PT990703E - Novo polipéptido, o adn que codifica o mesmo e a sua utilização - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "NOVO POLIPÉPTIDO, O ADN QUE CODIFICA O MESMO E A SUA UTILIZAÇÃO"

Campo Técnico A invenção refere-se a novos polipéptidos produzidos por uma certa linha de célula humana estromal e os ADN que codificam os referidos polipéptidos.

Mais particularmente, a invenção está relacionada a novos polipéptidos chamados de OAF065a e OAF065p (chamados a partir daqui OAF065s) , um processo para a sua preparação, os ADNs que codificam os referidos polipéptidos, um vector que contém o polipéptido, uma célula hospedeira transformada pelo vector, o anticorpo do referido polipéptido, uma composição farmacêutica que contém o polipéptido ou o anticorpo.

Antecedente Técnico

Sabe-se que as células estromais da medula óssea formam um micro ambiente dda medula óssea do sistema hematopoiético, imunológico, etc, e produzem e segregam factores essenciais para a indução da proliferação e diferenciação de células estaminais, por exemplo, IL-7, SCF, IL-11, M-CSF, G-CSF, GM-CSF, IL-6, TGF-β, LIF, etc. É também claro que certas células estromais da medula óssea estão relacionadas ao metabolismo ósseo (Kenneth Dorshkind Annu. Rev. Immunol. 8, 111-137. 1990). No entanto, o.s papéis das células estromais não são completamente . reconstituídos a partir somente ainda de de factores isolados. Pode sugerir a existência de quaisquer factores que ainda não estão isolados. 2 JAYAKUMAR ARUMUGAM et al: "Cloning and expressing o£ the multifunctional human fatty acid synthase and its subdomains in Escherichia coli", Actas da Academia Nacional de Ciências dos Estados Unidos, vol. 93, no. 25, 1996, páginas 14509-14514, descrevem que caracterizaram anteriormente um ADNc (8.3-kbp) de comprimento completo que codifica para a sintase de ácidos gordos (FAS; CE 2.3.1.85} a partir de clones de ADNc FAS do cérebro humano. No processo de realização desta tarefa desenvolveram agora um novo processo de PCR, o PCR recombinante, o qual é muito útil em juntar dois fragmentos de ADN de sobreposição que não têm um local de restrição comum ou único. O. ADNc de comprimento completo foi clonado em pMAL-c2 para a expressão heteróloga em Escherichia coli como uma fusão de proteína que liga a maltose. A proteína recombinante foi purificada por se utilizar a afinidade de amilose-resina e a cromatografia de hidroxilapatite. Como esperado a partir da capacidade de codificação do ADNc expresso, a proteína recombinante quimérica tem um^peso molecular de 310.000 e reage com anticorpos quer contra o FAS humano e a proteína que liga a maltose. 0 FAS humano da proteína que liga a maltose (MBP-hFAS) catalizou a síntese de palmitato de acetil-CoA, malonil-CoA, e NADPH e apresentou todas as actividades parciais de FAS a níveis comparáveis com aqueles da enzima humana nativa purificada a partir de células HepG2. Tal como o FAS HepG2 nativo, os produtos de MBP-hFAS são principalmenteo ácido palmítico (> 90%) e quantidades mínimas dos ácidos esteárico e araquídico. Semelhantemente, o ADNc FAS humano que codifica um domínio 1 (a sintase β-cetoacilo, as transacilases acetil-CoA e malonil-CoA, e a desidratase β-hidroxiacil) foi clonado e expresso em E. coli utilizando pMAL-c2. A proteína de fusão expressa, o domínio I MBP-hFAS, foi purificada a aparente homogeneidade (Mr 190.000) e apresentou as actividades das transacilases acetil/malonil e a desidratase hidroxiacil. Além disso, o ADNc FAS humano que codifica os domínios II e III (as reductases enoilo e β-cetoacilo, a proteína portadora de acilo, e a 3 tioestèrase) foi clonado em pET-32b(+) e expresso em E. coli como uma proteína de fusão com tioredoxina e seis resíduos de histidina em estrutura. A proteína de fusão recombinante, os domínios II e III do FAS humano da tioredoxina, que foi purificada de E. coli tinha um peso molecular de 159.000 e apresentou as actividades das reductases de enoilo e de β-cetoacilo e a tioesterase. Tanto o MBP e como os marcadores His da tioredoxina parecem não interferir com a actividade catalítica do FAS humano ou das suas actividades parciais.

Divulgação da Invenção

Os presentes inventores dirigiram a sua atenção para este ponto e foi realizada uma investigação enérgica, a fim de encontrar novos facto.res (polipéptidos) especialmente proteínas segregadoras e de membrana as quais são geradas por certas células estromais..

Até agora, quando um especialista na técnica tem a intenção de obter um polipéptido particular ou um ADN que o codifica, geralmente utiliza métodos destinados a confirmar uma actividade biológica pretendida num meio de tecido ou de célula, isolando e purificando o polipéptido e depois· clonando, gene ou por métodos por "clonagem de expressão" com a orientação da actividade biológica.

No entanto, os polipéptidos fisiologicamente activos em corpos vivos têm muitas vezes muitos tipos de actividades. Por conseguinte, é cada vez mais que, depois de um gene ser clonàdo, o gene é verificado como sendo idêntico àquele . que codifica um polipéptido já conhecido. Geralmente as células -estromais da medula óssea geram somente uma quantidade muito pequena de um factor e torna-se difícil isolar e purificar o factor e confirmar a sua actividade biológica. 4

Desenvolvimentos rápidos recentes em técnicas para a construção de ADNcs e técnicas de sequênciação têm tornado possível sequenciar rapidamente uma grande quantidade de ADNcs. Ao utilizar estas técnicas, um processo, que compreende . a construção de ADNcs aleatoriamente, identificando as suas sequências de nucleótidos, expressando novos polipéptidos codificados por eles, está agora em curso. Embora este processo seja vantajoso na medida em que um gene pode ser clonado e a informação relativamente à sua sequência de nucleótido pode ser obtida sem qualquer análise bioquímica ou genética, o gene alvo, assim, só pode ser descoberto acidentalmente em muitos casos.

Os presentes inventores estudaram o método de clonagem de genes que codificam os factores de diferenciação e/ou de proliferação que funcionam em sistemas hematopoiéticos e em sistemas, imunitários. Centrando a sua atenção' sobre o, facto de a maior parte das proteínas segregadoras, tais como os factores de proliferação e/ou de diferenciação (por exemplo várias citocinas)e as proteínas de membrana tais como os seus receptores (a partir daqui estas proteínas serão referidas genericamente como proteínas segreadoras e as semelhantes) terem sequências chamadas péptidos de sinal no terminal N, os inventores conduziram estudos extensivos num processo para eficientemente e selectivamente clonarem um gene que codifica para um péptido de sinal. Finalmente., inventámos com sucesso um método de rastreio para os ADNcs que têm uma sequência que codifica péptidos de sinal, chamámos o método como armadilha de sequência de sinal (SST) (Ver o Pedido de Patente .Japonasa No. 6-13951). Também desenvolvemos o método SST de levedura sobre O mesmo conceito. Através do método utilizando levedura, os genes que incluem a sequência que codifica o péptido de sinal podem ser identificados de forma mais fácil e eficaz (ver USP No. 5.536.637). 5

Ao utilizar o método SST, os presentes inventores conseguiram encontrar novas proteínas de membrana produzidas por células estromais da medula óssea e ADNs que as codificam, e nós depois completámos a invenção. Os polipéptidos OAF065s da invenção não são conhecidos, quando as sequências dé aminoácidos do polipéptido foram comparadas por um computador para se conhecerem todas as sequências na base de dados de Swiss Prot Release 33. Foi descoberto que os polipéptidos da invenção são uma proteína de membrana de tipo I e eles têm uma região rica de Cys extracelular que normalmente existe na família do receptor do factor da necrose tumoral (TNF) (Ver a Fig. 1) . Por isso, foi sugerido que os polipéptidos da invenção são novas proteínas de membrana que pertencem à família do receptor de TNF. A presente invenção fornece uma forma substancialmente purificada de um polipéptido como reivindicado na reivindicação 1, um ADNc como reivindicado na reivindicação 4, uma replicação ou vector de expressão como reivindicado na reivindicação 7, uma célula hospedeira como reivindicado na reivindicação 8, um método para produzir o polipéptido como reivindicado na reivindicação 9, um anticorpo mononoclonal ou policlonal' como reivindicado na reivindicação 10, e uma composição farmacêutica como reivindicado na reivindicação 11.

Breve Descrição do Desenho A Fig. 1 mostra a comparação da sequência de aminoácidos da invenção com aquela da família do receptor de TNF. O hTNFRl representa o receptor 1 do factor de necrose humana, o hTNFR2 representa o receptor 2 do factor necrose humana, o hNGFR representa o receptor do factor de crescimento do nervo humano, e o hFas representa o Fas humano, nesta figura. 6

Descrição Detalhada da Invenção A invenção fornece: 1) um polipéptido que compreende uma sequência de aminoácido mostrado na SEQ ID NO. 1 ou NO. 5, 2) um ADN que codifica os polipéptidos descritos acima (1), 3) um ADN que compreende uma sequência nucleotidica mostrada na SEQ ID NO. 2 ou NO. 6,

Mais particularmente, a invenção está relacionada com um polipéptido que compreende a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID No. 1 ou 5 na forma substancialmente purificada, um polipéptido que tem a sequência de aminoácido Lys na posição 1 para Ala na posição 392 mostrada na SEQ ID No. 4, um polipéptido que tem a sequência de aminoácido Lys na posição 1 para Leu na posição 398 mostrada na SEQ ID No. 8 ou um polipéptido que tem uma sequência de aminoácido sendo pelo menos 95% homóloga às sequências de aminoácidos da SEQ ID No. 1 ou 5.

Além disso, a invenção está relacionada com os ADNs que codificam os péptidos acima. Mais particularmente, a invenção fornece ADNs que compreendem a sequência nucleotidica mostrada SEQ ID NO. 2,. 3, 6 ou 7.

Um polipéptido que compreende a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO. 1 ou 5 na forma substancialmente purificada irá geralmente compreender o polipéptido em uma preparação na qual mais de 90%, por exemplo, 95%, 98% ou 99% do polipéptido na preparação é aquela da SEQ ID NO. 1 ou 5. Um homólogo de polipéptido que compreende a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO. 1 ou 5 será em geral, pelo menos, 95% homólogo ao polipéptido que compreende a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO. 1 ou 5. 7

Um tal polipéptido homólogo será referido a um polipéptido da invenção.

Uma forma de realização adicional da invenção fornece replicação e vectores de expressão gue transportam o ADN da invenção. Os vectores podem ser, por exemplo, vectores de plasmídeo, de vírus ou de fago fornecidos com uma origem de replicação, opcionalmente um promotor para a expressão do referido ADN e, opcionalmente, um regulador do promotor. 0 vector pode conter um ou mais genes marcadores selecionáveis, por exemplo, um gene de resistência à ampicilina. 0 vector pode ser utilizado in vitro, por exemplo, da produção de ARN que corresponde ao ADNc, ou utilizado para transfectar uma célula hospedeira.

Uma forma de realização adicional da invenção fornece células hospedeiras transformadas com os vectores para a replicação e expressão do.ADN da invenção, incluindo o ADN da SEQ ID NO. 2, 3, 6 ou 7 ou a sua estrutura de leitura aberta. As células serão escolhidos para serem compatíveis com o vector e podem ser, por exemplo, bactérias, leveduras, insectos ou mamíferos.

Uma forma de realização adicional da invenção fornece um método de produção de um polipéptido o qual compreende a culturação das células hospedeiras da invenção em condições efectivas para expressar um polipéptido da invenção. De preferência, além disso, um tal método é realizado sob condições em que o polipéptido da invenção é expresso e, em seguida, produzido a partir das células hospedeiras. 0 ADN da invenção pode também ser inserido nos vectores acima descritos, em uma orientação de anti-sentido, a fim de provar para a produção do ARN de anti-sentido. Tal ARN de anti-sentido pode ser 8 utilizado em um método para controlar os níveis de um polipéptido da invenção em uma célula. A invenção fornece tarríbém anticorpos monoclonais ou policlonais contra um polipéptido da invenção. A .invenção fornece adicionalmente um processo para a produção dos anticorpos monoclonais ou policlonais para os polipéptidos da invenção. Os anticorpos monoclonais podem ser preparados por uma tecnologia de hibridomas comum, utilizando polipéptidos da invenção ou os seus fragmentos, como um imunogénio. Os anticorpos policlonais podem igualmente ser preparados por meios comuns os quais compreendem a inoculação de animais hospedeiros, por exemplo, um rato ou um coelho, com polipéptidos da invenção e a recuperação do soro imune. A invenção fornece também composições farmacêuticas contendo um polipéptido da invenção ou um seu anticorpo, em associação com um diluente e/ou portador farmaceuticamente aceitável. 0 polipéptido da invenção inclui aqueles que compreedem a. sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO. 1 ou 5.

Como bem conhecido, existem de uma a seis espécies de codões que codificam um aminoácido {por exemplo, uma espécie de c.odão para a Metionina (Met), e seis espécies de codões para a leucina (Leu) que são conhecidos). Por consequência, a sequência de nucleótido de ADN pode ser modificada, a fim de codificar o polipéptido que tem a mesma sequência de aminoácidos. 0 ADN da invenção, especificado em (2) inclui um grupo de todas as sequências de nucleótidos que codificam os polipéptidos (1) apresentados na SEQ ID NO. 1 ou 5. Existe uma probabilidade do rendimento de um polipéptido ser melhorado pela modificação de uma sequência de nucleótido. 9 0 ADN especificado em (3) é a personificação do DNA mostrado em (2), e indica a sequência de forma natural. 0 ADN mostrado em (4) indica a sequência do ADN especificado em (3) com a região natural não translacional. 0 ADNc que transporta a sequência nucleotidica mostrado na SEQ ID NO. 3 é preparado pelo método seguinte:

Breve descrição do método SST de levedura (ver o documento USP No. 5536637) é como se segue.

Uma levedura tal como a Saccharomyces cerevisiae deveria segregar invertase no meio, a fim de ter. sacarose ou rafinose como uma fonte de energia ou de carbono (a invertase é uma enzima para decompor a rafinose em sacarose e melibiose, sacarose em frutose e em glicose). Sabe-se que muitas sequências de sinal de mamíferos conhecidos fazem a levedura segregar a sua invertase. A partir deste conhecimento, o método de SST foi desenvolvido como um método de triagem para encontrar novas sequências de sinal as quais tornam possível segregar a invertase de levedura a partir de bibliotecas de ADNc de mamíferos. 0 método de SST utiliza o crescimento de levedura em meio de rafinose como ura marcador. 0 gene SUC2 do tipo invertase não segregador (Adesão a GenBank No. V 01311) ao qual falta o codão de iniciação ATG foi inserido no vector de expressão da levedura para preparar o vector pSUC2 da levedura SST. Neste vector de expressão, o promotor ADH, o terminador ADH (ambos foram derivados do plasmídeo AAH5 (Gammerer, Methods in Enzymol. 101, 192-201, 1983) ) , 2μ ori (como uma origem de replicação de levadura), TRPl (como um marcador selectivo de levadura), ColEl ori (como uma origem de replicação de E. Coli) e um gene de resistência à ampicilina (tal como um marcador de resistência a fármacos) foram inseridos. O ADNc de mamíferos foi inserido a jusante do gene SUC2 para preparar a biblioteca de ADNc da levedura SST. A levedura a que falta a invertase de tipo segregadora, foi transformada com esta biblioteca. Se o ADNc de mamífero inserido codifica um péptido 10 de sinal, a levedura poderia sobreviver no meio de rafinose como resultado da restauração da segregação da invertase. Só culturando colónias de levedura, preparar plasmídeos e determinar a sequência de nucleótido dos ADNcs de inserção, é possível identificar novos péptidos de sinal rapidamente e facilmente. A preparação da biblioteca de ADNc da levedura de SST é como se segue: (1) 0 ARNm é isolado a partir de células alvo, a síntese do segundo cordão é realizada através da utilização de um iniciador aleatório com certos locais de reconhecimento da enzima (enzima I) de restrição, (2) O ADNc do segundo cordão é ligado ao adaptador contendo certos locais de reconhecimento da endonuclease (enzima II) de restrição, diferindo da enzima I, digerido com a enzima I e fraccionado em um tamanho adequado, (3) 0 fragmento de ADNc obtido é inserido no vector de expressão da levedura sobre a região a montante do gene da invertase cujo péptido de sinal é suprimido e a biblioteca foi transformada. A descrição pormenorizada de cada etapa é a seguinte: (1) o ARNm é isolado a partir de órgãos de mamíferos e de linhas celulares que os estimulam com um estimulador adequado, se necessário) por métodos conhecidos (Molecular Cloning (Sambrook,· J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) ou o protocolo actual em Biologia Molecular (F. M. Ausubel et al, John Wiley & Sons, Inc.) se não for observado especialmente). O HAS303 (linha de células' estromais humanas da medula óssea): fornecidas pelo professor. Keisuke Sotoyama, Dr. Makoto Aizawa do 11

Tokyo Medicai College, Ia medicina; ver J. Cell. Physiol., 148, 245-251, 1991 e Experimental Hematol., 22, 482-487, 1994) e o HUVEC (células endoteliais do cordão da veia umbilical humano: ATCC No, CRL-1730) são escolhidos como uma fonte de tecido. A síntese do ADNc de cordão duplo utilizando um iniciador aleatório é realizada por métodos conhecidos.

Quaisquer locais podem ser usados como o local I de reconhecimento da endonuclease de restrição o qual está ligado ao adaptador e o local II de reconhecimento da .endonuclease de restrição, que é utilizado na etapa (2), se ambps os locais forem diferentes um do outro. Preferivelmente, o EcoRI é usado como uma enzima I e Xhol como enzima II.

Na etapa (2), o ADNc é criado com extremidades planas com polimerase de ADN T4, ligado com o adaptador da enzima II e digerido com a enzima I. 0 fragmento de ADNc é analisado com eletroforese em gel de agarose (AGE) e a fração de ADNc é seleccionada variando, em tamanho de 300 a 800 pb. Como mencionado acima, qualquer enzima pode ser . utilizada' como enzima II, se não for igual à enzima I.

Na etapa (3), o fragmento de ADNc obtido na etapa (2), está inserido no vector de expressão da levedura na região a montante do gene da invertase cujo péptido de sinal é eliminado. O E. Coli transformado com. o vector de expressão. Muitos vectores são conhecidos como vector de plasmideo da expressão da levedura. Por exemplo, YEp24 também funciona em E. coli. Preferivelmente é usado o pSUC2 como descrito acima.

Muitas estirpes hospedeiras de E. Coli. são conhecidas para transformação, preferivelmente é usada a célula competente DH10B. Qualquer método de transformação conhecido está disponível, 12 preferivelmente, é realizado pelo método de electroporação. O transformante é culturado pelos métodos convencionais para a obtenção de biblioteca de ADNc para o método SST de levedura.

No entanto, nem todos os clones contêm o fragmento de ADNc. Além disso nem todos os fragmentos do gene codificam os péptidos de sinal desconhecidos. É necessário, portanto, o rastreio de um fragmento de gene que codifica um péptido de sinal desconhecido a partir da biblioteca.

Por isso, o rastreio de fragmentos contendo uma sequência que codifica um péptido de sinal adequado é realizado pela transformação da biblioteca de ADNc em Saccharomyces cerevisiae (por exemplo a estirpe de YT455) a que falta a invertase (que pode ser preparado por métodos conhecidos). A transformação de leveduras é realizada por métodos conhecidos, por exemplo, o método de acetato de litio. 0 transformante é cultivado num meio selectivo, em. seguida, transferido para um meio contendo rafinose como uma fonte de carbono. As colónias sobreviventes são selecionadas e., em seguida, o plasmideo preparado. As colónias sobreviventes num meio de rafinose indicam que algum péptido de sinal ' de proteína segregadora foi inserida a este clone.

Isolados os clones positivos, está determinada a sequência nucleotídica. Tal como o ADNc codifica uma proteína desconhecida, o clone de comprimento completo pode ser isolado, utilizando um fragmento de ADNc como uma sonda e, em seguida, determinado para se obter a sequência nucleotídica de comprimento completo. Esta manipulação é realizada por métodos conhecidos.

Uma vez que as sequências de nucleótidos mostradas na SEQ ID NO. 2, 3, 6 ou 7 são determinadas parcialmente ou preferivelmente completamente, é possível obter-se o ADN que- codifica a própria proteína de mamíferos, homóloga ou de sub-sistema. A biblioteca de 13 ADNc ou de ARNrrt proveniente de mamíferos foi rastreada por PCR com quaisquer iniciadores de oligonucleótidos sintetizados ou . por hibridização com qualquer fragmento como com uma sonda. É possível obter-se o ADN que codifica outra proteína homóloga de mamíferos proveniente de outro ADNc de mamíferos ou biblioteca de genoma.

Se um ADNc obtido anteriormente contém uma sequência de nucleótidos de fragmento de ADNc obtido por SST (ou a sua sequência de consenso), será pensado que o ADNc codifica o péptido de sinal. Portanto, é evidente que o ADNc será de comprimento completo ou quase completo. (Todas as sequências de sinal existem no terminal N de uma proteína e são codificadas na extremidade de 51 do quadro de leitura aberta de ADNc.) A confirmação pode ser efectuada através da análise de Northern com o referido ADNc como uma sonda'. Pensa-se que o ADNc é quase de comprimento completo, se o comprimento do ADNc for quase o mesmo comprimento do ARNm obtido na banda de hibridização.

Logo que as sequências de nucleótidos mostradas em SEQ ID NOs. 2, 3, 6 ou 7 são determinados, os ADNs da invenção são obtidos por síntese química, ou pela.hibridização fazendo uso de fragmentos de nucleótidos os quais são quimicamente sinterizados como uma sonda. Além disso, os ADNs da invenção são obtidos na quantidade desejada pela transformação dé um vector que contém o ADN em um hospedeiro apropriado, a pela culturação do transformante.

Os polipêptidos da invenção podem ser preparados por: (1) isolamento e purificação a partir de um organismo ou de uma célula culturada, 14 (2) sintetização química, ou (3) utilizando tecnologia de ADN recombinante, preferivelmente, através do método descrito em (3)., em uma produção industrial.

Os exemplos do sistema de expressão (sistema de vector hospedeiro) para a produção de um polipéptido, utilizando tecnologia de ADN recombinante são a expressão dos sistemas de bactérias, leveduras, células de insectos e células de mamíferos.

Na expressão do polipéptido, por exemplo, em E. Coli, o vector de expressão é preparado através da adição do codão de iniciação (ATG) à extremidade de 5' de um ADN que codifica um péptido maduro, conectando o ADN assim obtido a jusante de um promotor apropriado (por exemplo, . o promotor trp, o promotor lac, o promotor λ PL, o promotor T7 etc.) e, em seguida, inserindo-o em um vector (por exemplo, pBR322, pUC18, pUC19 etc.) que funciona em uma estirpe de Ξ. coli. .

Em seguida, uma estirpe de E. coli (por exemplo, a estirpe de E. coli DHl, a estirpe de E. coli JM109, a estirpe de E. coli HB101, etc.) a qual é transformada com o vector de expressão acima descrito pode ser cultivada em um meio apropriado para a obtenção do polipéptido desejado. Quando um péptido de sinal de bactérias (por exemplo, um péptido de sinal de pel B) é utilizado, o polipéptido desejado também pode ser libertado em citoplasma. Além disso, uma proteína de fusão com outros polipéptidos pode ser também produzida com facilidade.

Na expressão do polipéptido, por exemplo, em células de mamíferos, por exemplo, o vector de expressão é preparado através da inserção do ADN que codifica o nucleótido mostrado na SEQ ID NO. 3 ou 7 a 15 jusante de um promotor apropriado (por exemplo, o promotor SV40, o promotor LTR, o promotor da metalotioneína etc.) em um vector apropriado (por exemplo, o vector do retrovírus, o vector do vírus papiloma, o vector do vírus vacínia, o vector SV40, etc.). Uma célula de mamífero apropriada (por exemplo, a célula COS-7 do macaco, a célula CHO do hamster chinês, a célula L do rato etc. ) é transformada com o vector de expressão assim obtido, e, em seguida, o transformante é cultivado num meio adequado para se obter um polipéptido desejado na membrana celular. Um vector descrito acima pode ser inserido com supressão do ADN mutante que codifica a sequência, que é eliminada da região transmembranar a partir das: SEQ ID NOs. 3 ou 7 e o vector de expressão pode ser transfectado em uma célula de mamífero adequada. A proteína alvo solúvel pode ser segregada no meio de cultura. 0 polipéptido disponível pela maneira descrita acima pode ser isolado e purificado pelo método bioquímico convencional.

Aplicabilidade Industrial 0 polipéptido OAF065s da invenção mostra homologia significativa com uma série.de proteínas que pertencem à família do. receptor de TNF. As proteínas, que pertencem à família do receptor de TNF, são a proteína de membrana de tipo 1 a qual tem de 3 a 6 estruturas repetidas contendo 6 resíduos de Cys no'domínio extracelular. Ficou evidente que as proteínas estão relacionadas com a morte celular, proliferação, diferenciação de várias células pela interacção com os seus ligandos (Craig A. Smith et. al.', Cell, 76, 959-962, 1994) . Por exemplo, o receptor do factor de crescimento neuronal (NGF) / NGF são essenciais para conservar sobreviventes os vários tipos de células neuronais, permitindo aos tubos neuronais alongar-se e promover-se para fazer transmissores neuronais (Chao M.V., J. Neurobiol., 25, 1373-1385, 1994). Fas/FasL é essencial para a manutenção da homeostase in vivo, tal como a destruição de células 16 cancerosas e a remoção de linfócitos auto-reactivos através da sua actividade induzida pela apoptose, e também diz respeito a células T CD4 positivas na redução da SIDA, hepatite fulminante, enxerto versus doença hospedeira (GVHD) após o transplante e o aparecimento de várias doenças auto-imunes (Nagata S. et. al., Science, 267, 1449-1456, 1995). 0 CD40/CD40L é essencial'para activar as células B (aceleração do crescimento e a produção de anticorpos) através da interacção da célula T/B (Banchereau . J. et. al., Annu. Rev. Immunol., 12, 881-922, 1994). 0 receptor TNF / TNF ê o receptor de linfotoxina (LT) / LT tem actividades, tais como o crescimento, a indução de activação e de diferenciação de várias células imunes e hematopoiéticas, citotoxicidade e inibição do crescimento das células tumorais, o crescimento e a activação de vários tecidos conjuntivos (por exemplo, células endoteliais, fibroblastos, osteoblastos, etc.) e a inibição do crescimento virai, e também são essenciais para a morfologia ou a formação do órgão ou de tecido linfóide (Ware C.F. et al., Curr. Topics Microbiol. Immunol., 198, 175-218, 1995).

Uma vez que as estruturas repetitivas de Cys estão presentes em três pontos do domínio extracelular do. polipéptido da invenção, é óbvio que este é uma nova proteína pertencente à família, do receptor de TNF e exerce a sua actividade através de um ligando que pertence a uma família de TNF conhecida ou desconhecida. Em consequência, é considerado que o polipéptido da invenção e uma molécula de ADNc os quais codificam o polipéptido irá mostrar um ou mais dos efeitos ou actividades biológicas (incluindo aqueles que se referem às experiências citadas abaixo) no que se refere à diferenciação, proliferação, crescimento, sobrevivência ou morte de células de células hematopoiéticas, do sistema imunitário e nervoso, funções do sistema imunitário, a proliferação e o crescimento de tumores, inflamações, metabolismo ósseo, etc. Os efeitos ou as actividades biológicas descritas em relação ao 17 polipéptido da invenção são fornecidos pela administração ou a utilização do polipéptido ou pela administração ou a utilização de uma molécula de ADNc que codifica o polipéptido (p.or exemplo, o vector adequado para a terapia genética ou para a introdução de ADNc). 1} Actividade da citoquina e proliferação celular/actividade de· diferenciação 0 polipéptido da invenção pode apresentar citocina, proliferação celular (quer induzindo ou inibindo) ou actividade de diferenciação·, celular (quer induzindo ou inibindo) ou pode induzir a produção de outras citoquinas, em certas populações de células. Muitos factores de proteina descobertos até à data, incluindo todas as citoquinas conhecidas, apresentaram actividade em um ou mais ensaios de proliferação celular dependente do factor e, consequentemente, os ensaios servem como uma confirmação conveniente da actividade da citoquina. A actividade de um polipéptio da invenção é comprovada por qualquer um de uma série de ensaios de rotina de proliferação celular dependente do factor para as linhas celulares. 2) Estimulação imune/actividade supressora 0 polipéptido da invenção pode também apresentar estimulação imune ou atividade supressora imune. O polipéptido da' invenção pode ser útil no tratamento de diversas doenças e deficiências imunológicas (incluindo a imunodeficiência combinada grave (SCID)), por exemplo, na regulação (para cima ou para baixo) do crescimento e da multiplicação de linfócitos T e/ou B, assim como a. realização da actividade citolitica de células NK e de outras populações celulares. Estas deficiências imunológicas podem ser genéticas ou serem causadas por virus (por exemplo,. VIH), bem como infecções bacterianas ou fúngicas, ou podem resultar de perturbações auto- 18 imunes. Mais especificamente, as doenças infecciosas causadas por infecções virais, bacterianas, fúngicas ou outras podem ser tratadas usando o poliéptido da invenção, incluindo infecções por VIH, vírus da hepatite, virus do herpes, micobactérias, leishmaniose,' malária e várias infecções fúngicas, tais como Candida. Evidentemente, a este respeito, um polipéptido da invenção pode também ser útil quando um impulso para o sistema imunitário geralmente seria indicado, ou seja, no tratamento do cancro.

Um tal polipéptido da invenção pode também ser útil no tratamento .de reações e condições alérgicas, tal. como a asma ou outros problemas respiratórios. .0 poliéptido da invenção também pode suprimir inflamações agudas ou crónicas, tais como, por exemplo, aquela associada com infecção (tail como o choque séptico ou a síndrome de resposta inflamatória sistémica (SIRS)), a doença inflamatória intestinal, a doença de Crohn ou resultante do excesso de produção de citoquinas tais como o TNF ou o IL-I (tal como o efeito demonstrado por IL-11). 3) Actividade de regulação da hematopoiese 0 polipéptido da invenção pode ser útil na regulação da hematopoiese e, consequentemente, no tratamento de deficiências de células mielóides ou linfóides·. Mesmo a actividade biológica marginal de apoio de células que formam colónias ou de linhas celulares dependentes do faç.tor indicam o envolvimento na regulação da hematopoiese.

As referidas actividades biológicas estão relacionadas com todos ou alguns dos exemplo(s) seguintes, por exemplo no apoio ao crescimento e à proliferação das células progenitoras de eritróides isoladamente ou em combinação com outras citoquinas, indicando 19 assim a utilidade, por exemplo, no tratamento de diversas anemias ou para a utilização em conjunto com a irradiação/quimioterapia para estimular a produção de precursores de eritróides e/ou de células de eritróides; no apoio ao crescimento e à proliferação das células mielóides tais como os granulócitos e monócitos/macrófagos (ou seja, a actividade de CSF tradicional) útil, por exemplo, em conjunção com a quimioterapia para prevenir ou tratar a consequente mielo-supressâo; no apoio ao crescimento e à proliferação de megacariócitos e consequentemente, de plaquetas permitindo assim a prevenção ou o tratamento de várias desordens plaquetárias tal como a trombocitopenia e, em geral, para utilização no lugar de ou complementarmente, a transfusões plaquetárias; e/ou no apoio ao crescimento e à proliferação de células estaminais hematopoiéticas, as quais são capazes de vencer todas e quaisquer das células hematopoiéticas acima mencionados e, portanto, encontrar utilidade terapêutica em várias desordens de células estaminais (tal como aquelas habitualmente tratadas com transplantes, incluindo, sem limitação, a anemia aplástica e a hemoglobinúria paroxística noturna), bem como no repovoamento no compartimento das células estaminais após irradiação/quimioterapia, quer in vivo ou ex vivo (ou seja, em conjunção com o transplante da medula óssea) como células normais ou geneticamente manipuladas para a terapia genética. A actividade do polipéptido da invenção pode, entre outros meios, ser medida pelos métodos seguintes: 4} Geração de tecido/actividade de regeneração 0 polipéptido da invenção também pode ter utilidade em composições utilizadas para o crescimento ou a regeneração de ossos, 20 cartilagem, tendões, ligamentos e/ou tecidos nervosos, bem como para a cicatrização de feridas e a reparação de tecidos, e no tratamento das ancas, incisões e úlceras. 0 polipéptido da invenção, o qual induz o crescimento ósseo e/ou da cartilagem em circunstâncias em que o osso não é formado normalmente, tem aplicação na cicatrização de fracturas ósseas e defeitos ou danos da cartilagem nos seres humanos e outros animais. Essa preparação que emprega o polipéptido da invenção pode ter utilização profilática na redução da fractura fechada ou aberta e também em melhorar a fixação das articulações artificiais. A formação do novo osso induzida por um agente osteogénico contribui para a reparação da ressecção congénita, trauma induzido ou oncológica induzida por defeitos craniofaciais, e também . é útil na cirurgia plástica cosmética. O polipéptido desta invenção pode também ' ser utilizado no tratamento da doença periodontal, e em outros processos de reparação dos dentes. Esses agentes podem fornecer um meio para-atrair as células formadoras de osso, estimular o crescimento de células formadoras de osso ou induzir a diferenciação dos progenitores das células formadoras de osso. O polipéptido da invenção pode também ser útil no tratamento da osteoporose ou da osteoartrite, tal como através da estimulação da reparação do osso e/ou da cartilagem ou bloqueando a inflamação ou os processos de destruição tecidual {actividade da colagenase, actividade osteoclástica, etc) mediada por processos inflamatórios.

Uma· outra categoria daactividade de regeneração tecidual que pode ser atribuível· ao polipéptido da invenção é a formação de tendão/ligamento. Um polipéptido da invenção, o qual induz a formação de tecido semelhante a tendão/ligamento ou de outros tecidos em circunstâncias em que tais tecidos não são formados normalmente, tem aplicação na cicatrização da deliceração do tendão 21 ou ligamento, deformidades e outros defeitos do tendão ou do ligamento, nos seres humanos e outros animais. Essa preparação empregando um tecido semelhante a tendão/ligamento induzindo o polipéptido pode ter uso profilático na prevenção de danos ao tecido do tendão ou do ligamento, bem como a utilização na melhoria da fixação do tendão ou ligamento ao osso ou a outros tecidos, e, para reparar defeitos no tecido do tendão ou do ligamento. Ά formação de novo tecido semelhante a tendão/ligamento induzido por uma composição da invenção contribui para a reparação de defeitos congénitos, de trauma induzido, ou outros de tendão ou ligamento de outra origem, e também é útil na cirurgia plástica cosmética para a ligação ou reparação de tendões ou ligamentos. As composições da invenção podem fornecer um meio para atrair as células de formação de tendão ou de ligamento, estimular o crescimento das células de formação do tendão ou ligamento, induzir a diferenciação dos progenitores de células de formação do tendão ou ligamento, ou induzir o crescimento das células de ligamento do tendão ou progenitores ou ex vivo para retornar in vivo para efectivamente reparar os tecidos. As composições da invenção podem também ser úteis no tratamento de tendinites, síndroma do canal cárpico e outros defeitos do tendão ou ligamento. As composições podem também incluir uma matriz adequada e/ou agente de segregação como um portador como é bem conhecido na técnica. 0 polipéptido da invenção pode também ser útil para a proliferação .de células neurais e para a regeneração do tecido nervoso e cerebral, ou seja, para o tratamento de doenças do sistema nervoso central e do periférico e neuropatias, assim como desordens mecânicas e traumáticas, que envolvem a degeneração, morte ou trauma de células neurais ou de tecido nervoso. Mais especificamente, o polipéptido da invenção pode ser utilizado no tratamento de doenças do sistema nervoso periférico,· tais como lesões do nervo periférico, neuropatia periférica e neuropatias 22 localizadas, e de doenças do sistema nervoso central, tal como a doença de Alzheimer, de Parkinson, a doença de Huntington, a esclerose lateral amiotrófica, e a Síndroma de Shy-Drager. Outras condições que podem ser tratadas de acordo com a invenção incluem perturbações mecânicas e traumáticas, tais como perturbações da medula espinhal, traumatismo craniano e doenças vasculares cerebrais tal como apoplexia. Neuropatias periféricas resultantes da quimioterapia ou de outros tratamentos médicos podem também ser tratáveis usando o polipéptido da invenção.

Espera-se que o polipéptido da invenção possa também apresentar actividade para a geração de outros tecidos, tais como os órgãos(incluindo, por exemplo, o pâncreas, o fígado, o intestino, o rim, a pele, o endotélio), os músculos (liso, esquelético ou cardíaco) e o tecido vascular (incluindo o endotélio vascular), ou para promover a proliferação de células compreendendo esses tecidos. Parte dos· efeitos desejados pode ser pela inibição da cicatr.ização fibrótica para permitir a regeneraçãoo do tecido normal.

Um polipéptido da invenção pode também ser útil para a protecção' ou regeneração do intestino e o tratamento de fibrose pulmonar ou hepática, a reperfusao dos danos em vários tecidos, e as condições decorrentes de danos .da citoquina sistémica. 5) Actividade da activina/inibina 0 polipéptido da invenção pode também apresentar actividades relacionadascom a activina ou a inibína. As inhibinas são caracterizadas pela sua capacidade de inibir a libertação da hormona de estimulação do folículo (FSH), enquanto que as activinas são caracterizadas pela sua capacidade de estimular a libertação da hormona de estimulação do folículo (FSH). Assim, um polipéptido da 23 invenção por si só ou em heterodimeros com um membro da familia da inibina a, pode ser útil como um contraceptivo com base na capacidade das inhibinas de diminuir a fertilidade nos mamíferos femininos e diminuir espermatogénese nos mamíferos masculinos. A administração de quantidades suficientes de outras inhibinas podem induzir a infertilidade nestes mamíferos. Alternativamente, o polipéptido da invenção, como um homodímero ou como um heterodímero com outras subunidades de proteínas do grupo da inibina-β, pode ser útil como um terapêuticoindutor da fertilidade, tendo por base a capacidade das moléculas da activina para estimularem a libertação de FSH de células da pituitária anterior. Ver, por exemplo, o documento USP 4.798.885. 0 polipéptido da invenção pode também ser útil para o avanço do aparecimento da fertilidade em mamíferos sexualmente imaturos., a fim de aumentar a vida útil do desempenho reprodutivo dos animais domésticos, tais como vacas, ovelhas e porcos. 6) Actividade quimiotática/quimiocinética

Um polipéptido da invenção pode ter actividade quimiotática ou quimiocinética (por exemplo, agir como uma quimioquina) para células de mamíferos, incluindo, por exemplo, monócitos, neutrófilos, células-T, mastócitos, eosinófilos e/ou células endoteliais. As proteínas quimiotáticas e quimiocinéticas pode ser usadas para mobilizar ou atrair uma população de células desejada a um local de acção desejado. As proteínas quimiotáticas ou quimiocinéticas fornecem vantagens particulares no tratamento de feridas e outros traumas de tecidos, bem como no tratamento de infecções localizadas. Por exemplo, a atracção de linfócitos, monócitos e neutrófilos a tumores ou locais de infecção pode resultar no. aumento de respostas imunes contra o tumor ou o agente infeccioso. 24

Uma proteína ou péptido tem actividade quimiotática para uma população celular determinada se puder estimular, directa ou indirectamente, a orientação dirigida ou circulação de tal população de células. De preferência, as proteínas ou péptido têm a capacidade de estimular directamente dirigida à circulação das. células. Se uma determinada proteína tem actividade quimiotática para uma população de células pode ser prontamente determinada por se empregarem tais proteínas ou péptidos, em qualquer ensaio conhecido para a quimiotaxia de células. 7) Actividade t.rombolítica e hemo st ática 0 polipéptido da invenção pode também apresentar actividade hemostática ou trombolítica.' Como resultado, espera-se que essa proteína venha a ser útil no tratamento de várias perturbações da coagulação {incluindo as doenças hereditárias, tal como a hemfiliá) ou para melhorar a coagulação e outros eventos hemostáticos em tratamento de feridas resultantes de trauma, cirurgia ou outras causas. Uma proteína da invenção pode também ser útil para dissolver ou inibir a formação de tromboses e para o tratamento e prevenção de condições daí resultantes (tal como por exemplo, o enfarte ou a apoplexia). 8) Actividade do receptor/ligando 0 polipéptido da invenção também pode demonstrar actividade como receptores, ligandos de receptores ou inibidores ou agonistas de interacções de receptores/ligandos. Os exemplos desses receptores e ligandos incluem, sem limitação, receptores da citoquina e os seus ligandos, cinases receptoras e os seus ligandos, fosfatases receptoras e os seus ligandos, os receptores envolvidos nas interacções de célula-célula e os seus ligandos(incluindo as moléculas de adesão celular (tais como sd selectinas, integrinas e 25 os seus ligandos) e os pares receptor/ligando envolvidos na apresentação do antigénio, no reconhecimento do antigeno e no desenvolvimento de respostas imunes humorais e celulares). Os receptores e os ligandos são igualmente úteis para a análise de potenciais péptidos ou de inibidores de moléculas pequenas da interacção pertinente de receptor/ligando. Um polipéptido da invenção (incluindo, sem limitação, fragmentos de receptores e ligandos) poderão éles próprios ser úteis como inibidores de interacções de receptor/ligando. 9) Outra actividade 0 polipéptido da invenção pode também apresentar uma ou mais das seguintes actividades ou efeitos adicionais: a inibição do crescimento, a infecção ou a função de, ou matar, agentes infecciosos, incluindo, bactérias, vírus, fungos e outros parasitas; efectuar (suprimindo ou reforçando) caracteristicas corporais, incluindo, a altura, o peso, a cor do cabelo, a cor dos olhos, a pele, a gordura para apoiar a proporção ou outra pigmentação de tecido, ou dimensão ou forma de parte de órgãos ou do corpo, (como, por exemplo, o aumento ou a diminuição da mama); efectuando a eliminação da dieta de gorduras, proteínas, hidratos de carbono; efectuando caracteristicas comportamentais, incluindo o apetite, a libido, o stress, a cognição (incluindo distúrbios cognitivos), a depressão e comportamentos violentos; fornecendo efeitos analgésicos ou outros efeitos da redução da dor; apromoção da diferenciação e o crescimento' das células estaminais embrionárias em linhagens diferentes das linhagens hematopoiéticas; no caso das enzimas, a correcção de deficiências da enzima e o tratamento das doenças relacionadas com a deficiência. 26 0 polipéptido com as actividades acima referidas, é suspeito de ter as seguintes funções por si próprio ou a interacção com os seus ligandos ou receptores ou a associação com outras moléculas. Por exemplo, a proliferação ou a morte de células decélulas B, células T e/ou de mastócitos ou a indução especifica de classe de células B pela promoção da troca de classe dos genes da imunoglobulina; a diferenciação de células B às células formadoras de anticorpos; a proliferação, diferenciação, ou morte celular dos precursores dos granulócitos; a proliferação, diferenciação, ou morte celular dos precursores de monócitos-macrófagos; a proliferação, de até a regulação ou morte celular de neutrófilos, monócitos-macrófagos, eosinófilos e/ou básófilos; a proliferação, ou morte celular dos precursores dos megacariócitos; a proliferação, diferenciação,' ou morte celular dos precursores de neutrófilos; a proliferação, diferenciação, ou morte celular dos precursores das células T e das células B; a promoção da produção de eritrócitos; a subsistência da proliferação de eritrócitos., neutrófilos, eosinófilos, básófilos, monócitos-macrófagos, mastócitos, precursores de megacariócitos; a promoção da migração de neutrófilos, monócitos-macrófagos, células B e/oU de células T; a proliferação ou morte celular de timócitos; a supressão da diferenciação dos adipócitos; a proliferação ou morte celular de células letais naturais;.· a proliferação ou morte . celular de . células estaminais hematopoiéticas; a supressão da proliferação de células estaminais e de cada célula precursora hematopoiética; a promoção da diferenciação de células estaminais mesenquimais a osteoblastos ou condrócitos, a proliferação de células, ou morte de células estaminais mesenquimatosas, osteoblastos ou condrócitos e a promoção de absorção óssea pela activação' dos osteoclastos e da promoção da diferenciação de monócitos a osteoclastòs. 27

Este péptido é também suspeito de função para o sistema nervoso, tão esperado que tenha as funções abaixo; a diferenciação de tipos de neurónios responsivos-neiirotransmissores, a sobrevivência ou a morte celular destas células; a promoção da proliferação ou morte celular de células gliais; a propagação de dendrites neurais; a sobrevivência ou morte celular de gangríocites; a proliferação, promoção da diferenciação, ou morte celular de astrócitos; a proliferação ' ou sobrevivência dos neurónios periféricos; a proliferação ou morte celular das células de Schwann; a proliferação, sobrevivência ou morte celular de motoneurónios.

Além disso, no processo de desenvolvimento do inicio embrionário, este polipéptido é esperado para promover ou inibir a organogénese da epiderme, cérebro, coluna vertebral, e sistema nervoso pela indução da ectoderme, aquela de tecidos conjuntivos notocórdios(ossos, músculos, tendões), hemócitos, coração, rins, e órgãos genitais pela indução da mesoderme, e, aquela do aparelho digestivo (estômago, intestino, fígado,. pâncreas), do aparelho respiratório (pulmão, traqueia) pela indução, da endóderme. Nos adultos, também, pensa-se que este polipéptido prolifera ou inibe os órgãos acima referidos.

Por conseguinte, este polipéptido ele próprio é esperado para ser usado como um agente para a prevenção ou tratamento de doenças de progressão ou a supressão de função imunitária, nervosa, ou metabólica óssea, hipoplasiaou excesso de crescimento de células hematopoiéticas; doença inflamatória (reumatismo, colite ulcerosa, etc) , diminuição de células estaminais hematopoiéticas após transplante de medula óssea, diminuição dos leucócitos, plaquetas, células B, ou células T após a exposição às radiações ou dosagens quimioterápicas contra o cancro ou a ';leuçemia, anemia, doenças infecciosas, cancro, leucemia, SIDA, doença metabólica óssea 28 (osteoporose etc.), diversas doenças degenerativas (doença de Alzheimer, a esclerose múltipla, etc.) , qu, lesão nervosa.

Além disso, uma vez que se pensa que este polipéptido induz a diferenciação ou o crescimento de órgãos derivados d.e ectoderifia,. mesoderme, e endoderme, este polipéptido é esperado ser um agente para reparar tecidos (epiderme, ossos, músculos, tendões, coração, rins, estômago, intestino, fígado, pâncreas, pulmão e traqueia, etc.). A : quantificação do polipéptido da. invenção no' corpo podem, ser realizada utilizando anticorpos monoclonais ou policlonais contra o polipéptido dã invenção. Pode ser usado o estudo da1 relação entre este polipéptido e a doença ou o diagnóstico da doença, e assim por diante. Os anticorpos policlonais e monoclonais - podem ser preparados utilizando este polipéptido como um antigénio pelos métodos convencionais. . A identificação, purificação ou clonagem molecular de proteínas conhecidas ou desconhecidas que ligam o polipéptido da invenção (de preferência o polipéptido de domínio extracelular) pode ser. realizada utilizando o polipéptido da invenção, por exemplo, a preparação da coluna de afinidade.. A identificação das moléculas da transmissão de sinal a jusante que interagem com o polipéptido da invenção em citoplasma.e clonagem molecular do gene pode ser realizada: pelo método este-oeste usando o polipéptido da invenção (de preferência o polipéptido da região transmembranar ou o domínio intracelular) ou pelo sistema de dois híbridos de levedura usando o ADNc (de preferência o ADNc que codifica a região transmembranar ou o domínio citoplasmático do polipéptido)- " 29

Os agonistas/antagonistas deste polipéptido receptor e os inibidores entreo receptor e as moléculas de transdução de sinal podem ser rastreados utilizando o polipéptido da invenção.

Os ADNcs da invenção são úteis, não só o modelo importante e essencial para a produção do polipéptido da invenção que se espera ser em grande medida útil, mas também ser útil para o diagnóstico ou o tratamento (por exemplo, o tratamento para a falta de genes, o tratamento para parar a expressão do polipéptido pelo ADN de anti-sentido (ARN)).- 0 ADN genómico pode ser isolado com o ADNc da invenção, como uma sonda. Como da mesma maneira, um gene humano de codificação que pode ser altamente homólogo ao ADNc da invenção, ou seja, que codifica um polipéptido altamente homólogo ao polipéptido da invenção e de um gene de animais com excepção do 'rato, que pode ser altamehte homólogo ao ADNc da invenção, também pode ser isolado.

[Aplicação a medicamentos] 0 polipéptido da invenção ou o anticorpo especifico para o polipéptido da invenção é administrado sistemicamente ou topicamente e, em geral, por via oral ou parentérica para prevenir ou tratar doenças relacionadas com o crescimento incompleto ou o crescimento anormal de células do sistema hematopoiético, a aceleração ou a redução das funções do sistema nervoso ou a aceleração ou redução das funções do sistema imunitário, tais como as doenças inflamatórias (por exemplo, reumatóide, colite ulcerosa, etc.), a citopenia de células estaminais hematopoiéticas após transplante de medula óssea,, a citopenia de leucócitos, plaquetas, células B ou células T após tratamento de radiação ou após a administração de um agente quimioterápico, anemia, doenças infecciosas, cancro, leucemia, SIDA, , e diversas doenças degenerativas (por exemplo, a doença de Alzheimer, a esclerose múltipla, etc), ou danos nervosos, para prevenir ou tratar a doença 30 metabólica dos ossos (por exemplo, a osteoporose, etc.), ou para reparar tecidos. A administração oral, a injecção intravenosa e a administração intraventricular são preferidas.

As doses a serem administradas dependem da idade,· dò peso corporal, dõs sintomas, do efeito terapêutico desejado, da via de administração, e da duração do tratamento etc. Em humanos adultos, uma dose por pessoa está geralmente entre 100 yg e 100 mg, pela administração oral, até várias vezes por dia, e entre 10 yg ê 100 mg, pela administração parentérica até várias vezes por dia.

Como mencionado acima, as doses a utilizar dependem de várias condições. Por isso, há casos em que doses inferiores ou superiores às das variações especificadas acima podem ser usadas.

Os compostos da invenção podem ser administrado como composições sólidas, composições liquidas ou outras composições para a administração oral, como injecções, unguentos ou supositórios etc. para administração parentérica.

As composições sólidas para a administração oral incluem comprimidos compressos, pílulas, cápsulas, pós de dispersão, grânulos. As cápsulas incluem cápsulas moles ou duras.

Em tais composições, um ou mais do(s) composto (s) activos(s) é ou são misturados com pelo menos um diluente inerte (tal como a lactose, manitol, glicose, celulose de hidroxipropilo, celulose microcristalina, amido, polivinilpirrolidona, metassilicato de magnésio, aluminato, etc). As composições podem igualmente compreender, como é prática normal, substâncias adicionais diferentes de diluentes inertes, por exemplo: agentes lubrificantes (tais como o estearato de magnésio, etc.), ^agentes de desintegração (tais como o glicolato de cálcio de celulose, etc.), agentes de 31 estabilização (tais como a álbumina humana, lactose etc..), e agentes auxiliares para dissolução (tais como a arginina, o.ácido asparaginico, etc.).

Os comprimidos ou pílulas podem, se assim desejado, serem revestidos com uma película de materiais gástricos ou entéricos (tais como o açúcar, gelatina, celulose de hidroxipropilo ou ftalato de celulose de hidroxipropilmetilo, etc.), ou serem revestidos com mais de duas películas. E depois, o revestimento pode incluir a contenção dentro das cápsulas de materiais absorvíveis tal como a gelatina.

As composições líquidas para a administração oral incluem emulsões, soluções, xaropes e elixires farmaceuticamente aceitáveis. Em tais composições, um ou mais do(s) composto(s) activos(s) está ou estão contidos no(s) diluente(s) inerte(s) comumente utilizados (água purificada, etanol, etc.). Além dos diluentes inertes,, tais composições podem ainda compreender adjuvantes (tais como humidificantes, agentes de suspensão, etc.), agentes adoçantes, agentes de sabor, agentes aromantes, e agentes de preservação.

Outras composições para a administração oral incluem composições de pulverização que podem ser preparadas por métodos conhecidos e que compreendem um ou mais dos compostos activofs.) . As composições de pulverização podem compreender substâncias adicionais diferentes dos diluentes inertes, por exemplo: agentes de estabilização (sulfito de sódio, etc.), tampão isotónico (cloreto de sódio, citrato de· sódio, ácido cítrico, etc.).- Para a preparação dessas composições de' pulverização, por exemplo, 0 método descrito na Patente norte-americana No. 2868691 ou 3095355 (aqui incorporadas por referência na sua totalidade) podem ser utilizadas. 32

As injecções para administração parentérica incluem soluções aquosas ou não aquosas estéreis, suspensões e emulsões. Em tais composições, um ou mais composto(s)ativo(s) é ou são misturados com pelo menos um diluente aquoso inerte {água destilada para a injecção, solução salina fisiológica, etc.) ou diluentes(s) não-aquosos inertes (propiieno glicol, polietileno glicol, azeite, etanol, POLYSOLBATE 80 TM, etc.).

As injecções podem compreender compostos adicionais que não sejam diluentes inertes, por exemplo: agentes de preservação, agentes humidificantes, agentes emulsionantes,. agentes dispersantes, agente de estabilização (tal como a albumina do soro humano, lactose, etc.), e agentes auxiliares tais como agentes auxiliares para dissolução (arginina, ácido asparaginico, etc.).

Melhor Forma de realização da Invenção A invenção é ilustrada pelo seguinte exemplo, mas que não limita a invenção.

Exemplo 0 ARN total foi preparado a partir da linha de célula HAS303 estromal da medula óssea humana (fornecida pelo Professor Keisuke Sotoyama, Dr. Makoto Aizawa, primeira medicina, Tokyo Medicai

College; Ver J. Cell. Physiol., 148: 245-251 (1991) e Experimental Hematol., 22: 482-487(1994)) com o reagente TRIzol (marca registada, GIBCOBRL). O ARN Poly(A) foi purificado a partir do ARN total através do estojo de purificação· de ARNm (nome comercial, Pharmacia). 33 Síntese do. ADNc e por. Clonagem do - Plasmídeo (nome de marca, GIBCOBRL). com o ARN po.li (A) acima como modelo e 9mer aleatório como iniciador que estava contido no local de Xhol: SEQ ID NO. 9 5'-CGA TTG AAT.TCT AGA CCT GCC TGG AGN NNN NNN NN-3 ' 0 ADNc foi ligado ao adaptador de EcoRI pelo estojo de ligação de ADN, .versão 2 (nome comercial, Takara Shuzo; este estojo foi utilizado em todas as etapas de ligação a seguir} e digerido pelo Xhol. . Os ADNcs· foram separados por eletroforese em gel de agarose. 300 - 800. pb de ADNcs foram isolados e foram ligados ao local de EcoRI/Notl depSUC2 (ver a patente norte-americana 5.536.637). As estirpes DH1QB de E. coli foram transformadas por pSUC2 com electroporação para se obter a levedura de SST da biblioteca de ADNc.

Os plasmídeos' da biblioteca de ADNc foram preparados. . As estirpes da levedura YTK12 foram transformadas pelos plasmídeos com o método de acetato de lítio (Protocolos Currentes Em Biologia' Molecular 13.7.1) . As leveduras, transformadas foram chapeadas em meio livre de triptofano- (meio CMD-Try) para a selecção. A placa foi incubada durante 48 horas a 30 °C. A réplica da colónia, que é obtida por Accutran Replica Plater (nome comercial, Schleicher & Schuell) foi colocada numa placa YPR contendo rafinose para a fonte de carbono, e a placa foi incubada durante 14 dias a 30 °C. Depois de 3 dias, cada colónia, aparecida foi marcada na placa YPR novamente. As placas foram incubadas durante 48 horas a 30°C. Uma única colónia foi inoculada em meio de YPR e foi incubada durante 48 horas a 30 °C. Depois os plasmídeos foram preparados. A inserção de ADNc foi amplificada por PCR com dois tipos de iniciadores que existem no lado exstremo do local de clonagem em pSU62 (os iniciadores de cordão de sentido sentido foram biotinilados). Os cordões singulares biotinilados de ADNcs foram purificados com Dynabeads (nome comercial, DYNAL) e determinadas as sequências de nucleotido. 34 A sequencição foi realizada por Reacção Pronta de Sequencição de Ciclo Terminador de Tintura com o estojo de sequencição ' de ADN (nome comercial, Applied Biosystems Inc.) e a sequência foi determinada pelo sequenciador 373 de ADN (Applied Biosystems Inc'. } . Toda a sequenciação a partir daqui foi feita com este método. 0 clone chamado OAFQ65 não é registado nas bases de' dados por pesquisa de homologia de sequência de nucleotídeos e sequência de aminoácidos deduzida e por isso é apurado que a sequência é uma nova. Confirmamos que OAF065 contém o péptido de sinal, tendo em conta a função e a estrutura, por comparação com o péptido conhecido que tem o péptido de sinal e a sequência de aminoácidos deduzida. 0 ADNc de comprimento completo de OAF065 foi isolado por 3'-RACE (Rápida Amplificação da Extremidade de ADNc). 0 estojo de Amplificação de Maratona do ADNc(nome comercial, Clontech) foi utilizado em S^RACE. 0 ADNc de cordão duplo ligado ao adaptador foi preparado a partir de ARN poli(A) de HAS303 em consonância com o método do estojo. 0 iniciador F3 especifico de OAF065 (28mer): SEQ ID NO. 10 5'-AGA AAG ATG GCT TTA AAA GTG CTA CTA G-3' que incluiu uma região de codão ATG de iniciação com base na informação da sequência de nucleótido por SST foi preparado. O PCR foi realizado com o referido iniciador e o iniciador do adaptador ligado ao estojo. Dois tipos de ADNcs (4,0 kb e 1,5 kb) foram amplificados e o ADNc 4,0 kb foi chamado OAF065a e o ADNc 1,5 kb foi chamado OAF065p.

Dois tipos de ADNcs foram separados . còm eletroforese em gel de agarosé, e para pT7 Blue-2. T-Vector (nome comercial, Novagen), ai ligados e transformados em E. coli DH5a e, em seguida, o plasmídeo foi preparado. As sequências de nucleótidos. de extremidade de 5' foram determinadas, bem como a existência do iniciador F3 especifico OAF065 da sequência nucleotídica foram confirmados em ambas as sequências de nucleótidos. A sequência nucleotídica de 35 extremidade de 5' (ca 1,7 kb) de OAF065a e a sequência nucleotidica de comprimento completo de OAF065p foram determinadas e, em seguida, as sequências obtidas mostradas na SEQ ID NOs 3 e 7. O quadro de leitura aberta foi pesquisado e as· sequências de aminoácidos deduzidas mostradas ná SEQ ID NO. 1 e 5'foram.obtidas.

Em comparação com. as sequências de nucleótidos ÓAF065a e OAF065p, as sequências de nucleótidos de 1 a 1290 bases foram completamente as mesmas, mas as sequências a jusante de 1291 bases não tiveram nenhuma.' homologia umas com as outras. Em comparação com as sequências de aminoácidos OAF065a e ΟΑΡ065β., os- aminoácidos de 1 a 415 no terminal N foram completamente os mesmos, só dois aminoácidos no terminal· C de QAF065a foram substituídos para 8 aminoácidos (Arg Vai Gin Arg Leu' Gly Ser Leu) na sequência de OAF065p. Foi revelado que OAF065ot e OAF065£ foram novas proteínas de membrana de tipo I por análise de hidrofobisidade e que a região extracelular e a região transmembranar de ambas as sequências foram consistentes.' O pollpéptido OAF065a e OAF065p da invenção não são .conhecidos, quando as sequências de aminoácidos do polipéptído foram comparadas por um computador para todas as sequências conhecidas em base de dados de Swiss Prot Release 33. A região rica em Cys extracelular que normalmente existe na família do receptor . de TNF foi identificada no polipéptído da invenção.

Isto é, comparado com as sequências de aminoácidos do polipéptído da invenção (OAF065s)f e outros membros da família do receptor de TNF ou seja, o receptor 1 do factor da necrose humana (hTNFRl), o receptor 2 do factor da necrose humana (hTNFR2), o receptor do factor de crescimento do nervo humano {hNGFR), e o Fas humanos (hFas), foi revelado que os polipéptidos (OAF065s) da invenção são a proteína de membrana de tipo I e eles têm uma região rica em Cys 36 extracelular que existe usualmente na família do receptor de TNF (fatç>r da necrose tumoral) na Fig. 1.

Por conseguinte, foi confirmado que os polipéptidos ÒAF065a e OAF065p da invenção são novas proteínas membranares que pertencem à família do receptor de TNF.

LISTA DE SEQUÊNCIAS SEQ ID NO.·: 1'

Comprimento: aminoácido Tipo: aminoácido Topologia: linear Tipo de Molécula: proteína·

Sequência

Phe Phe Thr Leu 15 CyS Glu Thr Gly 30

Met Ala Leu Lys. Vai Leu.Leu Glu Gin Glu Lys Thr 1 5 10

Leu Vai Leu Leu Gly Tyr'Leu Ser Cys Lys Vai Thr 20 25

Asp Cys Arg Gin Gin Glu Phe Arg Asp Arg Ser Gly Asn Cys Vai Pro 35 40 45

Cys Asn Gin CyS Gly Pro Gly Met Glu Leu Ser Lys Glu Cys Gly Phe 50 55 60

Gly Tyr Gly Glu Asp Ala Gin Cys Vai Thr Cys Arg Leu His Arg Phe 65 70 75 80

Lys Glu A.sp Trp Gly Phe Gin Lys Cys Lys Pro Cys Leu Asp Cys Ala 85. 90 95

Vai Vai Asn Arg Phe Gin Lys Ala Asft Cys Ser Ala Thr Ser Asp Ala 100 105 110

Ile Cys Gly Asp Cys Leu Pro Gly Phe Tyr Arg Lys Thr Lys Leu Vai 115 120 125 37

Gly Phe Gin Asp Met Glu Cys Vai Pro CyS Gly Asp Pro Pro Pro Pro 130 135 140

Tyr Glu Pro His Cys Ala Ser Lys Vai Asn Leu Vai Lys Ile Ala Ser 145 150 155 160

Thr Ala Ser Ser Pro Arg Asp Thr Ala Leu Ala Ala Vai Ile Cys Ser 165 170 175

Ala Leu Ala Thr Vai Leu Leu Ala Leu Leu Ile Leu Cys Vai Ile Tyr 180' 185 190

Cys Lys Arg Gin Phe Met Glu Lys Lys Pro Ser Trp.Ser Leu Arg Ser 195 200 205

Gin Asp Ile Gin Tyr Asn Gly Ser Glu Leu Ser Cys Leu Asp Pro Arg 210 215 220

Gin Leu His Glu Tyr Ala His Arg Ala Cys Cys Gin Cys Arg Arg Asp 225 230 235 240

Ser Vai Gin Thr Cys Gly Pro Vai Arg Leu Leu Pro Ser Het Cys Cys 245 250 255

Glu Glu Ala Cys Ser Pro Asn Pro Ala Thr Leu Gly Cys Gly Vai His 260 265 270

Ser Ala Ala Ser Leu Gin Ala Arg Asn Ala-Gly Pro Ala Gly Glu Met 275 280 285

Vai Pro Thr Phe Phe Gly Ser Leu Thr - Gin Ser Ile Cys Gly Glu Phe 290 295 300

Ser Asp Ala Trp Pro Leu Het Gin Asn Pro Met Gly Gly Asp Asn Ile 305 310 315 320

Ser Phe Cys Asp Ser Tyr Pro Glu Leu Thr Gly Glu Asp Ile His Ser 325 .330 335

Leu Asn Pro Glu Leu Glu Ser Ser Thr Ser Leu Asp Ser Asn Ser Ser 340 345- 350

Gin Asp Leu Vai Gly Gly Ala Vai. .Pro Vai Gin Ser His Ser Glu Asn 355 360 365

Phe Thr Ala Ala Thr Asp Leu Ser Arg Tyr Asn Asn Thr Leu Vai Glu 370 375 380 38 38 Ser Ala Ser Thr Gin Asp Ala 385 390 Glu Ser Gly Ala Ile Ile His 405

Leu Thr Met Arg Ser Gin Leu Asp Gin 395 400

Pro Ala Thr Gin Thr Ser Leu Gin Glu 410 .415

Ala SEQ ID NO.: 2

Comprimento: 1269 pares de bases

Tipo: ácido nucleico Strandness

Qualidade do cordão: singular

Topologia: linear

Tipo de Molécula: ADNc para ARNm

Sequência ATGGCTTTAA AAGTGCTACT AGAACAAGAG AAAACGTTTT TCACTCTTTT AGTATTACTA 60 GGCTATTTGT CATGTAAAGT GACTTGTGAA ACAGGAGACT GTAGACAGCA AGAATTCAGG 120 GATCGGTCTG GAAACTGTGT TCCCTGCAAC CAGTGTGGGC CAGGCATGGA GTTGTCTAAG 180 GAATGTGGCT TCGGCTATGG GGAGGATGCA CAGTGTGTGA CGTGCCGGCT GCACAGGTTC 240 AAGGAGGACT GGGG.CTTCCA GAAATGCAAG CCCTGTCTGG ACTGCGCAGT GGTGAACCGC 300 TTTCAGAAGG CAAATTGTTC AGCCACCAGT GATGCGATCT GCGGGGACTG CTTGCCAGGA' 360 TTTTATAGGA AGACGAAACT TGTCGGCTTT CAAGACATGG AGTGTGTGCC TTGTGGAGAC 420 CCTCCTCCTC CTTACGAACC GCACTGTGCC AGCAAGGTCA ACCTCGTGM GATCGCGTCC 480 ACGGCCTCCA GCCCACGGGA CACGGCGCTG GCTGCCGTTA TCTGCAGCGC TCTGGCCACC 540 GTCCTGCTGG CCCTGCTCAT CCTCTGTGTC ATCTATTGTA AGAGACAGTT TATGGAGAAG 600 AAACCCAGCT GGTCTCTGCG GTCACAGGAC ATTCAGTACA ACGGCTCTGA GCTGTCGTGT ' 660 CTTGACAGAC CTCAGCTCCA CGAATATGCC' CACAGAGCCT GCTGCCAGTG CCGCCGTGAC 7.20 TCAGTGCAGA CCTGCGGGCC GGTGCGCTTG CTCCCATCCA TGTGCTGTGA GGAGGCCTGC 780 AGCCCCAACC CGGCGACTCT TGGTTGTGGG GTGCATTCTG CAGCCAGTCT TCAGGCAAGA 840 AACGCAGGCC CAGCCGGGGA GATGGTGCCG ACTTTCTTCG GATCCCTCAC GCAGTCCATC 900 TGTGGCGAGT TTTCAGATGC CTGGCCTCTG ATGCAGAATC CCATGGGTGG TGACAACATC 960 TCTTTTTGTG ACTCTTATCC TGAACTCACT GGAGAAGACA TTCATTCTCT CAATCCAGAA 1020 CTTGAAAGCT CAACGTCTTT GGATTCAAAT AGCAGTCAAG ATTTGGTTGG TGGGGCTGTT 1080 CCAGTCCAGT CTCATTCTGA AAACTTTACA GCAGCTACTG ATTTATCTAG ATATAACAAC 1140 ACACTGGTAG AATCAGCATC AACTCAGGAT GCACTAACTA TGAGAAGCCA GCTAGATCAG 1200 GAGAGTGGCG CTATCATCCA CCCAGCCACT CAGACGTCCC TCCAGGTAAG GCAGCGACTG 1260 GGTTCCCTG 1269 SEQ 10 NO.: 3

Comprimento: 1704 pares de bases Tipo: ácido nucleico Qualidade do cordão: singular Topologia: linear Tipo de Molécula: ADNc para ARNm Sequência GGGAACGTAG AACTCTCCAA CAATAAATAC ATTTGATAAG AAAGATGGCT TTAAAAGTGC 60 TACTAGAACA AGAGAAAACG TTTTTCACTC TTTTAGTATT ACTAGGCTAT TTGTCATGTA 120 AAGTGACTTG TGAAACAGGA GACTGTAGAC AGCAAGAATT CAGGGATCGG TCTGGAAACT 180 GTGTTCCCTG CAACCAGTGT GGGCCAGGCA TGGAGTTGTC TAAGGAATGT GGCTTCGGCT. 240 ATGGGGAGGA TGCACAGTGT GTGACGTGCC GGCTGCACAG GTTCAAGGAG GACTGGGGCT 300 TCCAGAAATG CAAGCCCTGT CTGGACTGCG CAGTGGTGAA CCGCTTTCAG AAGGCAAATT 360 GTTCAGCCAC CAGTGATGCC ATCTGCGGGG ACTGCTTGCC AGGATTTTAT AGGAAGACGA 420 AACTTGTCGG CTTTCAAGAC ATGGAGTGTG TGCCTTGTGG AGACCCTCCT CCTCCTTACG 480 AACCGCACTG TGCCAGCAAG GTCAACCTCG TGAAGATCGC GTCCACGGCC TCCAGCCCAC 540 GGGACACGGC GCTGGCTGCC GTTATCTGCA GCGCTCTGGC CACCGTCCTG CTGGCCCTGC 600 TCATCCTCTG TGTCATCTAT TGTAAGAGAC AGTTTATGGA GAAGAAACCC AGCTGGTCTC 660 TGCGGTCACA GGACATTCAG TACAACGGCT CTGAGCTGTC GTGTCTTGAC AGACCTCAGC 720 TCCACGAATA TGCCCACAGA GCCTGCTGCC AGTGCCGCCG TGACTCAGTG CAGACCTGCG 780 GGCCGGTGGG CTTGCTCCCA TCCATGTGCT GTGAGGAGGC CTGCAGCCCC AACCCGGCGA 840 CTCTTGGTTG TGGGGTGCAT TCTGCAGCCA GTCTTCAGGC AAGAAACGCA GGCCCAGCCG 900 GGGAGATGGT GCCGACTTTC TTCGGATCCC TCACGCAGTC CATCTGTGGC GAGTTTTCAG 960 ATGCCTGGCC TCTGATGCAG AATCCCATGG GTGGTGACAA CATCTCTTTT TGTGACTCTT 1020 ATCCTGAACT CACTGGAGAA GACATTCATT CTCTCAATCC,AGAACTTGAA AGCTCAACGT 1080 CTTTGGATTC AAATAGCAGT CAAGATTTGG TTGGTGGGGC TGTTCCAGTC CAGTCTCATT 1140 CTGAAAACTT TACAGCAGCT ACTGATTTAT CTAGATATAA CAACACACTG GTAGAATCAG 1200 CATCAACTCA GGATGCACTA ACTATGAGAA GCCAGCTAGA TCAGGAGAGT GGCGCTATCA 1260 TCCACCCAGC CACTCAGACG TCCCTCCAGG AAGCTTAAAG AACCTGCTTC TTTCTGCAGT 1320 AGAAGCGTGT GCTGGAACCC AAAGAGTACT CCTTTGTTAG GCTTATGGAC TGAGCAGTCT 1380 GGACCTTGCA TGGCTTCTGG GGCAAAAATA AATCTGAACC AAACTGACGG CATTTGAAGC 1440 CTTTCAGCCA GTTGCTTCTG AGCCAGACCA GCTGTAAGCT GÃAACCTCAA TGAATAACAA 1500 GAAAAGACTC CAGGCCGACT CATGATACTC- TGCATCTTIC CTACATGAGA AGCTICTCTG 1560 CCACAAAAGT GACTTCAAAG ACGGATGGGT TGAGCTGGCA GCCTATGAGA TTGTGGACAT 1620 ATAACAAGAA ACAGAAATGC CCTCATGCTT ATTTTCATGG TGATTGTGGT TTTACAAGAC 1680 TGAAGACCCA GAGTATACTI TTTC 1704 SEQ ID NO. : 4

Comprimento: 17Q4 pares de bases Tipo: ácido nucleico Qualidade do cordão: singular Topologia: linear

Tipo de Molécula: ADNc para ARNm' ·.

Fonte original:

Organismo: Homo Sapiens Linha de Célula: HAS303

Característica Nome/Chave: CDS Localização: 45..1295 Método de Identificação: P Nome/Chave: péptido sig Localização: 45..119 Método de Identificação: S Nome/Chave: péptido mat Localização:,120..1295 Método de Identificação: S

Sequência 41 . GGGAACGTAG AACTCTCCAA CAATAAATAC ATTTGATAAG AAAG ATG GCT TTA AAA 56

Met Ala Leu Lys -25 GTG CTA CTA GAA CAA GAG AAA ACG TTT TTC ACT çtt TIA GTA TIA CTA 104 Vai Leu Leu Glu Gin Glu Lys Thr Phe Phe Thr Leu Leu Vai Leu Leu -20 -15 -10 GGC TAT TTG TCA TGT AAA GTG ACT TGT GAA ACA GGA GAC TGT AGA CAG 152 Gly Tyr Leu Ser Cys Lys Vai Thr Cys Glu Thr Gly Asp Cyc Arg Gin -5 1 5 10 CAA GAA TIC AGG GAT, CGG TCT GGA AAC .TGT. GTT CCC TGC MC ( :ag TGT 200. Gin Glu. Phe Arg Asp Arg Ser Gly Asn Cys: Vai Pro Cys Asn Gin Cys 15 .20 25 GGG CCA· GGC ATG GAG TIG tct AAG GAA TGT GGC TTC GGC TAT GGG GAG 248 Gly. Pro Gly Met Glu Leu- Ser Lys Glu Cys Gly Phe Gly Tyr Gly Glu 30 35 40 GAT GCA CAG TGT GTG ACG TGC CGG CTG CAC AGG TTC MG GAG GAC TGG. 296 Asp Ala Gin Cys Vai Thr Cys Arg Leu Bis Arg Phe Lys Glu Asp Trp 45 50 55 GGC TTC CAG MA TGC. MG CCC TGT CTG GAC TGC GCA GTG GTG AAC GGC 344 Gly Phe Gin Lys Cys Lys Pro Cys Leu Asp Cys Ala Vai Vai Asn Arg 60 65 70 75 TTT CAG AAG GCA AAT TGT TCA GCÇ ACC AGT GAT GCC ATC TGC GGG GAC 392 Phe Gin Lys Ala Asn Cys Ser Ala Thr Ser Asp Ala Ile Cys Gly Asp 80 85 90 TGC TTG CCA GGA TTT TAT AGG AAG ACG AAA CTT GTC GGC TTT CAA GAC 440 Cys Leu Pro Gly Phe. Tyr Arg Lys Thr Lys Leu Vai Gly Phe Gin Asp 95 100 105 ATG GAG TGT GTG CCT TGT GGA GAC ccr CCT CCT CCT TAC GAA CCG CAC 488 Met Glu Cys Vai Pro Cys Gly Asp Pro Pro Pro Pro Tyr Glu Pro His 110 115 120 TGT GCC AGC AAG GTC AAC CTC GTG AAG ATC GCG TCC ACG GCC TCC AGC 536 Cys Ala Ser Lys Vai Asn Leu V.al Lys Ile Ala Ser Thr Ala Ser Ser 125 130 135 42 CCA CGG GAC ACG GCG CTG GCT GCC GTT ATC TGC AGC GCT CTG GCC ACC 584

Pro Arg Asp Thr Ala Leu Ala Ala Vai Ile Cys Ser Ala Leu Ala Thr 140 145 150 155 GTC CTG CTG GCC CTG CTC ATC CTC TGT GTC ATC TAT TGT AAG AGA CAG 632

Vai Leu Leu Ala Leu Leu Ile Leu Cys Vai Ile Tyr Cys Lys Arg Gin 160 165 170 TTT ATG GAG AAG AAA CCC AGC TGG TCT CTG CGG TCA CAG GAC ATT CAG -680

Phe Met Glu Lys Lys Pro Ser Trp Ser Leu Arg Ser Gin Asp Ile Gin 175 180 185 TAC AAC GGC TCT GAG CTG TCG TGT CTT GAC AGA CCT CAG CTC CAC GAA .728

Tyr Asn Gly Ser Glu Leu Ser Cys Leu Asp Pro Arg Gin Leu His Glu. 190 195 200 ' TAT GCC' CAC AGA GCC TGC TGC CAG TGC CGC CGT GAC TCA GTG CAG ACC 776

Tyr Ala His Arg Ala Cys Cys Gin Cys Arg Arg Asp Ser Vai Gin Thr. 205 210 215 TGC GGG CCG GTG CGC TTG CTC CCA TCC ATG TGC TGT GAG GAG .GCC TGC . . 824

Cys Gly Pro Vai Arg Leu Leu Pro. Ser Met· Cys Cys Glu Glu Ala Cys ' 220 225 230 . 235 AGC CCC AAC ÇCG GCG ACTCTT GGT TGT GGG GTG CAT TCT GCA GCC AGT . 872

Ser Pro Asn Pro Ala Thr Leu Gly Cys Gly Vai His Ser Ala Ala .Ser 240 245 250 CTT CAG GCA AGA AAC GCA GGC CCA GCC GGG GAG ATG GTG CeG ACT TTC 920

Leu Gin Ala Arg Asn Ala Gly Pro Ala Gly Glu Met Vai Pro Thr Phe 255 260 265 TTC GGA TCC CTC ACG CAG TCC ATC TGT GGC GAG TTT TCA GAT GCC TGG. 968

Phe Gly Ser Leu'Thr Gin Ser Ile Cys Gly Glu Phe Ser.-Asp Ala Trp 270 275 .280 CCT CTG.ATG CAG AAT CCC ATG GGT GGT GAC AAC ATC TCT TTT TGT GAC 1016

Pro Leu Met Gin Asn Pro Met Gly Gly Asp Asú Ile Ser Phe Cys Asp 285 290 295 TCT TAT CCT GAA CTC ACT GGA GAA GAC ATT CAT TCT CTC AAT CCA GAA 1064

Ser Tyr Pro Glu Leu Thr Gly Glu Asp Ile His Ser- Leu Asn Pro Glu 300 ' 305 310 315 43 CTT GAA AGC TCA ACG TCT TTG GAT TCA AAT AGC AGT CAA GAT TTG GTT 1112 Leu Glu Ser Ser Thr Ser Leu Asp Ser Asn Ser Ser Gin Asp Leu Val .32.0 325 330 GGT GGG GCT GTT CCA GTC CAG TCT CAT TCT GAA AAC TTT ACA GCA GCT 1160 Gly Gly Ala Vai Pro Vai Gin Ser His Ser Glu Asn Phe Thr Ala Ala 335 340 345 ACT GAT TTA TCT AGA TAT 'AAC AAC ACA CTG GTA GAA TCA GCA TCA ACT 1208 Thr Asp Leu Ser Arg Tyr Asn Asn Thr Leu VaL Glu Ser Ala Ser Thr 350 355 360 CAG GAT GCA CTA ACT ATG AGA AGC CAG CTA GAT CAG GAG AGT GGC GCT 1256 Gin Asp Ala Leu Thr Met Arg Ser Gin Leu Asp Gin Glu Ser Gly Ala 365 370 375 ATC ATC CAC CCA GCC ACT· CAG ACG TCC CTC CAG GM GCT TAAAGAACCT 1305 Ile Ile His Pro Ala. Thr Gin Thr Ser Leu Gin Glu Ala 380 -385 390. GCTTCTTTCT GCAGTAGAAG CGTGTGCTGG AACÇCAMGA GTACTCCTTT GTTAGGCTTA 1365 TGGACTGAGC AGTCTGGACC TTGCATGGCT TCTGGGGCAA AMTAAATCT GAACCAAACT 1425 GACGGCATTT GAAGCCTTTC AGCCAGTTGC TTCTGAGCCA GACCAGCTGT MGCTGAAAC 1485 CTCAATGAAT AACAAGAAAA GACTCCAGGC CGACTCATGA TACTCTGCAT CTTTCCTACA 1545 TGAGMGCTT CTCTGCCACA AAAGTGACTT CAAAGACGGA TGGGTTGAGC TGGCAGCCTA 1605 TGAGATTGTG GACATATAAC AAGAAACÂGA AATGCCCTCA TGCTTATTTT CATGGTGATT 1665 GTGGTTTTAC AAGACTGAAG ACCCAGAGTA TACTTTTTC 1704. SEQ ID NO.: 5

Comprimento: 423 aminoácidos . '

Tipo: aminoácido

Topologia: linear

Tipo de Molécula: proteína

Sequência

Met Ala Leu Lys Vai Leu Leu Glu Gin Glu Lys Thr Phe Phe Thr Leu 1 5 10 15

Leu Vai Leu Leu Gly Tyr Leu Ser Cys Lys Vai Thr Cys Glu Thr Gly 20 25 30 44 44 ! i

Asp Cys Arg Gin Gin Glu Phe Arg 35 40

Cys Asn Gin Cys Gly Pro Gly Met 50 55

Gly Tyr Gly Glu Asp Ala Gin Cys 65 70

Lys Glu Asp Trp Gly Phe Gin Lys 85

Vai Vai Asn Arg Phe Gin Lys Ala 100

Ile Cys Gly Asp Cys Leu Pro Gly 115 120

Gly Phe Gin Asp Met Glu Cys Vai 130 135

Tyr Glu Pro His Cys Ala Ser Lys 145 150

Thr Ala Ser Ser Pro Arg Asp Thr 165

Ala Leu Ala Thr Vai Leu Leu Ala 180

Cys Lys Arg Gin Phe Met Glu Lys 195 . 200

Gin Asp Ile Gin Tyr Asn Gly Ser 210. 215

Gin Leu His Glu Tyr Ala His Arg 225 230

Ser Vai Gin Thr Cys .Gly Pro Vai 245

Glu- Glu Ala Cys Ser Pro Asn Pro 260

Ser Ala Ala Ser Leu Gin Ala Arg 275 280

Vai Pro Thr Phe Phe Gly Ser Leu

Asp Arg Ser Gly Asn Cys Vai Pro 45

Glu Leu Ser Lys Glu Cys Gly Phe 60

Vai Thr Cys Arg Leu His Arg Phe 75 80

Cys Lys Pro Cys Leu Asp Cys Ala 90 95

Asn Cys Ser Ala Thr Ser Asp Ala 105 110

Phe Tyr Arg Lys Thr Lys Leu Vai 125

Pro Cys Gly Asp Pro Pro Pro Pro 140

Vai Asn Leu Vai Lys Ile Ala Ser 155 160

Ala Leu Ala Ala Vai Ile Cys Ser 170 175

Leu. Leu Ile Leu Cys Vai Ile Tyr 185 190

Lys Pro Ser Trp Ser Leu Arg Ser 205

Glu Leu Ser Cys Leu Asp Pro Arg ' 220

Ala Cys Cys Gin Cys Arg Arg Asp 235 . . ' ' 240

Arg Leu Leu Pro Ser Met Cys Cys 250 255

Ala Thr Leu Gly Cys Gly Vai His 265 270

Asn Ala Gly Pro Ala Gly Glu Met 285

Thr Gin Ser Ile Cys Gly Glu Phe 290 45 295 . 300

Ser Asp Ala Trp 305 Ser Phe Cys Asp Leu Asn Pro Glu ' 340 Gin Asp Leu Vai 355 Phe Thr Ala Ala ' 370 Ser Ala Ser Thr 385 Glu Ser Gly Ala

Pro Leu Met Gin Asn Pro Met Gly Gly Asp Asn Ile 310 315 320

Ser Tyr Pro Glu Leu Thr Gly Glu Asp Ile His. Ser 325 330 335

Leu Glu Ser Ser Thr Ser Leu Asp Ser Asn Ser Ser 345 . 350

Gly Gly Ala Vai Pro Vai Gin Ser His Ser Glu Asn 360 365 .

Thr Asp Leu Ser Arg Tyr.Asn Asn Thr Leu Vai Glu 375 380

Gin Asp Ala Leu Thr Met Arg Ser Gin .Leu Asp Gin 390 395 -400

Ile Ile His .Pro Ala Thr Gin Thr Ser Leu Gin Vai 405 410 415

Arg Gin Arg Leu Gly Ser Leu 420 , SEQ 10 NO.·: 6.

Comprimento: 1269 pares de bases

Tipo: ácido nucleico

Qualidade do cordão: singular

Topologia: linear

Tipo de Molécula: ADNc para ARNm

Sequência

ATGGCTTTAA AAGTGCTACT GGCTATTTGT CATGTAAAGT GATCGGTCTG GAAACTGTGT GAATGTGGCT TCGGCTATGG AAGGAGGACT GGGGCTTCCA TTTCAGAAGG CAAATTGTTC TTTTATAGGA AGACGAAACT

AGAACAAGAG AAAACGTTTT GACTTGTGAA ACAGGAGACT TCCÇTGCAAC CAGTGTGGGC GGAGGATGCA CAGTGTGTGA GAAATGCAAG CCCTGTCTGG AGCCACCAGT GATGCCATCT TGTCGGCTTT CAAGACATGG

TCACTCTTTT AGTATTACTA GTAGACAGCA AGAATTCAGG CAGGCATGGA GTTGTCTAAG CGTGCCGGCT GCACAGGTTC ACTGCGCAGT GGTGAACCGC GCGGGGACTG CTTGCCAGGA AGTGTGTGCC TTGTGGAGAC 60 120 180 240 300 360 420 CCTCCTCCTC CTTACGAACC GCACTGTGCC AGCAAGGTCA ACCTCGTGAA GATCGCGTCC 480 ACGGCCTCCA GCCCACGGGA CACGGCGCTG GCTGCCGTTA TCTGCAGCGC TCTGGCCACC .540 GTCCTGCTGG CCCTGCTCAT CCTCTGTGTC ATCTATTGTA AGAGACAGTT TATGGAGAAG .. 600 AAACCCAGCT GGTCTCTGCG GTCACAGGAC ATTCAGTACA ACGGCTCTGA GCTGTCGTGT 660 CTTGACAGAC CTCAGCTCCA CGAATATGCC CACAGAGCCT GCTGCCAGTG CCGCCGTGAC ' 720 TCAGTGCAGA CCTGCGGGCC GGTGCGCTTG CTCCCATCCA TGTGCTGTGA GGAGGCCTGC 780 AGCCCCAACC CGGCGACTCT TGGTTGTGGG GTGCATTCTG CAGCCAGTCT TCAGGCAAGA 840 AACGCAGGCC CAGCCGGGGA GATGGTGCCG ACTTTCTTCG GATCCCTCAC GCAGTCCATC 900 TGTGGCGAGT TTTCAGATGC CTGGCCTCTG ATGCAGAATC CCATGGGTGG TGACAACATC 960 TCTTTTTGTG ACTCTTATCC TGAACTCACT GGAGAAGACA TTCATTCTCT CAATCCAGAA 1020 CTTGAAAGCT CAACGTCTTT GGATTCAAAT AGCAGTCAAG ATTTGGTTGG TGGGGCTGTT' 1080 CCAGTCCAGT CTCATTCTGA AAACTTTACA GCAGCTACTG ATTTATCTAG ATATAACAAC 1140 ACACTGGTAG AATCAGCATC AACTCAGGAT GCACTAACTA tgagaagcca' GCTAGATCAG 1200 GAGAGTGGCG CTATCATCCA CCCAGCCACT CAGACGTCCC TCCAGGTAAG GCAGGGACTG 1260 GGTTCCCTG 1269 SEQ 10 NO. : ; 7.

Comprimento.: 1496 pares de bases

Tipo: ácido nucleico

Qualidade do cordão.: singular

Topologia:, linear

Tipo de Molécula: ADNc para ARNm

Sequência GGGAACGTAG AACTCTCCAA CAATAAATAC ATTTGATAAG AAAGATGGCT TTAAAAGTGC 60 TACTAGAACA AGAGAAAACG TTTTTCACTC TTTTAGTATT ACTAGGCTAT TTGTCATGTÁ 120 AAGTGACTTG TGAAACAGGA GACTGTAGAC AGCAAGAATT CAGGGATCGG TCTGGAAACT 180 GTGTTCCCTG CAACCAGTGT GGGCCAGGCA TGGAGTTGTC TAAGGAATGT GGCTTGGGCT 240 ATGGGGAGGA TGCACAGTGT GTGACGTGCC GGCTGCACAG GTTCAAGGAG GACTGGGGCT 300. TCCAGAAATG CAAGCCCTGT CTGGACTGCG CAG.TGGTGAA CCGCTTTCAG AAGGCAAATT 360 GTTCAGCCAC CAGTGATGCC ATCTGCGGGG ACTGCTTGCC AGGA?TTTAT AGGAAGACGA 420 AACTTGTCGG CTTTCAAGAC ATGGAGTGTG TGCCTTGTGG AGACCCTCCT CCTCCTTACG 480 AACCGCACTG TGCCAGCAAG GTÇAACCTCG TGAAGATCGC GTCCACGGCC TCCAGCCCAC 540 600

GGGACACGGC GCTGGCTGCC GTTATCTGCA GCGCTCTGGC CACCGTCCTG CTGGCCCTGC TCATCCTCTG TGTCATCTAT TGTAAGAGAC AGTTTATGGA GAAGAAACCC AGCTGGTCTC TGCGGTCACA GGACATTCAG TACAACGGCT CTGAGCTGTC GTGTCTTGAC AGACCTCAGC TCCACGAATA TGCCCACAGA GCCTGCTGCC AGTGCCGCCG TGACTCAGTG CAGACCTGCG GGCCGGTGCG CTTGCTCCCA TCCATGTGCT GTGAGGAGGC CTGCAGCCCC AACCCGGCGA CTCTTGGTTG TGGGGTGCAT TCTGCAGCCA GTCTTCAGGC AAGAAACGCA GGCCCAGCCG GGGAGATGGT GCCGACTTTC TTCGGATCCC TCACGCAGTC CATCTGTGGC GAGTTTTCAG ATGCCTGGCC TCTGATGCAG AATCCCATGG GTGGTGACAA CATCTCTTTT TGTGACTCTT ATCCTGAACT CACTGGAGAA GACATTCATT CTCTCAATCC AGAACTTGAA AGCTCAACGT CTTTGGATTC AAATAGCAGT CAAGATTTGG TTGGTGGGGC TGTTCCAGTC CAGTCTCATT CTGAAAACTT TACAGCAGCT ACTGATTTAT CTAGATATAA CAACACACTG GTAGAATCAG CATCAACTCA GGATGCACTA ACTATGAGAA GCCAGCTAGA TCAGGAGAGT GGGGCTATCA TCCACCCAGC CACTCAGACG TCCCTCCAGG TAAGGCAGCG ACTGGGTTCC CTGTGAACAC AGCACTGACT TACAGTAGAT CÁGAACTCTG TTCCCAGCAT AAGATTTGGG GGAACCTGAT GAGTTTTTTT TTTGCATCTT TAATAATTTC TTGTATGTTG TAGAGTATGT TTTAAAATAA ATTTCAAGTA TTTTTTTTAA AMCTAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAA SEQ ID NO.: 8

Comprimento:' 1496 pares de bases Tipo: ácido nucleico Qualidade do cordão: singular Topologia: linear Tipo de Molécula: ADNc para ARNm Fonte original

Organismo: Homo Sapiens Linha de Célula: HAS303 Característica Nome/Chave: CDS

Localização: 45..1313 . Método de Identificação: P Nome/Chave: péptido sig .

Localização: 45..119 Método de Identificação: S 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380. 1440 1496 48

Nome/Chave: péptido mat Localização: 120.. 1313 Método de Identificação: S

Sequência GGGMCGTAG MCTCTCCM CMTAMTAC ATTTGATMG AAAG ATG GCT TTA AAA , 56

Met Ala Leu Lys -25 GTG CTA CTA GAA CAA GAG AAA ACG TIT TTe· ACT CTITTA GTA TTA CTA 104

Vai Leu, Leu Glu Gin Glu Lys Thr Phe Phe Thr Leu Leu Vai Leu Leu -20 -15 -10 GGC TAT TTG TCA TGT AAA GTG ACT TGT GAA ACA GGA GAC TGT AGA CAG 152

Gl'y Tyr Leu Ser Cys Lys Vai Thr Cys Glu Thr Gly Asp Cyc Arg Gin -5 1 5 10 CM GM TTC AGG GAT CGG TGT GGA MC TGT GTT CCC TGC MC CAG TGT ' 200

Gin Glu Phe Arg Asp Arg Ser Gly Asn Cys VaiPro Cys Asn Gin Cys 15 20 25 GGG CCA ATG GAG TTG T.CT MG GM TGT GGC TTC GGC TAT GGG GAG . 248

Gly Pro Gly Met Glu Leu Ser Lys Glu Cys Gly Phe Gly Tyr Gly Glu

30 35 4C GAT GCA CAG TGT GTG ACG TGC CGG CTG CAC AGG TIC MG GAG GAC TGG 296

Asp Ala Gin Cys Vai Thr Cys Arg Leu His Arg Phe Lys Glu Asp Trp 45 , 50 55 GGC TTC CAG AM TGC MG CCC TGT CTG GAC TGC GCA GTG GTG MC CGC 344

Gly Phe Gin Lys Cys Lys Pro Cys Leu Asp Cys Ala Vai Vai Asn Arg . 60 65 70 75 TTT CAG MG GCA MT TGT TCA GCC ACC AGT GAT GCC ATC TGC GGG GAC '392

Phe Gin Lys Ala Asn Cys Ser Ala Thr Ser Asp Ala He Cys Gly Asp 80 85 90 ' TGC TTG CCA GGA TTT TAT AGG MG ACG AM CTT GTC GGC TTT CM GAC 440 v

Cys Leu Pro Gly Phe Tyr Arg Lys Thr Lys Leu Vai Gly Phé Gin Asp 95 100 105 49 ATG GAG TGT GTG CCT TGT GGA GAC CCT CCT CCT CCT TAC GAA CCG CAC 488

Met Glu Cys Vai Pro Cys Gly Asp Pro Pro Pro Pro Tyr Glu Pro His 110 115 . 120 TGT GCC AGC AAG GTC AAC CTC GTG AAG ATC GCG TCC ACG GCC TCC AGC 536

Cys Ala Ser Lys Vai Asn Leu Vai Lys Ile Ala Ser Thr Ala Ser Ser 125 130 135 CCA CGG GAC ACG GCG CTG GCT GCC GTI ATC TGC AGC GCT CTG GCC ACC 584

Pro Arg Asp Thr Ala Leu Ala Ala Vai Ile Cys Ser Ala Leu Ala Thr 140 145 150 155 GTC CTG CTG GCC CTG CTC ATC CTC TGT GTC ATC TAT rGT AAG AGA CAG 632

Vai Leu Leu Ala Leu Leu Ile Leu Cys Vai Ile Tyr Cys Lys Arg Gin 160 165 170 TTT ATG GAG AAG AAA CCC AGC TGG TCT CTG CGG TCA CAG GAC ATT CAG 680

Phe Mét Glu Lys Lys Pro Ser Trp.Sèr Leu Arg Ser Gin Asp Ile Gin . 175 180 185 TAC AAC GGC TCT GAG CTG TCG TGT CTT GAC AGA CCT CAG CTC CAC GAA 728

Tyr Asn Gly Ser Glu- Leu Ser Cys. Leu Asp Pro Arg Gin Leu His Glu ' 190 . 195 '200 TAT GCC' CAC AGA GCC TGC TGC CAG TGC CGC CGT GAC TCA GTG CAG ACC 776

Tyr Ala His Arg Ala Cys Cys Gin Cys Arg Arg Asp Ser Vai Gin Thr ' 205 .210 TGC GGG CCG GTG CGC TTG CTC CCA TCC ATG. TGC TGT GAG GAG GCC TGC 824

Cys Gly Pro Vai Arg Leu Leu Pro Ser Met Cys Cys Glu Glu Ala Cys 220- 225 230 235 AGC CCC AAC CCG GCG ACT CTT GGT TGT GGG GTG CAT TCT GCA GCC AGT 872

Ser Pro Asn Pro Ala Thr Leu Gly Cys Gly Vai His Ser Ala Ala Ser .240 245 250 CTT CAG GCA AGA AAC GCA GGC CCA GCC GGG GAG ATG GTG CCG ACT TTC . 920

Leu Gin Ala Arg Asn Ala Gly Pro Ala Gly Glu Met Vai Pro Thr Phe 255 ' 260 265 TTC .GGA TCC CTC ACG CAG TCC ATC TGT GGC GAG TIT TCA GAT GCC TGG 968

Phe Gly Ser Leu Thr Gin Ser Ile Cys Gly Glu Phe Ser Asp Ala Trp 270 275 280 50 CCT CTG atg cag aat ccc atg ggt ggt gac aac atc.tct.ttt TGT GAC 1016

Pro Leu Met Gin Asn Pro Met Gly Gly Asp Asn Ile Ser Phe Cys Asp. 285 . 290 295 TCT TAT CCT GAA CTC ACT GGA GAA GAC ATT CAT TCT CTC AAT CCA GAA 1064

Ser Tyr Pro Glu Leu Thr Gly Glu Asp Ile His Ser Leu Asn. Pro Glu 300 305 310 315 CTT GAA AGC TCA ACG TCT TTG GAT TCA AAT AGC AGT CAA GAT TTG GTT 1112

Leu Glu Ser Ser Thr Ser Leu Asp Ser Asn Ser Ser Gin Asp Leu Vai 320 325 330 GGT GGG GCT GTT CCA GTe CAG TCT CAT TCT GAA AAC TTT ACA GCA GCT 1160

Gly Gly Ala Vai Pro Vai Gin Ser His Ser Glu Asn Phe Thr Ala Ala 335 340 345 ACT GAT TTA TCT AGA TAT AAC AAC ACA.CTG; GTA GAA TCA GCA TCA ACT 1208

Thr Asp Leu Ser Arg Tyr Asn Asn Thr Leu Vai Glu Ser Ala Ser Thr . 350 355 360 CAG GAT GCA CTA ACT ATG AGA AGC CAG CTA GAT CAG GAG AGT GGC GCT 1256

Gin Asp Ala Leu Thr Met Arg Ser Gin Leu Asp Gin Glu Ser Gly Ala 365 370 375 ATC ATC CAC CCA GCC ACT CAG ACG TCC CTC CAG GTA AGG CAG CGA CTG 1304

Ile Ile His Pro.Ala Thr Gin Thr Ser Leu Gin Vai Arg Gin Arg Leu 380 385 .390 395 GGT TCC CTG TGAACACAG CACTGACTTÀ CAGTAGATCA GAACTCTGTT CCCAGCATAA 1362 Gly Ser Leu GATTTGGGGG AACCTGATGA GTTTTTTTTT TGCATCTTTA ATAATTTCTT GTATGTTGTA 1422 GAGTATGTTT TAAAATAAAT TTCAAGTATT TTTTTTAAAA ACTAAAAAAA AAAAAAAAAA 1482 AAAAAAAAAA AAAA 1496 SEQ 10 NO.: 9

Comprimento: 35 pares de bases Tipo:ácido nucleico Qualidade do cordão: singular Topologia: linear Sequência CGATTGAATT ctagacctgc ctcgagnnnn nnnnn SEQ 10 NO.: 10

Comprimento: 28 pares de bases Tipo:ácido nucleico Qualidade do cordão: singular Topologia: linear Sequência

AGAAAGATGG CTTTAAAAGT GCTACTAG

Lisboa, 18 de Agosto de 2008

Claims (11)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Forma substancialmente purificada de um polipéptído que compreende a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID No.. 1 ou· 5., um polipéptido que tem a sequência de aminoácido de Lys na1 posição 1 a Ala na posição..392 mostrada na SEQ ID No. 4, um •polipéptido que tem a sequência de aminoácido de Lys na posição 1· a Leu na posição 398 mostrada em ID SEQ No. 8 ou um. polipéptido que tem uma sequência de aminoácido sendo pelo menos 95% homóloga às sequências de aminoácidos da SEQ ID No. 1. ou 5.

2. Polipéptido de acordo com a reivindicação 1 que compreende a' sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID No. 1 ou 5, tendo o polipéptido a sequência de aminoácido de Lys na posição 1 a Ala na posição 392 mostrado na SEQ ID No. 4 ou o polipéptido que tem a sequência de aminoácido de Lys na posição 1 a Leu na posição 398 mostrado na. SEQ ID No. 8.

3. Polipéptido de acordo com a reivindicação 2 que consiste da sequência de aminoácido'mostrada na SEQ ID No. 1 ou 5, tendo o polipéptido a sequência de aminoácido de Lys na posição 1 a Ala na posição 392 mostrado na SEQ ID No. 4 ou o polipéptido que tem a sequência . de aminoácido de Lys na posição 1 a Leu na posição 398 mostrados na SEQ ID No. 8.

4. ADNc que codifica o polipéptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3.

5. ADNc de acordo, com a reivindicação 4 que compreende a sequência nucleotídica'mostrada na SEQ' ID No.' 2 ou 6. 2

6. ADNc de acordo com a reivindicação 4 que compreende a sequência nucleotidica mostrada na SEQ ID No. 3 ou 7.

7. . Vector de replicação ou de expressão que transporta o ADNc de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 6.

8. Célula hospedeira transformada com o vector de replicação ou de expressão de acordo com a reivindicação 7.

9. Método para produzir o polipéptido de acordo com qualquer uma das reivindicações l a 3, que compreende a culturação de uma célula hospedeira de acordo com a reivindicação 8 sob uma condição eficaz para expressar o polipéptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3.

10. Anticorpo monoclonal ou policlonal contra o .polipéptido de acordo com a reivindicação 3.

11. Composição farmacêutica que contém o polipéptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 â 3 ou o anticorpo de acordo com a reivindicação 10, em associação com um diluente e/ou portador farmaceuticamente aceitável. Lisboa, 18 de Agosto de 2008