PT99237B - Processo para a preparacao de um sistema de marcacao para a seleccao de transformantes - Google Patents
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Description
Descrição referente à patente de invenção de GIST-BROCADES N.V., holandesa, industrial e comercial com sede em Wateringseweg 1,
P.O.Box 1, 2600 MA Delft, Países Baixos, (inventores: Willem Van Hartingsveldt, Robert Franciscus Maria Van Borcom, R.J. Gouka e Roelof Ary Lans Bovenberg, residentes na Holanda), para, PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE UM SISTEMA DE
MARCAÇÃO PARA A SELECÇÃO DE TRANSFORMANTES
DESCRIÇÃO
A presente invenção refere-se a sistema de selecção de transformantes, particularmente para uma estirpe de fungo, mais particularmente Penicillium chrvsoqenum.
Além disso, a presente invenção refere-se a um marcador de selecção de transformantes, isto é, o gene da acetil-CoA sintetase (facA), isolado de Penicillium chrvsoqenum.
fungo filamentosa
Penicillium chrvsoqenum é o produtor mais aplicado dos compostos de βlactama como a penicilina 0 e a penicilina V. As penicilinas G/V são utilizadas como antibióticos ou convertidos em £>-lactamas semi-sintéticas.
são quimicamente 0 P. chrvsoqenum tem uma longa tradição de aplicação industrial. Desde a segunda guerra mundial tem sido o microorganismo de escolha para uma produção em grande escala de penicilinas em todo mundo. Foram feitos ao longo dos anos aperfeiçoamentos significativos no domínio do processo da produção de penicilinas, quer por aperfeiçoamento da estirpe quer pelo próprio desenvolvimento do processo. O desenvolvimento da estirpe tem sido efectuada por
aplicação de mutagénese aleatória por processos químicos e •Físicos bem como por mutagénese dirigidas de enzimas chave em vias metabólicas ligadas à biossíntese da penicilina, seguidos de selecçbes extensivas para estirpes com maiores títulos de penicilina. Para revisães ver por exemplo: Hersbach, G.J.M., Van der Beek, C.P. e Van Dijck, P.W.M., The Penicillins: Properties, Biosynthesis e Fermentation in Biotechology of Industrial Antibiotics, E. van Damme (ed), Mareei Dekker (NY), 1984 e Rowlands, R.T., Enzyme Microb.
Technol. 6, 1984, 3-10 and 290-300.
Tornou-se possível uma nova técnica para o aperfeiçoamento da estirpe com o desenvolvimento da tecnologia de ADN recombinante. Os pré-requisitos para a aplicação das técnicas de ADN recombinante em qualquer organismo ou linha de células, são a disponibilidade de um sistema de transfer@ncia de gene e de selecção ou detecção, que permite a identificação do número geralmente pequeno de células transformadas contendo ADN recombinante, numa grande maioria de células não transformadas. □ desenvolvimento dos sistemas eficazes para a transferência de genes e de selecção de genes para as estir— pes industriais produtoras de P -lactama, em particular de P. chrysoqenmn. é muito difícil por duas grandes razftes. Em primeiro lugar, é do conhecimento comum que as estirpes industriais produtoras de b -lactama são de longe mais difícies de transformar do que as estirpes de tipo natural ou de laboratório (Ingolia & Bueener, Med. Rev. 9, 1989, 245-264). A característica da menor transformação de estirpe industriais pode estar relacionada com a mutagénese extensa dessas estirpes. F'or exemplo, é provável que se acumulem mutaçães que afectem a composição e/ou estrutura da membrana da célula ou da parede da célula em estirpes industriais conduzindo a alteraç&es na morfologia durante o programa de aperfeiçoamento de uma estirpe. (Lein, em: Overproduction of Microbial Metabolites, Vanek e Hostâlek (ed), Í986, Butterworth Publishers, 105-139). Estas alteraç&es morfológicas podem por exemplo afectar a produção de protoplastos a partir de micélio, a estabilidade de protoplastos, a sua capacidade para a absorção de ADN, a regeneração de
protoplastos em micélios, etc. Em segundo lugar, constitui um requisito adicional que o procedimento de transferência e de selecção dos genes não afecte o nível da produção de penicilina.
As dificuldades encontradas no desenvolvimento de sistemas de selecção de transformantes estão também relacionadas com o conhecimento limitado do sistema genético de P. chrysoqenmn. que é difícil de estudar (por exemplo devido à natureza multinuclear do micélio filamento e à ausência de um ciclo sexual, que permite apenas uma análise para-sexual (Pontecorvo e col., Adv. Genet. 5, 1953, 141-238)), as barreiras físicas que prejudicam a absorção de ADIM exógeno (Peberdy, ems Biochemistry of Cel1 Walls and Membranes in Fungi; Kuhn, P.J., Trinei, A.P.J., Jung, M.J., Gossey, M.W., Copping, L.G. (ed) Springer-Ver1ag, Berlin 1989, 5-30) e a falta de elementos de ADN que permitam a replicação extracromossómica estável do ADN transformante que possivelmente resulta em frequências de transformação muito baixas devido ao facto do ADN transformante se integrar no genoma do hospedeiro.
Actualmente foram descritos vários sistemas para a selecção de transformantes para o P.chrysoqe— num. Contudo, embora o desenvolvimento destes sistemas de selecção tenha sido útil do ponto de vista científico, os sistemas de selecção de utilização actual sofrem de uma ou de várias das seguintes desvantagens que prejudicam a sua aplicação a estirpes industriais de produção de /3 -lactama, em particular de P.chrysoqenum.
Em primeiro lugar, em alguns sistemas de selecção o fenotipo escolhido é conferido a P. chrysoqenum por ADN heterólogo (EP-A-240250; EP-A-215539; EP-A-225078;
Cantoral e col., Bi o/technology 5,1987, 494-497; Beri e Turner, Curr. Genet. 11, 1987, 639-641; Kolar e col., Gene 62, 1988, 127-134; Stahl e col., App. Microbiol. Biotechnol. 26,1987, 237-241; Picknett e Saunders, FEMS Microbiol. Lett. 60,1989, 165-168; Whitehead e col., Mol. Ben. Benet. 216, 1989, 408-411).Como consequência da preocupação pública na tecnologia de ADN recombinante em geral, é preferida a utilização de um
de P. col. ,
Genet.
auxotróficos Picknett e col ., Curr.
sistema de selecção de transformantes para uma estirpe produtora de -lactama com base num marcador de selecção que consiste em ADN homólogo em vez de ADN heterólogo. Além disso, do ponto de vista prático, as sequências de transformação são geralmente maiores quando se utilizam marcadores de selecção homólogas em vez de heterólogos.
Em segundo lugar, alguns sistemas de selecção dependem da produção de mutantes chrygoqenu.ro. (EP-A-235951; EP-A-260762;
Curr.Genet. 12, 1987, 449-445; Diez e
12,1987, 277-282). De uma forma geral, o isolamento de mutantes auxotróficos específicos necessita da identificação extensiva de estirpe de mutante e é portanto muito trabalhosa. Isto é uma desvantagem grande quando são utilizados hospedeiros diferentes (por exemplo em programas de desenvolvimento de estirpes industriais). Além disso, e ainda mais importante, a introdução de mutaç&es auxotróficas em estirpes industriais de P. chrysoqenum resulta frequentemente numa redução inaceitável da biossíntese da penicilina. Este fenómeno pode ser uma consequência do tratamento mutagénico, necessário para introduzir as mutaçtfes auxotróficas necessárias na estirpe de interesse ou podem estar relacionados com os defeitos auxotróficos particulares por si próprios (ver por exemplo '0 Sullivan e Pirt, J. Gen. Microbiol. 76, 1973, 65-75 e Stahl e col., ibid).
Nos programas de chrysoqenum, dirigidos ao desenvolvimento maiores índices de produção de penicilina, marcadores genéticos, que requerem a mutagénesse, é portanto geral mente evitada (ver por exemplo Lein, em: Overproduction of Microbial Metabolites, Vanek, Z., Hostálek, Z. (eds), Butterworths, Boston, 1987, 105-140).
Em conclusão, os sistemas de selecção homólogos que não necessitam da mutagénese do hospedeiro, como por exemplo o sistema de selecção dominante ou sistemas de selecção que utilizam hospedeiros que podem ser obtidos por selecção positiva para uma mutação espontânea, são os altamente preferidos. Um exemplo da primeira categoria é o sistema de culturas de de estirpes a introdução
Êrcom de
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selecção homólogo semi-dominante oliC (EP-A-311272). Contudo, constitui uma séria desvantagem do sistema de selecção oliC a -frequência muito baixa de trans-formação que limita a aplicação desse sistema de selecção. Um exemplo da segunda categoria é o sistema de selecção niaD que utiliza mutantes niaD de Penicillium chrysoqenum, obtidos da sei seção positiva para a resistência ao clorato ÍWhitehead e col., ibid., pedido da patente AT 8900266). Dado que a resistência ao clorato pode ser obtida por mutaçães espontâneas em muitos ensaios de crescimento feitos em locais diferentes, é necessária identificar os mutantes niaD que conduzem a uma desvantagem desses sistemas. Outra desvantagem do sistema de selecção niaD é a observação de que uma grande parte dos transformantes de P. chrysoqenum são geneticamente instáveis (abortivos), ver Gouka e col., J. Biotechn. 20, 1991, 189-200.
Em terceiro lugar, para a aplicação das técnicas de ADM recombinantes num programa de aperfeiçoamento de estirpes industriais de estirpes de produção de β lactama é muito importante que uma estirpe que tenha sido transformada uma vez possa ser fácilmente transformada uma segunda vez. Não foram possíveis transformaçães sucessivas de forma eficiente utilizando os sistemas de selecção actuais. Esta característica é importante bem como para estudos científicos na regulação da expressão do gene em P. chrysoqenum e outros fungos filamentosos.
Em resumo, o sistema de selecção de transformante conveniente e reutilizável para P. chrysoqenum com base na utilização de um marcador de selecção, adequado para aplicação a estirpes industriais de microorganismos produtores de &-lactama, em particular de P. chrvsoqenum. não está ainda disponível»
Foi agora desenvolvido um sistema para a selecção de transformantes, em particular de um fungo, mais particularmente de uma estirpe produtora de β-lactama de um fungo, mais particularmente de F- chrvsoqenum. que não tem as desvantagens dos sistemas actuais de selecção. Este sistema de selecção é baseado na complementação de fac, em particular cr
mutantes f acA de estirpes produtoras de ^-lactama, em particular P. chrysQqenum (fac representa resistente a fluoroacetato) por transfarmação com o gene P. chrvsogenmn f acA que codifica a acetil-CoA sintetase.
Recentemente -foram isolados e caracterizados o gene fac A de A. nidulans e o gene correspondente acu-5 de IM.crassa por análise de sequência de nucleótidos (Sandeman e Hynes, Mol. Ben. Genet. 218, 1989, 87-92; Thomas e Col., Molec. Microbiol. 2, 1988, 599-606; Connerton e Col.,
Molec. Microbiol. 4, 1990, 451-460). □ gene facA do patogéneo de espiga de milho Ustilaqo maydis -foi também isolado (Hargreaves e Turner, J. Gen. Microbiol. 135, 1989, 2675-2678). Os mutantes Fac são fenotipicamente caracterizados pela sua instabilidade para crescerem em acetato como única fonte de carbono. Assim, os transformantes Fac* devem poder ser seleccionáveis pela sua maior capacidade para a utilização de acetato. Contúdo o desenvolvimento de um sistema de selecção transformante directo eficiente com base na utilização de acetato parece ser difícil para A. nidulans e N, crassa (Ballance a Turner, Mol. Gen. Genet. 202, 1986, 271-275; Connerton e Col., ibid) e Lh maydis (Harvgreaves e Turner, ibid).
A mutação facA pode ser escolhida em P. chrvsogenmn sem a necessidade de tratamentos mutagénicos por exemplo com radiação UV (ultravioletas), exposição a mutagéneos químicos e técnicas semelhantes. Os mutantes facA espontâneos, entre outros, podem ser isolados de forma surpreendentemente eficaz utilizando uma selecção positiva para estes mutantes que são resistentes ao fluoroacetato. Os mutantes facA estáveis com muito baixas frequências de reversão são fácilmente obtidos. Aspergillus nidulans e Coprinus laqopus foram identificadas mutaçães em três locais genéticos diferentes designados por f acA, f acB, facC (Apirion, Nature 195, 1962, 959-961) e acu-1. acu-11. acu-12 (Casseiton e Casseiton, Mol. Gen. Genet. 132, 1974, 255-264), respectivamente, resultando cada uma delas num fenotipo resistente a fluoroacetato, e não utilizador de acetato. Para além destes mutantes fac/acu, os mesmos estudos em A.nidulans e nidulans e C. laqopus descrevem o isolamento
de um grande número de mutantes resistentes a fluoroacetato mas que utilizam acetato, que são designados por f anA, f anB, f anD e FanE em A. nidulans (Apirion, ibid). Ao contrário deste conjunto complexo de mutantes a escolha dos mutantes f acA de F. chrysoqenum é surpreendentemente eficaz. Quase todos os mutantes resistentes ao -fluoroacetato de F. chrysoqenum não são utilizadores de acetato, e sofrem mutação o local facA. Uma elevada proporção destes mutantes facA de F. chrysoqenmn têm características de produção de penicilina inalteradas quando comparadas com a estirpe mãe.
Na presente invenção, é apresentado um processo para a selecção eficaz e directa de transformantes FacA* de uma estirpe produtora de β-lactama, particularmente de
F. chrysoqenmn num meio contendo acetato utilizando o gene facA de F. chrysoqenum como marcador de selecção homólogo.
É definido um marcador de selecção homólogo no presente pedido de patente como um marcador de selecção derivado das espécies aos quais é aplicado o sistema de selecção de transformante.
Por meio desta invenção também é proporeionado o gene facA particularmente isolado de Penici1lium chrysoqenum. A invenção também inclui genes que compreendem diferentes sequências de nucleótidos por exemplo com mutaçães conservativas, em que as sequências codificam a mesma sequência de aminoácido, mas podem ter até 15% de bases diferentes, ou mutaçífes que não são conservati vas, em que menos de cerca de ÍO%, mais habitualmente menos do que cerca de 5%, e de preferência não mais do que 1% dos aminoácidos são substituídos ou eliminados, e existem menos do que 5% de aminoácidos inseridos, em que a percentagem é baseada no número de aminoácidos de ocorrência natural.
Uma vantagem adicional do sistema de selecção facA em relação a outros sistemas de selecção é a esporulação rápida das colónias que utilizam o acetato em meios de selecção contendo acetato, o que melhora muito e acelera o procedimento de selecção de transformante. Os transformantes de facA+ são estáveis dado que o ADN transformante é integrado no
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genoma. D sistema de selecção de transformante f acA é adequado para a produção de diferentes tipos de transformantes, contendo o ADN transformante integrado no local de FacA residente em pontos genómicos desconhecidos, em cópias simples e/ou múltiplas. A produção de transformantes FacA+ de cópia simples utilizando ADN circular, de banda dupla é surpreendentemente eficaz. Esta característica permite o rápido isolamento de mutantes facA do transformante FacA+ e uma repetição do procedimento de selecção de transformante facA. Isto constitui uma outra grande vantagem do sistema de selecção de facA.
O sistema de selecção de facA pode ser aplicado para introduzir ADN não seleccionável num hospedeiro, de preferência F. chrysoqenum. □ ADN não seleccionável pode ser utilizado para obter ou para aumentar a produção de um composto de ^-lactama num hospedeiro, de preferência P. chrysoqenum. utilizando por exemplo ADN não seleccionável do tipo dos genes da penicilina, cefalaspirina ou cefamicina biossintética (Veenstra e col., J. Biotechn. 17, 1991, 81-90, e Cantwell e col., J. Biotechn, 17, 1991, 213-221).
Esta invenção proporciona um processo para scleccionar transformantes de um microorganismo que foi transformado com ADN que compreende:
isolar-se um mutante do microorganismo em que está inoperável ou ausente a acetil—CoA sintetase; co-transfarmar-se o referido mutante com o referido ADN e um sistema de expressão eficaz na produção da acetil-CoA sintetase de Panicillium chrysoqenum; e seleccionarem-se transformantes do referido microorganismo para determinar a capacidade para crescer num meio que contém uma fonte de carbono que necessita da actividade da acetil-CoA sintetase para o catabolismo.
Além disso, a invenção proporciona um processo para obter ou aumentar a produção de um composto de /3-Lactama em transformantes de um microorganismo por aplicação do processo de selecção acima mencionado processo que compreende co-transfarmar—se o referido mutante com a informação
genética que codifica o ADN necessária para obter ou potenciar a produção de um composto de p?-lactama.
Os processos acima mencionados são, de preferência, aplicados homologamente utilizando o Fenici11ium chrysoqenum transformado com o gene de F. chrysoqenum f acA.
Finalmente a invenção proporciona um gene designada por facA possuindo a sequência de nucleótidos apresentada na listagem de sequências 1, isolada em particularde P. chrysoqenum, e um vector e um hospedeiro compreendendo o mesmo gene. Também o gene facA em que um ou ambos os sinais de expressão foram substituídos por outros sinais de expressão, obtidos do mesmo ou de outro organismo foi proporeionado em conjunto com um vector e um hospedeiro compreendendo os mesmos CJE?nE?3n
Breve Descrição das Figuras
Figura i: Representação esquemática do ADN de F, chrysoqenum contido no lambda EMBL-3 fago facA7. A posição e a direcção de transcrição o gene de facA é indicada (seta). Ei EcoRI. PiPstI, s:Sal I.
Figura 2: Análise de revelação de Southern AND genómico degerido com FstI isolado de transformantes FacA+ de P. chrysoqenum por hibridização com (A) o fragmento de 6,5 Kb FstI contendo o gene de facA de P,chrysoqenum e (B) o plasmídeo pF'Cl-1, para a detecção da sequência de vector não-P. chrysoqenum nos transformantes. A banda de hibridização com aproximadamente 7 Kb no painel B é derivada da hibridização das sequências ni aD contidas em pPCi-1 com as sequências de ni aD cromossómicas correspondentes. A intensidade deste sinal de hibridização foi utilizada como padrão interno para determinar a quantidade de ADN carregada. A posição dos marcadores de tamanho de ADN é indicada p:pPCl-l; wt; P. chrysoqenum; 1-Í4s transformantes FacA+ diferentes.
Breve Descrição das Listagens de Sequências
Listagem de sequência 1: sequência de nucleótidos do gene f acA de P. chrysoqenum e sequências derivadas de aminoácido.
Listagem de sequência 2: sequência de aminoácidos de acetil CoA sintetase de P. chrvsoqenum.
A transformação das estirpes industriais de Penicillium chrvsoqenum por ADN recombinante pode ser conseguida utilizando processos bem conhecidos (Peberdy, Mycol. Res. 93, 1989, 1-20). Numa realização preferida da invenção, é colhido o micélio de uma cultura fresca e são criados protoplastos a partir do micélio filamentoso por tratamento enzimático, isto é com Novozyme 234, num meio osmoticamente estabilizado. Em seguida, são misturados em conjunto o ADN e os protoplastos numa solução contendo Ca2*. Geralmente, são adicionados vários pg de ADN a ÍO7-ÍO e protoplastos. Posteriormente, é adicionada o polietilenoglicol (PEG) à mistura para mediar a absorção de ADN pelos protoplastos. Finalmente, são placados os protoplastos num meio de selecção osmoticamente estabilizado. Foram descritas outras técnicas para a produção de ADN em células alvo isto é, transformação por electroporação (Richey e col., Phytopatology 79, 1989, 844-847) por processos do tipo biolistic™ (Du Pont Particle Delivery System) (Armaleo e col., Curr. Genet. 17, 1990, 97-103) ou por sistemas de produção de liposoma (Felger e Holm, Focus 11, 1989, 21-25).A aplicação destas técnicas aos fungos filamentosos está ainda em desenvolvimento, mas no âmbito da invenção é encarada a aplicação de qualquer processo química, físico ou biológico para a transfor— mação de P, chrvsoqenum.
Os resultados típicos obtidos utilizando o sistema de selecção aqui descrita, são: 1) frequências de transf ormação, da ordem de 1 a 100 transf ormantes por f_ig de ADN, e 2) a observação de que em todos os transformantes estáveis o ADN recombinante é integrado no genoma. Estes resultados são típicos para os sistemas de transformação de fungos filmen• tosos (Rambosek e Leach, Criticai Rev. Biotechn. ó, 1987, 35710
-373; Timberlake e Marshall, Science 244, 1989, 1313-1317; Peberdy, Mycol» Res. 93, 1989, 1-20).
No que se refere à -frequência de transformação, existe a possibilidade de a eficiência do procedimento de transfarmação f acA poder ser aumentado ainda mais por variaçães sistemática dos parâmetros da reacção no procedimento de transfarmação, tal como foi descrito por exemplo por Picknett para o procedimento de selecção (Picknett, British, DX 82490, British Library, Documsnt Supply Centre, Boston Spa, Wetherby, Reino Unido). No que se refere á natureza do passo de integração no processo de transformação, foi observado que a transformação com ADN circular de dupla banda resulta em três tipos diferentes de integração do vector: integração em pontos genómicos desconhecidos (integração tipo II), no locus residente f acA (integração tipo I) ou por conversão de genes ou substituição de genes do alei o mutante (integração tipo III) (Rambosek e Leach, Criticai Rev. Biotechn. 6, 1987, 357-393; Timberlake e Marshall, Science 244, 1989, 1313-1317).
Beralmente, alguns transformantes contêm cópias múltiplas do ADN transformante. Estas cópias múltiplas são dispersas em todo o genoma ou são organizadas numa disposição aleatória num único ponto. Os transformantes de cópia múltipla típicos contêm padr&es de integração dispersos e aleatórios de ADN transformado. Por vezes, ocorreram alguns rearranjos no ADN transformado. Embora a transformação por integração do ADN transformante no genoma seja o normal, deve ser notado que podem também ser obtidos transformantes estáveis por manutenção extra-cromossómica estável do ADN transformante. Esta situação da manutenção extra-cromossómica estável pode ser obtida quando as sequências necesárias para a replicação autónoma (ars) e/ou outras sequências necessárias para a replicação extra-cromossómica estável constituem parte do ADN transformante. Estas sequências podem ser adicionadas ao ADN transformante por técnicas convencionais de engenharia genética antes dos processos de transformação, ou alternativamente pode pensar-se que as sequências ars são escolhidas do genoma por
processos de integração e excisão in vivo durante o processo de transformação (Powell e Kistler, J, of Bacteriol. 172, 1990, 3163-3171). Pode encarar-se também que o ADN transformante é concebido de forma a funcionar como um cromossoma individual em Penicillium chrysoqenum., de forma análoga aos cromossomas artificiais de fungo (Burke e col., Science 236, 1987, 806-812) pela adição de sequências de centrómero e de telomeros, funcionais em P. chrysoqenum, ao ADN transformante. A presente invenção refere-se, de preferência, à transformação estável de P. chrysoqenum, pela integração estável do ADN transformante no genoma de P. chrysoqenum.
ADN transformante, habitualmente referido como vector, consiste tipicamente nos seguintes elementos funcionais:
uma origem de replicação funcional em E.coli que é necessária para a propagação de plasmídios em E. coli;
- um marcador seleccionável funcional em E.coli. de preferência não um gene de β-lactamase, sob o controlo de sinais de expressão adequados de E.coli. que é necessário para a manutenção de plasmídios e selecção transformante em E. coli;
- um marcador seieccionável funcional em P. chrysoqenum. de preferência o gene facA de P. chrysoqenum sob o controlo de sinais de expressão adequados de P. chrysoqenumque é necessário para a selecção de transformantes em P. chrysoqenum. Os sinais de expressão são definidos aqui como os sinais necessários e suficientes para a iniciação e a terminação eficaz da transcrição e iniciação e terminação de translacção.
marcador de selecção é de preferência expresso a partir dos seus próprios sinais de expressão endógenos, embora se possa pensar que a expressão adequada do marcador possa também ser conseguida por meio de sinais de expressão de outros genes de P. chrysoqenum, por exemplo os sinais de expressão do gene de P. chrysoqenum de fosfoglicerato quinase (pqk) (Van Solingen e col., Nucl Acid Res. 16, 1988, 11823) ou o gene da ortidino-5'-fosfato descarboxilase (pryG),
(EP-A-260762) ou mesmo por meio de sinais de expressão heterólogos, não P. chrysoqenum obtidos por exemplo do gene de A. nidulans gliceraldeído-3-fosfato dehidrogenase (qpdA) (Punt e col., gene 56, 1987, 117-124).
- Opcionalmente, o vector contém também a sequência do fago lambda cos que é necessário para o empacotamento in vitro eficiente do ADN recombinante em partículas de fago.
- Noutra opção, o vector contém também uma sequência que actua para aumentar a eficiência da transformação de P.chrysoqenum, como por exemplo a sequência ans-1 de
A. nidulans (Ballance e Turner, Gene 36, 19S5, 321-331; Cantoral e col., Bio/technology 5, 1987, 494-497) ou a sequência pyrG e P. chrysoqenum (EP-A-260762),
Em ainda outra opção, o vector contém uma ou mais sequências de ADN não seleccionáveis de interesse.
A introdução do ADN não seleccionável em P. chrysoqenum ocorre muito eficazmente quando o ADN não seleccionável está fisicamente ligado a um marcador seleccionável . Contudo, esta ligação não é um prê-requisi to para a transformação de um ADN não seleccionável. É também possível introduzir ADN não seleccionável e um marcador seleccionável em P. chrysoqenum utilizando diferentes moléculas de ADN. Dependendo do sistema de selecçâo utilizado e da proporção molar de diferentes ADN utilizados para as sequências de transformação e co-transformação obtidas com diferentes moléculas de ADN, que variam de alguns % até aproximadamente 90% (ver por exempla Kolar e col., Gene 62, 1988, 127-134). A presente invenção refere-se também a aplicação de estratégias de co-transformação de Penici11ium chrysoqenum com um ADN não seleccionável. A co-transformação é definida no presente pedido como a transformação do marcador de selecçâo em conjunto com ADN não seleccionável que está fisicamente ligado ou não ao marcador de selecçâo, na presença ou ausência das sequências de vector. 0 ADN não seleccionável é de preferência derivado de P. chrysoqenum mas pensa-se que na aplicação da invenção o ADN não seleccionável pode ser derivado de uma fonte diferente de P. chrysoqenum.
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manipulação eficiente, manutenção estável e replicação do vector em E. coli não são necesssárias para a selecção de transformantes de P, chrysoqenum. Assim, estas sequências podem ser removidas do ADN transformante antes da transformação de P. chrysoqenum. por exemplo por digestão com enzimas de restrição adequadas e purificação por electroforese de gel.
Numa realização preferida da invenção o ADN transformante consiste inteiramente de sequências homólogas derivadas de P. chrysoqenum.
Noutra realização preferida da invenção a produção de transformantes estáveis de P. chrysoqenum é conseguida pela transformação de estirpes de P. chrysoqenum industriais que não utilizam o acetato. Constitui ainda uma outra realização preferida o facto de as estirpes industriais de P. chrysoqenum que não utilizam acetato serem obtidas sem mutagénese, por selecção positiva para a resistência espontânea ao fluoroacetato. As estirpes que não utilizam acetato e são resistentes ao fluoroacetato podem sofrer mutação nos locais facA, facB ou facC. análogos aos locais facA. facB e facC e locais de A. nidulans e locais acu-1, acu-11 e acu-15 de C. laqopus. Noutra realização também preferida da invenção a produção de transformantes estáveis de P. chrysoqenum é conseguida par transformação de estirpes industriais que não utilizam o acetato, e que sofrem mutação no local facA, com ADN recombinante contendo o gene facA de P. chrysoqenum como marcador homólogo de selecção.
Outra realização ainda preferida da invenção, são ensaiados de transformantes para a complementaridade da mutação facA por selecção directa num meio contendo acetato, embora seja reconhecida a possibilidade de se poderem também utilizar outras fontes de carbono tais como o etanol e produtos semelhantes que requerem actividade de acetil CoA sintetase para o catabolismo bem como na selecção de transfor— mantes facA*. Uma realização preferida da invenção é também a aplicação repetida do sistema de selecção facA a estirpes industriais de P. chrysoqenum que já tenham sido transformadas
utilizando este sistema de selecção. 0 genatipo f acA mutante necessária para os processas de transformação seguintes, pode ser obtido por rompimento ou substituição do gene natural do tipo f acA no transformante utilizando o gene danado -fac A de F. chrysoqenum. mas é de preferência obtido por selecção positiva para a resistência espontânea ao fluoroacetato.
Ds seguintes exemplos não-limitativos demonstrarão a invenção.
Exemplo 1
Isolamento dos mutantes de F.chrysoqenum que não utilizam acetato
Foi utilizada a selecção positiva para a resistência a fluoroacetato para o isolamento de mutantes de várias estirpes de P. chrvsoqenum, sendo um deles a estirpe F'2 de P»chrysoqenum (ATCC 482771 (Lein, em: Overproduction of Microbial Metabolites, Vanek e Hostálek (ed.) 1986, Butterworth Publishers, 105-139; Barredo e col., Curr, Genet. 16, 1989, 453-459)). Estes mutantes são incapazes de utilizar o acetato com fonte de carbono. Foram placados aproximadamente 106-i<7 esporos em 25 ml de meio de selecção solidificado da seguinte composição (por 1000 ml, pH 6,5): glucose, 5 g; NaN03, 2 g; KC1, 1 g; KH2PQ.3H20, 3 g; FgSq,.7Hz0, 0,5 g; fluoroacetato (Aldrich) 10 g e agar (Oxoid No 3), 15 gel ml de uma solução de elementos traço que continha por 1000 ml: ZnS04 , 7Hp, 22 g;
BC,, 11 g; MnClz.4Hp, 5 g; PeSO 7HZ 0, 5 g; CoCl^êH^, 1,7 g; CuS04.5Hp, 1,6 g; Na2Mo0<2H20, 1,5 g; AEDT (Acido Etileno
Diamino Tetraacético), 5 g.
As colónias resistentes a fluoroacetato (fac) foram purificadas em meio de selecção e posteriormente ensaiada, para determinar a sua incapacidade para crescerem no meio de acetato. D meio de acetato consistia no meio mínimo acima descrito com a modificação do acetato de potássio, numa concentração de 100 mM, substituir a glucose ε o f1uoroacetato.
Todas as incubaçãas -foram -feitas a 252C.
Foram obtidos mutantes estáveis que não utilizavam acetato (-frequência de inversão <_ 10“7, ensaiados em meio de acetato para Penicillium chrysoqenum a uma frequência de aproximadamente 1.10Λ
Exemplo 2
Actividade da acetil-CoA sintetase em estirpes de P.chrysoqenum que não utilizam acetato
Foram ainda caracterizadas bioquimicamente as estirpes de P, chrysoqenum P2 resistentes a fluoroacetato, não utilizando acetato por medida da actividade da acetilCoA sintetase. As estirpes -foram cultivadas em -frascos de agitação durante 48 horas num meio de produção padrão, descrito em EP-A-357119. Em seguida, o micélio foi recolhido, liofilizado e moído num moinho. Foram extraídos aproximadamente 0,4 g do micélio moído durante 45 minutos a 42C com 10 ml de um tampão contendo Tris-HCl, 100 mM pH 7,3 AEDT, 0,4 mM; DTT, 0,1 mM e PMSF, 0,1 mM. Foram obtidos os extractos isentos de células por centrifugação do extracto durante 25 minutos a 12 000 g. A actividade da acetil-CoA sintetase foi determinada imediatamente após a preparação dos extractos isentos de células por medida da redução dependente de acetato de CoA com o reagente de Ellamn Cácido 5,5' ditio-bis-(2-nitrobenzóico)3 (DTNB), basicamente de acordo com os procedimentos descritos por Takao (Takao e col., Agric. Biol. Chem. 51, 1987, 145-152). A 750 μΐ da mistura A, contendo Tris-HCl (200 mM. pH 8,0) KCl (100 mM) e MgClz (20 mM foram, adicionados 150 μΐ da mistura B, contendo ATP (40 mM), LiCoA (15 mM) e acetato (20 mM). 0 ensaio foi iniciado por adição de 600 j_il de um extracto isento de células a esta mistuta. D ensaio foi efectuado a 302C. Em intervalos de tempos diferentes foram removidos alíquotas (150 μΐ) da mistura reaccional. As alíquotas foram adicionadas a 100 pl de TCA (10% p/v). A solução foi em seguida neutralizada com 100 μΐ de NaOH 0,6 e tamponada com 1,2 ml de fosfato (0,2 M, pH 7,4). Posteriormente, foram adicionados 100 pl de uma solução
de DTNB (4 mg/ml em tampão de -fosfato 0,2 M, pH 7,4). A extinção da cor da reacção foi medida a 413 nm com um espectrófotometro (LKB) após a centrifugação da amostra durante 5 minutos a 3000 rpm (Heraeus labofuge M). Os resultados típicos, apresentados na Tabela 1, mostram que uma grande proporção de mutantes que não utilizam acetato são deficientes na actividade da acetil-CoA sintetase ou tinham níveis muito reduzidos desta actividade enzimática.
Tabela 1: Actividade relativa da Acetil-CoA sintetase em
P. chrysoqenum P2 e alguns derivados de P2 que não utilizam acetato expresso em unidades arbitrárias por mg de proteína por minuto.
| Estirpe | Actividade da Acetil-CoA sintetase | ||
| (unidades | arbi trári as) | ||
| Γ Λ. | 100 | ||
| P2--nãa | utilizadas de | acetato 1 | nd |
| 2 | 14 | ||
| 3 | 18 | ||
| 4 | 10 | ||
| 5 | nd |
nd» não detectável.
Exemplo 3
Isolamento e caracterização do gene facA de P. chrysoqenum
Foram ensaiadas sondas de oligonucleótidas de facA quimicamente sintetizadas em revelaçftes de Southern contendo digest&es de enzimas de restrição de ADN cromossómico de P. chrysoqenum P2 (não representado). Os oligonucleótidos foram marcados na sua extremidade 5' utilizando ATP e T4-polinucleótido quinase após os procedi17
mentos convencionais (Maniatis e col., em: Molecular Cloning, a labotatory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982 e 1989 (segunda edição)). As sequências de oligonucleótidos -foram derivadas de regi&es conservadas nas sequências de oligonucleótidos do gene f acA de A. nidulans e do gene acu-5 homóloga de C. crassa (Connerton e col., Mole. Microbiol. 4, 1990, 451460).
Foi ' efectuada a hibridização e a lavagem das revelaç&es a 562C utilizando 6 SSC cloreto de sódio 0,9 M, citrato de sódio 0,09 M na lavagem final.
A sonda mista facA7 (5' SATGGCCTCG A
GGAATCATGGGAABGTAGAT 3') produzia um único sinal de hibridização e foi pósteriormente utilizada para o escrutínio de uma biblioteca genómica de F. chrysoqenum que tinha sido preparada por processos bem conhecidos (Maniatis e col., ibid).
□ gene facA de P« chrysoqenum foi isolado e caracterizado utilizando os procedimentos convencionais da forma descrita por Maniatis e col. (ibid).
Foi purificado o ADN de alguns dos fagos de hibridização positivo. Este ADN foi ainda caracterizado por análise de enzimas de restrição. A posição do gene facA no ADN de F. chrysoqenum danado nestes fagos foi determinada por análise de revelação Southern de digestães de enzima de restrição com sondas de oligonucleótidos específicas de facA. Num ensaio de controlo, foram detectados fragmentos de hibridização idênticos em ADN cromossómico de P. chrysoqenum. Por este processa, foi identificado o fragmento de fc,5 Kb FstI presente no fago facA7 (Figura 1) como fragmento adequado para a subclonação do gene facA no vector pBluescript* II (Stratagene, La Jolla). 0 plasmídio resultante foi designado por pPC2-3.
gene facA foi ainda caracterizado por análise de sequência de nucleótidos, ver Listagem de Sequência 1. A comparação desta sequência de nucleótidos com a sequência do gene facA de A. nidulans revelou uma homologia de 80%. A sequência de aminoácidos da acetil-CoA sintetase deduzida da sequência de nucleótidos (Listagem de Sequência 1 e 2) tem a homologia de 89% (incluindo as alteraç&es conservativas
de aminoácidos) em relação à sequência de A. nidulans acetilCoA sintetase (Connerton e col., ibid). Foram determinadas as homologias utilizando um programa de análise de sequências Mi cr oGenie™ versão 7,0 (EJeckman).
Exemplo 4
Transformação das estirpes de facA de Fenicillium chrysoqenmn
Foram cultivadas estirpes f acA de P. chrysoqenum em 500 ml de um meio completo (YPD: í*Á de extracto de fungo, 2% de peptona, 2% de glucose) num frasco cónico de 2 í, por inoculação do meio com 2.IO6 poros por ml e incubação posterior durante 18 horas num incubador rotativo a 252C e 300 rpm. Após este período de incubação, os micélios foram recolhidos por filtração do meio através do envelope de filtração de miracloth (Calbiochem). 0 micélio foi lavado com 50 ml de tampão de lavagem esterilizado contendo 0,63 M de NaCl e cada 0,27 M em água destilada e foi removido o tampão em excesso revelando o filtro contendo o micélio entre toalhas. Foi pesado o micélio num tubo esterilizado e transferido para um frasco cónico de 500 ml, a que foram adicionados 20 ml de um tampão (NaCl 0,53 M, CaClz 0,27 M) contendo 100 mg de Novozym 234 (NOVO Nordisk) por grama de micélio. Foram deixados formar protoplastos por incubação a 252C e por agitação moderada (80 rpm) durante 30 a 60 minutos, e o processo foi seguido com um microscópio. Foram recolhidos os protoplastos livres par filtração da suspensão através de lã de vidro, lavagem com um volume igual frio de tampão de STC/NaCl 0,63 M (corbitol 1,2 mM, Tris 10 mt*f pH 7,5, CaCl2 50 mM) e centrifugação posterior a 2500 rpm, 42C em tubos cónicos de 50 ml utilizando um rótor oscilante. Os protoplastos foram ressuspensos por duas vezes em 50 ml de tampão STC/NaCl 0,63 Me em seguida foram centrifugados. Posteriormente os protoplastos foram ressuspensos num pequeno volume de tampão de KC1 0,7 M e a concentração dos protoplastos foi determinada utilizando um hemocitómetro. Finalmente, os protoplastos foram diluídos a uma concentração
de 10®/ml de STC/NaCl 0,53 e mantidos em gelo.
Foram adicionadas alíquotas de 100 μΐ de suspensão de protoplastos a tubos de plástico de fundo redondo esterilizados contendo 10 pg de ADN linear ou circular pPC2-3, Após agitação moderada, as suspensães de protoplastos e ADN foram incubadas durante 5 minutas à temperatura ambiente após o que foi adicionado um volume total de 1250 pl de uma solução de polietileno glicol (PEG) (60% PEG 4000 (BDH), Tris/pH 10 mM 7,5, CaCl2 50 mM» A solução de PEG foi adicionada em duas alíquotas de 200 μΐ, e uma aliquota de G50 μΐ com agitação moderada entre cada adição, esta operação foi seguida por um período de incubação de 20 minutos à temperatura ambiente. Após a incubação, os tubos foram cheios com tampão KC1 0,7 Me os protoplastos foram centrifugados a 2500 rpm, 42C. Posteriormente, os prostoplastos foram placados em placas de agar, contendo KC1 0,9 M KAc 50 mM, glucose a 0,001% e sais de meio mínimo. Os resultados de uma experiência típica são apresentados na Tabela 2. O vector pBluescript foi utilizado como controlo negativo.
Tabela 2s Número de transformantes FacA* obtidos com pPC2-3
| DNA | pg | No» de transformantes |
| pBluescript | 10 | 0 |
| pPC2-3 | 10 | 40 |
Estes resultados foram obtidos utilizando várias estirpes produtoras de P. chrysoqenum entre elas a estirpe de P. chrysoqenum P2. é bem conhecido que os procedimentos de transformação necessitam de pequenos ajustamentos dependendo da estirpe particular utilizada.
Os transformantes efectuavam geral mente a esporulação dentro de um período de 7 dias de incubação a 252C no meio acima descrito»
Nas estirpes transformadas com pPC2-3
IVííí-íi”-».
‘«-à-s® 5 r,
a actividade da acetil-CoA sintetase (determinada de acorda com o Exemplo 2) -foi restaurada para os valores do tipo natural ou acima deles (Tabela 3).
Tabela 3: Actividade relativa de Acetil-CoA sintetase em dois transformantes FacA* e F'2 expressos em unidades arbitrárias por mg de proteína por minuto.
Estirpe
Actividade de Acetil-CoA sintetase (unidades arbitrárias)
Ρ2 100
Trans-f ormantes FacA* í 200
1000
Exemplo 5
Análise de ADN dos trans-f ormantes obtidos
Para verificar a presença de sequências intactas de vector no ADN cromossómico das colónias obtidas de FacA* e para identificar os transformantes que possuiam apenas uma cópia do vector integrado, foi purificado o ADN de 14 colónias individuais e analisado por hibridização de Southern. □ ADN das colónias foi isolado da forma seguinte. Foi inoculado um meio completo da forma descrita no Exemplo 4 (50 ml em frascos cónicos em 250 ml) com 10e poros de cada colónia, obtidas após dois ciclos de inoculaçães de esporos simples em placas de meio mínimo contendo 100 mH de KAc como única fonte de carbono. D meio foi incubado a 300 rpm num agitador rotativo a 252C durante 48 horas após o que o micélio foi recolhido utilizando um tecido de filtração lavado com 25 ml de uma solução de NaCl a 0,9%. Em seguida o micêlio foi pesado e congelado imediatamente em azoto líquido» Posteriormente, foram moídas partes de um micêlio utilizando um moinho e uma pá, enquanto se adicionava repetidamente azoto líquido, até ser obtido um pá fino, 0 pó foi adicionado a um tubo isento de ADN e a que foram adicionados 10 ml do tampão de extracção por grama de micélio. 0 tampão de exctracção foi preparado da forma seguinte: 40 ml de tampão 5 x RNB refrigerado com gelo Tris-HCl 1,0 M, pH 8,5, NaCl 1,25 M, AEDT 0,25 M, autoclavado) que foi adicionado a 80 ml de ácido p-aminossalicílico refrigerado com gelo (123 g/1; Sigma) a que foram adicionados 80 ml de TNS (sal de sódio do ácido tri-isopropilnaftalenosulfónico; 20 g/1; Eastman Kodak) refrigerado com gelo» Após a mistura, foi deixado formar um precipitado em gelo, a partir do qual foi utilizado o fluído superior da extracção de micélio.
Após a adição do pó de micélio congelado ao tampão de extracção deixou-se descongelar o micélio por agitação e foram adicionados imediatamente 0,5 volumes de solução de fenol 1. A solução de fenol 1 foi preparada por diluição de cristais de fenol em água desmimeralizada e posterior ajustamento do valor do pH a 8,0 com uma solução de NaOH. Após a adição da solução de fenol 1, a suspensão de micélio foi bem misturada e incubada em gelo até ter sido moída a última amostra de micélio. Em seguida foram adicionados 0,5 volumes de clorofórmio a cada tubo e os tubos foram mais uma vez misturados.
Em seguida, os tubos foram centrifugados a 12000 rpm, 42C durante 10 minutos, utilizando um rótor de oscilação. As fases superiores, contendo o ADN, foram transferidas para novos tubos aos quais se adicionaram 10 ml da solução de fenol 2. A solução de fenol 2 foi preparada diluindo 100 g de fenol em 100 ml de álcool cloroformisoamí1ico 25:1 (v/v). Em seguida foram adicionados 1,6 g de 8-hidroxiquinolina e a solução foi saturada com STE (NaCl 0,3 M Tris 10 mM pH 7,5, AEDT 0,1 mM).
Após agitação, foram mais uma vez centrifugados os tubos contendo o ADN e a fase superior foi transferida para outro tubo. Posteriormente foram adicionados 3 volumes de etanol a 96% (armazenado a -2020 e o ADN foi deixado precipitar durante 30 minutos a -75SC. Os tubos foram
centrifugados a 20000 rpm durante 15 minutos, 45C e as pastilhas de ADN foram lavadas com etanol a 70% (armazenadas a -2050. As pastilhas foram secas num excitador durante 3 minutos, ressuspensos em 0,5-0,1 ml de STE, dependendo do tamanho das pastilhas, e transferidas para tubos de eppendorf. A cada tubo foram adicionados 10 μΐ de uma solução a 20 mg/ml de ARN a se os tubos foram incubados durante 15 minutos a 37SC. A soluçífes de ADN foram extraídas de novo com uma solução de fenol 2 durante duas ou três vezes e o ADN foi precipitado da forma acima descrita. Finalmente, as pastilhas lavadas foram dissolvidas em tampão (TE/Tris 10 mM pH 7,5; ASDT 0,1 mM).
prosseguimento seguido para a análise do ADN cromossómico por hibridização de Southern foi essencial mente efectuada da forma descrita por Maniatis e col., (1962). D ADN foi digerido com F‘st I, seguida da separação dos fragmentos num gel de agarose a 0,6% e em seguida transferido para folhas de nitroceiulose. Estas revelaçífes foram hibridizadas com ADN marcado com 32 P de pPCl-1 ou com o fragmento PstI marcado com 32P contendo o gene facA de P. chrvsoqenum (Figura 2,A). A hibridização e a lavagem das revelaçífes foi efectuada a 655C utilizando 0,2 x SSC na lavagen final. Após a exposição das revelaçífes a filmes sensíveis aos raios-X foram analizados os padrífes e hibridização obtidos (Figura 2,B). A partir desta análise podia ser concluída que todos menos 2 transformantes contêm fragmentos vector. 0 padrão destes 2 transformantes (Nos. 7 e 11) é indistinguível do padrão natural, o que indica provavelmente que eles aparecem após a substituição ou conversão do alelo mutante. Seis transformantes (Nos. 1, 2, 3, 6, 10 e 12) contêm uma única cópia do vector no ponto residente f acA enquanto que quatro (Nos. 4, 6, 13 e 14) contêm uma única cópia do vector num ponto genómico desconhecido. Dois transformantes (nos. 5 e 9) contêm cópias múltiplas do vector. Esta experiência demonstrou que o sistema de selecção de transformantes facA é um sistema de selecção versátil, adequado para diferentes aplicaçífes como por exemplo a produção de transformantes de cópia simples, produção de transformantes de cópia múltipla,
integração do ponto facA residente, genómicos desconhecidos.
ou integração em pontos
Exemplo 6
Produção de penicilina de mutantes facA de P. chrysoqenutn
Foi determinado o efeito do procedimento de selecção de fluoroacetato na produção de penicilina para 3 mutantes facA estáveis, obtidos de aproximadamente 3.10* poros da forma descrita no Exemplo i. A produção de penicilina foi determinada em experiências com frascos de agitação, em duas experiências independentes, utilizando os procedimentos que foram descritos anteriormente em EP-A-357119. Os resultados obtidos são resumidos na Tabela 4.
Tabela 4: Produção de penicilina de mutantes facA de Penici1lium chrysoqenum. A quantidade de penicilina é expressa em unidades arbitrárias. 0 número de unidades arbitrárias produzidas por P2 é arbitrariamente estabelecida a 100.
| Estirpe | Produção de penicilina | ||
| (unidades | arbitrárias) | ||
| P2 | 100 | ||
| P2 | f acAl | 103 | |
| P2 | f acA5 | 91 | |
| P2 | f acA7 | 109 |
Esta esperiência mostra que os mutantes facA com características de produção de penicilina inalteradas são facilmente obtidos. Os transformantes FacA* com índices inalterados de produção de penicilina comparados com a estirpe mãe P2 foram também facilmente obtidos por transformação dos mutantes facA com pPC2-3 (não representado).
Exemplo 7
Utilização repetida do sistema de transformação facA
Foi transfarmada a estirpe facA de F. chrysoqenum com pPC2-3. Foram identificados os transformantes contendo a cópia simples do gene facA transformantes, da forma descrita no Exemplo 5. Esse transformante foi submetido a um segundo processamento de (í) selecção para mutantes facA que não utilizam acetato e (2) uma segunda transformação com pPC2-3 da forma descrita no Exemplo 4. Os mutantes que não utilizam acetato foram obtidos por selecção positiva em meio mínimo contendo fluoroacetato tal como descrito no Exemplo 1. A frequência da ocorrência de colónias que não utilizam acetato resistentes a fluoroacetato era comparável com a frequência observada com a estirpe mão P2.
Os mutantes facA de segunda geração, identificada da forma descrita no Exemplo 2, comportavam-se de forma semelhante nas experiências de transformação, em ensaios de estabilidade e em ensaios de produção de penicilina da forma descrita para os mutantes facA da primeira geração (ver Exemplos 4, 5 e 6). As experiências aqui descritas demonstram que a aplicação repetida eficaz do sistema de transformação de facA é possível.
Exemplo 8
Transformação homóloga é demonstrada a possibilidade de uma transformação homóloga completa utilizando o fragmento de restrição de PstI de 6,5 Kb de pPC2-3.
Foi propagado o plasmídio pPC2-3 utilizando estirpe JM109 de E. coli (Yanish-Psrron e col., Gene 33, 1985, 103-109) e foi feita a purificação de acordo com processos bem conhecidos (Maniatis e col., ibid). 0 plasmídio purificado pPC2-3 foi em seguida digerida com a enzima de
restrição PstI (New England Biolabs) para libertar as sequências derivadas de P. chrysoqenum a partir das sequências do vector pBluescript. 0 fragmento contendo as sequências derivadas P. chrysoqenum, por exemplo com 6,5 Kb de comprimento, foi purificado a partir das sequências do vector de pBluescript por electroforese em gel de agarose seguido de electoeluição do gel de agarose (bio-trap™, Schleicher e Schuell).
fragmento de restrição PstI de 6,5 Kb purificado foi em seguida utilizada para a transfarmação da estirpe f acA de P. chrysoqenum de acordo com os procedimentos descritos no Exemplo 4. As frequências de transfarmação eram semelhantes às obtidas utilizando todo o plasmídio pFC2--3 (Tabela 5).
Tabela 5: Número de transformantes FacA*
| DNA | pg | No. de transformantes | |
| pBluescript | 10 | - | |
| pPC2-3 | 10 | 40 | |
| fragmento 6,5 K | b Pst I | 10 | 50 |
A ausência das sequências do vector pBluescript foi posteriormerite - demonstrada utilizando um procedimento de hibridização de colónias sensível (Kinsey, Fungai Genetics, Newslewtt. 36, 1989, 45-47) e utilizando o pBluescript aleatoriamente marcado como uma sonda (Maniatis e col., ibid).
Exemplo 9
Co—transformacão mediada por facfl
A possibilidade de introduzir o ADN não seieccionável em P. chrysoqenum por utilização do sistema de selecçào de facA é demonstrada pela experiência de controlo descrita neste exemplo.
Foi transformado um mutante de facA de
P. chrysoqenum com o -fragmento de restrição PstI de 6,5 Kb da forma descrita no exemplo 8 juntamente com um -fragmento de restrição Sal I derivado de P. chrysoqenum de 3 kb que contém o gene de olic resistente à oligomicina. Esse gene olic pode ser obtido de P. chrysoqenum pelo processo descrito em pormenor (Buli e col., Curr. Genet. 1988, 13, 377-382).
Ds trans-formantes -foram escolhidos em primeiro lugar para o crescimento em meio contendo acetato da •forma descrita no exemplo 4. Em seguida, após a purificação do transformante em meio de acetato, os transformantes foram ensaiados para determinar a resistência á oligomicina por contendo 3 pg/ml de oligomicina resistentes à oligomicina foram facilmente obtidos utilizando a propoção 1:1 molar de ADN de facA/olic.
A partir destes resultados pode concluir-se que a co-transformação ocorre rapidamente utilizando o sistema de selecção facA. A ligação física do marcador de selecção ao ADN não seleccionável não é necessária para a co-transf ormação.
crescimento em meio sólido (Sigma). Ds transformantes
Exemplo 10
Selecção em meio contendo etanol é demostrada a possibilidade de seleccionar transformantes FacA* em meio contendo etanol em vez de acetato como fonte de carbono. Os transformantes FacA* foram obtidos por procedimentos descritos no Exemplo 4. A mistura de transf ormação foi placada em meio de absorção contendo 0,17», 0,37» ou 17. de etanol em vez de acetato de potássio 50 mM. No restante, o meio de selecção utilizado neste exemplo é idêntico ao meio descrito no exemplo 4.
Após aproximadamente 2 a 3 semanas de incubação a 252C os transformantes podiam ser claramente identificados. Utilizando um meio de selecção contendo etanol foi reduzida a frequência de transformação para aproximadamente
0,5 a 1 transformantes/pg de ADN.
Este exemplo demonstra a possibilidade de utilizar outras fontes de carbono em vez de acetato, o que requer actividade de acetil-CoA sintetase.
Claims (1)
- - lê. Processo para a selecção de transformantes de um microorganismo que tenha sido transformado com ADN caracterizado por:isolar-se um mutante do microorganismo em que a acetil-CoA sintetase é inoperável ou se encontra ausente, co-transformar-se o referido mutante com o referido ADN e um sistema de expressão eficaz na produção de acetil-CoA sintetase de Penicillium chrysoqenul. e seieccionaram-se os transformantes do referido microorganismo de acordo com a sua capacidade para crescerem num meio que contêm uma fonte de carbono que exige a actividade da acetil-CoA sintetase para catabolismo.- 2ê. Processo para a preparação ou aumento da produção de um composta de β-lactama por utilização de transformantes de um microorganismo que se pode obter pelo processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender a co-transformação do referido mutante com ADN que codifica a informação genética necessária para obter ou aumen28 tar a produção de um composto de 0-lactama.- 3é. Processo de acordo com as reivindicaç&es 1 ou 2 caracterizado por o referido microorganismo ser Penicillium chrysoqenum que foi transformado com ADN homólogo.- 4ã. Processo de acordo com qualquer das reivindicaç&es anteriores caracterizado por a referida fonte de carbono ser um acetato.- 5ã. Processo de acordo com qualquer das reivindicaç&es anteriores caracterizado por a referida cotransformação ser conduzida por fornecimento do referido ADN e do referido sistema de expressão na mesma molécula de ADN.- 6â. Processo de acordo com qualquer das reivindicaç&es anteriores caracterizado por o referido microorganismo ser uma estirpe de um fungo, de preferência uma estirpe produtora de I^-lactama, mais preferivelmente Pen i c i 11 i um chrysoqenum, Aspergillus nidulans ou Acremonium chrysoqenum.- 7é. Processo de acordo com a rei vindicação 6, caracterizado por a referida estirpe produtora de ^-lactama ser uma estirpe produtora de penicilina.Sã.Processo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores caracterízado por o referida mutante ser um mutante espontâneo identificado pela sua resistência ao fluoroacetato.- 9ã. Processo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores caracterizado por incluir ainda o isolamento dos mutantes sem actividade de acetil-CoA sintetase do referido mutante transfarmado.A requerente reivindica a prioridade do pedido de patente europeia apresentado em 15 de Outubro de 1990, sob n2. 90 202 754.9.
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