PT994721E - Factor de crescimento do tecido nervoso como adjuvante de vacina - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

FACTOR DE CRESCIMENTO DO TECIDO NERVOSO COMO ADJUVANTE DE

VACINA

Campo da Invenção A presente invenção relaciona-se com o campo das vacinas.

Antecedentes da Invenção

Os seres humanos, animais ce criação e animais domésticos, geralmente, são vacinados para evitar doenças ou para reduzir a gravidade da doença. A vacinação resulta na produção de anticorpos que são proteínas do soro capazes de ligarem-se, especificamente, às substâncias antigénicas utilizadas na vacina. Esta resposta humoral envolve a selecção de linhas específicas de linfócitos B e a proliferação e a diferenciação das células seleccionadas para produzir clones das células do plasma produtoras de anticorpos. A produção de anticorpos atinge um pico em várias semanas depois da imunização e, depois, gradativamente, declina. Devido a um volume constante de proteínas séricas, o declínio na produção de anticorpos é acompanhado por um declínio correspondente no nível de anticorpos em circulação. No entanto, se o doente for confrontado uma vez mais com o mesmo antigénio, é iniciada uma nova curva de resposta mais rapidamente e mais intensamente do que a primeira. Isto é chamado de resposta secundária, de reforço ou anamnéstica e, em doentes saudáveis resulta em níveis de anticorpos muito mais elevados com afinidade mais elevada ao antigénio do que a primeira exposição, ou imunização primária. A taxa aumentada de síntese de 1 anticorpos é o resultado de um número aumentado de células do plasma produtoras de anticorpos. Estas células são escassas nos nódulos linfáticos do doente imunizado, que contém principalmente pequenos linfócitos. No entanto, nos doentes saudáveis, as células do plasma constituem até 3% do total das células dos nódulos linfáticos depois de uma imunização primária e até 30% das células dos nódulos linfáticos depois de uma imunização secundária.

Diz-se que a resposta secundária é devida à memória imunológica. Isto é, o organismo saudável é capaz de "lembrar-se" da sua exposição anterior ao antigénio e reage mais prontamente e eficientemente na segunda vez que é exposto, mesmo se, neste meio tempo, a quantidade de anticorpos específicos no soro tenha declinado a um nível muito baixo.

Certos estados, tais como o envelhecimento, a desnutrição, a tóxico-dependência, o alcoolismo e certos estados patológicos, tais como a diabetes e a SIDA, levam à imunodeficiência, em que muitas respostas imunológicas são suprimidas e a vacinação é de eficácia reduzida. Deste modo, permanece uma necessidade na técnica para técnicas de vacinação melhoradas, particularmente entre os mais idosos ou os imunodeficientes. O documento WC 95/05845 descreve uma formulação farmacêutica aquosa que compreende um factor de crescimento do tecido nervoso, um sal biologicamente aceitável numa quantidade suficiente para manter a i.sotonicidade, um. tampão numa quantidade suficiente para manter o pH da formulação de cerca de 4,5 a cerca de 6,0 e água. 0 documento WO 95/30436 descreve uma composição adjuvante, que compreende pelo menos duas actividades de cítocinas (IL-Ιβ e TNF-oc ou IL-Ιβ e GM-CSF) que actuam em sinergia para intensificar uma resposta imunológica a um antigénio. 2

Heath A. W. et al., Vaccine (1992), vol. 10, n° 7, páginas 427-434 discutem a utilização de citocinas como IFN-y, IL-Ιβ e IL-2 como adjuvantes imunológicos em imunodeficiência. O Factor de Crescimento do Tecido Nervoso ÍNGF), descrito e caracterizado quase trinta anos atrás (Levi-Montalcini, 1987; Cohen, 1960) como o primeiro sinal solúvel de mediação de comunicações intercelulares, é um membro da família de proteínas conhecidas como neurotropinas, que são críticas para o desenvolvimento regulado e a sobrevivência das células neuronais (Barde, 1990). O seu papel em manter a sobrevivência dos neurónios de gânglios simpatéticos e sensoriais foi estabelecido durante décadas (Levi-Montalcini e Angeletti, 1966, 1968). Nos últimos anos, estas observações iniciais estenderam-se para outras populações de neurónios do sistema nervoso central, incluindo as células colinérgicas do antecérebro basal (Johnson et al., 1986; Shelton e Reichardt, 1986). Crê-se que o NGF, como as outras neurotropinas, é produzido no sistema nervoso por células acessório, tais como as células gliais e os oligodendrócitos (Errifors et al., 1990, Hofer et al., 1990) que, deste modo regulam o processo de diferenciação dos neurónios princípalmente através da formação de circuitos parácrinos.

As neurotropinas, incluindo o NGF, o factor neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), a neurotropina-3 (NT-3) e NT4/5, exercem os seus efeitos sobre alvos celulares por meio de receptores de superfície específicos que, após a ligação e internalizaçâo do ligando, desencadeiam uma cascata de eventos bioquímicos que representam a resposta adaptativa (analisado em Barde, 1990) . Duas classes de sítios de ligação da neurotropína podem ser identificadas em células alvo, com base em baixa (Kd 1 nM) e alta (Kd 20 pM) afinidade para o (s) ligando (s) . A natureza molecular destes receptores foi recentemente caracterizada (Meakin 3 e Shooter, 1992) . Uma glicoproteína 75 kDa, denominada p7 5NGL'R/ promove a mediação da ligação de baixa afinidade de qualquer neurotropina com afinidade semelhante (Chao, 1994) , As proteínas que pertencem à família de receptores tirosina-cinase trk:, que interagem com as neurotropinas de uma maneira altamente específica, são responsáveis pela ligação de alta afinidade. A pl40Lr*’rt combina com o NGF, a p!40trK‘B com o BDFN e a pl40trk~c com a NT-3 e NT-4/5 (Barbacid, 1994). Provavelmente, cada classe de receptores transmite sinais diferentes à célula alvo, uma vez que parece que a p75NaFR e a pl40trk’A não formam heterodímeros de ligação ao NGF (Jing et al., 1992). Curiosamente, a p75NGrR apresenta homologia estruturai aos receptores do factor de necrose tumoral I e II, os antigénios de superfície de linfócito CD30, CD40, 0X40 e antigénio de superfície Fas/Apo-1, moléculas envolvidas em evitar ou mediar a apoptose (analisado em Raffioni et al., 1993).

Desde a primeira descrição da purificação do NGF de células de glândulas maxilares de murganho, ficou evidente que este factor também era produzido por vários tipos de células não nervosas (Levi-Montalcini, 1987), incluindo os ceratinócitos (Di Marco et al., 1993) e as células de músculo liso (Ueyama et al., 1993). Do mesmo modo, a expressão do protooncogene trk foi registada por células imunológícas, tais como monócitos (Ehrard et al., 1993a) ou linfócitos T Ehrard et al., 1993b). Deste modo, crê-se que as neurotropinas, particularmente o NGF, podem promover papéis importantes fora do sistema nervoso.

Estas duas linhas de evidência, juntamente com a homologia estrutural da p75NSFR a uma série de receptores de superfície, incluindo aqueles para a citocinas, e com os níveis de plasma elevados de NGF observados em doentes com algumas doenças auto-imunes (Dicou et al., 1993; Bracci-Laudiero et al., 1993; L. B. -L, L. A., E. G. e G. Rasi observação não publicada), levaram a uma 4 investigação sobre se o NGF e/ou os seus receptores eram expressos por células do sistema imunológico. Aqui, é demonstrado que o NGF é sintetizado e libertado sob condições basais por línfócitos B humanos, normais, que também constirutivamente expressam tanto a cadeia de receptores p7 5NbFR como pl40trk“\ Além disso, o NGF endógeno funciona de forma autócrina para manter a viabilidade das células com o fenótipo dc superfície das células B de memória e a sua neutralização in vivo anula uma resposta imunológica humoral secundária.

Sumário da Invenção A presente invenção relaciona-se com uma associação farmacêutica para intensificar a eficácia da vacina em animais imunodeficientes. A associação farmacêutica compreende uma vacina capaz de estimular a produção num animal imunodeficiente de anticorpos a um agente causador de doença, estranho ao referido animal. A associação farmacêutica inclui ainda uma quantidade de Factor de Crescimento do Tecido Nervoso (NGF) de intensificação da eficácia da vacina, que intensifica a produção e a afinidade dos referidos anticorpos no referido animal, em resposta à referida vacina. A invenção também se relaciona com a utilização de uma vacina capaz de estimular a produção num animal imunodeficicnte de anticorpos para um agente estranho causador dc doença ao referido animal e a uma quantidade de Factor de crescimento do tecido nervoso (NGF) de intensificação da eficácia da vacina que aumenta a produção dos referidos anticorpos, em resposta à referida vacina, para a preparação de uma associação farmacêutica para a vacinação, em que a referida vacina e o referido NGF podem ser administrados separadaiaente ou em conjunto, e en que a eficácia da referida vacina no referido animal é aumentada pelo referido NGF. A invenção também se relaciona cem a utilização da referida associação 5 farmacêutica, em que a vacinação compreende administrar a um animal imunodeficiente uma primeira dose de uma vacina capaz de estimular, num animal, a produção de anticorpos para um agente estranho causador de doença ao referido animal; em seguida, num período de tempo entre 1 semana e 2 meses depois da administração da referida primeira dose, administrar ao referido animal seja 1) uma quantidade de Factor de Crescimento do Tecido Nervoso (NGF) de intensificação da eficácia da vacina que aumenta a produção dos referidos anticorpos, em resposta à referida vacina, seja 2) dose de reforço da referida vacina, juntamente com uma quantidade de Factor de Crescimento do Tecido Nervoso (NGF) de intensificação da eficácia da vacina, de modo a aumentar a eficácia da referida vacina no referido animal.

Breve Descrição do Desenhos A Fig. 1 é um gráfico que ilustra a produção de anticorpos em murganhos adultos tratados de acordo com a invenção, em comparação com o controlo. Ã Fig. 2 é um gráfico que ilustra a produção aumentada de anticorpos em murganhos envelhecidos utilizando a presente invenção, em comparação com o controlo. Ά Fig. 3 é um gráfico que ilustra a produção de anticorpos em murganhos jovens e envelhecidos. A Fig. 4 é um gráfico que ilustra a produção aumentada de anticorpos em murganhos envelhecidos de acordo com a presente invenção, depois de três meses de imunização, em comparação com o controlo. 6

Descrição Pormenorizada da Invenção

Verificou-se, inesperadamente, que o Factor de Crescimento do Tecido Nervcso não apenas actua sobre o desenvolvimento do sistema nervoso, como desempenha um papel importante na fisiologia do sistema imunológico. As células B de memória, linfócitos que mantêm a informação (memória) dc encontro de um organismo com uma dada estrutura química (antigénio), produzem e segregam NGF, ligam-no por meio de receptores de superfície de célula e respondem à sua mensagem biológica (circuito autócrino de produção e resposta pela mesma célula) permanecendo vivas por muitos anos e mesmo por toda a vida do organismo, ao contrário do resto das células linfóides que têm um tempo de vida muito mais curto.

Sem estar ligados a qualquer teoria em particular, crê-se que, para além da actividade do NGF em manter a sobrevivência das células B, o NGF também pode influenciar a sua geração, actuando de forma positiva sobre os seus precursores. A célula memória poderia originar da capacidade de produzir NGF, estocasticamente adquirida por um progenitor, caso contrário, destinado à morte por apoptose (suicídio), o que daria origem ao circuito autócrino que suporta a diferenciação para o estágio de célula memória madura e, depois, a sobrevivência desta. Deste modo, a administração de NGF exógeno a animais dá origem a números mais elevados de células memória. Um pool maior de células memória proporciona o indivíduo com uma protecção mais forte e mais duradoura contra o antigénio. Esta melhora é mais evidente em condições de imunodeficiência, por exemplo, envelhecimento, em que muitas respostas imunológicas são suprimidas. Ao aumentar o número de células B de memória, o NGF melhora a capacidade do sistema imunológico de reconhecer o antigénio a uma concentração muito baixa, em virtude da alta afinidade de anticorpos de superfície nas células B de memória. 7 A presente invenção pode ser aplicada a animais capazes de formar anticorpos numa reacção ímunológica, tais como mamíferos incluindo seres humanos, animais de criação e animais domésticos, bem como pássaros e aves domésticas. À medida que as pessoas envelhecem, a sua resposta ímunológica é reduzida, e a eficácia da vacinação é diminuída deviao à prevalência de resposta de anticorpo de baixa afinidade. Em concordância, a invenção é particularmente aplicável para utilização com seres humanos acima de 45 anos de idade, particularmente aqueles com 50 anos e acima. A invenção pode também ser aplicada em doentes de transplante que são imunodeficientes como resultado da administração de fármacos anti-rejeição, tal como a ciclosporina.

Crê-se que a presente invenção pode ser aplicada a qualquer vacina conhecida, cujos exemplos incluem vacina contra influenza, vacina contra Hemophilus influenza, vacina contra o vírus da Hepatí te A, vacina contra o vírus da Hepatite B, vacina contra o vírus da Hepatite C, vacina contra tuberculose, vacina contra o vírus Herpes-Zoster, vacina centra o Citomegalovírus, vacina contra a pneumonia Pneumocócica; vacina contra a meningite Meningocócica, vacina contra a Difteria, vacina contra o Tétano, vacina contra a Raiva, vacina contra a bactéria Heiicobacter pylori, vacina contra o pólio e vacina contra a varíola.

Crê-se também que a invenção pode ser aplicada a qualquer vacina futura, tal como uma vacina que pode ser desenvolvida para a vacinação contra o vírus da SIDA.

De um modo geral, as vacinas são administradas em quantidades na gama de 1 x IO'9 g a 1 x IO'3 g e, mais tipicamente, na gama de 1 x 10'8 g a 1 x IO-4 g.

As quantidades de NGF de intensificação da eficácia da vacina, de um modo geral, são administradas em quantidades na gama de 0,001 - 100 mg/kg de peso corporal do recipiente, preferencialmente, em quantidades de 0,01 - 10 mg/kg e, mais preferencialmente, 0,3-3 mg/kg.

De acordo com um aspecto da presente invenção, o NGF pode ser administrado antes e/ou concomitantemente com a administração da vacina. A presente invenção é particularmente eficaz quando administrada em relação a uma dose de vacinação secundária (reforço). As doses de vacinação secundária ou de reforço, tipicamente, são administradas num período de tempo de 1 semana a 2 meses depois da administração da primeira dose de vacina (primária), preferencialmente, em 10-45 dias da primeira dose da vacina, mais preferencialmente, em 10-30 dias da administração da primeira dose da vacina e, de acordo com algumas formas de realização, em 10—20 dias da administração da primeira dose da vacina.

De acordo com uma forma de realização, uma dose de NGF é administrada a um recipiente vários dias antes da administração de uma dose secundária (reforço) da vacina, mais preferencialmente, 3-4 dias antes da administração da dose secundária (reforço) da vacina. Em formas de realização particularmente preferidas, o NGF também é administrado concomitantemente com a administração da. dose secundária (reforço) da vacina. 9 A administração do NGF e da vacina pode ocorrer por qualquer meio adequado, tal como por injecção, por perfusão ou por via oral. Nas formas de realização particularmente referidas, a administração é por meio de injecção.

De acordo com uma forma de realização, o NGF pode ser administrado introduzindo mioblastos num recipiente, incluindo um vector que transporta um gene que codifica para o NGF. De acordo com esta forma de realização, o NGF é produzido pelos mioblastos no recipiente para aumentar a eficácia do sistema imunológico.

Quando uma vacina e o NGF são administrados concomitantemente, os mesmos podem ser proporcionados como uma composição única que inclui a vacina e o NGF.

As composições que incluem uma vacina e/ou o NGF também podem incluir um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis e, opcionalmente, outros componentes terapêuticos. As formulações adequadas para injecção ou perfusão incluem soluções para injecção estéreis, aquosas e não aquosas que podem conter, opcionalmente, antíoxidantes, tampões, bacteriostãticos e solutos que tornam as formulações isotónícas com o sangue do recipiente pretendido, e suspensões estéreis, aquosas e não aquosas que podem incluir agentes de suspensão e agentes de espessamento. As formulações podem ser apresentadas em recipientes de doses unitárias ou de doses múltiplas, por exemplo, ampolas e frascos vedados e podem ser armazenadas num estado seco por congelação (liofílizado) que requer apenas a adição do veículo liquido estéril, por exemplo, a água para injecção, imediatamente antes da utilização. 10

De preferência, o NGF utilizado é adequado ao recipiente, por exemplo, NGF humano é, preferencialmente, utilizado com recipientes humanos. A presente invenção é aplicável a NGF nativo (isto é, que ocorre naturalmente), bem como a NGF sintético e NGF recombinante correspondente ao NGF nativo, tendo a sequência de aminoácidos do NGF nativo, sequências de aminoácido biologicamente activas substancialmente semelhantes ao mesmo ou uma forma de sequência abreviada do mesmo, e os seus análogos biologicamente activos, tendo sequências substituídas, delectadas, alongadas, substituídas ou, então, modificadas que possuem uma bicactividade substancialmente semelhante à do NGF. A invenção é ainda ilustrada pelo Exemplo 1. EXEMPLO 1

Dois grupos de dez murganhos fêmeas C57/BL6, envelhecidos (> meses de idade) foram imunizados i.p. com 0,1 mg por murganho de (4-hidroxi-5-iodo-3-nitro-fenil)acetilo-aibumina de soro bovino (NIP-BSA) (Reth et ai., 1978) em 0,1 mL de soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS) ressuspensc em 0,1 mL de adjuvante de Freund completo. Depois de 21 dias, os animais num grupo foram injectados com 50 pg por animal de Factor de Crescimento do Tecido Nervoso (NGF) de murganho, purificado de glândulas salivares submandibulares conforme descrito, ao passo que os animais no outro grupo foram tratados com a mesma quantidade de NGF purificado, previamente desactivado por calor (72°C durante 20 minutos). Depois de maís quatro dias, os animais nos dois grupos foram dados o mesmo tratamento com NGF que acima e todos os murganhos foram administrados com doses de reforço com 0,1 mg de NIP-BSA em adjuvante de Freund incompleto. Depois de quatro dias, obteve-se « 0,4 mL de sangue de cada animal por aspiração do plexo retroorbiral e os anticorpos anti-BSA foram neutralizados pela adição de BSA às 11 amostras de soro. A titulação de IgG específica para NIP foi, então, avaliada por ELISA. Placas foram revestidas com NIP-BSA (35 pg/mL em PBS) e, depois de saturação com PBS contendo 1% de BSA e enxaguamento com PBS com 0,05% (v/v) de Tween-20, os poços revestidos foram incubados durante 1 hora a 37°C com diluição em série dos soros de murganho; um pool de soros de murganho pré-imune foi utilizado como controlo negativo. Foram detectados Ig ligados pela adição de IgG de cabra anti-murganho conjugado com fosfaease alcalina. A reacção final foi visualizada incubando com solução de substrato NPP (Sigma) e foi registada a absorvância a 405 nm. Os resultados estão apresentados na Tabela A adiante, e nas Figs. 1 e 2.

TABELA A

Titulação de IgG especifico para NIP (Unidades arbitrárias Abs^o) em soros de murganhos

Diluição do Soro Tratados com NGF Controlos Nível de significância (p) Envelhecido 1:20 179,1 + 29,3 82,6 ± 18,3 < 0,05 Normal 1:20 159,9 + 15,8 116,7 i 17,0 n. s. s . Envelhecido 1:50 146,3 ± 3,0 18,6 + 6,3 < 0,001 Normal 1:50 153,7 ± 19,2 133,8 + 11,9 n. s. s. Envelhecido 1:100 97,3 ± 17,5 < 10 < 0,0001 Normal 1:100 123,8 ± 34,7 148,4 ± 28,6 n . s . s . Envelhecido 1:500 75,5 +2,6 < 10 < 0,0001 Normal 1:500 87,3 + 7,53 98,2 i 14,2 n ♦ s. s . 80,1 ± 11,2 < 10 < 0,0001 Normal 1:1000 84,2 ± 12,3 78,1 ± 6,3 n.s.s. 12

As Figs. 1 e 2 demonstram que o tratamento com NGF aumenta dramaticamente a titulação de soro de IgG especifico para NIP em murganhos envelhecidos, ao passo que não afecta a resposta em murganhos jovens. A afinidade para o antigéníco determinante (NIP-BSA) da IgG específica em murganhos tratados com NGF e de controlo foi analisada numa máquina BIAcore, utilizando NIP-BSA acoplado a dextrano como chíp sensor. Os resultados destas experiências indicam que a afinidade da IgG para o antigénio é muito mais baixa em murganhos idosos do que em murganhos jovens, indicando um defeito na maturação das células memória. No entanto, o tratamento com NGF em murganhos idosos é capaz de restaurar a produção da IgG de alta afinidade, modificando, deste modo, não apenas a quantidade como também a qualidade da resposta imunológica hurnoral (dados não apresentados).

Com a finalidade de confirmar se este simples esquema de administração de NGF foi capaz de manter uma alta titulação de IgG específico durante um longo período depois da imunização, obtivemos amostras de sangue do mesmo grupo de murganhos imunizados, envelhecidos, três meses depois do reforço com NIP-BSA. A titulação do soro de IgG específico para NIP foi medida por ELISA. A Fig. 4 demonstra que o grupo de animais tratados com NGF manteve uma titulação significativa de IgG específico para NIP mesmo depois de um longo período desde a imunização de reforço.

Como um todo, estes resultados indicam que a qualidade e a quantidade da resposta imunológica hurnoral em murganhos envelhecidos pode ser corrigida mesmo por uma única administração de NGF no final da resposta primária, quando se sabe que ocorre a maturação das células B de memória. 0 tratamento com NGF, nesta altura, aumenta a 13 sobrevivência das células B de memória que, em murganhos envelhecidos, não são capazes de produzir a citoeina por elas próprias. Em contraste, o tratamento com NGF é ineficaz em animais jovens, normais, cujos linfócitos de memória são capazes de produzir quantidades suficientes de NGF e, deste modo, de sobreviver. Além disso, os dados sugerem que a administração de NGF pode ser útil em quase todos os estados de imunodeficiência primários ou secundários caracterizados por uma resposta imunológica humoral suprimida (cancro, SIDA, inflamação crónica, etc.). A invenção é ainda suportada pelo Exemplo 2 como a seguir. EXEMPLO 2

Sumário A produção do Factor de Crescimento do Tecido Nervoso (NGF) foi avaliada em culturas de linfócitos T e B e macrófagos humanos. 0 NGF foi produzido constitutivamente apenas pelas células B, que também expressaram as moléculas pjl40"rk‘A e p75NGFR de superfície e, deste modo, ligaram e internalizaram a citoeina de forma eficaz. A neutralização do NGF endógeno provocou o desaparecimento da proteína bcl-2 e a morte apoptótica dos linfócitos restantes que portam IgG ou IgA na superfície, uma população compreendendo células memória, enquanto que as IgM/IgD de superfície "virgens" de linfócitos B não foram afectadas. A administração in vivo de anticorpos anti-NGF de neutralização provocou a forte redução na titulação de IgG específica em murganhos imunizados com toxóide tetânico, nitrofencl ou arsenato e reduziu os números de linfócitos B da IgG ou IgA de superfície. Deste modo, o NGF é um factor de sobrevivência autócrino para os linfócitos B de memória. 14

Resultados

Produção de NGF por células humanas imunocompetentes, normais

Durante o decurso de um estudo para avaliar os níveis de NGF no plasma em vários ambientes patológicos, observamos que quantidades particularmente elevadas de citocina estavam presentes nos doentes com doenças crónicas do fígado e outros estados autoimunes. A fim de determinar que tipo de célula - se algum -entre as células imunocompetentes foi responsável pela produção do NGF, células normais do sangue periférico ou células mononucleares das amígdalas (MNC) foram fraccionadas em células T, células B e monócitos. Estas células foram, então, cultivadas na presença ou na ausência de estímulos relevantes e subsequentemente testadas para a verificação de evidência bioquímica da síntese e secreção de NGF. Apenas os linfócítos B constitutivamente produziram NGF e a sua geração de NGF foi aumentada por estimulação com Staphylococcus Aureus da estirpe Cowan I (SAC) (a) . A análise por imunoblot demonstrou uma banda importante no meio condicionado com linfócito B com anticorpos anti-NGF, mas não com IgG não imune (dados não apresentados). A imunoprecipitação de sobrenadantes de célula B metabolicamente marcadas também apresentou uma única banda importante com Mr 13 kDa sob condições redutoras ou com Mr2 6 kDA sob condição não redutoras, cuja presença foi bloqueada pela inclusãc de NGF não marcado em excesso. Estudos cinéticos de lisados e sobrenadantes de células B não apresentaram um pool de armazenamento de NGF (dados não apresentados). Em contraste ccm estes resultados com células B, não foi observada a produção de NGF ccm linfócítos T ou monócitos, mesmo depois da estimulação. Embora tenha sido registado, bastante recentemente, que alguns clones de célula T podem produzir NGF (Ehrard et al. , 1993b), parece que tais células estão escassamente representadas numa amostra de sangue periférico normal ou de amígdala (com base na análise das 15 populações de célula de pelo menos vinte dadores diferentes) e, deste modo, prestou-se atenção em particular à produção das células B.

Os linfócitos B foram fraccionados em gradientes de densidade e foram estudadas fracções de alfa e baixa densidade como representativas de células activadas em repouso e in vivo, respectivamente. Ambas as populações de células B produziram e libertaram eficientemente NGF (estas « 60% mais dc que aquelas, dados não apresentados). Em seguida, as células em repouso foram estimuladas com anticorpos para a região constante da cadeia de imunoglobulina humana mais Interleucina-4 (anti-μ + IL-4) ou com SAC, dois estímulos activos em células B, aquelas activando apenas a (s) células (s) IgMT de superfície e estas activando virtualmente todos os linfócitos B (Romagnani et al.r 19982). Ficou evidente que a estimulação com anti-μ + IL-4 foi ineficaz, enquanto SAC aumentou muito a síntese e a secreção do NGF. As análises por ELISA dos sobrenadantes de culturas semelhantes confirmaram que as células estimuladas por anti-μ + IL-4 e as células não estimuladas gradualmente reduziram a produção de NGF, ao passo que as células estimuladas por SAC aumentaram-na muito. Em contraste, ambos os estímulos foram eficazes, no que diz respeito à indução de índices de estimulação proliferativa de >10 e >20, respectivamente. Estas verificações indicaram que SAC, mas não anti-μ + IL-4, desencadeou uma via metabólica que leva à produção de NGF. Uma explicação alternativa era que os linfócitos que normalmente respondem a anti-μ + IL-4, isto é, principalmente às células sp'(V virgens, não alteraram a produção do NGF (ou, possivelmente, não o produziram) depois da ligação cruzada de slg, enquanto os linfócitos que respondem ao SAC, uma população também compreendendo células com fenótipc sy' ou sa+ (syT/a+), alteraram, sugerindo que a citocina estava envolvida em programas funcionais específicos a este último tipo de células. 16

Expressão de moléculas do receptor de NGF por células imunocompetentes humanas, normais A observação de que o NGF era produzido por linfócitos B promoveu uma determinação para verificar se os receptores de NGF também estavam presentes, possibilitando um circuito de resposta autócrina. Com esta finalidade, células T de amígdala ou de sangue periférico, células B e mcnócitos foram estudadas para a expressão das duas moléculas de ligação ao NGF que são exibidas no sistema nervoso, a pl40tEk‘A (trk) e a p75NGFR. As análises por transferência de Western de lisadcs de células utilizando anticorpos específicos, demonstraram, que cada um dos tipos de células estudados expressaram a molécula trk; curiosamente, a p75NGFR foi produzida apenas por células B. Além disso, as mesmas células foram estudadas por FACS depois de coradas com anticorpos para a cadeia p75NGFK e com Tmg 13.1, um anticorpo monoclonal recentemente descrito para a região de ligação da citocina extracelular da molécula trk (Eager, 1991) . Em concordância como a abordagem imunoquímica, a coloração dupla foi observada apenas nas células B, enquanto as células brancas T e os monócitos foram corados apenas por Tmg 13.1 (dados não apresentados). A expressão simultânea de ambas as cadeias de receptores por lifócitos B, uma situação típica das células nervosas, indicou que estas células estavam equipadas para responder à gama total dos sinais transmitidos peia citocina. As células B foram, portanto, observadas, com a finalidade de se obter dados relevantes para o papel funcional do NGF nos linfócitos. 7 Ά fim de demonstrar a ligação da citocina e, a fim de

analisar os seus efeitos funcionais, cs linfócitos B de amígdala foram separados em células pequenas e grandes e estudadas para verificar a sua capacidade de ligar e internalizar o NGF, utilizando ensaios de ligação de equilíbrio. Tanto as células B activadas em repouso como in vivo internalizaram 125I-NGF eficazmente (dados não apresentados). Foram observadas as curvas de saturação do i25l-NGF e as suas transformações Scatc.hard foram obtidas com células B grandes e em repouso. Conforme esperado, as células grandes expressaram duas classes de sítios de ligação, demonstrando Kd 30 pM (30.000 sítios/célula) e Kd 1 nM (106 sítios de ligação/célula), respectivamente, de acordo com os dados registados em relação às células nervosas. Surpreendentemente, quando a mesma análise foi realizada em células B pequenas, em repouso, não se pôde observar ligação saturável, mesmo depois da incubação com concentrações muito altas de 12iI-NGF (dados não apresentados), apesar da expressão evidente de ambas as cadeias receptoras e da internalização eficiente da citocina. Esta acentuada discrepância indicou a possibilidade de que o ligando endógeno estava, na realidade, a ocupar os sítios dos receptores, uma situação encontrada frequentemente quando os circuitos autócrinos estão a actuar (Cozzolino et al., 1989; Cozzolino et al., 1990). Deste medo, os linfócitos B pequenos, purificados, foram brevemente (60 segundos a 4°C) tratados com meio de cultura tamponizado a um pH 3,0 e, em seguida, lavados com meio regular antes do ensaio de ligação. Nestas condições, puderam ser detectados tanto os receptores de alta como de baixa afinidade (Kd 170 pM e 1 nM, respectivamente), com 90.000 e 10° sítios de ligação/célula, respectivamente. A fim de reforçar melhor a hipótese de que estes sítios estavam, de facto, ocupados por NGF devido à existência de um circuito autócrino, os eluidos do pH ácido (e os eluidos do pH neutro, como controlos) foram submetidos à técnica SDS-PAGE, submetidos à técnica de transferência e corados 18 com anticorpos específicos anti-NGF. A citocina foi detectada apenas nos eiuídos ácidos. Come um todo, estes resultados confirmaram a expressão por linfôcitos B de duas classes de receptores de NGF totalmente funcionais.

Efeito da neutralização do NGF endógeno em linfôcitos B

Os dados acima, indicando que as células B produziram NGF e expressaram receptores de alta e baixa afinidade, sustentaram a hipótese de um circuito autócrino. A fim de entender a função exercida por este circuito o NGF endógeno foi neutralizado e o seu impacto foi avaliado para verificar as propriedades dos linfôcitos B. Para esta finalidade foram utilizados seja anticorpos de neutralização para NGF, seja, em experiências seleccionadas, oligonucleótidos antisense para NGF. Os anticorpos anti-NGF foram primeiro testados em ensaios convencionais de incorporação de 3H-timidína utilizando linfôcitos B de sangue periférico ou amígdala em repouso, estimulado com anti-μ + IL-4 ou com SAC. Ambos os estímulos induziram uma resposta vigorosa na presença de anticorpos pré-imunes de controlo; na presença de anticorpos anti-NGF, a resposta ao anti-μ + IL-4 ficou inalterada, enquanto que a resposta ao SAC foi diminuída em 20-30% (Tabela 1), sugerindo, inicialmente, que o NGF estava envolvido na resposta proliferaiiva ao SAC. No entanto, a adição de NGF recombinante exógeno não fez aumentar a incorporação da 3H-timidina (Tabela 1), mesmo na presença de doses sub-óptimas de estimulantes (dados não apresentados), sugerindo, de um certo modo, que a citocina não estava a agir como um factor de crescimento. Em concordância, a proliferação espontânea de células B pré-activadas in vivo, de baixa densidade, não foram moduladas pelos anticorpos anti-NGF (dados não apresentados). Estas experiências de estimulação com anti-μ + IL-4 ou SAC, uma vez mais, indicaram que populações de células diferentes estava a responder 19 aos mitogénios e que estes poderiam estar divididos funcionalmente com base na utilização do NGF, para além da produção de NGF. A fim de obter suporte para este conceito os linfócitos B de amígdala em repouso foram separados por panning em células sp+5T e células sy+ e células soT (syVod) , que foram, então, estimuladas com SAC ou com anti-μ a il-4. A Tabela 1 demonstra que a proliferação de células 3μ+δ+ em resposta a SAC não foi afectada pelos anticorpos anti-NGF de neutralização. Conforme esperado, a proliferação de células sy+/a+ para anti-μ + IL-4 foi muito fraca (dados não apresentados), ao passo que estas células eram bastante sensíveis a SAC; quando a estimulação foi exercida na presença de anticorpos anti-NGF, a incorporação de 3H~timidina foi reduzida em 80% (<0,0001). Esta verificação, considerada em conjunto com os resultados das experiências na produção de NGF, sugeriu que a citocina era crítica para as células sy+/a+ e, aparentemente dispensável para as células sgfÔ+.

Estes dados conduziram à exploração adicional dos efeitos do NGF sobre as células sp+8T e as células syVod em repouso. Tendo em conta que não aumentou o crescimento in vítro das células B (Tabela 1) e por causa da propriedade conhecida de NGF de manter a sobrevivência das células neuronais (na sua ausência estas células sofrem apoptose), foi considerado se o NGF pode aumentar a sobrevivência das células sp+8+ ou das células sy+/a+ em repouso. Deste modo, as populações acima, purificadas da amígdala, foram cultivadas na presença de anticorpos anti-NGF ou olígonucleótidos antisense NGF por vários intervalos de tempo, e foi registada a proporção de ADN fragmentado/íntacto, como uma medida da percentagem das células que sofrem apoptose. Quando as células sg+8+ foram analisadas, proporções iguais de células eram apoptóticas, tanto aquelas tratadas como reagentes anti-NGF ccmo aquelas com IgG pré-imune de controlo (ou olígonucleótidos antisense). Em 20 contraste, as culturas de células syVof tratadas com anticorpos anti-NGF ou oligonucleótidos continham >60% de células apoptóticas às 60 horas, ao passo que as culturas de controlo tinham <20% de células apoptóticas (p <0,0001); curíosamente, a cinética da apoptose foi muito mais lenta em comparação com a das células sy+/a+, sugerindo uma importante diferença no potencial de vida entre estas últimas células e as células sy+/cx+ in vitro.

Como um todo, este conjunto de experiências demonstrou que o NGF endógeno era um factor de sobrevivência autócríno para as células sy+/a+, uma vez que a sua neutralização desencadeou a sua morte apoptótica, mas não para as células 3μ+δ+, sugerindo que apenas estas últimas células podiam elaborar a citccina. A fim de testar este conceito, foram analisadas, por ELISA, populações purificadas para verificar a produção de NGF. Ficou evidente que as células sy+/a+ produziram pelo menos oito vezes mais NGF do que as células sq+ô+ (409 células 19 pg/107 vs 51 células 4 pg/107; n=9).

Deste modo, a fim de verificar se a diferença funcionai entre os subconjuntos era devido à utilização, em vez da produção, de NGF, foi investigado um determinante importante da via que leva à apoptose, a produção de proteína bcl-2 (Korsmeyer, 1992). As populações de sy+/a+ e sg+ÔT purificadas, em repouso foram cultivadas com anticorpos anti-NGF ou de controlo durante 18 horas e, depois, lisadas para analisar o seu teor intracelular de proteína bcl-2. A neutralização de NGF endógeno provocou o completo desaparecimento da proteína bcl-2 das células sy+/a+, mas não afectou o teor de proteína bcl-2 nas células 8μ+δ% revelando uma importante diferença entre as sub-populações, no que diz respeito à utilização de NGF. 21

Anticorpos anti-NGP esgotam células B de memória in vivo

Uma vez que o fenótipo sp+/8+ identifica as células B virgens, ao passo que células com o fenótipo sy+/a+ compreendem aqueles linfócitos que já sofreram o processo da troca de classe da região constante de Ig, incluindo os linfócitos B de memória (Kishimoto e Hirano, 1989; Sprent, 1994), supôs-se que o NGF autócrino serve como um factor de sobrevivência para as células B de memória, e decidiu-se testar este conceito utilizando uma abordagem in vivo para analisar os sistemas bem definidos, específicos para hapteno de Nitrofenol-BSA (NP) ou Arsonto-KLH (Ars), ou o sistema de antigénio complexo (mosaico) Toxóide Tetânico (TT). Em primeiro lugar, foi demonstrado que uma identidade substancial entre as células B humanas e murinas, no que diz respeito a síntese do NGF (células murinas sy+/a+ e sp+ôT constitutívamente produziram células 234 t 21 e 28 í 3 pg/10', respectivamente), expressão do receptor de NGF [células murinas slg+ não fraccionadas expressas « 4.800 de alta afinidade (Kd » 135 mP) e » 10° de baixa afinidade (Kd «1,1 nM) sítios de ligação por célula] e a significância funcional da cítosina para células sobrev:ventes in vitro (as células syVa* apresentadas = 70% da fragmentação do ADN depois da exposição a anticorpos anti-NGF neutralizantes). Deste modo, grupos de vinte murganhos BALB/c ou C57BL/6 foram imunizados com o antigénio relevante e, depois de 40 dias, um grupo de 10 animais recebeu uma única dose de IgC anti-NGF de neutralização, enquanto os outros dez murganhos foram injeetados com IgG não imune como controlo. Depois de 48 horas adicionais, todos os animais receberam uma dose de reforço do respectivo antigénio e, quatro dias ma is tarde todos os murganhos foram sacrificados e as concentrações de IgG e IgM no plasma, específicos para o antigénio, foram determinadas per meio de ELISA. Os animais que receberam anticorpos anti-NGF apresentaram níveis de IgG especifico para o imunogénío dístíntamente inferior 22 àqueles dos controlos (p <0,001). Em contraste, não se observou qualquer diferença na concentração do IgM especifico para o antigénio, indicando que a resposta do anticorpo gerada pelos linfócitos B virgens, acabados de formar, que encontraram o imunogénio, a segunda resposta "primária", não foi afectada. Para melhor reforçar esta conclusão, dois grupos adicionais de murganhos foram primeiro tratados com IgG anti-NGF ou com IgG de controlo, depois (48 horas mais tarde,) foram imunizados com TT e depois de uma semana foram sacrificados para determinar o seu nível de IgM no plasma, específico para TT, que não era estatisticamente diferente nas duas populações (0,275 ± 0,032 Abs 405 Unidades Arbitrárias nos animais tratados vs 0,284 ± 0,041 nos controlos) (dados não apresentados).

As verificações acima sugeriram que, de acordo com os dados ín vitro, os anticorpos anti-NGF foram capazes de induzir a morte celular da maior parte das células 3 de memória trocadas isotopicamente, suprimindo, deste modo, uma resposta humoral secundária. Para obter prova directa para suportar este conceito, dois grupos de murganhos adultos normais foram tratados com IgG anti-NGF ou com IgG de controlo, depois de três dias foram isoladas as células do baço e as proporções das sub-populações de células B foram avaliadas por citofluorometria. A percentagem de células sy+/a+ foi signíficativamente reduzida nos baços de murganhos tratados, comparados como os controlos, embora não tenha sido observada uma diferença significativa entre os dois grupos na percentagem de células sp+ôT. Como um todo, este conjunto de experiências indicou que o NGF também in vivo desempenha um papel na manutenção das células B de memória. 23

NGF não é um factor de troca para linfócitos B 0 resultado das experiências de neutralização do NGF in vivo, acima, foi compatível com a hipótese de que a citocina era um factor de sobrevivência autócrina para os linfócitos B de memória. No entanto, os mesmos resultados teriam sido observados se o NGF estivesse envolvido no mecanismo que governa a troca de classe de IgMIgG, juntamente com o ligando CD40 (Aruffo et al., 1993). Se assim fosse, no entanto, uma proporção mais elevada de células produtoras de IgM, juntamente com uma quantidade reduzida de células produtoras de IgG ou IgA, deveria ser observada sempre que uma população policlonal de linfócitos é induzida para diferenciar in vitio na presença de anticorpos anti-NGF. Deste modo, células mononucleares de sangue periférico humano, normais, foram cultivadas durante dez dias com pokeweed mítogen, para estimular a diferenciação policlonal (Kishimoto e Hirano, 1989) e seja IgG anti-NGF seja IgG não imune como controlos negativos, ou com pentámero CD40 solúvel, urna molécula geneticamente modificada que evita a interacção CD40-gp39 (Fanslow et al., 1992), como controlo positivo. As medições da Ig por meio de ELISA revelaram que os anticorpos anti-NGF induziram uma redução definida no nível de IgG e IgA nas culturas estimuladas por pokeweed mitogen, mas também níveis de IgM 20% inferiores aos daquelas culturas de controlo (Tabela 2). Em contraste, o pentámero CD4Q solúvel provocou uma depressão da secreção de IgG e IgA comparada com os controlos e um aumento na taxa de secreção de IgM (Tabela 2).

Estas experiências indicaram uma clara diferença nos mecanismos passíveis de serem responsáveis pelas alterações observadas. De facto, o pentámero CD40 solúvel provocou um bloqueio no fenómeno de troca da classe Ig, induzindo uma "acumulação" de células no compartimento de pré-troca (isto é, sT) ; em contraste, os anticorpos anti-NGF provocaram apenas uma forte redução das 24 células produtoras de IgG e IgA, uma prova do desaparecimento (morte) das respectivas precursoras, induzida por anticorpos anti-NGF. Estes dados estão de acordo com os resultados das experiências ín vivo acima, pela qual a redução de células s+ ou s+ não foi acompanhada por um aumento de células s+. Como um todo, estas verificações indicaram, fortemente, que o NGF não estava a actuar como um "factor de troca" para linfócitos B humanos ou murinos, normais.

Discussão

A capacidade de discriminar com subtileza entre uma profusão de estruturas quimicas e reter um traço destes encontros especificidade e memória - são as caracteristicas do sistema imunoiógíco. Embora as bases moleculares da especificidade tenham sido definidas principalmente por meio da extensa caracterização da bioquímica e genética dos receptores de antigénio expressos por linfócitos T e B, o conhecimento da memória imunológica é ainda, em grande parte, fenomenológicc. Em particular, permanece a ser definido se uma única célula memória, como a maioria dos linfócitos, tem uma duração de vida definida e limitada em condições inertes, ou então, é uma célula de vida longa que dura por anos, possivelmente por toda a vida. Foram propostas várias hipóteses, sendo a prevalente que a longa perseverança do antiqénio no intericr de órgãos linfóides resulta numa proliferação lenta e contínua de células imunológicas que mantêm a memória imunológica (Cray, 1993). No entanto, é difícil imaginar como os antigénios podem permanecer inalterados durante anos, particularmente se forem proteináceos (Sprent, 1994). De facto, foram dadas provas de que a memória imunológica pode ser mantida durante períodos de tempo bastante longos por células não ciclizantes (Schittek e Rajewsky, 1990), embora os mecanismos moleculares que permitem a sua sobrevivências ainda sejam desconhecidos. A prova actual sugere que os linfócitos B 25 de memória, quando gerados, podem sofrer o mesmo destino das células "perenes" de Bizzozzero, cujos protótipos são neurónios, devido à sua capacidade de produzir o factor de sobrevivência autócrino, NGF. 0 argumento mais importante que sugere que a citocina actua como um factor de sobrevivência, em vez de um factor de crescimento é baseado na observação de que evitar o desencadeamento do receptor de NGF de células B em repouso syVa+ purificadas, por meio da neutralização dos anticorpos anti-NGF provocou a morte maciça de células por apoptose. Além disso, quando as células B não fraccionadas, em repouso foram estimuladas com anticorpos anti-μ + IL-4, que obtém uma forte resposta proliferativa, as mesmas não aumentaram a taxa de produção e a sua proliferação não foi aumentada por NGF recombinante exógeno, nem foi afectada por anticorpos anti-NGF. Além disso, quando se utilizou SAC para estimular as mesmas células, foram segregadas quantidades aumentadas de NGF, mas a adição de mais citocina exógena não potenciou a incorporação de ~H-timidina, mesmo se doses sub-óptimas de estimulante fossem aplicadas. Em concordância, as células B pré-activadas in vivo de baixa densidade expressaram mais NGF, mas doses saturantes de anticorpos anti-NGF não aboliram a proliferação de células B, como seria esperado se a citocina fosse um factor de crescimento. Tomadas em conjunto, estas considerações, preferencialmente, apontam para o NGF como um factor de sobrevivência.

Esta conclusão pode parecer em conflito com os registos de que nos últimos anos sugeriram uma actividade estimuladora do crescimento intrínseca do NGF em linfócitos (Otte et ai,, 1989;

Brodie e Gelgand, 1992; > · No entanto, estes regisnos podem ser reinterpretados levando em consideração que, de acordo com estas verificações, a adição de NGF exógeno pode reduzir o número de algumas células a morrer es ipontaneamente in vítro [particularmente 26 aquelas que originam as células que segregam IgA e IgG (Kimata et al.r 1991) devido a condições de cultura de baixa densidade, levando, eventualmente, a uma proliferação basal ma is elevada em cultura. Além disso, a distinção entre o factor de crescimento e de sobrevivência pede ser puramente nominalístico, conforme sugerido pela observação de que a IL-3 e o Factor de Células Estaminais suportam a sobrevivência a longo prazo de progenitoras linfo-hematopoiéticas não ciclizantes dormentes em culturas líquidas (Katayama et al., 1993).

A verificação da produção espontânea de NGF por células B proporciona maior suporte à evidência de um papel "flogístico" do NGF (Aloe et al., 1994), que provavelmente contribui, de uma maneira parácrina, para a função das células inflamatórias, tais como os macrófagos, que são equipados com o mecanismo receptor necessário para responder à citocina (Ehrhard et al. , 1993a), mas é incapaz de a produzir (Santambrogio et ai., 1994). Considerações semelhantes aplicam-se aos linfócitos T. Nestes estudo, não foram feitas tentativas para caracterizar mais precisamente, de um ponto de vista fenotípico ou funcional, as (sub)populações de células T que expressam os receptores de NGF e, deste modo, provavelmente, respondem ao mesmo. No entanto, o NGF derivado de células B pode ser favorável a papéis importantes no complexo evento da apresentação de antigénio de células B para linfócitos T, particularinente quando uma resposta imunológica secundária tem de ocorrer. De facto, as células B de memória slgG+ expressam os receptores corn a mais alta afinidade para o antigénio (Siekevítz et al., 1987; MacLennan e Cray, 1986) e, deste modo, são privilegiadas na competição para a ligação que ocorre quando o antigénio é em quantidade limitada. A sua capacidade em libertar NGF pode ser essencial para uma activação apropriada seja de células T de memória ou naive. 27

Um ponto importante que emergiu deste estudo é a expressão simultânea de ambas as cadeias conhecidas por ligar o NGF - a molécula trk e a molécula p75NG‘“ - por linfócitos B, uma característica apresentada, tipicamente, por células neuronais. Embora o NGF fosse a primeira citocina a ser caracterizada, ainda se sabe relativamente pouco a cerca das vias metabólicas específicas desencadeadas peia sua interacção com cada cadeia de receptor, nem é claro se ambas as cadeias cooperam ou não em ligar uma única molécula ou ligando, uma vez que foram registados resultados conflítuantes neste tópico (Jing et ai., 1992; Benedetti et al., 1993; Huber e Chao, 1995). No entanto, foi demonstrado que a expressão de p75NGF induziu a morte de células neurais constitutivamente quando a proteína não estava ligada, ao passo que a sua ligação por NGF ou por anticorpos monoclonais inibiu a morte da célula (Rabizadeh et al., 1993), sugerindo que a mesmo é, per se, capaz de transmitir um sinal biológico, em concordância com a homologia estrutural entre a p7 5N&1, e uma série de cadeias de receptores, incluindo TNFRI, TNFRII, Fas/Apo-1 e CD40, todas envolvidas em induzir ou evitar a apoptose em células alvo (analisado em Raffioni et al., 1993). Estes últimos dados estão totalmente de acordo com as verificações de que a neutralização do NGF autócrinc, mas não o tratamento com anti-p75NGFR, determina a morte das células B (manuscrito em preparação), indicando esta cadeia de receptor como um mediador qe sinais que actua sobre a linha de divergência entre sobrevivência/morte. Curiosamente, apesar da homologia estrutural entre p75NGFR e CD40, ficou claro que o NGF não faz parte do processo de troca de classes de Ig. eratinócítos ou 1993), a trk é a proliferação

Em alguns tipos de células, tais como os : melanócitos (Yaar et al., 1994; Di Marco et al., mediadora de sinais que potencialmente estimulam celular, em contraste com o que ocorre nas células neuronais, de modo que o NGF evita a apoptose depois de uma união com a trk, 28 possivelmente por meio da activação da fosfatidil inositol-3 quinase (Yao e Cooper, 1995). Esta discrepância pode ser resolvida pela existência de outra(s) cadeia(s) que pode(m) participar na formação de um complexo receptor de cadeias múltiplas com trk e/ou p7 5NGFR, como geralmente ocorre para a maioria dos receptores de cítocina. Esta última hipótese também explicaria a diferença limitada mas significativa que observamos nas afinidades de ligação do NGF apresentada por grandes populações de células B em repouso (« 30 pM vs * 170 pM, respectivamente). A separação de linfócitos B normais, em repouso, com base na expressão de isótipo Ig de superfície identifica duas sub-populações funcionalmente diferentes, isto é, as células 3μ+δ+ virgens e as células memória sy+/a+ (Kishimoto e Hirano, 1989) . Utilizamos esta abordagem para obter uma compreensão do papel do circuito autócrino de NGF e observamos várias características que conduziram à ideia de que a citocina é um factor de sobrevivência endógeno para as células memória, tanto em seres humanos como em murganhos. Em primeiro lugar, enquanto tanto as células virgens como as células memória expressaram basicamente os mesmos níveis de receptores de NGF, estas produziram pelo menos oito vezes mais proteína NGF do que aquelas. Em segundo lugar, o tratamento com anti-corpos anti-NGF de neutralização induziram o desaparecimento da proteína bcl-2 e, consistentemente, a maciça fragmentação do ADN em células sy+/a+, ao passo que foi insignificante para as células sp+ô+. Em terceiro lugar, a administração in vivo de anticorpos anti-NGF aboliu as respostas imunoiógicas secundárias, específicas para o antigénio, mas não afectcu a resposta primária de IgM. Finalmente, uma única injecção de anticorpos anti-NGF em animais normais provocou uma distinta redução na percentagem de linfócitos B isotipicamente trocados, o que compromete as células memória. Por outro lado, estas verificações levam a pelo menos duas questões importantes, 29 nomeadamente , o estágio de maturação em que tem lugar a expressão do gene NGF e as relações entre NGF e fccl-2. A produção baixa, mas detectávei, de NGF por células sp+Ô+ indicaria um aparecimento relativamente cedo durante a ontogénese das células B, cu]a significância funcional deveria ser melhor elucidada. No entanto, com base em considerações quantitativas a cerca das magnitudes de sub-populações de células B diferentes, sugere-se que as células spr também compreendam linfócidos de memória, capazes de dar origem a células que segregam Ig que não seja a IgM (Cray, 1993) . Se assim for, o NGF que observamos, derivado de células spq poderia ser produzido por estas ultimas células e, neste caso, a expressão do gene NGF pode ser ligada e, possivelmente regulada pelos mesmos mecanismos moleculares que operam a troca de classe da Ig.

Actualmente, pouco se sabe sobre as vias moleculares que relacionam as cadeias do receptor de NGF com a bcl-2, uma proteína que regula de forma critica a sobrevivência tanto em neurónios como em células linfóides, particularmente as células B de memória (Batistatou et al., 1993; Hawkins e Vaux, 1994; Nunez et al., 1991) que, de facto, desaparece das células slgG+ ou s ..gói em repouso tratadas com anticorpos anti-NGF de neutralização. Recentemente, foi proporcionada prova de que espécies reactivas de oxigénio e, de uma maneira mais geral, alterações no redox celular potencial, podem estar envolvidas (Greenlund, et al., 1995). Neste sentido, foi demonstrado que a produção de baixa taxa de óxido nítrico em linfócitos B infectados por EBV, que cor.stitutívamente expressam a óxido nítrico sir.tase, evita a apoptose (Mannick et al., 1994), provavelmente actuando em níveis múltiplos em vias sensíveis ao tíol que também regulam o metabolismo da bcl-2, susceptível ao redox intracelular potencial e que participam na sua manutenção (Hockenbery et al., 1993). Curiosamente, Mosialos et al. , (1995) 30 demonstrou, bastante recentemente, que existem relações funcionais entre as proteínas que transduzem sinais da família de receptores TNF/Fas/NGF; uma vez que o TNF induz alterações no equilíbrio do redox celular (Ishii et al. , 1992), estas moléculas também participam da resposta adaptativa obtida pelo NGF. Estamos, actuaimente, a investigar esta última hipótese em células B de memória a seguir a neutralização do NGF.

Uma prova notável que merece consideração é a observação de que, pelo menos em células linfóides, tanto a apoptose como a sobrevivência celular são reguladas por meio de circuitos autócrinos, a primeira envolvendo Fas/Apo-1 e os seus ligandos (Brunner et al.r 1995; Dhien et al. , 1995; Ju et al., 1995) e a última envolvendo NGF, de acordo com os nossos dados. Tal arranjo assegura que todas as exigências moleculares necessárias para comprometer a célula com qualquer via estão imediatamente disponíveis e auxilia a entender como os órgãos linfóides são sítios onde podem ocorrer alterações funcionais complexas de uma maneira ordenada. A prova de que o circuito autócrinc é publico -envolvendo a secreção de ligandos e unindo a receptores extracelulares, em vez de ser privado ou intracrino - sugere, fortemente, que a função de ambos os sistemas pode ser modulada seja por antagonistas do receptor seja por receptores solúveis, dando origem a uma rede complexa de controlos "sociais" em relação ao destino de um único linfócito. Curiosamente, esta complexidade pode produzir várias oportunidades para interferir com tal dinâmica utilizando abordagens farmacológicas. 31

Procedimentos Experimentais

Isolamento e cultura de células

Linfócítos T de humanos foram separados de células moncnucleares do sangue periférico ou de células de amígdala por E-rosetting. Os monócitoso foram isolados por aderência em placas de Petri de plástico. Os linfócítos B foram ainda purificados da população não T utilizando esférulas magnéticas revestidas com CD19. Linfócítos de murino, empobrecidos dos monócitos como acima, foram isolados dos baços por dois turnos de selecçào negativa utilizando um anticorpo monoclonal anti-CD3e (Boheringer Mannheim, Milão, Itália). A pureza da população era superior a 95%, conforme avaliado por citometria de fluxo. As células B de humanos ou murinos foram ainda fraccionadas em células em repouso (alta densidade) e activadas (baixa densidade) por gradientes de densidade de Percoll. As proporções das células slgM+, slgG+ e slgA+ ein células B de amígdala em repouso eram, tipicamente, 65%, 25% e 10%, respectivamente, conforme avaliado por citometria de fluxo.

Para os ensaios de proliferação, as células B foram cultivadas em placas de 96 poços na concentração de 106/mL em meio RPMI 1 640 (GIBCO, Milão) suplementado com 10% v/v de soro fetal bovino (FCS, Hycone, Logan, UT) , durante 72 horas em ar humidificado com 5% de C02. Foi utilizado Staphylococcus Ãureus desactivado por calor da estirpe Cowan I (SAC, Boheringer Mannheim) na diluição final de 1:10.000. Foi utilizado rIL-4 humano (R & D, Minneapolis, MN) a 100 U/mL, foi utilizada cadeia anti-hurnana de cabra a 1 g/mL, NGF (Boheringer Mannheim) foi utilizado a 100 ng/mL, anticorpos anti-NGF de cabra de neutralização [R & D, ND50 = 10 pg/mL no ensaio de proliferação de célula neuroblastoma iMT-32 (Janet st al.r 1995) em resposta a 100 ng/mL de NGF] ou IgG de cabra pré-imune foi utilizada a 10 ug/mL. As células foram pulsadas 32 com 0,5 Ci de 3H-timidina nas últimas 12 horas da cultura e contadas num contador de cintilação β.

Para a produção de imunoglobulina, foram cultivadas células mononucleares de sangue periférico humano durante 12 dias, na presença cu ausência de pokeweed mitogen (GIBCQ), 10 g/mL de anticorpos anti-NGF (10 g/mL), IgG de cabra pré-imune (10 g/mL), sobrenadante CD40 ou CD4 (1:10 diluição final). Os sobrenadantes foram colhidos e testados por ELISA para verificação da produção de IgG, IgA, IgM.

Para a análise da produção de NGF, foram cultivadas células (2 x 10') a ΙΟ'/mL em RPMI-1640 livre de soro, suplementado com 10% (v/v) de Nutridoma (Sigma) para tempos diferentes na presença ou ausência de SAC (1:10.000 diluição final), fito-hemoaglutinina (PHA-P, 1 g/mL, GIBCO), lipopolissácarido (LPS, 10 g/mL, Sigma) e sobrenadantes testados por ELISA.

As sub-populações de células B foram isoladas por procedimentos de panníng utilizando placas de Petri de plástico com IgM anti-humano de coelho e IgD anti-humano de coelho (referido como sp1 δ+) , ou IgG anti-humano de coelho mais IgA anti-humano de coelho (referido como s+/+) ou IgM e IgD ou IgG e IgA anti-murçanhos de cabra, preparado conforme descrito (Wysocki et al., 1978) . A pureza da população isolada foi sempre >90%, conforme avaliado por citometria de fluxo utilizando mAbs específico. A fim de eliminar a interferência do processo de activação a seguir ao desencadeamento do receptor slg, todas as experiências foram repetidas utilizando as populações não aderentes recíprocas (por exemplo, células s", compreendendo principalmente células s+/+), recuperadas depois de três turnos de aderência das placas revestidas com Ig. 33

Determinação da viabilidade celular e fragmentação de ADN

Sub-populações de células B de humanos e murinos, cultivadas a 5 x 106/mL com 10 pg/mL de IgG anti-NGF ou IgG pré-imune, ou com 20 μΜ de oligonucleótidos 18-mer antisense ou sense complementares aos nucleótidos 54-72 da região de codificação de NGF (Pnmm, Milão, Itália) foram diluídas com 1:1,5 com 5mM Tris, 20mM EDTA e 0,5% (v/v) de Triton X-100, pH 8,0 e deixou-se lisar durante 15 minutos em gelo antes da centrifugação por 20 minutos a 27.000 x g, para separar a cromatina incacta (sedimento) dos fragmentos de ADN (sobrenadante). Os sedimentos foram ressupensos em 5 mL de um tampão contendo 10 mM Tris e 1 mM EDTA e as amostras da suspensão e do sobrenadante foram testadas para verificação do teor de ADN, utilizando o reagente difenilamina (1,5% de difenilamina em ácido acético mais 101 de acetaldeído) durante 16 horas a 30°C (Burton, 19956). A densidade óptica a 600 ntn foi medida para cada amostra. A percentagem do fragmento de ADN foi calculada de acordo com McConkey et al., (1989). A viabilidade celular foi avaliada pela técnica de exclusão do corante azul tripano.

Estudos de ligação por radioligandos

Para analisar os receptores de NGF de superfície, linfócitos B esplénicos murino ou de amígdala em repouso humanos foram tratados com ácido com meio RPMI-1640 tainponizado ao pH 3,0 durante 1 minuto em gelo e lavado com PBS. Os linfócídos B em repouso tratados com ácido e os linfócitos B grandes, actívados in vivo foram, então, incubados a lQVmL com concentrações diferentes de i3I-NGF (Amersham, Milão, actividade específico 50 Ci/g), na presença ou ausência de rNGF humano não marcado em excesso durante 2 horas a 4°C. As células foram lavadas e a radioactividade ligada foi contada num contador-ay. A ligação específica foi calculada para cada ponto experimental e os dados foram analisados por um 34 programa científico (Fig.P, Biosoft, Cambridge, Reino Unido). Para a internalização do radioligando, as células foram cultivadas como acima com 0,5 nM de ^I-NGF na presença ou ausência de NGF não marcado em excesso, lavado e cultivado a 37°C durante 2 horas, depois tratado com tarnpâo glicina (pH 2, 8) e lisado. A radioactividade ligada à membrana (eluido ácido) e associada à célula foi determinada por contagem num contador-ay. 0 lavado de pH neutro e o eluido de pH ácido de 108 células B em repouso foi concentrado em TCA, submetido a transferência em nitrocelulose e imunocorado com IgG anti-NGF ou com IgG pré-imune para a detecção do ligando endógeno ligado ao receptor.

Análise imunoquímica

Para a análise por transferência de Western os sobrenadantes ou os lisados NP-40 (0,25% em PBS) de células 2 x 107 foram precipitados por TCA, lavados com etanol e diluídos 1:1 em tampão 2-mercaptoetanol Laemmli, As amostras foram corridas em SDS-PAGE, submetida a transferência contra filtros de nitrocelulose e imunocoradas com os anticorpos apropriados [anti-NGF de cabra, anti-trk de coelho (Genzyme, Bóston, MA) , anti-p75NGFR de murganho (Boheringer Mannheim), anti-bcl-2 de murganho (Santa Cruz Technology, Milão)] ou com Ig pré-imune. Os complexos antigénio-anticorpo foram visualizados utilizando anticorpos secundários apropriados e o sistema de detecção ECL, conforme recomendado pelo fabricante (Amersham). Para as marcações endógenas e os estudes de imunoprecipitação as células foram lavadas três vezes com RPMI-1643 (GIBCO) livre de cisteina e cultivadas a 107mL no mesmo meio suplementado com 5% de FCS dialisado e 200 Ci de J=S-cisteína (Amersham, actividade específica 800 Ci/mM) durante 4 horas a 37eC em 5% de CO2. Os sobrenadantes foram removidos e as células foram lavadas em PBS frio e lisadas em 0,25% de NP-40 maís PMSF 1 mM. Os sobrenadantes e os lisados celulares feram imunoprecipitados, 35 conforme descrito (Cozzolino et al. , 1990), na presença ou ausência de 100 pg/mL de rNGF humano. Os imunoprecipitados foram lavados, eiuidos em tampão SDS Laemmli com ou sem 2-mercaptoetanol e corridos em placas SDS-PAGE a 15% que foram tratadas com Amplify (Amersham), secos e expostos a Hyper film MP (Amersham) a -70°C.

Imunização e tratamento de murganhos

Preparou-se Ars-KLH pela diazotaçâo do ácido p-aminofenilarsónico e ligando a hemocianina keyhole pimpet (KLH, Calbiochem) numa proporção de 40 mg de hapteno para 1 g de proteína (Nisonoff, 1967). O (4-hidroxi-5-iodo-3-nitro-fenil)aceti.lo (NIP, um presente generoso do Dr. D. Schilovich, HSR, Milão) foi ligado a albumina de soro bovino (NIP-BSA) de acordo com Reth et al., 1978. Dois grupos de vinte murganhos Balb/c, fêmeas, com 6 semanas de idade, foram infectados s.c. no pescoço com 0,1 mL de solução TT [15 pg/mL (Anatetal, Biocine-Sclavo, Siena, Itália) ou i.p. com ARs-KLH (0,1 mg) e um grupo de vinte murganhos C57BL/6 foi imunizado i.p. com 0,1 mg de NIP-BSA. Quarenta dias depois da primeira dose, dez murganhos de cada grupo foram tratados com IgG anti-NGF de cabra (500 g/murganho), os outros com IgG de cabra pré-imune (500 g/murganho) e 48 horas mais tarde todos os murganhos foram reforçados com a mesma dose do antigénio relevante. Quatro dias depois da segunda imunização, foi retirado sangue do plexo venoso retroorbital. Outros grupos de dez murganhos imunizados com TT, NIP-BSA ou Ars-KLH foram utilizados par a medição de IgG específico de antigénio imediatamente antes da injecção de reforço.

Para análise FACS de esplenócitos, grupos de dez murganhos BALB/c adultos foram tratados com duas injecções em 72 horas (0,5 mg/murganho) de anticorpos anti-NGF ou IgG de cabra. Depois de mais 72 horas, os murganhos foram sacrificados e foram obtidos esplenócitos, empobrecidos de monócitos. A percentagem de 36 esplenócitos IgG+, IgA+ ou IgM1' de superfície foi determinada por citofluorimerria utilizando anticorpos específicos.

ELISA ELISA para NGF foi realizado conforme descrito por Sõderstrõm et al. (1990). Para a avaliação da titulação de IgM ou IgG específico para Toxóide Tetânico (TT), as placas foram revestidas com 50 L de TT (10 g/mL) em tampão borato 0,1 M, pH 8,6, de um dia para o outro a 4°C. Para a avaliação da titulação de IgM ou IgG específico para NIP ou Ars, as placas foram revestidas com NIP-KLH ou Ars-BSA (35 pg/mL em PBS) . A titulação de IgM e IgG específica para os complexos ímunizadores também foi avaliada revestindo as placas com NIP-BSA ou Ars-KLH. Depois da saturação com PBS contendo 1% de BSA e enxaguando com PBS com 0,05% (v/v) de Tween 20, os poços revestidos foram incubados durante 1 hora a 37°C com diluição em série de soros de murganho; um pool de soros de murganhos pré-imunes foi utilizado como controlo negativo. Ig ligado foi detectado pela adição de IgM ou IgG anti-murganho de cabra conjugado com fosfatase alcalina. A reacção final foi visualizada pela incubação com solução de substrato NPP (Sigma) e foi registada a absorvância a 405 nm.

Tabela 1. Efeito de anticorpos anti-NGF na proliferação de linfócitos B em repouso induzida por mitogénio

Incorporação dom 3H-timidina (cpm)

Exp. 1 Exp. 2 Exp. 3 Células 3 LTF 251 2 40 306 Células B UF + NGF 305 312 403 Céluxas 3 UF + SÃC 13.808 52.010 17.040 Células B DF - SAC + anti-NGF 11.489 25.432 13.050 Células B OF * SAC + IgG de cabra lu, /65 32.456 17.321 Células B UF - SAC NGF 14.CSC 34.021 1S.028 37

Céluias B UF + IL-4 + anti-μ 12.896 15.675 11.366 Células B UF + IL-4 + anti-μ + ar.ti-MGF 12.798 15.254 10.937 Células 3 1/ΓΕ ’ + IL-4 + anti-μ - IgG de cabra 12.913 16.070 11.654 Células B UF + IL-4 + anti-μ + NGF 13.004 16.876 12.114 Células splT purificadas 381 426 368 Células sptT purificadas + SAC + IgG de cabra 6.863 7.121 7.256 Células 6,943 6.889 7.124 sp 'ò punricactas + SAC + anti-NbF 279 344 368 Células syVa' purificadas 13.935 14.759 13.157 Células sy* / a' purificadas + SAC + IgG de cabra 2.468 3.137 2.324 Células sy‘ /a' purificadas + SAC + anti-NGF

Linfócitos B em repouso não fraccionaaos (UF) ou as populações purificadas indicadas foram cultivados durante 48 horas e pulsadas com 3H-timidina nas últimas 12 heras. Os dados foram expressos como a incorporação média de 3H-timidina de culturas em triplicata. 0 DP (desvio padrão) foi sempre inferior a 10%. Utilizou-se SAC na diluição final de 1:10.000. Foram utilizados anticorpos anti-NGF de cabra ou IgG de cabra pré-imune à concentração de 10 g/mL. NGF recombinante humano foi utilizado à concentração de 100 ng/mL. IL-4 foi utilizada à concentração de 100 U/mL. Anti- de coelho pcliclonal foi utilizado à concentração de 1 g/mL.

Tabela 2. Efeito de anticorpos anti-NGF na produção de Ig em PBMNC estimulada por PWM ig (ng/mL} IgM IgG IgA Apenas o meio 84 30 676 PWM 1.028 966 10.716 PWM + a-NGF 67 4 374 1.350 PWM + IgG de cabra 987 995 9.243 PWM + CD4 Ou 1.530 554 4.794 PWM + CD4p 92 8 1.024 9.865 38 PBMNC humanas foram cultivadas a 3 x 106 células/mL durante 12 dias na presença ou ausência de PWM (10 mg/mL), anticorpos anti-NGF de cabra ou IgG de cabra pré-imune (10 mg/mL), sobrenadante CD40 ou CD4 (1:10 diluição final). No final da incubação, os sobrenadantes foram colhidos e a IgA, IgG e IgM foram medidas por ELISA utilizando anticorpos específicos. Os dados são expressos como a concentração média de Ig de poços em triplicata; o DP foi de <15%. EXEMPLO 3

As alterações associadas à idade na imunidade humoral afecta a qualidade mais do que a quantidade da resposta do anticorpo. As alterações na qualidade da resposta do anticorpo com a idade inclui deslocamentos nos isótipos de anticorpos de IgG para IgM e nas afinidades dos anticorpos de alta para baixa. As respostas diminuídas dos idosos à maioria das vacinas e a maior susceptibilidade dos idosos a infecções promoveu uma ideia de que a senescência imunológica leva a um estado de deficiência imunológica. Embora estas alterações possam ser amplamente relacionadas a uma capacidade diminuídas das células T para facilitar a maturação das células B no que diz respeito ao isótipo e maturação da afinidade na periferia, este exemple demonstra uma capacidade diminuída das células B de memória de animais idosos em sobreviver, devido a uma produção diminuída de NGF. A administração de NGF durante a fase de maturação das células B de memória restaura a produção de IgG específico de alta afinidade em murganhos envelhecidos com um hapteno geralmente utilizado, NIP-BSA. 39

Resultados e Discussão

A produção de IgG especifica é profundamente deprimida em murganhos envelhecidos imunizados com NIP

Um grupo de dez murganhos C57/BL6 envelhecidos, fêmeas (>5 meses de idade) e um grupo de dez murganhos C57/BL6 jovens, fêmeas (d 8 semanas de idade) foram imunizados i.p. com 0,1 mL por murganho de (4-hidroxi-5-iodo-3-nitrofenil)acetilo-aibumina de soro bovino (NIP-BSA) (Reth et al., 1978) em 0,1 mL de soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS), ressupenso em 0,1 mL de adjuvantes de Freund completo. Depois de 21 dias, 0,4 mL de sangue foram obtidos de cada animal por aspiração do plexo retoorbital, e os anticorpos anti-BSA foram neutralizados pela adição de BSA às amostras de soro. A titulação de IgM e IgG específica para NIP foi, então, avaliada por ELISA. A Fíg. 3 demonstra que a resposta da IgG especifica contra NIP foi afectada de forma significativa nos murganhos envelhecidos em comparação com cs murganhos jovens, enquanto a resposta da IgM específica contra o hapteno foi semelhanre nos dois grupos de murganhos. Estes resultados sugerem que os mecanismos subjacentes à produção de imunoglobulina de alta afinidade específica para NIP [hipermutação somática, troca isotipica) são deficientes em murganhos envelhecidos.

Foi registado que o NGF é um factor de sobrevivência autócrino para linfócitos 3 de memória (Torcia et ai., 1996). A fim de estudar se a resposta imunológica deficiente de murganhos envelhecidos poderia ou não ser atribuída a uma maciça morte das células B de memória, induzida pela ausência da produção do NGF ou da disponibilidade do NGF, isolamos células B de memória (como os linfócitos slgD) por meio de técnicas panning do baço de 10 murganhos envelhecidos e de 10 murganhos jovens como controlo. As células foram cultivadas durante 16 horas a 37DC, os sobrenadantes 40 foram colhidos e o NGF foi medido por meio de técnicas ELISA. A Tabela 3 demonstra que as células B isoladas de murganhos envelhecidos são incapazes de produzir NGF, ao passo que a mesma população isolada de murganhos jovens, produz altos níveis da citocina, conforme registado (Torcia et al., 1996).

Tabela 3

Produção de NGF por esplenócitos slgD de murganho velho ou jovem Produção não estimulada de NGF (pg/mL)

Murganhos velhos 535,3 ±43,1

Murgannos jovens

Como consequência da produção diminuída de NGF, a curva de sobrevivência das células B de memória de murganhos envelhecidos foi consistentemente mais curta, se comparada com a da mesma população isolada de murganhos jovens.

Lisboa, 27 de Fevereiro de 2007.

Pela Requerente O Agente Oficial

f ROSÁRIO CRUZ GARCIA Agente Oficial da Propriedade Industrial Av.3 Conselheiro Fernando de Sousa, 11-1 St 1070-072 LISBOA \ 41

Claims (20)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Associação farmacêutica para intensificar a eficácia da vacina em animais imunodefícientes, caracterizada por compreender: uma vacina capaz de estimular num animal a produção de anticorpos contra um agente causador de doença estranho ao referido animal; e uma quantidade de intensificação da eficácia do Factor de Crescimento do Tecido Nervoso (NGF) que aumenta a produção dos referidos anticorpos no referido animal, em resposta à referida vacina.
2. 2. Combinação farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por o referido animal ser um ser humano e a referida vacina ser seleccionada do grupo que consiste na vacina contra a influenza, vacina contra a Hemophilus influenza, vacina contra o vírus da Hepatite A, vacina contra o vírus da Hepatite B, vacina contra o vírus da Hepatite C, vacina contra a tuberculose, vacina contra o vírus Herpes-Zoster, vacina contra o Citomegalovírus, vacina contra a pneumonia Pneumocccica; vacina contra a meningite Meningocócica, vacina contra a Difteria, vacina contra o Tétano, vacina contra a Raiva, vacina contra a bactéria Helicobacter pylori, vacina contra o pólio e vacina contra a varíola.
3. 3. Combinação *S&rmacêurics de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por a referida vacina ser numa quantidade de 1 x 10~s g a 1 x 10~J g e o referido NGF ser numa quantidade de 0,001-100 mg/kg. 1
4. 4. Combinação farmacêutica de acordo com a reivindicação i, caracterizada por a referida vacina ser numa quantidade de 1 x 10'e g a 1 x IO'4 g e o referido NGF ser numa quantidade de 0,1-10 mg/kg.
5. 5. Combinação farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por o referido NGF ser numa quantidade de 0,3-3 mg/kg.
6. 6. Combinação farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por compreender uma composição que inclui a referida vacina e o referido NGF.
7. 7. Combinação farmacêutica de acordo com a reivindicação 6, caracterizada por a referida composição incluir um veículo farmaceuticamente aceitável.
8. 8. Utilização de: uma vacina capaz de estimular num animal imunodeficiente a produção de anticorpos contra um agente causador de doença estranho ao referido animal; e uma quantidade de intensificação da eficácia do Factor de Crescimento do Tecido Nervoso (NGF) caracterizada por aumentar a produção dos referidos anticorpos no referido animal, em resposta à referida vacina.
9. 9. Utilização de acordo com a reivindicação 8, caracterizada por a referida vacina ser seleccionada do grupo que consiste na vacina contra influenza, vacina centra Hemophilus influenza, vacina contra o vírus da Hepatite A, vacina contra o vírus da Hepatite B, vacina contra o vírus da Hepatite C, vacina contra 2 a tuberculose, vacina contra o vírus Herpes-Zoster, vacina contra o Citomegalovirus, vacina contra a pneumonia Pneumocccica; vacina contra a meningite Meningocócíca, vacina contra a Difteria, vacina contra o Tétano, vacina contra a Raiva, vacina contra a bactéria Helícobacter pylori, vacina contra o pólio e vacina contra a varíola.
10. 10. Utilização de acordo con a reivindicação 8, caracterizada por a referida vacina ser numa quantidade de 1 x 10~9 g a 1 x 10“3 g e o referido NGF ser numa quantidade de 0,001-100 mg/kg.
11. 11. Utilização de acordo com a reivindicação 8, caracterizada por a referida vacina ser numa quantidade de 1 x 10~3 g a 1 x 10'4 g e o referido NGF ser numa quantidade de 0,1-10 mg/kg.
12. 12. Utilização de acordo com a reivindicação 8, caracterizada por o referido NGF ser numa quantidade de 0,3-3 mg/kg.
13. 13. Utilização de acordo com a reivindicação 8, caracterizada por a referida vacina ser administrada como uma dose de reforço da vacina.
14. 14. Utilização de acordo com a reivindicação 13, caracterizada por o referido NGF ser administrado 3-4 dias antes da referida dose de reforço da vacina.
15. 15. Utilização de acordo com a reivindicação 13, caracterizada por o referido NGF também ser administrado concomitantemente com a administração da referida vacina.
16. 16. Utilização de acordo com a reivindicação 8, caracterizada por a referida vacinação e o referido NGF serem administrados por meio de injecção. 3
17. 17. Utilização de acordo com a reivindicação 8, caracterizada por a referida vacinação compreender: - administrar ao referido animal uma primeira dose da referida vacina; - em seguida, num período de tempo entre 1 semana e 2 meses depois da administração da referida primeira dose, administrar ao referido animal seja 1) uma quantidade de Factor de Crescimento do Tecido Nervoso (NGF) de intensificação da eficácia da vacina que aumente a produção dos referidos anticorpos, no referido animal, em resposta à referida vacina, seja 2) dose de reforço da referida vacina, juntamente com uma quantidade de Factor de Crescimento do Tecido Nervoso (NGF) de intensificação da eficácia da vacina, de modo a aumentar a eficácia da referida vacina no referido animal.
18. 18. Utilização de acordo ccm a reivindicação 17, caracterizada por o referido período de tempo ser 10-45 dias.
19. 19. Utilização de acorao com a reivindicação 17, caracterizada por o referido período de tempo ser 10-30 dias.
20. 20. Utilização de acordo com a reivindicação 17, caracterizada por o referido período de tempo ser 10-20 dias.

    Lisboa, 27 de Fevereiro de 2007. 4