PT975672E - Anticorpos para inibir a coagulação sanguínea e métodos para a sua utilização - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

"ANTICORPOS PARA INIBIR A COAGULAÇÃO SANGUÍNEA E MÉTODOS PARA A SUA UTILIZAÇÃO"

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO 1. Campo da Invenção A presente invenção refere-se a novos anticorpos e métodos de utilização dos anticorpos para inibir coagulação sanguínea. Em particular, a invenção refere-se a novos anticorpos que podem ligar especificamente o factor tecidular humano nativo com afinidade elevada. Os anticorpos da invenção são úteis para uma variedade de aplicações, particularmente para redução da coagulaçao sanguínea in vivo. 2. Antecedentes A coagulação sanguínea facilita a homeostase minimizando a perda de sangue. Geralmente, coagulação sanguínea requer a lesão de vasos, agregação de plaquetas, factores de coagulação e inibição de fibrinólise. Os factores de coagulação actuam através de uma cascata que se refere a lesão de vasos para formação de um coágulo sanguíneo (ver geralmente L. Stryer, Biochemistry, 3a Ed, W.H. Freeman Co., Nova Iorque; e A.G. Gilman et al. , The Pharmacological Basis of Therapeutics, 8a Edição, McGraw Hill Inc., Nova Iorque, pp. 1311-1331). 1

Existe consenso geral em que a activação do factor X (FX) em factor Xa (FXa) é um passo crítico no processo de coagulação sanguínea. Geralmente, FX é convertido em FXa pela ligação a um complexo cataliticamente activo que inclui o "factor tecidular" (TF) . 0 TF é uma proteína da membrana celular expressa de modo controlável que liga o factor VlI/VIIa para produzir o complexo cataliticamente activo (TF:VIIa). A coagulação sanguínea segue-se à activação mediada por FXa da protrombina. A coagulação sanguínea pode ser minimizada pela inactivação de TF em formas não nativas que não podem produzir de forma óptima o complexo TFrVIIa. Crê-se que a formação excessiva de FXa contribua para várias tromboses incluindo restenose. A trombose pode ser associada com procedimentos invasivos médicos, tais como cirurgia cardíaca (e. g. angioplastia), cirurgia abdominotoráxica, cirurgia arterial, colocação de um implementação (e. g. , um stent ou cateter) ou endarterectomia. Além disso, a trombose pode acompanhar vários distúrbios tromboembólicos e coagulopatias, tais como um embolismo pulmonar (e. g. , fibrilhação atrial com embolização) e coagulação intravascular disseminada, respectivamente. A manipulação de fluidos corporais pode também resultar num trombo indesejável, particularmente em transfusões de sangue ou amostragem de fluidos, assim como em procedimentos que envolvem a circulação extracorporal (e. g. , cirurgia de bypass cardiopulmonar) e diálise.

Os anticoagulantes são frequentemente utilizados para aliviar ou evitar coágulos sanguíneos associados com trombose. A coagulação sanguínea pode frequentemente ser minimizada ou 2 eliminada pela administração de um anticoagulante adequado ou suamistura, incluindo um ou mais de um derivado de coumarina (e. g., warfina e dicumarol) ou um polímero carregado (e. g. , heparina, hirudina ou bivalirrudina) . Ver e. g.r Gilman et al. , supra, R.J. Beigering et al. , Ann. Hemathol., 72:177 (1996); J.D. Willerson, Circulation, 94:866 (1996).

No entanto, a utilização de anticoagulantes é frequentemente associada com efeitos colaterais, tais como hemorragia, re-oclusão, síndroma de "coágulo branco", irritação, defeitos de nascença, trombocitopenia e disfunção hepática. A administração a longo prazo de anticoagulantes pode particularmente aumentar o risco de doença com risco de vida (ver e. g. , Gilman et al., supra).

Determinados anticorpos com actividade anti-plaquetária foram também utilizados para aliviar várias tromboses. Por exemplo, Abciximab é um anticorpo terapêutico que é rotineiramente administrado para aliviar vários distúrbios tromboembólicos, tais como os provenientes de angioplastia, enfarte do miocárdio, angina instável e estenoses da artéria coronária. Adicionalmente, Abciximab pode ser utilizado como um profiláctico para reduzir o risco de enfarte do miocárdio e angina (J.T. Willerson, Circulation, 94:866 (1996); M.L. Simmons et al., Circulation, 89:596 (1994)).

Determinados anticorpos anticoagulantes são também conhecidos. Particularmente, determinados anticorpos de ligação a TF foram reportados como inibindo a coagulação sanguínea, presumivelmente por interferência com a montagem de um complexo cataliticamente activo TF:VIIa (ver e. g. , Jeske et al. , SEM in 3 THROM. and HEMO, 22:213 (1996); Ragni et al., Circulation, 93 : 1913 (1996); Patente Europeia N° 0420937 Bl; W. Rufet al. , Throm. Haemosp., 66:529 (1991); M.M. Fiorie et al., Blood, 8:3127 (1992)) .

No entanto, os anticorpos de ligação a TF actuais exibem desvantagens significativas que podem minimizar a sua adequabilidade como anticoagulantes. Por exemplo, os anticorpos de ligação a TF não exibem afinidade de ligação suficiente para actividade anticoagulante óptima. De acordo com o exposto, para muitos estados trombóticos, para compensar estas afinidades de ligação ineficazes, níveis inaceitavelmente elevados de anticorpo devem ser administrados para minimizar a coagulação sanguínea. Além disso, os anticorpos de ligação a TF actuais não discriminam eficazmente as formas nativas de TF e não nativas de TF, i. e. os anticorpos actuais não exibem especificidade de ligação suficiente. Além disso, os actuais anticorpos de ligação a TF não podem evitar que FX se ligue a TF e/ou complexo TF:Vila.

Deve deste modo ser desejável possuir um anticorpo anticoagulante que liga o TF humano nativo com afinidade elevada e selectividade para deste modo inibir a coagulação indesejada do sangue e a formação de coágulos sanguíneos. Deve ser também desejável possuir este anticorpo anticoagulante que evita a ligação do Factor X ao complexo TF/VIIa.

Fiore Μ. M. et al, Blood, vol. 80, n° 12 (15 de Dezembro), 1992; as páginas 3127-3134 divulgam dois anticorpos monoclonais anti-TF (TF8-11D12 e TF9-9C3). 0 documento WO 94/05328 refere-se a moléculas que se ligam ao factor tecidular e destroem o 4 complexo TF.VIIa. 0 documento WO 96/40921 proporciona anticorpos enxertados em CDR contra o factor tecidular humano que retém a elevada afinidade de ligação de anticorpos monoclonais de roedores contra o factor tecidular mas possui imunogenicidade reduzida. O documento WO 89/12463 refere um método e composição terapêutica para o tratamento de enfarte do miocárdio compreendendo a administração de uma proteína antagonista de factor tecidular e um agente trombolitico. 0 documento US 5437864 proporciona um método de inibição da coagulação na circulação extracorporal num indivíduo, compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo monoclonal que inibe a capacidade do factor tecidular se ligar ao factor VlI/VIIa.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Detectaram-se agora anticorpos que proporcionam actividade anticoagulante superior por ligação ao TF humano nativo com afinidade e especificidade elevadas. Deste modo, num aspecto, a invenção proporciona anticorpo ou um seu fragmento que se liga ao factor tecidular humano ("TF"), em que o anticorpo ou fragmento compreende: (i) regiões hipervariáveis de cadeia leve CDRl, CDR2, e CDR3, em que: ID N°: 5; ID N°: 6; e ID N°: 7; e

CDRl compreende a sequência de SEQ CDR2 compreende a sequência de SEQ CDR3 compreende a sequência de SEQ 5 (ii) regiões hipervariáveis de cadeia pesada CDR1, CDR2 e CDR3, em que: CDR1 compreende a sequência de SEQ ID N° : 8; CDR2 compreende a sequência de SEQ ID N° : 9; CDR3 compreende a sequência de SEQ ID N° : 10 .

Os anticorpos da invenção podem efectivamente inibir a coagulação sanguínea in vivo. Os anticorpos da invenção podem ligar-se ao TF humano nativo, isolado ou presente num complexo TFrVIIa, evitando eficazmente a ligação do factor X ao TF ou ao complexo, e reduzindo deste modo a coagulação sanguínea.

Os anticorpos da invenção preferidos são monoclonais e ligam-se especificamente a um epitopo conformacional predominante do TF humano nativo, proporcionando esse epitopo um sítio de ligação ao anticorpo inesperadamente forte. De facto, os anticorpos da invenção preferidos ligam-se ao TF humano nativo, pelo menos, cerca de 5 vezes mais, mais tipicamente, pelo menos, cerca de dez vezes mais do que a afinidade de ligação exibida pelos anticorpos anticoagulantes anteriores. Adicionalmente, os anticorpos da invenção preferidos são selectivos para o TF humano nativo e não se ligam substancialmente a TF não nativo ou desnaturado. 0 H36.D2.B7 (segregado pelo hibridoma ATCC HB-12255) é um anticorpo especialmente preferido da invenção.

Os anticorpos da invenção preferidos ligam-se a TF de modo que FX não se liga eficazmente ao complexo TF/factor Vila e deste modo FX não é eficazmente convertido na sua forma activada (FXa) . Os anticorpos da invenção preferidos podem inibir a 6 função de TF através do bloqueio eficaz da ligação a FX ou acesso às moléculas TF. Ver, por exemplo, os resultados do Exemplo 3 que se segue.

Os anticorpos da invenção preferidos também não inibem significativamente a interacção ou ligação entre o TF e o factor Vila, ou inibem a actividade de um complexo TF: factor Vila no que respeita a outros materiais que não FX. Ver, por exemplo, os resultados do Exemplo 4 que se segue. A invenção também proporciona ácidos nucleicos que codificam os anticorpos da invenção. As sequências de ácidos nucleicos e de aminoácidos (SEQ ID:N° 1-4) das regiões variáveis de H36.D2.B7 são apresentadas nas Figuras IA e 1B das figuras.

Nos aspectos preferidos, os anticorpos da invenção são para utilização na inibição da coagulação sanguínea e formação do coágulo sanguíneo, e na redução dos níveis de TF humano.

Em geral, os anticorpos da invenção serão úteis para modular virtualmente qualquer resposta biológica mediada através da ligação de FX ao TF ou ao complexo TFrVIIa, incluindo a coagulação sanguínea como discutido acima, inflamação e outros distúrbios.

Os anticorpos da invenção são particularmente úteis para aliviar várias tromboses, particularmente para evitar ou inibir restenose, ou outras tromboses seguindo um procedimento médico invasivo, tal como a cirurgia arterial ou cardíaca (e. g., angioplastia). Os anticorpos da invenção também podem ser empregues para reduzir ou mesmo eliminar eficazmente a 7 coagulação sanguínea proveniente da utilização de implementação médica (e. g. , um cateter, stent ou outro dispositivo médico). Os anticorpos da invenção preferidos serão compatíveis com muitas composições anticoagulantes, antplaquetárias e trombolíticas, permitindo deste modo a administração num formato de cocktail para reforçar ou prolongar a inibição da coagulação sanguínea.

Os anticorpos da invenção também podem ser empregues como um anticoagulante em circulação extracorporal de um mamífero, particularmente um indivíduo humano. Nestes métodos, um ou mais anticorpos da invenção são administrados ao mamífero numa quantidade suficiente para inibir a coagulação sanguínea antes ou durante circulação extracorporal, tal como pode ocorrer com a cirurgia de bypass cardiopulmonar, cirurgia de transplante de órgãos ou outras cirurgias prolongadas.

Os anticorpos da invenção também podem ser utilizados como um veículo para fármacos, particularmente produtos farmacêuticos dirigidos para a interacção com um coágulo sanguíneo tais como estrepocinase, activador de plasminogénio tecidular (t-PA) ou urocinase. Do mesmo modo, os anticorpos da invenção podem ser utilizados como um agente citotóxico pela conjugação com uma toxina adequada para o anticorpo. Os conjugados de anticorpos da invenção também podem ser utilizados para reduzir os níveis de factor tecidular num mamífero, particularmente um humano, por administração ao mamífero de uma quantidade eficaz de um anticorpo da invenção que é covalentemente ligado a uma toxina celular ou a uma molécula efectora para proporcionar capacidade de fixação de complemento e citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo, em que o conjugado de anticorpo contacta as células que expressam o factor tecidular para reduzir deste modo os níveis de factor tecidular no mamífero.

Os anticorpos da invenção também podem ser empregues em métodos de diagnóstico in vivo incluindo imagiologia de diagnóstico in vivo de TF humano nativo.

Os anticorpos da invenção também podem ser utilizados em ensaios in vitro para detectar TF nativo numa amostra biológica incluindo um fluido corporal (e. g. , plasma ou soro) ou tecido (e. g., uma amostra de biópsia). Mais particularmente, vários imunoensaios heterogéneos e homogéneos podem ser empregues num formato competitivo ou não competitivo para detectar a presença e de um modo preferido, uma quantidade de TF nativo na amostra biológica.

Estes ensaios da invenção são altamente úteis para determinar a presença ou possibilidade de um doente ter uma coagulação sanguínea ou um coágulo sanguíneo, ou seja, a coagulação sanguínea é normalmente acompanhado pela expressão de TF nas superfícies celulares, tais como células que cobrem a vasculatura. Na ausência de coagulação sanguínea, TF não é normalmente expresso. Deste modo, a detecção de TF numa amostra de fluido corporal através de um ensaio da invenção será indicativa de coagulação sanguínea.

Os anticorpos da invenção também podem ser utilizados para preparar TF nativo substancialmente puro, particularmente TF humano nativo, a partir de uma amostra biológica. Os anticorpos da invenção também podem ser utilizados para detectar e purificar células que expressam TF nativo. 9

Os anticorpos da invenção também podem ser empregues como um componente de um kit de diagnóstico, e. g. para detectar e, de um modo preferido, quantificar TF nativo numa amostra biológica. Outros aspectos da invenção são discutidos infra e são também apresentados nas reivindicações em anexo.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

As Fig. IA e 1B mostram as sequências de ácido nucleico (SEQ ID N°:l e 3) e de aminoácidos (SEQ ID N°:2 e 4) das regiões variáveis da cadeia leve e cadeia pesada de H36.D2.B7 com regiões hipervariáveis (CDR ou Regiões Determinantes de Complementaridade) sublinhadas (sublinhado simples para as sequências de ácido nucleico e sublinhado duplo para as sequências de aminoácidos). A Fig. 2 mostra as constantes de associação (Ka) e dissociação (Kd) de anticorpos anti-factor tecidular como determinado por ELISA ou análise BIACore. A Fig. 3 mostra inibição da activação de FX mediada pelo complexo TF:VIIa através da pré-incubação com anticorpos anti-factor tecidular. A Fig. 4 mostra a inibição da actividade de TF/VIIa contra o substrato especifico de FVIIa S-2288 através de anticorpos anti-factor tecidular. 10 A Fig. 5 mostra a capacidade do anticorpo H36 para aumentar o tempo de protrombina (PT) num ensaio de coagulação

iniciado por TF . As Fig. 6A e 6B mostram graficamente a relação entre a formação de FXa e proporção molar do anticorpo H36.D2 e rHTF. Fig. 6 A: H36.D2 foi pré-incubado com o complexo FT:Vila antes da adiçao de FX. Fig. 6B: H36.D2, TF: Vila e FX foram adicionados simultaneamente. A Fig. 7 mostra a inibição da actividade TF:VIIa pelo anticorpo H36.D2 num ensaio de activação de células J-82.

As Fig. 8A e 8B são representações de transferências de mancha mostrando que o anticorpo H36.D2 se liga a um epitopo conformacional no rhTF. Pista 1- rHTF nativo, Pista 2- rhTF nativo tratado com 8 M de ureia, Pista 3- rHTF nativo tratado com 8 M de ureia e 5 mM de DTT. Na Fig. 8A, a transferência foi exposta durante aproximadamente 40 segundos, enquanto na Fig. 8B, a transferência foi exposta durante 120 segundos.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Como discutido acima, os anticorpos da invenção preferidos exibem substancial afinidade para o TF humano nativo. Em particular, os anticorpos da invenção preferidos exibem uma constante de associação (Ka, M-1) para o TF humano nativo de, pelo menos, cerca de 1 x 108 como determinado por análise de plasmão de superfície (particularmente, análise de BIACore de 11 acordo com os processos do Exemplo 1 que se segue) , de um modo mais preferido, pelo menos, cerca de 5 x 10 como determinado por análise de plasmão de superfície, de um modo ainda mais preferido, um Ka (Ka, ΝΓ1) para o TF humano nativo de, pelo menos, cerca de 1 x IO10 como determinado por análise de plasmão de superfície. Esta substancial afinidade de ligação dos anticorpos da invenção contrasta drasticamente com afinidades de ligação muito mais baixas de anticorpos previamente reportados. A este respeito, pode ser empregue uma concentração eficaz bastante baixa de um anticorpo da invenção, e. g. uma concentração relativamente baixa de anticorpo pode ser empregue para inibir a função de TF como desejado (e. g., pelo menos, cerca de 95, 98 ou 99 porcento de inibição) num ensaio in vitro, tal como descrito no Exemplo 3 que se segue.

Os anticorpos preferidos são também altamente específicos para o TF humano nativo e, de um modo preferido, não ligam substancialmente TF não nativo. Os anticorpos preferidos não ligam substancialmente TF não nativo ou outras moléculas imunologicamente não relacionadas como determinado, e. g. por ensaio de transferência de mancha convencional (e. g. sem ligação ou essencialmente sem ligação ao TF não nativo visualmente detectado por este ensaio de transferência de mancha) . As referências aqui a "TF não nativo" significam um TF humano que ocorre naturalmente ou recombinante que foi tratado com um agente caotrópico de modo que o TF seja desnaturado. Os agentes caotrópicos típicos incluem um detergente (e. g. SDS) , ureia combinada com ditiotreitol ou β-mercaptoetanol; cloridrato de guanidina e semelhantes. Os anticorpos H36, H36.D2 ou H36.D2.B7 não se ligam substancialmente a este TF não nativo. 12

Ver, por exemplo, os resultados do Exemplo 8 que se segue e é um ensaio de transferência de mancha.

Como discutido acima, os anticorpos da invenção preferidos também se ligam com TF de modo que FX não se ligou eficazmente ao complexo TF/factor Vila em que FX não é eficazmente convertido na sua forma activada (FXa). Os anticorpos da invenção particularmente preferidos exibidos irão inibir a actividade de FX para um complexo TF/factor Vila, e. g. uma inibição de, pelo menos, cerca de 50%, de um modo mais preferido, pelo menos, cerca de 80% e ainda, de um modo mais preferido, pelo menos, cerca de 90% ou 95%, mesmo em baixas concentrações de TF, tal como inferior a cerca de 1,0 nM de TF, ou mesmo inferior a cerca de 0,20 nM ou 0,10 nM de TF, como determinado por um ensaio convencional de ligação in vitro, tal como o do Exemplo 3 que se segue e inclui o contacto de FX com um complexo TFrfactor Vila ambos na presença (i. e. amostra experimental) e ausência (i. e. amostra de controlo) de um anticorpo da invenção e determinação da percentagem de diferença de conversão de FX em FXa entre a amostra experimental e a de controlo.

Os anticorpos da invenção são, de um modo preferido, substancialmente puros quando utilizados nos métodos e ensaios divulgados. As referências a um anticorpo como sendo "substancialmente puro" significam um anticorpo ou proteína que foi separada de componentes que o acompanham naturalmente. Por exemplo, utilizando técnicas de purificação convencionais de imunoafinidade ou afinidade com proteína A, um anticorpo da invenção pode ser purificado a partir de uma cultura de hibridoma utilizando TF nativo como antigénio ou uma resina de 13 proteína A. Do mesmo modo, o TF nativo pode ser obtido numa forma substancialmente pura utilizando um anticorpo da invenção com técnicas convencionais de purificação por imunoafinidade. Particularmente, um anticorpo ou proteína é substancialmente puro quando, pelo menos, 50% da proteína total ( % em peso da proteína total numa determinada amostra) é um anticorpo ou proteína da invenção. De um modo preferido, o anticorpo ou proteína é, pelo menos, 60% em peso da proteína total, de um modo mais preferido, pelo menos, 75% em peso, de um modo ainda mais preferido, pelo menos, 90% em peso e, de um modo mais preferido, pelo menos, 98% em peso do material total. A pureza pode ser rapidamente ensaiada por métodos conhecidos, tais como electroforese em gel de SDS (PAGE), cromatografia em coluna (e. g., cromatografia de afinidade) ou análise por HPLC.

As sequências de ácido nucleico (SEQ ID N° : 1 e 3) e aminoácidos (SEQ ID N° : 2 e 4) de um anticorpo da invenção preferido (H36.D2.B7) são apresentadas nas Figuras IA e 1B dos desenhos. As SEQ ID N° 1 e 2 são o ácido nucleico e os aminoácidos respectivamente da região variável da cadeia leve, e as SEQ ID N° 3 e 4 são o ácido nucleico e os aminoácidos respectivamente da região variável da cadeia pesada, com regiões hipervariáveis (CDR ou Regiões Determinantes de

Complementaridade) sublinhadas em todas estas sequências.

Os anticorpos da invenção preferidos adicionais terão uma substancial identidade de sequência com uma ou ambas as sequências da cadeia leve ou pesada, apresentadas nas Figuras IA e 1B. Mais particularmente, os anticorpos preferidos incluem os que possuem, pelo menos, cerca de 70 porcento de homologia (identidade de sequência) com as SEQ ID N° 2 e/ou 4, de um modo 14 mais preferido, cerca de 80 porcento ou mais homologia com as SEQ ID N° 2 e/ou 4, de um modo ainda mais preferido, cerca de 85, 90 ou 95 porcento ou mais homologia com as SEQ ID N° 2 e/ou 4.

Os anticorpos da invenção preferidos terão uma elevada identidade de sequência com regiões hipervariáveis (apresentada com sublinhado duplo nas Figuras IA e 1B) das SEQ ID N° 2 e 4) . Os anticorpos da invenção especialmente preferidos possuirão três regiões hipervariáveis da região variável da cadeia leve de H36.D2.B7 (estas regiões hipervariáveis apresentadas com sublinhado na Figura IA e são as seguintes: 1) LASQTID (SEQ ID N0:5) ; 2) AATNLAD (SEQ ID N°:6); e 3) QQVYSSPFT (SEQ ID N°:7)).

Os anticorpos da invenção especialmente preferidos também possuirão três regiões hipervariáveis da região variável da cadeia pesada de H36.D2.B7 (estas regiões hipervariáveis apresentadas com sublinhado na Figura 1B e são as seguintes: 1) TDYNVY (SEQ ID N°:8); 2) YIDPYNGITIYDQNFKG (SEQ ID N°:9); e 3) DVTTALDF (SEQ ID N°: 10).

Os ácidos nucleicos da divulgação têm, de um modo preferido, um comprimento suficiente (de um modo preferido, pelo menos, cerca de 100, 200 ou 250 pares de bases) para se ligarem à sequência de SEQ ID N°:l e/ou SEQ ID N°:3 sob as seguintes condições moderadamente restringentes (referidas aqui como condições de "restringência normal"): utilização de um tampão de hibridação compreendendo 20% de formamida em 0,8 M de tampão solução salina/0,08 M de citrato de sódio (SSC) a uma temperatura de 37 °C e permaneceram ligados quando submetidos a lavagem uma vez com esse tampão SSC a 37 °C. 15

De um modo mais preferido, os ácidos nucleicos da divulgação (de um modo preferido, pelo menos cerca de 100, 200 ou 250 pares de bases) ligar-se-ão à sequência de SEQ ID N°:l e/ou SEQ ID N°:3 sob as seguintes condições de elevada restringência (aqui referido como condições de "elevada restringência"): utilização de um tampão de hibridação compreendendo 20% de formamida em 0,9 M de tampão solução salina/0,09 M de citrato de sódio (SSC) a uma temperatura de 42 °C e permanecendo ligados quando submetidos a lavagem duas vezes com esse tampão SSC a 42 °C.

Os ácidos nucleicos da divulgação compreendem, de um modo preferido, pelo menos, 20 pares de bases, de um modo mais preferido, pelo menos, cerca de 50 pares de bases e, de um modo ainda mais preferido, um ácido nucleico da invenção compreende pelo menos cerca de 100, 200, 250 ou 300 pares de bases.

Os ácidos nucleicos da invenção geralmente preferidos irão expressar um anticorpo da invenção que exibe as afinidades de ligação preferidas e outras propriedades como aqui divulgado.

Os ácidos nucleicos da invenção preferidos terão também uma substancial identidade de sequência com uma ou ambas as sequências de cadeia leve ou pesada, apresentadas nas Figuras IA e 1B. Mais particularmente, os ácidos nucleicos preferidos compreenderão uma sequência que possui, pelo menos, cerca de 70 porcento de homologia (identidade de sequência) com as SEQ ID N° 1 e/ou 3, de um modo mais preferido, cerca de 80 porcento ou mais de homologia com as SEQ ID N° 1 e/ou 3, 16 ainda, de um modo mais preferido, cerca de 85, 90 ou 95 porcento ou mais de homologia com as SEQ ID N° 1 e/ou 3.

As sequências de ácido nucleico da invenção particularmente preferidas possuirão elevada identidade de sequência com regiões hipervariáveis (apresentadas com sublinhado nas Figuras IA e 1B) das SEQ ID N° 1 e 3). Os ácidos nucleicos especialmente preferidos incluem os que codificam para uma região variável da cadeia leve do anticorpo e possuem três sequências que codificam para regiões hipervariáveis de H36.D2.B7 (as regiões hipervariáveis apresentadas com sublinhado na Figura IA e são as seguintes: 1) CTGGCAAGTCAGACCATTGAT (SEQ ID N°: 11); 2) GCTGCCACCAACTTGGCAGAT (SEQ ID N°: 12); e 3) CAACAAGTTTACAGTTCTCCATTCACGT (SEQ ID N°: 13)).

Os ácidos nucleicos especialmente preferidos também codificam para uma região variável da cadeia pesada de anticorpo e possuem três sequências que codificam para as regiões hipervariáveis de H36.D2.B7 (as regiões hipervariáveis apresentadas com sublinhado na Figura 1B e são as seguintes: 1) ACTGACTACAACGTGTAC (SEQ ID N°: 14); 2) TATATTGATCCTTACAATGGTATTACTATCTACGACCA GAACTTCAAGGGC (SEQ ID N°: 15); e 3) GATGTGACTACGGCCCTTGAC TTC (SEQ ID N°: 16)).

Os ácidos nucleicos da invenção são isolados, o que significa que um determinado ácido nucleico normalmente constitui, pelo menos, cerca de 0,5%, de um modo preferido, pelo menos, cerca de 2% e, de um modo mais preferido, pelo menos, cerca de 5% em peso do ácido nucleico total presente numa 17 determinada fracção. Um ácido nucleico parcialmente puro constitui, pelo menos, cerca de 10%, de um modo preferido, pelo menos, cerca de 30% e, de um modo mais preferido, pelo menos, cerca de 60% em peso do ácido nucleico total presente numa determinada fracção. Um ácido nucleico puro constitui, pelo menos, cerca de 80%, de um modo preferido, pelo menos, cerca de 90% e, de um modo mais preferido, pelo menos, cerca de 95% em peso do ácido nucleico total presente numa determinada fracção.

Os anticorpos da invenção podem ser preparados por técnicas geralmente conhecidas na técnica e são tipicamente produzidos numa amostra purificada de TF nativo, tipicamente TF humano nativo, de um modo preferido, factor tecidular humano recombinante purificado (rhTF) 0 factor tecidular humano recombinante truncado ou "rhTF" (composto por 243 aminoácidos e sem o domínio citoplasmático) é particularmente preferido para produzir anticorpos da invenção. Os anticorpos também podem ser produzidos a partir de um péptido imunogénico que compreende um ou mais epitopos de TF nativo que não são exibidos por TF não nativo. As referências aqui a "TF nativo" incluem as amostras de TF, incluindo as de rhTF. Como discutido acima, os anticorpos monoclonais são geralmente preferidos, embora os anticorpos policlonais também possam ser empregues.

Mais particularmente, os anticorpos podem ser preparados por imunização de um mamífero com uma amostra purificada de TF humano nativo ou um péptido imunogénico como discutido acima, isolado ou complexado com um veículo. Os mamíferos adequados incluem animais de laboratório típicos, tais como ovelhas, cabras, coelhos, cobaios, ratos e murganhos. Os ratos e murganhos, especialmente murganhos, são preferidos para obtenção 18 de anticorpos monoclonais. 0 antigénio pode ser administrado ao mamífero através de qualquer de várias vias adequadas tais como injecção subcutânea, intraperitoneal, intravenosa, intramuscular ou intracutânea. 0 intervalo óptimo de imunização, dose de imunização, etc. pode variar em intervalos relativamente alargados e pode ser determinado empiricamente com base nesta divulgação. Os processos típicos envolvem a injecção do antigénio várias vezes durante vários meses. Os anticorpos são recolhidos a partir do soro do animal imunizado por técnicas convencionais e rastreado para encontrar anticorpos específicos para o TF humano nativo. Os anticorpos monoclonais podem ser produzidos em células que produzem anticorpos e as células utilizadas para produzir anticorpos monoclonais utilizando técnicas convencionais de fusão para formar células de hibridoma. Ver G. Kohler, et al., Nature, 256:456 (1975). Tipicamente isto envolve a fusão de uma célula produtora de anticorpo com uma linha celular imortal, tal como uma célula de mieloma para produzir a célula híbrida. Alternativamente, os anticorpos monoclonais podem ser produzidos a partir de células pelo método de Huse, et al., Science, 256:1275 (1989).

Um protocolo adequado proporciona imunização intraperitoneal de um murganho com uma composição compreendendo o complexo rhTF purificado conduzido durante um período de cerca de dois a sete meses. As células do baço podem então ser removidas a partir do murganho imunizado. Os soros do murganho imunizado são ensaiados quanto a títulos de anticorpos específicos para rhTF antes da excisão das células de baço. As células do baço do murganho excisadas são então fundidas com uma linha de células linfóides homogénicas ou heterogénicas apropriadas (de um modo preferido homogénicas) possuindo um marcador tal como deficiência em 19 fosforribosiltransferase de hipoxantina-guanina (HGPRT) ou deficiência em cinase de timidina (TK_) . De um modo preferido, é empregue uma célula de mieloma como a linha de células linfóides. As células de mieloma e células de baço são misturadas em conjunto, e. g. numa proporção de cerca de 1 a 4 células de mieloma para células de baço. As células podem ser fundidas pelo método do polietilenoglicol (PEG). Ver G. Kohler, et al., Nature, supra. 0 hibridomas assim clonado é cultivado num meio de cultura, e. g. RPMI-1640. Ver G. E. More, et al., Journal of American Medicai Association, 199:549 (1967). Os hibridomas, cultivados após o processo de fusão, são rastreados, tal como por radioimunoensaio ou enzimoimunoensaio para secreção de anticorpos que se ligam especificamente ao rhTF purificado, e. g. são seleccionados os anticorpos que se ligam ao rhTF purificado, mas não a TF não nativo. De um modo preferido, é empregue um ELISA para o rastreio. Os hibridomas que apresentam resultados positivos após este rastreio podem ser expandidos e clonados pelo método de diluição limitante. Além disso, os rastreios são, de um modo preferido, realizados para seleccionar anticorpos que podem ligar-se a um rhTF em solução assim como numa amostra de fluido humano. Os anticorpos isolados podem ser ainda purificados por qualquer técnica imunológica adequada incluindo cromatografia de afinidade. Uma cultura de hibridoma que produz o anticorpo particular preferido H36.D2.B7 foi depositada de acordo com o Tratado de Budapeste na American Type Culture Collection (ATCC) em 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, 10852. A cultura de hibridoma foi depositada na ATCC em 8 de Janeiro de 1997 e foi-lhe atribuído o Número de Acesso ATCC HB-12255. 20

Para aplicações terapêuticas humanas, pode ser desejável produzir derivados de anticorpo quimérico, e. g. moléculas de anticorpo que combinam uma região variável de animal não humano e uma região constante humana, para deste modo produzir anticorpos menos imunogénicos para um indivíduo humano do que o correspondente anticorpo não quimérico. Uma variedade de tipos destes anticorpos quiméricos podem ser preparados, incluindo e. g. através da produção de quimeras de regiões variáveis humanas, as partes das regiões variáveis, especialmente as regiões conservadas do domínio de ligação ao antigénio, são de origem humana e apenas as regiões hipervariáveis são de origem não humana. Ver também discussões sobre anticorpos quiméricos humanizados e métodos para os produzir em S.L. Morrison,

Science, 229:1202-1207 (1985); Oi et al. , BioTechniques, 4:214 (1986); Teng et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 80:7308-7312 (1983); Kozbor et al. , Immunology Today, 4:7279 (1983); Olsson et al., Meth. Enzymol., 9:3-16 (1982). Adicionalmente, podem ser empregues murganhos transgénicos. Por exemplo, foram produzidos murganhos transgénicos portadores de repertórios de anticorpo humano que podem ser imunizados com TF humano nativo. Os esplenócitos destes murganhos transgénicos imunizados podem então ser utilizados para produzir hibridomas que segregam anticorpos monoclonais humanos que especificamente reagem com TF humano nativo como descrito acima. Ver N. Lonberg et al. , Nature, 368:856-859 (1994); L.L. Green et al., Nature Genet. , 7:13-21 (1994); S.L. Morrison, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 81:6851-6855 (1994).

Os ácidos nucleicos dos anticorpos da invenção também podem ser preparados por reacção em cadeia da polimerase (ver iniciadores divulgados no Exemplo 1 que se segue) . Ver 21 gerericamente, Sambrook et al., Molecular Cloning (2a ed. 1989). Estes ácidos nucleicos também podem ser sintetizados por métodos conhecidos, e. g. o método do triéster de fosfato (ver Oligonucleotide Synthesis, IRL Press (M.J. Gait, ed., 1984)), ou utilizando um sintetizador de oligonucleótidos automatizado comercialmente disponível. Este ácido nucleico preparado da invenção pode ser empregue para expressar um anticorpo da invenção por técnicas conhecidas. Por exemplo, um ácido nucleico que codifica para um anticorpo da invenção pode ser incorporado num vector adequado por métodos conhecidos, tal como a utilização de enzimas de restrição para efectuar cortes no vector para inserção da construção seguido por ligação. 0 vector contendo a sequência de ácido nucleico inserida, adequada e operativamente ligada a uma sequência de promotor, é então introduzida em células hospedeiras para expressão. Ver, genericamente, Sambrook et al., supra. A selecção de vectores adequados pode ser realizada empiricamente com base nos factores relacionados com o protocolo de clonagem. Por exemplo, o vector deve ser compatível com e possuir o replicão próprio para a célula hospedeira em que é empregue. Além disso, o vector deve ser capaz de acomodar a sequência de ácido nucleico inserida. As células hospedeiras adequadas incluem uma vasta variedade de células eucarióticas ou procarióticas, tal como, E. coli e semelhantes. 0 peso molecular dos anticorpos da invenção irá variar dependendo de vários factores, tais como a utilização pretendida e se o anticorpo incluir uma toxina conjugada ou recombinantemente fundida, fármaco ou marca detectável ou semelhantes. Em geral, um anticorpo da invenção terá um peso molecular entre aproximadamente 20 a 150 kDa. Estes pesos 22 moleculares podem ser rapidamente determinados por métodos de dimensionamento molecular, tais como electroforese em gel SDS-PAGE seguido por coloração de proteína ou análise de transferência de Western. 0 "anticorpo da invenção" ou outro termo semelhante refere-se a uma imunoglobulina completa assim como fragmentos imunologicamente activos que ligam TF nativo. As imunoglobulinas e seus fragmentos imunologicamente activos incluem um sítio de ligação ao anticorpo (i. e., peritopo capaz de ligar especificamente TF humano nativo). Os fragmentos de anticorpo exemplificativos incluem, por exemplo, fragmentos Fab, F(v), Fab', F(ab')2r "meias moléculas" derivadas por redução de ligações persulfureto de imunoglobulinas, imunoglobulinas de cadeia simples ou outros fragmentos adequados de ligação ao antigénio (ver e. g., Bird et al., Science, pp. 242-424 (1988); Huston et al. , PNAS, (USA), 85:5879 (1988); Webber et al., Mol. Immunol., 32:249 (1995)). 0 anticorpo ou seu fragmento imunologicamente activo pode ser de animal (e. g., um roedor tal como um murganho ou um rato) ou forma quimérica (ver Morrison et ai., PNAS, 81:6851 (1984); Jones et ai., Nature, pp. 321, 522 (1986)). Os anticorpos de cadeia simples da invenção podem ser preferidos.

Do mesmo modo, um "ácido nucleico da invenção" refere-se a uma sequência que pode ser expressa para proporcionar um anticorpo da invenção uma vez que cada termo é especificado para o significado imediatamente acima.

Como discutido acima, os anticorpos da invenção podem ser administrados a um mamífero, de um modo preferido, um primata 23 tal como um humano, para evitar ou reduzir tromboses, tais como restenose, tipicamente numa composição incluindo um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis não tóxicos tais como água estéril ou solução salina, glicóis, tais como polietilenoglicol, óleos de origem vegetal, e semelhantes. Em particular, polímero lactídeo biocompatível, biodegradável, copolímero de lactidoglicolídeo ou polioxietileno, copolímeros de polioxipropileno podem ser excipientes úteis para controlar a libertação das composições contendo anticorpo aqui descritas. Outros sistemas de administração potencialmente úteis incluem partículas de copolímero de acetato de etilenovinilo, bombas osmóticas, e sistemas de infusão implantáveis e lipossomas. Geralmente, uma composição anticoagulante da invenção estará na forma de uma solução ou suspensão, e incluirá, de um modo preferido, aproximadamente 0,01% a 10% (p/p) do anticorpo da presente invenção, de um modo preferido, aproximadamente 0,01% a 5% (p/p) do anticorpo. O anticorpo pode ser administrado como único ingrediente activo na composição, ou como um cocktail incluindo um ou mais de outro anticoagulante (e. g., heparina, hirudina, ou Bivalirudina), antplaquetárias (e. g., Abciximab ou agente trombolíticos (e. g., activador de plasminogénio de tecido, estrepocinase e urocinase). Além disso, os anticorpos da invenção podem ser administrados antes de ou após a administração de um ou mais anticoagulante adequados, antplaquetárias ou agentes trombolíticos para reforçar ou prolongar a actividade de anti-coagulação desejada.

Como também discutido acima, os anticorpos da invenção podem ser empregues para reduzir a coagulação sanguínea potencial proveniente da utilização de implementação médica, e. g. um dispositivo de aplicação, tal como um cateter, stent, etc. Num 24 método preferido, a implementação podem ser tratada com um anticorpo da invenção (e. g., como uma solução salina a 1 mg/mL) antes do contacto com um fluido corporal. Alternativamente, ou além disso, um anticorpo da invenção pode ser combinado com o fluido corporal numa quantidade suficiente para minimizar a coagulação sanguínea.

As composições terapêuticas anticoagulantes de acordo com a invenção são adequadas para utilização na administração parentérica ou intravenosa, particularmente na forma de soluções líquidas. Estas composições podem ser convenientemente administradas em dose unitária e podem ser preparadas de acordo com métodos conhecidos na técnica farmacêutica. Ver Remington's Pharmaceutical Sciences, (Mack Publishing Co., Easton PA, (1980)). Pela expressão "dose unitária" entende-se uma composição farmacêutica da presente invenção empregue numa unidade fisicamente discreta adequada como dosagens unitárias para um primata, tal como um humano, cada unidade contendo uma quantidade pré-determinada de material activo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o diluente ou veículo desejado. A dose unitária dependerá de uma variedade de factores incluindo o tipo e gravidade da trombose a ser tratada, capacidade do sistema de coagulação sanguínea do indivíduo de utilizar o anticorpo e grau de inibição ou neutralização da activação de FX desejada. As quantidades precisas do anticorpo a ser administrado serão tipicamente seguidas do julgamento de quem o pratica, contudo, a dose unitária dependerá geralmente da via de administração e estará no intervalo de 10 ng/kg de peso corporal a 50 mg/kg de peso corporal por dia, mais tipicamente no intervalo de 100 ng/kg de peso corporal a cerca de 10 mg/kg de peso corporal por dia. Os 25 regimes adequados para a administração inicial nas injecções de reforço são também variáveis mas são tipificadas por uma administração inicial seguida por doses repetidas em uma ou mais horas de intervalo através de uma subsequente injecção ou outra administração. Alternativamente, podem ser preparadas infusões intravenosas continuas ou intermitentes suficientes para manter concentrações de, pelo menos, desde cerca de 10 nanomolar a 10 micromolar de anticorpo no sangue.

Em alguns casos, pode ser desejável modificar o anticorpo da presente invenção para lhe transmitir uma propriedade biológica, quimica ou física desejável. Mais particularmente, pode ser útil para conjugar (i. e., ligar covalentemente) o anticorpo a um agente farmacêutico, e. g., um fármaco fibrinolítico, tal como t-PA, estreptocinase ou urocinase para proporcionar actividade fibrinolítica. Esta ligação pode ser conseguida através de vários métodos incluindo a utilização de uma molécula de ligação tal como um agente de reticulação de proteína heterobifuncional, e. g. SPDP, carbodimida ou semelhantes, ou através de métodos recombinantes.

Além disso a produtos farmacêuticos, tal como um agente fibrinolítico, um anticorpo da invenção pode ser conjugado com uma toxina de e. g. vegetal ou de origem bacteriana, tais como toxina da difteria (i. e., DT), toxina shiga, abrina, toxina da cólera, ricina, saporina, exotoxina de pseudomonas (PE) , proteína antiviral de fitolaca ou gelonina. Fragmentos biologicamente activos destas toxinas são bem conhecidas na técnica e incluem, e. g., cadeia A de DT e cadeia A de ricina. A toxina pode também ser um agente activo na superfície de células tais como fosfolipases (e. g., fosfolipase C) . Como outro 26 exemplo, a toxina pode ser um fármaco quimioterapêutico, tal como, e. g., vendesina, vincristina, vinblastina, metotrexato, adriamicina, bleomicina, ou cisplatina ou a toxina pode ser um radionuclídeo tal como, e. g. , iodo-131, ítrio-90, rénio-188 ou bismuto-212 (ver geralmente, Moskaug et al., J. Biol. Chem., 264:15709 (1989); I. Pastan et al. , Cell, 47:641 (1986); Pastan et al. , Recombinant Toxins as Novel Therapeutic Agents, Ann. Rev. Biochem., 61:331 (1992); Chimeric Toxins Olsnes e Phil, Pharmac. Ther., 25:355 (1982); Pedido PCT N° WO 94/29350 publicado; Pedido PCT N° WO 94/04689 publicado; e Patente U.S. N° 5620939). Também, como discutido acima, além de a uma toxina, um anticorpo da invenção pode ser conjugado com uma molécula efectora (e. g. IgGl ou IgG3) para proporcionar capacidade de fixação de complemento e citoxicidade mediada por células dependente de anticorpo após administração a um mamifero.

Este conjugado de anticorpo/citotoxina ou molécula efectora pode ser administrado numa quantidade terapeuticamente eficaz a um mamifero, de um modo preferido, um primata, tal como um humano, em que o mamifero é conhecido por ter ou é suspeito de ter células tumorais, células do sistema imunitário ou endotélio capaz de expressar TF. Exemplos destas células tumorais, células do sistema imunitário e endotélio incluem malignidades da mama e pulmão, monócitos e endotélio vascular.

Os anticorpos da invenção também podem ser conjugados com uma variedade de outros agentes farmacêuticos além dos descritos acima, tais como, e. g. , fármacos, enzimas, hormonas, agentes quelantes capazes de ligação a radionuclídeo, assim como outras proteínas e polipéptidos úteis para diagnóstico ou tratamento de doença. Para propósitos de diagnóstico, o anticorpo da presente 27 invenção pode ser utilizado marcado de forma detectável ou não marcado. Por exemplo, uma vasta variedade de marcas pode ser adequadamente empregue para marcar de forma detectável o anticorpo, tal como radionuclideos, flúores, enzimas, substratos de enzima, cofactores de enzima, inibidores de enzima, ligandos, tais como, e. g., haptenos e semelhantes.

Os métodos de diagnóstico são também divulgados incluindo imagiologia de diagnóstico in vivo [ver, e. g., A.K. Abbas, Cellular and Molecular Immunology, pg. 328 (W.B. Saunders Co. 1991)] . Para a maioria de aplicações in vivo, um anticorpo da invenção pode ser marcado de forma detectável com, e. g., I, 32P, 99Tc ou outra etiqueta detectável e subsequentemente administrado a um mamífero, particularmente um humano, para uma quantidade pré-determinada de tempo suficiente para permitir que o anticorpo contacte um alvo desejado. 0 indivíduo é então rastreado através de procedimentos conhecidos, tal como análise de câmara de cintigrafia para detectar ligação do anticorpo. A análise podia auxiliar no diagnóstico e tratamento de várias tromboses, tais como os especificamente aqui divulgados. 0 método é particularmente útil quando empregue em conjunto com cirurgia cardíaca, particularmente, angioplastia ou outro procedimento cirúrgico em que a formação não desejada de um coágulo sanguíneo pode ocorrer, para visualizar o desenvolvimento ou movimento de um coágulo sanguíneo.

Os anticorpos da invenção também podem ser utilizados para preparar substancialmente TF nativo puro (e. g., pelo menos cerca de 90% puro, de um modo preferido, pelo menos, cerca de 96 ou 97% puro), particularmente, TF humano nativo a partir de uma amostra biológica. Por exemplo, o TF nativo pode ser obtido como 28 previamente descrito (ver e. g. , L.V.M. Rao et al., Thrombosis Res., 56:109 (1989)) e purificado por mistura da solução com um suporte sólido compreendendo o anticorpo para formar uma mistura de reacção de acoplamento. Exemplos de suportes sólidos incluem uma parede de uma placa, tal como uma placa de microtitulação, assim como suportes incluindo ou consistindo em poliestireno, polivinilcloreto, um dextrano reticulado, tal como Sephadex™ (Pharmacia Fine Chemicals), agarose, esferas de poliestireno (Abbott Laboratories), cloreto de polivinilo, poliestireno, poliacrilmida na forma reticulada, nitrocelulose ou nylon e semelhantes. 0 TF pode então ser isolado do suporte sólido na forma substancialmente pura de acordo com técnicas imunológicas convencionais. Ver genericamente Harlow e Lane em Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Publications, Nova Iorque (1988) e Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nova Iorque (1989) .

Como também discutido acima, os anticorpos da invenção podem ser empregues para detectar TF humano nativo numa amostra biológica, particularmente TF nativo associado com um coágulo sanguíneo. Amostras biológicas exemplificativas incluem plasma sanguíneo, soro, saliva, urina, fezes, secreções vaginais, bílis, linfa, humores oculares, fluido cérebroespinal, meio de cultura de células e tecido, particularmente, tecidos vasculares, tal como tecido cardíaco. As amostras podem ser adequadamente obtidas de um mamífero que sofre ou se suspeita que sofra de uma trombose, de um modo preferido, restenose, associada com, e. g., um procedimento médico invasivo, tal como cirurgia de bypass cardiopulmonar; uma doença cardíaca, tal como enfarte do miocárdio, cardiomiopatia, doença cardíaca valvular, angina instável ou fibrilhação atrial associada com embolização; 29 uma coagulopatia incluindo coagulação intravascular disseminada, implante de uma implementação, tal como um stent ou cateter; choque (e. g. , síndroma de choque séptico), trauma vascular, doença hepática, trombose coronária, malignidades (e. g., carcinoma pancreático, ovariano, ou das células pequenas do pulmão), lúpus, eclâmpsia, doença perivascular oclusiva e doença renal.

Para estes ensaios, um anticorpo da invenção pode ser marcado de forma detectável com um átomo ou molécula adequados e. g. , iodo radioactivo, trítio, biotina ou reagente capaz de produzir um produto detectável, tal como um anticorpo anti-iodiotípico ligado a uma enzima, tal como β-galactosidase ou peroxidase de rábano, ou uma etiqueta fluorescente (e. g., fluoresceina ou rodamina) de acordo com métodos conhecidos. Após o contacto da amostra biológica com o anticorpo marcado de forma detectável, qualquer anticorpo que não reagiu pode ser separado da amostra biológica, a marca (ou produto) é detectada através de métodos imunológicos convencionais incluindo ensaio de captura de anticorpo, ensaio de anticorpo sanduíche, RIA, ELISA, imunoprecipitação, imunoabsorção e semelhantes (ver Harlow e Lane, supra; Ausubel et al. supra). Qualquer marcação (ou produto) em excesso que é detectada num amostra de controlo adequada é indicativa da presença de TF nativo, mais particularmente um coágulo sanguíneo, na amostra biológica. Por exemplo, os anticorpos da invenção podem ser marcados de forma detectável para detectar e, de um modo preferido, quantificar, o TF nativo de acordo com técnicas imunológicas convencionais tais como ensaio de captura de anticorpo, ELISA, ensaio sanduíche com anticorpo, RIA, imunoprecipitação, imunoabsorção e semelhantes. Em alguns casos, particularmente quando um tecido é utilizado, a 30 técnica imunológica pode incluir a fixação de tecido com um reagente conhecido por substancialmente manter a conformação de proteina (e. g. , formaldeido diluído). Ver genericamente, Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nova Iorque, (1989); Harlow e Lane in Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Publications, NY (1988).

Os anticorpos da invenção também podem ser utilizados para detectar e purificar células que expressam TF nativo, incluindo fibroblastos, células cerebrais, células imunitárias, (e. g., monócitos), epitélio, assim como certas células malignas. Os métodos preferidos de detectar e purificar as células incluem métodos imunológicos convencionais (e. g., métodos de citometria de fluxo, tais como FACS e imunosselecção). As populações substancialmente puras de células que expressam o TF nativo são úteis nas aplicações clínicas e de investigação, e. g., para estabelecer estas células como células em cultura para a rastreio de anticorpos de ligação a TF. A divulgação também divulga kits de teste e de diagnóstico para a detecção de TF nativo, particularmente TF humano nativo, numa amostra de teste, especialmente um fluido corporal tal como sangue, plasma, etc., ou tecido como discutido acima. Um kit preferido inclui um anticorpo da invenção marcado de forma detectável. 0 kit de diagnóstico pode ser utilizado em qualquer formato imunológico aceitável, tal como um formato de ELISA para detectar a presença ou quantidade de TF nativo na amostra biológica.

Os exemplos não limitantes que se seguem são ilustrativos da invenção. Nos exemplos seguintes e outros são referidos os 31 anticorpos H36 e H36.D2. Estes anticorpos são o mesmo anticorpo que o H36.D2.B7, mas H36 é derivado do clone mãe e o H36.D2 é obtido a partir do clone primário, enquanto o H36.D2.B7 é obtido a partir do clone secundário. Não foram observadas diferenças entre estes três clones no que respeita à capacidade para inibir TF ou outras propriedades fisicas. EXEMPLO 1 - Preparação e Clonagem de Anticorpos Monoclonais Anti-rhTF. Os anticorpos monoclonais contra rhTF foram preparados como se segue. A. Imunização e Reforços

Foram imunizados cinco murganhos fêmea BALB/c cada com 10 pg de rhTF purificado, lipidado. Os murganhos foram inicialmente sensibilizados intraperitonealmente utilizando adjuvante Titermax de Hunter. Foram administrados três reforços finais em 0,85% de NaCl. Os reforços foram 2, 5,5 e 6,5 meses após sensibilização inicial. Todos os reforços foram administrados intraperitonealmente, excepto o primeiro que foi subcutâneo. O reforço final foi administrado 3 dias pré-fusão e foram administrados 20 pg. B. Fusão de Linfócitos de Baço de Murganho com Células de Mieloma de Murganho

Os linfócitos do baço de um murganho BALB/c imunizado com rhTF foram fundidos com células de mieloma de murganho X63-Ag8.653 utilizando PEG 1500. Após exposição ao PEG, as 32 células foram incubadas durante uma hora em soro de bovino fetal inactivado com calor a 37 °C. As células fundidas foram então ressuspensas em RPMI 1640 e incubado, durante a noite a 37 °C, com 10% de CO2. As células foram plaqueadas no dia seguinte utilizando RPMI 1640 e suplementadas com sobrenadante de cultura de macrófagos.

C. Desenvolvimento de ELISA

As placas para o ensaio de ELISA foram revestidas com 100 microlitros do factor tecidular recombinante (0,25 pg/mL) num tampão à base de carbonato. Todos os passos foram realizados à temperatura ambiente. As placas foram bloqueadas com BSA, lavadas e, depois, foram adicionadas as amostras de teste e de controlo. A ligação de antigénio/anticorpo foi detectada por incubação da placa com conjugado de anti-HRP de murganho de cabra (Jackson ImmunoResearch Laboratories) e depois utilizando um sistema de ABTS de substrato de peroxidase (Kirkegaad and Perry Laboratories). A absorvência foi lida num leitor de placas automático a um comprimento de onda de 405 nm.

D. Estabilização de Linhas de Células de Hibridoma de rhTF

Duas semanas após a fusão, o rastreio de colónias de hibridoma por ELISA específico para rhTF foi iniciado. O rastreio de novas colónias continuou durante três semanas. Os clones positivos foram testados em cada uma ou duas semanas para a produção continuada de anticorpo até quinze clones estáveis terem sido congelados. 33 E. Clonagem Primária e Secundária A clonagem por diluição limitante foi realizada em cada um dos hibridomas estáveis positivos para obter clones primários. As células foram descongeladas, cultivadas em cultura durante um curto período de tempo e, depois diluído de 10 células/poço a 0,1 células/poço. Os clones primários foram testados por ELISA anti-rhTF e cinco a seis clones positivos foram expandidos e congelados. O clone secundário de anticorpo anti-rhTF, H36.D2.B7, foi obtido do clone primário, H36.D2, preparado e armazenado em azoto líquido como descrito acima. Foram preparados quatro diferentes diluições, 5 células/poço, 2 células/poço, 1 célula/poço, 0,5 células/poço do clone primário em placas de microtitulação de 96 poços para iniciar a clonagem secundária. As células foram diluídas em meio de cultura de tecidos IMDM contendo os seguintes aditivos: 20% de soro fetal de bovino (FBS), 2 mM de L-glutamina, 100 unidades/mL de penicilina, 100 pg/mL de estreptomicina, 1% de GMS-S, 0,075% de NaHCCh. Para determinar clones que segregam anticorpo anti-rhTF, sobrenadantes de cinco poços individuais da placa de microtitulação de 0,2 células/poço foram drenadas após duas semanas de crescimento e testados quanto à presença de anticorpo anti-rhTF através de ensaios de ELISA como descrito acima. Todos os cinco clones apresentaram resultados positivos no ensaio de ELISA, sendo H36.D2.B7 o melhor produtor de anticorpo. Todos os cinco clones foram adaptados e expandidos em meio RPMI contendo os seguintes aditivos: 10% de FBS, 2 mM de L-glutamina, 100 unidades/mL de penicilina, 100 pg/mL de estreptomicina, 1% 34 de GMS-S, 0,075% de NaHC03 e 0,013 mg/mL de ácido oxaloacético. O H36.D2.B7 foi purificado por cromatografia de afinidade de Proteina A a partir do sobrenadante da cultura celular e foi testado quanto à sua capacidade para inibir TF:VIIa num ensaio de activação de FX. Os resultados indicaram que H36.D2.B7 tinha a mesma inibição do anticorpo H36.D2. Todas as células foram armazenadas em azoto líquido. F. Isolamento do ARN total de H36.D2.B7

Foram isolados 269 pg de ARN total a partir de 2,7 x 105 células do hibridoma H36 . D2 . B7 . 0 isolamento do ARN total foi realizado como descrito no protocolo dos RNeasy Midi Kits da

Qiagen. A amostra de ARN foi armazenada em água a -20 °C até ser necessária. G. Síntese de ADNc e Clonagem de Regiões Variáveis do gene de H36.D2.B7 Gene

Para obter a primeira cadeia de ADNc, uma mistura de reacção contendo 5 pg de ARN total isolado como acima, os iniciadores reversos JS300 (todos os iniciadores são identificados a seguir) para a cadeia pesada (HC) e OKA 57 para a cadeia leve (LC) , inibidor de RNase, dNTP, DTT e a transcriptase reversa superscript II , foram preparados e incubados a 42 °C durante 1 hora. O tubo de reacção é depois incubado a 65 °C durante 15 minutos para interromper a transcrição. Após arrefecimento, cinco unidades de RNase H foram depois adicionadas e a reacção 35 foi deixada incubar a 37 °C durante 20 minutos. A amostra de ADNc foi armazenada a -70 °C até ser necessária. A PCR (reacção em cadeia da polimerase) foi conduzida separadamente para clonar as regiões variáveis de HC e LC de H36.D2.B7 anti-rhTF do ADNc preparado como acima (as sequências de ácido nucleico e de aminoácidos das regiões variáveis HC e LC apresentadas nas Figs. IA e 1B) . Foram conduzidas três rondas de PCR. Ronda 1: PCR foi realizada com 35 ciclos a 96 °C, 53 °C e 72 °C utilizando o iniciador directo JS002 e o iniciador reverso JS300 para HC. Para LC foram utilizados o iniciador directo JS009 e iniciador reverso OKA 57 e a PCR foi realizada durante 35 ciclos a 96 °C, 63 °C e 72 °C. Ronda 2: a PCR de HC e LC foi realizada como na Ronda 1 com a excepção de que pMC-18 foi utilizado para iniciador directo de HC e pMC-15 para iniciador directo de LC. Ronda 3: a PCR foi realizada durante 30 ciclos a 96 °C, 60-65 °C e 72 °C utilizando os iniciadores H36HCF e H36HCR para HC. Para LC, a PCR foi realizada durante 30 ciclos a 96 °C, 58 °C e 72 °C utilizando os iniciadores H36LCF e H36LCR.

Foram utilizados os seguintes iniciadores para clonagem de regiões variáveis de HC e LC de H36.D2.B7. OKA 57: 5'-GCACCTCCAGATGTTAACTGCTC-3' (SEQ ID N°: 17) JS300: 5'-GAARTAVCCCTTGACCAGGC-3' (SEQ ID N°: 18) JS009: 5'-GGAGGCGGCGGTTCTGACATTGTGMTGWCMCARTC-3' (SEQ ID N°: 19) JS002: 36

5'-ATTTCAGGCCCAGCCGGCCATGGCCGARGTYCARCTKCARCARYC-3' ( SEQ ID N°: 20) pMC-15: 5'-CCCGGGCCACCATGKCCCCWRCTCAGYTYCTKG-3' (SEQ ID N°: 21) pMC-18: 5'-CCCGGGCCACCATGGRATGSAGCTGKGTMATSCTC-3' (SEQ ID N°: 22) H36HCF: y-ATATACTCGCGACAGCTACAGGTGTCCACTCCGAGATCCAGCTGCA GCAGTC-3’ (SEQ ID N°: 23) H36HCR: 5'-GACCTGAATTCTAAGGAGACTGTGAGAGTGG-3' (SEQ ID N°: 24) H36LCF: 5'-TTAATTGATATCCAGATGACCCAGTCTCC-3' (SEQ ID N°: 25) H36LCR: TAATCGTTCGAAAAGTGTACTTACGTTTCAGCTCCAGCTTGGTCC (SEQ ID N°: 26) em que nas SEQ ID N°: 17 a 26 acima: K é G ou T; M é A ou C; Ré A ou G; S é C ou G; V é A, C ou G; W é A ou T; Y é C ou T. EXEMPLO 2 - Actividade de Ligaçao dos Mab da Invenção

Os Mab da invenção como preparados no Exemplo 1 acima foram empregues. A molécula de rhTF foi expressa em E. coli e purificada por cromatografia de afinidade de acordo com métodos convencionais (ver Harlow e Lane, supra, Ausubel et al. supra) . As constantes de associação (Ka) e dissociação (Kd) de Mab foram determinadas por ensaios de ELISA e de ressonância de plasmão de 37 superfície (i. e., BIACore) (ver e. g., Harlow e Lane, supra;

Ausubel et al. supra; Altschuh et al., Biochem., 31:6298 (1992); e o método BIAcore divulgado por Pharmacia Biosensor). Para os ensaios BIACore, o rhTF foi imobilizado num chip biosensor de acordo com as instruções do fabricante. As constantes para cada Mab foram determinadas para quatro concentrações de anticorpo (0,125 nM, 0,25 nM, 0,5 nM, e 1 nM).

As concentrações de proteína foram determinadas por ensaio convencional (M.M. Bradford, Anal. Biochem., 72:248 (1976)) utilizando a Albumina do Soro Bovino como um padrão e um reagente e coloração comercialmente disponível (Bio-Rad). A Fig. 2 mostra as constantes de associação e dissociação para cada Mab anti-rhTF. 0 Mab H36 exibiu a maior taxa de associação (Ka= 3,1 X IO10 M_1) e a menor taxa de dissociação (Kd=3,2 X 1CT11 M) de qualquer dos Mab anti-rhTF testados. EXEMPLO 3 - Ensaio de Substrato Específicos para FXa

Em geral, as experiências aqui descritas foram conduzidas utilizando rhTF lipidado com fosfatidilcolina (0,07 mg/mL) e fosfatidilserina (0,03 mg/mL) numa proporção de 70/30 p/p em 50 mM de Tris-HCl, pH 7,5, 0,1% de albumina do soro bovino (BSA) durante 30 minutos a 37 °C. Uma solução stock de complexo TF:VIIa pré-formado foi preparada por incubação de 5 nM do rhTF lipidado e 5 nM de FVIIa durante 30 minutos a 37 °C. O complexo TF:VIIa foi dividido em aliquotas e armazenado a -70 °C até ser necessário. Os factores humanos VII, Vila, e FX purificados foram obtidos de Enzyme Research Laboratories, Inc. Foi 38 utilizado o seguinte tampão para todos os ensaios FXa e FVIIa: 25 mM de Hepes-NaOH, 5 mM de CaCl2, 150 mM de NaCl, 0,1% BSA, pH 7,5.

Os Mab foram rastreados quanto à sua capacidade para bloquear a activação de FX mediada por TFrVIIa em FXa. A activação de FX foi determinada em dois passos descontínuos. No primeiro passo (activação de FX) , a conversão de FX em FXa foi ensaiada na presença de Ca+2. No segundo passo (ensaio de actividade de FXa) , a activação de FX foi interrompida por EDTA e a formação de FXa foi determinada utilizando um substrato cromogénico específico para FXa (S-2222). Os cromogénios S-2222 e S-2288 (ver a seguir) foram obtidos de Chromogenix (distribuído por Pharmacia Hepar Inc.). A activação de FX foi conduzida em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL por incubação da reacção com 0,08 nM de TF:VIIa, pré-incubada com um anticorpo anti-rhTF ou um tampão de controlo. A reacção foi subsequentemente incubada durante 30 minutos a 37 °C, depois, foi adicionado 30 nM de FX seguindo-se uma incubação adicional durante 10 minutos a 37 °C. A actividade de FXa foi determinada em placas de titulação de 96 poços. Foram drenados vinte microlitros de amostra do passo um e misturados com um igual volume de EDTA (500 mM) em cada poço, seguindo-se a adição de 0,144 mL de tampão e 0,016 mL de 5 mM de substrato S-2222. A reacção foi deixada a incubar por mais 15-30 minutos a 37 °C. as reacções foram depois interrompidas com 0,05 mL de ácido acético a 50%, após o qual foi registada a absorvência a 405 nm para cada reacção. A inibição da actividade de TF:VIIa foi calculada a partir dos valores de DO405 nm nas amostras experimentais (com anticorpo) e de controlo (sem anticorpo) . Em algumas experiências, um anticorpo anti-hTF, TF/VIIa e FX foram cada um 39 adicionados simultaneamente para detectar competição de ligação. A Fig. 3 mostra que o MAb H36.D2 (a negrito) inibiu a actividade TF:/VIIa contra FX numa extensão significativamente maior (95%) do que outros Mab anti-rHTF testados. EXEMPLO 4 - Ensaio de Substrato Específico para FVIIa

Os Mab foram depois rastreados através de um ensaio específico para FVIIa. Neste ensaio, 5 nM de rhTF lipidado foi primeiro incubado com tampão (controlo) ou 50 nM de anticorpo (experimental) numa placa de titulação de 96 poços durante 30 minutos a 37 °C, depois misturados com 5 nM de FVIIa humano purificado (VT= 0,192 mL), seguindo-se 30 minutos de incubação a 37 °C. Oito microlitros de uma solução stock a 20 mM de substrato específico para FVIIa S-2288 foram, depois, adicionados a cada poço (concentração final, 0,8 mM) . Subsequentemente, a reacção foi incubada durante uma hora a 37 °C. A absorvência a 405 nm foi depois medida após interrupção com 0,06 mL de ácido acético a 50%. A percentagem de inibição da actividade de TF/VIIa foi calculada a partir de valores de D04o5 nm das amostras experimentais e de controlo. A Fig. 4 mostra o anticorpo H36 não bloqueou significativamente a actividade de TF/VIIa contra o substrato S-2288 quando o anticorpo foi pré-incubado com TF (antes da adição de Vila) ou adicionado a TF pré-incubado com Vila (antes da adição do anticorpo). Isto indica que H36 não interfere com a interacção (ligação) entre TF e FVIIa, e que H36 também não inibe a actividade de TF:VIIa contra um substrato peptídico. 40 EXEMPLO 5 - Ensaio de Tempo de Protrombina (PT) 0 plasma de sangue calcificado irá coagular em alguns segundos após adição de tromplastina (TF); um fenómeno denominado o "tempo de protrombina" (PT) . Um PT prolongado é tipicamente um indicador útil de actividade de anti-coagulação (ver e. g., Gilman et al. supra). 0 anticorpo H36.D2 foi investigado quanto à capacidade de afectar o PT de acordo com métodos convencionais utilizando plasma humano disponível comercialmente (Ci-Trol Control,

Levei I obtido de Baxter Diagnostics Inc.). As reacções de coagulação foram iniciados por adição de rhTF lipidado na presença de Ca++. 0 tempo de coagulação foi monitorizado por um cronómetro de coagulação automático (MLA Electra 800). Os ensaios PT foram iniciados por injecção de 0,2 mL de rhTF lipidado (num tampão de 50 mM de Tris-HCl, pH 7,5, contendo 0,1% de BSA, 14,6 mM de CaCl2, 0,07 mg/mL de f osf atidilcolina e 0,03 mg/mL de fosfatidilserina) nas cuvetes de plástico de dois poços. As cuvetes continham cada 0,1 mL de plasma pré-incubado com 0,01 mL de tampão (amostra de controlo) ou anticorpo (experimental amostra) durante 1-2 minutos. A inibição da coagulação mediada por TF pelo anticorpo H36.D2 foi calculada utilizando uma curva padrão de TF em que o log[TF] foi apresentado em função do log do tempo de coagulação. A Fig. 5 mostra que o anticorpo H36.D2 inibe substancialmente a coagulação iniciada por TF no plasma humano. O anticorpo H36.D2 aumentou os tempos de PT significativamente, 41 mostrando que o anticorpo é um inibidor eficaz da coagulação iniciada por TF (até aproximadamente 99% de inibição). EXEMPLO 6 - FX e o Anticorpo H36.D2 Compete Pela Ligaçao ao Complexo TF:VIIa

As experiências de competição foram conduzidas entre TF/VIIa, FX e o anticorpo H36.D2. A Fig. 6A ilustra o resultado de uma experiência em que um complexo TF/VIIa pré-formado (0,08 nM) foi pré-incubado a 37 °C durante 30 minutos em tampão incluindo 0,02 nM, 0,04 nM, 0,08 nM e 0,16 nM do anticorpo monoclonal H36.D2, respectivamente. FX (30 nM) foi depois adicionado à mistura de TF/VIIa e anticorpo H36.D2 e a mistura foi deixada a incubar durante mais 10 minutos a 37 °C. A activação de FX foi interrompida com EDTA como descrito previamente. 0 FXa produzido foi deste modo determinado pelo ensaio especifico para FXa descrito no Exemplo 3, acima. A Fig. 6B mostra o resultado de uma experiência conduzida nas linhas acima descritas, excepto que o anticorpo H36.D2, TFrVIIA pré-formado e FX foram adicionados simultaneamente para iniciar o ensaio de activação de FX.

Os dados apresentados nas Figs. 6A e 6B mostram que o anticorpo H36.D2 e FX competem pela ligação ao complexo TF/VIIa pré-formado. 42 EXEMPLO 7 - Inibição da Actividade de TF na Cultura Celular J-82 é uma linha de células de carcinoma da bexiga humano (disponível na ATCC) que expressa abundantemente TF humano nativo como uma proteína da superfície celular. Para ver se o anticorpo H36.D2 pode evitar a ligação de FX ao TF nativo exposto na superfície celular, um ensaio de activação de FX em J-82 foi conduzido em placas de microtitulação na presença de FVII (ver D.S. Fair et al., J. Biol. Chem. , 262:11692 (1987)). A cada poço, foram adicionadas 2 x 105 células e incubadas com 50 ng de FVII, tampão (amostra de controlo) ou com o anticorpo anti-TF (amostra experimental) durante 2 horas a 37 °C. Depois, cada poço foi suavemente lavado com tampão e foram adicionados 0,3 mL de FX (0,05 mg/mL) a cada poço durante 30 minutos à temperatura ambiente. Em alguns casos, o anticorpo foi adicionado ao mesmo tempo que FX para detectar a competição da ligação para o TF nativo. A seguir, foram removidas aliquotas de 0,05 mL e adicionadas a novos poços numa placa de titulação de 96 poços contendo 0, 025 mL de 100 mM de EDTA. A actividade de FXa foi determinada pelo ensaio específico para FXa como descrito no Exemplo 3, acima. A inibição da actividade de TF à superfície das células J-82 foi calculada a partir da DO405 nm na ausência (amostra de controlo) e presença de anticorpo (experimental amostra). A Fig. 7 mostra que o anticorpo H36.D2 se ligava a TF nativo expresso em membranas de células em J-82 e inibia a activação de FX mediada por TF. Estes resultados indicam que o anticorpo compete com FX para a ligação a TF nativo exposto na superfície celular. Tendo em conta os dados do Exemplo 8, a seguir, os 43 resultados também mostram que o anticorpo H36.D2 se pode ligar a um epitopo conformacional no TF nativo numa membrana celular. EXEMPLO 8 - Ligação Especifica do Anticorpo H36.D2 ao rhTF Nativo A avaliação da ligação de H36.D2 ao rhTF nativo e não nativo foi realizada através de um ensaio simplificado de transferência de mancha. Especificamente, o rhTF foi diluído para 30 pg/mL em cada um dos seguintes três tampões: 10 mM de Tris-HCl, pH 8,0; 10 mM de Tris-HCl, pH 8,0 e 8 M ureia; e 10 mM de Tris-HCl, pH 8,0, 8 M ureia e 5 mM de ditiotreitol. A incubação no tampão Tris mantém rhTF na forma nativa, enquanto o tratamento com 8 M de ureia e 5 nM de ditiotreitol produz rhTF não nativa (desnaturada). Cada amostra foi incubada durante 24 horas à temperatura ambiente. Após a incubação, uma membrana Millipore Immobilon (secção 7x7cm) foi pré-embebida com metanol, seguido por 25 mM de Tris, pH 10,4, incluindo 20% de metanol. Depois, as membranas foram secas ao ar, aproximadamente 0,5 pL, 1 pL e 2 pL de cada amostra (30 pg/mL) foram aplicados à membrana e seca ao ar. Após bloquear a membrana com PBS contendo 5% (p/v) de leite magro e 5% (v/v) de NP-40, a membrana foi sondada com o anticorpo H36.D2, seguido por incubação com um conjugado de anti-IgG de murganho de cabra com peroxidase (obtido de Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.). Após incubação com os reagentes de ECL Western Blotting de acordo com as instruções do fabricante (Amersham), a membrana foi envolvida com película aderente (Saran Wrap) e exposta a um filme de raios X por várias vezes. 44 A Fig. 8A mostra que o Mab H36.D2 se liga a um epitopo conformacional no TF nativo na presença de tampão Tris ou tampão Tris com 8 M de ureia (pistas 1 e 2) . 0 autorradiograma foi exposto durante 40 segundos. No entanto, quando o TF nativo foi desnaturado com 8 M de ureia e 5 mM de DTT, a ligação de H36.D2 foi significativamente reduzida ou eliminada (pista 3). A Fig. 8B mostra um autorradiograma sobre-exposto que apresenta uma ligação residual do anticorpo H36.D2 ao rhTF não nativo (i. e., desnaturada). A sobre-exposição foi de aproximadamente 120 segundos. O tratamento com somente 8 M de ureia resultou provavelmente em apenas uma desnaturação parcial do rhTF nativo uma vez que as duas ligações persulfureto em TF não são reduzidas. É também possível que o TF parcialmente desnaturado possa reorganizar-se de novo na conformação nativa mais tarde durante o processo de transferência quando a ureia é removida. Estes resultados também distinguem claramente os anticorpos da invenção preferidos que não se ligam a TF desnaturado dos anticorpos previamente reportados que não se ligam selectivamente a um epitopo conformacional e ligam-se a um TF desnaturado (ver Patente U.S. 5437864 em que na Figura 18 a análise de Transferência de Western mostra ligação a TF desnaturado por SDS).

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

(1) INFORMAÇÃO GERAL (i) REQUERENTE: Wong, Hing C. Jiao, Jin-an Esperanza, Nieves 45

Lawrence, Luepschen

(ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: ANTICORPOS PARA INIBIR A COAGULAÇAO SANGUÍNEA e MÉTODOS PARA A SUA UTILIZAÇÃO (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 26 (iv) ENDEREÇO DE CORRESPONDÊNCIA:

(A) DESTINATÁRIO: Dike, Bronstein, Roberts & Cushman, LLP (B) RUA: 130 Water Street (C) CIDADE: Boston

(D) ESTADO: MA

(E) PAÍS: EUA (F) ZIP: 02109 (v) FORMA DE LEITURA EM COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: Disquete (B) COMPUTADOR: IBM Compatível

(C) SISTEMA OPERATIVO: DOS (D) PROGRAMA DE COMPUTADOR: FastSEQ Version 1.5 (vi) DADOS DO PRESENTE PEDIDO: (A) NÚMERO DO PEDIDO: (B) DATA DO PEDIDO: (C) CLASSIFICAÇÃO: (vii) DADOS DO PEDIDO ANTERIOR: (A) NÚMERO DO PEDIDO: (B) DATA DO PEDIDO: 46 (viii) INFORMAÇÃO DO ADVOGADO/AGENTE:

(A) NOME: Corless, Peter F (B) NÚMERO DE REGISTO: 33,860

(C) NÚMERO DE REFERÊNCIA/ARQUIVO: 46943-PCT (ix) INFORMAÇÃO DE TELECOMUNICAÇÕES: (A) TELEFONE: 617-523-3400 (B) TELEFAX: 617-523-6440 (C) TELEX: (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 321 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) ANTISENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) FONTE ORIGINAL: 47 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 1: 60 120 180 240 300 321

GACATTCAGA TGACCCAGTC TCCTGCCTCC CAGTCTGCAT CTCTGGGAGA AAGTGTCACC ATCACATGCC TGGCAAGTCA GACCATTGAT ACATGGTTAG CATGGTATCA GCAGAAACCA GGGAAATCTC CTCAGCTCCT GATTTATGCT GCCACCAACT TGGCAGATGG GGTCCCATCA AGGTTCAGTG GCAGTGGATC TGGCACAAAA TTTTCTTTCA AGATCAGCAG CCTACAGGCT GAAGATTTTG TAAATTATTA CTGTCAACAA GTTTACAGTT CTCCATTCAC GTTCGGTGCT GGGACCAAGC TGGAGCTGAA A (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 107 aminoácidos (B) TIPO: aminoácidos (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPOTÉTICO: NAO

(iv) ANTISENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal (vi) FONTE ORIGINAL: 48 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUENCIA: SEQ ID N°: 2:

Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ala Ser Gin Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Ser Vai Thr Ile Thr Cys Leu Ala Ser Gin Thr Ile Asp Thr Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gin Leu Leu ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Lys Phe Ser Phe Lys Ile Ser Ser Leu Gin Ala 65 70 75 80 Glu Asp Phe Vai Asn Tyr Tyr Cys Gin Gin Vai Tyr Ser Ser Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 351 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) ANTISENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) FONTE ORIGINAL: 49 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUENCIA: SEQ ID N°:3: 60 120 180 240 300 351

GAGATCCAGC TGCAGCAGTC TCCTGCAAGA CTTCTGGTTA CATGGAAAGA GCCTTGAGTG GACCAGAACT TCAAGGGCAA ATGCATCTCA ACAGCCTGAC ACTACGGCCC TTGACTTCTG

TGGACCTGAG CTGGTGAAGC CTCATTCACT GACTACAACG GATTGGATAT ATTGATCCTT GGCCACATTG ACTGTTGACA ATCTGACGAC TCTGCAGTTT GGGCCAAGGC ACCACTCTCA

CTGGGGCTTC AGTGCAGGTA TGTACTGGGT GAGGCAGAGC ACAATGGTAT TACTATCTAC AGTCTTCCAC CACAGCCTTC ATTTCTGTGC AAGAGATGTG CAGTCTCCTC A (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 117 aminoácidos (B) TIPO: aminoácidos (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) ANTISENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal (vi) FONTE ORIGINAL: 50 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 4:

Glu Ile Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 Ser Vai Gin Vai 5 Ser Cys Lys Thr Xaa 10 Gly Tyr Ser Phe Thr 15 Asp Tyr Asn Vai Tyr 20 Trp Vai Arg Gin 25 Ser Hls Gly Lys Ser Leu 30 Glu Trp Ile Gly Tyr 35 Ile Asp Pro Tyr Asn 40 Gly Ile Thr Ile 45 Tyr Asp Gin Asn Phe 50 Lvs Gly Lys Ala Thr Leu 55 Thr Vai Asp Lys Ser 60 Ser Thr Thr Ala Phe 65 Met His Leu Asn Ser 70 Leu Thr Ser Asp Asp 75 Ser Ala Val Tyr Phe 80 Cys Ala Arg Asp Vai 85 Thr Thr Ala Leu Asp 90 Phe Trp Gly Gin Gly 95 Thr Thr Leu Thr Vai 115 100 Ser Ser 105 110 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 7 aminoácidos (B) TIPO: aminoácidos (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) ANTISENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal (vi) FONTE ORIGINAL: 51 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 5

Leu Ala Ser Gin Thr Ile Aap 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 6: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 7 aminoácidos (B) TIPO: aminoácidos (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) ANTISENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal (vi) FONTE ORIGINAL: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 6

Ala Ala Thr Asn Leu Ala Asp 1 5 52 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N° : 7: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 9 aminoácidos (B) TIPO: aminoácidos (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) ANTISENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal (vi) FONTE ORIGINAL: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°

Gin Gin Vai Tyr Ser Ser Pro Phe Thr 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 8: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 6 aminoácidos (B) TIPO: aminoácidos (C) TIPO DE CADEIA: simples 53 (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) ANTISENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal (vi) FONTE ORIGINAL: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 8

Thr Asp Tyr Asn Vai Tyr 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 9: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 aminoácidos (B) TIPO: aminoácidos (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) ANTISENTIDO: NÃO 54 (v) TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal (vi) FONTE ORIGINAL: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 9:

Tyr Ile Asp Pro Tyr Asn Gly Ile Thr Ile Tyr Asp Gin Asn Phe Lys 15 10 15

Gly (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 10: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 8 aminoácidos (B) TIPO: aminoácidos (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) ANTISENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal (vi) FONTE ORIGINAL: 55 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUENCIA: SEQ ID N°: 10:

Asp Vai Thr Thr Ala Leu Asp Phe 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 11: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) ANTISENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) FONTE ORIGINAL: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 11: CTGGCAAGTC AGACCATTGA T 21 56 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 12: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) ANTISENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) FONTE ORIGINAL: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 12: GCTGCCACCA ACTTGGCAGA T 21 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 13: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 28 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples 57 (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) ANTISENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) FONTE ORIGINAL: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 13: CAACAAGTTT ACAGTTCTCC ATTCACGT 28 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 14: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) ANTISENTIDO: NÃO 58 (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) FONTE ORIGINAL: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 14: ACTGACTACA ACGTGTAC 18 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 15: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 51 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) ANTISENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) FONTE ORIGINAL: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 15: TATATTGATC CTTACAATGG TATTACTATC TACGACCAGA ACTTCAAGGG C 51 59 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 16: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) ANTISENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) FONTE ORIGINAL: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 16: GATGTGACTA CGGCCCTTGA CTTC 24 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 17: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 23 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico 60 (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) ANTISENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) FONTE ORIGINAL: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 17: GCACCTCCAG ATGTTAACTG CTC 23 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 18: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO 61

(iv) ANTISENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) FONTE ORIGINAL: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 18: GAARTAVCCC TTGACCAGGC 20 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 19: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 35 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) ANTISENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) FONTE ORIGINAL: 62 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUENCIA: SEQ ID N°: 19: GGAGGCGGCG GTTCTGACAT TGTGMTGWCM CARTC 35 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 20: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 45 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) ANTISENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) FONTE ORIGINAL: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 20: ATTTCAGGCC CAGCCGGCCA TGGCCGARGT YCARCTKCAR CARYC 45 63 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 21: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 33 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) ANTISENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) FONTE ORIGINAL: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 21: CCCGGGCCAC CATGKCCCCW RCTCAGYTYC TKG 33 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 22: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 35 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples 64 (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) ANTISENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) FONTE ORIGINAL: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 22: CCCGGGCCAC CATGGRATGS AGCTGKGTMA TSCTC 35 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 23: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 52 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) ANTISENTIDO: NÃO 65 (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) FONTE ORIGINAL: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 23: ATATACTCGC GACAGCTACA GGTGTCCACT CCGAGATCCA GCTGCAGCAG TC 52 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 24: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 31 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) ANTISENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) FONTE ORIGINAL: 66 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 24: GACCTGAATT CTAAGGAGAC TGTGAGAGTG G 31 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 25: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 29 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) ANTISENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) FONTE ORIGINAL: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 25: TTAATTGATA TCCAGATGAC CCAGTCTCC 29 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 26: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: 67 (A) COMPRIMENTO: 45 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) ANTISENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) FONTE ORIGINAL: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 26: TAATCGTTCG AAAAGTGTAC TTACGTTTCA GCTCCAGCTT GGTCC 45

Lisboa, 7 de Fevereiro de 2012 68

Claims (21)

1. REIVINDICAÇÕES Anticorpo ou um seu fragmento que se liga ao factor tecidular humano ("TF"), em que o anticorpo ou fragmento compreende: (i) regiões hipervariáveis de cadeia leve CDR1, CDR2, e CDR3, em que: CDR1 compreende a sequência de SEQ ID N° : 5; CDR2 compreende a sequência de SEQ ID N° : 6; e CDR3 compreende a sequência de SEQ ID N° : 7; e (ii) regiões hipervariáveis de cadeia pesada CDR1, e CDR3, em que: CDR1 compreende a sequência de SEQ ID N° : 8; CDR2 compreende a sequência de SEQ ID N° : 9; e CDR3 compreende a sequência de SEQ ID N° : 10. Anticorpo ou fragmento da Reivindicação 1, em que o anticorpo ou fragmento é um anticorpo monoclonal. Anticorpo ou fragmento da Reivindicação 1 ou Reivindicação 2, em que o anticorpo ou fragmento é um anticorpo quimérico. Anticorpo ou fragmento da Reivindicação 1 ou Reivindicação 2, em que o anticorpo ou fragmento é um anticorpo humanizado. 1 5. Anticorpo ou fragmento de qualquer reivindicação anterior, em que o anticorpo ou fragmento compreende uma região variável da cadeia leve possuindo, pelo menos, 95% de identidade de sequência coma sequência de aminoácidos de SEQ ID N°: 2 e/ou uma região variável da cadeia pesada possuindo, pelo menos, 95 % de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID N°: 4.
2. 6. Anticorpo ou fragmento da Reivindicação 5, em que o anticorpo ou fragmento compreende uma região variável da cadeia leve possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID N°: 2 e/ou uma região variável da cadeia pesada possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID N°: 4.
3. 7. Anticorpo ou fragmento de qualquer reivindicação anterior, em que o anticorpo ou fragmento compreende uma região constante humana.
4. 8. Anticorpo ou fragmento de qualquer reivindicação anterior, em que o anticorpo ou fragmento é um anticorpo de cadeia simples.
5. 9. Anticorpo ou fragmento de qualquer reivindicação anterior, em que a afinidade de ligação do anticorpo ou fragmento para o TF humano é igual ou superior ao do anticorpo monoclonal H36.D2.B7 que é produzido pelo hibridoma que está depositado na ATCC sob o número de acesso HB-12255.
6. 10. Anticorpo ou fragmento de qualquer reivindicação anterior, em que o anticorpo ou fragmento possui uma constante de 2 associaçao para o TF humano de, pelo menos, cerca de 1 x ΙΟ10 ΝΓ1.
7. 11. Anticorpo ou fragmento de qualquer reivindicação anterior, em que a especificidade de ligação do anticorpo ou fragmento para o TF humano sobre o TF humano desnaturado é igual ou superior ao do anticorpo monoclonal H36.D2.B7 que é produzido pelo hibridoma que é depositado na ATCC sob o número de acesso HB-12255.
8. 12. Anticorpo que se liga ao factor tecidular humano ("TF"), em que o anticorpo é o anticorpo monoclonal H36.D2.B7 que é produzido pelo hibridoma que está depositado na ATCC sob o número de acesso HB-12255.
9. 13. Anticorpo humanizado que se liga ao factor tecidular humano (/Jr£F") , em que o anticorpo é um derivado humanizado d o anticorpo da Reivindicação 12.
10. 14. Método de purificação do factor tecidular humano ("TF") a partir de uma amostra biológica, compreendendo o método o contacto da amostra biológica com um anticorpo ou fragmento de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1 a 13.
11. 15. Método de detecção do factor tecidular humano ("TF") numa amostra biológica, compreendendo o método o contacto da amostra biológica com um anticorpo ou fragmento de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1 a 13. 3
12. 16. Anticorpo ou fragmento de qualquer uma das Reivindicações 1 a 13, para utilização na inibição da coagulação sanguínea num mamífero.
13. 17. Utilização de um anticorpo ou fragmento de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1 a 13 para a preparação de um medicamento para inibir a coagulação sanguínea num mamífero.
14. 18. Anticorpo ou fragmento da Reivindicação 16 ou utilização da Reivindicação 17, em que o mamífero sofre ou é suspeito de ter uma trombose, ou o mamífero sofre ou é susceptível a restenose associada com um procedimento médico invasivo ou o mamífero sofre de um estado tromboembólico associado com doença cardiovascular, uma doença infecciosa, uma doença neoplásica ou utilização de um agente trombolítico.
15. 19. Anticorpo ou fragmento da Reivindicação 16 ou utilização da Reivindicação 17, em que o mamífero é um humano.
16. 20. Anticorpo ou fragmento da Reivindicação 16 ou utilização da Reivindicação 17, em que o anticorpo é para ser administrado em combinação com uma composição antplaquetárias, uma composição trombolítica ou uma composição anticoagulante.
17. 21. Anticorpo ou fragmento da Reivindicação 16 ou utilização de Reivindicação 17, em que o anticorpo é para ser administrado em combinação com heparina, hirudina, Bivalirudina, Abciximab, activador de plasminogénio tecidular, estreptocinase ou urocinase. 4
18. 22. Anticorpo ou fragmento de qualquer uma das Reivindicações 1 a 13, para utilização como um medicamento. 23. Ácido nucleico isolado que codifica um anticorpo ou um seu fragmento que se liga ao factor tecidular humano ("TF"), em que: (a) o ácido nucleico codifica uma região variável da cadeia leve e compreende as sequências de polinucleótidos das SEQ ID N°: 11, 12, e 13; e (b) o ácido nucleico codifica uma região variável da cadeia pesada e compreende as sequências de polinucleótidos das SEQ ID N°: 14, 15, e 16. 24. Ácido nucleico isolado da reivindicação 23 compreendendo a sequência de polinucleótidos de SEQ ID N°: 1 e a sequência de polinucleótidos de SEQ ID N°: 3. 25. Ácido nucleico que codifica um anticorpo ou um seu fragmento de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1 a 11.
19. 26. Vector compreendendo o ácido nucleico de qualquer uma das Reivindicações 23 a 25.
20. 27. Célula hospedeira compreendendo o vector da Reivindicação 26.
21. 28. Célula hospedeira compreendendo (a) um primeiro vector compreendendo um ácido nucleico, em que o ácido nucleico codifica uma região variável da cadeia leve de um anticorpo ou um seu fragmento que se liga ao factor tecidular humano ("TF") e compreende as sequências de polinucleótidos das SEQ ID N° : 11, 12, e 13; e (b) um segundo vector compreendendo um ácido nucleico, em que o ácido nucleico 5 codifica uma região variável da cadeia anticorpo ou um seu fragmento que se tecidular humano (TF) e compreende as polinucleótidos das SEQ ID N°: 14, 15, e 16. Lisboa, 7 de Fevereiro de 2012 pesada de um liga ao factor sequências de 6