PT97876B - Processo para a producao de uma nova proteina - Google Patents

Description

Verificou-se que mamíferos, incluindo o ser humano foram protegidos contra o desafio do Plasaodium quando vacinados com esporosoitos (Clyde et al. , Am. 1. ,Trp.pJfed.JBy.g-, 24; 397 (1975),

Hussensweig et al. , Phll Tran B Soe_LontiLB, .117.:117-28 (1984).

Este método, embora efieas, é limitado devido à dificuladade em se cultivar esporosoitos.

Os esporosoitos expressam uma proteína superficial especifica da espéeia, a proteína do circumsporosoito (CS), a qual foi identificada pela primeira ves em F. bershei, um parasita dos roedores. Os anticorpos monoclonais desta proteína protegeram completamente ratinhos do desafio com mosquitos infectados (Ftocndak et al. , J Exp Me.d. 151; 1504-13 (1980)). A pesquisa baseada na proteína CS foi amplamente referida (ver, por exemplo, Science. 225:593-9 e 628-9 (1984),

Patente dos E.U.A. No. 4.707.357, Science. 211.:815-18 (1985),

Science. 221:958-62 (1985), PCT/W086/01721 and Lancet·. 1:1277-81 (1987)). Contudo, uma vacina tendo como base a proteína CS ou uma sua subunidade nunca foi comercializada, e os ensaios clínicos foram decepeionantes ("Malaria vaccines; The Failed Fromise", Science, 211= 402-3 (1990)).

Dados recentes lançaram algumas dúvidas acerca da utilidade da proteína CS como um potencial candidato a vacina; fraca Imunogenicidade no ser humano, forte restriccão genética (tal como foi indicado nos ratinhos) da resposta imunitária ao antigénio e polimorfismo de sequências imunologicamente relevantes sugerem que esta proteína, sem modificação alternativa, não pode evoluir para um anti-esporosoito e/ou vacina do estádio identificação de novos usir imunidade protecto-estadio hepático é hoje antí-fígado eficazes. Deste modo, a antigénios exoeritrocíticos que podem ind ra contra o esporosoito e/ou parasita do 4 -

reconhecida como constituindo uma importante- prioridade no campo do desenvolvimento da vacina da malária (Parasitology Today, &.'· 3, 64-65 (1990) e Immunology Today, 0.:351-355 (1988)).

Dm estratagema alternativo, ou adicional, seria o de produzir vacinas do estádio sexual que induzissem anticorpos, os quais, quando inferidos numa refeição de sangue contendo parasitas sexuais, iriam evitar a infeoçao dos mosquito e desse modo a transmissão. Embora uma tal vacina de bloqueio da transmissão não fosse proteger o indivíduo vacinado da infecção, ela iria reduzir quando combinada com um esporosoito e/ou vacina do estádio eritrocitico assexual a hipótese de transmissão de mutantes induzidos pela vacina resistentes a qualquer uma destas vacinas.

Foi sugerido que o polimorfismo.pode ser menos provável nas proteínas do estádio sexual visto estas serem expressas apenas quando o parasita entra no mosquito não sendo confrontadas com o sistema imunitário humano que constitui talvez a pressão principal em relação à alteração evolutiva nos esporozoitos. A transmissão de imunidade por bloqueio foi induzida cora êxito por imunização com game-tas extraeelulares em várias espécies, Ho Flasmodium faloinarum. foram identificados três antigénios específicos em relação aos estádios (25, 45/48 e 230 kDa) contra os quais os anticorpos monoclonais bloqueiam a transmissão. Estes antigénios representam proteínas superficiais que são expressas durante diferentes fases do estádio sexual do Parasita. Laslor e.t, &X (Nsture, 3ód. 74-78 (1988)) clonararii recentemente o gene codificando a proteína 25 £Da. Esta última proteína representa uma proteína superficial nos sigotos e oocinetos de F. falcípsrum. A clonagem de outros genes do P. faleirarum envolvidos na indução da imunidade por bloqueio da transmissão não tem sido até agora realizada, principalmente devido a problemas na obtenção de quantidades suficientes de parasitas e de proteína purificada necessária para a formação de sequência de proteínas.

Adoptamos uma nova estratégia de clonagem que não se peptídeos para a eons-verdade, foi usada uma como base a observação apoia na disponibilidade da sequência de trução de processos de hibridização. Na técnica de hibridisação subtraetiva tendo de que os antigénios de superfície do estádio sexual não são provavelmente não expressos nos estádios sanguíneos assexuados.

Foi construída uma colecção de cADN a partir do gameto-cito total ARN obtido a partir de P. falciparum NF54 e avaliada quanto à presença de sequências de codificação específicas em relação ao estádio sexual por hibridisação com cADN de cadeia única radiomarcada construído a partir da ARN isolado a partir de estádios sanguíneos sexuado e assexuado do parasita. Os clones que hibridizaram com os processos de cADN assexuado foram eliminados .

Consequentemente, identificamos um novo gene que é expresso nos estádios sexuais do parasita. A análise da estrutura primária deduzida revela que o gene codifica para uma proteína de 16 kDa que apresenta todas as características de uma proteína superficial. Estudos de microscopia imuno-eiectrõnica demonstrara® claramente a presença da proteína de 16 kDa na membrana de game-tocitos e game-tas, Tendo em consideração estes aspectos esta carac ter is t. ica torna-a um componente potencial de uma vacina contra a malária por bloqueio de transmissão,

Surpreendentemente, o produto do gene Pfsl6 foi também identificado sobre a superfície dos esporosoitos do P. falciparum. Os anticorpos preparados contra um peptídeo sintético de Pfsl6 assim como anticorpos preparados contra proteínas de fusão recombinante de Pfsl6 não apenas reconhecem a proteína de 16 kDa nos extraetos de proteína do esporosoito por registo Western como também estudos microscópicos imuno-eleotrônicos demonstraram a sua presença sobre a superfície de esporosoitos. 0 antigénio de 16 kDa do F. faleinarum (ou suas contru-çõss de ADN recombinante) tem assim o potencial para desencadear uma dupla resposta imunitária protectora contra os estádios esporosoito e exoeritrocito do parasita assim como contra as sua formas sexuadas.

Consequentemente, o presente invento proporciona a proteína de 16 kDa tendo a sequência indicada mais abaixo, e seus derivados imunogénicos (incluindo mutantes). A expressão "derivado imunogénico” abrange qualquer molécula tal como uma truncada ou outro derivado da proteína que retenha a capacidade de indusir uma resposta imunitária em relação à proteína a seguir â administração interna a um ser humano. Isses outros derivados podem ser preparados pela adição, delecção, substituição, ou rearranJo de amino ácidos ou por suas modlfícações químicas.

Os fragmentos úteis na preparação de i munogénicos acinas subun por expressão dos peptídeos los fragmentos de gene; por exemplo usando a da proteína, que podem ser Ltãrias, podem ser preparados s apropriados ou por síntese síntese de Merrifield (The

Feptides, YoL

Aeademie Press, NY, page 3)

0 derivado imunogénico do invento pode ser um híbrido, isto é, um polipeptídeo de fusão contendo sequências adicionais que podem transportar um ou mais epítopos para outros imunogénios de Plasmodium. ou outros imunogénios ngfl-Plasmodium. Alternativa-mente, o derivado imunogénico do invento pode ser fundido com um veículo polipetídeo tal como antigénio de superfície ou de núcleo da Hepatite E ou com outro veículo que tenha propriedades imuno-estimuiadoras, tal como no caso de um adjuvante, ou que de qualquer outro modo favoreça a resposta imunitária à proteína de 16 kDa ou a um seu derivado, ou que seja útil na expressão, purificação ou formulação da proteína de 16 kDa ou de um seu. derivado. 0 invento também se estende à proteína de 16 kDa ou a um seu derivado imunogénico quando conjugada quimicamente com uma m&cromoléeula usando ura agente de ligação convencional tal como glutaraldeido (Geerlings et al, (1988) J, Immunol. Methods, 10.6. 239-244).

Um outro aspecto do invento proporciona um processo para a preparação da proteína de 16 kDa ou de um seu derivado imunogénico, processo esse que compreende a expressão de ADN por codificação da referida proteína ou de um seu derivado numa célula hospedeira recombinante e por recuperação do produto, e em seguida, preparação de um seu derivado»

__J5a C^Haí.X X

Uma molécula de ADN ação constitui um outro compreendendo essa sequência de aspecto do invento e pode ser sintetiaada por meio de técnicas padrão de síntese do ADN, tais como por ligação enaimática tal como é descrito por D.M. Eoberts fiL al. em Biochemistry 1985, 2A, por polímeriaação enaimática in. técnicas» 5080-5898, por síntese química, viim, ou por combinação destas 8 A polimerização enzimãtiea do ADN pode ser realizada la vltro usando uma polimerase do ADN tal como polimerase I do ADN (fragmento Klenow) num tampão apropriado contendo os trifosfatos de nucleosido dATP, dCTP, dGTP e dTTP tal como seja requerido a uma temperatura de 10°-37°C, geralmente num volume de 50μ1 ou inferior. A ligação enzirnática de fragmentos de ADN pode ser realizada usando uma ligase de ADN tal como ligase de ADN T4 num tampão apropriado, tal como Tris 0.05H CpH 7,4), MgCL-, 0,0111, ditiotreitol 0.01M, espermidina ImM, ATP lmM e albumina do soro bovino 0,1 mg/ml, a uma temperatura de 4°C à temperatura ambiente, geralmente num volume de 5Θ μ.1 ou inferior. A síntese química do polímero de ADN ou fragmentos pode ser realizada por técnica química convencional usando fosfotriéster, fosfito ou fosforami-dite, usando técnicas de fase sólida tais como as descritas em 'Chemical and Enzymatic Synthesis of Gene Fragmentes - A Labora-tory Manual' (ed. H. G. Gassen and A. Lang). Verlag Chernie, Weinheim (1982), ou noutras publicações científicas, por exemplo M.J. Gait, H.W. D. Mat-tlies, M. Singh, B.S. Sproat, and R. C. Titmas, Nucleic Acids Research, 1982, 10, 6243; B.S. Sproat and W. Bannwarth, Tetrahedron Letters, 1983, 24, 5771; M. D. Matteueei and M.H. Caruthers, Tetrahedron letters, 1980, 21, 719; M. D.

Katieucci and M.H. Caruthers, Journal of the American Society, 1981, 103, 3185; Chemical Society, McMannus. and H. e Η.H.D. Matthes

S.P. Adams 1983, 105, Koester, Nuel et- al. , EHBO et al., Journal of the American 661; N.D. Sinha, J. Biernat, J. eic Acids Research, 1984, 12, 4539; Journal, 1984, 3. 801.

Alternativamente, a sequência de codificação pode ser derivada de mARN de P._ falciparum. usando técnicas conhecidas Cpor exemplo transcrição reversa de mARN a fim de gerar uma cadeia de cADN complementar), e de estojos de cÂDN comercializados. 0 invento não se limita à sequência específicamente apresentada, rnas inclui todas as moléculas que codificam a proteína de 16 kDÃ ou um seu derivado imunogénioo, tal como foi descrito anteriormente,

Os polímeros de ADN que codificam mutantes da proteína de 16 kDa podem ser preparados por mutagenese de cADN dirigida ao sítio que codifica a proteína de 16 kDa por métodos convencionais tais como os descritos por G. Winter si al em Nature 1982, 299, 756-758 ou por Zoller and Srnith 1982; Nucl, Acids Kes,, 1£. 6487-6500, ou mutagenese por delecção tal como é descrito por Qhaft and Srnith em Nucl, Acids Ses, , 1984, 12., 2407-2419 ou por G, Wiater sl al em Biochem. Soc. Trans. , 1984, 12., 224-225, 0 processo do invento pode ser realizado por técnicas reeombinantes convencionais tais como as descritas em Maniatis si, âl. , Molecular Cloning - A Laboratory Manual; Gold Spring Harbor, 1982-1988,

Em particular, o processo pode compreender os passos de- í) preparar um vector de expressão replicável ou de integração capas, numa célula hospedeiro, de expressar um polímero de ADN compreendendo uma sequencia de nucleõtídos que codifica a referida proteína de 16 kDa ou um seu derivado imunogénico; ii) transformar uma célula hospedeiro com o referido vector -r íii) cultivar a referida célula hospedeiro transformada em condições que permitam a expressão do referido polímero de ADN para produzir a referida proteína; e 10 - iv) recuperar a referida proteína. Ã expressão 'transformar' é aqui usada para significar a introdução de ABN estranho numa célula hospedeiro por transformação, transfecção ou infecção com um plasmídio ou vector virai apropriado usando por exemplo técnicas convencionais tal como são descritas em Genetie Engineering; Eds. S.M. Kingsman and A.J. Kingsman·, Blackwell Scientific Puhlications; Oxford, England, 1988. A expressão 'transformado' ou 'transformante' será aqui a seguir aplicada à célula hospedeiro resultante contendo e expressando o gene estranho pretendido. 0 vector de expressão é novo e fas também parte do invento. O vector de expressão repiicável pode ser preparado de acordo com o invento, por clivagem de um vector compatível com a célula hospedeiro a fim de proporcionar um segmento de ABN linear tendo um replicon intacto, e combinando o referido segmento linear com uma ou mais moléculas de ABN, as quais, juntamente com o referido segmento linear codificam o produto desejado, tal como o polímero de ABN que codifica a proteína de 16 kBa, ou seus fragmentos, em condições de ligação.

Assim, formado durante o polímero de ABN a construção do vector, ode ser pré-formado como seja desejado. ou apropriados incluem plasmídios, reeombinantes- vector será det pode ser procarí A escolha do célula hospedeiro, que vectore e vírus erminada em parte pela onte ou euearionte. Os bacteriôfagos, cosmídios

A preparação de vector de expressão replicável pode ser realizada convencionalmente com enzimas apropriados para restric- ção; por polimerisação e ligação do ADN, por processos descritos xernplo, Maniatis ei ai citado anteríormente, em, A célula hospedeiro recombinante é preparada, de acordo com o invento, por transformação de uma célula hospedeiro com um vector de expressão replicável em condições de transformação. Condições de transformação apropriadas são convencionais e são descritas, por exemplo, por Maniatis ei ai citados anteríormente, ou "DM Cloning" 7ol. II, D. M. Glover ed. , IRL Press, Ltd. 1985, A escolha das condições de transformação é determinada pela célula hospedeiro. Assim, um hospedeiro bacteriano tal como 1. coli pode ser tratado com uma solução de CaCl0 (Cohen gi ai, iL>

Proc. Nat. Acad. Sei., 1973, (39, 2110) ou com uma solução compreendendo uma mistura de RbCl, MnCb-,, acetato de potássio e glice-rol, e em seguida com ácido 3-CN-mofolinol-propane-sulfónico, RbCl e glicerol. As células de mamífero em cultura podem ser transformadas por co-precipitação de cálcio do vector ADN nas células. 0 invento estende-se também a uma célula hospedeiro transformada com um vector de expressão replicável. A cultura da célula hospedeiro transformada em condições que permitem a expressão do polímero de ADN é realizada convencionalmente, tal corno é descrito era, por exemplo. Maniatis et al e "DM Cloning" citados anteríormente. Assim, de preferência a célula é fornecida com agente nutritivo e. cultivada a uma temperatura inferior a 45 °0. convencionais de célula hospedeiro submetida a lise 0 acordo com a ê feaoteriana produto é recuperado por métodos célula hospedeiro. Assim, quando a , tal como E. coli ela pode ser

fisicamente, quimicamente ou ensimãticamente e o produto proteico isolado a partir do produto da lise resultante. Quando a célula hospedeiro é de mamífero, o produto pode geralmente ser isolado a partir do meio nutritivo ou a partir de extractos sem células. As técnicas convencionais de isolamento da proteína incluem precipitação, absorção, cromatografia, e eromatografia de afinidade, selectivas incluindo uma coluna de afinidade em relação ao anticorpo monoelonal.

De preferência, a célula hospedeiro é. E. coli. Alterna-tivarãente, a expressão pode ser realizada em células de inseetos usando um vector apropriado tal como Baculovírus. Num aspecto particular deste invento, a proteína é expressa em células de Lepidoptera a fim de produzir polipeptídeos imunogénicos. Para a expressão da proteína das células de Lepidoptera, é preferida a utilização de um sistema de expressão com baculovírus. Nesse sistema, uma casse t-te de expressão compreendendo a sequência codificadora da proteína, ligada operativamente a um promotor baculovírus, é colocada tipicamente num vector de vai-vém. Esse vector contem uma quantidade suficiente de ADN bacteriano a fim de propagar o vector de vai-vém em E. coli ou em qualquer outro hospedeiro procarionte apropriado. Esse vector de vai-vém contém também uma quantidade suficiente de ADN de baculovírus flanqueando a desejada sequência de codificação da proteína de modo a permitir a reeombinação entre um baculovírus do tipo selvagem e o gene heterõlogo. 0 vector recombinante é então cotransfectado para. células de Lepidoptera cora ADN a partir de um baculovírus do tipo selvagem. Os baculovírus recombinantes que derivam da reeombinação homóloga são então seleccionados e purificados na placa por meio de ténicas padrão. Ver Summers et al. , TAES Buli (Texas Agrioultural Experimental Station Bulletin) NB 1555. May, 198?. 13

Um processo para a expressão da proteína CS em células de insecto é descrito detalhadamente em USSN 287.934 de Smith-Kline KIT (WO/US 89/05550). A produção em células de insecto pode também ser realizada por infeeçao das larvas dos insectos. Por exemplo, a proteína pode. ser produzida em lagartas de Heliothis .virescens. fornecendo o báculovírus recombinante do invento juntamente com vestígios de baculovirus do tipo selvagem e extraindo então a proteína da hemolinfa após cerca de dois dias. Ver, por exemplo, Mil ler st al. , PCT/WO88/02030. A nova proteína do invento pode também ser expressa em células de levedura tal como é descrito para a proteína CS em EP-á-0 278 941. A vacina do invento compreende uma quantidade imunopro-tectora da proteína de 16kAd ou de um seu derivado. A expressão ''imunoprotectora” refere-se à quantidade necessária para desencadear a resposta imunitária contra um subsequente desafio pelo P, faleinarum de modo a que se evite ou mitigue a doença, e/ou a que se bloqueie ou se atrase a doença. Na vacina do invento, pode ser utilizada directamente uma solução aquosa da proteína. Alternati-vamente, a proteína, com ou sem liofiliaação prévia, pode ser misturada ou absorvida com qualquer um dos vários adjuvantes conhecidos. Esses adjuvantes incluem, mas não se limitam a, hidróxido de alumínio, dipeptídeo muramilo e saponinas tais como Quil A, 3D-MFL (Lípide A monofosforílico desacilado em 3), ou TDM, Como ainda um exemplo alternativo, a proteína pode ser encapsulada no interior de microparticulas tais como liposomas. Ainda num outro exemplo alternativo, a proteína pode ser conjugada com uma macromolécula imunoestimuladora, tal como Bordet.eTIa morta ou um toxoide do tétano.

A preparação da vacina é geralmente descrita em New

Tren.fla-.and_Pe.velcipmaBtg_in_Sacaines. Voller si al. (eds.) t

University Park Press, Baltimore, Maryland, 1978, A encapsulação no interior de liposomas é descrita por Fullerton, Patente dos E.U.A. No. 4.235.877. A conjugação de proteínas com maeromolécu-las é apresentada, por exemplo, por Likhite, Patente dos E.U.A. No. 4.372.945 e Armor si. ai· , Patente dos E.U.A. No. 4.474.757. A utilisação de Quil A é apresentada por Dalsgaard si. ai, , Ac ta Vet Scand. 12.:349 (1977), A quantidade de proteína do presente invento presente em cada dose de vacina é seleccionada como uma quantidade que indus uma resposta imunoprotectora sem os efeitos secundários prejudiciais, significativos das vacinas habituais. Essa quantidade irá variar dependendo do imunogénio específico utiUsado e da vacina ser adjuvada. Geralmente, espera-se que a dose compreenda 1-1.000 ug de proteína, de preferência 1-200 ng. Uma quantidade. óptima para uma vacina particular pode ser verificada por estudos normalisados envolvendo a observação dos títulos de anticorpo e de outras respostas em indivíduos. A seguir a uma vacinação inicial, os indivíduos irão receber de preferência um reforço ao fim de cerca de 4 semanas, seguindo-se reforços repetidos de seis em seis meses enquanto existir um risco de ínfeccao, com o

Um outro aspecto do invento proporciona um método para evitar ou mitigar as infecções maiáricas no ser humano, e/ou para bloquear a transmissão do parasita da malária, método esse que compreende a administração a um indivíduo dela necessitado de uma quantidade imunogênicamente eficaa da proteína de 16 KDa ou de um seu derivado imunogénico, ou de uma vacina de acordo invento. 15

Os exemplos que se seguem são ilustrativos mas nao limitativos do invento. Os ensimas de restrioção e outros reagentes foram usados substancialrnente de acordo com as instruções do fornecedor. i 18

Igfllflroanj»......e-g.Ãgjflêns.ifl.cãQ.Jte.· nucleptidog _dp_.gsne.... Ffslg.

Gametoeitos de P. falciparum maduros (NF54) foram produzidos num sistema de cultura em suspensão semiautomática CFonnudurai ei. al- s 1983). Catorze dias após a cultura, eritroci-tos infectados foram recolhidos por centrifugação durante 5 minutos a 560 x g. A seguir à indução da gametogenese (Vermeulen et al., 1983) os macrogametas/sigotos e gametoeitos foram recuperados separadamente por centrifugação através de um gradiente de Nyoodenz descontínuo (Hyegaard, Oslo) tal como foi descrito por Vermeulen et. al. (1983). Apôs a lise destas células em 100 mM de NaCl, Tris-HOl 50 mM pH 7,2, SDTA 50 mM, 0,2¾ SDS e 2% de Tritori--X100, o AEN foi purificado por extracção oom fenol/clorofõrmio e centrifugação através de uma camada de CsCl 5,7 M em NaAc 30 mM, pH 6,8 e EDTA 50 mM tal como ê descrito por Maniatis et al. (1982).

Uma coleoção de cADN foi construida a partir do AEN total dos gametoeitos obtidos a partir de Plasroodium falciparum NF54, 0 cADN foi sintetizado por síntese de primeira cadeia por oligo ídT) primeração e síntese de segunda cadeia mediada por Enase H-ADN polimerase (Gubler and Hoffmann, 1983), A seguir à formação de tubos delgados de proteína do homopolímero com dGTF o cADN foi temperado dando origem ao plasmídio do sitio Sstl com tubos delgados de proteína de oligo(dC), pFLc24511. 0 vector pPLc24511 é um derivado do plasmídio pPLc245 CRemaut ei al., 1983) em que o fragmento de restrioção 221 bp Sall/Rsal foi substituído pelo fragmento Sall/Fvull do ADN MISmpll. Após transformação em E......co.ll MC 1061 (Casadaban and Cohen, 1980) foram obtidos cerca de 25.000 transformantes. A colecção de cADN assim η construída foi avaliada quanto à presença de sequências codificadoras de estádios específicos sexuais por hibridização in gitu. *3.0 cora cADN de cadeia única marcado com ^ώΡ, preparado por oligo ídT) primeração de ΔΕΝ isolado a partir de gametocitos/sigotos e estádios sanguíneos assexuados do parasita NF54. Foram identificados clones que só hibridizavam com macrogameta/sigoto e probes (substancias para informação genética) de dADN de gametoeito. Um dos clones - GB8 - continha parte da sequência indicada maís abaixo. 0 fragmento inserido foi isolado, marcado com toP sendo então utilizado para avaliar uma colecçao do ARN total de gameto-cito a partir de P. falcinarum NF54. A construção desta colecçao foi publicada (Wesseling si al* . 1989). Urn destes clones fágicos ÍGBSc) continha a sequência de ABN Pfsl6 indicada mais abaixo. A análise da hibridiaação Northern do ARN total a partir de estádios sanguíneos assexuados de P. falciparum. gametooitos e macrogametas/zigotos revelou que o clone GB8c continha um gene que é expresso como um única espécie tíjâRN de cerca de 1.400 bp em gametooitos e macrogametas/aigotos. A hibridiaação em ARN a partir de estádios sanguíneos assexuados esteve, virtualmente ausente ou foi apenas muito fraca.

Para a hibridiaação Northern, 3 μ.κ de ARN total (isolado a partir estádios sanguíneos assexuados, gametooitos ou g-ametas/3igotos) foram carregados num gel de 1¾ de agarose contendo 2,2 M de formaIdeido, 0 gel foi submetido a electrofore-se em tampão NaPO^ 25 roM (pH 7,0) e 0 ARN foi transferido para nitrocelulose (Schleicher and Bchuell) em 20 x S8FE. A hibridiaa-çSo das manchas foi realizada a 42°C durante 18 horas ern NaPO^ 50 raM CpH 8,5), NaCl 0,8 M, 50% de formarnida, EDTA 1 mM, 0,1% SDS, 2,5 x solução de Denhardt, 50 gg/ml de ADN de esperma de salmão desnaturado e 500 u.g/ml de ARN da levedura. As manchas foram lavadas com elevada adstringência (0,11 SDS, 65°C). - 18

Sondas com elevada radioactividade específica foram ^reparadas por transcrição ih vitro dos fragmentos de restricção •S-Propriados que tinham sido prêviamente ligados no agente, de po- liigaçao de asul pGEMb.

Para a análise da sequência de nucleótidos os fragmeri-iíos de ABN apropriados foram digeridos a partir dos plsmídios re-combinantes seleccionadose subclonados ero vectores M13mpl0/mpll H-?ene, 2â; 101-106 (19835 ). A sequência de nucleótidos foi estabelecida de acordo com a estratégia de sequência de dídesoxi tal co-iso foi desenvolvida originalmente por Sanger (Sanger ei ai. ,1977). A sequência de nucleótidos da região de codificação de Pis16 e de regiões flanqueadoras é indicada na figura 1 anexa. Os nucleótidos são numerados em relação ao A do codão de iniciação ATS. A sequência dedusida de arnino ácidos é indicada acima da sequência de nucleótidos e é numerada de acordo com o sistema de numeração proposto por Lu and Elainga (1977). A caixa sólida representa a sequência de arnino ácidos do peptídeo sintético do Exemplo 6. A sequência de arnino ácidos dedusida compreende uma sequência sinal no término N e uma sequência de fixação da membrana seguida Por uma sequência hidrofílica no término C. A sequência não tem os arnino ácidos Cis, Trp e Tir. Na sequência das proteínas não foram detectados sítios potenciais de glicosilação ero N (Asn-X-5er/Thr). Análise de pesquisa por computador ao nível do ADN (dados de base do nuoleõtido EMBL; libertação 12) assim como o nível de proteína (dados de base da proteína NBRF/PIH; libertação 12) indicou que o gene Pfs16 e a sua sequência proteica derivada não apresenta qualquer similaridade significativa com qualquer sequência de- ADN ou sequência de proteínas conhecida até 19

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Gene FfslB ero células CDS 0 gene Pfsl6 foi inserido irnediatamente a jusante do promotor CMV no vector plasrnidio CDM8. Depois da selecç-ão do plasmídio recombinante apropriado a produção transitória nas células COS (derivadas das células de rira de macaco) da proteína (Pfs 16kBa) que é codificada pelo gene das células Pfsl6 foi estudada coia um ensaio de fluorescência imunitário (IFA). A partir destes estudos pode-se concluir que após transfeeção sobre a superfície das células COS foi possível deteetar ura antigénio •que reagiu específicamente· com antisoro produsido contra proteína de 18 kDa (recombinante) ou de seus fragmentos. E1EMPL0 3

Insectos

Expressão de Gene Pfsl6 em Células de

Para expressar o gene Pfsl6 em células de cultura de tecido de células da lagarta dos cereais do outouno Spodoptera frugiperda (células Sf9) foi utilizado o sistema de expressão derivado do baculovirus AcMNPV. Como vector de transferência, foi utilizado o plasmídio pJYP10.Z.Pfsl6. Este plasmidio é um derivado da selecção positiva (B-galactosidadse) do vector pJVP10.Z e é construído por inserção de um fragmento PCR de extremidade embotada (Vialgrd et al 1990) que· abrange o gene PfslS completo mais as sequências flanqueadoras (isto é 4 nucleótidos na sua extremidade 5'e 3 nucleótidos na extremidade 3'), no seu único sítio Nhel com a sua extremidade tornada embotada com polimerase ADN T4. Este sítio encontra-se localizado imediatamente a jusante do promotor de polihedrina.

Após selecgão e clonagem do vírus AclíNPY10. Z. -Ffsl6 recofflbinante contendo o gene Pfsl6 foi pósteriormente propagado. Subsequentemente foi estudado se após infecção das células Sf9 com o vírus recombinante se produzia proteína de 16 kBa.

Foi isto, na verdade, o que aconteceu. Com a ajuda de estudos de imunofluorescência foi possível demonstrar que a proteína se localiza principalmente sobre a superfície da célula Sf9. Â secreção da proteína de PfslS não foi observada. A avaliação imunolõgiea das manchas Western preparadas a partir dos extractos celulares totais de células infectadas com AcMNPV--10.Z.Pfsi8 demonstrou que nas células Sf9 são produsidas pelo menos três proteínas específicas deo gene FfsiB, A maior é provávelmente o precursor não processado da proteína (média) que 21 -

com-migra com a proteína de PfslB presente em gametocitos de Plasmodium falciparum. A natureza da proteína mais pequena é desconhecida. A aJuiaar pela sua mobilidade electroforética concluímos que é maior do que o peptídeo sinal que é separado por clivagem da proteína precursora da proteína de 16 kDa durante a sua inserção na membrana da célula hospdeiro. Surpreendentemente ms conjunto semelhante de proteínas com pesos moleculares idênticos foi também observado após expressão do gene de Pfsl6 completo em E. coli. expressa o... gene C^ggtrugãp d Ο—vírus vaccinia recombiriant.ft qua EESIfi. k sequência de oociificaçao completa do gene Ffsl6 foi clonado para o único sítio de clivagem do enzima de restricçio 3m&I do plasmídio de transfeccção com vaccinia psCll (1), proporcionando plasmidio recornbinante pSCll:Pfsl8.

Nesta construção, o gene Ffsl6 encontra-se sob o controlo transcripcional do promotor 7,5 do vírus vaccinia (1).

Para se obter um vírus vaccinia recornbinante expressando o gene Ff s 16, foram usados métodos publicados (2). Resumida-mente, células CV1 CATGG # CGL705 foram infectadas com vírus vaccinia selvagem (estirpe WR), sendo então transfectadas com plasmídio pSCll:Ffsl6. Um estoque de virus obtido a partir destas células infectadas foi usado para infectar uma monocamada de células RAT-2 (TK ) (ATGC # CRL1764), na presença de 5-bromodeso-xiuridina (BUdR). Os vírus recombinantes foram seleccionados como placas de lise TK , BGalT. Foram ainda submetidos a três ciclos de purificação de placa em células RAT-2, usando de novo a dupla selecçao TK , BGal . 0 vírus recornbinante purificado obtido foi des ignado vSC11;Ffs16, vírus A fim de demonstrar a expressão recornbinante, células CV1 e BHK21 do gene Pfsl6 por (ATCG # CC110) este foram infectadas com vSCll;Pfsl6 ou controlo, vSCll, que não contem gene PfslB. Pesásseis a 48 horas foram recolhidas, submetidas a com um vírus recornbinante de a sequência de codificação do a seguir a. infecção, as células lise em tampão de carregamento

FÂQ/SDS, e os estractos de células foram analisados por manchas imunitárias. As manchas foram reagidas corn ant.i-soro de coelho (K37S8) produaido contra urna proteína de 16 kDa recombinante, produzida em E. coli.. purificada. Os resultados desta análise demonstraram que células CV1 e BHK21 infectadas com vírus vSCll:Pfsí6 sintetizam o antigénio 16 kDa.

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Um peptídeo sintético cobrindo os resíduos de amino ácidos 31 a 47 foi sintetizado seguindo a estratégia de fase solida passo a passo tal como foi descrita por Barany and Merri-field (1980) e foi purificado por cromatografia líquida de elevada performance de fase reversa. A composição de amino ácidos foi verificada por análise de amino ácidos. 0 peptídeo sintético foi acoplado com albumina de soro bovino CBSA) com glutaraldeido de acordo com Geerlings etg sl (1988). sxEWPba ,6

Preparação de proteína: de fusão recombinant-es

Proteínas de fusão reeombinantes consistindo em partes 16 kBa convenientemente acopladas com transferase-3 glutationa de Schistosoma japonicum (Smith etg ai. , 1986) foram sintetizadas usando o vector pGEX-£T (Smith et ai,, 1988) em que os fragmentos apropriados de gene Pfsl6 (fragmentos BamHl/Dral, BamHl/Sspl, respectivamente) foram inseridos, A expressão foi realizada em E. eoll JM181 recA. As proteínas de fusão foram isoladas por adsor-çao e. subsequente eluição a partir de pérolas de agarose gluta-tiona (ligação Enxofre, Sigma), SXEKE10--1

Coelhos da Nova Zelândia foram iniectados subcutânea-mente com um produto homogeneizado de 200 y.g de conjugado P31/4T emulsifiçado em adjuvante completo de Freund com reforço de três em três semanas com conjugado P31/47 BSA em adjuvante incompleto de Freund. Os coelhos foram sangrados a partir da veia principal da orelha sete dias após cada reforço. Deixou-se o sangue coagular a 4°C durante a noite e os soros foram armazenados a -20°C até à utilização.

Os anti-soros dos coelhos imunizados foram analisados quanto à sua reactividade contra tanto gametas como gametócitos de ?. faleiparum por meio de imunomareação. Os extractos de gametas e gametocitos foram preparados submetendo a ebulição 1 x 10“ parasitas em amostra de tampão SDS (Tris.Cl 62,5 raM, 2% SDS, 1©% glicerol, 5% 2-mercaptoetanol, 0,003% de azul de bromofenol). Geles de poliacrílamida (10% - 20%) contendo SDS (0,1%) foram produzidos e processados em condições de desnaturação de acordo com Daemmli (1970). As proteínas foram transferidas para filtros de nitrocelulose de 0,45 um tal como foi descrito (Towbin ei aJL. , 1979). Os filtros de nitrocelulose foram bloqueados com 11 de leite, ern pó em TBST (Tris.HCl 50 xaM, NaCl 200 mM, EDTA 5 tóM, 0,05% Tween-20, pH 7,5), antes da incubação com uma diluição 1:100 de diferentes anti-soros de coelhos durante 1-2 horas.- A deheoção foi realizada com diluição 1:8.000 de IgGCH+L) de coelho anti cafcra-fosfatase alcalina em tampão TBST durante 1 hora. Após lavagem extensiva com EBS a reacção de coloração foi realizada com fosfato de 5-bromo-4-eloro-3-indoliio (sal de p-toluidina, Sigma) e cloreto de Nitroazul-tetrazolium em Tris 100 mM, NaCl 100 mM e MgCir, 5 mM (pH 9,5). Os filtros forara revelados até

aparecerem bandas, sendo então lavados em Tris-HCl 20 mM (pH 8,0) e EDTA 5 mM. A análise da mancha Western revelou que os anticorpos preparados contra o peptídeo sintético reagiam fortemente com uma proteína de Mr = 16 kPa em extractos de proteína de ambos os gametas e gametocotos. Os anticorpos também reagiram com gametas e gametocotos secos num ensaio de imuno-fluorescência padrão CHoelans eet al 1991).

Esta conclusão foi confirmada por estudos de microsco-pia electrónica imunitária com ouro (ver mais abaixo) usando os anticorpos de coelho criados contra o peptídeo sintético, istes estudos revelaram claramente que a proteína de 16 kDa se encontra presente na superfície dos gametas e gametocitos do Plasmodium falciparum. o rosco Piei imunoe lec trónica P. falciparum ÍNF54) foi cultivado num sistema "tipper" e sincro-nisado tal como foi préviamente descrito (Ponnudurai st. ai. f 1986), Foram colhidas da cultura amostras de sangue contendo gametocitos que foram imediatamente fixadas. A fim de iniciar a exflagelação e detectar os gametas, outras amostras foram mantidas durante 10 e 30 minutos à temperatura ambiente antes da fixação. Todas as amostras foram fixadas durante 2 horas em 1¾ acroleina/2% paraformaldeido em tampão fosfato 0,1 m, centrifuga-das (1.500 x g) durante 10 minutos e suspensas de novo em 2% (p/v) de paraformaldeido em tampão fosfato 0,1 M. Após uma noite a 4°C as células foram lavadas extensivamente em tampão fosfato e a pílula foi implantada em gelatina (2¾ p/v). Após deshidratação em et-anol a 70% as amostras foram implantadas em resina branca a lí.B, , de grau médio (London Resin Co, Ltd) e polimeriaadas 5®°C. Cortes delgados foram gravados durante 15 minutos à temperatura ambiente em gotas de solução aquosa saturada de metaperio-dato de sódio, lavados com água destilada e préincubados com 1% de albumina do soro bovino em tampão fosfato 0,1 M. Os cortes foram subsequentemente incubados durante a noite numa câmara húmida a 4°C em gotas de 50 ul do anticorpo contra P31/47 diluído apropriadamente até se atingir uma concentração de cerca de 25 Mg/ml.Os cortes foram completamente lavados e feitos reagir durante 1 hora com ouro proteína A (10 mm) (Slot and Geuse, 1985). Os cortes de controlo foram incubados com soros préimimi-tários. Após lavagem final os cortes foram põs-fixados durante 10 minutos com 2% de glutaraldeido, lavados e corados com acetato de uranilo. proteínas totais do usando anti-soro de 31/47, proteínas de BamHl/Sspl, revelou A análise da mancha Western das gametocito. macrogameta/sigoto e esporosoito, coelho produzido contra peptídeo sintético fusão do fragmento BamHl/Dral, e fragmento também que a proteína de 16 kAd se encontra presente era extraotos de proteína de esporosoitos de B. falojparnm (Moelans et al 1991a). A análise por microscopia electrónica imunitária com ouro confirmou este achado, e localizou a proteína de 16 kDa espalhada uniformemente sobre a superfície do esporosoito (Moelans &£. al 1991). A reacção foi obtida com anti-soros de coelho produzidos contra o peptídeo sintético e a proteína de fusão BamHl/Dral. SXBMFL0.-8. grttrroulac3es de Vacina

Orna vacina tendo corno base o antigénio 16 kDa pode ser planeada para se conseguir um ou dois dos obiectivos que se peguem;

Desencadear imunidade contra os parasitas do estádio sexual por indução da produção de elevados títulos de anticorpos de bloqueio da transmissão.

Desencadear a imunidade protectora contra estádios exoeritrocíticos do parasita através da produção de títulos elevados de anticorpos anti-esporoaoito neutra1isadores assim como de uma resposta imunitária forte mediada por células dirigida a um parasita do estádio hepático.

Uma vacina ilustrativa deste invento é preparada corno se segue: A uma solução aquosa, tamponada de hidróxido de alumínio a 3¾ (fosfato de sódio IBmM, NaCl 150 mH, pH 6,3; esteriliçados por filtração), adiciona-se com agitação o polipeptídeo de P. falejparum deste invento em tampão semelhante a uma concentração final de 100 ixg/ml de polipeptídeo e 8,5 mg/ml de alumínio 0 pH ê mantido a 6,8. A mistura é deixada durante a noite a cerca de 0°C, Adiciona-se timerosal numa concentração final de 8,8885¾. 0 pH é avaliado e aJustado, se necessário, para 6,8.

As vacinas do invento podem ser planeadas para desencadearem uma resposta de anticorpos, uma resposta mediada por células, ou urna combinação de ambas. Tal como a proteína CS, a proteína de 16 kDa do presente invento encontra-se presente na superfície dos esporosoitos. Ê assim muito provãvelrnente transportada para os hepatocitos pelo parasita invasor. Por analogia com a proteína CS, o antigénio 16 kDa pode assim constituir um alvo apropriado para células T citotóxicas dirigidas para as células hepáticas infectadas (Nature, Ml, 323-325 (1989)). As técnicas que se encontram disponíveis para desencadear uma resposta mediada por células incluem as que se seguem; (a) Imunisação coro um vírus recombinante vivo que expressa o antigénio pretendido, tal como é descrito por exemplo em Science, 221=397-9 (1984) e Nature, 331, 258-260 (1988) para vaccinia, Proc. Natl. Âcad. Sei. USA 81, 3896-3900 (1987) para varicela-soster, e Journal of Infectious Diseases 161: 27-30 (1998) para adenovirus. (b) Imunização com uma bactéria recombinante viva que expressa o antigénio pretendido, tal como é descrito por exemplo ei» Yaccine, 7_, 495-498 (1989), WO89/02924, Science, 240. 336-338, (1988), e USSN222,202 de SrnithKline Beckman (EF-A-0357208) para Salmoitella. e em W090/00594 para mieobaeteria tal como Mvcobacte- rimfÍ bovis. (c) υ antigénio pode ser transportado por uma partícula que pode ser ou não ser ela própria imunogéniea. Por exemplo, Yalert-suela gi. al. , (US Fatent 4.722.840), EP-A-0278940 and Butgers sl SlL (Bio/Technol ogy. 6.:1065-70 (1988)) indica que vários compri mentos de P, falciparum CS superfície da Hepatite B. se repetem fundidas com o antigénio de As fusões são expressas coroo partículas virais em SacnhavnmyceS- nerev.lslae. por em era eia (d) 0 antigénio pode alternativamente ser transportado partículas inertes tais coroo liposomas tal como é descrito Immunology Today, 11, No. 3 (1990), 89 et seq., ou inseridos complexos imunoestimulantes (ISCOMs) tal corno é descrito Hature, 457-460 (1934),

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INDICAÇÕES 1¾. - Processo para a produção de uma proteína de 16 de P. faleiparum compreendendo a sequência de aminoáeidos tal e indicada na figura. 1*

Claims (1)

1. 34 tttttatttt attttt 17 ttta ttttttattt ttttttctttfc gccatttttc tatttatact ttcttcaac 1 met asn ile arg lys phe ile pro ser leu ala leu met leu ile 71 ATG AAT ATT CGA AAG TTC ATA CCA TCT TTA GCT TTA ATG CTT ATA 16 phe phe ala phe ala asn leu vai leu ser asp ala asn asp lys 116 TTC TTC GCT TTT GCA AAC CTG GTA TTA TCA GAT GCA AAT GAC AAA 31 laia lys lys pco ala gly lys gly ser pro ser thr leu gin thr 161 GCA AAA AAG CCC GCT GGA AAA GGA TCC CCT TCA ACT TTG CAA ACC 46 pro glyjser ser ser giy ala ser leu his ala vai giy pro asn 206 CCA GGA AGT TCT TCA GGT GCC TCT CTT CAT GCT GTT GGA CCT AAT 61 gin gly gly leu ser gin giy leu ser giy lys asp ser ala asp 251 CAA GGT GGA CTA TCT CAA GGT CTT TCT GGA AAA GAT TCT GCT GAC 76 lys met pro leu glu thr gin leu ala ile glu glu lie lys ser 296 ΑΛΑ ATG CCT TTA GAA ACT CAG CTA GCT ATA GAA GAA ATC AAG AGC 91 leu ser asn met leu asp lys lys thr thr vai asn arg asn leu 361 TTA TCC AAT ATG TTA GAT AAA AAA ACG ACA GTT AAC AGA AAC TTA 106 ile ile ser thr ala vai thr asn met ile met leu ile ile leu 386 ATC ATA AGT ACT GCT GTC ACA AAT ATG ATC ATG TTG ATC ATA TTA 121 ser g!y ile vai gly phe lys vai lys lys thr lys asn ala asp 631 TCT GGT ATA GTT GGA TTT AAA GTT AAA AAA ACG AAG AAC GCA GAT 136 asp asp lys gly asp lys asp lys asp lys asp asn thr asp glu 676 GAT GAT AAA GGA GAT AAG GAT AAG GAC AAG GAT AAT ACA GAT GAA 151 giy asp glu gly asp asp ser •A“A"A‘ 521 GGA GAC GAA GGA GAT GAT TCT taa atgta tatatatata tatatatata 570 tatttattta tttatttaaa tatttatata tatatatata Ctatatatat aata 615 ttttat aatttt = -35- de proteínas de fusão contendo a proteína de 16 KDa ou de seus derivados imunogénicos, caracterisado por compreender: a) a transformação de um hospedeiro com uma sequência de ABN que codifica a proteína de 16 KDa, a proteína de fusão ou os seus derivados, b) a cultura do referido hospedeiro num meio apropriado, e) o isolamento da referida proteína, proteína de fusão ou seus derivados a partir do meio. £â. - Processo de acordo com a reivindicação 1, carac- de 16 KDa, proteína de capas de desencadear uma ambos os estádios esporo- H) cl' erisado por se produair uma proteína usão ou proteína imunogénica que é resposta imunitária em mamíferos contra soito e exoeritrocito do parasita. 3a. caracteria ado - Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, por a proteína produaida ser uma proteína de fusão. 4â, - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterisado por a sequência de ADN se encontrar localisada num vector de expressão. 5a. - Processo para a produção de uma vacina compreen dendo uma proteína ou derivado imunol de 16 KDa E. falei parmn, >gico, caracterisado por ou proteína de fusão empreender a mistura da proteína com um ve: ou exeipiente apropriado, Lis V. i j de Junho de 199;

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