PT97355B - Processo para a preparacao de polipeptidos recombinantes contendo uma sequencia de aminoacidos de uma proteina de celulas - Google Patents

Description

RESEARCH DEVELOPMENT FOUNDATION

Campo da invenção

A presente invenção refere-se a novas sequências de DNA, a moléculas de DNA recombinantes, a processes para a preparação de novas proteínas de transmembranas expressas no desenvolvimento de células T e a novas proteínas de transmembranas numa forma substancialmente pura. Mais particularmente, re fere-se a novas sequências de DNA expressas em hospedeiros apro priados e às novas proteínas, duas das quais são proteínas da membrana integral produzidas nestes hospedeiros. As sequências de DNA e as moléculas de DNA recombinantes da presente invenção são caracterizadas pelo facto de cada uma codificar para uma no va proteína que tem pelo menos duas das seguintes características: (1) é expressa per células T linfena, (2) é expressa em ti mos normais, células de baço activadas ou tecido linfõide associado com o intestino, (3) é expressa em tecido cváricc, em linhas de células de fígado normais ou imortalizadas ou cancerosas, (4) é expressa nc des-envclvimento embrionário e/ou (5) con têm dominios abrangendo membranas múltiplas. Como se pode vericar a partir da descrição que segue, as sequências de DNA, as moléculas de DNA. recombinantes e cs processes para a produção de novas proteínas expressas nc desenvolvimento de células T e das proteínas das células T novas seb a forma substancialmente

pura pedem ser úteis para manipulação e regulação do desenvolvimento de células T que alteram o fenõtipo tumorigênico e podem ainda ser úteis para a localização de focos metastãticcs de tumores. A presente invenção proporciona também anticorpos novos que se ligam a epítopes das proteínas da presente invenção e ã utilização destes anticorpos para identificar e alvejar fãrmacos ou outros agentes para tipos de células específicos que exprimem as novas proteínas.

Técnica anterior

No desenvolvimento do sistema imunologico, os linfõcites T são derivados de células embrionãrias precursoras que nos timos sofrem diferenciação e maturação. Muitos genes são activados cu reprimidos quando a célula T passa per diferentes estádios de desenvolvimento no time. Por exemplo, as células adquirem o receptor de IL-2, CD4 e/ou CD8 sobre a sua superfície durante este período. Estes marcadores de diferenciação são importantes para o desenvolvimento da célula T e/ou para a sua função. Muitos produtos genéticos aumentam os seus níveis de expressão no desenvolvimento de linfõcitos T. Estes incluem o receptor de célula T para o antigénio, assim como os marcadores CD4 e CD8. Muitos outros antigênies têm servido como marcadores de células T antes de ser conhecida a sua função exacta nos lin fõcitos. Semente recentemente se descobriu que o antigénio de células T Pgpl auxilia os timócitos na sua permanência no timo enquanto Τ200 (CD45) funciona como um componente para a sinalização intracelular. Um outro marcador de célula T, Thy 1, ainda não têm função associada a este conhecida.

As células SL 12.4 exibem um fenõtipo duplamente ..

-3tive CD4 CDB e, portanto, assemelham-se a timccitos num estádio í relativamente precoce de desenvolvimento. Alem disso, não expri mem a subunidade alfa dc receptor de célula T. Contudo, as célu las SL 12.4 podem ser induzidas a expressar estavelmente CD4 e CD8 na sua superfície após cultura conjunta com monocamadas epi. teliais tímicas. Após estes tratamentos e também induzido o mRNA TCR-alfa. Assim, parece que as células SL 12.4 tém a capacidade para apresentarem diferenciação e maturação. Este sistema biológico in vitro único mimetiza, em certa medida, o microambiente tímico.

Foram identificados numerosos genes que são primeiro expressos em timócitos em desenvolvimento. Muitos destes genes codificam proteínas que devem ser expressas para precursores de células T para se tornarem funcionais no sistema imunologico, por exemplo: 1) TCR para o antigénio que ê requerido para reconhecimento do antigénio; 2) CD25 (receptor de IL2) que deve ser expresso para as células para responderem à citoquina IL2;

3) produtos genéticos importantes para transdução de sinal durante o reconhecimento antigênico, tais como CD3, CD4, CDS,

CD45; 4) alguns dos produtos genéticos envolvidos na permanência de timócitos em orgãos alvos e 5) produtos genéticos envolvidos na activação de células T (Fowlkes e Pardoll, Advances in Immunology, 44 (1989) 207-264; Hocd et al. , Cell, 40 (1985) 225-229; Rcthenberg e Lugo, Develcp. Biol., 112,(1985) l-17;Adkins et al-, Ann. Rev. Immunol.,5(1987) 325-365; Crabtree, Science, 243(1989) 343-355; Kwon e Weissman, Proc.. Natl. Acad. Sei. USA, (1989) 1963-1967. Existe uma heterogeneidade notável nos subconjuntos de timócitos que exprimem diferentes associações de genes expressos. A expressão genética tem sicc analisada em por

mencr em muitas mas nãc em todas as numerosas classes de timõcitos e é provável que genes ainda não identificados codifiquem produtos que funcionem no desenvolvimento e permanência das células T; particularmente aqueles que são expressos em timócitos progenitores transitórios e numericamente infrequentes.

Devido à grande heterogeneidade dos timócitos, nãc ê possível obter timócitos progenitores fraccionados em numero ou pureza suficientes para caracterizar completamente a cascata de expressão genética que ocorre durante o desenvolvimento. Por es te motivo, as linhas de células de linfoma e de leucemia têm s_i do grandemente utilizadas para o estudo da expressão genética no desenvolvimento linfóide (Greaves, Science, 2 34 (19 86) 697-704; Hanley-Hyde e Lynch, Ann. Rev. Immunol.,4(1986) 621-649. Uma literatura considerável indica que as células progenitoras transitórias numericamente infrequentes são o alvo de transformação para a malignidade;e ainda que algumas das características das células alvo transformadas são preservadas nas células turnorais. A expressão genética inesperada em células tumcrais foi frequentemente desprezada como uma aberração da transformação. Contudo, a análise cuidadosa da expressão genética aberrante em células tumorais hematopoeiticas revelou que cs subconjuntos raros de células progenitoras normais que exprimem esses genes (Greaves, Science, 234 (1986) 697-704; Hanley-Hyde e Lynch, Αηη. Rev. Immunol., 4_(1986) 621-649; Pierce e Speers, Câncer Res.,48(1988) 1996-2004.

A heterogeneidade de linhas de células de linfoma murino e humano derivadas de um único indivíduo pode resultar de diferenças na extensão da maturação alcançada pelas células individuais. A heterogeneidade de linhas de células de linzo/.e 7 estabelecida tem sido utilizada para se obter clones de ...enes

-5estreitamente relacionadas que diferem num número limitado de características. Hedrick et al., Nature, 308 (1984) 149-153, utilizando técnicas de clonagem de subtracção, efectuaram esti. mativas mostrando que as células T e B diferem na expressão em cerca de 100 genes. É provável que células T de linfoma estrei^ tamente relacionadas devam diferir na expressão de ainda menos genes. Estes clones celulares proporcionam uma oportunidade pa ra trabalhe com populações puras de células com fenõtipos defi. nidos estáveis que diferem num número limitado de caracterí sti. cas. O sistema modelo de linfoma T SL12 foi desenvolvido e uti lizado no presente pedido de patente de invenção para proporcio nar uma destas populações de células estreitamente relacionadas. (Hays et al., Int. J. Câncer, 30 (1986) 597-601; Macleod et al.,

Câncer Research, 44 (1984) 1784-1790; Macleod et al., J. Nat.

Câncer Inst., 74 (1985) 875-882; Macleod et al., Proc. Natl. Acad.

Sei. USA, 83 (1986) 6989-6993; Siegal et al., J. Exp. Med., 166 (1987) 1702-1715.

Descrição resumida da presente invenção

A presente invenção proporciona novas sequências de DNA e moléculas de DNA recombinantes (rDNA), processos para a produção de novas proteínas de células T expressas no desenvolvimento de células T, novas proteínas de células T numa forma substancial, mente pura e anticorpos que se ligam ãs novas proteínas. Mais par ticularmente a invenção refere-se a novas sequências de DNA expressas em hospedeiros apropriados e ãs novas proteínas de células T produzidas nesses hospedeiros. A presente invenção também proporciona novas proteínas de transmembrana sob uma forma substancialmente oura, moléculas de rDNA aue codificam as referidas

-6proteínas de transmembrana e a processos para a produção das novas proteínas de transmembrana. As sequências de DNA e as mo léculas de DNA recombinantes da presente invenção sãc expressas per células T de linfema e têm pelo menos uma das características seguintes: (1) são expressas em células de timo normal, em células de baço activadas ou em tecido linfóide associa do ac intestino, (2) são expressas em tecido de ovário, em fíga do normal e/ou em um estádio específico do desenvolvimento embrionário e (3) codificam novas proteínas da transmembrana contendo domínios de membrana múltiplos.

Num outro aspecto, a presente invenção proporciona um gene novo, 19.5 aqui também referido como Lov, induzível em células SL 12.4 apõs cultura conjunta com monocamadas epiteliais tímicas. A presente invenção também proporciona anticorpos poli clonais que surgem contra uma construção oligopeptídica com base na sequência de cDNA de Lov. A indução de Lov parece ser estável dado que os clones de células isolados de uma população celular SL 12.4 apõs cultura conjunta, exibiu um nível maior da expressão de Lov no mRNA, assim como o nível de proteína de superfície. 0 gene Lov foi mapeado no cromossoma 16 murino. 0 pro duto genético Lov tem um desenvolvimento regulado e desempenha um papel no desenvolvimento da célula T.

Foi construída uma biblioteca de cDNA de SL 12.4 a partir da qual se isolaram seis novos CDNAs através da hibridação subtractiva sobre uma linha de células de linfoma muito pró xima SL 12.3. As células SL 12.3 têm características de timócitos num estádio mais imaturo de desenvolvimento do que a linha SL 12.4. Um dos clones de cDNA, 19.5, é expresso em SL 12.4, mas estã ausente nas células SL 12.3. Esta sequência foi designada

-7Lov (expressão celular _linfõide e ovãrica) . A proteína prevista parece altamente hidrõfcba e com base na análise por computador contém quatro regiões na transmembrana. Nao se descobriram hcmolcgias significativas entre o cDNA de Lcv nem entre a sequência da proteína prevista e outras sequências conhecidas.

gene Lov é conservado em várias espécies de mamíferos, tais como, por exemplo, seres humanos, roedores, coelhos, leão mari_ nho e aves e a transcrição parece ser grandemente expressa em tecido ováricc e tecido linfõide associado ao intestino (GALT), assim como nc timo. A expressão de Lov e a sua inducibilidade em biossistemas, as características físicas da proteína Lov, bem como a localização no cromossoma murino deste gene são aqui descritos.

A presente invenção, proporcionando sequências de DNA e moléculas de DNA recombinante, também proporciona sondas e mê todos para identificar células que contêm ou não contêm estas sequências e meios para administrar estas sequências a células onde elas não estão presentes. Adicionalmente, a presente inven ção proporciona um meio para inibir a expressão de sequências novas mediante o fornecimento de uma sequência de RNA anti-sentido que, quando administrado a uma célula ou quando o DNA que codifica o referido RNA anti-sentido ê administrado a uma célula que contem essa sequência de DNA, produz um RNA anti-sentido que se pode ligar e, portanto, bloquear a síntese do RNA que co difica as novas proteínas da presente invenção. É também eviden te para um especialista na matéria a partir desta descrição que os anticorpos contra qualquer das proteínas da presente invenção se podem utilizar para bloquear a ligação de ligandos a pro teínas e a fãrmacos alvo ou de outros agentes (tal como marcado

res) a células que exprimem estas proteínas.

Prcporcicna-se também um clone cDN? ferido'aqui como Tea, que identifica transcrições encontradas apenas num número limitado de tecidos. As transcrições Tea são induzidas em esplenõcitos activadcs com ConA mitogénico de célula T. Diferentemente de outros genes conhecidos expressos em células T activadas, o gene Tea parece codificar uma proteína que atravessa a membrana várias vezes, enquanto um grande núme ro de proteínas de membrana integral que são induzidas na acti vaçãc da célula T são proteínas que se distribuem pela membrana de um modo simples (Crabtree, Science, 243 (1989) 355-361).

A presente invenção também proporciona processos para a produção de novas proteínas de transmembrana e novas proteínas de transmembrana sob forma substancialmente pura que po dem ser úteis no desenvolvimento de células T, regulação de fe nõtipo tumorigênico e podem também ser úteis para bloquear a activação de células T nas doenças de autoimunidade.

Os novos clones de cDNA que são diferencialmente expresses entre dois clones de células de linfoma T estreitamente relacionados foram isolados utilizando sondagem diferencial melhorada por dedução. As células SL 12.4, das quais se isolaram cDNAs, têm características de timõeitos num estádio intermédio do desenvolvimento e provocam tumores do ovário extranodais importantes em animais singeneicos. Um clone de célula ir mã, SL 12.3, derivado do mesmo tumor tem um fenótipo distinto e causa linfomas difusos mais agressivos. Quatro dos cinco genes novos são expressos em timos normais, células de baço activa das ou em tecido linfõide associado ao intestino. As .sequências de IMA e as sequências de proteínas previstas para os clones de cDNA no

-9vos estão representadas nas Figuras 3, 13 e 20 a 23. O ncyo cio ne de cDNA 19.5 detecta mRNA no time normal, em tecido linfeide associado ac intestino e em tecido de ovário. A proteína previ£ ta apresenta quatro regiões na transmembrana putativas. A expres são da transcrição é reprimida em células híbridas somáticas for madas a partir de células SL 12.4 fundidas com três diferentes linhas de células de linfoma T com ausência detectãvel de mRNA complementar ao novo clone de cDNA, Esta regulação trans-negativa sugere que a expressão do gene ê regulada por mecanismos de repressão.

Descrição resumida dos desenhos

A Figura 1 representa a expressão de 5 diferentes clones de cDNA específicos de SL 12.4, por manchas de Northern.

A Figura 2 representa a hibridação da mancha de Southern de 4 di ferentes clones de cDNA específicos de SL 12.4.

A Figura 3 representa DNA e a sequência de proteína prevista do clone de cDNA de 19.5. A, a sequência de DNA e a sequência de aminoãcidos prevista foram obtidas utilizan do sequenciação de dupla hélice. Utilizou-se microgenia (Beckman) para reunir a sequência de DNA e para preparar a sequência de aminoãcidos prevista. B, mostram-se os sítios de restrição com cDNA para subclcnagem e a estratégia de sequenciação. A cadeia de leitura aberta está indicada pela linha horizontal a tracejado. Ambas foram sequenciadas a partir da inserção in tacta e de quatro subclones utilizando iniciadores para as regiões T3 e T7 do plasmídeo pT7T3 e um inicia-10A Figura 4

A Figura 5

A Figura 6

A Figura 7

A Figura 8

A Figura 9

A Figura 10

A Figura 11 der oligonuclectídico sintético. Utilizaram-se os f programas SOAP, HELIXMEN, NONOTNY e RAOARGOS do software PC Gene para examinar as propriedades fí_ sicas da proteína prevista e para preparar o esboço apresentado em C.

representa os esquemas de expressão cDNA de 19.5 e 20.2 em células híbridas somáticas e 19.5 em tecido de murganho normal.

demonstra através da mancha de Northern que sequências complementares a cDNA 19.5 estão contidas em linhas de células de carcinoma de ovário humano.

demonstra através da mancha de Southern que as sequên cias complementares a 19.5 estão presentes numa varie dade de espécies de mamíferos e que são, portanto, conservadas durante a evolução.

demonstra através da mancha de Nouthern que ambas as transcrições de Lov são induzidas como resposta a cul_ tura conjunta.

apresenta uma análise de anticorpo fluorescente de cê lulas SL 12.4 para a expressão superficial de Lov.

apresenta a especificidade do anticorpo 19.5 para o antigénio imunizante.

apresenta a inducibilidade da proteína Lov por células epiteliais tímicas.

demonstra a estabilidade da expressão Lov através da mancha de Northern e análise FACS.

A Figura 12 demonstra a localização de Lov no cromossoma 16.

A Figura 13	apresenta o DNA e a sequência de proteína prevista do cDNA dc clone 20.5.
A Figura 14	demonstra a expressão do gene Tea.
A Figura 15	apresenta a cinética da indução do gene Tea em es plenõcitos activados.
A Figura 16	apresenta o alinhamento das sequências de 20.5 e de cDNA de ERR.
A Figura 17	apresenta o alinhamento da sequência de proteína prevista de Tea com a sequência do receptor retro virai ecctrcpico murino.
A Figura 18	apresenta as propriedades físicas dos produtos da proteína prevista dos genes Tea e Rec-1.
A Figura 19	apresenta uma análise de Southern de DNA de espécies diferentes e a análise de DNA inato recombi- nante da posição do gene Tea no cromossoma 8.
A Figura 20	representa o DNA e a sequência de proteína previs ta do clone de cDNA 19.1.
A Figura 21	representa o DNA e a sequência de proteína previs ta do clone de cDNA 19.2.
A Figura 22	representa o DNA e a sequência de proteína previs ta do clone de cDNA 19.4.
A Figura 23	mostra uma representação esquemática de pNEO/TfR- -NC.
A Figura 24	mostra uma representação esquemática de pMAMneo-

-Blue.

-12Descrição pormenorizada da presente invenção

Para uma total compreensão da presente invenção, apre senta-se em seguida uma descrição pormenorizada.

Nesta descrição são utilizados os termos seguintes:

termo hospedeiro ê utilizado para significar e in cluir não apenas procariotas mas também eucarictas, tais como levedura e filamentos, assim como células vegetais e animais.

termo procariota é apresentado para incluir todas as bactérias que podem ser transformadas com o DNA para a expres são de proteínas de transmembrana cu proteínas de célula T de transmembrana recombinantes (rtTCP) da presente invenção.

termo eucariota é apresentado para incluir todas as leveduras, fungos, células vegetais e animais que podem ser transformadas com o DNA para a expressão de proteínas de transmembrana ou de proteínas de célula T de transmembrana recombinan tes da presente invenção.

DNA para as proteínas de célula T da presente invenção pede ser derivado de qualquer espécie de mamífero. 0 que ê necessário para isso é que a sequência genética para as proteínas de célula T (TCP) seja expressa em organismos procariõticos ou eucariõticos. É preferido DNA de célula T que expressa prcteí_ na ou proteínas de TCP de murganho. Especialmente preferida é a sequência de DNA de célula T que tem imunologia com reacção cruzada entre diversas espécies animais (por exemplo, murganho, coe lho, leão marinho ou ser humano).

Uma molécula de DNA recombinante que codifica qualquer das proteínas de célula T da presente invenção pode ser utilizada para transformar uma hospedeira utilizando qualquer das técni

cas ccrrentemente utilizadas pelos especialistas na matéria.

É especialmente preferida a utilização de um vector que contém a sequência codificadora para as proteínas de célula T da presente invenção ccm a finalidade da transformação de procariotas.

A proteína recombinante de célula T (rTCP) da presente invenção pede ter mais ou menos aminoácidos nas extremidades flanqueadoras comparativamente à sequência de aminoácidos das proteínas de célula T naturais.

A designação substancialmente pura quando aplicada â proteína de célula T de transmembrana da presente invenção significa que o polipéptido é essencialmente isento de outras proteínas habitualmente associadas com a proteína de célula T no seu estado natural e que exibe uma resposta electroforêtica ou cromatogrãfica e perfis de eluição e actividade antigénica constantes e reprodutíveis. A designação substancialmente puro nãc significa que se excluem misturas artificiais ou sintê ticas da proteína de célula T com outros compostos.

Os métodos para a preparação de genes fundidos ou Li gados cperacicnalmente e que se exprimem em bactérias são conhe eidos e estão apresentados por exemplo, na patente de invenção norte-americana n9 4 366 246 que aqui se inclui como referência. As construções genéticas e os métodos descritos ali podem ser utilizados para a expressão da proteína de célula T de transmem brana em hospedeiros procariõticas ou eucariõticas.

As hospedeiras procariõticas podem incluir as bactérias Gram positivas ou Gram negativas, tais como E. coli, S. tymphimurium, Serratia marcescens e Bacillus subtilis.

As hospedeiras eucariõticas pedem incluir leveduras, tais como Pichia pastoris ou células de mamífero.

-14Em geral, os vectores de expressão gue contêm as sequências do promotor que facilitam a transcrição eficiente dc fragmento de DNA inserido sãc as utilizadas em relação à hcspe deira. 0 vector de expressão contêm habitualmente uma origem de replicação, prcmotcr(es) e terminadcr(es), assim como os ge nes específicos que são capazes de proporcionar a selecção dc fenõtipc nas células transformadas. As hospedeiras transformadas podem ser fermentadas ou cultivadas de acordo com meios con vencionais para se obter c desenvolvimento celular óptimo.

Os exemplos de promotores que se podem utilizar na presente invenção incluem, mas não estão limitados a: rec A, trp, lac, tac, o bactericfago lambda pR cu pL, MMTV, SV40. Exem pios de alguns dos plasmídeos ou de bacteriófagos que se podem utilizar na presente invenção estão relatados em Maniatis et al., Molecular Cloning Cold Spring Harbor Laboratories, 1982 e outros são conhecidos e podem ser facilmente determinados pelos especia listas na matéria.

A presente invenção é extensiva a qualquer hospedeiro modificado de acordo com os métodos descritos ou modificado por qualquer outro método convencional, tais como, por exemplo, atra vés da transformação de material genético utilizando um fago lisogénico, e que proporcione um gene de expressão procariota ou eucaricta para a proteína de célula T de transmembrana.

Um gene é uma sequência de DNA que codifica através da sua matriz ou do seu RNA mensageiro uma sequência de aminoácidos característica de um pêptido específico. 0 termo cDNA inclui genes dos quais se removeram as sequências de intervenção. Pelo termo rDNA designa-se uma molécula que foi recombinada por excisão-reparação de cDNA ou de sequências de DNA genómicas in vi-15tro,

Um veicule de clonagem é um DNA plasmídico ou fãgicc ou outra sequência de DNA capaz de se replicar numa célula hes pedeira que é caracterizada por um ou um pequeno número de sítios de reconhecimento de endonuelease nos quais essas sequências de DNA pedem ser cortadas de uma forma determinável sem perda da função biológica essencial do DNA e que contém um mar cadcr adequado para se utilizar na identificação das células transformadas. São marcadores, por exemplo, a resistência à te traciclina, a resistência à necmicina ou a resistência à ampiciclina. A palavra vector é por vezes utilizada para veículo de clonagem.

Um veículo de expressão é um veículo similar a um veí culo de clonagem mas que ê capaz de exprimir um dado gene estru tural em um hospedeiro, normalmente sob o controlo de certas se quências de controlo.

As hoépedeiras transformadas com o genome de células T de transmembrana para proteínas de célula T de transmembrana são particularmente úteis para a produção de polipéptido e de proteina de célula T de transmembrana.

A proteína de célula T recombinante pode conter toda a sequência de aminoácidos da proteína de célula T ou pode conter apenas um determinante específico. Um animal imunizado com a proteína recombinante de célula T produzirá anticorpos que se podem ligar acs epítopes presentes nos pelipéptidos recombinantes ou naturais. Deste modo, pode fazer-se a produção comercial de proteínas recombinantes contidas na célula T.

A designação indivíduo, refere-se à inclusão de qual quer animal, de preferência um mamífero e com maior preferência

-16£ um roedor, felino, cão, bovino ou ser humano.

marcador detectãvel pode ser qualquer molécula que possa ser detectada. Os marcadores detectãveis normalmente uti lizadcs são radioactivos e incluem, mas não estão limitados a,

14 125 3 35

P, C, I, H e S. Os nuclectidos marcados ccm bictina podem ser incorporados em DNA ou em RNA por meios de corte trans locado Cnick translation), enzimãticos cu químicos. As sondas biotiniladas sãc detectadas apôs hibridação utilizando conjugados de avidina/estreptavidina, fluorescentes, enzimãticos cu de curo coloidal. Os ácidos nucleicos podem também ser marcados com outros compostos fluorescentes, com derivados fluorescentes detectãveis imunologicamente ou com análogos da biotina. Os ácidos nucleicos pedem ser também marcados por ligação a uma proteína. Podem também ser utilizados ácidos nucleicos com ligação cruzada com histona radioactiva ou fluorescente Hl, enzimas (fosfatase alcalina e peroxidases), ou com uma proteína de ligação de cadeia simples (ssB) .

Portanto, a presente invenção torna possível um anticorpo de proteína de célula T de anti-transmembrana para utiliza ção como uma sonda para as proteínas de transmembrana da presente invenção e como inibidores da ligação dos ligandos naturais das proteínas de célula T de transmembrana da presente invenção e como um sistema de libertação de um fãrmaco ou de um marcador alvo.

Foram escolhidos dois elenes de células derivados da linha de células de linfoma T SL12 para o isolamento de genes di ferencialmente novos expressos com base em diferenças conhecidas na expressão genética ou na sua diferente capacidade para provocar tumores em animais hospedeiros singeneicos £ (vidé Hays et

-17al., Int. J. câncer, 38 (1986) 597-601; MacLeod et al,, Câncer / ,

Research, 44 (1984) 1784-1790; MacLecd et al., J. Nat. Câncer

Inst. , 74 (1985) 875--882: MacLecd et al., Proc. Natl. Acad. Sei.

USA, 83. (1986) 6989-6993; Siegal et al. , J. Exp. Med., 166 (1987) 1702-1715; Weinroth et al., Câncer Research, 45 (1985) 4804-4809; Wilkinscn et al., EMBO J. , 7. (1988) 101-109 e o Quadro 1 para um resumo de fenótipes J. A linha de células SL 12.3 expressa muito poucos dos genes requeridos para a função da célula T e ê altamente maligna em animais singeneicos e forma tumores difusos, agressivos. Em contraste, as células SL 12.4 expressam mRNAs para tedos os componentes do complexo TCR/CD3 excepto TCR-alfa e em vários aspectos, as células são similares a timócitos num estádio intermédio de desenvolvimento dos timócitos. As células SL 12.4 são muito menos tumorigénicas e induzem tumores extranodais importantes. Em animais hospedeiros fêmeas, o sítio principal da formação de tumor é o ovário. As novas proteínas de trans membrana pedem ser relacionadas com as células tumorais do ovário.

Foram isolados novos clones de cDNA a partir de duas linhas de células que diferem na capacidade tumorigénica, propriedades e estado de maturação. Estes clones de cDNA representam genes que codificam produtos relacionados com a diferente ca pacidade das duas linhas de células para provocar tumores e/ou as que intervêm no desenvolvimento da célula T. A presente invenção refere-se ao isolamento e caracterização de cinco novos clones de cDNA que representam genes que são preferencialmente expressos no clone de célula T, SL 12.4, e que não são detectáveis ou são fracamente expressos em um clone da célula irmã, SL 12.3. Os clones de cDNA foram obtidos por uma associação de sondas enri-18( quecidas por hibridaçao subtractiva e de sondagem diferencial convencional. Descrevem-se novos clones de cDNA que representam genes diferencialmente expressos entre os dois clones da célula. Todos cs genes representativos sãc expresses num subconjunto de tecidos limitado. Algumas transcrições não são encontradas exclusivamente nas células linfeides, mas mostraram uma série de expressão. As sequências de dois dos cDNAs (19.5 e 20.5) indicam que cs produtos genéticos são novas proteínas abrangendo múltiplas membranas que sãc expressas em tecido de óvario mu rino normal, timo, tecido linfóide associado ao intestino, baço e fígado. Uma sequência também hibridou com células de carcinoma de ovário humano e tecido normal.

Apõs a descrição genérica da presente invenção, pode obter-se uma melhor compreensão da invenção por referência aos exemplos específicos que se seguem. Estes exemplos são apresentados apenas com fins de ilustração e não são entendidos como limitativos, a menos que especificado de outro modo.

Exemplo 1

Isolamento, caracterização e cultura de células

A. Linhas de células de linfoma

As exigências para isolamento, caracterização e cultu ra das linhas de células SL 12.1, SL 12.3, SL 12.4 de linfoma T e células híbridas somáticas formadas entre estas, foi descrita pormencrizadamente por Hays et al., Int. J. Câncer, 38 (1986) 597^601; MacLeod et al., Câncer Research, 44 (1984) 1784-1790; MacLeod et al., J. Nat. Câncer Inst., 74 (1985) 875-882; MacLeod et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 83 (1986) 6989-6993 e Wein-19-

roth et al.. Câncer Research, 45 (1985) 4804-4809; incluindo-se aqui todas estas referências.

Os fenótipos dos clones SL 12.3 e SL 12.4 estão resu midos no Quadro 1. A expressão de transcrição, a expressão da proteína de superfície, a tumorigenicidade e o tipo de tumor foram determinados por análise de Northern, citometria de fluxo e injecção in vivo de células clonadas em animais singeneicos respectivamente. As transcrições TCR-βΐ,Ο e 1,3 kb codificam sequências (D)-J-C e V-D-J-C, respectivamente. A resposta glucocorticõide foi determinada através do desenvolvimento das cé lulas em dexametasona lmM.

.../...

-20QUADRO 1

Características fenotrpicas dos clones celulares SL12.4 e

SL12.3 . ........ ........

		SL12.4	SL12.3
	Thy-1	++	+++
	TCR-alpha	-	+
	TCR-p l.Okb	+	-
mRNA	1.3Kb	-	-
	TCR-gamma	-	-
	TCR-delta	-	-
	CD3-gamma	+	-
	CD3-delta	+	-
	CD3-epsilon	+	+/-
	CD3-zeta	+	+
	CD2	+	+
	CD4	-	-
	CD8	-	-
	Thy-1	++	++
	Pgp-1	-	+
Expressão de	ThB	+	-
superfície	TL	+	+
	T200	+	+
	H-2Kk	-	-
	IL2r	+	+
	Jlld	+	+
	CD3-epsilon	-	-
Glucocorticoide sensibilidade	Mel-14	+	NT SR
Tumorigenicidade		Baixa	Alta
Tipo de tumor		Extra- Nodal	Difusa
R = resistência S = sensibilidade	das células à à lise	lise

-21Obtiveram-se células SAK 8 Cell Bicl., 96 (1983) 409-415 através ç

(Gasson, e Bcurgeois, J. · * do Dr. Gasson. As células linfoma foram cultivadas em medo de Eagle modificado por Dulbecco complementado com soro de vitela fetal a 10%, glutamina, penicilina e estreptomicina. Cultivaram-se duas linhas de células 2008 de carcinoma de ovário humano (Disaea et al., Am. J. Obstet. Gynecol., 114(1972) 070-989 e células COLD 316 (Woods et al., Câncer Res., .39 (1979) 4449-4459 em meio RPMI 1640 complementado com soro de vitela bovino a 5%, glutamina e 1% de Fungi-bact (Irvine Scientific, Santa Ana, CA.).

Quando se utilizaram as células para preparar RNA, estas foram recolhidas durante o desenvolvimento exponencial numa densidade próxima da 5-8 x 10^ células por ml (Wilkinson e MacLeod, EMBO J., 2(1988) 101-109). Semearam-se esplenõcitos derivados de murganhos BALB/c a 3x 10^ células/ml e estimularam-se com 10 ug/ml de ConA durante dois dias antes da recolha de RNA.

B. Cultura simultânea de células SL12.4 e monocamadas epiteliais de timo.

As condições de cultura conjunta para células SL12.4 e monocamadas epiteliais de timo. Resumidamente, semearam-se células SL12.4 a uma densidade tal que a sua concentração final após três dias do período de cultura conjunta fosse de 1 x 10θ células/ml. As células TEL ou TEPI atingiram a confluência cerca do terceiro dia. Cultivaram-se as células em meio de Eagle modificado por Dubellco contendo 10% de soro de vitela fetal e complementado com glutamina e penicilina/estreptomicina, â temperatura de 37°C.

-22C.

Linha de células para estudes de expressão de 20.5

Utilizaram-se as linhas de células das origens seguin tes para cs estudos de expressão de 20.5: Células de carcinoma embrionário F9 e PCC4 (Bernstine et al., Proc. Natl, Acad. Sei USA, 70 (1973) 3899-3903, células de tumor de pituitária ATt 20 (Buonassisi et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 48(1962) 1184-1192), células epiteliais tímicas TEPI (beardsley et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 80/1983) 6005-6009), células epiteliais mamárias (evans, Science, 240 (1988) 889-894, 12.9, células 3T3 (ATCC n? 92) e MEF que se prepararam de acordo com o processo de Freshney (Freshney, In Culture of Animal Cells, Alan R. Liss, Inc.,1983, pp 99-110).

Cultivaram-se as células em meio de Eagle modificado por Dubbecco suplementado com 10% de soro de vitela fetal, glutamina, penicilina e estreptomicina. As células utilizadas para a preparação de RNA foram recolhidas durante o desenvolvimento exponencial das culturas contendo 5-8 x 10^ células/ml. Semearam-se os esplenocitos obtidos de murganhos BALB/c 3 χ 10θ células/ml em meio RPMI 1640 suplementado como citado anteriormen te e estimularam-se com 10 jig/ml ConA durante 6 , 24, 48 ou 72 horas antes da recolha de RNA.

Exemplo 2

Estratégia de clonagem e de sondagem

Utilizou-se poli (A)⁺ mRNA de células SL12.4 como uma matriz para preparar cDNA de dupla hélice fGubler e Hcffman, Gene, 25/1983) 263-269 J. Adicionaram-se adaptadores EcoRI ao DNA de dupla hélice que fora previamente metilado. Ligaram-se prolongamentos de lambda gt 10 desfosforilado ao cDNA e inseri-23-

ram-se no fago lambda utilizando o extracto de inserção Stratagene de acordo com as instruções do fabricante (Huynh et al., in D. Glover (ed.), DNA Cloning Techniques: A Practical Approach., Oxford, U.K., IRL Press, 1984.

Realizou-se a hibridação subtractiva essencialmente dc modo descrito inicialmente por Hedrick et al., £Nature, 308 (1984) 149-153; Timberlake, Dev. Biol., 78(1980) 497-503 J. Pre parou-se cDNA de hélice simples a partir de 10 mg de poli (A) ⁺

SL12 4 RNA utilizando 250 mC de P dCTP (Amersham) na presença de 100 ^ig/ml de actinomicina D e hibridou-se com um Rot de 1260 (mole de nucleõtido por litro x segundo) com 25 mg de poli (A)⁺

RNA de células SL12.3 em um volume de 8 ml, â temperatura de

68°C durante 18 horas. Após a hibridação, recolheu-se cDNA de hélice simples por cromatografia através de uma coluna de hidro xiapatite. A partir de 1 jig de cDNA inicial de SL12.4, aproxi7 madamente 120 ng (12% do cDNA utilizado contendo 3 x 10 Cpm) recolheu-se e utilizou-se para sondar dois filtros de 150 mm de nitrocelulose contendo 20 000 placas de lambda gt 10 por litro.

O primeiro dos dois duplicados dos filtros retirados da biblioteca de lambda gt 10 de SL12.4 foi sondado com cDNA total de mRNA de SL12.3 e o segundo filtro retirado foi sondado com o cDNA de SL12.4 enriquecido por subtracção do modo descrito ante riormente. A estratégia utilizada foi similar à utilizada por Filmus et al. Os clones de fago lambda purificados na placa foram identificados como SL12.4 específico por duas sondagens (ut_i lizando separadamente sondas reduzidas preparadas), subsequentemente â análise de Northern para confirmar que o clone se hibridava apenas com mRNA proveniente de células SL12.4 e não com mRNA proveniente de células SL 12.3. Remcveram-se as inserções de cDNA de DNA de lambda por digestão ccm as enzimas de restrição

-24Hind III e Bgl II, isoladas em agarose de baixo ponto de fusão (ver Kem) e subclonaram-se no plasmídeo vector pT7/T3 (Bethesda Research Laboratory) digerido ccm Hind III e BamHI. As inser ções não puderam ser retiradas do fagc ccm EcoRI porque cs sítios EccRI estavam danificados em todos cs isolados: Kuziel et al., Nucl. Acid. Res., 15 (1987) 3181.

Exemplo 3

Análise por mancha de Northern

A, Procedimento geral

Isclou-se RNA celular total proveniente de linhas de células e de tecidos pelo método de isotiocianato de guanidina /(Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y., Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1983), modificado do modo descrito por Wilkinson et al., EMBO J., 7 (1988) 101-109 £. Para análise de Northern, submeteram-se a elec troforese 10 yig de RNA em geles de agarose a 1% contendo formal_ deído e transferiram-se para membranas de nitrocelulose £Meinkoth, Wahl, Anal. Biochem., 13 (1984) 267-284 £.

Avaliou-se impregnação e transferência igual de RNA por faixa por meio de coloração com alaranjado de acridina (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold

Spring Harbor, N.Y., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1983) e per hibridação com actina, CHO-A e/ou ciclofilina cDNA. Hibr£ daram-se as manchas de Northern com inserções de cDNA marcadas 32 com P iniciadas aleatoriamente (Amersham) na presença de sulfato dextrano a 10% e formamida a 50% durante 12 a 18 horas à temperatura de 42°C, lavaram-se em vários passos com uma lavagem

-25final de 30 minutos em 0,1 x SSPE, 0,1% SDS à temperatura de

42° cu 50°C. Para remover a sonda marcada, lavaram-se as manchas de RNA com 0,1 x SSPE e 0,1% de SDS à temperatura de 90°C , deixaram-se arrefecer atê à temperatura ambiente, secaram-se ac ar e conservaram-se sob vazio até nova hibridação.

B. Análise de Northern de RNA de Lov (19.5)

Recolheram-se as células SL 12.4 após cultura conjun ta e efectuou-se a lise em isotiocianatc de guanidinio 4M, 2-mercaptoetancl 1M e acetato de sódio 25mM (pH 5,2). Em seguida, colocou-se o lisado numa camada de cloreto de césio 5,7Μ/ΕΌΊΆ 2mM e centrifugou-se a 38 000 RPM durante 18 horas à temperatura de 4°C. Em seguida, ressuspendeu-se c aglomerado de RNA em tampão TE e extraiu-se por duas vezes com clorofórmio/butanol. Submeteram-se a electroforese 10 jig de RNA em cada faixa de gel de agarose-formaldeido a 1% e transferiram-se para membranas de nitrocelulose. Hibridaram—se as manchas de Northern com a inser 32 çao de cDNA do gene Lõv que tinha sido marcada com P utilizan do o conjunto de marcação iniciada aleatoriamente de Amersham.

A hibridação processou-se durante 12 a 18 horas à temperatura de 42°C na presença de sulfato de dextrano a 10% e formaldeído a 50%. Em seguida, analisaram-se os auto-radiogramas resultantes de acordo ccm as modificações em RNA de Lov por densitometria de varrimento de laser. Ncrmalizaram-se as induções aparentes para o RNA impregnado utilizando hibridação subsequente com actina e CHO-A que não são induzidas após cultura conjunta £ MacLeod et al. , Proc. Natl. Acad'. Sei. USA, 83 (1986) 6989-6993 J. Portanto, os valores referidos representam os aumentos corrigidos da expressão de Lov na cultura conjunta versus células SL 12.4 não tratadas.

C. Análise da mancha de Northern de RNA de 20,5 (Tea)

Isolou-se RNA celular total de células SL12.4, SL

12.3 e de preparações de tecido recentes de murganho Balb/c pe lo método de isotiocianato de guanidina, do mcdc descrito antes. Preparou-se RNA nuclear ou citoplasmãtico tal como'se de£ creveu anteriormente. Para análise Northern submeteram-se a electrcforese 10 de RNA em geles de agarose-formaldeído a 1% e transferiram-se para membranas de nitrocelulose (Maniatis et al., in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1983); /”Mein koth e Wahl, Anal. Biochem, 13 (1984) 267-284 y.

Exemplo 4

Análise de mancha de Southern

A. Procedimento geral

Isolou-se DNA celular total de células provenientes de células, linfoma T e híbridas de células murinas e de hamster somáticas e de tecidos de outras espécies e digeriu-se com as enzimas de restrição indicadas nas legendas das figuras, de acordo com as condições do fornecedor. Aplicou-se 10 yig de DNA digerido em cada faixa de um gel de agarose a 0,7% e submeteuTse a electroforese e coloração em suportes Nytram essencialmen te do modo descrito por Meinkoth e Wahl, Anal. Biochem, 13 (1984) 267-284, hibridou-se e lavou-se do modo descrito para a análise de mancha de Northern.

B. Análise de mancha de Southern de 20.5

Realizou-se a análise de Southern de 20.5 do modo anteriormente descrito com as diferenças que se referem a seguir.

Isolou-se o DNA celular tctal de células SL12.4, de fígado murino e de hamster e de células híbridas somáticas. Com prou-se DNA de fígado de frango e humano a Clonetec Paio Alto, CA. Digeriu-se o DNA com os enzimas de restrição indicados nos Exemples, de acordo com as condições do fornecedor. Aplicaram-se 10 yig de DNA digerido em cada faixa do gel de agarose a 0,8% e submeteram-se a electroforese em tampão Tris-acetato durante um período não inferior a 48 horas e coraram-se em suportes Nytran, hibridaram-se e lavaram-se dc modo descrito na análise de mancha de Northern.

As manchas contende DNA de outras espécies foram lava das com um menor rigor e a lavagem final foi realizada à temperatura ambiente com 2 x SSPE.

Exemplo 5

Isolamento de novos clones de cDNA utilizando sondagem diferencial de redução reforçada

Identificaram-se os novos clones de cDNA, que são expressos exclusivamente ou de forma mais abundante nas células SL12.4 do que nas células SL12.3, isolaram-se do modo descrito nos Exemplos 1 a 4. A sondagem inicial de 40 000 fago ggt 10 re combinantes forneceu apenas onze candidatas, oito das quais foram recuperadas após nova sondagem com sondas reduzidas e pareciam representar seis produtos genéticos diferentes. Realizou—se a caracterização de cinco clones de cDNA. As manchas de Northern de RNA proveniente de células SL12.3 e SL12.4, demonstraram que cs clones de cDNA isolados foram expressos diferencialmente em células SL12.3 e SL12.4, tal como se representa na

-28Figura 1. Mascaram-se inserções purificadas dos respectivos cio nes de cDNA específicos de células SL12.4 foram marcadas e utilizaram-se para sondar as manchas de Northern. Cada faixa conti nha 10 yjg de RNA celular total proveniente das linhas de células SL12.4 e SL12.3, tal como é indicado. A mancha foi sondada de forma sequencial com a inserção de cDNA marcada ccm radioactividade, indicada. As setas marcam a mobilidade relativa das transcrições de rRNA 18S e 28S. A quantidade de RNA SL12.3 e SL12.4 impregnada em cada faixa era equivalente, como determina da pela hibridação com sondas de cDNA CHO-A, tal como se descre ve no Exemplo 3,

Alguns dos clones de cDNA 19.5 e 20.5 foram expressos exclusivamente em células SL12.4 enquanto outros (19.1, 19.2 e 19.4) foram expressos mais intensamente, pelas células SL12.4. Vários dos cDNAs identificaram mais do que uma classe de dimensão de transcrição, sugerindo que deviam iniciar ou terminar em sitios diferentes, por excisão diferencial ou deviam provir de genes estritamente relacionados.

Os clones de cDNA correspondiam a poucas cópias ou a genes de uma sõ cópia presentes em ambas as linhas de células SL12. Como as células SL12.3 não possuem expressão detectável das transcrições 19.5 e 20.5, investigou-se se o gene tinha sido delectado ou sofrido um rearranjo para explicar a ausência de transcrição. Digeriu-se o DNA genómico de células SL12.3, SL12.4 e de fígado normal com EcoRI, Hind III ou PstI e analisou-se com sondas de inserção purificadas para os clones de cDNA. A Figura 2 apresenta a hibridação de mancha de Southern de clones de cDNA específicos de SL12.4. O DNA genómico (10 jig por faixa) proveniente de linhas de células de fígado de murga-29-

nho AKR SL12.3, SL12.4 e SAK clonadas ccm linhas de células T de linfoma e proveniente de células híbridas SL12.3 x SL12.4, SAK x SL12.4, SAK x SL12.3 foi digerido com EcoRI e analisado por manchas de Southern hibridadas ccm o clone de cDNA indicado, tal como se descreve nc Exemplo 4. As dimensões dos fragmen tos em pares de quilobases (determinados por co-migração de DNA digerido com lambda Hind III) estão indicados na margem. Um ou alguns fragmentos de restrição foram reconhecidos pelas sondas, c que indica que os genes correspondentes estão presentes em am bas as linhas de células num pequeno número de cópias no genoma murino. A intensidade da hibridação foi similar em todas as fai xas, indicando que os genes estavam presentes no DNA de células SL12.3 em quantidades aproximadamente iguais e sem rearranjos detectáveis utilizando quatro enzimas diferentes (Figura 2). Portanto, é provável que as diferenças na expressão dos genes nos clones de células SL12 seja devida a regulação específica da célula e nãc a perda de, ou a rearranjos detectáveis nos genes respectivos. Contudo, não se podem exluir pequenos rearranjos ou mutações pontuais nas células SL12.3.

Os clones de cDNAs específicos de SL12.4 são genes no vos. Os clones de cDNAs 19.1, 19.2, 19.5 e 20.5 foram totalmente sequenciadcs. Não têm homologias significativas com sequências publicadas. As sequências estão representadas nas Figuras 3, 13, 20, 21 e 22.

Embora a sequência de 19.4 tenha apenas sido determi3 nada parcialmente (aproximadamente 2,8 Kb de 3,6 Kb), nao foi identificada homologia de sequência significativa nos bancos de dados de DNA cu por tamanhos de transcrições, níveis de expressão e esquemas de expressão de tecido. Além disso, nenhum dos clones de cDNA corresponde a genes de células T conhecidos, on-30-

cogenes ou genes retrovirais murinos conhecidos como expresses em linhas de células AKR com base nc tamanho da transcrição cu na ocorrência de expressão (Hagiwara et al., J. Immunol,, 138 (1987) 2514—2517; Heckford et al., J. Immunol., 137 (1986) 3652-3663; LeClair et al., EMBO J. , 5_ (1986) 3227-3234; Mushinski et al. , Science,' 220 (1983) 795-798; Yague et al., Cell, 42 (1985) 81-87; Quint et al., J. Virol., 39 (1981) 1-10; Selton et al., EMBO J. 4 (1985) 1793-1798.

O tamanho dos cDNAs e as transcrições reconhecidas por estes, ccnjuntamente com c comprimento da cadeia de leitu4 ra aberta (ORF ) estão apresentados no Quadro 2.

QUADRO 2

Tamanho das inserções de cDNA e das

------ ^J - ----- - ------- - transcrições de mRNA

	19.1	19.2	19.4	19.5
Tamanho da
inserção da	1,6	3,2	3,9	1,2
*
cDNA
Tamanho(s)	8,4
da transcri	6,5	5,0	4,5	1,7
ção	4,6	4,5	4,0	1,5
LORF+	-	471++	Z 2400	819
* 0 Tamanho	da inserção	de cDNA é	apresentado	sob

pares de quilobases (kb) e foi determinado por análise sequen ciai de DNA.

Os tamanhos das transcrições, em kb, foram grosseira mente avaliados pela sua migração relativa para RNA de ribossoma 18S e 28S em geles de agarose-formaldeí dc do modo descrito em Materiais e Métodos.

⁺LORF = Comprimento da cadeia de leitura aberta, apresentado em pares de bases. As sequências de DNA foram examinadas utilizando programas de computador Microgenie para localizar ORFs; destes, estão incluídos aqui 1300 pb. O sinal - significa que não se encoutrou mais ORF. O LORF 19.4 de 2400 pb é preliminar, com base na informação da sequenciação incompleta.

⁺⁺ O cDNA de 19.2 contêm 2 ORFs maiores do que 450 pb, que, após novo exame, podem ser realmente contínuos e portanto abrangerem cerca de 920 pb.

Com base numa comparação do tamanho da transcrição e da inserção de cDNA, concluiu-se que nenhum dos cDNAs tem comprimento total. A sequência de DNA de 1,6 kb de cDNA de 19.1 não contêm quaisquer ORFs longos, tem uma extensão poliA e provável

I mente representa uma sequência 3 não traduzida. O cDNA de 19.2 tem um comprimento de 3,5 kb mas tem um ORF relativamente curto (471 pb^, Quadro 2). A sequência parcial do cDNA de 19.4 revela um ORF de 2,4 kb. Tal como 19.4, o clone de cDNA de 19.5 parece conter a sequência codificadora completa e tem um tamanho muito próximo do comprimento total.

Exemplo 6

Anãlise de cDNA 19.5

O clone de cDNA 19.5 parece codificar uma proteína

-32que se espalha pela membrana múltipla. 0 cDNA de 19,5 e a sequên cia de aminoãcidos prevista estão representados na Figura 3A. A estratégia de sequenciação estã representada na Figura 3B. A se quência de cDNA proporciona várias provas de que a região codificadora completa estã presente no clone 19.5: 1) Existem sinais de paragem em todas as três cadeias de leitura antes da posição

I inicial prevista na região 3 não traduzida prevista? 2) 0 sítio de início de metionina previsto é circundado por uma sequência que combina a sequência de consenso Kosak GXC AUG G (em que X pode representar A, C, G cu U) para um sítio de início de tradução óptimo (30); 3) Um sinal de poliadenilação potencial, ATTAAA,

I ~ (31) estã presente na extremidade 3 do codão de terminação.

A sequência de aminoãcidos derivada fornece um tamanho da proteína (não modificada) previsto de 32 981 daltcns e revela dois sítios de glicosilação potencial que estão representados por estrelas, na Figura 3A. A sequência de aminoácidos prevista fornece uma avaliação exacta do peso molecular que pode ser alterado por glicosilação ou fosforilação ou por ambas. Utilizando programas de software Intelligenetics, identificaram-se quatro regiões da transmembrana potenciais muito hidrófcbas (sublinhadas na Figu ra 3A). Não se detectou sequência sinal. Na Figura 3C apresenta-se um esboço de uma estrutura possível associada à membrana com base nas propriedades físicas da proteína prevista. Embora a estrutura prevista faça lembrar o receptor a de acetilcolina nicoti^ nico não se encontrou similaridade de sequência de DNA ou de proteína. A Figura 3 apresenta a sequência de DNA e de proteína prevista do clcne de cDNA 19.5. O painel A mestra a sequência de cDNA e a sequência de aminoácidos prevista obtidas utilizando sequenciação de hélice dupla.

-33Utilizou-se microgenie (Beckman) para reunir a sequên cia de DNA e para preparar a sequência de aminoácidos prevista. 0 painel B apresenta os sítios de restrição no cDNA utilizado para subclcnagem e a estratégia de sequenciaçãc aplicada. A cadeia de leitura aberta está indicada pela linha vertical tracejada. Ambas as hélices foram sequenciadas a partir da inserção intacta e de 4 subclones utilizando iniciadores para as regiões T3 e T7 do plasmideo pT7T3 e um iniciador oligcnuclectídico sin téticc. Utilizaram-se os programas de software PC gene SOAP HELIXMEN, NOVOTNY, RAOARGOS para examinar as propriedades físicas da proteína prevista e para preparar o esboço apresentado no painel c.

Exemplo 7

Regulação negativa da expressão do gene 19.5 em células híbridas somáticas

Investigou-se a expressão diferencial de transcrições relacionadas com 19.5 nas linhas de células SL12.3 e SL12.4 uti lizando híbridos celulares somáticos formados per fusão de célu las SL12.3 e SL12.4 (SL12.3 x SL12.4). Estes híbridos são parti cularmente úteis porque têm uma estabilidade nãc usual e um número de cromossomas quase tetraplõide. As células híbridas SL 12.3 x SL 12.4 contêm 79 cromossomas e não perderam qualquer cro mossema durante um período de vários anos. A Figura 4A mostra que a expressão das transcrições 19.5 é fortemente reprimida nas células híbridas SL12.3 x SL12.4. Além disso, as fusões formadas entre as células SL12.4 e duas outras linhas de células de linfo ma T, SAK8 ou SL12.1, que não apresentam a expressão de mRNA 19.5

-34(Figura 4A) também resultam em células híbridas que não possuem transcrições 19.5 detectáveis, como representado na figura 4A.

A pequena quantidade da expressão do gene 19.5 em todos cs três híbridos celulares somáticos não resulta da perda de genes ou de rearranjos de genes principais, dado gue, comparando as manchas de Southern de DNA das linhas de células SL12.3 e SL12.4, não se conseguiu demonstrar diferenças detectáveis nc tamanho da banda ou na sua intensidade, tal como se mostra na Fi gura 2. Além disso, ê improvável que ambos os cromossomas que contêm o gene que é contribuído pela célula SL12.4 progenitora esteja perdido em três híbridos independentes, dado o conteúdo cromcssõmico quase tetrapclõide das células e a estabilidade do cariotipo. 0 gene representado por cDNA 19.5 é regulado de forma negativa nas fusões de células somáticas que se formam entre células SL12.4 e as três linhas de células T diferentes a que falta a expressão do gene 19.5. Estes resultados sugerem que os fac tores repressores proporcionados por SL12.3 podem ser pelo menos parcialmente responsáveis pela expressão diferencial do gene detectado pela sonda de cDNA 19.5. Similarmente, demonstrou-se que as transcrições TCR-beta e CD3-delta são reguladas por factores negativos presentes nas células SL12.3. Dado que se utilizaram três linhas de células de linfoma T diferentes como parceiros de fusão ccm células SL12.4 e nenhuma das três fusões conseguiu exprimir mRNA 19.5 detectável, é provável que factores negativos participem na regulação da expressão do gene 19.5. Ê improvável que mutações ou deleções não detectáveis de ambos os alelos 19.5 da célula progenitora SL12.4 ocorram em três fusões independentes derivadas de fontes celulares diferentes.

Nos estudos dos híbridos celulares somáticos entre cê-35lulas de linhagens diferentes, observou-se o fenômeno de extin ção fenotípica, pelo que a maioria das mensagens especificas de diferenciação não se acumulam £ Davidson, Ann. Rev. Genet.,

8_ (1974) 195-218; Hyman e Stallings, Immunogenetics, 6. (1978) 447-458 J. A extinção fenotípica ê invulgar em híbridos formados entre células estreitamente aparentadas, da mesma linhagem f Hyman et al., Immunogetics, 10 (1980) 261-271J. Quando, em híbridos celulares somáticos de linhagem próxima ocorre a repressão, esta é habitualmente atribuída a depressores específi cos de trans-actuação expressos por uma das linhas de células progenitoras. No caso do gene da hormona de crescimento, a repressão nas células somáticas híbridas é exercida indirectamen te num activador positivo específico, GHFl £ McCormick et al., Cell, 55. (1988) 379-389 J.

Exemplo 8

Distribuição tecidular das sequências especificas do clone SL12.4

Examinou-se RNA proveniente de vários tecidos murinos para determinar se o gene que corresponde a 19.5 ê expresso de forma ubíqua ou de uma forma específica do tecido.

A Figura 4 apresenta os esquemas de expressão de cDNA 19.5 e 20.2 em células híbridas somáticas e 19.5 em tecido muri no normal..

Prepararam-se manchas de Northern do modo descrito na Figura 1 e no Exemplo 3. O painel A mostra RNA de linhas de células progenitoras SL12.3, SL12.4, SAK8 e SL12.1 e de células híbridas, avaliados para a expressão dos genes 19.5 e 20.2. 0 painel B apresenta RNA de orgãos e tecidos normais provenientes

-36de murganhos Balb/c, Os tamanhos das transcrições foram avalia dos ccm base na sua migração relativa com actina, ciclofilina, RNA de ribosscma 18 e 28S. 0 cDNA 19,5 hibridou com duas trans crições de 1,7 e 1,5 kb. As manchas foram sondadas ccm uma inserção de cDNA 19.5 iniciada aleatoriamente e subsequentemente com CHO-A, actina e/cu ciclofilina (CP) para verificar se todas as faixas continham quantidades aproximadamente equivalentes de RNA. 0 controlo de CP pareceu ser uma medida mais fiável de RNA quando da avaliação de RNA de células normais. Todos pareceram absorver igualmente o alaranjado de acridina dcs geles antes da coloração.

Pequenas quantidades de mRNA estão presentes no GALT (tecido linfõide associado ao intestino, incluindo células Pátch de Peyers), cérebro, coração e pulmão e a transcrição é muito abundante no ovário (Figura 4B). As transcrições 19.5 não foram detectáveis no fígado ou no intestino (Figura 4B), no pâncreas, testículos, medula óssea, esplenócitos inertes ou esplenõcitos activados pelo mitcgénio ConA de célula T (Quadro 3). Embora não fossem detectãveis transcrições relacionadas com 19.5 em timõcitos não fraccionados (Figura 4B), nem em timócitos duplamente ne gativos CD4 CD8 purificados, o mRNA estã presente no total do ti mo (Figura 4B) e numa linha de células epitelial tímica (TEL). Portanto, é provável que as células estromais tímicas expressem a transcrição.

Vários novos clones de cDNA identificam mRNAs que nao estão limitados na expressão à linhagem linfõide. Esta descoberta é similar a outros genes que têm uma função de célula T conhe cida, tal como Thy—1 e CD4 que também sãc expressas em células de cérebro normais /* Lonberg, et al., Mol. Cell Biol., 8 (1988)

-372224-2228 J e antigênio 6C3, um marcador para neoplasmas de cé lulas pré-rB, que também se encontra nas células epiteliais cor ticais do timo Adkins et al., Ann. Rev. Immunol., 5. (1987) 325-365 A expressão das transcrições 19.5 em linhas de célu las de cvãrio normal e de carcinoma ovãrico é questionável porque a linha de células SL12.4 induz tumores extrancdais importantes no ovário de 95% dos animais receptores fêmeas (14) . Em contraste, as células linfoma T SL12.3 de diferentes tumores difusos que nãc se instalaram nos ovários £ MacLeod et al., J. Nat. Câncer Inst., 74 (1985) 875-882 J não exprimem as transcr_i ções 19.5. Um linfoma B humano conhecido (Burkitt) frequentemen

I te forma metastases para os ovários [ Harrison s Principies of Internai Medicine. 11- edição (Ed. Braunwald. et al., Nova Iorque, A. McGraw-Hill, 1987) Como o cDNA 19.5 se hibrida com duas diferentes linhas de células de carcinoma ovárico humano, deve existir uma função de reconhecimento ou de residência para o produto genético 19.5 que lhe permite estabelecer-se ele próprio e desenvolver-se no ovário. Ainda que se pense que mRNA 19,5 não se encontra nos timócitos totais ou em timócitos dupla mente negativos fraccionados, é possível que o gene seja expres so num subconjunto raro de timócitos, ou que seja expresso apenas transitoriamente durante a limfopoiese do feto ou do adulto. Os estudos de hibridação in situ determinarão os tipos de células no timo, ovário e coração que exprimem as transcrições rela cionadas com 19.5.

Quadro 3 resume os estudos de expressão realizados em todos os cinco clones de cDNA (está incluido 19.5 para compa ração).

-38Quadro 3

Expressão de mRNA para novos clones de cDNA
	em tecidos murinos
19.1	19.2	19.4	19.5
SL12.4	++	+++	+	+
Timos	+	+++	+++	+
Esplenccitos „ +		-	+	-
ConA	+	++	++
GALT +	++	-	+
Medula óssea		-	-	-
Cérebro	-	+	-	+/-
Fígado	-	+	-	-
Lg. Intest.		-	-	-
Pâncreas	-	-	-	-
Ovário	-	-	-	++
Testículos	-	-	-	-
Expressão	relativa de	transcrições	complementares aos
novos clones	de cDNA, avaliada de acordo com	a análise de Nor-

thern.

sinal + indica que a sonda detectou uma transcrição no tecido indicado. Em todos os casos, as transcrições provenien tes de tecido de murganho migraram conjuntamente com RNA proveniente da linha de células SL12.4. o sinal - indica a expressão pele menos 10 a 20 vezes menor do que nas células SL12.4

Quatro dos cinco clones de cDNA detectaram transcrições no tecido linfóide: 19.1, 19.2, 19.4, e 19.5 são expressos

de forma detectável no time; a expressão de 15.1, 19.2, e 19.4 é induzida em esplenõcitos estimulados com CcnA; e 19.1, 19.2, e 19.5 são expressos em GALT (tecido linfõide associado ao intestino) . Vários tecidos não linfõides contêm transcrições que hibridam com sondas de cDNA 19.2 e 19.5 (Figura 4B e Quadro 3).

As linhas de células de carcinoma de ovário humano exprimem sequências complementares a cDNA 19.5. Como se demonstrou c nível alto da expressão dos genes 19.5 no tecido de ovário murino, ensaiaram-se as linhas de células de carcinoma cvãrico relativamente à presença da sequência de 19.5. Sondaram-se manchas Northern de 10 yjg de KNA total de células SL12.4 e da linha de células de carcinoma ovãrico do medo descrito na Figura 2. A lavagem final da mancha da esquerda foi com 2 x SSPE à temperatura ambiente; a mesma mancha, do lado direito foi lavada subsequentemente com 0,2 x SSPE â temperatura ambiente, do que resultou a perda do sinal das faixas que continham RNA huma no, mas não na faixa que continha RNA SL12.4 derivado de murganho. Avaliou-se por análise de Northern RNA proveniente das linhas de células humanas estabelecidas 2008 e COLD 316 e verifi cou-se conterem uma transcrição de 1,7 Kb que hibrida com a son da de cDNA 19.5 (Figura 5). Ê algo inesperada a descoberta de que as células de origem epitelial da mesoderme exprimem a tran£ crição, uma vez que estas células contêm apenas uma percentagem pequena da massa de um ovário normal (foram encontradas em uma camada espessa de uma célula na superfície externa do ovário).

As células do estroma ovãrico podem também exprimir o gene. A presença de transcrições que hibridam com cDNA 19.5 sugere que um gene relacionado com um mRNA 19.5 codificador se encontra no genome humano.

Várias espécies de mamíferos exprimem sequências com-40plementares de cDNA 19.5. Com o objectivo de determinar se outros DNAs de mamífero contêm sequências em comum com 19.5 fez-se a sondagem de uma mancha de Southern de DNA proveniente de leão marinho, hamster, murganho e de seres humanes. As manchas de Southern de 10 yug de DNA das fontes indicadas digeridas com

PstI foram sondadas com uma inserção de cDNA 19.5 marcada ccm 32 p iniciada aleatoriamente. As manchas foram lavadas ccm lxSSPE final em condições restritas, â temperatura ambiente. A faixa contendo DNA humano tem uma linha de base relativamente alta.

As manchas do lado direito da faixa indicam a reprodutibilidade dos fragmentes de DNA detectados que hibridam cruzadamente ccm a sonda murina. Todos os DNAs tinham esquemas simples de hibridação sugerindo que o gene tinha side conservado entre as espécies de mamífero (Figura 6). Como se apresenta na Figura 6, as sequências complementares também foram detectadas em DNA de rato, coelho, lemur e orangotango. Portanto, parece que o gene re presentado pelo clone de cDNA 19.5 se conserva entre os mamíferos. A conservação deste gene sugere que ele deve ter uma função importante mas ainda não identificada.

A abundância de transcrições reconhecidas pelas novas sondas de cDNA não foi determinada directamente. Contudo, por comparação com as manchas de Northern, 19.2 e 19.5 são relativamente pouco abundantes e expressos num menor numere de cópias do que mRNAs TCR-beta. A observação de que quatro dos genes cio nados provenientes das células SL12.4 são expressos de forma de tectãvel no times, três nos esplenõcitos actiyados e três nas cé lulas de tecido linfóide associado com c intestino GALT mostra que os sistemas de experiência em linfoma são uteis para o isolamento dos genes que são regulados em tecidos linfeides normais

-41e talvez na ontogenia da célula T.

Nenhum dos novos clones de cDNA descritos neste relatório correspondem a sequências de genes publicadas. 0 programa Pc Gene, Prosite, (IntelliGenetics) foi utilizado para examinar as proteínas previstas representadas por cDNAs 19.2, 19.4, 19.5 e 20.5 para sítios de ligação de DNA ou nucleotídicos potenciais, dedos de zinco, zippers de leucina, sítios activos de enzima, sítios de alvo celular ou aspectos de proteínas estruturais, receptores, citocinas e factores de crescimento. Esta análise não identificou sítios relacionados com cs citados anteriormenre em qualquer das proteínas previstas. Neste momento não há indicação de sua função potencial.

Ê possível que estes genes codifiquem produtos relacio nados em eventos de diferenciação porque: 1) os genes estão expressos de forma diferencial em clones celulares SL12.3 e SL12.4 que parecem representar estádios distintos de maturação dos timócitos; 2) os genes desempenham especificidade tecidular na sua expressão; 3) a expressão dos genes 19.1, 19.2 e 19.4 é induzida em células T esplénicas activadas pelo mitogénio Con-A da célula T; 4) cs genes relacionados com 20.5 e 19.5 são expressos num es tádio específico nos embriões precoces.

As séries de clones de cDNA novos são codificadas por genes que têm esquemas interessantes de expressão e de regulação. Estes são úteis para examinar os mecanismos moleculares que regulam a diferenciação celular, a residência de linfoma T e as propriedades tumorigênicas de células T progenitoras transformadas, Estes clones de cDNA são também uteis ccmo sendas para loca lizar células que comportam estes novos genes de célula T e como uma fonte das novas proteínas da célula T, substancialmente pu-

-42Exemplo

Produção de anticorpos policlonais contra Lov

Foi sintetizado o oligopêptido de 14 aminoácidos nas instalações de UCSD Core. A sequência dc pêptido construído é *

K-G -K-A-D-R-E-Q-E-S-E-E-E-V. Esta sequencia representa os últã.

mos 13 aminoácidos nas extremidades C-terminal prevista para 14

Lov com a adiçao de uma C-glicina para utilização como indica dor da ligação ao veículo. Ligaram-se 2 mg deste pêptido a 4 mg da proteína veicular, hemocianina de lapa (KLH) por adição lenta de glutaraldeído durante 30 minutos. Em seguida, dialisou-se contra PBS durante a noite. Obtiveram-se 10 ml de soro provenien tes de coelhos da Nova Zelândia brancos fêmeas (Holbarts-6 meses de idade) antes da imunização. Em seguida, injectaram-se os animais com o pêptido conjugado na presença do adjuvante completo de Freunds. Injectaram-se 0,2 mg de pêptido total por via subcu tânea em 5 sítios do animal. Decorridas 4 semanas fez-se o desa fio com 0,2 mg de pêptido em adjuvante de Freunds incompleto. Testaram-se semanalmente os soros para a produção de anticorpos anti-Lov por método ELISA.

Exemplo 10

Análise de anti-soros Lov

A presença dos anticorpos que reconhecem Lov foi controlada pelo ensaio ELISA. 0 oligopêptido e a hemocianina de la pa (KLH) foram secos directamente em placas ELISA nas correspon dentes cavidades. Em seguida, adicionaram-se diluições variadas de anti-soros e deixou-se reagir durante 2 horas. Após lavagem

-43com Blottc, incubaram-se as amostras numa diluição 1:1000 de anticorpo secundário (IgG de caprino anti-coelho (FC) ligado com peroxidase de rábano) durante 2 horas, A percxidade de rã bano catalisa uma reacção cclorimétrica em que se utiliza pero xido de hidrogénio e OPD como substrato. Os resultados foram analisados num leitor automático de ELISA. Quando o título de anticorpo atingiu um patamar, os coelhos foram sangrados (apro ximadamente 9 semanas após a injecção inicial). Nos ensaios ELISA que utilizaram componentes celulares, as células foram lisadas per sonicação, A fraeção da membrana foi isolada do c_i toplasma por centrifugação do lisado a 45 000 g durante 30 minutos. A membrana e as fracções citolõgicas foram em seguida secas nas cavidades ELISA durante a noite.

Exemplo 11

Análise de anticorpos fluorescentes g

Suspenderam-se células SL12.4 10 de cultura conjunta ou não tratadas em 25 yjl de tampão A (PBS contendo 5% do soro bovino fetal e 0,02% de azeto de sódio). Em seguida, adicionaram-se 50 yil de uma diluição a 1 : 100 de anti-soro anti-Lov e deixou-se incubar durante 30 minutos sobre gelo. Apõs três lava gens ccm tampão A, incubaram-se depois as células durante 30 mi nutos com IgG anti-coelho, desenvolvido na cabra (com diluição a 1 : 1000), sobre gelo. Nas experiências em que se testaram a especificidade da interaeção, adicionou-se igual volume de uma solução oligcpeptídica de 1 mg/ml aos anti-soros durante 30 minutos antes da sua adição ãs células. Analisaram-se as células num suporte para células activadas por fluorescência num citofluorcgrafo 50H, operando com laser emitindo a 488 nm.

-44Separaram-se as células mortas devido à coloração com iodeto de propldio. Analisaram-se 5 000 células para gerar os histogramas resultantes.

Exemple 12

Imunoprecipitação da proteína Lov

Realizaram-se estudos de imunoprecipitação utilizando o procedimento descrito por Harlow e Lane, em Antidodies: A Labor ate ry Manual Nova Iorque, Cold Spring Harbor Press, 1988.

As células foram marcadas por pulsaçao ccm S-metionina em meio isento de metionina durante 4 horas. Em seguida, lisaram-se as células em RIPA ou em tampão de lise NP40. Os lisados foram pre viamente depurados pela adição de 50 yil de soros pré-imunes incubados em gelo durante 1 hora e imunoprecipitadas as proteínas com reacção cruzada mediante a utilização de Staphylococcus aureus (Calbiochem). Em seguida, adicionaram-se 5 jãl de soro imunizado, incubaram-se durante 1 hora e imunoprecipitaram-se. O material foi depois lavado e submetido a electroforese em gel SDS-PAGE. Após desenvolvimento, expôs-se o gel a uma película para análise auto-radiográfica por métodos conhecidos pelos especialistas na matéria.

Exemplo 13

Mapiação genética de Lov

A produção e caracterização de células híbridas somáticas de hamster chinês X foi descrita anteriormente /~Kosak,

J. Virol., 48/1983) 300-303 £. Isolou-se o DNA destas células híbridas e digeriu-se totalmente com PstI, uma enzima que forne

ce esquemas únicos para cada espécie de digestos de DNA de hams ter ou de murganho quando sondados com uma inserção de cDNA 19.5 de 10 Kb. O DNA digerido foi submetido a electroforese em geles de agarose a 0,8% durante 72 horas a 25 volts e transferido para membranas de nitran. As manchas resultantes foram em seguida sondadas com cDNA Lov marcado ccm P e expostas a película Kodak XAR. Em vãrias linhas de células observaram-se provas de hibridação dos conteúdos cromossómicos de murganho com Lov e os resultados foram analisados por computador com o objectivo de determinar qual o melhor candidato para a localização cromosscmica de Lov murino.

Exemplo 14

Expressão de Lov induzida em células SL12.4 após cultura conjunta em monocamadas epiteliais de timo

As células TEL Glincher et al., Scand. J. Immunol., 17 (1983) 1-11 /7 e TEPI ^Beardsley e Hays, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 80(1983) 6005-6009 J são duas linhas de células imortais epiteliais de timo que podem induzir a expressão dos genes CD4 e CD8 estável em células SL12.4. Após a cultura conjunta de células SL12..4 com monocamadas TEL ou TEPI durante três dias, ava liaram-se os níveis de mRNA de Lov. A mancha de Northern na Figura 7 mostra que ambas as transcrições (1,7, 1,5 Kb) de Lov são induzidas como resposta à cultura conjunta. Ambas as linhas de células epiteliais tímicas estão aptas a provocar esta indução, embora a expressão de Lov após a cultura ccm TEL seja superior quando comparada com a cultura de TEPI (Quadro 4). Os va lores fornecidos representam a média e o erro-padrão de cinco

experiências separadas após analise densitométrica. Além disso, os níveis acrescidos de mRNA Lov nas células SL12.4 persistem mesmo após a remoção das monocamadas tímicas estimuladoras. As células aderentes de origem não tímica (MME: uma linha de células epiteliais mamárias de murganho e AKR1-2B: uma linha fibroblãstica) não tiveram efeito indutivo na expressão de Lov nas células FL12.4. Fragmentos de 100 pb que correspondiam às regiões 5' e 3' de cDNA Lov foram utilizadas para sondar manchas de Northern. Ambas as sondas reconheceram ambas as transcrições de Lov.

Quadro 4

Comparação da expressão genética após cultura conjunta com TEL ou TEPI

Gene	cc TEL	ccTEPI
CD4	1.1 + 0.1	1.9 + 0.3
CD8	1.5 + 0.1	2.8 + 0.5
	““
TCR-í/	2.0 + 0.1	1,5 + 0.2
lov	3.7 + 0.3	2.9 + 0.2

Os auto-radiogramas resultantes das manchas de Northern hibridaram-se sequencialmente com CD4, CD8, TCR-d?^, 19.5 (lov) e finalmente com actina/CHO-A foram sondadas por densitometria laser. Os sinais densitométricos foram normalizados utilizando actina/CHO-A como controlo para a quantidade de RNA introduzida. Os valores referidos representam a relação entre a intensidade de hibridação de mRNA induzido e a do mRNA não induzido (portanto, representam os aumentos médios + o erro-padrão da média para a

-47acumulação de mRNA, referido anteriormente SL12.4 não tratadas).

, detectado em células

A cultura conjunta destas células com mcnocamadas epiteliais tímicas parece provocar a maturação das células SL12.4. Nesta descrição, demonatra-se que um novo gene Lov, também parece ser induzido nas células SL12.4 após este tratamento. A sequência de Lov indica que a proteína prevista codificada será uma molécula superficial que contêm domínios que abrangem a membrana múltipla. Os aumentos da mensagem (indução de três ou quatro vezes) e a expressão superficial de Lov foram observados após a cultura conjunta com epitélio tímico. Estas induções de expressão Lov também parecem ser estáveis porque os clones isola dos após cultura conjunta mantêm a sua expressão Lov alta mesmo decorridos meses de cultura do tecido. Devida ã relativamente pe quena indução, não foi possível efectuar as experiências nucleares para determinar se a indução é decorrente de mecanismos trans^ cricionais ou põs-transcricionais.

mRNA Lov consiste em duas transcrições com as dimensões de 1,7 Kb e 1,5 Kb. Estas duas transcrições são igualmente induzidas após cultura conjunta das células SL12.4 com monocamadas epiteliais tímicas. Além disso, ambas as transcrições são re conhecidas pelas sondas 5' e 3' de cDNA Lov. Desconhece-se se estas transcrições são provenientes de sítios iniciais alternados, cisão, sinais de poliadenilação ou, provavelmente, quaisquer outros mecanismos. Contudo, apenas a transcrição maior se observa em outros tecidos adultos testados que exprimem Lov (por exemplo ovário,' coração) . Além disso, em embriões de murganho em desenvolvimento, apresenta-se como sendo uma modificação de expressão de ambas as transcrições para expressarem somente a

-48transcrição maior cerca do 152 dia (dados não apresentados). possivel que apenas a transcrição de 1,7 Kb codifique para a proteina funcional em animais adultos.

Exemplo 15

A proteina Lov é detectâvel em membranas celulares SL12.4

Os anticorpos anti-Lov reconhecem epitopes encontrados na membrana plasmática de células SL12.4. Induziram-se anticorpos policlonais contra os últimos 13 aminoácidos de Lov em coelhos utilizando o péptido sintético como antigênio. Estes anticorpos reconheceram um antigênio associado à membrana plasmãtica das células SL12.4. A Figura 8 apresenta a análise de um anticorpo fluorescente de células SL12.4 para a expressão superficial de Lov. Os histogramas representam a fluorescência das células SL12.4 coradas com o soro imunizado colocado contra células SL12.4 corados com soros imunizados previamente. Por obser vação microscópica das células permeabilizadas, verificou-se a existência da ligação do anticorpo apenas na membrana plasmãtica e não corou o citoplasma. Os resultados da fluorescência de um clone de célula de linfoma irmã SL12.3, também foram apresentados. As células SL12.3 não exprimem mRNA Lov e não exibem qua_l quer expressão Lov na sua superfície celular. A ligação dos anticorpos de soros imunizados com o antigênio também foi bloqueado especificamente após a adição de quantidades competitivas do oligopéptido de imunização (Figura 9) , mas não por um oligopéptjí do irrelevante. As preparações de membrana, mas não as fracções citosólicas, de células SL12.4 também mostraram a proteína Lov quando se avaliaram por ELISA.

-490 anticorpo que surgiu contra um oligcpéptido sintéti co correspondendo ã extremidade carboxi-terminal de Lov reconhece especificamente um epítope que se encontra na superfície das cê lulas SL12.4. Uma linha de células aparentada, SL12.3, que não exprime mRNA Lov também não exprime a proteína, tal como se observou per fluorescência. Efectuaram-se estudes de imunoprecipi tação da proteina Lov, mas parece haver uma quantidade não usual de interacçces não específicas com os soros imunizados previamen te, 0 facto de a proteína Lov não ser provavelmente abundante (com base na expressão da linha de base de mRNA Lov nestas células) ainda complicou mais estas experiências. No entanto, apareceram três bandas específicas após a marcação com ^^S-meticnina nas células SL12.4 e F6 (um clone celular que exprime muito Lov), mas que estava ausente nas células SL12.3. Estas três bandas também desapareceram após a adição competitiva do oligopéptido específico. A banda de 32 kd relaciona-se com o peso molecular previs to da estrutura de Lov. A banda de 22 kd pode ser um produto de clivagem enquanto a banda de 50 kd deve representar uma forma gli cosilada de Lov.

Exemplo 16

Indução da expressão da superfície de Lov

Os níveis de expressão superficial de Lov também foram induzidos apes a cultura conjunta com monccamadas epiteliais timicas durante três dias. Realizou-se a análise FACS em células SL12.4 após cultura conjunta com a monocamada epitelial timica durante três dias. A Figura 10 demonstra que a quantidade de pre teina Lov detectãvel na superfície das células SL12.4 foi indutí^

-50vel após o tratamento epitelial tímico. Os histogramas mostram anti-soros representados em função de prê-exudados em células SL12.4 estimuladas e não estimuladas. Apresenta-se também o re sultadc das culturas de células SL12.4 com células TEL compara das ccm células SL12.4 não tratadas (gráfico inferior). Estes gráficos sãc traçados em escala logarítmica. As células TEPI provocaram uma resposta similar para a indução de Lov.

Os clones de células cultivadas previamente ccm mcno camadas epiteliais tímicas exibiram uma expressão de base supe rior de 19.5. A cultura conjunta resultou em maiores níveis da expressão Lov em certas células. Isclaram-se uns tantos clones celulares de SL12.4 após cultura conjunta com TEL ou com TEPI.

A clonagem foi realizada por diluição limitante. Por exemplo,

F6 são células derivadas e clonadas de uma população celular SL12.4 após ter sido cultivada com uma monocamada TEL durante três dias.

Estes clones celulares têm sido desenvolvidos em meios normais sem a presença de epitélio tímico estimulante durante vã rios meses. As análises de Northern de RNA e as análises TACS pa ra a proteína superficial de F6 demonstram que este clone celular tem um nível mais estável da expressão Lov do que as células aparentadas SL12.4 (Figura 11). Outros clones celulares isolados e analisados exibiram quantidades variáveis da expressão Lov. Além disso, a cultura conjunta destes clones celulares com monocamadas epiteliais tímicas não resultam em qualquer aumento significativo adicional da expressão Lov.

-51Exemplo 17

Localização de cromossomas

Preparou-se DNA genómico a partir de células híbridas somáticas de hamster-murganho contendo um complemento de um con junto específico de cromossomas de murganho. A digestão com enzimas de restrição PstI forneceu diferentes esquemas de restrição para c hamster e para o murganho (Figura 12, faixas 1,2).

As manchas de Southern de DNA destas células híbridas sondadas com Lcv demonstraram que apenas alguns híbridos continham o esquema murino de hibridação (Figura 12). Com base na análise de Southern em um certo número destas linhas de células híbridas, a melhor correlação foi com o cromossoma 16 murino. A amostra número 77 ê uma célula híbrida cujo o único componente de murga nho é o cromossoma 16. 0 Quadro 5 apresenta a análise computori zada que demonstra que o cromossoma 16 tem a menor discordância em relação a Lov nas células híbridas testadas. 0 gene Lov foi depois mapeadc para uma região específica do cromossoma 16.

···/·.·

-52Quadro 5

Análise de concordância entre cromossomas de murganhos específicos e a presença do gene Lov numa série de células híbridas somáticas murganhc-hamster.

Cromossoma

Número de hibridaçáo de DNA híbridos por cromossoma +/+

-/- +/- -/+

Discordância

Murino percentual

X

1*

1*

38,9

29,4

35.7

22,2

38,9

35.3

43.8

36.8

26.3

44.4

44.4 50,0

31.6

29.4

69.2

12.5

35.7

31.2 47,1

26.3

-53Mapeação do gene (Lov) 19.5 utilizando células somáticas híbridas murganho-hamster. Os símbolos indicam a presença (+/) ou a ausência (-/) do fragmente de restrição Lov murino quan do relacionado com a presença (/+) ou a ausência (./-) dc cromossoma murino particular indicado pele número da coluna esquerda detectado por hibridação com a sonda de cDNA 20.5. 0 número de observações discordantes ê representado pelo somatório das cbser vaçoes +/- e das observações -/+. Nenhum destes híbridos foi ca riotipificadc. Estes foram tipificados per outros marcadores; por tanto, ê possível que as excepções sejam atribuições incorrectas de cromossomas.

Exemplo 18

Imunoprecipitação da proteína Lov

Para determinar a dimensão da proteína Lov realizaram35

-se estudos de imunoprecipitação. Utilizaram-se S para marcar a proteína total novamente sintetizada e I para marcar as pro teinas superficiais. Os soros pré-imunizados de ambos os coelhos tinham bandas não específicas similares. Embora muitas bandas não especificas estivessem presentes nos lisados, identificaram-se algumas bandas específicas. Duas bandas, correspondentes a pe sos moleculares de 22 e 32 kd, pareciam ser específicas nas célu 35 las SL12.4 marcadas ccm S-metionina. Nos soros pre-imunizados não estava presente nenhuma banda nem nes lisados preparados a partir das células SL12.3. Contudo, as duas bandas não foram ob- 125 servadas nas células marcadas com I, mas em substituição encontrcu-se uma banda de 50 kd nas células SL12.4, mas não nas cé lulas SL12.3. Fizeram-se tentativas para reduzir a quantidade de

bandas de fundo (isto e, precipitação com sulfato de amónio da fracçãc IgG, purificação por afinidade do anticorpo numa coluna de Sepharose ligada ao oligopéptido sintético utilizando o clone F6 como expressor elevado de Lov), mas não tiveram sucesso em diminuir as interacções não específicas observadas.

Deste medo, o gene Lov codifica uma proteína que ê ex pressa na superfície celular. Além disso, os níveis de Lov pare cem relacicnar-se com o estado de maturação destas linhas de cê lulas de linfoma T, Não só as células SL12.4 sãc deslocadas para um fenótipe duplamente positivo CD4+CD8+ apôs cultura conjun ta com o epitêlio tlmico, mas também existe um aumento de coordenada na expressão de Lov nestas células. Lov ê um novo cDNA e uma proteína que não contém homologias significativas com quais^ quer das sequências conhecidas. Muitos outros marcadores de células T, tais como Thy-1 e T-200, foram descritos antes de ser determinada a sua função. Embora o gene Lov tenha sido isolado de uma linha de células de linfoma T, outros tipos de células podem exprimir este gene. 0 esquema da expressão de Lov pode re velar alguns indícios para uma possível função. Os tecidos que exprimem níveis mais altos de mRNA Lov são o timos e os tecidos linfóides associados com o intestino (GALT) e os ovários. Os pri meiros dois loci são sítios normais em que os linfócitos se encontram. É interessante notar que os ovários são os primeiros sítios da formação de tumor quando células SL12.4 são injectadas em murganhos singeneicos. Além disso, cs ovários contêm um sistema linfático extenso. As células GALT, também designadas por placas (patches) Peyers estão ligadas por muitos vasos endote liais e demonstrou-se que o antigénio Mel-14 ê necessário para a passagem através delas. As células SL12.4 exprimem o antigénio

Mel-14 na sua superfície celular e são, portanto, candidatos à permanência nestas áreas especializadas do intestino delgado. Uma vez que Lov ê expresse na superfície de células, deve desem penhar um papel nas propriedades de residência dos linfócitcs. Lov não foi detectado em todas as populações de linfócitos e ti^ mõcitcs. Possivelmente, ê apenas expresso num certo subconjunto minoritário de células T e não ê uma característica dominante.. As células SL12.4 podem representar um timócito normal numérica mente pouco frequente.

Exemplo 19

Construção de uma biblioteca de cDNA e sondagem do gene 20.5

Tal como outros clones, a construção da biblioteca de cDNA e sondagem para o gene 20.5 foi realizada do modo descrito nos Exemplos 1 a 4. A inserção de cDNA foi retirada de DNA lamb da por digestão com as enzimas de restrição Hind III e Bgl II e subclonada no vector plasmídico pT7/T3 (Bethesda Research Labs).

Exemplo 20

Análise de sequência de DNA 20.5 ou Tea

Determinou-se o mapa de endonuclease de restrição e subclonaram-se fragmentos em pT7T3, purificou-se o plasmídeo com cloreto de césio e sequenciou-se directamente por métodos de sequenciação didesoxi de cadeia dupla utilizando reagentes Sequena se (U.S. Biochemical Corp., Cleveland, Ohio). Parte da sequência foi determinada utilizando iniciadores para o plasmídeo hospedei ro e outros iniciadores oligonucleotídiccs específicos (17 mers) preparados para cDNA -em UCSD Câncer Center Core Molecular Biology

-56Facility, Ambas as cadeias de DNA foram sequenciadas totalmente e a sequência total foi determinada era pelo menos duas reacções realizadas em duplicado. Utilizaram—se programas de computador de Microgenie para reunir a informação da sequência sobreposta e realizar a analise inicial da sequência de DNA.

Exemplo 21

Mapeação genética de 20.5

A produção e caracterização de células híbridas somáticas de hamster Chinês murganho X foi descrita anteriormente por Hoggan et al. , J. Virol., 62 (1988) 1055-1056. Obtiveram-se murganhos da estirpe NFS/N de Division of Natural Resources, NIH, Bethesda, MD. Obtiveram-se murganhos Mus musculus musculus de uma colónia laboratorial derivada de murganho originalmente cap turados em Skive, Dinamarca, e mantidos pelo Dr. M. Potter, (NCI, NIH, contrato NO1-CB2-5584) nos Hazelton Laboratories, Rockville, MD, Cruzaram-se fêmeas híbridas NFS/N χ X. m. musculus com M. m. musculus machos para produzirem os animais de experiência. Extrai, ram-se DNAs des fígados de murganho, digeriram-se com Saci e BamHI, submeteram-se a electroforese em geles de agarose a 0,4% durante 48 horas a 24 volts e transferiram-se para membranas de nylon (Hybond N+, Amersham). Hibridaram-se as membranas ccm cDNA 20.5 marcado com P e uma sonda de 438 pares de bases representando o gene de DNA pelimerase B que estã presente no cromossoma 8 (MacBride et al., no prelo). Lavaram-se as membranas e sondaram-se do modo descrito anteriormente. Tipificaram-se as amostras de rim dos mesmos murganhos para herança dos marcadores Gr-1 e Es-1 por coloração histcquímica após electroforese em geles de amido £ Harris e

-57Hopkinson,' Handbook of Enzyme Electrophoresis in Human Genetics, Amesterdão, North Hclland Publishing Co., 1976 J.

Exemplo 22

Isolamento e sequência de DNA do clone de cDNA 20.5

Sondou-se uma biblioteca de cDNA SL12.4 de 40 000 membros em ggt 10 (16,24) ccm uma sonda de cDNA SL12.4 subtraída con tra mRNA SL12.3 e, simultaneamente, em filtros duplicados com cDNA SL12.3 total dc modo descrito anteriormente. Este método de sondagem foi utilizado para caracterizar c gene 20.5. Com base nas características de expressão descritas em seguida, o clone de cDNA. fci designado Tea (T cell early activation gene) . A inserção deste clone foi sequenciada por método de cadeia dupla e em ambas as cadeias, representando-se a sequência na Figura 13. A in serção de cDNA tem 2397 pares de bases de comprimento e contêm um quadro de leitura aberta longo único com início no par de bases 409 e prolongando-se até 1769. O cDNA não contém uma sequência si nal de poliadenilação nem uma extensão poli A. A sequência de cENA 20.5 prevê uma proteína que abrange a membrana múltipla. A Figura 13 mostra a sequência de 453 aminoácidos prevista da proteína pre vista que tem um peso molecular de 49,5 quilodaltons (não modificada) . A sequência de cDNA parece conter a região codificadora completa, uma vez que o codão de metionina N-terminal previsto é rodeado por uma sequência de consenso Kczak (GXC AUG G em que X pode representar A, U, G ou C), que ê um sítio de início de tradu

I 1 ção óptimo e as regiões não traduzidas 5 e 3 previstas contêm codces múltiplos de paragem em todas as três cadeias de leitura. As propriedades físicas da proteína prevista foram analisadas uti lizando programas Microgenie e PC Gene. Os três sítios de N-glico

-58silação potenciais estão representados por estrelas na Figura 13. A proteína prevista tem nove regiões muito hidrcfobas (su blinhadas na Figura 13); 7 destas têm características de domí nios que se distribuem pela transmembrana com base numa anãl£ se em que se utilizam programas de software IntelliGenetics SOAP, HELIXMEM, NOVOTNY e RAOARGOS.

gene Tea ê expresso diferencialmente em células de linfoma T e células linfóides T activadas provenientes de baço normal. Foi avaliada a expressão de transcrições reconhecidas pelo clone de cDNA 20.5. A Figura 14 demonstra a expressão do gene Tea. A inserção purificada contendo a região codificadora completa foi marcada com P por iniciação aleatória e utiliza da para sondar manchas de Northern nas quais cada faixa continha 10 de RNA celular total (ou no caso do painel B, RNA ci toplasmático e nuclear) de células SL12.4, células SL12.3, as linhas de células indicadas ou de tecidos de murganho Balb/c normal. Os auto-radiogramas das manchas de Northern estão repre sentados nos painéis A a D. 0 painel A apresenta uma comparação da expressão de mRNA Tea em linhas de células SL12.3 e SL12.4.

O painel B mostra a expressão de mRNA Tea em RNA citoplásmico e nuclear celular total de células SL12.4. O painel C apresenta a expressão de mRNA Tea numa série de linhas de células rçiurinas descritas no texto e o painel D contém RNA proveniente dos teci, dos normais indicados de murganhos Balb/c (GALT significa tecido linfóide associado ao intestino). O tamanho das transcrições em quilobases (kb) estã indicado em cada painel e foi avaliado pela sua migração relativa contra marcadores BRL e RNA ribossómico endogeno 18 e 28S. Foi avaliado impregnação equivalente e transferência de RNA em todas as faixas por coloração com o ala

-5932 \ ranjado de acridina e por hibridaçao com P-ciclofilina (Cic) e/ou cDNA marcado com P Cho-A.

A sonda de cDNA 20.5 reconheceu duas transcrições com aproximadamente 4kb e 7kb que estão presentes nas células SL12.4, mas que não se encontram nas células de linfoma T SL12.3, (Figura 14A). Examinou-se a localização subcelular das duas transcrições para determinar se estas eram ambas transcrições maduras en contradas no citoplasma ou se o RNA maior era um precursor nuclear. Ambas as transcrições pareciam ser RNAs processadas tctal^ mente, uma vez que se encontravam no citoplasma, (Figura 14B) . A origem das duas transcrições não é ainda conhecida; estas pedem surgir da iniciação alternada de transcrição, excisão-reparação alternada da transcrição ou a utilização de sinais de pcliadenilação alternados. Ambas as transcrições citoplãsmicas maduras (com 7 e 4 kb) são maiores que o clone de cDNA (2,4 kb). Portanto, o cDNA não tem o comprimento total, embora pareça conter toda a região codificadora. Ambas as transcrições são detectãveis

I com sondas preparadas com a região 5 (nucleotidos 1 a 380) e

I uma 3 (nucleotidos 2005 a 2394) do clone de cDNA, indicando que o cDNA não ê um artefacto de clonagem que ligou duas transcrições diferentes. Além disso, para os dois RNAs maduros existem várias transcrições maiores muito menos abundantes, presentes nas preparações de RNA celular total e nuclear, que podem ser pre cursores nucleares que sofreram excisão-reparação ou sofreram ex cisão-reparação parcial (Figura 14B).

Foram examinadas várias linhas de células murinas de origem embrionária (F9 e PCC4), epiteliais mamárias (MME) e neuronais (ATt 20) para a expressão de RNA Tea. Nenhuma destas linhas de células expressa RNA Tea detectãvel. Em contraste, linhas

de células epiteliais tímicas (TEPI) e de origem fibroblástica (3T3, MEF) contêm mRNA Tea embora seja muito mais abundante nas células de linfoma T SL12.4 (Figura 14C).

Para determinar se tecidos e células normais de linha gem linfõide exprimem o gene Tea, prepararam-se manchas de Northern de mRNA de tecido murino, que se examinaram. As células de timo de baço inactivo e tecido linfõide associado ao intesti_ no (GALT) e medula óssea não possuem expressão detectável de mRNA de Tea (Figura 14D). Contudo, as transcrições de Tea foram induzidas em células de baço normais activadas com a Concanavalina A mitogénica de células T (ConA, Figura 14D). Utilizou-se ConA para simular a activação de células T esplénicas que ocorre normalmente em um clone celular de forma específica após apre sentação apropriada de um antigênio estranho. O fígado foi o úni co tecido não linfõide testado que expressou quantidades mo deradas de mRNA Tea. As transcrições Tea não foram detectáveis no intestino, estômago, ovário (Figura 14D), cérebro, coração, pulmão, rim, pâncreas ou testículos. Assim, a expressão do gene Tea está limitada a poucos tipos celulares, tais como as células esplénicas activadas, células epiteliais tímicas, células de linfoma T e de fígado.

Exemple 23

Indução de mRNA Tea

Para melhor se investigar a indução de mRNA Tea, preparou-se RNA, 6, 24, 48 e 72 horas após a adição de ConA. acs es plenôcitos. A Figura 15 apresenta a cinética da indução do gene Tea em esplenõcitos activados. A análise de Northern de RNA de

-61cêlulas esplénicas activadas e inactivas foram recolhidas nos tempos indicados e fci realizado após a activação com mitogénio ConA de célula T, A Figura 15, painel A mostra o ponto das 72 horas, o painel B mestra uma mancha diferente de RNA juntamente com ciclcfilina como sonda de controlo (Cyc) para indicar a quantidade relativa de mRNA embebido em cada faixa. Diferente mente do mRNA Cyc, o rRNA embebido foi equivalente em cada faixa, de acordo com a avaliação pela coloração com alaranjada acridina. As transcrições Tea não são detectáveis nes linfÓcitos esplénicos inactivos, mas tornam-se detectáveis em 6 horas atingindo c máximo em cerca de 48 heras. Embora a quantidade total de mRNA fosse equivalente em cada banda (10 ^ig) , de acordo com a avaliação feita com a coloração de alaranjada acridina a relação relativa de mRNA ribossómico parece ser alterada durante a activação da célula T, uma vez que a quantidade de acti na, CHO-A e ciclofilina transcrita/10 yiÇÍ úe RNA total aumenta (Figura 15). Contudo, há uma indução evidente da expressão dc gene Tea relativamente a estes RNAs de controlo durante a activação da célula T.

Exemplo 24

Homologia de DNA 20.5 e sequência de aminoácidos com o receptor retroviral ecotrõpico murino.

A procura de homologia aplicando-se a base de dados Bionet não revelaram similaridade sequencial significativa entre cDNA 20.5 e outras sequências de DNA referidas anteriormente. Contudo, a sequência foi comparada com um relatório recente (Albritton et al,, Cell, 57 (1989) 659-666) do clone de cDNA do

-62receptor retroviral ecotrópico murino e verificou-se ter uma identidade de sequência extensa. 0 gene que codifica o receptor retroviral ecctrôpico tem sido designado por Rec-1. A Figura 16 apresenta uma comparação da sequência de cDNA 20.5 com a sequên cia de cDNA ERR. A Figura 16 apresenta as sequências de cDNA 20.5 e de cDNA ERR alinhadas. Na Figura 16, painel A, as regiões das sequências cDNA ERR e 20.5 incluem a análise dc alinhamento que está indicada pelas linhas verticais. Qs quadros de leitura abertos estão indicados para cada cDNA. No painel B, apresentasse a sequência de cDNA 20.5 completa na linha do topo de cada par de linhas, a sequência de cDNA de ERR (pb 400-2425) não pc£ sui os primeiros 400 pares de bases e representa-se na parte in ferior da cada par. As linhas horizontais marcam as posições de identidade da sequência. A comparação foi realizada utilizando software Microgenie com omissões (gaps”) estabelecidas para permitir o alinhamento das partes das sequências com maior seme lhança. A identidade em percentagem é referida apenas para as regiões de cDNA que são nitidamente sobreponíveis. Nota-se que o cDNA 20.5 ê muito mais longo na extremidade 3 e o cDNA ERR é

I muito mais longo na extremidade 5 .

esquema dos dois cDNAs (Figura 16) mostra que o cENA ¹ ERR é mais longo na extremidade 5 enquanto a sequência de cDNA

I

20.5 é mais longa na extremidade 3 ; o comprimento total des dois cDNAs é idêntico. A região codificadora de cada um ê definida por uma porção sobreposta de cada clone de cDNA. O alinhamento de DNA revela uma identidade de sequência de DNA global entre as regiões sobrepostas de cDNA 20.5 (pb 1 a 2047) e de cDNA ERR (pb 400 a 2425) que é de 59%; uma região de cDNA 20.5 (pb 1011 a 1088) tem 80% de identidade. A região não codificado-63I

ra	5	da	sequência	de	cDNA
de	de	sequência de	68%	com
ra	1 5	da	secruência	do	cDNA

ram derivados de uma sequência comum através de um evento de duplicação genética.

A proteína Tea prevista tem uma similaridade estrutu ral com outras proteínas de domínios que se distribuem pela membrana múltipla, tais como as proteínas de transdução, canais de iões, bombas iónicas e transportadores de açúcar. Contudo, não se encontrara similaridade de sequência significativa com estas famílias de genes, nem qualquer similaridade significativa ccm outras sequências de proteínas conhecidas, ccm a excepção notável da proteína ERR prevista derivada da sequência de cDNA ERR. Um alinhamento da proteína Tea prevista ccm a proteína ERR mostra duas regiões de grande similaridade de sequência de aminoácidos (Figura 17). A Figura 17 comprova o alinhamento de Tea sequência de proteína prevista ccm a sequência do receptor retroviral ecctrõpico murino. No painel A, a linha desenhada mostra o alinhamento da região de dois produtos proteínicos previstos que foram comparados; a proteína Tea prolonga-se desde o aminoácido 1 até ao 404 e a proteína ERR prclonga-se desde o aminoácido 204 até ao 603. No painel B, o alinhamento das duas proteínas previstas mostra a sequência de aminoácidos prevista para cDNA 20,5 no topo, com o cDNA ERR na parte inferior. Os pa rênteses rectos representam as extremidades das duas regiões ccm grande identidade de aminoácidos; a região 1 ê 81,3% idêntica sobre 192 aminoácidos, a região 2 apresenta uma identidade de 51,9% sobre 79 aminoácidos. A região 1, definida pelos parênteses rectos tem uma identidade de sequência de 81% e uma simila-

ridade de 91% sobre 193 aminoácidos. A região 2 tem uma identidade da sequência de 62% e uma similaridade de 75% sobre 60 ami noãcidcs. As diferenças de aminoácidos conservativas (Doolittle, R., Of Urfs and Orfs: A primer on how to analyze derived amino acid sequences, Mill Valley, CA University Science Bocks, 1986) são representadas por um traço longo entre os dois.

Em contraste com o produto genético previsto para Tea, a proteína ERR é maior e tem 13 a 14 regiões distribuídas na transmembrana prevista. Além disso, tem um terminal carboxi hidrófilo menor e um terminal amino de comprimento similar. Os terminais carboxi- e amino- previstos das proteínas mostram a maior divergência de sequência. Similarmente â proteína ERR e outras proteínas que se distribuem pela membrana múltipla, o produto do gene Tea não contêm sequência sinal. A comparação mostra regiões grandes de similaridade de aminoácidos, ainda que as duas proteínas sejam produtos genéticos nitidamente distintos .

A Figura 18 representa um esboço da estrutura da proteína prevista preparada através de programas PC gene para examinar as propriedades físicas do modo anotado na legenda da figura. A Figura 18 apresenta as propriedades físicas dos produtos proteínicos previstos dos genes Tea e Rec-1. O painel A apre senta um modelo para uma estrutura possível da proteína Tea pre vista. As linhas a cheio indicam as duas regiões de grande simi laridade com a proteína ERR. Utilizaram-se os programas do soft ware PC Gene de IntelliGenetics, SOAP, HELIXMEM, NOVOTNY, RAOARGOS para examinar as propriedades físicas da proteína prevista para preparar o modelo apresentado. O painel B apresenta a região das duas proteínas previstas que foram analisadas relati

-65vamente a uma comparação da hidrofcbicidade, (aminoácidos 1 a 403 para a proteína Tea e aminoácidos 204 a 603 para a proteína ERR). O painel C mostra os gráficos de hidrofobicidade da proteína Tea prevista (topo) e da proteína ERR prevista (parte inferior).

O modelo representado define as regiões de grande si milaridade ccm proteína ERR. Come ERR codifica uma proteína da superfície da célula compararam-se cs perfis de hidrofobicidade das duas proteínas previstas nas regiões de sobreposição (aminoácidos 1 a 401 da proteína prevista Tea e aminoácidos 204 a 600 da proteína ERR).

A linha traçada no topo da Figura 18 mostra a região das duas proteínas que foi comparada nos gráficos de hidrofobicidade. A comparação abrange uma região de 401 aminoácidos contíguos e mostra uma similaridade notável. Portanto, é provável que o produto do gene Tea também seja uma proteína da superfície celular.

O gene Tea parece manter-se nos grandes vertebrados. Para determinar se as sequências do gene Tea são mantidas na evolução, testou-se DNA humano, de hamster, de murganho e de frango por hibridação cruzada com a sonda de cDNA 20.5. Quando se utilizou o clone de cDNA de comprimento completo para sondar a mancha de Southern, ocorreu hibridação detectável com todos os DNAs gencmicos testados (Figura 19). A Figura 19 apresenta mna análise de Southern de DNAs de diferentes espécies e a análise de DNA recombinante inato para a posição do gene Tea no cromossoma 8. A sonda de cDNA marcada com P para ambos os pai. neis foi um fragmento Bal I de comprimento quase total do ozono de cDNA 20.5. O painel A apresenta um auto-radiograma que mos-66tra o esquema de hibridação de DNA digerido com PstI humano, de hamster, murganho e de frango sondado com o fragmento Bal I do modo descrito na secção Materiais e Métodos. 0 painel B representa um auto-radiograma de DNA de fígado proveniente de ani. mais recombinante inato. A Figura 19 mostra um exemplo do esque ma de hibridação obtido de vários animais recombinantes do medo indicado e de DNA NFS/N inicial digerido com Saci.

Para confirmar se algum dos fragmentos de DNA detecta do era proveniente do gene Rec-1, verificou-se que uma sonda pa

I ra a região 3 do clone de cDNA 20.5 (que é grandemente divergente da sequência de cDNA ERR) se hibrida com os fragmentos de

DNA da mesma dimensão. Estes resultados sugerem que as sequên» cias detectadas pelo terminal 3 divergente também foram ccnser vadas na evolução e que a hibridação cruzada com o DNA de outras espécies se verificou com a maior sequência divergente presente entre os dois clones de cDNA. Estes dados, considerados conjuntamente com os dados provenientes da secção anterior, demonstram que o gene Tea codifica uma proteína diferente de ERR que se en contra noutras espécies. A divergência da sequência de aminoáci dos nos terminais carboxi e amino sugerem que as duas proteínas podem ter funções distintas.

Exemplo 25

Mapeação do gene Tea no cromossoma 8

Uma vez que o produto genético ERR funciona como um receptor virai, mapeou-se o gene Tea para determinar se estava num cromossoma conhecido para codificar um dos outros receptcres retrovirais conhecidos £ Kozak, J. Virol., 48 (1983) 300-67-303 J. Varias células somáticas diferentes híbridas formadas entre hamster Chinês e células de murganho ainda retêm um núme ro limitado de cromossomas de murganho diferentes. Estas híbri das foram utilizadas para mapear o gene Tea Hoggan et al.,

J. Virol., 62 (1988) 1055—1056 J. A análise de Southern de DNAs digeridos ccm PstI de células híbridas demonstrou que 7 das 21 híbridas continham fragmentos de DNA específicos de murganho. Uma comparação do conteúdo cromosscmico de murino conhecido com hibridação positiva para fragmentos de DNA específicos de murga nho indicou que a melhor correlação é com o cromossoma 8 de mur ganho (Quadre 6).

-68Quadro 6 ( .*

Análise da concordância entre os cromossomas específicos de murganho e a presença do gene Tea numa série de células híbridas somáticas murganho/hamster.

Cromossoma

Murino

Número de híbridos hibridação de DNA por cromossoma +/+ -/- +/-/+ Discordância em percentagem

X

1*

1*

30,0

36,8

35.7 25,0

35,0

36.8

52.6 9,5

33,3

45,0

35,0

41.7

42.9

38.9 66,1

33.3

41,2

29.4

36.8

38,1

-69Mapeação do gene Tea utilizando células híbridas somáticas de murganho/hamster. Os símbolos indicam a presença (+/) ou ausência (-/) do fragmento de restrição Tea murino relacionado ccm a presença (/+) ou a ausência (/-) do cromossoma de murganho particular indicado pelo numero da coluna da esquer da, detectadc por hibridação com a sonda de cDNA 20.5. O número de observações não concordantes constitui o somatório das observações +/- e -/+.

Nenhum destes híbridos foi cariotipifiçado. Foram tipificados per outros marcadores, e, portanto, é possível que as células híbridas +/- contenham fragmentos do cromossoma 8 cu uma pequena percentagem das células que contêm o cromossoma.

A excepção -/+ pode conter uma porção do cromossoma 8, mas ausência da região que contém o gene Tea.

Fara confirmar e aprofundar esta observação, posicionou-se Tea nc cromossoma 8 por análise de cruzamento revertido interespécies. O DNA digerido com SstI mostrou que murganhos NFS/N produzem bandas de reacção cruzada de 10,0, 7,4 e 5,5 kb.

O DNA. de M. m. musculus produz fragmentos de 10, 6,4 e 5,5 kb.

A Figura 19 mestra o esquema de hibridação da sonda de cDNA 20.5 no cruzamento revertido de murganhos Fl NFS/N χ M. m. musculus com M. m. musculus. O esquema de segregação do polimorfismo do comprimento deste fragmento de restrição com outros marcadores no cromossoma 8 demonstrou que este gene estã ligado a Gr-1 e Es-1 ccm a ordem genética: centrõmero-Polb-Gr-l-Tea-Es-1 (Quadros 7 e 8) .

Quadro 7

Segregação do	fragmento	de hibridação	Tea com alelos	de Polb
Gr—1 e Es-1 na	progénie	57 de um	cruzamento	revertidc	> interes-
pécies.
	Hereditariedade3·	do alelo NFS/N	Numero de
Murganho	Polb	Gr-1	Tea	Es-1	murganhos
Progenitores	+	+	+		+	22
	-	-	—		-	13
Singelo	+	+	+		-	5
Recombinantes	-	-	-		+	9
	+	+	-		-	0
	-	-	+		+	2
	+	-	-		-	1
	-	+	+		+	5
+ = Hereditariedade do	alelo; -	= ausência	de hereditariedade
			do	alelo

Quadro 8

Recombinação

Par de locus	r/n	CM +/- S.E.3
Polb, Gr-1	6/57	10,5 +/- 4,1
Gr-1, Tea	2/57	3,5 +/- 2,4
Tea, Es-lb	14/57	24,5 +/- 5,7
Polb, Tea	8/57	14,0 +/- 4,6
Gr-1, Es-L	16/57	28,0 +/- 5,9
Polb, Es-xl	22/57	38,6 não sigi

ficativo

-71^aDistâncias em centimorgans (cM) e erro-padrão, para cada par de locus calculadas de acordo com Green (19) a partir do núme ro de recombinantes (r) em um tamanho de amostra de n.

riais 46 murganhos foram marcados para Tea e Es-l para um núme ro total de recombinantes de 24 em 103 murganhos de cruzamento revertido (23.3 cM +/— 4.2).

A localização do gene Tea no cromossoma 8 proporciona a prova de que o gene é diferente do gene Rec-1 que codifica ERR e que estã localizado no cromossoma 5. Também elimina a po£ sibilidade de Tea ser o receptor retroviral MCF que tem sido lo calizado no cromossoma 1 embora não haja dados suficientes para determinar se estã relacionado com o receptor para o vírus A/10 que ainda não foi mapeado num cromossoma.

Setenta genes ou produtos genéticos são conhecidos por aumentarem a expressão quando em células T activadas como resposta a uma associação do antigénio e moléculas de auto-histocompatibilidade na superfície das células que apresentam c an tigénio. Os activadores policlonais tais como as lectinas, ionó foros de cálcio ou anticorpos para o receptor da célula T para o antigénio pedem simular a resposta induzida pelo antigénio. Alguns destes genes de activação estão envolvidos na transição entre Gq e G^ do ciclo celular. Algumas codificam citoquinas e cs seus receptores, proteínas reguladoras nucleares e ain da outras estão envolvidas no transporte de iões e nutrientes para as células para as prepararem para o desenvolvimento. Pelo menos 26 produtos genéticos de activação de célula T foram lo calizados na membrana celular, 0 primeiro exemplo, 20.5 de um gene clonado ou de um cDNA que tem o potencial para codificar uma proteína que se distribui na transmembrana múltipla e que é

-72induzida durante a activação da célula T, ( .¼ processo de activação da célula T esplénica inicia do por ConA cu pelo antigênio inicia-se dentro de alguns minutos de contacto com pectina ou apresentação do antigênio e con tinua durante um período de 7 a 14 dias, aproximadamente. As alterações na expressão genética ocorrem durante o período de activação. Crabtree catalogou estas alterações na expressão ge nética pela analogia com as activações do gene virai (imediata, precoce, tardia e muito tardia). De acordo com o critério de Crabtree, Tea é um gene precoce porque o mRNA de Tea é virtual_ mente indetectãvel em células T normais inactivas, aumentos pa ra níveis detectáveis em 6 horas e máximos em cerca de 24 heras.

A função do gene Tea não é ainda conhecida; pede ser uma função para sinais de transdução ou moléculas de pequeno transporte que são transdutoras de sinal, ou pode funcionar como um receptor para um ligando não identificado. 0 terminal carbóxi longo da proteína de Tea putativa talvez possa funcionar como um trans dutor de sinal, embora não exista prova que apoie esta hipótese.

Uma vez que as células de linfoma T SL12.3 e numerosas outras linhas de células tumorais T e B não exprimem este gene, a expressão do gene Tea não é necessária para o desenvolvimento celular. Contudo, os estudos não excluem a possibilidade de as cé lulas T normais necessitarem da expressão do gene Tea para iniciarem a proliferação celular normal que acompanha a activação da célula T. A interferência com a expressão deste gene pode blo quear a activação das células T nas doenças de autoimunidade, tais como a diabetes da artrite é outras doenças da imunidade medeadas pelas células T.

A espantosa homologia entre as proteínas de Tea e de

ERR sugere que o produto do gene Tea deve funcionar como um receptor retroviral murino, uma vez que pelo menos quatro classes de receptores de retrovirais murinos foram definidas geneticamente e apenas uma fci clcnada per via molecular. A localização do gene Tea no cromossoma 8 elimina a possibilidade do gene Tea codificar o receptor do vírus MCF ecotrcpico recombinante e per mite a possibilidade de poder codificar o receptor retroviral anfotrcpico que foi localizado no cromossoma 8. Em centraste ccm o gene Rec-1 (que codifica ERR), o que é expresso em todos os tecidos murinos, o gene Tea tem uma distribuição tecidular muito mais limitada. Se o gene Tea codifica uma proteína que funciona como um receptor retroviral, a distribuição tecidular limitada pode proporcionar especificidade para os retrovirus que são restritos à linhagem linfóide. Um precedente para a restrição mediada pelo receptor é o retrovirus humano HIV que utiliza a proteína CD4 como o seu principal receptor. Contudo, os recepto res específicos da célula são muito diferentes para serem intei ramente responsáveis pela especificidade tecidular dos retrevírus murinos. 0 tropismo do tecido exibido pelos retrovirus é provavelmente resultante de uma série complexa de factores, tais como a especificidade tecidular de variações LTRs nas proteínas gp 70 env, factores celulares e/ou a expressão de receptores su perficiais da célula apropriados. Quando o sítio de ligação de ERR para o vírus for identificado, será possível determinar se o sítio ê uma região de grande similaridade com a proteína Tea. Os estudos de ligação virai e de infecçãc são necessários para determinar se a proteína Tea funciona como um receptor virai.

Apesar do grande grau de similaridade do produto genê tico ERR, existem diferenças substanciais nas propriedades físi^

-Ίϊ-

cas das proteínas Tea e ERR previstas. Estas mapeiam para cromossomas diferentes e os seus esquemas de expressão tecidular são diferentes. Uma vez que as funções celulares naturais de ambos estes genes são desconhecidas, são necessários outros es tudos para determinar se similaridades funcionais devem existir entre as duas proteínas. Uma análise dos aminoácidos conservados e não conservados pode proporcionar uma visão das funções similares ou distintas da proteína ERR e do produto do gene Tea. Em particular, a identificação desta nova família de genes e as regiões da sequência de DNA que são grandemente conservadas entre as duas moléculas permitirão agora investigações de novos membros desta família genética.

Os véctorés designados por pT7T3-19.1 (número de acei tação 68298), pT7T3-19.2 (número de aceitação 68299), pT7T3-19.4 (números de aceitação 68300, 68301, 68302), pT7T3-19.5 (número de aceitação 68303) e pT7T3-20.5 (número de aceitação 68305) foram depositados no American Type Culture Collection (ATCC), Rock ville, Md., Estados Unidos da América, a 13 de Abril de 1990. Os depósitos estão disponíveis como consequência das leis das paten tes e regulamentos dos Estados Unidos e dos países estrangeiros em que estão registados os correspondentes deste pedido de paten te de invenção. A disponibilidade do depósito não constitui uma licença para a prática desta invenção e do seu pedido em derroga ção de qualquer patente de invenção ali concedida ou qualquer di_ visão ou continuação em parte do presente pedido de patente de invenção,

Tendo a presente invenção sido completamente descrita, será evidente para um especialista na matéria que se podem fazer mudanças e modificações sem afastamento do seu espírito ou âmbito tal como ê definido nas reivindicações seguintes.

Claims (23)

1. REIVINDICAÇÕES

   1.- Processo para a preparação de polipéptidos recombinantes contendo a sequência de aminoácidos de uma proteína de células T codificada pelos genes escolhidos entre o grupo constituído por 19.5, 20.5, 19.1, 19.2, 19.3 e 19.4, caracterizado pelo facto:

   a) de se transformar um hospedeiro com uma sequência de ADN que codifica para a proteína de células T;

   -Tò-

   b) de se exprimir a referida sequência de ADN; e

   c) de se isolar a referida proteína de células T.
2. 2.- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracte rizado peio facto de se submeter o polipeptido obtido a uma ope ração ulterior de purificação para se obter uma forma substancialmente pura.
3. 3. - Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo facto de a proteína de células T citada antes ser codificada por ADN de linfoma T.
4. 4. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracte rizado pelo facto de a sequência de aminoácidos, citada antes, ser codificada pela sequência de ácido nucleico seguinte:

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5. 5.- Processo de acordo com a reivindicação 1, caract' rizado peio facto de a sequência de aminoácidos citada antes ser codificada pela sequência de ácido nucleico secuinte:

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   BAD Ο Η í Ci ί N aL

   5,- Processo ds aoordo cor. a reivindicação L, caracte terizado oeio zacuc ds a sequência de aminoao ocos ortaoa artes ser oocifioada oeia secuênoia cs ácido nuoisioo ssçuints:

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6. 7.- Processo de acordo rizado peie facto de a sequência ser codificada peia sequência de com a reivindicação 1, caracte ds aminoácidos citada anuas acido nucleico seguinte:

   bad ORIGíNâl

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7. 8.- Processe- de acordo com e reivindicação L, caracterizado peio facto de a sequência de aminoácidos citada antes ser codificada peia sequência de ácidc nucleico seguinte:

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   BAD ORIGINAL

   I..................

   -82Α-
8. 9. - Veículo de expressão, caracterizado pelo facto de comportar uma sequência de ADN codificacora para qualquer uma das proteínas de células T como descritas nas reivindicações

   4 a 8 .
9. 10. - Veículo de expressão de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo facto de ser um plasmídeo capaz de re plicação em um hospedeiro que comporta, numa ligação operável (operable linkage):

   a) uma origem de replicação;

   b) um promotor; e

   c) uma sequência de DNA que codifica para-uma proteína de células T.
10. 11. - Veículo de expressão de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo facto de ser um fago ou um plasmídeo capaz de replicação em um hospedeiro eucariótico que comporta em uma ligação operável (operable linkage):

    a) uma origem de replicação procariótica;

    b) um promotor procariótico; e

    c) uma sequência de DNA que codifica para uma proteína da transmembrana de células T.
11. 12. - Veículo de expressão de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo facto de se escolher entre

    BAD GRIG'í\!AL i

    pMAMneo, pNEO/Tfr-NC e pMAM/neo/Tfr-NC.
12. 13.- Vector, caracterizado pelo facto de comportar uma sequência de DNA que codifica para uma proteína de células T.
13. 14. - Vector de acordo com a reivindicação 13, caracte rizado pelo facto de se isolar do grupo constituído por um plasmídeo, um fago e um cosmídeo.
14. 15. - Vector de acordo com a reivindicação 14, caracte rizado por ser o pT7T3-19,l com o número de aceitação na

    ATCC 68298.
15. 16. - Vector de acordo com a reivindicação 14, caracte rizado por ser o pT?T3-19,2 com o número de aceitação na

    ATCC 68299.
16. 17. - Vector de acordo com a reivindicação 14, caracte rizado pelo facto de ser o pT7T3-19,4 com os números de aceitação na ATCC 68300-68302.
17. 18. - Vector de acordo com a reivindicação 14, caracte rizado pelo facto de ser o pT7T3-19,5 com o número de aceitação na ATCC 68303.
18. 19. - Vector de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo facto de ser o pT7T3-20,5 com o número de aceitação na ATCC 68305.
19. 20. - Hospedeira, caracterizada pelo facto de se trans formar com uma molécula de DNA recombinante contendo uma sequên cia de DNA que codifica para qualquer uma das proteínas de célu las T como descritas nas reivindicações 4-8.
20. 21. - Hospedeira de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo facto de ser a E. coli.
21. 22. - Método para a produção de proteína de células T, caracterizado pelo facto:

    a) de se transformar um hospedeiro com uma sequência de DNA que codifica para a proteína de células T;

    b) de se expressar a sequência de DNA., citada antes; e

    c) de se recuperar a proteína de células T, citada antes.
22. 23. - Processo para a preparação de composições farmacêuticas úteis para induzirem a produção de anticorpos para a proteína da transmemhrana de células T em um indivíduo, caracterizado pelo facto de se incorporar uma quantidade eficaz, sob o ponto de vista imunologico de proteína de transmemhrana de cé

    -85lulas T produzida de acordo com o método descrito na reivindicação 22.
23. 24.- Processo para a preparação de composições farmacêuticas de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo facto de o antigénio referido ser uma proteína de células T recombinante .