PT98865A - Processo para a preparacao de tioeter-amidas fenolicas - Google Patents

Description

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1. Campo do Invento 0 presente invento refere-se a tioéter-amidas fenólicas e mais particularmente refere-se aos novos compostos de fórmula I que são inibidores específicos de 5-lipoxigenase e são úteis, por exemplo, como agentes anti-inflamatórios e antialérgicos. Os compostos do presente invento podem ser úteis no tratamento de artrite, asma e psoríase. Os compostos do presente invento que estimulam ou modulam a geração de superóxido podem ser úteis como agentes terapêuticos adjuntos no tratamento de infecções. Os compostos que inibem a geração de superóxido podem ser úteis nas condições de tratamento em que os radicais superóxido estão envolvidos. 2. Informação Fundamental e Técnica Relacionada É bem reconhecido que o ácido araquidónico, um ácido gordo insaturado essencial, é oxigenado enzimaticamente para vários produtos, incluindo prostaglandinas, tromboxanos, os ácidos 5-, 11-, 12- e 15-hidroxieicosatetraenóicos (HETEs, DIHETEs) e ácidos hidroperoxieicosatetraenóicos (HPETEs) e os leucotrienos, tendo todos efeitos fisiológicos potentes. Os leucotrienos, que são produzidos via 5-lipoxigenase, são os maiores contribuintes para o começo dos sintomas da asma e mediadores para as reacções de hipersensibilidade imediata, inflamação e outras respostas alérgicas.

Os leucotrienos são encontrados em exsudatos e estão envolvidos no processo de invasão celular durante a inflamação. 0 termo "leucotrienos" é usado como termo genérico para descrever uma classe de substâncias, tal como a substância de reacção lenta - 4 -

(SRS) que é um mediador importante na asma. çutras reacções de hipersensibilidade. A SRS gerada imunologicamente é usualmente referida como substância de reacção lenta de anafilaxia (SRS-A). A SRS-A consiste de leucotrienos (LT) conhecidos por A4, B^, C, D4 e Ε4· O LTC4 é pelo menos 100 vezes mais potente que a histamina na causa de efeitos de broncoconstricção de longa duração. . Os leucotrienos também aumentam a permeabilidade vascular e causam a diminuição da resposta cardíaca e a contrac-ção ventricular diminuída. O LTB4 pode ser um importante mediador da inflamação, por exemplo, na doença do intestino inflamatório. A quimiotaxia é uma reacção pela qual a direcção da migração das células é determinada pelas substâncias no seu ambiente. É um dos principais processos de encaminhar leucócitos do sangue para um local de inflamação, se a inflamação for causada por um agente infeccioso, desafio alérgico ou outro estímulo pró-inflamatório. O LTB4 não é apenas quimiotáctico para neutrófilos e monócitos, mas também é altamente activo na estimulação da locomoção eosinófila. O LTB4 também estimula o influxo de cálcio e a agregação de leucócitos polimorfonucleares e o LTB4 pode, desta maneira, desempenhar um importante papel na mediação da inflamação não só aguda mas também crónica. A espondilite reumatóide é caracterizada por uma explosão de neutófilo aguda na articulação que está associada com níveis elevados de LTB4· 0 LTB4 está também presente nas efusões gotosas; a exposição a cristais de urato é conhecida por estimular a produção de LTB4 por neutrófilos. Assim, os inibidores de 5-lipoxigenase do presente invento por meio da inbição da atrac-ção e activação do neutrófilo nas articulações artríticas deverão reduzir a protease e a carga oxidante que se crê serem responsáveis pela destruição da articulação nas doenças artríticas. 5

A aspirina e outros agentes não èsteróides anti-infla-matórios (NSAIDS) tais como indometacina, ibuprofeno, fenoprofeno e semelhantes, inibem a síntese de prostaglandinas via ciclooxi-genase do metabolismo do ácido araquidónico. Estes inibidores da sintetase de prostaglandina geralmente exibem actividade anti-in-flamatôria, antipirética e análgesica e são largamente utilizados no tratamento da artrite. Os agentes não esterõides anti-infla-matórios podem conduzir à formação de derivados pró-inflamatõrios adicionais de ácido araquidónico produzido através da via 5-lipo-xigenase que desempenha um papel nas reacções de hipersensibili-dade imediata e também têm pronunciados efeitos inflamatórios. A administração de NSAIDs isoladamente pode produzir reacções alérgicas que incluem a reactividade broncospática, erupções da pele, sindroma da dor abdominal, febre, tremores, náusea e vómitos e anafilaxia. Por esta razão, a aspirina e outros agentes não esteróides anti-inflamatórios (NSAIDs) estão geralmente contra-indicados para pacientes que sofrem de asma ou que exibiram anteriormente sensibilidade alérgica â aspirina ou outros NSAIDs.

Antes do conhecimento do significado da via 5-lipoxi-genase do metabolismo do ácido araquidónico nas reacções alérgicas e na inflamação, a pesquisa de agentes terapêuticos eficazes teve como base principalmente os agentes que tratavam os sintomas da alergia e inflamação. Tem havido desde então esforços para se desenvolverem novas drogas que bloqueiem selectivamente a formação dos mediadores destas condições e o presente invento proporciona novas entidades químicas que são inibidoras da via 5-lipo-xigenase e/ou ciclooxigenase e são úteis no tratamento da asma, artrite reumatóide, psoríase e outras condições alérgicas, de hipersensibilidade e inflamatórias. Em aditamento, os compostos que estimulam a geração de superóxido podem ser úteis na terapia adjuntiva de infecções microbianas.

Ver Goodman e Gilman's, The Phâtmácological Basis of Therapeutics (7^ Edição, 1985) p. 660-673; P. A. Ward, et al., "Oxigen Radicais, Inflammation and Tissue Injury", FREE RADICAL BIOLOGY & MEDICINE, 5, 403-408 (1988); e C. E. Cross, et al., "Oxigen Radicais and Human Disease", ANN. INT. MED., 107 r 526-545 (1987). O presente invento proporciona compostos que bloqueiam a via metabólica da 5-lipoxigenase e, por consequência, bloqueiam a formação de dos leucotrienos responsáveis por alergia e inflamação e representam agentes terapêuticos que são úteis no tratamento de reacções alérgicas e de hipersensibilidade e inflamação, isoladamente, ou podem também ser utilizados em combinação com outros inibidores de lipoxigenase ou com inibidores de ciclooxi-genase tais como agentes não esteróides anti-inflamatórios.

Recentemente, os radicais oxigénio foram implicados na patogénese de muitas doenças. Esta implicação é reflectida pelas muitas conferências dedicadas a este tópico, livros sobre o assunto dos radicais livres e doenças e o aparecimento de duas novas revistas especializadas: Free Radical Research Communications e Free Radical Biolocfv and Medicine.

Conhece-se muito sobre as propriedades físico-químicas de vários radicais de oxigénio, mas o conhecimento da sua importância global na iniciação e amplificação de doenças humanas é limitado. Algumas condições clínicas nas quais os radicais de oxigénio se pensa estarem envolvidos são discutidas em Cross, C. E., et al., "Oxigen Radicais and Human Disease", ANN. INT. MED., 107. 526-545 (1987) (ver Tabela 1, p. 527) e Ward, P. A., et al., "Oxigen Radicais, Inflammation, and Tissue Injury", FREE RADICAL BIOLOGY & MEDICINE, 5, 403-408 (1988). De entre as condições clínicas em que se pensa que os radicais de oxigénio estão

envolvidos, por exemplo, trauma inflamátcfrio imune, doenças autoimunes, isquemia - estados de refluxo, desordens da idade, cancro, efeitos do fumo do cigarro, enfisema, síndroma da angustia respiratória aguda (ARDS), aterosclerose, artrite reumatóide, demência senil, cataratogénese, retinopatia da prematuridade, lesão por radiação e dermatite de contacto.

Os radicais de oxigénio são capazes de reversível ou irreversivelmente causar danos a compostos de todas as classes bioquímicas, incluindo ácidos nucleicos, proteínas e aminoácidos livres, lípidos e lipoproteínas, hidratos de carbono e macromo-léculas de tecido conjuntivo. Estas espécies podem ter um impacto nestas actividades celulares como função de membrana, metabolismo e expressão do gene. Os radicais de oxigénio são formados em tecidos por muitos processos (ver Cross, et al., p. 528, Tabela 2). Acredita-se que são não só endógenos, tal como cadeias de transporte de electrão de mitocôndrio, microssoma e cloroplasto; enzimas oxidantes tais como oxidase de xantina, dioxigenase de indolamina, dioxigenase de triptofano, oxidase de galactose, ciclooxigenase, lipoxigenase e oxidase de monoamina; células fagocíticas tais como neutrófilos, monócitos e células macrófagas, eosinófilas e endoteliais; e reacções de antioxida-ção; mas também exógenas, tais como substâncias de ciclização redox, oxidações de drogas, fumo de cigarro, radiação ionizante, luz solar, choque térmico e substâncias que oxidam a glutationa. Eles podem estar envolvidos na acção de toxinas tais como para-quato, fumo de cigarro e drogas antitumores de quinona. A geração de espécies de oxigénio reactivo é um evento crítico no sucesso da defesa do hospedeiro contra a invasão de organismos. Não só os neutrófilos mas também os macrófagos contam com uma variedade de oxidantes para danificar os constituintes bacterianos (ver V. L. Shepherd, "The role of the 8 - i ϊ

respiratory burst of phagocytes in host defense", SEMIN. RESPIR. INFECT. (United States) Jun. 1986, 1(2) p. 99-106. Vários compostos de tioéter foram já anteriormente descritos. Por exemplo, a U.S. 4 711 903 e a sua Continuação em Parte U.S. 4 755 524 revelam compostos de fórmula

12 em que R e R são iguais ou diferentes e, mdependentemente, representam tert-alquilo ou fenilo; A representa metileno ou metileno substituído por alquilo, dialquilo ou hidroxi, com a condição de que quando A inclui hidroximetileno, o grupo hidroxi-metileno não está adjacente a um heteroãtomo; B representa enxofre, sulfóxido, sulfona, oxigénio, -NH- ou azoto substituído por alquilo, fenilo, benzilo, fenilo substituído ou benzilo substituído; C representa metileno ou metileno substituído por alquilo; R representa C02H, CC>2-alquilo ou um grupo tetrazole; m éOoul, né2, 3 ou 4 e p é 1, 2 ou 3; eos seus sais farmaceu-ticamente aceitáveis. Os compostos são inibidores específicos de 5-lipoxigenase e são úteis no tratamento da inflamação local e sistémica, alergia e reacções de hipersensibilidade e outras desordens nas quais estão envolvidos os agentes formados no percurso metabólico da 5-lipoxigenase.

Ns 0 131 221 revela O Pedido de Patente Europeia compostos de fórmula

t Αχ—Q—Λ—S-R (Ο),

I em que Ar representa fenilo ou fenilo substituído por um até três substituintes variados, por exemplo, alquilo, alcoxi, hidroxi, etc.; Q representa oxigénio, enxofre ou um grupo NH; A representa uma cadeia linear ou ramificada, facultativamente substituída, alquileno e R representa hidrogénio ou alquilo linear ou ramificado, facultativamente substituído por alcoxi, hidroxilo, carbo-xilo, alcoxicarbonilo, etc.; e a é 0, 1 ou 2. Os compostos revelados são indicados como tendo propriedades anti-inflamató-rias e anti-alérgicas por meio de inibição de reacções anafi-lácticas e anafilactóides não definidas, ainda que não sejam proporcionados nenhuns dados de testes. Os compostos preferidos são indicados como sendo aqueles em que Q representa oxigénio e n é 0 sem menção de qualquer preferência entre os numerosos substituintes possíveis para R ou fenil substituído como Ar. Em contraste com o invento revelado no pedido de patente anterior, os compostos do presente invento têm todos um átomo de enxofre na posição que corresponde a Q assim como têm grupos di(terciário)--alquilo ou difenilo como substituintes na porção de fenol ' que corresponde ao grupo Ar substituído no anterior pedido de patente que, como aqui se descreve, pode ou não compreender um fenol. Além disso, verificou-se que os compostos do presente invento possuem especificidade para a inibição da 5-lipoxigenase o que constitui uma importante e distinta propriedade não atribuída aos compostos no anterior pedido de patente. Os habituais peritos na técnica apreciarão que os compostos de fórmula I deste invento, incluindo as suas surpreendentes propriedades inibidoras de superóxido específicas, não são, por conseguinte, especificamente - 10 -

descritos no pedido de patente EPA Ns 0 131:221 anteriormente referida.

As U.S. Patente Nos. 4 029 812, 4 076 841 e 4 078 084 revelam compostos de fórmula C(CHj)j ÇHj )-V (ÇHx)3 ^R| \_! O Rj C(CHj)3 que compreendem 2-(3,5-di-terc-butil-4-hidroxi-fenil)tiocarboxa-midas. Os compostos são indicados como úteis no abaixamento dos níveis de lípido no plasma incluindo os níveis de colesterol e triglicerídeo no soro. A U.S. Patent N2 4 153 803 revela ésteres de ácido fenoxialcanóico que diminuem o colesterol de fórmula

y—c—coz em que, quando Y representa enxofre, X representa hidrogénio, benzilo, benziloxi ou benziltio ou os seus derivados substituídos; R representa hidrogénio, halogéneo, hidroxi, alquilo ou 1 2 alcoxi, A e A representam hidrogénio ou alquilo e Z. representa amina ou azaciclo-hidrocarboniloxi. A U.S. Patent 4 663 333 revela compostos de fórmula i t

K-i em que R e R2 são membros iguais ou diferentes do grupo constituído por halo, fenilo, fenilo substituído e um grupo » (C.Hn+t)

«VH em que n, m e p representam independentemente um inteiro desde 1 até 8 com a condição de que n+m+p seja igual ou menor do que 10, X representa tio, sulfinilo ou sulfonilo, AlJc1 representa alqui-leno inferior de cadeia linear ou ramificada de 1 até 6 átomos de carbono, R3 representa alquilo inferior, Alk2 alquileno inferior de cadeia linear ou ramificada de 1 até 4 átomos de carbono, R^ é escolhido do grupo constituído por hidrogénio, halo, hidroxi, alquilo inferior ou alcoxi inferior, e os seus sais farmaceutica-mente aceitáveis. Os compostos inibem a 5-lipoxigenase e são úteis no tratamento da inflamação, alergia e reacções de hiper-sensibilidade e outras desordens do sistema imune. 0 Pedido de Patente Europeia EP 0 372 409 publicada em 13 de Junho de 1990 revela que estes compostos são úteis na inibição da actividade invasora de células de tumor e da metástase resultante. O Pedido de Patente Europeia EP 0 190 685 revela amidas heterocíclicas representadas pela fórmula 12 1 i

*2 em que R^ e R^ são membros iguais ou diferentes do grupo consti tuído por halo, fenilo, fenilo substituído e um grupo

«yw em que q, r e t representam independentemente um inteiro desde 1 até 8 com a condição de que q+r+t seja igual ou menor do que 10, Y representa tio, sulfinilo ou sulfonilo, Alk representa alqui-leno inferior de cadeia linear ou ramificada e R^ representa uma amina heterocíclica representada pela fórmula »

P em que R^ é escolhido do grupo constituído por hidrogénio, alquilo inferior, fenilo, fenilo substituído, benzilo, benzilo substituído, carboxilo ou carboxi-alquilo inferior; X é escolhido do grupo constituído por N-R , 0 e CH0;mé2ou 3;né2ou 3 quando X representa O ou N-R4 e n é 1 até 3 quando X representa CH2; p é 0 até 2; e os seus sais farmaceuticamente aceitáveis. Os compostos inibem a 5-lipoxigenase e são úteis como agentes

J

anti-inflamatórios e antialérgicos. 0 Pedido de Patente Europeia EP 0 372 410 publicada em 13 de Junho de 1990 revela que estes compostos são úteis na inibição da actividade invasora de células de tumor e a metástase resultante. O Pedido de Patente Europeia EP 0 190 682 revela anilidas representadas pela fórmula

em que R e R2 são membros iguais ou diferentes do grupo constituído por halo, fenilo, fenilo substituído e um grupo

«yw (cyw-Ç“-• VW em que n, m e p representam independentemente um inteiro desde 1 até 8 com a condição de que n+m+p seja igual ou menor do que 10; X representa tio, sulfinilo ou sulfonilo; Alk representa alqui-leno inferior de cadeia linear ou ramificada; R3 representa hidrogénio ou alquilo inferior; e R^ representa fenilo ou fenilo substituído. Os compostos inibem a 5-lipoxigenase e são úteis no tratamento da alergia e reacções de hipersensibilidade e inflamação. A U.S. Patent N2 4 857 588 revela métodos para a inibição da lipoxigenase e inclui formulações farmacêuticas que compreendem um agente de suporte farmacêutico e uma quantidade eficaz que inibe a lipoxigenase de um composto de fórmula

H

em que R^ e R£ são membros iguais ou diferentes do grupo constituído por 1,1-dimetiletilo, halo, fenilo e fenilo substituído; Alk representa alquileno inferior de cadeia linear ou ramificada; R4 representa hidrogénio ou alquilo inferior; R3 representa hidrogénio ou alquilo inferior ou um grupo cicloalquilo de 3 até 8 átomos de carbono. Os compostos revelados inibem a 5-lipoxige-nase e são úteis no tratamento da alergia e reacçóès de hipersen-sibilidade e inflamação. A Patente do Reino Unido Ns 1 557 622 revela compostos de 3,5-di-terc-butil-4-hidroxifenil-piridina de fórmula

ou um seu sal por adição de ácido farmaceuticamente aceitável, em que: 4 4 Y representa -0-, -s- ou -N(R )- [em que R representa um átomo de hidrogénio, um grupo alquilo que tem de 1 até 4 átomos de carbono (e. g. metilo, etilo, propilo ou butilo), um grupo aralquilo (e. g. benzilo, metoxibenzilo ou fenetilo)]; 15 1 2 cada um dos R e R representa um átomo de hidrogénio, um grupo hidroxilo ou um grupo alquilo que tem de 1 até 4 átomos de carbono (e. g. metilo, etilo, propilo ou butilo) ; 3 R representa um átomo de hidrogénio, um grupo hidroximetilo ou um grupo de fórmula ) hj-Q-iph^o-cm,· ct»4\

em que méOoul; enéO, 1, 2 ou 3.

Os compostos preferidos da fórmula são aqueles em que Y 4 4 representa -0- ou -N(R )- (em que R é definido como anteriormen-te). Estes compostos são referidos como tendo actividades antiarterosclerótica, anti-hiperlipidémica, de vasodilatação cerebral e antitrombótica, e são úteis como drogas para o tratamento da doenças vasculares isquémicas em mamíferos, tais como arterosclerose, enfarte cardíaco, angina pectoris, enfarte cerebral, hemorragia cerebral, enfarte renal, claudicação intermitente, ataque cerebral transiente ou trombose. A German Offenlegunsschrift 1 936 463 revela fenóis que têm a fórmula

X

em que·

Xe Y, que podem ser iguais ou diferentes, representam átomos de hidrogénio ou halogéneo ou radicais alquilo inferior, R^ representa um átomo de hidrogénio ou um radical alquilo inferior, R2 representa um dos grupos

R

COOH, CCOR3, COK CN, e, no caso de n igual a 0 e R1 representar um hidrogénio, pode representar apenas C^-H^ e no caso de n igual a 1, pode representar também OH, pelo que pelo que R3 representa um radical alquilo com 1 até 5 átomos de carbono e R4 e R5, que podem ser iguais ou diferentes, representam átomos de hidrogénio ou radicais alquilo inferior ou médio ou, conjuntamente com um átomo de azoto, representam um anel que pode conter um outro heteroátomo, n representa 0 ou 1, bem como os correspondentes fenolatos. Os fenóis são referidos como tendo actividade biocida mas eles são referidos por serem acima de tudo adequados como intermediários para a preparação de 17

substâncias biocidas, por exemplo, ésteres de :fosfato e carbama-tos.

Sumário do invento

0 presente invento refere-se a compostos de fórmula I

" 12 em que R e R são iguais ou diferentes e, independentemente, 1 representam tert-alquilo ou fenilo; Alk representa alquileno de

cadeia linear ou ramificada de 1 até 10 átomos de carbono; X 2 representa enxofre ou oxigénio; Alk representa alquileno de cadeia linear ou ramificada de 1 até 4 átomos de carbono; m é 0, 1 ou 2; e R representa a)

R3

3 ... em que R representa hidrogénio ou alquilo de 1 ate 4 átomos de 3 . . . . . carbono; Alk representa alquileno de cadeia linear ou ramificada _ 4 de 1 ate 4 átomos de carbono; e R representa hidrogénio ou alquilo de 1 até 4 átomos de carbono; ou

" - 18 - * V

R7 g em que Y representa CH, N, O ou S; R representa hidrogénio, alquilo inferior, fenilo, fenilo substituído, benzilo, benzilo 7 substituído ou uma amina heterocíclica e R representa hidrogénio ou alquilo de 1 até 4 átomos de carbono; e os seus sais e estere-ómeros ou isómeros geométricos farmaceuticamente aceitáveis.

I

Os compostos de fórmula I são inibidores de 5-lipoxige-nase e são úteis no tratamento de alergias, inflamação, psoríase, síndroma da angustia respiratória do adulto (ARDS) e reacçóes de hipersensibilidade e desordens e condições relacionadas nas quais estão envolvidos os agentes fisiologicamente activos formados no percurso metabólico da 5-lipoxigenase.

Os compostos do presente invento também afectam a geração de superóxido. Eles podem estimular a geração de super-óxido ou, em alguns casos, eles podem operar de uma maneira bifásica estimulando a geração de superóxido a doses inferiores e inibindo a geração de superóxido a doses mais altas. Por conseguinte, eles podem também ser utilizados para modular a geração de superóxido.

Os compostos de fórmula I que actuam como estimuladores da geração de superóxido podem ser úteis no tratamento terapêutico ou profiláctico de condições de doença em que a geração de superóxido é um factor importante.

Os compostos de fórmula I que são inibidores da geração de superóxido em certas doses podem ser úteis no tratamento terapêutico ou profiláctico de condições de doença que são completa ou parcialmente mediadas pela geração de superóxido tais como síndroma da angustia respiratória do adulto, condições inflamatórias ou alérgicas mediadas por superóxido e outras condições clínicas que são causadas por ou agravadas por superóxido .

Ainda que tenha sido especulado que a 5-lipoxigenase possa estar envolvida na geração de superóxido, a capacidade destes compostos, que inibem a 5-lipoxigenase, para estimular a geração de superóxido em neutrófilos indica que a geração de superóxido não é governada pela 5-lipoxigenase. Por conseguinte, a actividade dos compostos de fórmula I na estimulação da geração de superóxido não está relacionada com a capacidade de inibir a 5-lipoxigenase. O presente invento também proporciona um método pelo qual a activação de neutrófilos e a geração de aniões de superóxido são realizadas utilizando os compostos de fórmula I. De acordo com isto, os compostos de fórmula I são úteis no desenho e testagem de propriedades anti-inflamatórias de outros agentes farmacologicamente activos. A capacidade para produzir superóxido, que pode ele própria ser microbicida ou que é em seguida convertido para oxidantes tóxicos tais como H202*0H e o oxigénio singelo, é importante para os mecanismos de morte fagocítica que possibilita os neutrófilos e macrófagos de matar bactérias e parasitas através da fagocitose.

Por conseguinte, os compostos de fórmula I que estimulam a geração de superóxido podem ser úteis na terapia adjuntiva de infecçóes microbianas. Os compostos podem também ser úteis no tratamento de condições tais como o Sindroma de Chediak-Higashi em que os macrófagos e polimorfos do paciente são apenas fracamente activos sendo causa dos pacientes sofrerem de infecções recorrentes que envolvem organismos com patogeneticidade normalmente baixa. Os compostos de fórmula I podem também ser úteis na terapia adjuntiva de pacientes cujos sistemas imunes têm sido enfraquecidos ou prejudicados por doença ou por quimioterapia ou terapia de radiação e que estão mais sujeitos a infecções microbianas.

Descricao Detalhada do Invento

Os compostos preferidos do presente invento são compostos de fórmula

e os seus sais e estereõmeros e isõmeros geométricos farmaceuti-camente aceitáveis, em que R e R são iguais ou diferentes e representam hidrogénio ou alquilo de 1 até 4 átomos de carbono, e R é definido como anteriormente. 0 termo "tert-alquilo·' conforme aqui usado em referência a R1 e R2 refere-se a porções alquilo de cadeia ramificada desde 4 até 10 átomos de carbono que têm um carbono terciário ligado ao anel de fenilo substituído por R^ e . Exemplos de tais grupos são tert-butilo, i.e., 1,1-dimetiletilo, 1,1-dimetil-propilo, 1-metil-l-(etil)pentilo, 1,1-dietilpropilo, 1-etil-l--(propil)butilo e semelhantes. 0 termo "alquileno" refere-se a grupos alquileno de cadeia linear ou ramificada que têm entre 1 e 10 átomos de carbono que incluem, por exemplo, metileno, etileno, propileno, 1,2-dimetiletileno, pentileno, 1-metilbutileno, isopentileno, neopentileno, etc.. O termo "alquilo inferior", conforme aqui usado, refere-se a grupos alquilo de cadeia linear ou ramificada que têm de 1 até 6 átomos de carbono, inclusive, i.e., metilo, etilo, n-propilo, iso-propilo, n-butilo, sec-butilo, terc-butilo, n-pentilo, 2-metilbutilo, 2,2-dimetilbutilo, n-hexilo, e semelhantes .

Os termos "fenilo substituído" e "benzilo substituído" referem-se a fenilo ou benzilo que têm um ou mais substituintes escolhidos do grupo constituído por halo, hidroxi, alquilo inferior, acilo e alcoxi inferior. São particularmente preferidos os compostos de fórmula I em que R^ e são ambos terc-alquilo. O termo amina heterocíclica refere-se a um anel hetero-cíclico de 5 até 7 membros que contêm um ou dois heteroátomos e inclui piperidina, piperazina, piridina, morfolina e tiomorfolina e semelhantes. A expressão "sais farmaceuticamente aceitáveis" pretende incluir os sais capazes de serem formados com os compostos do 22

presente invento sem materialmente alterarem a'estrutura química ou as suas propriedades farmacológicas. Tais sais incluem sais de catiões inorgânicos e orgânicos ou sais por adição de ácido, tais como de sódio, potássio, cálcio, amónio, alquilamónio, trietanolamina, lisina, hidrocloreto, hidrobrometo, citrato, tosilato, etc., bem como conhecidos dos peritos da técnica. Os sais anteriores são preparados de uma maneira convencional por neutralização dos compostos de Fórmula I com a base ou ácido desejados.

I

Os compostos do presente invento podem ser administrados em formas de dosagem oral como comprimidos, cápsulas, pílulas, pós, grânulos, elixires ou xaropes bem como aerossóis para inalação. Semelhantemente, a administração pode ser efectuada de forma intravascular, subcutânea ou intramuscular, utilizando formas de dosagem conhecidas dos peritos habituais nas técnicas farmacêuticas. Em geral, a forma preferida de administração é a oral. Uma quantidade eficaz mas não tóxica do composto é empregue no tratamento. 0 regime de dosagem que utiliza os compostos presentes é escolhido de acordo com uma variedade de factores que incluem o tipo, idade, peso, sexo e condição médica do paciente; a severidade da condição a ser tratada; e a via de admnistração. Um médico com perícia normal pode prontamente determinar e prescrever a quantidade eficaz da droga requerida para prevenir, tratar ou parar o progresso da condição particular. Para a modulação da geração de superóxido, a quantidade eficaz para administração é vulgarmente a quantidade que é necessária para assegurar que os neutrõfilos de mamífero envolvidos na geração de superóxido estarão expostos a uma concentração suficiente da droga para estimular ou inibir a geração de superóxido. 0 regime de dosagem pode ser eficazmente determinado para cada paciente ou animal por infusão intravenosa inicial a um nível de dosagem baixo, e.g. 0,01 Mg/kg/min e depois disso aumentar a dosagem até ser obtido o efeito desejado. Desta meneira, podem ser determinadas as dosagens orais que produzirão equivalentes níveis de sangue da droga. As dosagens dos compostos do presente invento, variarão geralmente entre 0,1/mg/kg/dia até 100 mg/kg/dia e preferivelmente entre 0,5/mg/kg/dia até 50 mg/kg/dia quando administrados a pacientes que sofrem de reacções alérgicas ou de hipersensibilidade ou inflamação. Os compostos podem também ser administrados transdermicamente ou topicamente. A dosagem diária pode ser administrada numa dose única ou em doses divididas iguais três ou quatro vezes por dia.

Nas composições e nos métodos do presente invento, pelo menos um dos compostos activos do invento ou um seu sal farmaceu-ticamente aceitável serão tipicamente admnistrados em mistura com diluentes, excipientes ou agentes de suporte (colectivamente referidos daqui em diante como materiais "agente de suporte") farmaceuticamente adequados, adequadamente escolhidos em relação à forma pretendida de administração, isto é, comprimidos orais, cápsulas, elixires, xaropes e semelhantes orais, e consistentes com as práticas farmacêuticas convencionais.

Por exemplo, para admnistração oral na forma de comprimidos ou cápsulas, a componente da droga activa pode ser combinada com um qualquer agente de suporte oral, não tóxico, farmaceuticamente aceitável, inerte, tal como lactose, amido, sacarose, celulose, estearato de magnésio, fosfato de dicálcio, sulfato de cálcio, manitol e semelhantes; para admnistração oral na forma líquida, a componente da droga activa pode ser combinada com qualquer agente de suporte oral, não tóxico, farmaceuticamente aceitável, inerte, tal como etanol e semelhantes. Além disso, quando desejado ou necessário, podem também ser incorporados na mistura agentes ligantes, lubrificantes, agentes de desintegração e agentes de coloração adequados. Os ligantes adequados incluem 24 t

amido, gelatina, açúcares naturais, agentes adoçantes de grão de cereal, gomas naturais e sintéticas tais como acácia, alginato de sódio, carboximetilcelulose, polietileno-glicol e ceras. Os lubrificantes utilizados em tais formas de dosagem incluem ácido bórico, benzoato de sódio, acetato de sódio, cloreto de sódio e semelhantes. Os agentes de desintegração incluem, sem limitação, amido, metilcelulose, ágar, bentonite, goma de guar e semelhantes .

Avaliações Biológicas

Os compostos do invento são avaliados em relação à inibição da 5-lipoxigenase de acordo com o seguinte processo de ensaio.

Inibição da 5-lipoxigenase, in vitro: actividades anti-inflamatória e anti-alércrica A fracção sobrenadante a 100 000 x g de Homogenato de Célula de Leucemia Basofílica de Ratazana (RBL-i) serve como fonte da enzima 5-lipoxigenase. A enzima é incubada com . 14 . . ++ ácido (1- C)-araquidonico e Ca na presença e ausência de composto de teste. O produto de 5-lipoxigenase, ácido # 5-hidroxieicosatetraenóico (5-HETE), é separado por cromato- grafia de camada fina e medido por radioactividade. Um composto que inibe a síntese de 5-HETE por 30 % ou mais é considerado activo a essa concentração. As doses de ras- -4 treio inicial sao de 1 x 10 M. Quando o composto inibe mais do que 50 % da síntese do 5-HETE a 10 M, esse composto é testado em níveis de dose múltipla para determinar o valor ICgQ (concentração inibidora para inibir 50 %).

I 25

Os compostos do invento são avaliados em relação à actividade de modulação de superóxido de acordo com o seguinte processo de ensaio:

Geração de superóxido neutrófilo humano:

A geração de superóxido por neutrófilos estimulados por formil-metionil-leucil-fenilalanina (FMLP) foi quantificada pela redução do citocromo C (Badwey, J. A. , Curnutte, J. T. e Karnovsky, M. L., ácidos gordos cis-poli-insaturados induzem altos níveis de produção de superóxido por neutrófilos humanos; J. Biol. Chem.. 256. 12640-12643, 1981). A 5 milhões de neutrófilos em 2,85 mL de tampão fosfato de Krebs-Ringer, pH = 7,2, foram adicionados 50 mL de inibidor (em DMSO a 10 %/tampão) e 50 μΙ> de ferricitocromo C (5 mH, armazém) foram adicionados e pré-incubados durante 3 minutos a 37 °C. As medidas de absorção a 550 nm foram registadas no início da pré-incubação. Foram adicionados 50 mL (6 μΜ, armazém) para iniciar a reacção. Foi atingido um patamar dentro de 3 minutos e esta leitura - leitura inicial (antes da adição de FMLP) foi usada para calcular os nanomoles de superóxido gerados com base num coeficiente de extinção 4 -1 -1 molar de 2,1 x 10 cm *mol

Isolamento de neutrófilos humanos:

Foram isolados neutrófilos humanos a partir de colheitas de sangue recente de dadores saudáveis. Dois mL de dextrano a 5 % (PM 200 000-300 000) em salina foi adicionado a alíquotas de 10 mL de sangue, misturados e colocados em reposo durante 45 min a 37 °C. Aproximadamente 8-10 mL de suspensão de glóbulos brancos do plasma da sedimentação de dextrano foram acamados em 3 mL de Ficol-paque num tubo de

26 Ρ

X / 15 mL e centrifugados a 400 g durante 30· minutos. 0 sobre-nadante, que continha plasma e plaquetas, foi separado por aspiração e o pelete, que continha predominantemente neutró-filos, foi ressuspenso em 1 mL de salina. A suspensão foi transferida para um tubo limpo e combinado com outros alíquotas de sangue tratado de modo semelhante. A suspensão combinada foi centrifugada a 350 g durante 5 min e o sobre-nadante foi separado. 0 pelete foi ressuspenso em 5 mL de NaCl a 0,05 % com uma pipeta de Pasteur plástica durante 25 segundos para lisar por contaminação os glóbulos vermelhos e, em seguida, foi adicionado 5 mL de NaCl a 1,75 % para recuperação da isotonicidade. O processo de lise dos glóbulos vermelhos foi repetido, as células suspensas em tampão apropriado (dependendo do ensaio) e contadas.

Para comparação, foi utilizado o composto de fórmula IV, um conhecido inibidor de 5-lipoxigenase descrito na U.S. 4 663 333.

(IV) ácido [2S*-[[3,5-bis(1,ldimetiletil)-4-hidroxifenil]-tio]-IR -metilpropoxi]acético (±)

Os resultados em relação a alguns compostos do presente invento são indicados na Tabela 1 seguinte: TABELA 1

Composto do Exemplo Número Inibição de 5-lipoxigenase ic50(mm) Efeito sobre superóxido induzido por FMLP 13 0,16 Estimulado a 1-50 μΜ (171 % > controlo) 14 0,22 a) Estimulado a 1-10 μΜ (171 % > controlo) b) Inibido a 25-50 μΜ (57 % < controlo) 15 0,13 a) Estimulado a 1-10 μΜ (38 % > controlo) b) Inibido a 50 μΜ (13 % < controlo) 16 0,16 a) Estimulado a 1-50 μΜ (146 % > controlo) b) Inibido a 50 μΜ (13 % < controlo) 17 0,20 Estimulado a 1-50 μΜ (60 % > controlo) 19 0,46 Estimulado a 1-50 μΜ (33 % > controlo) 20 0,40 a) Estimulado a 1-25 μΜ (135 % > controlo) b) Inibido a 50 μΜ (100 % < controlo) 21 0,15 Estimulado a 50 μΜ (46 % > controlo) 22 0,17 Estimulado a 50 μΜ (17 % > controlo) Fórmula IV 4,9 Geração de superóxido inibida IC50 = 11 m 28

Ao contrário dos compostos do presente invento que estimularam a geração de superóxido ou actuaram bifasicamente para estimular a geração de superóxido a doses mais baixas e inibir a geração de superóxido a doses mais altas, os compostos de Fórmula IV inibiram não só a geração de superóxido mas também a 5-lipoxigenase. Estes dados indicam que a geração de superóxido não depende da 5-lipoxigenase e que a capacidade de um composto de inibir a 5-lipoxigenase não está relacionada com a sua capacidade de estimular a geração de superóxido.

Os seguintes exemplos não limitativos ilustram ainda os detalhes para a preparação dos compostos utilizados na prática do presente invento. Os que são peritos na técnica compreenderão e apreciarão de pronto que variações conhecidas das condições e processos nos métodos preparativos seguintes podem ser utilizados. Todas as temperaturas estão em grau Celcius a menos que se indique de outra maneira. Os pontos de fusão foram determinados num aparelho de ponto de fusão de Thomas-Hoover e não estão corrigidos.

Os compostos do presente invento podem ser preparados a partir dos ácidos correspondentes como se mostra no Esquema A, em primeiro lugar pela reacção do ácido (III) com um cloreto apropriado para dar o cloreto de ácido (Illa) e em seguida pela reacção do cloreto de ácido com uma amina RH apropriada para produzir as amidas de fórmula I.

(III) KSOPEMA A R1

oxalilo de tionilo (IHa) M)

Exemplo 1 3,5-bjs(1.1-Dimetiletil)-4-hidroxifenil-tiocianato acH»)j

Hl

SCN C(CHj)) A um frasco de 5 L de fundo redondo de três tubuladuras, equipado com um agitador mecânico, entrada de gás, termómetro e saída de gás, foi adicionado 2,6-di-terc-butilfenol (474 g; 2,30 mol), tiocianato de amónio (76,12 g; 4,83 mol) e metanol 30

(1200 mL). A mistura de reacção foi agitada e arrefecida até 0 °C num banho de gelo/sal). Mantendo a temperatura em 0 até 10 °C, foi lentamente borbulhado cloro gasoso através da mistura durante cerca de 1 hora depois do que a mistura de reacção ficou de uma cor amarela heterogénea. Foi em seguida borbulhada amónia através da mistura de reacção durante cerca de 1/2 hora, mantendo a mistura de reacção a uma temperatura entre 0 e 10 °C. A mistura de reacção foi agitada durante mais 1 hora a 0 °C, vertida em 2 L de água destilada fria e refrigerada durante a noite. A fase aquosa foi decantada e o sólido foi recebido em metanol, precipitado por adição de água, filtrado e seco durante 2 dias sobre pentóxido de fósforo. O sólido amarelo gomoso resultante foi recristalizado a partir de pentano e seco in vacuo para dar o produto na forma de um pó branco; p.f. 61,5-63 °C.

Análise calculada para ci4H2iNSO:

Teoria: C - 68,40; H - 9,03; N - 5,32; S - 12,17;

Encontrado: C - 68,85; H - 8,05; N - 5,29; S - 12,12.

Exemplo 2 2.6-bis(1.l-Dimetiletil)-4-mercaptofenol

QCHj)j

SH 3,5-bis(l,i-Dimetiletil)-4-hidroxifenil-tiocianato (55 g; 0,209 mol) foi dissolvido em acetona (200 mL) sob uma atmosfera de árgon. Foi adicionada água (7,6 g; 0,42 mmol) e a mistura de reacção foi arrefecida até 0 °C. Foi adicionada gota 31 a gota ao longo de um período de 1 hora trietilfosfina (24,7 g; 0,209 mol) e, em seguida, a mistura de reacção foi deixada aquecer até à temperatura ambiente com agitação. A solução foi concentrada, os solventes foram removidos e o óleo resultante foi purificado por cromatografia sobre sílica. As fracções que continham o tiol foram combinadas e os solventes foram removidos para se obter um pó branco que foi recristalizado a partir de metanol/água e que foi seco para produzir 43,3 g do produto desejado. A análise por RMN confirmou a identidade do produto.

Exemplo 3

Ácido Γ Γ2-Γ Γ3,5-bis(1,1-dimetiletil)-4-hidroxifenill -tioletintiolacético. sal monossódico

J Ácido mercaptoacético (1,3 g; 0,0144 mol) foi adicionado a uma solução de etóxido de sódio, preparada a partir de sódio (0,66 g; 0,0228 mol) em álcool etílico (25 rnL). Após agitação durante 1 hora, foi adicionado de uma só vez l-bromo-2-cloroetano (6 mL; 0,072 mol) e a solução foi agitada durante 2 horas. Depois de refluxo durante 4 horas, o excesso de l-bromo-2-cloro-etano foi removido por um evaporador rotativo. Foi adicionado álcool etílico (50 mL) ao resíduo e o sal de sódio de 2,6--bis(1,1-dimetiletil)-4-mercaptofenol preparado a partir de sódio (0,33 g; 0,0144 mol) e 2,6-bis(1,1-dimetiletil)-4-mercaptofenol (3,43 g; 0,0144 mol) em álcool etílico (25 mL) foi adicionado por meio de uma cânula. Após agitação durante dezoito horas à 32 temperatura ambiente, a mistura foi refluxada durante 1 hora, arrefecida até à temperatura ambiente e foi adicionada água (50 mL) com agitação rápida. O álcool etílico foi removido com um evaporador rotativo. O resíduo aquoso foi extraído com acetato de etilo (2 x 100 mL), combinado, seco sobre sulfato de sódio, filtrado e concentrado. O resíduo foi cristalizado a partir de acetato de etilo/hexano. O sólido foi recristalizado a partir de acetato de etilo/hexano para dar o composto mencionado em título.

Análise calculada para ci3H27°3S2Na (378,54):

Calculado: C - 57,11 H - 7,19; S - 16,94;

Encontrado: C - 56,75; H - 7,24; S - 16,84.

Exemplo 4 Ácido Γ Γ2-Γ r3,5-bis(l,l-dimetiletil)-4-hidroxifenil,|-tioletilltiolacético

) O composto mencionado em título do Exemplo 3 (0,90 g) foi dissolvido em água (40 mL), acidificado com ácido clorídrico a 10 % e extraído para acetato de etilo (2 x 50 mL). Os extrac-tos combinados foram secos sobre sulfato de sódio, filtrados e concentrados utilizando um evaporador rotativo para dar um óleo. O óleo foi cristalizado a partir de hexano para dar o composto mencionado em título, p.f. ca. 86 °C. 18 28 3 2 C - 60,64 H - 7,92; S-17,98; C - 60,93; H - 7,87; S - 17,81.

Análise calculada para ci8H28°3S2 (356'54): Calculado: C - 60,64 H - 7,92; S - 1 Encontrado: C - 60,93; H - 7,87; S - 1

Exemplo 5 O composto mencionado em título do Exemplo 4 foi também preparado pelo processo do Exemplo 3 sem o isolamento do sal de sódio. A solução de acetato de etilo que continha o sal de sódio foi tratada com ácido clorídrico a 10 %, agitada durante 30 minutos e as camadas foram separadas. A camada orgânica foi seca sobre sulfato de sódio, filtrada e concentrada com um evaporador rotativo para dar um sólido que foi recristalizado a partir de hexano.

Análise calculada para C18H28°3S2 (356/54):

Calculado: C - 60,64 H - 7,92; S-17,98;

Encontrado: C - 60,73; H - 7,84; S - 17,92.

Exemplo 6 Ácido 3-ΓΓ2-ΓΓ3.5-bisl1.1-dimetiletiU-4-hidroxifenill-tioletilltiolpropanóico acH)>j

acHjjj 0 composto mencionado em título foi preparado de acordo com o método do Exemplo 5 a partir do ácido 3-mercaptopropiónico (6,1 g; 0,057 mol), sódio (3,9 g; 0,17 mol) , l-brómo-2-cloroetano (12,4 g; 0,086 mol) e 2,6-bis(l,l-dimetiletil)-4-mercaptofenol (13,7 g; 0,057 mol), purificado por cromatografia sobre sílica e recristalizado a partir de acetato de etilo/hexano, p.f. ca. 57,5 °C.

Analise calculada para c19II3o03S2 (370/6):

Calculado: C - 61,58 H - 8,16; S - 17,30;

Encontrado: C - 61,64; H - 7,89; S - 17,32.

Exemplo 7 2,6-bis(1,1-Dimetiletil) -4-Γ(2-hidroxi-l-metilpropil)-tiolfenol

r0" CHj 2,6-bis(l,1-Dimetiletil)-4-mercaptofenol (18,2 g; 0,076 mol) foi adicionado a uma solução de etóxido de sódio, preparada recentemente a partir de sódio (3,5 g; 0,15 mol) em álcool etílico (100 mL) e agitado durante 1 hora. Após arrefecimento até 5 °C com um banho de gelo, foi adicionado trans-2,3--epoxibutano (5,0 g; 0,069 mol) e o banho de gelo foi removido. Após agitação durante 5,5 horas, a mistura de reacção foi vertida em ácido clorídrico a 10 % (50 mL) . 0 álcool etílico foi removido utilizando um evaporador rotativo e o resíduo aquoso foi extraído com acetato de etilo (2 x 75 mL) . Os extractos foram combinados, secos sobre sulfato de sódio, filtrados e concentrados até um óleo laranja. O produto foi purificado por 35

cromatografia sobre silica para dar um sólido F ^amalrelo que foi recristalizado a partir de hexano para dar um sólido branco, p.f. ca. 73 °C.

Análise calculada para C28H30°2S (310'5):

Calculado: C - 69,63 H - 9,74; S - 10,33;

Encontrado: C - 69,75; H - 9,60; S - 10,35.

Exemplo 8 f f 2 — ΓΓ3,5-bis(1,1-Dimetiletil)-4-hidroxifenintiol-1--metilpropilltiolacetato de metilo

0 composto mencionado em título do Exemplo 7 (3,5 g; 0,0112 mol) foi adicionado a ácido trifluoroacético (4 mL) e agitado durante 1 hora. 0 tioglicolato de metilo (1 mL; 0,0112 mol) foi adicionado, a mistura de reacção foi agitada durante 2,5 horas e, em seguida, foi vertida em água (100 mL) e acetato de etilo (25 mL). Após 18 horas, as camadas foram separadas e a camada orgânica foi concentrada para dar 5,6 g de um óleo. O produto foi purificado por cromatografia sobre sílica.

Análise calculada para C2iH34°3S2 (398/l):

Calculado: C — 63,28 H - 8,60; S - 16,09;

Encontrado: C - 63,17; H - 8,70; S - 16,15. 36

Exemplo 9 - v . Ácido f f2-Γ f3 >5-bis(1,l-dimetiletill-4-hidroxifenill- tiol-l-metilpropin tiolacético acHj),

COjH

Hidróxido de litio mono-hidrato (0,20 g; 0,0035 mol) foi adicionado a uma solução do composto mencionado em título do Exemplo 8 (1,16 g; 0,0029 mol) em álcool metílico (35 mL) e água (10 mL). Quando a mistura de reacção se tornou límpida, foi adicionada mais água. A mistura de reacção foi acidificada com ácido clorídrico a dez porcento. 0 álcool metílico foi removido utilizando um evaporador rotativo e o resíduo foi extraído com acetato de etilo. 0 extracto de acetato de etilo foi seco sobre sulfato de sódio, filtrado e concentrado. O produto foi purificado por cromatografia sobre sílica.

Análise calculada para C Calculado: C - 62,46 Encontrado: C - 62,33 20H32°3S2 <384'6> H - 8,39; S - ; H - 8,22; S - 16,67; 16,37. i 37

2.6-bis(1.1-Dimetiletil)-4-Γ(2-hidroxietil)tiolfenol

-OH

Trietilamina (0,42 g; 0,0042 mol), 2-bromoetanol (0,52 g; 0,0044 mol) e o composto mencionado em título do Exemplo 2 (1,0 g; 0,0042 mol) foram agitados em cloreto de metileno (50 mL) durante 20 horas. A mistura de reacção foi condensada e foi adicionado acetato de etilo (25 mL) ao resíduo. Após filtração do sólido branco, o filtrado foi concentrado e o produto foi purificado por cromatografia sobre sílica, p.f. ca. 66 °C.

Análise calculada para

Calculado: Encontrado: C - 68,04 C - 67,98;

H H

02S (282,4) -9,28; S -9,20; S 11,35; 11,24.

I

Exemplo li Ácido Γ2-Γ Γ3,5-bis(1.1-dimetiletil)-4-hidroxifenill-•bjol etoxil acético

COjH Ácido cloroacético (1,88 g) foi adicionado a uma solução do produto do Exemplo 10 (5,64 g) em álcool terc-butíli-co. Foi adicionado tert-butóxido de potássio (8,96 g) e a mistura foi refluxada durante 22 horas. A mistura de reacção foi tornada básica com bicarbonato de sódio a 5 % e extraída com éter etílico (3 x 50 mL). Os extractos de NaHC03 foram acidificados até cerca de pH = 2 com HCl 1 N e extraídos 3 vezes com éter etílico (100 mL). Os extractos orgânicos combinados foram lavados duas vezes com água, duas vezes com água salgada saturada, secos sobre sulfato de sódio e o solvente foi removido utilizando um evaporador rotativo para dar o produto impuro. o produto foi purificado por cromatografia sobre sílica, p.f. ca. 86 °C.

Análise calculada para (340,47):

Calculado: C - 63,50 H - 8,29; S - 9,42;

Encontrado: C - 63,52; H - 8,02; S - 9,46.

Exemplo 12 Ácido T2S*-rr3.5-bis(1.1-dimetiletil)-4-hidroxifenill-tiol-lR -metilpropoxilacético (±)

(a) Partindo com o 2,6-bis(l,1-dimetiletil)-4-[(2-hi-droxi-l-metilpropil)tio]fenol do Exemplo 7 e utilizando o método do Exemplo 11, obteve-se o composto mencionado em título, p.f. ca. 89-92 °C; esp. massa 368 (M+). (b) Num método alternativo, um recipiente seco purgado de árgon foi carregado com 1,6 kg de hidreto de sódio (dispersão a 60 % em óleo) que foi em seguida lavado três vezes com um total de 21 kg de n-heptano. 0 recipiente de reacção foi arrefecido até -20 °C e foi adicionado sob árgon 41 L de tetra-hidrofurano •Jj»

seco. Uma solução de 4 kg de 2,6-bis(1,1-dimetiletil)-4-[(2S --hidroxi-lR -metilpropil)tio]fenol (±) em 16 L de tetra-hidrofurano foi lentamente adicionada à suspensão de hidreto de sódio e a mistura foi aquecida até 0-5 °C e agitada durante 1,5 hora. 0 tetra-hidrofurano foi removido a pressão reduzida e foi adicionado sob árgon 12 L de dimetilsulfóxido. Foi adicionada uma solução de 1,9 kg de cloroacetato de sódio em 40 L de dimetilsul-fóxido e a mistura de reacção foi agitada à temperatura ambiente durante aproximadamente 15 horas. Quando a reacção se completou, conforme indicado por cromatografia de camada fina, a mistura de reacção foi adicionada a aproximadamente 178 L de água a 5-10 °C e a solução aquosa foi extraída duas vezes com um total de 60 L 40 40

de n-heptano. A fase aquosa foi acidificada- · còm 14 L de ácido clorídrico 4 N e extraída três vezes com um total de 95 L de acetato de etilo. A fase orgânica combinada foi lavada duas vezes com um total de 74 L de água e uma vez com 20 L de solução aquosa saturada de cloreto de sódio. A fase orgânica foi seca sobre 2,0 kg de sulfato de magnésio anidro, filtrada e o solvente foi removido por destilação sob pressão reduzida. O produto foi dissolvido em 40 L de n-hexano em refluxo e a solução foi arrefecida até à temperatura ambiente. 0 produto foi recolhido por filtração, lavado duas vezes com um total de 20 L de n-hexano e seco â temperatura ambiente num forno de vácuo para dar 4,27 kg (90 % do teórico) de ácido [2S -[[3,5-bis(l,l-dimetil-etil)-4-hi- •jç droxifenil]tio]-lR -metilpropoxi]acético (±) (primeira recolha). 0 filtrado de hexano foi concentrado sob vácuo para dar um adicional de 0,23 kg de produto (4,80 % do teórico).

Exemplo 13 2-Γ Γ2-Γ r3.5-bis(1,1-Dimetiletil)-4-hidroxifenilltiol-etilltiol-N-(2-piridinilmetil)acetamida

Foi adicionado por meio de seringa cloreto de oxalilo (0,39 g; 0,0031 mol) a uma solução do composto mencionado em título do Exemplo 4 (1,0 g; 0,0028 mol) em benzeno (50 mL) e agitado à temperatura ambiente durante 20 horas. A solução foi 41

concentrada por evaporador rotativo sob pressão .reduzida até um óleo que foi dissolvido em tetra-hidrofurano (50 mL). 2-(Amino-metil)piridina (0,30 g; 0,0028 mol) e trietilamina (0,5 mL) foram ambas adicionadas e a solução foi agitada durante 4 dias. 0 hidrocloreto de trietilamina foi removido por filtração e o filtrado foi concentrado por um evaporador rotativo até um óleo. O composto mencionado em titulo foi purificado por cromatografia sobre gel de sílica. A estrutura atribuída foi suportada por RMN, espectro de infravermelho e análise elementar (446,7).

Análise calculada para C24H34N2°2S2:

Calculado: C - 64,54 H - 7,67; N - 6,27;

Encontrado: C - 64,39; H - 7,58; N - 6,37.

Exemplo 14 2S*- Γ2- Γ Γ 3.5-bis (1,1-Dimetiletil) -4-hidroxifenintiol--lR*-metilpropoxil -N-metil-N- Γ2- (2-piridinil) etiDace-tamida (t)

0 composto mencionado em título foi preparado pelo método do Exemplo 13 mas substituindo Exemplo 4 por Exemplo 12 e 2-(aminometil)piridina por 2-(2-metilaminoetil)piridina. Depois de cromatografia sobre gel de sílica o produto cru foi convertido para o sal hidrocloreto por adição de cloreto de hidrogénio

gasoso a uma solução de éter etílico. Esta solução foi concen trada para um óleo com um evaporador rotativo. Este óleo foi dissolvido em água (10 mL), a solução foi tornada básica com hidrogeno carbonato de sódio e extraída com acetato de etilo. A solução de acetato de etilo foi seca sobre sulfato de sódio, filtrada e concentrada com um evaporador rotativo até um óleo. Uma purificação por cromatografia sobre gel de sílica produziu o composto mencionado em título. A estrutura atribuída foi suportada por espectrometria de massa e análise elementar (486,7).

N - 5,76; N - 5,85.

Análise calculada para C28H42N2°3S: Calculado: C - 69,10 H-8,70;

Encontrado: C - 68,94; H - 8,48;

Exemplo 15 2-ΓΓ2-ΓΓ3,5-bis(l,l-Dimetiletil)-4-hidroxifenilltiol-etilltiol-N-(3-piridinilmetil)acetamida

0 composto mencionado em título foi preparado pelo método do Exemplo 13 pela substituição de 2-(aminometil)piridina por 3-(aminometil)piridina. Uma purificação por cromatografia sobre gel de sílica produziu um sólido que foi recristalizado a partir de acetato de etilo/hexano, DEC ca. 122 °C. A estrutura atribuída foi suportada por RMN, espectro de: infravermelho e análise elementar (446,7).

Análise calculada para C24H34N2°2S2:

Calculado: C - 64,54 H - 7,67; N - 6,27;

Encontrado: C - 64,44; H - 7,65; N - 6,28.

Exemplo 16 3-ΓΓ2-ΓΓ3,5-bis(1,1-Dimetiletil)-4-hidroxifenilltiol-etilltiol-N-metil-N-Γ2-(2-piridinil)etillpropanamida

0 composto mencionado em título foi preparado pelo método do Exemplo 13 pela substituição de Exemplo 4 por Exemplo 6 e 2-(aminometil)piridina por 2-(2-metilaminoetil)piridina. A estrutura atribuída foi suportada por RMN, espectro de infravermelho e análise elementar (488,8).

Análise calculada para C27H40N2°2^2:

Calculado: C - 66,35 H - 8,25; N - 5,73;

Encontrado: C - 66,25; H-7,86; N - 5,69.

Exemplo 17 2S*-r Γ Γ2-Γ Γ3,5-bis (1.1-Dimetiletil) -4-hidroxif enill -tiol-IR ~metilpropil‘)tiol-N- (4-píridinilmetil) acetamida iil

O composto mencionado em título foi preparado pelo método do Exemplo 13 pela substituição do Exemplo 4 por Exemplo 9 e 2-(aminometil)piridina por 4-(aminometil)piridina. A estrutura atribuída foi suportada por RMN, espectro de infravermelho e análise elementar (474,7).

Análise calculada para C26H3gN202S2:

Calculado: C - 65,78 H - 8,07; N - 5,90;

Encontrado: c - 65,57; H - 7,83; N - 5,88.

Exemplo 18 1-Γ2-Γ2-ΓΓ3,5-bis(1.1-Dimetiletil)-4-hidroxifenintiol etoxi-l-oxoetill-4-lmetilpiperazina

o

\

CH a

Foi adicionado cloreto de oxalilo (1,55 g; 0,0122 mol) a uma solução fria (0 °C) do composto mencionado em título do Exemplo 11 (0,50 g; 0,00148 mol) em benzeno (5 mL). A mistura de reacção foi agitada a frio durante 5 minutos e à temperatura ambiente durante mais 40 minutos e, em seguida, concentrada até um óleo com uma corrente suave de azoto gasoso. O resíduo foi dissolvido em cloreto de metileno (5 mL). A esta solução em agitação foi adicionado N-metilpiperazina (0,163 g; 0,00148 mol) e trietilamina (0,2 mL; 0,00148 mol) e a mistura de reacção foi agitada durante a noite à temperatura ambiente. Foi adicionada agua (5 mL) e as camadas foram separadas. A camada orgânica foi lavada com água, seca sobre sulfato de magnésio anidro e concentrada até um óleo. 0 óleo foi purificado por cromatografia sobre gel de sílica e recristalizado a partir de hexano, DSC ca. 83 °C. A estrutura atribuída foi suportada por RMN, espectro de infravermelho e análise elementar (422,6).

Análise calculada para C„_H_o0_N_S: 2 ó jo ó 2*

Calculado: C - 66,37 H - 9,06; N - 6,63; S - 7,59;

Encontrado: C - 65,53; H - 9,26; N - 6,59; S - 7,77. 46

Exemplo 19 1-Γ2-Γ23*-Γ Γ3,5-bis(1,1-Dimetiletil)-4-hidroxifenin- «j^· tiol-lR -πιβίίΐΡΓθΡθχϊ1-ΐ-οχο6ίί1·|-4- (fenilmetil)pipe-razina

0 composto mencionado em título do Exemplo 12 (1,0 g; 0,0027 mol) foi adicionado a cloreto de tionilo (0,6 mL; 0,0081 mol) e agitada à temperatura ambiente durante 20 horas. Foi adicionado tolueno (50 mL) e a mistura de reacção foi concentrada por evaporador rotativo a pressão reduzida. 0 processo foi repetido com cloreto de metileno (50 mL) . 0 resíduo foi dissolvido em cloreto de metileno (50 mL). Com agitação, foi adicionada gota a gota uma solução de 1-benzilpiperazina (0,47 g; 0,0027 mol) em cloreto de metileno (10 mL) seguida por trietil-amina (2 mL). A solução foi agitada à temperatura ambiente durante 20 horas e concentrada até um óleo com uma corrente suave de azoto gasoso. 0 resíduo foi dissolvido em acetato de etilo, filtrado e concentrado por um evaporador rotativo sob pressão reduzida até um óleo que foi purificado por cromatografia sobre gel de sílica. A estrutura atribuída foi suportada por RMN, espectro de infravermelho e espectrometria de massa. 47

Exemplo 20 1-Γ2-ΓΓ2-ΓΓ3,5-bis(1.1-Dimetiletil)-4-hidroxifenill-tio]etilltiol-1-oxoetill -4-metilpjperazina

\ CH,

Foi adicionado por meio de seringa cloreto de oxalilo (0,39 g; 0,0031 mol) ao composto mencionado em título do Exemplo 4 (1,0 g; 0,0028 mol) em benzeno (50 mL) e a mistura de reacção foi agitada à temperatura ambiente durante 20 horas. A mistura de reacção foi concentrada com um evaporador rotativo sob pressão reduzida até um óleo que foi dissolvido em tetra-hidrofurano (THF) (50 mL) . Uma solução de 1-metilpiperazina (0,28 g; 0,0028 mol) em tetra-hidrofurano (10 mL) foi adicionada gota a gota seguida por trietilamina (0,5 mL) e a solução resultante foi agitada à temperatura ambiente durante 20 horas. 0 hidrocloreto de trietilamina foi removido por filtração e a solução ' foi concentrada. 0 óleo resultante foi purificado por cromatografia sobre gel de sílica. A estrutura atribuída foi suportada por KMN, espectro de infravermelho e análise elementar (438,7).

Análise calculada para c23H3gN202S2:

Calculado: C - 62,97 H - 8,73; N - 6,39;

Encontrado: C - 62,68; H - 8,45; N - 6,34. 48 48

Exemolo 21 1-Γ3-Γ Γ2 — ΓΓ3,5-bis(1,1-Dimetiletil)-4-hidroxifenin-tioletilltiol-Ι-οχοργορϊΙ]-4-(l-piperidinillpiperidina

0 composto mencionado em título foi preparado pelo método do Exemplo 20 substituindo o composto do Exemplo 4 pelo composto do Exemplo 6 e 1-metilpiperazina por 4-piperidinopipera-zina. A estrutura atribuída foi suportada por RMN, espectrosco-pia de infravermelho e de massa e análise elementar (520,85).

Análise calculada para C„.H.oN.0„S : y 4 o Δ Δ £

Calculado: C - 66,88 H - 9,29; N - 5,38; Encontrado: C - 66,86; H - 9,61; N - 5,49.

I 49 49

Exemplo 22 1-(4-acetilfenil)-4-Γ2-Γ r2S*-r Γ3.5-bis(1,1-Dimetil- * -etil)-4-hidroxifenintiol-lR -metilpropilltiol-l--oxoetillpiperazina (í)

0 composto mencionado em título foi preparado pelo método do Exemplo 20 substituindo o composto do Exemplo 4 pelo composto do Exemplo 9 e l-metilpiperazina por 4'-piperazinoaceto-fenona. A estrutura atribuída foi suportada por RMN, espectros-copia de infravermelho e de massa.

>

Claims (9)

1. REIVINDICAÇÕES: lâ. Processo para a preparação de um composto de fórmula:

   12 , em que R e R são iguais ou diferentes e, independentemente, representam tert-alquilo ou fenilo, Alk1 representa alquileno de cadeia linear ou ramificada de 1 até 10 átomos de carbono, X . . 2 representa enxofre ou oxigénio, Alk representa alquileno de cadeia linear ou ramificada de 1 até 4 átomos de carbono; m é 0, 1 ou 2; e R representa RJ

   a) b) R* g em que Y representa CH, N, O ou S; R representa hidrogénio, alquilo inferior, fenilo, fenilo substituído, benzilo, benzilo 7 substituído ou uma amina heterociclica e R representa hidrogénio ou alquilo de 1 até 4 átomos de carbono; ou de um seu sal ou estereoisómero ou isómero geométrico farmaceuticamente aceitável; caracterizado por compreender a reacção do ácido (III):

   (III) com um cloreto apropriado (por exemplo cloreto de oxalilo ou cloreto de tionilo) de modo a obter-se o cloreto de ácido apropriado (Illa):

   e, em seguida a reacção com uma amina apropriada RH a fim de se obter uma amida de fórmula (I).

   2¾. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracte-rizado por .se obter um composto de fórmula:

   R ou um seu sal ou estereisoómero ou isómero geométrico farmaceuti- 8 9 camente aceitável, em que R e R são iguais ou diferentes e representam hidrogénio ou alquilo de 1 até 4 átomos de carbono, X representa enxofre ou oxigénio e R representa a) R* / 3 em que R representa hidrogénio ou alquilo de 1 até 4 átomos de 3 . . . * . carbono, Alk representa alquileno de cadeia linear ou ramificada

   Alk3

   •R* 4 de 1 até 4 átomos de carbono e R representa hidrogénio ou alquilo de 1 até 4 átomos de carbono; ou b)

   Rr 6 em que Y representa CH, N, 0 ou S; R representa hidrogénio, alquilo inferior, fenilo, fenilo substituído, benzilo, benzilo . . 7 substituído ou uma amina heterocíclica e R representa hidrogénio ou alquilo de 1 até 4 átomos de carbono. 3®. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracte-. 1 2 nzado por R e R representarem tert-alquilo. 4 a. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracte-rizado por se preparar a 2-[[2-[3,5-bis(l,l-dimetiletil)-4-hidro-xifenil]tio]etil]tio]-N-(2-piridinilmetil)acetamida.
2. 52. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracte-rizado por se preparar a 2S -[2-[[3,5-bis(1,1-dimetiletil)-4-hi-droxifenil]tio]-IR -metilpropoxi]-N-metil-N-[2-(2-piridinil)-etil]acetamida (±).
3. 62. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracte-rizado por se preparar a 2-[[2—[[3,5-bis(l,l-dimetiletil)-4-hi-droxifenil]tio]etil]tio]-N-(3-piridinilmetil)acetamida.
4. 72. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracte-rizado por se preparar a 3-[[2-[[3,5-bis(1,1-dimetiletil)-4-hi-droxifenil]tio]etil]tio]-N-metil-N-[2-(2-piridinil)etil]propana-mida.
5. 82. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracte-rizado por se preparar a 2S -[[[2-[[3,5-bis(1,1-dimetiletil)-4--hidroxifenil]tio]-IR -metilpropil]tio]-N-(4-piridinilmetil)acetamida (±) . 54 -

   9s. Processo de acordo com a reivindicáçãò 1, caracte-rizado por se preparar a l-[2-[2-[(3,5-bis(l,l-dimetiletil)-4-hi-droxifenil]tio]etoxi-l-oxoetil]-4-metilpiperazina. 10a. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracte-rizado por se preparar a l-[2-[2S*-[[3,5-bis(l,l-dimetiletil)-4--hidroxifenil]tio]-IR -metilpropoxi]-1-oxoetil]-4-(fenilmetil)pi-perazina (±). llâ. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracte-rizado por se preparar a l-[2-[[2-[[3,5-bis(1,1-dimetiletil)-4--hidroxifenil]tio]etil]tio]-1-oxoetil]-4-metilpiperazina. 123. processo de acordo com a reivindicação l, caracte-rizado por se preparar a 1-[3-[[2-[[3,5-bis(1,1-dimetiletil)-4--hidroxifenil]tio]etil]tio]-l-oxopropil]-4-(1-piperidinil)piperi-dina.
6. 133. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracte- rizado por se preparar a l-(4-acetilfenil)-4-[2-[[2S -[[3,5-bis- . . . . * . (1,1-dimetiletil)-4-hidroxifenil]tio]-IR -metilpropil]tio]-l-oxo-etil]piperazina (±).
7. 143. Processo para a preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento de condições de inflamação e de alergia, caracterizado por se incluir na referida composição uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto de acordo com a reivindicação 1, juntamente com um agente de suporte farmaceuti-camente aceitável.
8. 153. Processo para a preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento de condições de inflamação e de alergia, caracterizado por se incluir na referida composição uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto de acordo com a reivindicação 2, juntamente com um agente de suporte farmaceuti-camente aceitável. 16a. Processo de acordo com a reivindicação 14, carac-terizado por o referido composto ser escolhido de entre o grupo constituído por 2—[[2—[3,5-bis(1,1-dimetiletil)-4-hidroxifenil]tio]etil]tio]-N--(2-piridinilmetil)acetamida; & λ 2S -[2-[[3,5-bis(1,1-dimetiletil)-4-hidroxifenil]tio]-IR -metil- propoxi]-N-metil-N-[2-(2-piridinil)etil]acetamida (±); 2- [[2—[[3,5-bis(1,1-dimetiletil)-4-hidroxifenil]tio]etil]tio]-N--(3-piridinilmetil)acetamida; 3- [[2-[[3,5-bis(1,1-dimetiletil)-4-hidroxifenil]tio]etil]tio]-N--metil-N-[2-(2-piridinil)etil]propanamida; 2S -[[[2-[[3,5-bis(1,1-dimetiletil)-4-hidroxifenil]tio]-IR -me-tilpropil]tio]-N-(4-piridinilmetil)acetamida (±); 1-[2-[2-[(3,5-bis(1,1-dimetiletil)-4-hidroxifenil]tio]etoxi-1--oxoetil]-4-metilpiperazina; l-[2-[2S -[[3,5-bis(1,1-dimetiletil)-4-hidroxifenil]tio]-IR -me- tilpropoxi]-l-oxoetil]-4-(fenilmetil)piperazina (±); 1-[2-[[2-[[3,5-bis(1,1-dimetiletil)-4-hidroxifenil]tio)etil]tio]- -1-oxoetil]-4-metilpiperazina; 56 - λ ι ι

   1-[3-[ [2- [ [3,5-bis (1, l-dimetiletil) -4-hidroxi'ffenir]tio]etil]tio]--1-oxopropil]-4-(1-piperidinil)piperidina; e l-(4-acetilfenil)—4—[2—[[2S*-[[3,5-bis(l,l-dimetiletil)-4-hidro-xifenil]tio]-lR -metilpropil]tio]-l-oxoetil]pipera2ina (±).. 17a. Método de tratamento de uma condição inflamatória ou alérgica, caracterizado por compreender a administração a um mamífero com necessidade de tal tratamento de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto de acordo com a reivindicação 1; sendo a gama de dosagem de composto activo de cerca de 0,1 mg por quilograma de peso corporal por dia até cerca de 100 mg por quilograma de peso corporal por dia, em especial desde cerca de 0,5 mg por quilograma de peso corporal por dia até cerca de 50 mg por quilograma de peso corporal por dia. 18a. Método de tratamento de uma condição inflamatória ou alérgica, caracterizado por compreender a administração a um mamífero com necessidade de tal tratamento de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto de acordo com a reivindicação 2; β J sendo a gama de dosagem de composto activo de cerca de 0,1 mg por quilograma de peso corporal por dia até cerca de 100 mg por quilograma de peso corporal por dia, em especial desde cerca de 0,5 mg por quilograma de peso corporal por dia até cerca de 50 mg por quilograma de peso corporal por dia. 19a. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por o referido composto ser escolhido de entre o grupo constituído por 57 - * i * t

   2-[ [2- [3,5-bis (1,1-dimetiletil) -4-hidroxif eriil;] tio] etil] tio]-N--(2-piridinilmetil)acetamida; A ^ 2S -[2-[[3,5-bis(1,1-dimetiletil)-4-hidroxifenil)tio]-IR -metil-propoxi]-N-metil-N-[2-(2-piridinil)etil]acetamida (±); 2- [[2-[[3,5-bis(1,1-dimetiletil)-4-hidroxifenil]tio]etil]tio]-N--(3-piridinilmetil)acetamida; 3— [[2—[[3,5-bis(1,1-dimetiletil)-4-hidroxifenil]tio]etil]tio]-N--metil-N-[2-(2-piridinil)etil]propanamida; 2S*-[[[2-[[3,5-bis(l,l-dimetiletil)-4-hidroxifenil]tio]-lR*-me-tilpropil]tio]-N-(4-piridinilmetil)acetamida (±); 1-[2-[2-[(3,5-bis(1,1-dimetiletil)-4-hidroxifenil]tio]etoxi-1--oxoetil]-4-metilpiperazina; 1-[2-[2S*-[[3,5-bis(1,1-dimetiletil)-4-hidroxifenil]tio]-lR*-me-tilpropoxi]-l-oxoetil]-4-(fenilmetil)piperazina (±); 1-[2-[[2-[[3,5-bis(1,1-dimetiletil)-4-hidroxifenil]tio]etil]tio]--1-oxoetil]-4-metilpiperaz ina; 1—[3—[[2—[[3,5-bis(1,1-dimetiletil)-4-hidroxifenil]tio]etil]tio]- -l-oxopropil]-4-(l-piperidinil)piperidina; e 1-(4-acetilfenil)-4-[2-[[2S*-[[3,5-bis(1,1-dimetiletil)-4-hidro- j· xifenil]tio]-IR -metilpropil]tio]-1-oxoetil]piperazina (±). 20a. Método de inibição da 5-lipoxigenase, caracteriza-do por compreender a administração a um mamífero com necessidade «► «. ϊ V

   de tal tratamento de uma quantidade terapeuticãmentè eficaz de um composto de acordo com a reivindicação 1; sendo a gama de dosagem de composto activo de cerca de 0,1 mg por quilograma de peso corporal por dia até cerca de 100 mg por quilograma de peso corporal por dia, em especial desde cerca de 0,5 mg por quilograma de peso corporal por dia até cerca de 50 mg por quilograma de peso corporal por dia. 21â. Método de tratamento da asma, caracterizado por compreender a administração a um mamífero com necessidade de tal tratamento de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto de acordo com a reivindicação 1.
9. 222. Método de tratamento da psoríase, caracterizado por compreender a administração a um mamífero com necessidade de tal tratamento de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto de acordo com a reivindicação 1; sendo a gama de dosagem de composto activo de cerca de 0,1 mg por quilograma de peso corporal por dia até cerca de 100 mg por quilograma de peso corporal por dia, em especial desde cerca de 0,5 mg por quilograma de peso corporal por dia até cerca de 50 mg por quilograma de peso corporal por dia. 23s. Método de modulação da geração de superóxido, caracterizado por compreender a administração a um animal com necessidade de tal tratamento de uma quantidade de um composto de acordo com a reivindicação 1 que é eficaz para estimular ou inibir a geração de superóxido; sendo a gama de dosagem de composto activo de cerca de 0,1 mg por quilograma de peso corporal por dia até cerca de 100 mg por 59 quilograma de peso corporal por dia, em especial desde cerca de 0,5 mg por quilograma de peso corporal por dia até cerca de 50 mg por quilograma de peso corporal por dia. Lisboa, 5 de Setembro de 1991

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