeração celular por resistividade assenta na manutenção de um campo eléctrico onde é mantida uma corrente constante; a passagem de uma célula neste campo provoca um aumento da tensão necessária para a manutenção da corrente constante (de acordo com a lei de Ohm). A impulsão da tensão gerada pela passagem de uma célula (e que constitui a medida registada pelo aparelho) é proporcional à resistência oposta, portanto ao volume da célula, independentemente da sua forma. Este modo de detecçao apenas se aplica, portanto, às células previamente tratadas (mais particularmente por citólise diferencial) para se obter uma discriminação muito nítida

-4-Λ» dos tamanhos das sub-populações.

Este método é de utilização muito simples visto que não é necessário corar as células.

A requerente realizou uma nova formulação do reagente de lise diferencial que preserva os granulocitos basófilos para permitir a sua utilização nos aparelhos de medida por resistividade.

Assim o reagente de acordo com a presente invenção compreende um agente tensioactivo do tipo éter de polioxietileno (como o Brij 35 ou 23-lauril-éter) em uma concentração compreendida entre 1 e 5 g/litro e uma mistura de ácido ftálico em uma concentração compreendida entre 0,5 e 1,5 g/1 e de ácido clorídrico 0,25 mM. As concentrações relativas dos diferentes constituintes são ajustadas para se obter um pH compreendido entre 2,5 e 3,2.

A requerente verificou que se melhorava a sensibilidade da detecção mediante adição de SDS (dodecil-sulfato de sodio) ao reagente, a uma concentração compreendida entre 50 e 300 mg/1, como agente desnaturante das proteínas, o que diminui a formação de depósitos no instrumento de medida; além disso, o SDS acelera a lise das células.

Ao reagente adiciona-se, com vantagem, um agente anti-oxidante como o hidroxitolueno butilado ou BHT (C^ HgO-di-terc. butil-4-metilfenol) em uma concentração compreendida entre 10 e 30 mg/litro.

Assim, de acordo com um modo preferido da presente in-5venção, o reagente compreende os seguintes constituintes:

a

0,5 a a

a

5 g/litro	de Brij 35
1,5 g/litro	de ácido ftálico
0,25 mM	de ácido clorídrico
300 mg/litro	de SDS
30 mg/litro	de hidroxitolueno butilado

De acordo com um modo de realização da presente invenção, ao reagente pode-se ainda adicionar Bleu Astra, corante específico dos grânulos de heparina, que assegura uma melhor fixação desta última.

A presente invenção diz igualmente respeito a um método para a utilização deste reagente em aparelho automático com citometria de fluxo, por medida da resistividade, para a determinação dos leucócitos basófilos.

processo de acordo com a presente invenção compreende o contacto da amostra sanguínea a estudar com o reagente, em um recipiente termostatizado a uma temperatura compreendida entre 30 e 40°C durante um período compreendido entre 5 e 30 segundos (sendo a temperatura e o tempo de contacto ajustados, em função inversa um do outro).

O processo de acordo com a presente invenção compreende, em seguida, a detecção das células intactas, quer dizer os basófilos, mediante determinação da resistividade em um aparelho de detecção apropriado e o registo destas determinações sob a forma

-6- Ζ\ de histograma.

A figura é um histograma representativo obtido mediante utilização do processo de acordo com a presente invenção sobre uma amostra de sangue normal.

O exemplo seguinte ilustra um modo de realização do processo de acordo com a presente invenção, sem contudo a limitar de modo algum.

Exemplo

As seguintes concentrações dos diversos constituintes são calculadas para a preparação de um litro de reagente:

Brij 35	2,5	g
ácido ftálico	0,9	g
ácido clorídrico - 1N	0,25	ml
SDS	200	mg
hidroxitolueno butilado	25	mg

água destilada ajustada para 1 litro

Mantêm-se o pH a 2,7 (entre 2,5 e 3,2).

Pode-se adicionar, ao reagente, Bleu Astra, em uma concentração compreendida entre 10 e 100 mg/litro; nas condições de pH escolhidas o Bleu Astra é solúvel e estável.

Este reagente pode ser utilizado em qualquer aparelho de contagem automática de glóbulos sanguíneos baseada no princípio da medida da resistividade [por exemplo ABX modelo 504eQ. A tensão dos eléctrodos é ajustada para 100V.

Regula-se o aparelho para pôr em contacto uma amostra de

-Ί

Ί 5 jjlI de sangue total e 2 ml de reagente. Esta mistura efectua-se em um recipiente termostatizado a uma temperatura de 40°C durante 17 segundos. {Obtêm-se o mesmo resultado diminuindo a temperatura e aumentando o tempo de contacto e vice-versa).

O reagente provoca uma lise imediata dos glóbulos vermelhos e depois uma lise progressiva de todos os outros tipos de glóbulos com excepção dos granulócitos basófilos. Depois de 30 segundos de contacto a 40°C pode-se verificar mediante determinação manual e observação ao microscópio que todos os basófilos conservam uma morfologia intacta. Quando o reagente contêm Bleu Astra, a coloraçao dos basófilos é proporcional à concentração de Bleu utilizada.

Um histograma representativo de uma amostra de sangue normal está representado na figura 1: a curva 1.1 representa a determinação efectuada em um meio sem SDS nem Bleu Astra e a pH 1,9; observa-se que os resíduos de membrana de hemácias dificultam a medida da resistividade. A curva 1.2 representa a determinação efectuada no reagente de acordo com a presente invenção; a zona A corresponde aos núcleos das células lisadas; a zona B corresponde aos leucócitos basófilos cujo o citoplasma está intacto.

Claims

REIVINDICÃgOES

1,- Processo para a preparação de um reagente lítico diferencial para a numeração dos leucócitos basófilos do sangue em um analisador automático por medida de resistividade, caracterizado pelo facto de se fazer reagir:

- um agente tensioactivo do tipo éter de polioxietile no;

- uma mistura de ácidos ftãlico/clorídrico;

- SDS (dodecilsulfato de sódio); e

-9.¾

- um antioxidante do tipo hidroxitolueno butilado, estando o pH do reagente obtido compreendido entre 2,5 e 3,2 e sendo aquele electricamente condutor.
2.- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracte rizado pelo facto de o agente tensioactivo ser o 23-lauril-éter em uma concentração final compreendida entre 1 e 5 g/litro.
3. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracte rizado pelo facto de a mistura de ácidos compreender ácido ftã lico em uma concentração final compreendida entre 0,5 e 1,5 g/ /litro e ácido clorídrico em uma concentração final de 0,25 mM.
4. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo facto de o reagente conter SDS em uma concentração final compreendida entre 50 e 300 mg/1.
5. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo facto de o reagente conter hi droxitolueno butilado em uma concentração final compreendida entre 10 e 30 mg/litro.
6. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo facto de o reagente conter um conjunto de soluções catiónicas que podem servir para produzir tinta de escrever, papel carbono, tintas, etc., bem conhecido como corante da heparina, e designado por Azul Astra, em uma concentração compreendida entre 10 e 100 mg/litro.
7. - Processo para a numeração em aparelho automático mediante citometria de fluxo da população de leucócitos basófi los do sangue, caracterizado pelo facto de compreender as seguintes etapas:

- contacto de uma amostra de sangue com o reagente pre parado pelo processo de acordo com uma qualquer das reivindica ções 1 a 6, em um recipiente termostatizado;

- detecção das células intactas, ou seja os basõfilos, mediante determinação da variação da resistividade,

- registo desta determinação sob a forma de histograma.
8. - Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo facto de se efectuar o contacto do sangue com o rea gente a uma temperatura compreendida entre 30 e 40°C e durante um período compreendido entre 5 e 30 segundos.