PT98901A - Processo para a preparacao de dioxabiciclo-octanos uteis como inibidores da esqualeno-sintetase - Google Patents

Description

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A hipercolesterolemia é conhecida por ser um dos factores de risco mais importantes para a isquémia cardiovascular tal como a arteriosclerose. Têm sido usados sequestrantes do ácido da bílis para tratar estes sintomas; em princíopio eles tem uma efectividade moderada mas por outro lado podem ser consumidos em grandes quantidades, i. é. vários gramas de cada vez mas por outro lado eles não são muito saborosos MEVACOR (lovastatina), que se encontra agora comercialmente disponível é um dos grupos de agentes de larga activi-dade anti hiper colesterolémica que funcionam através da limitação da bio-síntese do colesterol pela inibição do enzima, HMG-CoA reductase. A esqualeno-sintetase é o enzima envolvido no primeiro passo praticado na nova via bio-sintética do colesterol. Este enzima catalisa a dimerização reductiva de duas moléculas de pirosfosfato de farnesilo para formar o esqualeno. A inibição deste passo praticado em relação ao colesterol deve deixar desimpedidas as vias bio-sintéticas para a ubiquinona, o dolicol e o isopentil-t-RNA.

Nas primeiras tentativas para a inibição da esqualeno--sintetase foram empregues compostos contendo pirofosfato ou análogo de pirofosfato tais como os que são descritos em Ortiz de Montellano et al, J. Med. Chem., 20, 243 (1977) e E.J. Corey e R. Volante, J. Am. Chem. Soc., 98, 1291 (1976). S. Biller (patente U.S. 4.871.721) que descreve fosfonatos (fosfinilmetil) isopre-noides como inibidores da esqualeno-sintetase. Μ Α presente invenção fornece inibidores da esqualeno--sintetase que não contêm fósforo.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se aos novos compostos de I fórmula estrutural (I) os quais são inibidores da esqualeno-sin- tetase:

nos quais Ζχ/ z2 e z3 sao cada um independentemente seleccionados a partir de: 1

a) H; b) c1_5 alquilo; c) 01-5 alquilo substituído por um membro do grupo consistindo em: i) fenilo; ii) fenilo substituído por metilo, metoxi, halogé-neo (Cl, Br, F, I) ou hidroxi; ou um sal farmaceuticamente aceitável de um composto de fórmula (I).

Uma execução do presente invento traduz-se nos compostos de fórmula (I) em que a configuração estrereoquímica relativa do anel do 2/8-dioxabiciclo[3.2.1]octano apresenta-se tal como é revelado abaixo:

O

Através desta descrição e reivindicações na quais a estereoquimicidade é descrita para o anel dioxabiciclo[3.2.1.]oc-tano a configaração implícita é relativa. A actual configaração pode ser tal como é demonstrada ou a do seu enantiómero. Ainda ilustrando esta execução apresentam-se os compostos da fórmula estrutural (I) nos quais a configuração relativa nas posições 3, 6 e 7 tal como é mostrada a seguir: ο

co2z3

Numa classe desta execução estão aqueles compostos de estrutura (I) nos quais a configuração relativa nas posições 4 é tal como é revelada abaixo:

O

Como exemplo desta classe encontra-se o composto no qual Z^, Z^ e Z^ são cada um hidrogénio ou um seu sal -7- farmacêuticamente aceitável. 0 composto no qual Z^, Z^ e Z3 são cada um hidrogénio é referido daqui para a frente como Composto A.

Ilustrando ainda melhor esta classe encontram-se aqueles compostos nos quais Z^, Z2 e Z^ ê C^_5 alquilo ou C^_g alquilo substituído por fenilo ou fenilo substituído dos quais o substituinte é metilo, metoxi, halogéneo ou hidróxi. Numa ilustração específica, Z, Z^ e Z3 são cada um metilo. Este composto é doravante referido como Composto B.

Os compostos de fórmula (I) são preparados com um procedimento de fermentação empregando uma cultura fúngica nova, MF5465, identificada como Leptodontium elatius. Embora o uso deste organismo seja especificamente descrito aqui, outras espécies do género Leptodontium elatius incluindo mutantes do organismo descrito atrás são igualmente capazes de produzir os compostos desta invenção. A cultura MF5465 é a de um fungo, lignicolous Hyphomy-cete Leptodontium elatius, isolado a partir da madeira na Joyce Kilmer Memorial Forest na Carolina do Norte. Esta cultura foi depositada na American Type Culture Collection na 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852 como ATCC 74011. A cultura MF5465, identificada como Leptodontium elatius revela as seguintes características morfológicas.

Colónias atingindo 12 a 15 mm em 7 dias em Agar de farinha de aveia (Difco), quer com micélios aéreos quer submergidos. A superfície da colónia é plana a comprimida vista de lado, minuciosamente aveludada com um brilho metálico em direcção às margens, baço em direcção ao centro, hialino na margem, mas depressa se tornando em cinzento claro para escuro e por fim preto desenvolvendo muitas vezes uma cor olivácea com o tempo, Cinzento Neutral Pálido, cinzento Gaivota Claro, Cinzento Gaivota Forte, Cinzento Gaivota Escuro, Cinzento Ardósia, Cinzento Azeitona Forte, (as cores em letras maiúsculas são de Rigway, R. 1912. Color standards and Nomenclature, Washington, D.C.) com uma pigmentação inversa semelhante, sem pigmentos ou cheiros de exudatos difusíveis.

As células holoblãsticas conidiogéneas, resultando como as células terminais dos conidióforos relativamente indiferenciados, com terminais afunilados, subulados, com o loci conidiogéno confinado ao pico extremo. Ocasionalmente com o loci conidiogéno indiferenciado directamente na hifa vegetativa. Conidias desenvolvidas aderem ao terminal conidioforo em ráquis finos, irregulares a escadeados em grupos de 4 a 15 conidias. Conidióforas surgindo , sob a forma de ramos indiferenciados em ângulos rectos ou ligeiramente agudos da hifa vegetativa, alongando-se gradualmente, mantendo-se simples ou formando pontas com 1 a 3 ramos, normalmente agrupados em pequenos grupos quando vistos de cima, 1 a 3 septos, cilíndricos a cónicos com picos aguçados hialinos quando novos mas desenvolvendo pigmentos oliváceos a cinzento azeitona desde a base até cima com o tempo, com paredes ligeiramente mais finas dos que as da hifa vegetativa, 20-65 x 3-5 jiim. As conidias formam-se abundantemente em meios comuns tais como em agar de farinha de aveia, extracto de malte, ou farinha de milho, 3,5-5 jum x 1-2 μιη, aseptato, suave, de paredes finas, alantoide, sub-alantoide, a cilíndrico, ou elípticamente afuniladoo, muitas vezes com uma marca proximal ou um apíiculo, sem qualquer material viscoso ou gelatinoso visível. Hifa septata, ramificada, cilíndrica ou ocasionalmente inflada, até 5 μπι de diâmetro.

Os compostos desta invenção podem ser obtidos cultivando os microorganismos referidos acima num meio nutriente aquoso contendo, fontes de carbono e azoto assimilável, preferentemente sob condições aeróbias. 0 meio nutriente pode igualmente conter sais minerais e agentes anti espuma. A fontes de carbono preferenciais no meio nutriente são os carbohidratos tal como a glucose, glicerina, o amido, a dextrina, e outros semelhantes. Outras fontes que podem ser incluídas são maltose, manose, sucrose e outras semelhantes. Além disso fontes nutrientes complexas, tais como a farinha de aveia, a farinha de milho, o milho miúdo, o milho e outras semelhantes podem substituir o carbono utilizável. A quantidade exacta da fonte de carbono que é usada no meio dependerá, em parte, dos outros ingredientes no meio, mas é usualmente encontrada numa gama entre 0,5 e 5 por cento por peso. Estas fontes de carbono podem ser usadas individualmente num dado meio ou diversas fontes em combinação no mesmo meio.

As fontes preferidas de azoto são os amino ácidos tais como a glicina, a metionina, a prolina, a treonina, e outras semelhantes, bem como as fontes complexas tais como os extractos de levedura (hidrolisatos, autolisatos), levedura seca, pasta de tomate, agar de soja, peptona, licor de milho em infusão, destiladores solúveis, extractos de malte e semelhantes. Fontes inorgânicas de azoto tais como sais de amónio (por exemplo, nitrato de amónio, sulfato de amónio, fosfato de amónio, etc) podem igualmente ser usadas. As várias fontes de azoto podem ser usadas sozinhas ou em combinação em quantidades que variam numa gama entre 0,2 e 90 por cento por peso do meio.

As fontes de carbono e azoto são geralmente empregues em combinação, mas não necessitam de estar na forma pura.

Materiais menos puros os quais contenham vestígios de factores de crescimento, vitaminas, e nutrientes minerais podem igualmente ser usados. Os sais minerais podem igualmente ser acrescentados ao meio tais como (mas não sendo limitado aos mesmos) o carbonato de cálcio, o fosfato de sódio ou de potássio, o cloreto de sódio ou de potássio, os sais de magnésio, os sais de cobre, os metais como o manganésio, o ferro molibdeno, o zinco e outros semelhantes. Além disso, se necessário, um agente anti espuma tal como o polietileno glicol ou o silicone podem ser acrescentados, especialmente se os meios de cultura espumam de um modo muito forte.

Os processos preferidos para a produção de compostos desta invenção consiste em inocular esporos ou micélios do organismo produtor num meio adequado e então cultivar sob con-diçõeas aeróbias. 0 processo de fermentação geralmente consiste em primeiramente inocular uma fonte de cultura conservada num meio de cultura semeado e obter, algumas vezes através de um processo em duas fases, o crescimento de organismos os quais servem de sementes na produção dos compostos activos. Após a inoculação, os frascos são incubados com agitamento a temperaturas numa gama desde 20° a 30°C, preferentemente de 25° a 28°C. Os níveis de agitamento podem ir até 400 rpm, preferentemente de 200 a 220 rpm,. Os frascos com sementes são incubados durante um período de 2 a 10 dias, preferentemente de 2 a 4 dias. Quando o crescimento se encontra no auge, geralmente dentro de 2 a 4 dias, a cultura pode ser usada para inocular os frascos do meio de produção. Um segundo estágio do crescimento das sementes pode ser empregue, particularmente quando se utilizam frascos maiores. Quando isto está feito, é usada uma porção do meio de cultura para inocular um segundo frasco de sementes incubado sob condições semelhantes mas empregando menos tempo. -11- -11-

Após a inoculação, o meio produtor de fermentação é posto em incubação durante 3 a 30 dias, preferentemente de 4 a 14 dias, com ou sem agitamentoção (dependendo do meio de fermentação ser sólido ou líquido). A fermentação é conduzida aerobicamente a temperaturas variando desde 20 a 40 °C. Se usada, a agitação pode ser de uma gama entre 200 a 400 rpm. Para se obterem óptimos resultados, as temperaturas deverão estar entre os 22 até aos 28°C, mais preferentemente entre 24 a 26°c. 0 pH adequado do meio nutriente para produzir o composto activo encontra-se numa variação de 3,5 a 8,5, mais preferentemente de 5,0 a 7,5. Após o período adequado para a produção do composto desejado, os frascos de fermentação são colhidos e o composto activo é isolado. É empregue um solvente alcoólico para extrair um composto desta invenção a partir do meio de fermentação sólido. 0 solvente preferido para a extração da fermentação sólida é o metanol. A mistura do solvente alcoólico e o caldo de fermentação é agitada vigorosamente e filtrada, e é acrescentada água ao filtrado. 0 extracto aquoso de metanol é então adsorvido numa resina de permuta aniónica. A resina preferida é a Dowex-1 (Cl ). O composto activo pode ser eluido a partir da Dowex-1 usando um sal altamente eluente; o eluente preferido é composto por 3% cloreto de amónio em 90% metanol/água. Após a eluição a partir da resina de permuta iónica, o composto activo pode ser recuperado a partir do eluato através da diluição do eluato com agua, baixando o pH para 2,5, e extraíndo-o num solvente orgânico; o solvente preferencial para a extracção é o diclorometano. O extracto orgânico é então evaporado para dar origem ao composto activo parcialmente purificado. O composto activo é posteriormente purificado através da separação cromatográfica a qual pode ser levada a cabo através do emprego da cromatografia de fase reversa. O adsorvente -12

-12 J

preferido para esta cromatografia é um gel de sílica de fase ligada em C8. 0 eluente preferido para a cromatografia de fase reversa é uma mistura de acetonitrilo e água tamponada com um pH baixo, tal como o ácido fosfórico a 0,1%, ou o ácido trifluoroa-cético. A presente invenção diz também respeito a um método de inibir a bio-síntese do colesterol o qual incului a administração a um indivíduo com necessidade deste tratamento de uma quantidade não tóxica terapeuticamente eficaz de um composto representado pela fórmula estrutural (I) e os seus sais farmaceuticamente aceitáveis. Especificamente, os compostos são úteis como agentes para o tratamento da arteriosclerose, da hiperlipidémia, hiper-colesterolemia hereditária e outras doenças semelhantes em humanos. Podem ser administrados oralmente ou parenteralmente sob a forma de uma cápsula, um comprimido, uma preparação injectável ou outros métodos semelhantes. Geralmente é preferível usar o tratamento oral. As doses podem ser variadas, dependendo da idade, da severidade dos sintomas, do peso corporal e de outras condições de pacientes humanos, mas a dosagem diária para adultos é entre uma gama de desde cerca de 20 mg a 2000 mg (preferentemente 20 a 100 mg) as quais podem ser dadas em duas a quatro doses. Podem ser empregues favoravelmente doses mais elevadas se necessário. Os sais farmaceuticamente aceitáveis dos compostos desta invenção incluem aqueles que são formados a partir dos catiões tais como o sódio, o potássio, o alumínio, o cálcio, o lítio, o magnésio, o zinco, e a partir de bases tais como o amoníaco, a etilenodiamina, a N-metil-glucamina, a lisina, a arginina, a ornitinina, a colina, a N,N'-dibenziletilenodiamina, a cloroprocaina, a dietanolamina, a procaína a N-benzil fenitil-amina, a dietilamina, a piperazina, a tris(hidroxilmetil)anime-tano e o hidroxido de tetrametilamónio. Os sais aqui citados incluem aqueles onde um, dois ou todos os três dos grupos carbo-xilo se encontram sob a forma de um sal.

Os compostos desta invenção também podem ser administrados em conjunto com polímeros catiónicos não tóxicos farmaceu-ticamente aceitáveis capazes de ligar os ácidos da bílis numa fórmula não reabsorbível no tracto intestinal. Exemplos destes polímeros incluem a colestiramina, o colestipol e a poli[metil--(3-trimetilaminopropil)imino-trimetileno-dihalido]. As quantidades relativas dos compostos desta invenção e destes polímeros é entre 1:100 e 1:15.000. A esqualeno sintetase intrínseca inibiória da activida-de dos compostos representativos desta invenção foi medida pelo relato padrão in vitro descrito abaixo:

Preparação dos Microssomas:

Ratazanas machos, Charles River CD, (120 a 150 g) foram alimentados com uma dieta contendo 0,1 % lovastatina durante 4 dias. Os fígados destes ratos foram homogenizados em cinco volumes (ml/g) de gelo 50 mM HEPES (ácido etanosulfónico4-(2-hi-droxietil)-l-piperasina-), 5 mM EDTA (ácido etilenodiaminotetra--acético) com um pH de 7,5 com um triturador de tecidos do tipo Potter-Elvehjem. O homogenato foi centrifugado duas vezes a 20.000 x g durante 15 minutos 4°C, libertando a pílula de cada vez. 0 supernadante foi então centrifugado a 100.000 x g durante 1 hora a 4 °C. A pílula microssómica foi re-suspensa num volume do tampão homogenizador atrás referido igual a um quinto do volume do homogenato original. a

Esta preparação microssómica tem uma concentração de proteínas de cerca de 7 mg/ml. As suspensões microssómicas foram armazenadas em quantidades alíquotas a -70°C. A actividade da esqualeno sintetase nestas porções alíquotas é estável pelo menos durante vários meses.

Purificação Parcial de Prenil Transferase A prenil transferase foi purificada para ser usada na síntese enzixnática do pirofosfato farnesil marcado com radio. A prenil transferase foi testada através do método de Rilling (Methods in Enzymology 110. 125-129 (1985)) e uma unidade de actividade é definida como a quantidade de enzima que produzirá 1μ mole de pirofosfato farnesil por minuto a 30 °C no teste padrão.

Os fígados de ratos machos de 23 dias de idade que foram alimentados com 55 de colestiramina mais 0,1% de lovastatin foram homogenizados num misturador Waring num litro de 10 mM mercapto-etanol, 2 mM EDTA, 25 μΜ leupeptina, 0,005 % flureto fenilmetil sulfonilo pH 7,0 contendo 0,1 unidades de inibidor tripsina de aprotinina/ml. 0 homogenato foi centrifugado a 20.000 x g durante 20 minutos. O supernadante foi ajustado ao pH 5,5 com 6N HOAc e centrifugado a 100,000 x g durante uma hora. Este supernadante foi ajustado ao pH 7,0 com 3N KOH e a uma fracção tomada de 35 a 60 % de sulfato de amónio. A pílula de 60 % foi re-dissolvida em 60 ml de 10 mM de fosfato de potássio, 10 mM de mercaptoetanol, 1 mM EDTA pH 7,0 (tampão A) e dializada duas vezes contra 1 litro de tampão A de cada vez. Esta fracção dializada foi posta numa coluna de 12,5 x 5 cm de DEAE-sefarose 4B equilibrado com o tampão A. A coluna foi lavada com 700 ml do tampão A e um litro gradiente do tampão A a 100 mM de fosfato de potássio, 10 mM de mercaptoetanol, 1 mM EDTA pH 7,0. As fracções que tem uma actividade específica maior do que 0,20 unidades/mg foram combinadas, foi acrescentado sulfato de amónio no estado -15-

·>' sólido para originar 60% de saturação e o produto resultante foi transformado em pílulas. A pílula foi dissolvida em 8 ml de 10 mM Tris, 10 mM β-mercaptoetanol pH 7 (tampão B). A pílula redissol-vida foi levada até uma saturação de 60 % com sulfato de amónio acrescentando 1,5 volumes de sulfato de amónio saturado no tampão B. Esta suspensão de sulfato de amónio contendo 3,5 unidades/ml com uma actividade específica de 0,23 unidades/mg e foi libertada de actividade isomerase de pirofosfato de isopentilo. Esta suspensão de sulfato de amónio foi usada para a síntese de 14 [4- C] farnesil-pirofosfato e a sua actividade e estável quando armazenada a 4°C durante pelo menos seis meses.

- . - . 14 Síntese Enzimatica do Γ4- Cl farnesil-pirofosfato 0 solvente (etanol :0,15 N NH4OH, 1:1) foi removido a partir de 55 μΟί de pirofosfato de isopentil [4-^C] (47,9 jLiCi/jUmole) por evaporação rotativa. Foram acrescentados seiscentos microlitros de 100 mM Tris, 10 mM MgCl2, 4 mMd e ditiotreitol pH 7,5 e a solução foi transferida para um tubo de centrifugação

de Eppendorf de 1,5 mL. Foram acrescentados 250 μΐ de uma solução de 20 mM de pirofosfato de geranilo, e 50 μΐ dasuspensão de sulfato de amónio de prenil transferase para iniciar a reacção. Esta incubação continha 5 μ moles de pirfosfato de geranilo, 1,15 μταοίβε de pirofosfato isopentilo, 6 μιαοΐεε de MgCl2 de 0,18 unidades de prenil transferase num volume de 900 μΐ. A incubação foi conduzida a 37 °C. Durante a incubação, a mistura tornou-se branco leitoso quando o complexo de magnésio recém formado de pirofosfato farnesilo precipitou da solução. O pirofosfato . 14 farnesilo [4- C] foi recolhido por centrifugação durante 3 minutos a 14.000 rpm numa centrifugadora Eppendorf dissolvido em 1,0 ml de 50 mM HEPES, 5 mM EDTA, pH 7,5. O rendimento foi 50,7 14 14 μ<0ι (92%) de [4- C] farnesil-pirofosfato. O [4- C] farnesil-pi- rofosfato foi armazenado em porções alíquotas a - 70°C.

-16-

Teste de Escualeno-Sintetase

As reacções foram feitas 16 x 125 mm. Foi preparado um banho seguinte: em tubos de i de ensaio a tampa roscada de partir da solução J u por teste volume para 50 testes 1. 250 mM Hepes pH 7,5 20 1000 i 2. NaF 110 mM 10 500 3. MgCl2 55 mM 10 500 4. Ditiotreitol 30 mM 10 500 5. NADPH lOmM (feito de fresco 10 500 6. 14 [4- C] farnesil-pirofosfato 47,9 μΟΐ/ιηοΙθ, e 0,025 μα/3,0 μΐ 3,0 150 > J 7. «2° 24 1200

Esta mistura para o teste foi desgaseifiçada sob vácuo e fluxada com N2. As soluções inibidoras da esqualeno-sintetase foram preparadas quer em DMSO ou MeOH e foi feita uma diluição de 1 para 120 da proteína microssómica com o tampão homogenizador original. Para cada reacção, foram tomados 87 μΐ da mistura de teste com 3 μΐ de uma solução inibidora (DMSO ou MeOH nos controles) , aquecidos até 30 °c em banho-maria e então a reacção foi -17- iniciada pela adicção de 10 μΐ de 1:120 de diluição de proteínas microssómicas (0,6 /ig de proteínas totais no teste). As reacções foram paradas após 20 minutos pela adição de 100 μΐ de 1:1 mistura de 405 de KOH com 95 % de EtOH. A mistura interrompoda foi aquecida a 60 °C durante 30 minutos, arrefecida, foram acrescentados 10 ml de heptano e a mistura foi sujeita vórtice. Dois g da alumina activada foram então acrescentados, a mistura foi novamente sujeita a vórtice, a alumina foi deixada depositar e foram remvidos 5 ml da camada de heptano. Foram acrescentados dez ml de fluído cintilante á solução de heptano e a radioactivi-dade foi determinada através da contagem pela cintilação líquida.

tí,·* <r: .

A inibição percentual é calculada através da fórmula : [amostra - ensaio em branco] 1--x 100 [controle - ensaio em branco]

Os valores IC^g foram determinados através de marcação do log. da concentração do composto do teste versus a percentagem de inibição. 0 IC50 é a concentração do inibidor que dá 50 % de inibição tal como é determinado a partir destes gráficos. O dado lCg0 constante na tabela abaixo é representativo das actividades inibitórias da esqualeno-sintetase dos compostos desta invenção:

Composto Esqualeno-Sintetase

Composto A 9 nH 1" Os presentes compostos também demonstraram um largo espectro de actividade antifúngica tal como foi determinado pelos -18- métodos de diluição de caldo e de agar. Os compostos são particularmente activos contra os filamentos dos fungos e da levedura incluindo a Candida albicans e a Cryptococcus neoformans. A sensibilidade dos filamentos dos fungos e das levduras é determinado usando testes de diluição inibidores em formato de micro titulação. Os compostos foram dissolvidos em DMSO a 2 mg/ml e foram diluidos em série em 0,1 M de um tampão de fosfato, pH 7,0 no prato de microtitulação a partir de 100 até 0,006 jug/ml. Uma suspensão padrão de esporos para testar os fungos filamentosos foi preparada através da inoculação de Antibiotic Médium #3 -3

contendo 1,5% agar com esporos de mod que 1,5 x 10 de unidades formando colónias por cavidade foram acrescentadas. As cavidades de microtitulação foram cheias com 50μ1 de um tampão contendo o composto e 50μ1 do meio inoculado. A sensibilidade das leveduras foi determinada através da inoculação de uma base de azoto contendo 1% dextrose (YNB/G) com porções alíquotas de uma cultura de leveduras feita de um dia para o outro crescida no meio Yeast Morfology (YM) a 35°C e diluindo em YNB/G para render uma concentração final de 1,5-7,5 x 3 . ...

J 10 unidades formando colónias/cavidade. Para testar a sensibilidade da levedura, o composto foi solubilizado em 10 por cento de DMSO aquoso a 2,56 mg/ml. 0 composto foi diluído por séries em YNB/G a partir de 128 até 0,06μg/ml e posteriormente diluído numa proporção de 1 para 10 em YNB/G. As cavidades foram cheias com 150 μΐ de droga contendo o meio. A concentração inibitória mínima (MIC) é definida como a concentração mais baixa para prevenir o crescimento após uma incubação de 48 horas, a 28°C para os fungos filamentosos, e 24 a 48 horas, a 35 °C para as leveduras. Os elementos revelados abaixo com a concentração inibidora mínima são representativos da actividade anti-fúngica.

Concentração Inibidora Mínima (mcg/ml)

Orcanismo Funcros Filamentosos Composto Ά Asoercrillus flavus MF383 1,5 A. nidulans R21 1,5 Levedura Composto A Candida albicans MY1055 16 C. tropicalis MY1012 8 C. parapsilosis MY1010 8 Crvpt. neoformans MY1051 1

Assim a presente invenção também diz respeito a um método para tratar infecções causadas por fungos o qual compreende a administração a um organismo que necessite desse tratamento uma quantidade não tóxica terapêuticamente eficaz de um composto representado pela fórmula estrutural (I) e os seus sais farmacêuticamente aceitáveis. Baseado nos elementos MIC atrás referidos é determinado que geralmente a partir de 2 a cerca de 20 mg por Kg deverá ser empregue como unidade de dosagem num tratamento anti-fungíco.

Os compostos desta invenção são aceitáveis para serem utilizadosem várias aplicações de composições antifungícas. Neste uso, os compostos podem ser misturados com um veículo biologicamente inerte, geralmente com a ajuda de um agente de dispersão de superfície activa, cuja natureza variará dependendo se o uso for para o controle de mamíferos infectáveis patogénicos tais como o homem, ou pássaros ou répteis, ou para o controle de fungos na agricultura tal como no solo ou em partes de plantas, ou para o controlo de fungos em objectos inanimados.

Nas composições para aplicações médicas, os compostos podem ser misturados com um veículo farmacêuticamente aceitável, cuja natureza variará consoante a composição for para ser de aplicação tópica, parenteral ou oral.

Se a referida aplicação for para ser tópica, a droga pode ser formulada nos cremes convencionais e unguentos tais como o petróleo branco, a lanolina anidra, o álcool cetílico, a emulsão de cera e óleo em água, o monoestearato glicerilo, a água de rosas e outros semelhantes.

Para as aplicações parenterais, os compostos podem ser formulados nas soluções parenterais convencionais tais como o cloreto de sódio a 0,85 por cento ou a dextrose em água a 5 por cento, ou outras composições farmacêuticamente aceitáveis.

As composições para a administração oral podem ser preparadas através de as drogas componentes serem intimamente misturadas com qualquer um dos meios farmacêuticos usuais, incluindo para as preparações líquidas, os veículos líquidos tais como a água, os glicóis, os óleos, os álcois, e outros semelhantes; e para as preparações sólidas tais como as cápsulas e os comprimidos, os veículos sólidos tais como os amidos, os açúcares, a caolino, a etil celulose, os agentes dispersantes activos de superfície, geralmente com um lubrificante tal como o -21- -21-

'ÍT i .

estearato de cálcio, em conjunto com ligantes, agentes desinte-gradores e outros semelhantes.

Estas composições são então administradas em quantidades suficientes para se obter o efeito anti fúngico desejado. Para aplicação médica, o método inclui a administração a um sujeito em necessidade de tratamento de uma quantidade anti-fun-gica terapêuticamente eficaz de um composto de fórmula I. As doses apropriadas variarão dependendo da idade, da gravidade dos sintomas, do peso corporal e de outras condições. Para a aplicação tópica as composições são aplicadas directamente á área onde o controle é desejado. Para a administração interna, a composição pode ser aplicada através de injecção ou pode ser administrada oralmente

Para aplicação não medicinal, o produto da presente invenção, quer sozinho quer em mistura, pode ser empregue em composições num veículo inerte o qual inclui diluentes líquidos ou secos, finamente divididos, agentes de expansão, agentes de enchimento, condicionadores, e excipientes, incluindo várias argilas, terra diatomácea, talco, e outros semelhantes, ou água e vários líquidos orgânicos tais como alcanóis inferiores, por exemplo etanol e isopropanol, ou querosene, benzeno, tolueno e outras fracções destiladas do petróleo ou misturas feitas a partir das mesmas.

Estas composições podem ser empregues através da aplicação à superfície ou incorporando-as no meio a ser protegido. Para o controlo da praga do arroz, da peste tardia do tomate, da peste temporã tomate, ferrugem da folha de trigo, do míldio do feijão e o murchar do tomate Fusarium. as composições podem ser aplicadas directamente na planta numa aplicação tópica ou administradas ao solo para aplicação sistémica. 0 método compreende a administração à planta infectada, ao solo ou ao meio a ser protegido uma quantidade anti-fúngica eficaz do composto de fórmula I.

Os exemplos seguintes ilustram a preparação dos compostos de fórmula (I) e a sua incorporação nas composições farmacêuticas e, como tal, não são para ser consideradas como limitadoras dos objectivos da invenção presentes nas reivindicações aqui apensas. A composição dos meios empregues nos exemplos seguintes encontram-se na lista abaixo:

KF MEIO DE SEMENTES por litro

Elemento Vestiqiais Mistura #2

giJ

Licor de Milho em infusão 5 g

Pasta de Tomate 40 g

Farinha de aveia 10 g

Cereolse 10 g

Elemento vestigial Mitura #2 10 ml Água destilada 1000 ml pH ajustado a 6,8 (presterilo) 50 mls/sem chicanas 250 mis Frasco de Erlenmeyer 20 minutos em autoclave (121°C,

FeS04 7H20 1,0 MnS04 4H20 o H CuCl2 2H20 0,025 CaCl2 2H20 0,1 H3B°3 0,056 (NH4)6M07°244H2° 0,019 ZnS047H20 0,2 dissolvido em 1 L 0,6 N HCl 15 psi)

Meio de Produção

F1 BRF

Milho partido 10,0 g/frasco Arroz interal 5,0 g/frasco Base líquida #3 10,0 mls/frasco Base líquida #2 20,0 mls/frasco

Base líquida #3 alk Ardamina PH 0,2 KH„PO. 2 4 0,1 MgS04 7H20. 0,1 Tartarato de sódio 0,1 FeS04 7H20 0,01 ZnS04 7H20 0,01 HO destilada 1000,0 mis (sem ajustamento de pH) 15 minutos em autoclave (121°C, 15 psi) acrescentam-se 15,0 mis de H20 destilada por frasco 20 minutos em autoclave (121°C, 15 psi)

Base líquida #2

gJL

Extracto de levedura 1,0 Tartarato de sódio 0,5 KH2P04 0,5 · água destilada 1000,0 mis (sem ajustamento de pH) 15 minutos em autoclave (1210C, 15 psi) acrescentam-se 15,0 mis de H20 destilada por frasco 20 minutos em autoclave (121°C, 15 psi)

EXEMPLO I

Preparação do Composto A A. Cultura do MF5465

Uma cultura de MF5465, inoculada a partir de uma amostra tubular de solo usando uma pá de para solo em vidro, cresceu em frascos de meio de sementes durante 74 horas a 25° C, a 220 rpm, com 85% de humidade. Os frascos foram então reunidos, e foi acrescentada glicerina esterilizada para se obter uma concentração final de 10%. Os conteúdos foram misturados e e foram repartidos assepticamente em quantidades alíquotas em criotubos esterilizados. Os frascos foram congelados e mantidos a -80 °C.

Três frascos contendo micélio vegetativo congelado foram descongelados e transferidos, cada um para cada um dos frascos de meio de sementes 3 KF. Estes frascos de sementes foram incubados durante 71 horas a 25°C, a 220 rpm, com 85% de humidade. Ao completar-se a incubação, os três frascos KF foram reunidos e as sementes foram usadas para inocular frascos de meio de produção 56 Fl. Foram tomadas precauções ao distribuir manualmente as sementes em crescimento através do meio de produção sólido. Os frascos de produção de meio foram estatisticamente incubados a 25°C durante 21 dias. Os frascos foram recolhidos como se segue: 45 mis de metanol a 75% foi acrescentado a cada um dos frascos de produção; o crescimento foi partido ã mão em pequenos fragmentos com a ajuda de uma pipeta de vidro; os frascos foram de novo rolhados e foram postos num misturador giratório durante 30 minutos a 220 rpm enquanto se efectuou a extracção. Após o agitamento, o conteúdo dos frascos individuais foi reunido vertendo o extracto de solvente do milho coberto de micélio num frasco de Èrlenmeyer de 2 litros. 0 conteúdo de cada frasco foi então submetido a uma segunda extracção com mais 45 mis de metanol. A extracção decorreu como foi referido atrás sendo os extractos resultantes reunidos num segundo frasco de Èrlenmeyer de 2 litros.

Isolamento do Composto A

Os extractos acima referidos (4800 mL) foram carregados numa coluna DOWEX-1 (500 mL de resina) a uma velocidade de 20 mL/min.. A coluna foi então lavada com 50% metanol e água (300 mL), e 90% metanol e água (500 mL), e de seguida foi eluida com 3% cloreto de amónio em 90% metanol e água. Foram recolhidas seis fracções (500 mL). As primeiras três fracções foram combinadas, diluídas com água (1 L) , e ajustadas ao pH 2,5 com ácido clorídrico concentrado. O eluato acidificado foi extraído com diclo-rometano (2 x 500 mL). A evaporação do extracto de diclorometano rendeu um resíduo oleoso (402 mg). O residuo foi dissolvido em metanol (1,2 ml) e carregado numa coluna HPLC prep (Dynamax 60A, 8 um C8, 24,6 x 250 mm com coluna de protecção). A coluna foi eluida com 72% de acetonitrilo/28% (0,1% de ácido fosfórico em água) com 10 mL/min de caudal. Recolhendo fracções de 5 mL, o composto desejado eluiu em fracções de 29-34. As fracções de 29-34 foram combinadas e foi acrescentado acetato de etilo (30 mL). Após ser lavado com água (10 mL), o sedimento orgânico foi evaporado para dar origem ao Composto A sob a forma de um óleo. EXEMPLO 2

Preparação de um sal de Amónio

Uma amostra de 0,1 mmol do ácido livre de um composto de fórmula (I) é dissolvido em 10 ml de acetato de etilo. A solução resultante é saturada com amoníaco gasoso sobre o qual o sal de amónio precipita a partir da solução. EXEMPLO 3

Preparação de um Sal de Potássio

Uma solução de 0,1 mmol do ácido livre de um composto de fórmula (I) em 10 ml de metanol é tratado com uma solução aquosa ou metanólica contendo 0,3 mmol de hidróxido de potássio. A evaporação do solvente rendeu o sal tri-potássico. A adição de entre 0,1 e 0,3 mmol de hidróxido de potássio rendeu análogamente misturas de sais mono-potássicos, di-potássicos e tri-potássicos cujas composições dependem da quantidade exacta de hidroxido de potássio acrescentada.

De um modo semelhante podem ser formados sais de sódio e de lítio. EXEMPLO 4

Preparação de um Sal de Cálcio

Uma solução de 0,1 mmol do ácido livre de um composto de fórmula (I) em 20 ml de 6:4 metanol/ãgua é tratada com uma solução aquosa de 0,1 mmol de hidróxido de cálcio. Os solventes são evaporados para darem origem ao correspondente sal de cálcio. EXEMPLO 5

Preparação de um Sal de Etilenodiamina

Uma solução de 0,1 mmol do ácido livre de um composto de fórmula (I) em 20 ml de metanol é tratado com 0,1 mmol de etilenodiamina. A evaporação do solvente dá origem ao sal de etilenodiamina. O procedimento pode do mesmo modo ser aplicado ao sal de N,N''-dibenziletilenodiamina. EXEMPLO 6

Preparação de um Sal de Trisfhidroximetil)aminometano A uma solução de 0,1 mmol do ácido livre de um composto de fórmula (I) em 10 ml de metanol é acrescentado desde 0,1 a 0,3 mmol de tris(hidroximetil)aminometano dissolvido em 10 ml de metanol. A evaporação do solvente dá origem ao sal correspondente, cuja composição exacta é determinada pela relação molar da amina acrescentada. Do mesmo modo são preparados os sais de L-ortinina, L-lisina, e N-metilgluacamina. EXEMPLO 7

Preparação de um Sal de L-arqinina

Uma solução de 0,1 mmol do ácido livre de um composto de fórmula (I) em 20 ml de 6:4 metanol/água é tratada com uma solução aquosa de 0,1 mmol a 0,3 de L-arginina. A evaporação do solvente rende o sal em titulo, cuja composição exacta é determinada pela relaçao molar do amino ácido em relação ao ácido livre de fórmula (I) usado.

Do mesmo modo são preparados os sais de L-ornitina , L-lisina, e N-metilglucamina. EXEMPLO 8

Preparação de um Composto B (Método 1) A 5 mg de L-697,350 em metanol (5 ml) foram acrescentados 2 ml de diazometano acabado de ser destilado em éter (2,05 M). Após 5 minutos o solvente foi removido para dar origem ao ester trimetílico (Composto B) sob a forma de um óleo. EXEMPLO 9

Preparação de um Composto B (Método 2)

Uma solução de 2 mg do composto A em 0,5 ml de acetoni-trilo é tratado ã temperatura ambiente com 10 equivalentes de DBU e 10 equivalentes de Mel. Passadas 2 horas a reacção é diluida com 10 ml de diclorometano e lavada sucessivamente com 10 ml de 0,1M de ácido fosfórico, 10 ml de água, 10 ml de bicarbonato de sódio saturado e 10 ml de água. Após secar sobre sulfato de sódio, o sedimento orgânico é concentrado e o resíduo é cromato-grafado em gel de sílica usando misturas de hexano e acetato de etilo para dar origem ao composto B. 0 método do Exemplo 9 é também adequado para aprepara-ção de outros derivados de esteres tais como 1) etilo e outros esteres de alquilo inferiores e 2) benzilo e estéres benzilo substituídos.

Dados de Espectros de Massa

Os espectros de massa foram gravados num modelo Finnigan-MAT MAT212 (de impacto electrónico, EI 90 eV), MAT 90 (Fast Atom Bombardement, FAB) e TSQ70B (FAB, EI) espectómetros de massa. As medições exactas de massa foram executadas a resolução elevada (HR-EI) usando óxido de perfluoroquerosene (PFK) ou de perfluoropolipropileno (Ultramark I1600F) como padrão interno.Os derivados trimetilsililo foram preparados com uma mistura de 1:1 de piridina BSTFA á temperatura ambiente.

Dados

13C RMN

Os espectros 13C RMN f°ram gravados em CD30D a 75 MHz num espectrómero Varian XL-300. Os deslocamentos químicos são dados em ppm relativamente ao TMS a zero ppm usando o pico do solvente a 49,0 ppm (CD^OD) como padrão interno.

Espectros H RMN

Os espectros RMN foram gravados a 300 MHz num espectrómetro Varian XL-300. Os deslocamentos químicos são revelados em ppm relativamente ao TMS a zero ppm usando o pico do solvente a 3,30 ppm (CD30D) como padrão interno.

Prpopriedades Físicas dos Compostos de Estrutura I:

Composto A-o composto de estrutura (I) no qual Z^ Z^ e Z3 são cada um hidrogénio.

Dados Espectros de Massa:

Este compopsto tem o peso molecular 754. A fórmula molecular c40H5o°i4 f0·*· determinada através da medição HR-MS do 754,3198, derivado penta-trimetilsililo(cálculo para C . AH,_-0, . 40 50 14 encontrado 754,3154. 13 C NMR (CD30D) (300MHZ) (cd3 OD, 22 °C) : 7 CM CM (m, 4H) , 7, 13 (m, 6H) , 6,23 (d, 1,8) , 5 ,36 (m,2H), 5, 24 (s ), 4,88 (q, 3,9) , 4,03 (d, 1, 8) , 2,73 (dd, 13 ,3, 5, 6 Hz) , 2,54 (t, 7,6, 2H) , 2, 3 (m , 5H) , 2 ,04 (s , 3H), 2,04 (m, 2H), 1,89 (br t, 7,0 , 2H) , 1 , 6 (m, 5H) 1 ,27 (m, 2h), 0 ,93 (d, 6,8, 3H) , 0, 86 (d, 6,8, 3H) , PPm • : 173 ,06, 173, 04, 172, 43, 170, 14, 168, 46, 143,84, 141 ,88, 138, 78, 130, 15 ( 2X) , 129,3 6, (2X) , 129 ,24 (4X) , 127, 53, 126 , 89 , 126, 61 , 107, 17, 90, 94, 82,15 , 81, 11, 78, 10, 76,57, 75,56, 40,46, 39, 62, 37,77 , 37, 56, 36, 87, 36,21, 35,34, 32,43, LO O 44, 28,75 , 21, 25, 21, 13, 20, 08 / 14, 32 ppm. IV (sob a forma de um ácido livre; filme em ZnSe): 3200 br, 2936, 1733, 1496, 1454, 1437, 1375, 1250, 1180, 1148, 1026, 972, 898, 831, 746, 700 cm"1.

Composto B-o estér trimetílico do composto A, i. e. o composto de estrutura (I) no qual Z1 Z2 e Z3 são cada um metilo.

Dados de Massa Espectral:

Este composto tem o peso molecular 796 através de FAB-MS (observado (M+Cs]+ a m/z 929. -31- r,f·

Espectro Ή RMN (300 MHz) (CD 3° V 22 °C) : 7 ,22 (m / 6H), 7,15 (m, 4H) , 6,16 (d, 1/9) , 5,32 (m / 2H), 5,24 (S), 4,9 (m) , 4,00 (d, 1/9) / 3,81 (s , 3H) , 3,70 (s, 3H) , 3,68 (S, 3H) , 2,73 (dd, 13, 3, 5,7 Hz), 2,56 (dt, 2,5, 7,6, 2H) , 2,35 (m, 3H) , 2,25 (m, 2H) 2, 08 (m) , 2,05 (S/ 3H) , 2,01 (m) , 1,88 (br t, 7,4 / 2H) , 1,68 (m, 2H) , 1,56 (m, 3H), 1 ,29 (m, 2H) / 0,94 (d, 6,8, 3H), 0,86 (d, 6,8, 3H) ppm.

13 C RMN

Deslocamentos Químicos

13C RMN 173,04, 172,85, 171,16, 168,75, 167,39, 143,94, 141,98, 128,96, 130,21 (2x), 129,43, (2x), 129,30 (4x), 127,49 , 126, 96, 126, 66, 107 ,49, 91 ,12, 81 ,89, 81,17, 78,04, 76,83, 76,20, 53,62, 53,03, 52,77, 40,52, 39,75, 37,87, 37,61, 36,93, 36,09, 35,19, 32,46, 30,53, 28,78, 21,27, 21,13, 20,13, 14,35 PPm.

IV (filme em ZnSe) : 1246 3200 br, 2917, 2848, 1738, 1603, 1149, 1124, 1030, 968, 748, 702 1441, -1 1371, cm

i

Claims (1)

1. REIVINDICAÇÕES lã. - Processo para a preparação de um composto de fórmula estrutural (I): O

   (i) em que Z^r %2 e Z3 são independentemente seleccionados a partir de um grupo que consiste em a) H; b) ci-5 alquilo; e c) ci_5 alquilo substituído por um membro de um grupo que consiste em i) fenilo, e ii) fenilo substituído por metilo, metoxi, halogéneo (Cl, Br, I, F) ou hidroxi; ou de um sal farmaceuticamente aceitável de um composto de fórmula (I) ; -33- •· r. U'.'

   caracterizado por compreender a cultura de MF5465, ATCC 70411, ou de um seu mutante activo sob condições adequadas para formar o composto da Reivindicação 1 e a recuperação do referido composto. 2â. - Processo de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por se preparar um composto em que a configuração relativa da fórmula estrutural (I) é: o r·' ,y

   e Z , Z2 e Z3 são cada um -CH3 ou Z1, Z2 e Z3 são cada um -H ou os seus sais farmaceuticamente aceitáveis.

   3â. - Processo de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por se preparar um composto em que a configuração absoluta da fórmula estrutural (I) é: F. -34-

   ) Ο

   Γ-* . :-<>

   I

   e Ζ^, Ζ2 e são cada um -CH^ ou Z^, e Z^ são cada um -H ou os seus sais farmaceuticamente aceitáveis. 4 ã. - Processo para a preparação de uma composição farmacêutica, caracterizado por se incluir na referida composição uma quantidade não tóxica terapeuticamente eficaz de um composto da Reivindicação 1, juntamente com um veículo farmaceuticamente aceitável. 5â. - Processo para a preparação de um medicamento útil para o tratamento da hipercolesterolemia ou para inibir a esqua-leno-sintetase num indivíduo que necessite desse tipo de tratamento, caracterizado por se incluir no referido medicamento uma quantidade não tóxica terapeuticamente eficaz de um composto da. Reivindicação 1. 6â. - Método para inibir o desenvolvimento de fungos, caracterizado por se aplicar na área onde esse desenvolvimento deve ser controlado de uma quantidade antifúngica eficaz de um composto da Reivindicação 1, sob a forma de unidade de dosagem, contendo desde cerca de 2 até cerca de 20 mg de ingrediente activo por quilograma de peso corporal. I -35- 7a. - cultura biologicamente pura de MF5465, ATCC 70411, ou de um seu mutante activo, caracterizada por ser biologicamente pura e por ser capaz de produzir um composto da Reivindicação 1 em quantidades recuperáveis. 8a. - Cultura de MF54 65, ATCC 70411, ou de um seu mutante activo, caracterizada por ser capaz de produzir um composto da Reivindicação 1 em quantidades recuperáveis. Lisboa, 9 de Setembro de 1991

   J. PEREIRA DA CRUZ Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 10-A 3“ 1200 LISBOA