PT97526A - Hospedeiros bacterianos deficientes em proteases - Google Patents

Description

Referfnc.ia a Pedidos de Patente Relacionados

Este pedido de patente è uma Continuação em Parte de U.S» N2 tíe Série @7/169,488, entregue em 17 de Março, 1988, o conteúdo da qual â aqui incluída como referfncia.

Campo do Invento

Este invento situa-se no campo da genética molecular,.

Especif icanusnte, este invento é dirigido a mutantes ds E.____coli que sao capaces de expressar níveis elevados de proteínas heteró-logas»

FUNDAMENTO DO INVENTO I„ Expressão de Proteína Estranha em Células Baeterianss A capacidade para controlar ou regular a expressão de um gene olonado homólogo ou heterólogo numa célula hospedeira é uma necessidade central da tecnologia de DMA rseombinantB,. As moléculas rscombinsntas capazes de mediar a expressão de tais genes s métodos para empregar tais moléculas estio descritas por Cohsn et al. U.S* 4,237,224 e 4,468.464 e por Maniatis, T« et âL·.» .........IA Laboratg.ry_ Manual >., 21 sdiçlo, Colda

Spring Harbor Laboratory, 1989.

Quer a expressão do gene cionado seja continua ou modulada, quando ss pretende expressar o gene, é f requer? temente desejável obter o máximo tíe proteína possível.. A quantidade de uma proteína danada que é recuperada de um hospedeiro refiecte um equilíbrio entre a capacidade do hospedeira para sintetizar a proteína e capacidade do hospedeiro para degradar a proteína» Muitas vezes, os hospedeiros bacterlanas degradaas proteínas estranhas clonadas a velocidades que são muito superiores á velocidade de degradação de uma proteína hospedeira homóloga» Assim, é desejável identificar mecanismos que possam minimizar tal degradação» il= Enzimas Mitrogsnases em Rhizobium meli laM. A finação do azoto em Rhizohium meliloti e noutros diazotróficos é um processo insrsntemente sensível ao oxigénio» A nitrogenase è protegida da danificação pelo oxigénio dentro de um nódulo simbiótico por hemoglobina, a qual fornece oxigénio a baeieróidss dentro do nódulo mantendo ao mesmo tempo condiçSes microaeróbicas» A produção da enzima nitrogenase na presença de oxigénio ê eficazmente evitada uma vez que NifA, o activador da transcrição dos genes estruturais da nitrogenase, é regulado em dois níveis pelo oxigénio» A transcrição de R» meliloti n.ifft é regulada pelo par sensor/regulador ambiental f i x l.J α qual estimula a transcrição de nifA apenas em condiçBes microaerébicss ÍDxfcta, S», et al» » J. Bacteriol» 169;5217-3223 (1987)? Oavid, M = lt._a.l_»., Cel 1 54s671-063 (1988))» Em adição, o produto do gene nif A é ele própria inactiva em condiçóes aeróbicas (Fischer, H = -n„ st al » Mol» Ben »____Benet» 2Θ9s621-6Ξ6 C i987) q Beynon, J»L« et al- , EHBO J» 7 = 7-14 (1988)¾ Huala, E» et al», J»__Bacteriol» 171s3354-3365 (1989))= A inactivação de NifA de R, meliloti em condiçass aeróbicas ocorra mesmo quando NifA é expresso sm E. cdIí, sugerindo que a inactivação de NifA por oxigénio não requere a presença de quaisquer factores do hospedeiro ou que tais factores estio presentes em R*.___meliloti e sm E» coli» Pelo contrárioNif A do diszotróíica de vida livre Kleoslel la___pneumo nia é sensível ao oxigénio apenas na presença de nifL» o qual é coiranscrito com nifA em K, oneumoniae mas para o qual nSo se encontrou homólogo em qualquer espécie simbiótica fixadora de azoto» Não está esclarecido como o produto nifL. modula a aciivi-dade Nif A em K.„ pneumonia em resposta ao nível de oxigénio»

Trabalhos anteri?;jres com Nif A de R, mel i lati demonstraram que pequenas alterações na sequlncia de aminoácidos do extremo ansina pode ter um efeito drástico no nível de acumulação de Nif A quando expresso em E» coli CHuala» E. et._ai,, J...

Bacteriol» 171;5354-35éo (Í9S?))» NifA traduzido a partir de do primeiro codão AUS \MifA-AU8i> acumula~ss em níveis muito baixos quando as células são cultivadas aarobicamente s atinge níveis lígeiramsnts superiores qando crescidas em 1% de oxigénio» Pelo contrário^ várias NifA variantes com sequincias do extremo amina alteradas acumulam-se em níveis muito elevados em E,·. coli durante o crescimento aeróhico ou microseróhico, mais provávelmente devido a diferenças na estabilidade CHuala, E. et al» » J» Bacteriol» 1.71 s5-554-5565 (1989)>= Parece provável que esta diferença na estabilidade é mediada por um factor presente em E» coli mas ausente em R» meliloti» uma vez que em R» meltlotl não se observou diferença na acumulação entre diferentes formas de NífA» No entanto» não foram identificados fsetores em E., coli que provocam o decréscimo rápido na actividade transcricional de NifA"AUBi na presença de oxigénio» Se tais fsetores pudessem ser identificados ou inactivadosg c#s hospedeiros E»_coli poderiam ser capazes de manter níveis elevados de proteína expressa numa forma altamente estável»

SUMÁRIO DO INVENTO

Reconhecendo a importância da elucidação da via em E, cali que provoca o decréscimo rápido na actividade transcricional em MifA-AUBÍ na presença de onigénio,; d inventor decidiu identificar factorss sm E» coli que medeiam o decréscimo da actividade Niffi na presença de concentrações altas de OKÍgénio5 quer pelo decréscimo da acumulação de MifA quer pela contribuição para a inaciivaçlo de NiíA» 0 inventor realizou uma muiaqénese Tnõ de E, coii e isolou muiantes com maior actividade NifA-AUBi durante o crescimento seréoico» Estes estudos cumularam na identificação de células hospedeiras E» coli muiantes possuidoras da capacidade de expressão de proteínas clonadas de uma forma altamente estável»

Assims constitui um objectivo do invento proporcionar hospedeiros foaetecianos que SKpressem proteínas estranhas de uma forma altamente estável» Ê ainda um outro objectivo do invento proporcionar métodos para criar e identificar tais hospedeiros»

BREVE DESCRIÇKO DOS DESENHOS

Figura 1» Agrupamento das inserções Ϊπ5 em tr@s classes» Transferência Southern de DNA cortado com EcoRX das estirpes LC2-LC25» despistadas com Tno» Os pesos moleculares estio apresentados em Kilobasss á direita» As setas indicam inserções ©ro snoA ÍA), snoB <B) s snoC <C> » j-igura 5» Transfertncia Southern de DNA cortado com EcoRI ÍA) e EcoRV (B)das estirpes LC4a LC6» LCi75 LC23 e LC25, despistados

I τ

com Ϊη5» Faixa i? LC4 <snoB)i faixa 2.» LCé (snoB)g faixa 3* LC17 (snofi)g faixa 4, LC23 (snoB)s faixa õ5 LC25 CsnoB). A estirpe LGí7? que originaImante pareceu ter uma inserção em snoB <Fig» 1 > =i foi reclassificada como uma inserção snoA como resultado desta experiência* Os pesos moleculares estio apresentados em Kilobases è direita»

Figura 3, A posição das inserções snoB rslativamente ao sitio Sal I em ala S. Transf sr^ncias Southern de DMA cortado com Sal I das estirpes L.C4 <15, L.C6 (2), LC23 <35 s LC25 <45 despistadas com Tn5» Os pesos moleculares estão apresentados em Kilobases à direita*

Figura 4* PosiçBss do mapa físico de Tn5 em LC24. Transferência Southern de DMA de MCi®èl cortado com BamHI <i>5 HindiII <25, EcoRI <35 , EcoRV <45, Bqlll <55, Kpnl (6), PstI (7) e PvuII (8) despistada com DNA deiimifcants da inserção Tn5 em LC24= A banda com o sinal de hibridsçlo mais intenso foi escolhida para cada encima e os tamanhos destes fragmentos foraffi usados para determinar a localicaçSo da inserção Tn5 em snocC no mapa físico de Koharas Y» et ah» Cel1 56s495-568 <19875* Qs pesos moleculares estão apresentados em kilobases à direita»

Figura 5» Imunodetecção de NifA-~AU81 de R* meliloti em MClÔàl s derivados mutantes crescidos em 1% ou 21% de oxigénio* <A) Células cultivadas em 1% de oxigénio» Faixa C, KC10&1 contendo apenas yector (sem NifA>§ faixa 1, Μ01Θ61 com pEH32 <NifA-AU8Í > ? faixa 23 HA62 (1on) com pEH32s faixa 3? LC23 CsnoB) com pEH32s faixa 4? LC24 CsnoC) com pEH32= <B) Células cultivadas em 21% de oxigénio? faixas como na parte A» As posiçSes dos marcadores de peso molecular estio apresentados à direita <x 6=,661} *

Figura ò. ImunadetscçMc ds MifA-dsltaM de R, mel1 loti em MClC?6i s derivados mutantes crescidos Sffi 1% ou 21% ds oxigénio,, CA) Células cultivadas sm 1% de oxigénio. Faixa C, f!CÍ®6Í contendo apenas vsctor (sem NifA>jj faixa 1 „ riCluél com pEHdeltaRI <NifA-AUGl>; faixa 2, HA62 (lon) com pEHdeltaRI; faixa 3, LC23 <siioB) com pEHdeltaRI; faixa 4, LC24 (snoC) com pEHdeltaRI,, CB) Células cultivadas em 21% de oxigénio, faixas como na parte A. As posições dos marcadores de peso molecular estão apresentados à direita < x Θ,ΘΘί),

Figura ?, ImunodetscçSo de Nifft-AU8i de R» meliloti em lon„ snoB 1 on s mutantes snoC 1 on crescidos sm 1% ou 2Í% de csxigénio. CA) Células cultivadas sm 1% de oxigénio» Faixa t9 HA62 (lon) com pEH32 (NifA---AUG1) í faixa 2,, HA63 (snoB lon) com pEH32g faixa 3, HA64 (snoC lon) com pEH32. (B) Células cultivadas em 21% ds oxigénio, faixas como na parte A» As posições dos marcadores de peso molecular estão apresentados à direita Cx 0,001),,

Figura 8» ImunodetscçSo de NifA-deltaNl de R.____fijeliloti em mutantes lon. snoB lon s snoC lon crescidos em 1% ou 21% de oxigénio» <A> Células cultivadas em 1% de oxigénio. Faixa 1, HA62 (lon) com pEHdeltaRI CNifA~deltaN)s faixa 2,, HA63 \ snoB lon) com pEHdeltaRI; faixa 3, HA64 <snoC lon) com pEHdeltaRI» CB) Células cultivadas em 21% de oxigénio, faixas como na parte A» As posições dos marcadores de peso mal seu. lar estio apresentadas à direita Cx Φ,ΘΘΙ)»

Figura 9. Expressão de fs-galactosidsse a partir do promotor t.acZ„ Gel em dodecilsulfato de sódio CSDS) e poliscrilaroida da proteína total» CA) Células cultivadas em 1% de oxigénio, CB) Células cultivadas em 21% ds oxigénio» Faixa 1. HC10àI com pr!B210s faixa 2, flCieéi com pLAC;; faixa 3, LC12 com pLAC? faixa 4, LC23 com pLACs faixa 5, LC24 com pLAC» A seta indica a posição da fs-galaciosidase» Posições ds marcadoras da pesos moleculares estSo apresentadas à direita ίχβ,,ΘΘΙΚ

Fioura 1Φ„ Estabilidade ds NifA em HCiôói s derivados mutantess electroforsse em gel de dodecilsui fato de sódio e poliacrilamida <SDS~Pft8E) ds NifA imunoprecipitado após um pulso de 2 minutos com Í35Sj-metionina a um intervalo de & a ó horas com metionins nSo marcada em excesso= 0 comprimento do intervalo para cada faixa está indicado em horas no topo da Figura» Faixa C, ΗΟΙΘόί com pEHdsliaRI (sem NifA-deltaN)s Cl), HClôéi com pEHdeltaRI? (II), HA62 (lon) com pEHdeltaRIf UII), LC23 (snoB) com pEHdeltaRlo CIV)5 LC24 com pEHdsltaEí» ív)5 Hé3 1on snoB) com pEHdsltaRIg (MI), HAó4 (lon snoC) com pEHdeltaRIu As posições dos marcadores de peso molecular estio apresentadas á direita <x 0,801).

Figura 11Semi-vida ds NifA-deltaM em estirpes selvagens e mutantss. A quantidade de NifA é dada como o log natural do número casos da decaimento detestados ao longo de ΙθβΘ minutos para cada banda NifA vísivel na Fig» 1Θ. (A), ΜΟίΘόί; (B), HA62 Uon)a <C) LC23 (snoB)s CD), HA63 (lon snoB; CE), LC24 (snoC); CF), HA64 (lon snoC),

DESCRIÇÃO DAS REALÍZAÇSES PREFERIDAS Ϊ,= Dafiniçass

Ma descrição que se segue5 é e/ítensivamente usada uma série da termos usados em tecnologia de DMA racombinants írDMA). Para proporcionar uma compreensão clara e consistente da especificação e reivindicaçõess incluindo α Smoito a ser dado a tais termos são dadas as definições que se seguem» 8sns„ Uma sequfncia de DMA contendo um molde para uma RlMA-polimerase. 0 RMA transcrito a partir de um gene pode ou não codificar uma proteína,. 0 RNA que codifica uma proteína é designado RNA mensageiro ímRNA),,

Um gene de “DMA complementar" ou "cDMA" inclui genes recombinantes sintetizados por transcrição reversa de mRNA,,

Veículo de clonagefiu Um DMA de plasmideo ou de fago ou outra sequência ds DMA que ê capaz de se replicar autonomamente numa célula hospedeira e que á caracterizado por um ou um pequeno número de sítios de reconhecimento por endonucleases nos quais tais saqu@ncias ds DMApodeai ser cortadas de uma forma determinável sem perda de uma função biológica essencial do veiculo e no qual pode ser inserido DMA da forma a ser replicado e clanado» D veiculo de clonagem pode ainda conter uma marca adequada para usar na idsntificação ds células transformadas com o veículo ds clonagem,, As marcas5 por eKemplos são resistência á tetraciciina; canamicina ou ampicilina,, A palavra "vsctor" à por vezes usada para "veiculo de clonagem"»

Veiculo de expressão,. Um veiculo ou vector semelhante a um veículo de clonagem que ê capaz de expressar um gene que foi Γ

clanado nele, após transformação num hospedeiro* 0 gene danada é qeralments colocado sob o controle ds certas sequências de contrais íi*e* ligada operscionalmente) tais como sequências de promotoras* As sequências tíe controle da expressão variarão dependendo se o vsctor foi projectado para expressar o geris — operacionalmente ligado ds uma forma continua ou de uma forma regulada e pode adicionaimente conter elementos Iranscricionais tais como sequências de terminação, ssqufncias que aumentem a tradução do mRNA e sequência que promova a secreção da proteína* ) II» Engenharia Senética dos Hutantes do Invento

0 invento proporciona linhas celulares estáveis do hospedeiro E* coli que sejam capazes de se replicar s crescer continuaments em meio de cultura e condições ambientais adequadas* Em adição estas células hospedeiras contêm mutações que inactivam vias proteoliticas s permitem uma acumulação inespera-damente alta ds proteínas estranhas* Em adição, estas células sSo capazes de servir como fonte para a purificação s clonagem ds genes mutagsnizados que são responsáveis pelas vias proteoliticas inactivadas* Em adição, estas células são capazes de servir como um sistema modelo para o ensaio da presença de fsetores s outros agentes, incluindo mutações adicionais, as quais podem reverter ou aumentar a capacidade inerente destas células para expressarem proteínas clonadas de uma forma altamente estável*

Fez-se um depósito das linhas celulares do invento na American Type Culture Collection, 123Θ3 Parklat~n Drive* Rackvxlie, MD 2Θ852, USA em 1 de riaio* 199Θ* à célula hospedeira LC24, que contem uma mutação snoC foi atribuído o número de acesso ATCC 55#4®* h célula hospedeira HA63, que contem uma íi mutação dupla lon e snoB, foi airibuido a número de acssso ATCC 55®39. 0 presente invento está relacionada com uma célula hospedeira hacteriana que contem uma mutação no seu gene snoC nativo ou nos seus elementos reguladores* Esta mutação resulta numa célula hospedeira que é tíefectiva nas vias proteolíticas usadas para degradar proteínas estranhas e que, como resultado de tal mutação, acumula quantidades surpreendentes de tais proteínas estranhas* 0 presente invento está ainda relacionado com uma célula hospedeira bacteriana que é dupla mutants e contem uma mutação no seu gene nativo lon e no seu gene nativa snoB* Esta dupla mutação também resulta numa célula hospedeira que é defsc-tivs nas vias proteolíticas usadas pare degradar proteínas estranhas s que, como resultada ds tais mutações, acumula quantidades surprendentes de tais proteínas estranhas*

Foram identifiçadas duas classes de mutantes Eh______coli sno ísstahilidade de NifA em OKigénio) pelo método do invento com a capacidade ds proporcionar uma estabilidade surpreendente de

proteínas estranhas em células hospedeiras E=_coli =. A primeira

classe são duplos mutantes nos locus snoB e lon de £, coli. A segunda classe são mutantes simples no locus snoC de E*_coli,

Tanto os mutantes duplos snoB lon coroo os simples snoC resultam em células hospedeiras que possuem uma menor capacidade para dag radar prote ina.s sstran has.

Os mutantes do invento podem ser identifiçados por um esquema de selecção que utiliza uroa construção recombinante que contem um promotor regulado por MifA cnifH de R* melíloti) fundida cam um gene repórter;; lacZ* A estirpe hospedeira, E»___coli 1 5 f

estirpe ΜΟίΦάί, gus foi transfarmada com esta construção cresce muito fracamsnte em neio mínimo com lactose na ausência de NifA activos Portanto5 quando NifA não é expresso ou de outra forma é inactivado ou não está presente no hospedeiro, o hospedeiro cresce muito fracamente em meia mínimo com lactose» Por crescimento muito fraco pretende-se significar que HC10ÒÍ produz colónias fracamsnte vísivsis apés 84 horas de crescimento a 28°C =

Para criar os mutantes do invento, E_*____coli estirpe )

MC106Í3 portadora de um gene de resistência à canamicina, o plasmídeo de eKprsssão de IacZ-nifA, pEH32, e o gene repórter nifH-lacZ da plasmídea pHB2í0s pode ser mutaqsnizada, por exemplo, com TnS e semeadas em placas de meio mínimo com lactose» Os mutantes com um nível aumentado de activídads NifA, resultando numa maior capacidade para activar a sKpressio da fusão nifH-1acZ» aparecem como colónias maiores contra um fundo de microcolónias« As colónias grandes resistentes à canamicina podem ser isoladas semeando-as em meio mínimo com lactose e o ssu tamanho grande verificado semeando-as intíividualmente em meio mínimo com lactose s comparando-as com !S!C1®61 tipo selvagem portadora de pEH32 e ρΜΒ21β* A ausência de uma inserção TnS nos plasmídsos transportados pelos mutantes ΜΟΙΘάΙ pode ser verificada pelo isolamento de DMA ds plasmídeo a partir de cada mutante e transformação de E» coli MCtôèi» Se não resultarem colónias resistentes á canamicina, então as inserçSes TnS estão localizadas no cromossoma

Para identificar o sitio ds mutação (aqui o sítio da inserção TnS), DMA cromossómico de cada uma das estirpes mutantes pode ser eKtraído por técnicas conhecidas e digerido com enzimas ds restrição s analisado numa transferência Southern usando uma sonda» Para os mutantes feitos pela mutação TnS, usou-se uma mutação TnS» Se os hospedeiros forem mutagenizados quimicamente. a localização da mutação pode ser dstersiinada por sequenciação química =

Usando a mutação Tn5 como descrito atrás encontrou-se que as mutações ocorreu? em três fragmentos EcoRl diferentes do genoma hospedeiro. Estes foram designados como mutantes snol (grupo 2) ou snoC (grupo 3>« Ainda nalguns casos, como descrito abaixo, nalguns casos foram feitas duplas mutações»

As localizações genéticas aproximadas das mutações podem ser determinadas por mapeamento de Hfr„ A mutação snoA do invento está entre 2 e 13 minutos, a mutação snoB da inventa está entre 23 s 3Θ minutas s a mutação snoC do invento está entre 51 e 61 minutos do mapa genético de Bachmann, B.J., em Escherichia EaU. e Balmonella typhifflurium,, F„C„ Meidheardt, ed. vol. II, í1987), Am. Soc. Hicrcbiology, Washington, ρρ = 807--876 =

Para examinar a estabilidade ao oxigénio da proteína expressa, os mutantes sno que contfm os plasmldsos pEH32 (IMifA-AUG1)e ρΜΒ21Θ xnifH-íacZ) podem ser cultivados em meio LB sob uma corrente continua de 1% ou 21% de oxigénio durante 16 horas s testado quanto à actividads de is-galactosidase a partir da fusão repórter nifH-lacZ= Quando crescido em 21% de oxigénio, os mutantes do invento apresentam níveis de actividads de B~ga~ lactosidass cerca de dez vezes superiores ao tipo selvagem ΜΟΙΘάΙ contendo pEH32 e ρί¥!Β21Θ,. Em 1% ds oxigénio, os mutantes snoA e snoC apresentam níveis lioeiramente elevados de actividads de [5-ga lac tosidass relativamente a WC1061, enquanto que os mutantes snoB não apresentam aumento relativo na actividade de P»-ga lac tosidass. A inserção 1on s sΤη1Θ do HphS2 pode ser transferida para hospedeiros com mutações simples tais como LC23 e LC24 para criar

estirpes hospedeiras com duplas mutações <estirpes HA63 < ion snoB) e HA64 (1on snoC), respectivamente). Estes mutantes duplos podem também ser transformados com pEH32 ou pEHdsltaRI e observada a acumulação de NifA*

Para determinar a sequência e identidade das mutações, a inserção Tn5 s DMA circundante podem ser sufoclonados a partir de cada mutante* A mutação que resulta no fenètipo snoA em LC12 á cerca de 55 Kb a partir de proCa dentro do gene lon que codifica a proteass La» A mutação qus resulta no fenètipo snol do hospedeiro LC2.3 está situada aproximadamente 16Θ pares da bases a jusante do codlo de terminação da alaS qus codifica alanil-tRNA-sintetsse. A mutação qus resulta na fenótipo snoC do hospedeiro LC24 está situada a aproximadamente 1Θ Kilobases de nirR <29,4 min) na direcção de rac» A capacidade de um mutante para expressar uma proteína estranha de uma forma estável pode ser determinada testando os níveis da proteína nas células hospedeiras, por exemplo imuno-logicaroente com anticorpos contra a proteína·, Π1» Engenharia, Benétim.-de.....Proteínas a serem Expressas nos

MyAMltei-jdQjLnvmto 0 processo para a engenharia genética de sequências proteicas, de acordo com o invento, é facilitado através da clonagem ds sequências genéticas qus são espaces ds codificar a proteína pretendida e através da expressão ds tais sequências genéticas,·. Conforme aqui è usado, o termo “sequências genéticas'1 pretende referir-se a uma molécula de ácido nucleico (de preferência DMA). Sequências genéticas que são capases de codificar a proteína pretendida derivam de uma variedade de fontes» Estas fontes incluem DHà genómico, cDNA, DMA sintético e combinações deles»

Be se utilizar DNA genóraico como fonte da sequência codificadora ele pode ou não incluir introes naturais» Ainda, tal DNA genémico pode ser obtido em associação com a região 55 do promotor s/ou a região 3? de terminação da transcrição» 0 grau até que uma célula hospedeira pode reconhecer os sinais reguladores da transcrição s/ou tradução associados à expressão do mRNA e proteínas pretendidos, seguido de regiões não transcritas 55 s/ou 3* do qene nativo, regiões não transcritas 55 s/ou 3? do ínRNA, podem ser retidas e empregues para regulação da transcrição e da tradução» 0 DNA genémico pode ser extraído e purificado a partir de qualquer célula por meios bem conhecidos (por exemplo, vsr Guide to Molecular Cloning Tschnigues» S.L. Berger st al« eds», Academic Press <Í987>>»

Como alternativa, o mRNA codificador da proteína pretendida pode ser isolado a partir de qualquer célula que produza ou expresse a proteína e usado para produzir cDNA por meios bem conhecidos (por exemplo, vsr Guide ta Molecular Cloning

Technigues» S = L» Berger et______ah, eds», Academic Press (Í987>>*

Prsferenciaimente a preparação de mRNA usada será enriquecida em mRNA codificador de uma proteína pretendida, naturalmente, por isolamento a partir de células que estão a produzir grandes quantidades da proteína ou in vitro» por técnicas normalmente usadas para enriquecer preparações de mRNA em sequências específicas, como seja centrifugação em gradiente de sacarose ou ambas» rara clonagem num vector, tais preparações de DNA adequadas (DNA genémico ou cDMA) são partidas ao acaso ou clivadas enzimaticamente, respectivassente e ligadas nos veciores adequados para formar uma biblioteca de genes rscooibinanta (genómico ou cDNA)=

Uma ssqufncia de DNh codificadora de uma proteína pretendida pode ser inserida num vecior de DMA de acordo com técnicas convencionais, incluindo produção da entremos cersss para ligação, digestão com enzimas de restriçãc· para proporcionar extremos adequados, preenchimento de extremos coesivos conforme adequado, tratamento com fosfatase alcalina para evitar ligações indesejáveis e liaçao com ligasse adequadas» Técnicas para tais manipulações estão descritas por rtaniatis, T,, et al-= supra a são bem conhecidas»

Bibliotecas recombinantes podem ser despistadas e um clons da pratsina pretendida identificada par quaisquer meios seleccionem especificaments ácidos nucleicos específicos de tal proteína, como seja por exemplo» a) por hihridação com uma ou mais sondas de ácido nucleico contendo uma ssqufncia específica da DMA desta proteína ou b) por análise de tradução seleceionada por hibridação em que o mRIMA nativo hibrida com o cione em questão é traduzido in vitro e as produtos de tradução são ainda caracterizados, ou c) se as sequtncias genéticas cionadas forem elas próprias capazes de expressar mRMft, por imunoprecipitacão de um produto proteico traduzido pelo hospedeiro contendo o cione»

Os oligouclsétidos sonda específicos de uma proteína qu.e podem ser usados para identificar clones desta proteína e podem ser projsctados a partir do conhecimento da sequfncia de sminoácidos da proteína» Devido ao código genético ser degenerado, pode ser usado mais de um codlo para codificar um acninoácido particular tWatson, 3.B., Ems Molecular Biology of the Gene» 3i Ed«, W»A» Benjamin, Inc», Menlo Park, CA (1977), ρρ» 356-357)= Os

fragmentos peptídicos foram analiazados para identificar sequências de arninoâcidos que pedem ser codificadas por oligonucleó-tidos tendo o grau de degenerescência mais baino* Isto é preferencialmente conseguido através da identificação de sequências que contêm arninoâcidos que sao codificados por apenas um codão»

Se bem que ocasionalmente uma sequência de arninoâcidos possa ser codificada par uma únoca sequência de oligonucleótidos, frequentemente a sequência de arninoâcidos pode ser codificada por qualquer de uma série de oliganucleòtidos» é importante que enquanto todos os membros desta série contêm sequências de· oligonucleótidos que são capares de codificar o mesmo fragmento peptídico e portanto potencialmente conter a mesma sequência oligonucleétidica do gene que codifica o fragmento psptidicof apenas um membro da série contem a sequência de nucleótidos que ê idêntica à sequência codificadora do exlo do gene. Devido a este membro estar presente na série e ser capas de hibridar com DMA mesmo na presença de outros membros da série5 é possível empregar a série não fraccionads de oligonucleótidos do mesmo modo que se empregaria um único oligonucleétido para clonar o gene que codifica o peptideo»

Usando o código genético Usatson, am?. Molecular Bloloqy of the Ssne, 3i Ed„5 W.A. Benjamin, ínc», Menla Park, CA (1977)>5 podem ser identifiçados um ou mais oligonucleótidos diferentes a partir da sequência de arninoâcidos, cada um dos quais seria capaz de codificar a proteina pretendida,. A probabilidade de que um oligonucleótido particular constitua de facto a sequência proteica real pode ser calculado considerando as relações de empare1hamentc de bases anormais e a frequência com que um codão particular é de facto usado (para codificar um aminoáoido particular) em células procarióticas» Tais "regras de utilização de cadSes9 estão descritas por Laths, R,, et al»» ã„

lio 1 se- Biol» i85s 1 -í2 i 1985)» Usando as “regras ds utilização de codõss" de Lathe3 identificou-se uma sequência de oliqonucleé-tidos ou uma séria ds de saqufncias da oligonucleétidos que contêm uma sequência de nueleótidos teoricamente 11 ma is provável" capas de codificar a proteína*

0 oligonuclsótido adequado ou série de oliqonucleátidos que é capaz de codificar uni fragmento do gene da proteína (ou que ê complementar de tal oligonucleóiido ou série de oligonucleóti-dos) pode ser sintetizado por seios bem conhecidos (ver par exemplo, Synthssis and Application of DNA and RMA» 8 = A* Narang, ed»» 19Q7? Acadesic: Press» San Diego3 CA) e empregue como sonda para identificar e isolar o gene clonado da proteína por técnicas conhecidas» As técnicas ds hibridação ds ácidos nucleicos e identificação de clones estio descritas em Maniatis? T=s et al»5 <HalflCUlflC......Çloning,j_A__Laboratory Manual.,.. 21 Ed-Cald Spring Harbor

Laboratories^ Cold Spring Harbor, NY (1989)) e por Hames=, B«D*?

BL.AÍj· <E«»s Mucjeic,,, Acid_IRL

Press5 Washington, DC (1985))» Os membros da biblioteca de genes atrás descrita que ss observou serem capazes fis tal hibridação foram então analisados para determinar o grau e natureza das sequências codificadora da proteínas que contêm»

Para facilitar a detecção da sequência de DNA codificador pretendidas a sonda de DNA atrás descrita foi marcada com um grupo deter.távei „ Tal grupo detectável pode ser qualquer material tendo uma propriedade física ou química detectável* Tais materiais foram bem desenvolvidos no campo da hibridação ds ácidos nuclaicos a em geral quase todas as marcas úteis em tais métodos podem ser aplicadas ao presente invento* Bao particularmente úteis as marcas radioactivas, tais como -Ή, Ò-S5 íz:5j ou similares» Pode ser empregue qualquer marca radioactiva desde que proporcione um sinal adequado e tenha uma semi-vida suficien- te = 0 oiiqormcleétido pode ser marcado radioactivamente, por exemplo, por "nick-translation” através de métodos bem conhecidos, como descrito por exemplo sm Rigby, et aL, J_,,____Mc?l, Bío.1íl 113! 23/ (lv/7> e por síntese de substituição com DNA-poli-me rase coma descrito por exemplo em Deen, K.C„, et al,·, Anal, Biochem. 135^456 (1983)=

Como alternativa, os polinucleétidos são também citeis como sondas de hibridaçlo de ácidos nu.clei.cos quando marcados, com uma marca não radioactiva como seja Platina, ι«μ encima ou um grupo fluarescente» Ver, por exemplo, Leary, u=J«= et al» Proc»

Natl. Acad,_____Sei, USA 8β=4®45 (1983)? Renz, M», et al.. Nuc1.

Acids Res* 12;3435 (1984)= a Renz, M = EMBO J. 6=817 (1983)=

Assim, resumindo, a identificação de sequências proteicas permite a identificação de uma sequência de DNA teórica !imais provávelS! ou uma série de tais sequências, capazes de codificar tal proteína,, Através da construção de um oligonucleótido complementar desta sequência teórica (ou pela construção de uma série de oligonuclsótidos complementares da série de oligonucleótidos iSmais prováveis*) oh tem-se uma molécula de DNA (ou série de moléculas de DNA) capazes de funcionar como uma sonda na identificação e isolamento de clones contendo as sequências codificadoras de tal proteína=

Numa via de dosagem alternativa da proteína, prepara— -se uma biblioteca recombinante usando um vector de expressão, através da clonagsm de DNA ou mais preferenciaIsente cDNfi preparado a partir de uma célula capaz de expressar a proteína, num vector de expressão. A biblioteca é então despistada relativamen— te a membros que expressem a proteína pretendida, por exemplo, por despiste da biblioteca com anticorpos contra a proteína, 2® 2®

Os métodos atrás discutidos são portanto capazes de identificar sequências genéticas que sejam capazes de codificar uma proteína ou fragmentos desta proteína, Para caracterizar melhor tais sequências genéticas e para produzir a proteína recombinante, á desejável expressar as proteínas que estas sequências codificam» Tal expressão identifica os danes que expressam proteínas possuidoras de característícas da proteína pretendida» Tais característícas podam incluir a capacidade para ligar especificamerite anticorpos dirigidos contra a proteína, a capacidade para induzir a produção ds anticorpos que são capazes de se ligarem à proteína e a capacidade para proporcionar uma função única daquela proteína a uma célula recipiente entre outras» Σ1Σ» Ejjgrgssto _de_. uma _Proteína,._Ulmada _ num^ .....do I n ven t o

Para expressar uma proteína clonada que á estranha (heteréloga) para d hospedeirodo invento ou homóloga para o hospedeiro, são necessários sinais de transcrição e tradução reconhecíveis pelo hospedeiro» As sequências de proteína danadas ohtidasatravés dos métodos descritos atrás e prefersncialmente numa forma de cadeia dupla, podem ser operacionalments ligadas a sequências que controlam a expressão transcricional num vector de expressão s introduzidas nuamoêlula hospedeira, para produzir a proteína recombinante»

Uma molécula de ácido nuclsico, como seja DMA, ê referida como sendo !,capaz de expressar” um polipeptídeo se possuir sequências ds controle da expressão que contêm informação reguladora da transcrição s tais sequências estão “operacional-mente ligadas" à sequência de nucleótidos que codifica a proteína»

Uma ligação operacional é uma ligação em que uma sequência é ligada a uma sequência reguladora (ou sequências) de forma a colocar a expressão da sequência sob a influência ou Controls da sequência reguladora» Duas sequências de DMA (como seja uma sequência codificadora de uma proteína e uma sequência de região ds promotor ligada ao extremo 55 da sequência codificadora) sSo referidas como estando operacionalmente ligadas se a indução da função do promotor resultar na transcrição da sequência de mRNA codificador da proteína e se a natureza da ligação entre as duas sequências da DNA não (1) resultar na introdução de uma mutação de alteração da grelha de leitura, \2> interferir com a capacidade das sequências reguladoras da expressão para dirigir a síntese do mRMA da proteína ou (3) interferir com a capacidade do ínolds de DNA a ser transcrito pela sequência da região do promotor» Assim, uma região tíe promotor será operacionalmente ligada a uma sequência tíe DNA se o promotor for capas de efectuar a transcrição da sequência de DNA» A naturesa precisa das regiSes reguladoras necessárias para a expressão podesn variar, mas em geral incluem sequências não transcritas e não codificadoras 55 envolvidas na iniciação da transcrição3 como seja a caixa TATA, sequência de "capping"s sequência CAAT e similares» Especialmente, tais sequências de controle 53 não transcritas incluirão uma região que contem um promotor para o controle do gene operacionalmente ligado»

Qs sinais reguladores da iniciação da transcrição podem ser seleccionados para permitir a expressão ou activação, de tal forma que a expressão dos genes operacionalmente ligados pode ser modulada» Sempre que as sequências ds sinais de controle da expressão nativas não funcionem satisfatoriamente na célula hospedeira, então as sequências funcionais na célula hospedeira podem ser substituídas*

Numa realização preferida, transformantes hospedeiros geneticamente estáveis podem ser construídos com sistemas vectares ou sistemas de transformação, pela que o DMA da proteína pretendida é integrado no cromossoma hospedeiro» Tal integração pode ocorrer de novo dentro da célula au na realização mais preferida ser ajudada por transformaçlo com um vector funcional-mente se insere no cromossoma do hospedeiro, por exemplo, trans-posSes ou outros elementos de DMA que promovam a integração de sequências de DNA em cromossomas» Células que foram transformadas com DNA foram também selecc.lanadas pela introdução de uma ou mais marcas que permitam a selecçlo de células hospedeiras que contenham o vector de expressão no cromossoma, por exemplo a marca pode proporcionar resistência a biocidas, e,g» resistência a antibióticos ou metais pesados, tais como cobra ou similares» 0 gene da marca seleccio·-·· náveí pode ser ligado directamente a sequências de DNA do gene a ser expresso ou introduzido na mesma célula por cotransfecção*

Numa outra realização, a sequência introduzida é incorporada num plasmídeo au vector virai capaz de se replicar autonomamente no hospedeiro recipiente» Qualquer um de uma variedade de factares pode ser empregue para esta finalidade,

Festores importantes para a selecção de um plasmídeo ou vector virai particular incluem?, a facilidade com que as células recipientes que contêm o vector podem ser reconhecidas e selec-danadas a partir das células recipientes que não contêm o vector5 o número de cópias do vector que se pretende num hospedeiro particular; e se é desejável que seja capaz de fazer de vector "vai-vemS! entre as células hospedeiras de diferentes espécies»

i

Uma vez o vector ou sequência de DMA contendo a ou as construções preparado para espresslo, a ou as construções de DMA são introduzidas numa célula hospedeira adequada <que se refere então como estando "transformada"> por qualquer uma de uma variedade de meios adequados* Após a introdução do vector, células recipientes transformadas são cultivadas num meio selec-tivo, o qual sslecciona o crescimento de células contendo o vector, h SKpressão de uma ou mais sequências de genes clonados resulta na produção da proteína pretendida,, Esta expressão pode ter lugar numa forma continua em células transiornadas ou de uma forína controlada. A proteína expressa é isolada e purificada a partir da célula hospedeira do inventa de acordo com condiçSes convencionais, tais como e;<tracçlo, precipitação, cromatografia, cromato-grafia tíe afinidade, electroforese ou similares.

Os eKmplos que se seguem descrevem ainda os materiais e métodos usados na realização do invento. Qs exemplos não se destinam tíe forma alguma a limitar o invento.

r: v srsvis

ί... !-..t -I

MhTERMI^_.MÉIODGS BMÍQÍsátgB.gg^.,jesfeirses......bacterianas e meios. Todos as radioisótopos foram adquiridos â New Engisnd Muclear, As estirpes bacterianas e plasmldeos usados neste estudo estio apresentados na Tabela 1» Meio LB (Meatíe, H,M = et al., J.Bacteriol. 149 s 114-122 (1982))., meio mínimo M9 e meio mínimo 11 è3 (Mil ler. J.H.j Experimento in Molecular uenetics, uold Spring Harbor Press, Cold Sprin Harbor,, Me^ York <1972)) foram anteriormente descritos*

Isolamento de mutantes Tnõ, Μ01Θ61 contendo os plasmí·- deos pEH32 e ρΜΒ21θ foi infectada com iambdab22x rex;;Tn5 cI857 O n < Berq, D., Insertion and EKcision of ths transposable kanamycin resistancs determinant Τη55 ρ, 205--212, em A.I,

Bukharis J„A, Shapiro s S.L» Adhya Ced,>3 DNA issrtion aisments, plasmids and episome, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring

Harbor,, New York <1977)g Ruvkun, q„B„ et al * Mature 289s85-88 <1981)), Oito ml de células cultivadas em meio LB para uma o densidade de 1x10' células por mi5 foram infectadas a uma multiplicidade de infecçSo ds @515 incubadas a 32°C durante 4 horas e semeadas em meio mínimo íí9 suplementado cos ds lactose como única fonte de carbono e 25 μα/ml de canamicina, A observação num microscópio de dissecação permitiu ver colónias extremamente pequenas resistentes â canamicina após 84 horas tie incubação a 28°C (uma temperatura que permite uma actividade elevada de NifA) a uma densidade de aproximadsmente 12 ΘΘ® colónias em cada uma de th placas. Para além destas numerosas micorcolónias, cada uma das placas continha uma a oito colónias significativamsnte maiores, Vinte e uma de um total de aproximadamente noventa colónias grandes foram purificadas através de nova sementeira em placas de meio mínimo mais canamicina, Várias microcolónias resistentes à canamicina foram também purificadas para servirem de controle. Técnicas....gsnéticas..e, mapeamento físico, A Transdução de inserçSes Ϊπ5 par PIvir foi realizado como anteriormente descrito <Millers (1,1-1,, Experimento in Molecular Beneiics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1972)),

escepto as estirpes recipientes terem sida diluídas a í=2@ a partir da cultura fresca crescida durante a noite s cultivadas a 37°C durante duas horas antes da adição do lisado de transduçSo* 0 ínapsamsnio de Hfr foi realizado como anieriormente descrito <Wanner3 B»L,, , J« Hol« Biol.·.· 191 = 59-58 CÍ98à>> usando uma série de estirpes HfrssTni® (Tabela 1)= A localização no mapa físico d© inserção L.C24 Tn5 foi obtida por análise de transferencias

Southern (Chomczynski 3 P,. et sl. g Biochem,__Biophvs__Res,______Çommun_;_

I 122 = 540-544 (1984))« íiCIôési digerido com BamHI„ Hind111 „ EcoRI „ EcoRV, Bq1lI * KgnI? Pstl ou Pvull foi despistado com DNAdeli-mitante da inserção LC24 e os padrões de restrição resultantes foram comparados com o mapa físico do genoma de E·., coli gerado por Kohara5 Y. et ahs Cell 50=495-508 (1987) na região à volta cie nirR.

τ ABELA 1

Estirpes hacterianas e plssmideos

Estirpe Caracteristicas relevantes Fonte de referfncia Et -itíis nL i <·οα 1 araDI39 Atara leu>7697 1271acX74 Casadaban & Cohen 8® Mph82 galU gall< hsr bsm strA lonssTnl® <BW7u2B) Boytí, 1987 HA62 !viC 1 ®á 1 com ionssTnl® de Hph82 Este trabalho HAÒ3 LC23 com IonssTnl® de Mph82 Este trabalho HA64 LC24 com IonssTnl® de Mph82 Este trabalho LC12 Mutante Tn5 de MC1®61 ísnon) Este trabalho LC4 Mutante Tn5 de MC1®61 CsnoB) Esta trabalho LC6 Mutante Tn5 de MCieél CsnoB) Esta trabalho LC23 Mutante Tn3 de MCÍ®6i CsnoB) Este trabalho LC25 Mutante Tn5 de MCi®61 (snoB) Este trabalho LC24 Mutante Tn5 de MC186Í CsnoC) Eis te trabalho C-iA prototrófica Sasaki et al = , 1965 LC241A C-ÍA contendo LC24 Tn5 Este trabalho BW6íè® Hf rs 3 Tn :l 0 Wanner, 1986 BW762® Hfrs slnl® Wanner, 1986 BWSòè® Hf r s sTni® Wanner, 1986 BW6175 Hfr;uTní® Wanner3 1986 BW6Í64 HfrssTnlO Wanner, 1986 NK6ÔS1 Hfr;slnl® Wanner, 1986 BWéièS HfrssTni® Wanner, 1986 BWÒ156 Hfr;sTnlÔ Wanner, 1986 BW7261 Hfrs sTnl® Wanner, 1986 BW7623 Hfr;sTnl® Wanner, 1986 BW7622 Hfr;slnl® Wanner, 1986 BW5659 Hfr;slnl® Wanner, 1986 BW6163 Hfrs sTni® Wanner, 1986

Wanner, 1986 Wanner, 1986 Singer st al», 1989 Singer et al«» 1989 Singer st al. 5 1989 Singsr st al., 1989

Levinson et al», 84 Huaia & Ausubel 89 Huala & Ausubel 89 Bsttsr et al.s 1985 Huala & Ausubel 89 BW6 i 69 HfrssTnl® BW6166 Hfr:sTnl© CABÍ2169 zch-506: sTnl€> CAB12028 zcí-233 s s Τη1® CAB12081 zcj-3061ssTnl0 CAB12Θ26 trg-2ssTnI© pSDC13 Μ13 ori, ColEl ori» Cm-r pEH32 pSDC13 com IscZ-nifA (NifA-AUGl) pEHARl pBDC13 com lacZ-nifA ÍNifA-/\N> pMB21ô niíH-lacZ, RK2 ori, Tc-r pLAC lacZ, RK2 ori, Tc-r

Better st al», EMBO J„ 4x2419-2424 (1985)

Boyd, D« et al», em Pbosphate MstabDlisffi and Csilular Rsgulation in Microarganismsj A» Torriani-Borini st al», eds,, Am» Soc„ Microbiol», Washington, pp„ 89-93 (1987)

Casadaban et al., J. Mol. Biol. 138x179-297 (198Θ)

Haula, E. et al,, u. Bacteriol. 171§3354-3365 (1989)

Levinson et al., J» Mol» Appi, Bsnet. 2x507-517 (1984)

Sasaki st al. , Can, J. Ssn == Micro, 4®s365-376 (1965)

Singer et al», Microbiol» Rsv, 53s1-24 (1989)

Wanner, B.L., J. Mol. Biol» 191x39-58 (1986)

Ensaios___de β-qalacfcosidase» Estirpes hacterianas contendo um plasmideo sjipressando lacZ-nifA C pEH32 ou pEHdeltaRI) a um plasmídeo repórter niffi-lacZ <pnB2í®> foram cultivados em meio LB m&is antibióticos a 28*C sob tuna corrente continua de i% oxigénio ou 21% oxigénio coajo anteriormente descrito (Huala, E» at a.l» ,s d,, Bactsriol,, 171¾5354-5365 Í1989)>» A quantidade ds MifA activo presente apás 16 horas ds crescimento foi medido testando as culturas quanto â actividade de fs-galactosidase (Millsr, J»!-!», Experimente in Molecular Senetics, Cold Sprinq Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York <X972>>» Técnicas imunológicas, Preparam-se anticorpos contra um peptídeo contendo pelo menos 14 aminoácidos de Nifft tis R, ms1i1o~ ti (NH -G1 i-Tir-A 1 a-Leu-Arg-His-Gl i-Va 1 -Asp-Va 1 -Arg-Lis-Leu-COOH) que foi sintetiza .o por técnicas conhecidas CBodans^ky, n»,

Peptide Chginistrys A Praticai.....Textbaok, Springer-Verlag, New York, (1988)» 0 peptídeo foi conjugado usando o éster m-malsimidobenco-il-M-hidraxi-succiniínida (MBS;: Fiercs) com uma proteína veículo, hemocianina de lapa (Sigma), através de um resíduo cis- teina extra adicionado ao extremo amina do peptídeo, A proteína veículo (1® mg) foi dissolvida em ®,7 ml de tampão fosfato de po~ tássio In, pH 7,3, s diluído para 7 ml em água desíonicada* MBS <6 mg) foi dissolvido em 1®® μ! de 5@% dimetilformamida, 5®% tetrs-hidro-furano e adicionado qota a gota a uma proteína veiculo com agitação constante» Após adição de 6 mg de peptídeo, a reacçao foi agi-agitada à temperatura ambiente durante a noite, depois dialisada 24 hr contra 4 litros de tampão de fosfatos salino» Pi imunicação de dois coelhos New Zealand red foi realicada subcutaneamente com &».67 ml ds peptídeo conjugado emulsionado com ®,33 ml de adjuvante completo de Freund íCalfeiochem) seguido de duas injecçSes de memória com @,5 ml de peptídeo conjugado e ®,5 ml de adjuvante incompleto de Freund aos 16 s 31 dias após as injecçSes iniciais.

Transisrfncias western foram realizadas coma anterior— msnte descrito < tílaks 3 M-S, st........aki Hnal^.Biochgnu. ÍM= i75-179 <1984)) com imunoglobulinas de cabra anti~Ig8 de coelho conjugadas com fosfatase alcalina (Calbiochem) como anticorpo secundária» !!Nitro blue teirazol iumí! e fosfata de S-bramo—4~clcro~3-in-dolilo para a reacção da fosfatase alcalina foram da Sigma» “idulsg.~ch.ase" s .I.mur»opreci.B.itacão.. Culturas contendo pEHdeltaRi foram cultivadas durante a noite em meio LB, depois diluídas a 1 ίΙΘ® em meia M9 mais Θ,5% de giiceral, 4Θ pg/ml de L~aminoácidos s?;cepto metionina e cisteina» ®55 mg/ml de tiamina e antibióticos e cultivadas aerobicamenta num agitador orbital a 37°Cdurante várias horas» Quando a densidade éptlca da cultura a 60Θ nm atingiu um nível entre 0,1 e 0,5, as culturas foram diluidas para uma densidade óptica de ®,1 no mesmo meio e crescidas a 2Q°C durante duas horas num agitador orbital» As culturas foram marcadas por pulso através da adição de 37,5 pCi/ml de yt<=i L~L ~""óJmetionina <1245 Ci/mmol) seguido após dois minutos da adição de L-mefcionina em excesso não marcada para uma concentração final de '1,4 mg/ml (Parsell, D»A» et al., a » Biol»_____Chem» 564s7590-7595 <1989)) s mantido a 28°C ao langa do periodo de i!caça.H» A diferentes intervalos adicionou-se quantidades de 0,5 ml a 35 μΐ de fluoreto de feni.Imetilsulfonilo (PMSF) 60 mM e azida de sódio 80 mM em 9Θ% de etanol em gelo» As células marcadas foram colhidas por centrifugação, ressuspensas em 3Θ μΐ de tampão de amostra com SDS (125 mM Tris EpH 6,83, 5 mM EDTA, 1®% glicerol, 5% fs-mercaptoetanol , 2% dotíecilsulfato de sódio) a fervido durante 5 minutos» A imunoprecipitação das amostras marcadas com pulsos foi realizadapela adição de 1® a 3® μΐ do lisado fervido a 97® μΐ de tampão de fosfatas salina s 5μ1 de anti-saro, agitação durante a noite a 22‘"'C e precipitação durante a noite a 22°C e precipitação dos anticorpos ligados usando proteína A-Sepharose (Pharmacia) como anteriormente descrito (Storz, S« et aL, J. Bacterioi. 17is2049-2055 (1989))= A proteína NifA foi libertada a partir do sedimento da proteína A-Sepharose lavada por fervura em tampão de amostra com SÍ)S (como atrás) durante 5 minutos e as amostras foram sujeitas a electroforese num gel de 1@% paliacrilsmida--8D8»

Clonagem de Tn5 e____análise da sequência, DMA cromossó- mico das mu tant.es L.C12, LC23 e LC24 foi digerido com EcoRí = Sal I ou BamHI e ligado em pMLC28. As colónias resistentes è canamicina resultantes continham piasmideos plasmideos portadores de parte ou de toda a inserção Tn5 s DMA delimitaste* 0 DMA adjacente ás inserções Tn5 foi sequenciado pelo método didesaxi CSanger, F, et ílL·.? Proc* Matlu ficad* Sei*USA 74s5463-5567 (1977)) usando um kit Sequenase (U = S = Biochemical) com um iniciador especifico de Tn5 í3J-STTChTCSCASSACT70~5? ? Ronson, C = W = st al.= J* Bacteriol, f.69s2424-5431 (1987b))* 0 iniciador pode ser feito por técnicas conhecidas <Saits í j = J * ;i ed=, Qliqonucleatide Synthesis·,____a

Praticai Approach, IRS Press, Washington, DC, (1984))=

Curvas de crescimento* Foi anteriormente publicado que mutanies em dep são incapases de clivar N-acetil-ala-sla-ala e portanto não podem crescer neste composto como única fonte de

azoto <Deutch? C.E. et_jkj Froc, ...Natl, ficad*__Sci=__USA 7313998··-6β0í (1978))= Para testar se a inserção Tn5 de LC24 está situada em dtp, a inserção Tn5 de LC24 foi transdusido para uma estirpe de E. coli protoferéfica, C-1A» A estirpe resultante, LC241A, foi cultivada a 37°C em meio mínimo M63, crescida durante várias horas até a densidade éptica (DG) exceder &f05 a άΘΘ nm= Cada uma culturas foi diluida para uma densidade óptica de 6,05 em M63? depois diluida a Ι5ΙΘ® em π63 (1Θ mg/ml de sulfato de amónio) ou em meio M63 sem sulfato de amónio contendo 1Θ mn N-âcstil-ala-ala-ala (Sigma) como única fonte de carbono e o crescimento das culturas foi observado medindo a densidade éptica das culturas a 6ΒΘ nm periodicamente durante 24 horas,

Mutagiêoese......de TnS. e .seieçjcgo_de_mu.tantes E, col i estirpe MC10é:LP portadora do plasmideo de expressão de lacZ-nifA, pEH32 e do plasmideo repórter de nifH-lacZ„ ρΜΒ2ϊθ? foi mutageniaado com Tn5 e semeado em placas de meio mínimo com lactose, onde MCÍ©éí tipo selvagem cresceu muito fracamsnts, produzindo colónias mal visiveis após 84 horas de crescimento a 28*0, Esperava-se que os mutantes com um nível aumentado ds actividade MifAf resultando numa maior capacidade pra activar a expressão da fusão nifH—lacZ . surgissem como colónias maiores contra um fundo ds microcolónias,, Vinte e uma colónias grandes resistentes â canamicina foram isoladas por sementeira em meio mínimo com lactose e o seu tamanho grande foi verificado por plaqueamento de cada uma delas em meio mínimo com lactose e comparando-as com MC1061 tipo selvagem portador de pEH32 e de pMB2íã„ A aus'§ncia de uma inserção TnS nos plasmídeos transportados pelos mu. tan tes foi verificado por isolamento de DMA de plasmideo a partir de cada um dos mutantes e transformação de E,; coli ΜΟΙΘ&Ι, NIo resultaram colónias resistentes à canamicina indicando que as inserções Tn5 estavam situadas no cromossoma,

Preparou-se DWfi cromossémico de cada estirpe mutante, digeriu-se com EcoRI & analisou—se numa transferência Southern usando Tn5 como sonda (Figura 1), Quatro mutantes portadores de «sais ds uma inserção Tn5 <LC95 LC11= LC213 LC22) e duas outras inserções com fenétipos fracos CLC55 LC1B) nlo foram mais carac-terizados,, Encontrou-ss qus as restantas inserções TnS ocorrem sí tr®s fragmentos EcoRI diferentes. 0 Grupo i <snoft, para estabilidade de NifA em oxigénio) consistiu em 1Θ membros (LC2, LC3, LC7 =, LCB? LCÍ0? LC12, LC13? LC14S LC15, LC-íòp Figura í) - Brupo 2 CsnoS) consistiu es? 4 membros <L.C4.j LCò9 L.C239 LC2Ss Figura 2) a Grupo 3 (snoC)consistiu num membro ÍLC24| Figura 2)» Escolheu-se um represar?tante de cada grupo para posterior caracterização. As localizações genéticas aproximadas de snoA, snoB e snoC foram determinadas por mapeamento os Bfr como estando entre 6 e i3 min para snoA- entre 23 e 30 min para snoB s entre 5Θ e 61 min para Í11MISÍS._2 .....

Os mutantes LC123 LC23 s L.C24 contendo os plasmídsos pEH32 CMifA-AUGl> e pMB210 (nifH-lacZ) foram cultivados eoí meio LB com uma corrente continua de t% ou 21% de oxigénio durante 16 horas s testado quanto à actividade de fs-galactosidase a partir da fusão repórter nifri-lacZ. Buando cultivados em 21% de oxigé-nio5 os tr®s mutantes apresentaram níveis de actividade de fs-galactosidase cerca de dez superiores ao tipo selvagem HCÍΘ6Ι contendo pEH32 e ρΜΒ21Φ. Com í% da oxiqánia, LCÍ2 e LC24 apresentaram níveis ligeiramente elevados de B~-qalactosida.se relativa-mente a MCÍuál j enquanto que L.C23 nSo apresentou aumento relativo na actividade de jS-galactosidase» Para confirmar que os os fenétipos dos mutantes eram provocados pelas inserções Tno em vez de mutações pontuais pouco prováveis9 as inserções TnS das estirpes LC12, L.C23 e LC24 foras? transduzidas para rlCiôéi usando e o fago Pí* Os iransdutantes foram transformados com pEH32 pMB21© e testados quanto á actividade de 15-qalac tosidase em 21% ds oxigénio* As estirpes transdusidas5 tal como os mutantas originais apresentaram um nível elevado de cerca de de? veses de actividade de (T-galae tosidase rslativamente a HCíBòl (Tabela 2>„ 0 nível aumentado tís actividade de B~galactosidase nas estirpes mutantes estava fcotalmenta dependente da presença de NifA* Wao foi observado aumento no nível basal de actividade devido a actividade constitutiva do promotor nifH na ausência de nifA em qualquer um dos mutantes (Tabela 2) =, TABELA 2. Actividade Nif A em h, coli tipo selvagem e mutante*

Actividade de β-galactosidase 1% oxigénio 21% oxigénio

MC1061 MC1061 + pMB210 LC12 + pMB210 LC23 + pMB210 LC24 + pMB210 MC1061 + pMB210, pEH32 LC12 + pMB210, pEH32 LC23 + pMB210, pEH32 LC24 + pMB210, pEH32 MC1061 + pMB210, pEHARl LC12 + pMB210, pEHARl LC23 + pMB210, pEHARl LC24 + pMB210, pEHARl MC1061 + pLAC LC12 + pLAC LC23 + pLAC LC24 + pLAC 7.6 7.9 144 169 99 164 135 129 133 183 46,128 1,367 67,902 12,650 48,789 13,859 60,341 15,163 53,189 35,836 60,017 42,847 54,584 28,660 57,398 45,205 41,420 32,901 37,615 30,452 31,538 25,882 34,133 29,388 A actividâds ds [3~galsctosidase é dada em unidades Mil ler. pEH32 espressa WifA-AUGi a partir do promotor lacZ. pEHdeltaRl expressa NifA-deliaN a partir do promotor LacZ« pMB2i@ é portador de ama fusão repórter nifH-IacZ pLAC eKprasss o gene lacZ. ριΤΒΞΙΘ é portador de uma fusão repórter nifH-lacZ. pLAC eKprsssa o gene lacZ a partir do seu promotor natural. 0 efeito das mutações sno numa forma mutants mais estável de NifA transportada pelo plasmídso pEHtisltaEl foi também testado» As estirpes LC12» LC23 e LC24 contenda pEHdeltaRl e pMB2Í® foram testadas quanto àactividade de R-galactosidase em í% e 21% de oxigénio (Tabela 2)» Apenas um pequeno aumenta na actividade NifA-deltaN foi observado em LG12 (snoA) e LC24 (snoB). &£5Μ&Ρ-5

BgjBgostra£lo......de,.jgug_as,.mutações snoA estão em lon 0 mapeamento Hfr da inserção snoA em LC12 mostrou que a localização de snoA estava entre 6 a 13 minutos ηo mapa genético de E. coli- A localização da inserção no mapa físico (Kohara et ai, , Ceí 1 5βs;495-508 (Í987)) foi determinada por análise Southern como estando a cerca de 55 !<b de proC Ca marca genética mais próxima no mapa ds Kohara et al.» Ce11 50s495-508 (1987)) na vizinhança de lon, A inserção Tn5 e DMA flanqueante de LCÍ2 foi clonada e cerca de 3ΦΘ pares ds bases ds cada lado da inserção de TnS foram sequenciados, A sequência 1 abaixo representa a sequência reconstruída (a sequência TnS e duplicação do sítio de inserção tendo sido removido) que estava presente no hospedeiro antes da inserção TnS» A inserção TnS ocorreu a sequir ao núcleo— tido 305= SEQUÊNCIA 1

1 CXXITCXGCG AAGGXGGAGT ATCTGGAGTC GCCGACCATT GATGACiCGGG 51 AACAGGAAGT GCTGGTGCGT ACTGCAATCA GCCAGXTCGA AGGCIACAIC 101 AAGCTGAACA AAAAAATCCC ACCAGAAGTG CIGACGXCGC TGAATAGCAT 151 CGACGATCCG GCGCGTCTGG CGGATACCAT TGCXGCACAX ATGCCGCTGA 201 AACTGGCTGA CAAACAGXCX GXXCXOTTCX GGAGATCTCC GACGTTAACG 251 AACGTCTGGA ATATCTGATG GCAATGATGG AATCGGAAAT CGATCTGCTG 301 CAGGTTGAGA AACGCATTCG CAACCGCGXT AAAAAGCAGA TGGAGAAATC 351 CCAGCXXGAG TACIATCTGT CXGAACGAGC AAAXGAAAGC XATTCAGAAA 401 GAACXCGGTG AAAXGGACGA CGCGCCGGAC GAAAXGAAGC CCXGAAGCGC 451 AAAATCGACO CGGCGAAGAT GCCGAAAGAG GCAAAAGAGA AAGCGGAAXX 501 AGAGXXGCAG AAGCXGAAAA TGATGTCICC GATGXCGGCA GAAGCGACCG 551 TAGTGCGTGG TXAXATCGAC TGGAXGGTAC AGGTXCCGXG GAATGCGCGX 601 CAAGAGGTCA AAAAAGXCC7 GCGTCXGGCG CAGGAAATCC TTGATACCGA 651 CCATTATGGT CTGGAGCGCG XGAAAGATCG AAXCCTTGÁG TA7CXTGCG0 101 TTCAAAGCCG TGTCAACAAA ATCAAGGGAC C3ATCCTCTG CCTGGTAGGG 751 CCGCCGGGGG TAGGTAAAAC CXCTCTTGGT CAGTCCATTG CCAAAOCCAC 801 CGGGCGTAAA TATGTCCGTA TGGCGCTGGG CGGGCGTGAT GAAGCGGAAA 851 TCCGTGGXCA

Esta sequência permitiu-nos determinar que a ins^rção i-L-12 está dentro da gene lan - o qual codifica a profease? La» A inserção Tn5 em LC12 a sequir ao nuoleótido tfc-‘38 da sequência 1 on uescrita, por Chin et a'1„ 3·.- Biol» Chem» 263; í 1718—11728 ( Í98S> a resultou na duplicação de um sitio Pstl situado a um quarto da região codificadora de lon=

w ε«β!2Εΐά_1 teâI4jscIo„.,dÊ„JiQ.ol A inssrçlo Tn5 cie LC23 (snoB) foi danada e uma região de 23és pares de bases da DMA flanqueants foi sequenciada* A sequência de um extrema das sequências genéticas do hospedeira no sitio da inserção de Tn5 em LC23 está apresentado na sequência 2,

L.· C.l i .-*·. O E

SEQUfMQ.lft.__2

1 TAGCGATATA CACAACTTCA ACCTGACTTT ATCGTTGTCG ATAGCGTTAA 51 TGCGAATGCC GTGAAGCGAG TCCACGGCAT TGCCTGACGC TTATATTATT 101 GCAATTTCGC GCTGACCCAG CCTTTCACAC TGGCTAACGC TGCAGGTAAG 151 GCCGCAGCAT CCGTACCACC GGCTTGCGCC ATGTCAGGAG CTCCACCACC 201 CXTGCCGCCC ACCTGClGAG CGACCATACC AATCAG

Uma pesquisa na base de dados de sequências da 6enbank usando a sequência do DNh flanqueants revelou que a inssrçlo Tn5 deste mutante está situada aproximadamente 16Θ pares de bases a jusante do codao de terminação de a 1 aScodificador de aian.il- tRNA-sinfceta.se (Put.neyH S,D, et_al „ a Science 2:í3s 1497-15Φ1

J (1981))» Para confirmar que as inserções Tn5 em LC4;i LC6 s LC25 também estavam perto medimos a frequência de cotransduçlo destas inserções Tn5 com uma inserção srclC5®0í; sTHl@ da estirpe BW566® (líiannsr, B.L., J. ÍIoL Biol, 191 r;59-58 (1986))» Encontrámos que as quatro inserções snoB Tn5 foram cotransduaidas numa fraquência elevada com srlC (Tabela. 3). A análise de transferências Southern usando DHA cortado com Sal I ds L.C4* LC6, LC23 e LC25 mostrou que duas inserções (LC23 e LC6) estio situadas cerca de 4Θ# pares ds bases a jusante cde um sitio SalI perto do extremo 3* de alaS e as outras duas inserções CLC4 s LC25) estão a cerca de 750 pares ds bases deste sítio Sa1I« TABELA 5

Cotransdução da snoB com srlCs; g tni®

Colónias % da „ _ P?

Iestadas Colónias ic" Cotransdução ^4 (snoB) 8 0 1Θ® enqB) 9 & 100 C23 (snoB) 7 1 86 i® 1 9® *5>noC) 6 & ® SEstirpes dadoras na transduçaa PI« Colónias recipien-_=® resistentes -à canamicina portadoras de uma inserção ansdusida foram avaliadas relativainante à resistência à ,a? indicando a presença da inserção srlCs sTn 10;i tj&araJLaja

LogMizãSio.....de.....snoC

Os 221 pares de bases de DMA flanqusante da inserção roram clonados e sequenciados. A sequência de um sx~ jas sequências genéticas do hospedeiro no sitio da inserção está apresentado na sequência 3 abaixo* ÍESaiNCIA_3

1 AAAAAAGGAA GTAAGACAAT ATGGAGCGCA ACGCCCATCG CTTGACGTTG 51 CATTCACCTG CAAGAGAGAT ATTGCCCTGA ATGGGTAGAG AGTTTATTGA 101 CTTCGCTCAA ACTTTGCGGC GTTTTTGTAT ACAGACAGCC GGAAAAA1TG 151 CTTTTGTTAC AACCATTTAC TACGATGCAA CCATAAAGCA ACACCACCAA 201 XAAGAACAAC TAACAGAATA C

Tentou-se encontrar na base ds dados ds sequências da Bsnbank uma sequência semelhante mas sem £?κϋο= Uma vez que a local ilação aproximada desta inserção foi determinada por mapea-mento Hfr como sendo 23 a 31 minutos no mapa genético de E. coli, ..¾ transduçlo PI foi testada com uma série de inserções ϊηίβ desta regi!o= Uma inserçlo Tnl©9 em 29,3 minutos < zc j--306í % sTnií?) fopi .^.nada como sendo 84¾ cotransduzívsl com a inserçlo L.C24 Tno .abela 4K A localizaelo da inserçlo no mapa fisico de Kanara, _____a 1„Ce 11 50s495-503 (1987), foi determinada com oito .cirnas de mapeamento usadas na geraçSo do mapa fisico e despis-_om o DNA flanqueante clonado da inserção LC24 (Figura 4), TABELA 4

Localizaglo de snoC por TransduçSo Px % de Cotransduçlo

Recipiente Experiência 2 EjUaeritnçia 3 x2169 0% (190)** i_AB 12028 7,1% (112) 4% (482) 11% (20Θ ..a 12081 81% (170) 84% (04) •-.t-so uííí;o 0¾ (VUí 0?2% (579) de colónias resistentes è canamicina que nlCo eram resistentes à tetracxelins, *S Número total ds colónias contadas,.

Os resultados do mspeamento físico a genético indicam que a inserção LC24 está situada a cerca ds 1Θ kilobasss de nirR (29,4 min) na direcçlo de raç, 0 gene dcp, que codifica dipepti- dil-carbGXÍpeptitíases situa-se nesta vizinhança (Deutch, C = fc.» et. al.. Froc. Natl.___ftcad. Sei, USA 75ϋ5998-6ΘΘί (1978))« Para determinar se a inserção Tn5 de LC24 se situa dentro de deo„ a inserção Tn5 de LC24 foi transduzida para a estirpe prototrófica G-1A para criar a estirpe LC241A e medido o efeito da inserção na capacidade desta estirpe para crescer em meio mínimo usando N-acetil-ala-ala-ala como única fonte de carbono» Se bem que E» coli tipo selvagem seja capaz de crescer neste substrato, um mutante dep ê incapaz de clivar este tripeptídeo e portanto não pode usá-lo como fonte de azoto (Dsutchs C»E« et al« « Proc. Natl» Acari» Sei» USA 75;5998-6001 (1978))» A comparação das taxas de crescimento de C-1A e LC24ÍA não revelou diferenças na capacidade destas estirpes para crescerem em N-acetil-ala-ala-ala como única fonte de carbono, indicando que a inserção Tn5 em LC24 pode não ser ries. ii<?TOl.o-á

Para determinar se um aumento na acumulação de NifA-AUGl era responsável pelo nível aumentado da actividade de Is-çalactosidase nos mutantes» a acumulação de NifA-AUGl em MCl©òls HA62 (um derivado lon;sTrilt? de nCÍf?6Í>5 LC23 (snoB) e LC24 CsnoC) foi comparada ρο-r transfsrtncia Western» A acumulação de NifA-AUGl a 1% de oxigénio foi praticamente igual para as-quatro estirpes (Figura 5A)5 mas a acumulação em 21% de oxigénio variou» Enquanto NifA-AUGl decresceu para um nível quase inde-tectável em Η01Φ61 crecida a 21% de oxigénio (Figura 5BS faixa 1) i NifA-AUGl em HAé>2 (lon) crescida nas mesmas condições não apresentou decréscimo na acumulação (Figura 5B. faixa 2)» Tal como HA62 (lon) » L.C24 (snoC) mostrou um aumento na acumulação de nlif A-AUGÍ em 215 de oxigénio (Figura 5B, faixa 4> = No entanto, não se observou aumento na acumulação de NífA-AUGl em LC23 (snoB) cultivado em 21% de oxigénio (Figura 5B, faixa 3), Estas resulta-dos sugerem que as mutações lon s snoC nas estirpes HA62 e L.C24, . sspectivamente, podam causar um decréscimo na velocidade de _ssgrsdaç!o ou um aumento na velocidade de sintsse de NifAcom .ensSo de oxigénio elevada* Ao contrário, LC23 (snoB) nSo pareceu ,„ausar um aumento na acumulação de NifA-AURl em 21% da oxigénio, ^agerindo que o efeito de uma mutação snoB pode ser para aumentar actividads da;- NifA~AUS a 21% de oxigénio em ves da sua veloci-.atíe ds acumulação, possivelmente através de um decréscimo na velocidade de inactivação ds NitA-AUBI pelo oxigénio*

Se bem que as mutações sno não tenham qualquer efeito óbvio na actividads ds NifA-dsltaíM, a acumulação desta forma mutante de Nif A em Μ01Θ61 e os três mutantes sno ÍHA62, 1 cn;; LC23, snoB; e L..C24* snoC) foi também comparado,. Ao contrário dos resultados com NifA---AUG1, encontraram-se diferenças na acumulação ...* cs c^cganxD para NifA-deltaN (Figura 6) * A acumula ção de de NifA-deltaN em HClêòl é muito superior sob 1% e 21% de oxigénio do que a acumulação de NifA-AUSi, provavelmente devido a um aumento na estabilidade da proteína, roas a acumulação é ainda fluais baixa a 21% de oxigénio (Figuras 6A e 6B, faixa ís Huala, E» et al „ , J * Bacteriol,, 171;3354-3365 (1989))* A mutação lon CHA62 p Figura 6h5 faixa Ξ) provocou um aumento visivel na acumulação ds NifA-deltaN mesmo sob 1% de oxigénio e uma vec mais, evitou qualquer decréscimo na acumulação a 21% de oxigénio (Figura 6B, faixa 2>=, A mutação snoC (LC24) também provocou uma aumenta na acumulação de NifA-deltaN sob 1% e 21% de oxigénio (Figuras 6A s 6B, faixa 4), enquanto que LC23 (snoB) não apresentou uma maior acumulação de NifA-deltaN relativamente a NC1Ô61 (Figuras 6A e 6.8, faixa 35* No conjunto, o efeito das mutações na acumulação a 21% de oxigénio foi semelhante a NifA-AU81 e NifA-N* A inserção long gTnl© de 11^1^82 foi transduzida para LC23 e LC24 para criar estirpes HA&3 Clon snoB) e HA&4 (lon snoC). Estes mutantes duplas foram transformados com pEH32 ou pEHdeltaRi e a acumulação de NifA foi observada nas transferencias Western (Figuras 7 a 8)= HA64 lon snoCs Figura 7, faixa 3) acumulou NifA-AUGÍ no mesmo nível de HAé2 (lonξ Figura 7, faixa i>, indicando que os efeitos da mutação em snoC s lon não sao aditivos» No entanto, HA63 (lon snoBg Figura 7, faixa Ξ) apresentou uma maior acumulação quando comparado com HA62 (lon)» Este resultado foi inesperado uma vez que a inserção snoB pareceu não ter efeito sobre a acumulação NifA-AUBl por si sé (Figura 4) . 0 efeito das duplas mutações lon snoB e lon snoC na acumulação de NifA-tíeltaN foi também estudado (Figura 8) = Nova-mente, HA64 (lon snoC: Figura 8, faixa 3) acumulou NifA-deltaN no mesmo nivai de HA62 (lon. Figura 8, faixa 1), enquanto HA63 (lon snoB ξ Figura 8, faixa 2) apresentou aumento de acumulação quando comparado com HA62 (lon)» 0 efeito da dupla mutação lon snoC na acumulação de NifA-AUBl e NifA-deltaN sugere que o produto do gene snoC actua cocn o produto do gene lon para decrescer a acumulação de NifA, uma vez que o nível de NifA baixa apenas quando uma célula tem cópias tipo selvagem de ambos os genes» Pelo contrário, a mutação snoB causa um aumento na susceptibili-dads à degradação pelo produto lon sem trazer uma alteração da acumulação de NifA»

Mutações, sno sem gjMtõ-Jl^.QnaBQtCTi_laç São possíveis várias explicações para o aumenta observado na acumulação de NifA em LCÍ2 e LC24? incluindo o aumento da transcrição de nifA a partir do promotor lac.» um aumento na eficiência da tradução ou um decréscimo na velocidade de degradação de NifA» Para testar se a transcrição a partir do promotor lac estava aumentada nestes mutantes, comparou-se a expressão de -fl-galactosidass a partir de uma cópia do gene 1 acZ presente em plasmídeo εκpressa a partir do seu promotor natural (plasmídeo ρί..AC) em E. coli MClObl, LC12 (snoA) . LC23 (snoB e LC24 (snoC) (Tabela 2) „ Mão foi detectada diferença na actividade de fl-galac-tosidase nos mutantes, sugerindo que a actividade do promotor lac e do sítio de ligação ao ribossoma de 1ac não foi aíeciada pelas mutaçSes» A quantidade de proteína fl-galac tosidase produzida a partir de pLAC em ΗΟΙΘόί, LCÍ2, LC24 e LC24 foi também comparado com um gel de dodeciIsulfato de sédio <3DS>~poliacrilamida» Não se observou diferenças no nível de B~gaIactosidase em MClSèi e nos mutantes sno após crescimento sob 1% ou 21% de oxigénio (Figura 9)» Uma vez que o sítio de ligação ao ribossoma de iacZ e as sequências não traduzidas 5P estão presentes no plasmídeo teste iâcZ e na fusão lacz-nifA transportada por pEH32, este resultado sugere que a transcrição e tradução de NifA não è afectada em L.C'i.2 e LC24, a menos que a presença de nif A em vez das sequências IacZ a jusante do sítio de iniciação da tradução provoque um aumento na transcrição ou tradução nos mutantes» fcxeffi.pl ο,,8,

Hejai=viáa --fla---Mr.:ote jna......Mi f A,

Para comparar as velocidades de síntese NifA & degradação sm MC1061 e os mutantes sno,, células em fase logarítmica com arejamento foram marcadas por pulsos durante dois minutos e controlado o declínio de WifA marcado. Como a semi-vida de MifA-AU8i pareceu inferior a dois minutos, tornando a medição precisa dífi-cil, mediu-se a semi-vida mais estável de NifA-deltaN (Figuras 1Θ e íls Tabela 5). Se bem que a actividads de NifA-deltaN tenha aumentado apenas ligsiramente pelas mutações lonsnoB ou snoC·, estas mutações afectaram a acumulação de NifA-deltaN e de NifA-AUB1 sob 21% de oxigénio de forma semelhante, A semi-vida de NifA-deltaN foi aumentada no mutante lon HA62 a partir de aproxi-madamente 3,5 horas até cerca das 7 horas (Tabela 5). A inserção snoB por si só nSo tem efeito significativo na semi-vida de NifA-deltaN, consistente com a falha deste mutante para aumentar a acumulação de NifA-deltaN ou de NifA-AUSí, Também de s.carúo com os resultados da análise de transferência Western, NifA-deltaN expresso num mutante duplo snoB lon apresentou umafc aumento da semi-vida que foi maior do que o efeito da mutação lon sócinha, até cerca de 21 dias (Tabela 5), A semi-vida de NifA-deltaN em LC24 (snoC) e em HA64 (lon snoC) não pode ser tíevidamente avaliada pois os resultados foram mais dispersos para estas duas estirpes (Figura 11¾ Tabela 5), IâiiLã_5

Semi-vida de MifA—deltaN em MClôòi e mu t antes- sno a 28°C h.stirpe Semi-vida (horas)# Sarna## MCI061 3,5 2,7 - 5,Θ HA62 (1on) 75Θ 5,4 - Í0,0 LC23 (snoB) »E « 4,8 - 5,9 LC24 (snoC) 5,® 2,8 - 24,5# HA63 (lon snoB 21,4 12,è - 70,2 HA64 (lon snoC) 3,8 2,3 - 10,3# t Resultados da experiência de “pulse-chase" mostrados na Fig, 5, tt Bams dada representa o nivel de 95% de confiança (dais desvios padrões)„

As semi-vidas foram calculadas pelo método dos quadrados mínimas para uma curva de decaimento exponencial de única experiência» A gama representa um desvio padrão do declive médio» Uma outra experiência produziu resultados semelhantes (não apresentado/„

ϋϊ^Ο IRS2ίΠ

Resultados anteriores demonstraram que a inaetivação de

NifA em níveis de oxigénio elevados em E„ coli e em Rj,_meliloti

não è divido apenas a proteóliss? uma vez que para algumas formas fnutantes de NifA o nível de NifA na célula baixa apenas ligeira-mente á medida que se aumenta o oxigénio,; enquanto que a activi-dade de NifA diminui muito nsais rapidamente (Huala, E„ et ai« J. Bactarol17Í; 3354-5565 (1989)),, A observação ds que os mutantes lon e snoC podem causar um declínio na actividade de NifA através do decréscimo da quantidade de NifA presente na célula pode ser explicado de duas maneiras» Uma possibilidade óbvia é que os produtos dos genes lon s snoC degradem apenas NifA activo ou NifA activo e inactivo» Unia outra posssibilidade á que 1 on e snoC degradem apenas NifA inactivo s afectem o nível de NifA activo apenas indirectamente através da eliminação do conjunto de NifA inactivo e consequentemente prevenção da reversão da inaetivação de NifA» Isto poderá acontecer se a. inactivação de NifA for unia reacção reversível,, No entanto, uma vez que a inactivação de NifA a partir tíe Bradhyrhisobiym.japonicmn é irreversível (Kullik, I» st ai„,, Arch. Microbiol,. 151;191-197 (1989)), á pouco provável que isto seja correcto»

E. coli contendo as mutações lon e snoC não mostra uma aumento adicional na acumulação de NifA ou na semi-vida quando comparado com uma estirpe contendo apenas a mutação lon„ Se os produtos dos genes lon e snoC fossem professes independentes3 cada uma capaz ds degradar NifA na ausência da outra? os efeitos das duas mutações devem ser aditivos» Uma vez que não é este o caso* os produtos dos genes lon s snoC devem trabalhar cooperafi-vamente para degradar NifA» A ideia de que o produto 1on pode requerer um outro factor de E. coli para degradar algumas proteínas foi anteriormente sugerido (Schoamsker, J»li» et al», J „

Bacteriol, 158s551-56í <1984)), SulA, um regulador instável da divisão celular» apresenta grande estabilidade num mutante lon.» No entantos o produto do gene lon por si só pode não ser suficiente para fazer a proteóliss de SulA» Lon é incapaz de degradar SulA in vitro, se bem que nas mesmas condições a proteína A e a caseína seiam degradadas, levando à especulação de que outros factores possam ser necessários para a degradação de SulA por lon* È pouco provável que o gene snoB codifique uma protease uma vez que uma mutação em snoB aumenta a actividade MifA dez vezes sem provocar um aumento visível na acumulação de NifA, enquanto que um mutante lon ou snoC» para dar origem a uma aumento semelhante na actividade de NifA, aumenta a acumulação de MifA várias vezes. Portanto, o efeito da mutação snoB é ria actividade especifica de MifA e não na sua acumulação. 0 declínio da actividade de MifA sem um concomitante declínio na acumulação de NifA com o aumento de oxigénio CHuala, E. et al.,, J» Bacteriol* í 7 í s 5354-3565 <1989); ver também Tabela 3) confirma que a inacti-vação de NifA pode ocorrer por um mecanismo diferente da degradação* A inactivaçlo ds MifA pelo oxigénio foi proposta como ocorrendo através ds uma alteração no estado de oxidação de um ião me tá 1 ico C F isc he r, H«M, et al *, Nucleic Acids Res. 16?220/-2224 (1988))» Este modelo para a inactivação de NifA pelo oxigénio não sugere imediataments o envolvimento de factores do hospedeiro no processo* Mo entanto, é possível que inserções em snoB possam in-directamente proteger NifA dos danos de oxidação, por exemplo causando um aumento do nível de enzimas tais como supsróxido dis— íuutass s catalase que protegem a célula de danos oxidativos» Como alternativa, o produto snoB poderá actuar como directamenie para decrescer s actividade de MifA na presença ds oxigénio, sugerindo um papel como análogo funcional de Klebsleila pmeumoniae NifL* Í I t

Todas as referências aqui citadas estão totalmente incluídas por referência,· Tendo agora discutido total mente o invento, será entendido pelo familiarizados com a matéria que o Smbito do presente invento pode incluir uma larga gama de equivalentes ds condiçSes, parâmetros e similares* sem afectar o espirito ou âmbito do invento ou qualquer realização sua»

í

I

Claims (1)

1. REIV Ϊ NDICftÇSES: xâ« - Hospedeira bacierianos caracterizado por o referida hospedeira possuir uma mutação soí snoC e por a referida mutação resultar num decréscimo da ia^a de degradação de proteínas produzidas por via recomhinante» 2i. - Hospedeiro de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a referida mutação em snoC ser uma mutação na região de 23 a 31 minutos do mapa genético de E.. coli e em que a referida mutação dista aproMimadamente 1Θ quilobases de nirR na dirscção de rac, 3ân - Hospedeiro de acordo com a reivindicação caracterizado por o referido hospedeiro ser o ATCC número de acesso 55Θ4Φ. 4ã» - Hospedeiro bacteriano5 caracterizado por o referida hospedeiro possuir uma mutação em lon e uma mutação em snsE e por as referidas mutaçSes resultarem num decréscimo da taxa de degradação das proteínas produzidas por via recombinante« 5s» - Hospedeiro de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por a referida mutação em sno8 estar situada aproKimadafnerite 1 é-Θ pares de bases a jusante do cod-lo de terminação para a1aS. és* ~ Hospedeiro de acordo com a reivindicação 4? caracterizado por o referido hospedeira ser o ATCC número de acesso 5503?* 7S. - Processo para a preparação de uma proteína recombinan te ? caracterizado por a referida proteína raconsbinante \ produzida por qualquer nospec*01 ros DSC 'C'.~·r.1 anos; snoL icaçSes 1--6 = Sâ. ~ Processo P-S rõí -S DDT^nç aractsrisado por α Γ’-Ξ T 01'~ 1. ô o iJr4A de qualquer um dos nos pír'QSf X r OS· d -~l αε de DNA purificada de ) 9â. - Proce; -LO.ÍSMj caracterisado por o referido DMA de snoB ssr purificado partir de qualquer um doe hospedeiros das reivindicações 4-6= [ ,§ de Abri 1 de t

   J. PEREIRA DA CRUZ Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VtCTOR CORDON, 10-A 3.° 1200 LISBOA