PT99622A

PT99622A - Processo de preparacao de proteinas substancialmente purificadas derivadas de orgaos de embriao de mamifero e de composicoes farmaceuticas

Info

Publication number: PT99622A
Application number: PT99622A
Authority: PT
Original assignee: Eytan R Barnea
Priority date: 1990-11-28
Filing date: 1991-11-27
Publication date: 1992-10-30
Also published as: EP0512102A4; EP0512102A1; IE914128A1; ZA919361B; JPH05508419A; WO1992009294A1; IL96499A0; CA2074476A1; AU9085491A

Description

73 405 7050-004-118 -2- MEMÓRIA DESCRITIVA 1. Introdução O presente invento refere-se ao processo de preparação de agentes, substancialmente purificados, habitualmente expressos durante a gravidez de mamíferos, que podem ser usados para controlar a proliferação de células e proporciona, em particular, agentes proliferativos, bem como agentes anti-proliferativos. os agentes anti-proliferativos podem ser usados para limitar a proliferação indesejada de células, por exemplo no tratamento do cancro. Os agentes proliferativos podem ser usados para aumentar a proliferação celular e podem ser usados, por exemplo, no tratamento da infertilidade. 2. Antecedentes do Invento A gestação humana está dividida em duas etapas de desenvolvimento: o período embrionário, que se estende desde a concepção ao final da oitava semana, seguido pelo período fetal, que dura até ao parto. O período embrionário é caracterizado pela génese de virtualmente todas as estruturas essenciais. Estas estruturas, durante o período fetal, crescem e tornam-se mais elaboradas (ver, para revisão, Moore, 1977, no "The Developing Human", segunda edição, W. B. Saunders Company, Philadelphia). É, portanto, durante o período embrionário que o produto de concepção em desenvolvimento tem o seu maior fluxo, passando por várias mudanças para recriar o modelo humano e estabelecer a ligação maternal necessária para a sua sobrevivência. 0 ovo fertilizado, ou zigoto, é submetido, muito cedo no período embrionário, a um certo número de divisões celulares para formar uma bola de cerca de 15 células pequenas, denominada mórula. A mórula entra no útero e desenvolve uma cavidade interior, tornando-se, assim, um blastocisto consistindo de (1) uma massa de células interior que dá origem ao embrião; (2) uma cavidade blastocística; e (3) uma camada de células exterior, denominada o trofoblasto. Cerca de cinco ou seis dias após a concepção, o blastocisto fixa-se ao epitélio endométrico do útero e as células trofoblásticas invadem a parede uterina. 73 405

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Com o passar do tempo, o trofoblasto activamente erosivo invade o estroma endométrico, e o blastocisto é gradualmente engolido pelo endométrico (Id., p. 33). 0 trofoblasto diferencia-se em dois tipos: citotrifoblasto e sinciciotrofoblasto. 0 sinci-ciotrofoblasto está adjacente ao embrião em desenvolvimento e torna-se numa massa protoplasmática multinucleada na qual não se definem quaisquer limites celulares (Id., p. 34). Aparecem, no sinciciotrofoblasto, espaços isolados, denominado lacunas, por volta do dia 9 e enchem-se com um fluido constituído por sangue e secreções maternais. Este fluido, ou embriolinfa, proporciona nutrientes para o embrião em desenvolvimento e marca o início da circulação uteroplacentária. Eventualmente, o endométrico forma a parte maternal da placenta, e o trofoblasto forma a parte fetal da placenta (Id., p. 36).

Uma vez estabelecida a circulação placentária primitiva, o embrião começa-se a desenvolver a uma velocidade surpreendente. O cérebro e a espinal medula começam-se a formar aos 20 dias. O coração embrionário começa a bater cerca dos 22 dias, Aos 27 dias já apareceram os botões dos braços e das pernas. Aos 30 dias estão-se a formar os olhos e o nariz. Aos 40 dias os braços dobram nos cotovelos, adivinham-se dedos e orelhas precoces, e o embrião tem somente um centímetro de comprimento.

Este período de desenvolvimento rápido é conseguido através de um programa de divisão e diferenciação celular, cuidadosamente regulado o qual, até à data, não está completamente esclarecido. Um interesse nos sinais envolvidos no início ou no fim do desenvolvimento embrionário, tem sugerido a análise de hormonas e de citoquinas associadas com o tecido placentário, embrionário ou fetal. Segue-se uma breve lista de alguns resultados de tais estudos.

Dois produtos proteicos, bem documentados, da placenta são (1) a gonadotrofina coriónica humana (hCG) e (2) somatomamotro-fina coriónica humana (hCS), também conhecida por lactogénio placentário humano (hPL) (Id., p. 105). A hCG é produzida pelo trofoblasto, e actua para impedir a degeneração do corpos luteum, 73 405 7050-004-118 -4-uma estrutura ovárica que produz progesterona. Durante o início da gravidez, os níveis circulantes de hCG aumentam linearmente até à oitava semana de gestação, atingindo uma plataforma à nona e décima semana de gestação, e diminuindo daí em diante até o termo da gestação. Este padrão secretório é considerado como sendo um indicador importante do normal desenvolvimento do tro-foblasto. De facto, se os níveis circulantes de hCG continuarem a aumentar para além da décima semana de gestação, deve-se sus

peitar de uma neoplasia trofoblástica, tal como uma mola hidati-forme (Delf, 1957, Obstet. Gynecol. 9.:1). Por outro lado, uma plataforma e diminuição prematuras do nível de hCG indicam, geralmente um precoce insucesso da gravidez (Aspillaga e col., 1982, Am. J. Obstet. Gynecol. 147:903). A Patente Japonesa Na. 59078694, de 7 de Maio de 1984, de Yoshida, descreve a identificação de uma substância, activada pelo cobalto, no tecido fetal ou placentário, que inibe a acção de uma enzima formadora de proteína carcinogénica. A Patente Japonesa Na. 2215730, de 28 de Agosto de 1990, descreve o isolamento do factor de crescimento beta transformador de citoquina (TGF-beta) da placenta humana.

Massague (1983, J. Biol. Chem. 258:13614-13620) descreve a ligação de factor do tipo do de crescimento epidérmico, transformando o factor de crescimento em receptores de factor de crescimento epidérmico em membranas de placenta humana.

Roberts e col. (1985, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 82:119--123) descrevem que o TGF beta pode ser isolado da placenta humana, de entre outros tecidos. Verificou-se que a resposta das células ao TGF-beta pareceu ser bifuncional visto que o TGF-beta foi capaz de estimular a transformação reversível de fibroblastos murinos, mas foi também capaz de inibir o crescimento dependente da fixação de fibroblastos de rim de ratazana normais e de células tumorais humanas, aumentando o tempo do ciclo das células. 73 405 7050-004-118

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Letnansky (1987, Immunology, 175:68) descreve o isolamento e caracterização de uma proteína de placenta de bovino, que inibe especificamente a proliferação de células tumorais. Esta proteína, denominada factor inibidor da decidua (DIF), tinha um peso molecular estimativo de cerca de 60 kD por SDS-PAGE.

Barnea e col. (1989, Placenta 10:331-344) descrevem que ex- tractos embrionários humanos modulam a função placentária no primeiro trimestre. Observaram que extractos de tecidos específicos eram capazes de diminuir ou, alternativamente, aumentar a secreção de hCG. Verificou-se, em particular, que extractos de água do pulmão embrionário produziam o dobro da diminuição na produção de hCG por explantes placentários; pareceu, que uma proteína possuindo um peso molecular inferior a 8000 daltons, era o agente activo, mas não foi purificada.

Plowman e col. (1990, Mol. Cell. Biol. 10.:1969-1981) descrevem o isolamento de um gene codificando amfiregulina (AR), uma citoquina que está evolucionalmente relacionada com o factor de crescimento epidérmico e com o factor alfa transformador de crescimento (TGF-alfa). Verificou-se que a AR era uma proteína de 84 aminoácidos capaz de actuar como um modulador do crescimento bifuncional, sendo capaz de promover o crescimento de células epiteliais normais e também de inibir o crescimento de linhas celulares de certos carcinomas. Verificou-se que a placenta e ovários humanos exprimiam quantidades significativas de ARN codificando-AR. Previu-se que o percursor AR não-glicosilado menos o péptido de sinal teria um peso molecular de cerca de 25942 D.

Ainda em relação à compreensão do controlo do desenvolvimento, e adicionalmente às hormonas e citoquinas acima mencionadas, diversas correntes sugerem que existe uma interdependência entre o trofoblasto e o embrião nos mamíferos. A morte fetal tanto em carneiros, como em ratazanas, resulta numa descida da secreção de lactogénio placentário (Ramsay e col., 1985, Biol. Neonate 47:42: Albrecht e col., 1984, Endocrinol. 107:766; Taylor e col., 1984, Res. Vet. Sei. 3j>.:22; Robertson e col., 1984

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Endocrinol. 114:22) . Barnea e col. (supra) investigaram o possível papel de órgãos viscerais embrionários como reguladores da função trofoblástica, examinando os efeitos de extractos de órgãos diluídos após secreção in vitro de hCG, e observou um efeito supressor de hCG em certas fracções. Parece, portanto, que o embrião em desenvolvimento não está totalmente sujeito a controlo pelo seu ambiente; em vez disso, parece que o próprio embrião tem um papel activo na fisiologia da gravidez. 3. Sumário do Invento 0 presente invento proporciona um processo de preparação de agentes gestacionais que podem ser usados para controlar a proliferação celular. Baseia-se, pelo menos em parte, na verificação de que diversos agentes produzidos pelo embrião em desenvolvimento, parecem ter um papel importante na obtenção de um sistema de controlos e de balanços que regula a proliferação e a diferenciação das células durante a gravidez.

Em concretizações particulares, o presente invento proporciona uma proteína substancialmente purificada, possuindo um peso molecular inferior a cerca de 10 000 daltons e de preferência de cerca de 6 500 - 7 000 daltons, que é expressa em embriões de mamíferos e que tem um efeito anti-proliferativo sobre certas células cancerosas e sobre certas células embrionárias. Esta proteína, denominada proteína JDK, mostrou exercer um efeito anti-proliferativo sobre todas as linhas celulares cancerosas testadas, e verificou-se que impedia a formação de tumor e melhorava a sobrevivência de ratinhos nús inoculados com células de fibrossarcoma. A proteína gestacional anti-proliferativa do invento, pode ser utilizada na prevenção e tratamento do cancro. Pode também ser usada como um contraceptivo para impedir a gravidez .

Em concretizações alternativas, o presente invento proporciona uma proteína substancialmente purificada possuindo uma peso molecular inferior a cerca de 3 000 daltons, que é expressa em tecido embrionário de mamíferos e que possui um efeito proliferativo sobre as células morulares. Observou-se ainda que

73 405 7050-004-118 -7-este agente gestacional proliferativo do invento, denominado GPA-1, alimentava a secreção de gonadotrofina coriónica humana por explantes placentários, para promover o desenvolvimento de uma mórula em blastocisto, e para facilitar a implantação. Noutras concretizações, o presente invento proporciona um segundo agente gestacional proliferativo, denominado GPA-2, que possui um peso molecular superior a 20 000 daltons. Estes agentes proliferativos podem ser usados no tratamento da infertilidade e/ou de distúrbios hipoproliferativos. 4. Descrição das Figuras FIGURA 1.Resultados da análise HPLC da fracção de PM <8 000 da espinal medula mostrando três bandas dominantes. FIGURA 2. Resultados da análise PAGE da fracção de PM <10 000 da espinal medula. FIGURA 3. Dispositivo de superfusão. 1.CÂMARAS DE CULTURA: continham o tecido a ser cultivado. 2.SISTEMA DE TUBAGEM: o silicone permitiu que o gás entrasse no sistema de tubagem. 3. PERMUTADOR DE CALOR/GÁS: mantém o ambiente térmico dentro e em torno das câmaras de cultura. 4. TRANSFERÊNCIA DE GÁS: é conseguido inundando o sistema com o gás desejado. 5. GÁS ADMITIDO: (5% de C02, 95% de ar). 6. ENTRADA DE ÁGUA MORNA: ( 37 ° C). 7. SAÍDA DE ÁGUA: após aquecer o permutador. 8. LIGADO: inicia o funcionamento da bomba. 9. MÍNIMO: 0,01 ml/min.

73 405 7050-004-118 -8- 10. MÁXIMO: 3 ml/min. 11. DIRECÇÃO: a direcção da seta iluminada indica a direcção do fluido através da tubagem da bomba. 12. CAUDAL: de 00>99, representa uma percentagem da velocidade de bombeamento normal. 13. NESTE PONTO, adiciona-se outra bomba peristaltica para adicionar GnRH ou outros factores. 14. DIVISÃO do tubo principal. 15. RESERVATÓRIO MÉDIO. 16. BOMBA PERISTALTICA. FIGURA 4.A. Efeito supressor da fracção, de PM <8 000 do extracto sobre a secreção de hCG por explantes placentários. Recolheram-se fracções de amostras eferentes a cada 2,4 minutos e numeraram-se sequencialmente. B. Efeito supressor da fracção de PM <8 000, do extracto sobre a secreção de hCG por explantes placentários. C. Uma amostra idêntica à de (B) perdeu a capacidade supressora sobre a secreção de hCG após inactivação pelo calor. FIGURA 5. Capacidade de diversas diluições de extracto total em suprimir a secreção de hCG por explantes placentários. Usaram-se as seguintes diluições de extracto em 0,05M de Tris-HCl PMSF-DTT (pH 7,4): 1/20, 1/200 e 1/2000. Usou-se um tampão isolado como um controlo. FIGURA 6. Actividade supressora de fracção de PM <8 000 de ex tracto sobre a proliferação de linhas de células can-

73 405 7050-004-118 -9- -9- ‘áÇi. cerosas. O número de células nas culturas tratadas com tampão servem como um controlo. FIGURA 7. Percentagem de supressão da proliferação de MCF-7 como uma função do aumento da dosagem da fracção proteica de PM <8 000. FIGURA 8. Efeito supressor do extracto de embrião sobre o desenvolvimento embrionário do ratinho in vitro. A. Percentagem de embriões de controlo não tratados atingindo a etapa morular. B. Percentagem de embriões de controlo não tratado exibindo desenvolvimento/adesão. FIGURA 9. Efeito de diversos pesos moleculares de fracções de extracto sobre a sobrevivência de ratinhos nús após a inoculação com fibrossarcoma. A fracção 1 corresponde a PM <3 000; a fracção 2 corresponde a PM <30 000; a fracção 3 corresponde a PM <8 000; a fracção 4 corresponde a PM <10 000; a fracção 5 corresponde a PM <100 000; e a fracção 6 corresponde a um controlo tratado com tampão. FIGURA 10. Uma fracção, de PM <3 000, de extracto de embrião, aumentou a secreção de hCG em expantes placentários. FIGURA 11. Resultados da análise HPLC da fracção de peso molecular <3 000 D, associada com a actividade prolifera-tiva. 5. Descrição detalhada do Invento 0 presente invento proporciona um processo de preparação de agentes gestacionais que podem ser usados para controlar a proliferação celular. Baseia-se, pelo menos em parte, na teoria de que a gravidez opera, falando de forma figurativa, como um cancro reversível. Os produtos da concepção, de forma semelhante 73 405 7050-004-118 -10-

exprimem antigénios de superfície semelhantes, e segregam certos compostos relacionados com cancros, tais como a alfafetoproteína e o antigénio carcinoembrionário. Além disso, o produto da concepção, tal como um tumor, não é rejeitado pelo corpo, pelo contrário aproveita recursos maternais para manter o seu bem estar. Contudo, ao contrário do cancro, a capacidade invasiva e a tolerância associada com a gravidez são reversíveis em quase qualquer altura.

Constitui um objecto do presente invento isolar agentes que operam para controlar o desenvolvimento do embrião de tal forma que a proliferação, capacidade invasiva e diferenciação possam ocorrer sem prejudicar substancialmente o hospedeiro materno. Verificou-se que diversos agentes produzidos pelo embrião têm, aparentemente, um papel importante no seu desenvolvimento. As diversas concretizações do invento referem-se a esses agentes e ao seu uso, por exemplo no tratamento do cancro e da infertilidade, ou como um contraceptivo.

Por razões de clareza da descrição, e não com o intuito de a limitar, a descrição detalhada do invento está dividida nas seguintes subsecções: (i) preparação do agente gestacional antiproliferativo; (ii) preparação de agentes gestacionais proliferativos; (iii) anticorpos do invento; (iv) o uso de agentes gestacionais na terapia do cancro; (v) o uso de agentes gestacionais no controlo da fertilidade; e (vi) utilidades adicionais do invento. 5.1. Preparação de Acrente Gestacional Anti-Proliferativo 0 presente invento proporciona um agente gestacional anti--proliferativo que está compreendido num extracto de tecido embrionário de mamífero, e que tem um peso molecular inferior a cerca de 10 000 daltons. O agente tem, em particular, um peso molecular entre cerca de 6 500 e 7 000 daltons, e é denominado JDK.

73 405 7050-004-118 -11- O agente gestacional antiproliferativo JDK pode rado a partir de qualquer embrião de mamífero adequado. Como o tamanho do embrião afectará a facilidade com que os órgãos individuais podem ser identificados e isolados, é desejável que se obtenha o embrião a partir de um mamífero relativamente grande tal como, por exemplo, mas não limitado a, um humano, um primata não-humano, um cavalo, uma vaca, uma ovelha ou um porco, etc.. Se for obtido a partir de um humano, o embrião pode ser obtido, após consentimento adequado, a partir dos produtos de um aborto electivo ou espontâneo. É ainda desejável que o embrião esteja numa fase do desenvolvimento em que esteja a ocorrer um desenvolvimento rápido ou tenha começado a terminar. Em humanos, por exemplo, será desejável utilizar um embrião que esteja entre as seis e as nove semanas de gestação. Para animais não-humanos, será preferível usar embriões numa etapa comparável de seis a nove semanas de gestação humana.

Pode-se utilizar qualquer órgão do embrião. Nas concretizações preferidas do invento usam-se, de preferência, o cérebro e a espinal medula (i.e. elementos neurais) ou glândulas supra-renais. Podem também ser usados os órgãos viscerais, tais como pulmão, fígado ou rim.

Pode-se preparar o agente gestacional anti-proliferativo, JDK, do invento da forma seguinte, de acordo com uma concretização específica, não limitante, do presente invento. 0 tecido embrionário pode ser picado e colocado em Tris-HCl frio a pH 7,4, contendo 10 mM de ditiotreitol (DTT) e 2 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF), depois sonicado sobre gelo durante cerca de 60 segundos e depois centrifugado a cerca de 2 400 rpm durante cerca de dez minutos para remover os detritos celulares. Pode-se processar uma quantidade inicial de tecido embrionário pesando cerca de 50 mg em, por exemplo, cerca de 1 ml de tampão e pode dar cerca de 1 ml de sobrenadante. 0 so-brenadante do material centrifugado pode então ser separado em 73 405 *

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fracções baseadas no peso molecular usando, por exemplo, o Filtrou System Omega Cell (Biolab), 30 mm de diâmetro, sob azoto, e podem-se desejavelmente obter as fracções contendo pesos moleculares inferiores a cerca de 10 000 daltons. Esta fracção pode, de preferência, ser ainda purificada por electroforese em gel de poliacrilamida (PAGE). A porção do gel resultante correspondendo a pesos moleculares entre cerca de 3 000 e 8 000 daltons, e de preferência entre cerca de 6 500 e 7 000 daltons, pode ainda ser separada a partir do resto do gel e eluída para produzir o agente gestacional anti-proliferativo JDK. A fracção pode, alternativamente, ser ainda purificada por HPLC como descrito na Secção 6.1.3, infra. caso em que se espera que se produzam três bandas principais, como descrito na figura 1.

O presente invento proporciona, consequentemente, uma proteína substancialmente purificada, possuindo um peso molecular inferior a cerca de 10 000 daltons, e de preferência entre cerca de 6 500 e 7 000 daltons, que é habitualmente expressa no tecido embrionário de mamíferos e que possui um efeito anti-proliferativo em certas células cancerosas e em certas células embrionárias. O facto de ser "normalmente expressa" num embrião de mamífero é distinto da forma substancialmente purificada da proteína indicada, visto que a proteína não ocorre, habitualmente (i.e. naturalmente) na forma substancialmente purificada. O presente invento proporciona ainda uma proteína substancialmente purificada, como descrito supra, que corresponde à proteína compreendida no pico I, pico II ou pico III do cromato-grama descrito na figura 1.

Pode-se também preparar o agente gestacional proliferativo, ou JDK, do invento, por qualquer outro processo conhecido na arte, incluindo, mas não limitado a síntese química ou a tecnologia do ADN recombinante. Além disso, o presente invento proporciona a preparação e uso de fragmentos ou de derivados de JDK, incluindo fragmentos produzidos quimicamente, por ADN recombinante, ou por actividade da protease, e derivados obtidos 7"* 7"*

«ϊ“Αϋ 73 405 7050-004-118

-13- por, por exemplo, glicosilação, fosforilação, desfosforilaçao conjugação química de qualquer composto a JDK ou a um seu fragmento. 0 presente invento proporciona também uma proteína relacionada com JDK mas normalmente expressa num embrião não humano que é pelo menos cerca de 70 por cento homóloga a JDK.

Pelo menos uma porção da JDK pode ser sequenciada e a sequência de aminoácidos assim obtida pode ser usada para deduzir sondas oligonucleotídicas que podem ser usadas directamente para seleccionar bibliotecas de ADN recombinante ou, em reacção em cadeia de polimerase, de forma a obter sequências de ácido nucleico codificando JDK. Estas sequências podem então ser inseridas num sistema de vector de expressão apropriado e pode então ser expresso em quantidade usando técnicas padrão. A JDK pode ser produzida, alternativamente por síntese química ou por qualquer outro processo conhecido na arte. 5.2. Preparação de Aaentes Gestacionais Proliferativos O presente invento proporciona um agente gestacional proli-ferativo, denominado GPA-1, que está contido num extracto de tecido embrionário e que possui um peso molecular inferior a cerca de 3 000 daltons e, de preferência, cerca de 1 500 - 2 000 D. A fonte de tecido embrionário adequada é a descrita na secção 5.1., acima, com a excepção de que se podem também usar os embriões num estado de desenvolvimento comparável com uma gestação humana de seis semanas.

Pode-se preparar a GPA-1 da seguinte forma, de acordo com uma concretização específica, não limitante, do presente invento. Pode-se picar o tecido embrionário e coloca-se em Tris-HCl frio, a pH 7,4, contendo ditiotreitol 10 mM (DTT) e fluoreto de fenil-metil-sulfonilo 2mM (PMSF), e depois sonicado sobre gelo durante cerca de 60 segundos e centrifugado, depois, a cerca de 2 400 rpm, durante cerca de dez minutos para remover os destroços celulares. Pode-se processar, por exemplo, uma quantidade inicial de tecido embrionário pesando cerca de 50 mg, em cerca de 1 ml de tampão para dar cerca de 1 ml de sobrenadante. 0 sobrenadante do material centrifugado pode então ser separado em fracções

73 405 7050-004-118 -14-baseadas na peso molecular, usando, por exemplo, o Filtron System Omega Cell (Biolab), de 30 mm de diâmetro, sob azoto, podendo-se obter, de forma desejável, a fracção contendo pesos moleculares inferiores a 3 000 D. Esta fracção pode, de preferência, ser ainda purificada por electroforese em gel de poliacrilamida. Essa porção do gel correspondendo a um peso molecular inferior a cerca de 3 000 D pode então ser separada do resto do gel e eluida para formar o agente gestacional proliferativo GPA-1. Ver Secção 8, infra.

Consequentemente, o presente invento proporciona uma proteína substancialmente purificada, GPA-1, possuindo uma peso molecular inferior a cerca de 3 000 daltons, que está expressa em tecido embrionário de mamífero e que possui um efeito proliferativo em células morulares. Em concretizações preferidas, esta proteína tem um peso molecular superior a 1 400 D, e, na maior parte das concretizações, o peso molecular é de cerca de 2 000 D. A GPA-1 é também capaz de aumentar a secreção de hCG pelos explantes placentários, de promover o desenvolvimento de uma mó-rula num blastocisto, e de facilitar a implantação. O presente invento proporciona, ainda, um segundo agente gestacional proliferativo denominado GPA-2, que tem um peso molecular superior a 20 000. 5.3. Anticorpos do Invento

De acordo com o invento, os agentes gestacionais prolifera-tivos (i.e. GPA-1 e GPA-2) e o agente gestacional anti-prolife-rativo (i.e. JDK) ou seus fragmentos ou derivados activos, podem ser usados como imunogénios para gerar anticorpos.

Para melhorar a probabilidade de produzir uma resposta imunitária, a sequência de aminoácidos do agente gestacional pode ser analisada de forma a identificar porções da molécula que possam estar associadas com um aumento da imunogenicidade. A sequência de aminoácidos pode, por exemplo, ser submetida a análise por computador para identificar os epítopos de superfície. Alternativamente, as sequências de aminoácidos

73 405 7050-004-118 -15-deduzidas do agente gestacional de diferentes espécies poderiam ser comparadas, e identificadas regiões relativamente não-homólogas; estas regiões não-homólogas seriam, muito provavelmente, imunogénicas em diversas espécies.

Para preparar anticorpos monoclonais dirigidos aos anti-génios do invento, pode-se usar qualquer técnica que proporcione a produção de moléculas de anticorpo por linhas de células contínuas em cultura. Por exemplo, a técnica de hibridoma originalmente desenvolvida por Kohler e Milstein (1975, Nature 256.:495-497), bem como a técnica de trioma, a técnica de hibridoma de célula-B humana (Kozbor e col., 1983, Immunology Today 4.:72), e a técnica de hibridoma de EBV para produzir anticorpos monoclonais humanos (Cole e col.,1985, em "Monoclonal Antibodies and Câncer Therapy", Alan R. Liss, Inc. pp. 77-96) e semelhantes, são abrangidos pelo âmbito do presente invento.

Os anticorpos monoclonais podem ser anticorpos monoclonais humanos ou anticorpos monoclonais humano-ratinho quiméricos (ou de outras espécies). Os anticorpos monoclonais humanos podem ser efectuados por qualquer uma das numerosas técnicas conhecidas na arte (p.e. Teng e col., 1983, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 80:7308-7312? Kozbor e col., 1983, Immunology Today 4:72-79; Olsson e col., 1982, Meth. Enzymol. 92:3-16). As moléculas de anticorpo quiméricas podem ser preparadas contendo um domínio de ligação de antigénio de ratinho com regiões humanas constantes (Morrison e col., 1984, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 81:6851, Takeda e col., 1985, Nature 314:452).

Podem-se usar diversos processos conhecidos na arte para a produção de anticorpos policlonais para epítopos dos antigénios do invento. Para a produção de anticorpos podem-se imunizar diversos animais hospedeiros através de injecção com antigénio, ou sem fragmento ou derivado, incluindo, mas não limitado a, coelhos, ratinhos, ratazanas, etc.. Podem-se usar diversos adjuvantes para aumentar a resposta imunitária, dependendo das espécies de hospedeiro, e incluindo, mas não limitado ao de Freund (completo e incompleto), a geles minerais tal como 73 405 7050-004-118 -16-

hidróxido de alumínio, a substâncias tensio-activas, tal como lisolecitina, a polióis plurónicos, a polianiões, a péptidos, a emulsões oleosas, a hemocianinas de lapa do tipo fissurela, a dinitrofenol, e a adjuvantes humanos potencialmente úteis tais como o BCG (Bacilo Calmette-Guerin) e o Corvnebacterium parvum.

As moléculas de anticorpo podem ser purificadas por meio de técnicas conhecidas p.e., cromatografia de imunoabsorção ou de imunoafinidade, métodos cromatográficos tal como HPLC (cromato-grafia liquida de elevado rendimento), ou uma sua combinação, etc..

Podem-se regenerar, através de técnicas conhecidas, os fragmentos de anticorpos que contêm o idiotipo da molécula. Tais fragmentos incluem, por exemplo, mas não estão limitados a: fragmento F(ab7)2 que pode ser produzido por digestão da molécula de anticorpo com pepsina; fragmentos Fab7 que podem ser produzidos reduzindo as pontes de dissulfureto do fragmento F(ab7)2, e fragmentos Fab ou 2 Fab que podem ser produzidos tratando a molécula de anticorpo com papaína e com um agente redutor. 5.4. Uso de Acentes Gestacionais na Terapêutica do Cancro 0 presente invento proporciona um processo para inibir a proliferação de células cancerosas, o qual compreende expor as ditas células a uma concentração eficaz de agente gestacional antiproliferativo (i.e. JDK). Nas concretizações preferidas do invento, o agente gestacional antiproliferativo é uma proteína substancialmente purificada, como descrito na Secção 5.1., supra ou seu análogo. O presente invento proporciona um processo para o tratamento de um paciente sofrendo de cancro, o qual compreende administrar ao paciente uma quantidade eficaz de agente gestacional antiproliferativo JDK num veículo farmaceuticamente aceitável. Nas concretizações preferidas do invento, o agente gestacional antiproliferativo é uma proteína substancialmente purificada como descrito na Secção 5.1., supra.

73 405 7050-004-118 -17- 0 presente invento pode ser usado para inibir a proliferação de uma larga gama de células cancerosas e para tratar uma larga gama de cancros. Como exemplificado na Secção 7, infra. observou-se que o JDK inibia a proliferação de todas as linhas celulares cancerosas testadas, sugerindo que possui um largo espectro de actividade tanto in vitro como in vivo. Consequentemente, o presente invento pode ser usado para inibir a proliferação de células cancerosas provenientes de qualquer tecido, incluindo, mas não limitado a, mama, medula óssea, sistema linfor-reticular, ovário, rim, pulmão, cérebro, intestino, estômago, esófago, pâncreas, espinal medula, mucosa, célula germinativa, osso, músculo, pele (p.e. melanoma), etc.. O presente invento pode ser usado para tratar cancro proveniente de qualquer tecido num paciente, incluindo, mas não limitado a, cancro da mama, ovário, rim, pulmão, cérebro, intestino, medula óssea, sistema linforreticular, estômago, esófago, pâncreas, espinal medula, mucosa, célula germinativa, osso, músculo, pele (p.e. melanoma), coriocarcinoma, etc..

Pode-se definir uma concentração eficaz de JDK como qualquer concentração que seja capaz de inibir a proliferação de células MCF-7, sob as condições indicadas na Secção 7, infra, mas em relação a pelo menos 10 por cento de controlo não tratado. Pode-se definir uma quantidade eficaz de JDK a ser usada no tratamento de um paciente como a quantidade que produz uma concentração eficaz de JDK no tecido a ser tratado.

Nos processos de tratamento de acordo com o invento, o JDK pode ser administrado por qualquer via conhecida na arte incluindo, mas não limitada a, intravenosa, subcutânea, intramuscular, por injecçáo num tumor ou por outra injecção local, intranasal, intraocular, intraperitoneal, oral, etc.. Além disso o JDK pode ser ligado a outra molécula, tal como um anticorpo ou a uma esfera magnética de forma a atingir o alvo. 0 JDK pode ser administrado através de um implante sólido ou semi-sólido, tal como um implante de libertação sustida. 0 JDK pode ser incorporado em microcápsulas, microesferas ou lipossomas. Além 73 405 7050-004-118 -18-disso, o JDK pode ser acoplado a outra molécula/ tal como um anticorpo, ou a uma esfera magnética de forma a atingir o alvo. Se for administrado oralmente, pode ser desejável proporcionar um meio para proteger o JDK de desnaturação no estômago.

De acordo com o invento, um veículo farmaceuticamente aceitável é qualquer veículo que seja relativamente não tóxico para os humanos e que conserve a actividade do JDK. Os veículos adequados incluem, mas não estão limitados a, água, solução salina, solução salina tamponada com fosfato, dextrose, etc..

5.5. Uso de Agentes Gestacionais no Controlo da Fertilidade De acordo com o invento, o agente gestacional antiprolife-rativo (i.e. JDK) pode ser usado como um contraceptivo, e os agentes gestacionais proliferativos (i.e. GPA-1 e/ou GPA-2) podem ser usados para promover a fertilidade e para proteger a gravidez precoce.

O presente invento proporciona um método de contracepção o qual compreende administrar a um sujeito fêmea uma quantidade eficaz de agente gestacional.antiproliferativo JDK num veículo farmaceuticamente aceitável. Em concretizações preferidas do invento, o agente gestacional antiproliferativo JDK é uma proteína substancialmente purificada. 0 presente invento proporciona ainda um processo de melhorar a fertilidade de um sujeito, o qual compreende administrar ao sujeito uma quantidade eficaz de agente gestacional prolife-rativo, tal como GPA-1 e/ou GPA-2, num veículo farmaceuticamente aceitável. Nas concretizações preferidas do invento, o(s) agen-te(s) gestacional(ais) proliferativo(s) é(são) proteína(s) substancialmente purificada(s).

Um sujeito é qualquer sujeito mamífero humano ou não humano. 0 aspecto promotor da fertilidade do invento pode ser particularmente útil em melhorar a fertilidade do gado.

Constrói-se uma quantidade eficaz de agente gestacional an- 73 405 7050-004-118 -19-tiproliferativo, em concretizações relacionadas com a contracep-ção para se referir uma quantidade que resultará numa concentração, em pelo menos uma porção dos órgãos reprodutores do sujeito, que é a mesma que uma concentração que inibirá o desenvolvimento morular de embriões de ratinho, sob as condições descritas na Secção 7.1.3., em pelo menos 50 por cento em relação a controlos não tratados.

Constrói-se uma quantidade eficaz de agente gestacional proliferativo, em concretizações relacionadas com a fertilidade, para se referir uma quantidade que resultará numa concentração, em pelo menos uma porção dos órgãos reprodutores do sujeito, que é a mesma que uma concentração que aumentará o número de mórulas que progridam para formar blastocistos em pelo menos 50 por cento, para controlos não tratados sob as condições descritas na Secção 8, infra.

Os agentes controladores da fertilidade podem ser administrados por qualquer método conhecido na arte, como descrito na Secção 5.4., supra.

Os transportadores farmacêuticos que se podem usar de acordo com o invento são relativamente não tóxicos para o hospedeiro e conservam a actividade do agente, e incluem aqueles descritos na Secção 5.4., supra.

Noutras concretizações do invento, o anticorpo dirigido para o agente gestacional proliferativo (i.e. GPA-1 e/ou GPA-2) pode ser usado em métodos de contracepção. 0 presente invento proporciona um método de contracepção o qual compreende administrar a um sujeito fêmea uma quantidade eficaz de anticorpo que se ligue a um agente gestacional proliferativo. Em concretizações alternativas, o presente invento proporciona um método de contracepção o qual compreende imunizar um sujeito fêmea com uma preparação imunogénica que compreende um agente gestacional prolif erativo. Uma tal composição imunogénica pode compreende um adjuvante, tal como um adjuvante completo de Freund, e pode, desejavelmente, compreender um agente gestacional proliferativo 73 405 7050-004-118 -20-

acoplado a um composto imunogénico, ou a um agente gestacional proliferativo obtido a partir de uma espécie que é diferente do sujeito a ser imunizado. De notar que tal imunização pode resultar numa contracepção irreversível. 5.6. Utilidades Adicionais do Invento

Nas concretizações adicionais do invento, o agente gestacional antipoliferativo pode ser usado no tratamento de doenças relacionadas com um aumento da proliferação celular incluindo, mas não limitado a, situações pré-malignas, queloides, doença de Von Recklinghausen, polipose familiar, neoplasias benignas (p.e. adenomas mamários), doenças auto-imunes tais como artrite reuma-tóide, etc..

Ainda noutras concretizações do invento, o agente gestacional proliferativo (i.e. GPA-1 e/ou GPA-2) pode ser usado no tratamento de doenças relacionadas com uma diminuição da proliferação celular tais como doenças mieloproliferativas em fase de esgotamento, anemia perniciosa, sindrome de Sjogren, etc.. 0(s) agente(s) gestacional(ais) proliferativo(s) pode também ser usado para tratar situações nas quais se deseja um aumento da proliferação celular, por exemplo, para substituir células lesadas por enfarto, infecção, lesão ou exposição a um agente tóxico (p.e. miocardio pós-enfarto do miocárdio, tecido do sistema nervoso que tenha sido lesado ou perdido por enfarto, infecção, lesão ou exposição a agente tóxico, medula,óssea que tenha sido lesada por doença ou por exposição a um agente tóxico, pele que tenha sido lesada ou perdida, p.e. em pacientes queimados), Numa concretização específica, não limitativa, do invento, o(s) agen-te(s) gestacional(ais) proliferativo(s) pode(m) ser usado(s) para promover a regeneração hepática. Noutra concretização específica,, não limitativa, do invento, o(s) agente(s) gestacional(ais) proliferativo(s) pode(m) ser usado(s) para facilitar a incorporação de um enxerto num sujeito. Noutras concretizações específicas, não limitativas, do invento, o(s) agente(s) gestacional(ais) proliferativo(s) pode(m) ser usado(s) para promover a cicatrização de feridas e/ou crescimento do cabelo. 73 405 7050-004-118 -21-

Os agentes gestacionais do invento podem ser usados in vivo ou in vitro. Por exemplo, o não como forma de limitação, o GPA-1 e/ou o GPA-2 podem ser usados para promover o crescimento de células ou tecidos em cultura.

6. Exemplo; Preparação do Agente Gestacional Antiproliferativo JDK 6.1. Materiais e Métodos 6.1.1. Extracção

Isolaram-se, assepticamente, embriões humanos, até 9 semanas de idade, que eram os produtos de gravidezes interrompidas, e obtidos com autorização, dos outros produtos de concepção, e confirmaram-se as idades gestacionais pelo último período menstrual e pela medição do perímetro cefálico-cintura pélvica do specimen, com um erro experimental de ±3 dias. Dissecaram-se os órgãos embrionários do embrião e identificaram-se usando um microscópio de dissecação e colocaram-se em gelo. Todas as etapas subsequentes foram efectuadas a 4°C.

Extraíram-se os órgãos viscerais compreendendo os pulmões, fígado, rins e cápsulas supra renais, e/ou órgãos neurais tais como a espinal medula e o cérebro, por sonicação em gelo seguido de centrifugação (2400 rpm x 10 min.) em tampão Tris-HCl 0,5M a pH 7,4, ditiotreitol (DTT) 10 mM e fluoreto de fenil-metil-sulfonilo (PMSF) 2 mM. A extracção com etanol resultou num produto com uma actividade aproximadamente 3 vezes menor. 6.1.2. Preparação de Fraccões de Diferentes Pesos Moleculares

Usando o Filtron System Omega Cell (Biolab Labs, 30 mm de diâmetro), sob azoto, o extracto obtido, de acordo com (A) acima, de espinal medula embrionária, foi filtrado através de filtros de diferentes pesos moleculares (P.M.) usando o tampão PBS com DTT e PMSF. Filtrou-se cada 1 ml de extracto com 30 ml de tampão. 0 extracto recolhido foi liofilizado e o sedimento foi suspenso em água destilada e armazenado a -20eC.

73 405 7050-004-118 -22-

Prepararam-se as seguintes fracções (usando-se o símbolo "<", como convencionalmente, para indicar as fracções tendo "menos do que" o P.M. indicado): <100 000, <30 000, <10 000, <8 000 e <3 000. Testaram-se todas as fracções em relação à capacidade para modular a produção de HCG de explantes placentários, usando o modelo de superfusão descrito por Barnea e Kaplan (1989, J. Clin. Endocrinol. Metab. 69.:215-217) ver Secção 7, infra). Só as fracções inferiores a cerca de 10 000 mostraram ser biologicamente activas. 6.1.3. Análise por Cromatoqrafia Líauida de Elevada Pressão

Efectuou-se a análise por cromatografia líquida de elevada pressão (HPLC) na fracção de P.M. <8 000 de extracto de espinal medula usando um aparelho de HPLC Hitachi e uma coluna RP-18 de 25 cm a 25“C. A amostra foi colocada sobre água e eluída usando 40 por cento de H20 e 60 por cento de CH3OH com um caudal de 1 ml/min.

Sonicaram-se aproximadamente 50 mg de tecido em 0,5 ml de tampão Tris 0,2M contendo PMSF- 10-·^Μ e DTT 2 mM a pH 7,4, centrifugou-se a 20 000 rpm e o sobrenadante foi filtrado através de um filtro de 0,2 /xm. Colocou-se uma amostra (335 μΐ de 16 mg de proteína/ml) numa coluna de HPLC (Superdex 75HR 10/30, LKB, Pharmacia) a qual foi previamente equilibrada com o mesmo tampão. Recolheram-se amostras de 0,5 ml a caudais de 0,5 ml/min e congelaram-se a -70eC até à sua utilização. Avaliaram-se os pesos moleculares das diversas fracções a partir do tempo de retenção de proteínas com pesos moleculares conhecidos. 6.1.4. Análise da Electroforese em Gel de Poliacrilamida

Efectuou-se a electroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) na fracção de P.M. <10 000, usando um gel a 12,5 por cento. O gel resultante foi então manchado com azul de Coomassie, usando técnicas padrão. 6.2. Resultados e Discussão

Submeteram-se a fraccionamento, de acordo com o peso mole- 73 405 7050-004-118 -23-

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cular, extractos de diversos órgãos embrionários, preparados da forma acima descrita. Só as fracções possuindo um peso molecular inferior a 10 000 daltons foram capazes de alterar a produção de HCG dos explantes placentários.

Quando se submeteu a fracção de P.M. <8 000 a análise HPLC, visualizaram-se três picos, como se mostra na Figura 1. De igual modo, quando se submeteu a fracção de P.M. <10 000 de espinal medula a PAGE, apareceram três bandas dominantes nos pesos moleculares de aproximadamente 3 000 a 8 000 daltons, como se mostra na Figura 2. A análise por HPLC posterior indicou que o agente gestacional antiproliferativo, denominado "JDK" parecia ter um peso molecular de cerca de 6,43 D. 7.EXEMPLO; JDK tinha um efeito supressor sobre a secreção de HCG de explantes placentários, um efeito antiproliferativo sobre as células cancerosas e um efeito supressor sobre o desenvolvimento embrionário 7.1. Materiais e Métodos 7.1.1. Análise do extracto fraccionado segundo o peso molecular em relação à capacidade para suprimir a secreção de HCG por explantes placentários

Para determinar a actividade supressora, usou-se um dispositivo de superfusão (Accusyst, Endotronics, St. Paul, MN) (Figura 3) com uma bomba peristaltica de múltiplos canais e um co-lector de fracção (modelo 272, ISCO, Durham, NC), para estudar a dinâmica a curto prazo, da secreção de gonadotrofina coriónica humana (hCG), como descrito em Barnea e Kaplan (1989, J. Clin. Endocrinol. 69.:215-217). Colocaram-se os explantes placentários (200-330 mg de peso, em húmido) nas câmaras de cultura e lavou-se com uma solução HEPES/DMEM 18 mM, numa atmosfera de 5% C02 e 95% de ar, a 37"C. Aplicou-se uma amostra correspondendo a uma fracção de um determinado peso molecular, administrando num impulso de um minuto de tal forma que todas as fracções pudessem ser analisadas em paralelo. As experiências foram conduzidas por um período de 120 minutos. Recolheu-se, a cada 2,4 minutos, uma amostra de 1 ml do efluente do dispositivo, para medições da hCG 73 405 7050-004-118 -24-por radio-imunoensaio. Em tais experiências, ma canal serviu como controlo e quatro serviram como canais experimentais. Em intervalos determinados, forneceu-se um impulso de 1 minuto de uma solução aquosa da fracção testada, através de uma bomba peristáltica equipada com um medidor de caudal digital (Ismatech DD, Chicago, IL). Foram consideradas como 11 amostras activas" as fracções que provocaram uma alteração significativa na secreção de hCG após a administração dos impulsos.

7.1.2. Teste da Actividade do JDK Sobre Linhas de Células Cancerosas

As linhas celulares a serem testadas, obtidas do American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, eram a MCF-7, uma linha de células de mama (número de acesso HTB22) e HBL-40, uma linha de células de mama exposta ao vírus SV40 (número de acesso HTB124). Outras linhas celulares incluíam CRL, uma linha celular de rim, e GNL, uma linha celular de ovário.

Cultivaram-se as células em RPMI-1640 em soro fetal de vitelo a 10-15% a uma concentração de 10 000 células por mililitro num volume de 0,5 ml, e mantido a 37°C numa atmosfera de 95 por cento de ar/5 por cento de CO2. Adicionaram-se alíquotas de 10-15 microlitros de extracto de fracções de <8 000 e <10 000, correspondendo, respectivamente, a concentrações de proteína de 0,2-1,0 micrograma por ml, a culturas idênticas de forma a avaliar a resposta à dose. Usaram-se duas culturas de controlo para cada linha celular. A primeira era uma cultura não tratada. 0 segundo controlo era uma cultura à qual se adicionaram 50 microlitros de Tris-HCl. Adicionou-se o extracto às culturas só no início da experiência. Contou-se, o número de células, 3-5 dias depois, usando um contador de células automático. 7.1.3. Análise do Efeito da JDK Sobre o Desenvolvimento

Embrionário In Vitro

Obtiveram-se ratinhos da estirpe ICR a partir do Charles Ri ver Laboratory. Acasalaram-se as fêmeas (com seis e sete semanas de idade) com machos com dez a doze semanas de idade. Cerca de 72 horas depois, as fêmeas foram sacrificadas e

73 405 7050-004-118 -25-removeram-se os embriões em fase de mórula, lavando as trompas de falópio com HAM-F1. Os embriões foram então colocados em meio EBSS contendo 10 por cento de soro de cordão de recém~nascido mantido numa atmosfera, humidificada, de 95 por cento de ar/5 por cento de C02. Para estudos do desenvolvimento do trofoblasto, as placas de cultura foram pré-revestidas com uma espessura de 1 mm de colagénio. 7.1.4. Análise do Efeito das Fraccões do Extracto Sobre a Sobrevivência de Ratinhos Nús Inoculados com Fibrossarcoma

Trataram-se ratinhos adultos (Balb/c) por irradiação sub-letal com raios-X para destruir a sua capacidade de formar uma resposta imunológica. As experiências foram efectuadas nos ratinhos inoculados subcutaneamente com 100 000 células de uma linha celular de fibrossarcoma. Usaram-se cinco ratinhos para cada experiência, e usaram-se cinco ratinhos que não foram inoculados como controlos. Os ratinhos inoculados foram tratados, adicionalmente, injectando 50 μΐ de material tipo proteína, a cerca de 1 ^g/ml, de fracções de peso molecular diferente, obtido como descrito supra imediatamente após a inoculação do tumor. Os animais foram mantidos, subsequentemente, num ambiente isento de bactérias, alimentados ad libitum. e examinados semanalmente. 3 semanas depois, os ratinhos foram sacrificados e examinados para detectar a presença de tumores. 7.2. Resultados e Discussão 7.2♦1.Fraccões do Extracto Contendo Moléculas Possuindo um Peso Molecular Inferior a 10 000 Daltons, Suprimiram a Secreção de HCG por Explantes Placentários

Quando os explantes placentários foram expostos a fracções do extracto de embrião correspondendo aos pesos moleculares de <100 ooo, <30 ooo, <10 ooo, <8 ooo e <3 ooo daltons, só aquelas fracções representando pesos moleculares inferiores a 10 000 daltons mostraram suprimir a secreção de hCG. A fracção <10 000 pareceu exibir uma actividade supressora inferior à fracção <8000, enquanto que a fracção <3 000 exibiu toma actividade estimuladora.

73 405 7050-004-118 -26- A figura 4Α mostra a capacidade do extracto em suprimir a secreção de hCG. Tal como as figuras 4B e 4C ilustram, a capacidade de curtos impulsos da fracção de PM <8 000 em inibir a secreção de hCG (figura 4B) é eliminada pela inactivação pelo calor a 57°C (Figura 4C) indicando que a JDK é termolábil. A figura 5 ilustra que se observou que, mesmo com uma diluição de 1/2000 de extracto, correspondendo a uma concentração de proteína de cerca de 100 ng/ml, se conseguiu cerca de 50 por cento do efeito supressor associado ao controlo. ^ 7.2.2.JDK Suprimiu o Crescimento de Linhas de Células de Cancro In Vitro

Adicionaram-se alíquotas de cinquenta microlitros de fracções, de pesos moleculares <8 000 e <10 000, de extracto de embrião a culturas celulares de MCF-7, CRL, HBL-40, e GNL, como acima descrito, e contou-se o número de células em cada cultura tratada ao fim de 3-5 dias e comparou-se com o número de células nas culturas de controlo não tratadas (expressas como 100%) e com culturas às quais se adicionou tampão (controlo de tampão).

Como se mostra no Quadro I, infra, a contagem de células nas culturas MCF-7 tratadas com a fracção de PM <8 000 era de 11 por cento do controlo, representando uma inibição do crescimento de 89 por cento. Noutra experiência, após somente três dias de cultura na presença de uma fracção de extracto de peso molecular de 6,428 KD, a proliferação celular foi inibida em 10 por cento estatisticamente significativos, (p<0,05). As culturas tratadas de modo semelhante de (i) CRL atingiram uma contagem celular de 63 por cento do controlo, representando uma inibição de 37 por cento; (ii) HBL-40 atingiu uma contagem celular de 3 por cento do controlo, representando uma inibição de 97 por cento; e (iii) GNL atingiu uma contagem celular de 23 por cento do controlo, representando uma inibição de 77 por cento. Curiosamente, a fracção de PM <10 000 mostrou uma inibição significativa só nas culturas MCF-7. Isto pode reflectir a presença de algum(ns) composto(s) que podem limitar o efeito da fracção activa sobre as outras linhas celulares.

73 405 7050-004-118 -27-

Tabela I

Percentagem de controlo não tratado

Controlo Controlo de

Linha celular não tratado PM <8 000 PM <10 000 tamoão MCF-7 100 11 50 97 CRL 100 63 100 100 HBL-40 100 3 103 105 GNL 100 23 104 98 Os resultados de outra experiência semelhante estão repre sentados na Figura 6. Nesta experiência, o extracto tinha um efeito mais pronunciado sobre as células CRL que na experiência descrita na Tabela I; isto pode ser uma função da heterogeneidade do próprio extracto ou do estado proliferativo das células antes de cada experiência. O Quadro II, infra. e a figura 7 ilustram a dose de dependência do efeito antiproliferativo da JDK na fracção de PM <8000 em células MCF-7 em cultura. A redução na contagem celular tor-nou-se detectável (quando se usou 10 μΐ de extracto, correspondendo a uma concentração de proteína de 0,2 μg/ml. Obteve-se a diminuição máxima com 50 μΐ de extracto, correspondendo a 1,0 μg/ml de proteína. •f (segue Tabela II)

Percentagem de redução

Tratamento na contagem

Controlo não tratado 0

Controlo de tampão 3 10 μΐ de extracto <8 000 (0,2 jug/ml proteína) 36 25 μΐ de extracto <8 000 (0,5 /ig/ml proteína) 52 50 μΐ de extracto <8 000 (1,0 μg/ml proteína) 89 7.2.3. Efeito Supressor da JDK no Extracto Sobre o Desenvolvimento Embrionário do Ratinho In Vitro

Como se mostra na figura 8, os embriões de ratinho tratados com JDK em fracção de extracto de PM <8 000 não se desenvolveram normalmente, em comparação com embriões de controlo não tratados. Verificou-se que o número de embriões tratados com extracto que atingiu a fase morular era só de cerca de doze por cento dos controlos não tratados (figura 8A),e o número de embriões tratados com extracto que exibia incubação/adesão (medido por mi-croscopia luminosa) era só de cerca de sete por cento dos controlos não tratados (Figura 8B). Isto está de acordo com a activi-dade antiproliferativa da JDK e apoia a sua utilização como um agente contraceptivo. 7.2.4. Ratinhos Nús Tratados com JDK Inoculados com Fi-brossarcoma Mostram Sobrevivência Melhorada e Menos Tumores

Inocularam-se trinta ratinhos nús com células de fibros-sarcoma e dididiram-se em seis grupos de cinco ratinhos cada. Cinco ratinhos não inoculados serviram como controlos negativos. Um grupo de ratinhos inoculados foi tratado só com tampão Tris-HCl. Os restantes cinco grupos foram tratados com 50 μΐ de cerca de 1 ^g/ml de uma das seguintes fracções de extracto: PM <3 000; PM <8 000; PM <10 000; e PM <30 000. Como se mostra na Tabela III, todos os cinco ratinhos do grupo tratado com a fracção de PM <8 000, estavam isentos de tumor. 0 único outro grupo que tinha animais isentos de tumor era o grupo que havia

73 405 7050-004-118 -29-recebido a fracção de peso molecular <8 000 (2 em 5). Dos grupos restantes encontraram-se tumores no local de inoculação.

Tabela III

Isento de tumor 5/5 0/5 0/5 5/5 2/5 0/5 0/5

Tratamento Nenhum (controlo) Tampão PBS <3 000 <8 000 <8 000 <10 000 <30 000

Numa experiência semelhante, a sobrevivência de ratinhos inoculados com fibrossarcoma e depois ou não tratados (controlo) ou tratados com fracções de extracto de diversos pesos moleculares foi avaliada durante um período de três semanas. A sobrevivência foi medida como o número de ratinhos que sobreviveram após o período de três semanas. Os ratinhos inoculados com células tumorais que receberam a fracção 3, correspondendo a uma fracção de extracto de PM <8 000, apresentaram uma sobrevivência equivalente aos ratinhos que não tinham sido inoculados com tumor. 8. EXEMPLO: Preparação de Agentes Gestacionais Prolife- rativos Activos 8.1. Materiais e Métodos 8.1.1. Preparação de Extractos Contendo Aaente Gestacional Proliferativo

Obteve-se a fracção de peso molecular <3 000, picando espinal medula embrionária em Tris-HCl frio a pH 7,4 contendo DTT 10 mM e PMSF 2 mM, sonicando o tecido picado em gelo durante cerca de 1 minuto e centrifugando depois a cerca de 2 400 rpm durante 10 minutos. O sobrenadante do material centrifugado foi, então, submetido a medição usando um Filtron System Omega Cell

73 405 7050-004-118 -30 (Biolab) sob azoto, e recolheram-se as fracções contendo pesos moleculares inferiores a 3 000 D. 8.1.2. Preparação de Embriões de Ratinho Obtiveram-se ratinhos de estirpe ICR do Charles River

Laboratory. As fêmeas (com seis a sete semanas de idade) foram acasaladas com machos de dez a doze semanas de idade. Cerca de 72 horas depois, as fêmeas foram sacrificadas e os embriões em fase de morula foram removidos por lavagem das trompas de falópio com HAM-F1. Colocaram-se, então, os embriões em meio EBSS contendo 10 por cento de soro de cordão de recém-nascido mantido numa atmosfera humidificada de 95 por cento de AR/5 por cento de C02. Para os estudos de desenvolvimento do trofoblasto, as placas de cultura foram pré-revestidas com uma espessura de 1 mm de cola-génio . 8.1.3. Análise do Efeito do Extracto Sobre a Secrecâo de HCG Pelos Explantes Placentários

Avaliou-se o efeito do extracto de P.M. de 3 000 sobre a secreção de hCG pelos explantes placentários, usando um dispositivo de superfusão, como descrito na Secção 7.1.1., supra. 8.1.4. Análise por Cromatoarafia Líquida de Elevado Rendimento

Efectuou-se a análise por HPLC como descrito na Secção 6.1.3., supra. Ver Figura 11. 8.2.Resultados e Discussão 8.2.1.A GPA-1 Provoca um Aumento da Secrecâo de HCG Pelos Explantes Placentários

Verificou-se que a fracção do extracto de PM <3 000, contendo uma proteína denominada GPA-1, era capaz de aumentar a secreção de hCG pelos explantes placentários. Habitualmente, a hCG é segregada pelos extractos placentários de uma forma pulsátil espontânea com uma frequência relativamente estável. Quando se administrou um impulso de um minuto da fracção de P.M. <3 000 aos explantes através do dispositivo de superfusão, observou-se um grande aumento na secreção de hCG, como se mostra na 73 405

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Figura 10. Isto foi evidenciado por iam aumento de quatro v< área sob a curva indicada no canal do dispositivo de superfusão tratado com a fracção de FM <3 000 em comparação com o canal de controlo. Em oposição, não se observou qualquer efeito sobre a secreção de hCG nos canais tratados com fracções de PM <100 000, de PM <50 000, e de PM <30 000. De notar que, o tratamento de explantes com a fracção de PM <3 000 (GPA-1) que tinha sido inactivada pelo calor a 57°C durante 30 minutos, não teve qualquer efeito sobre a secreção de hCG. Adicionalmente, a extracção da fracção com carvão/dextrano (como usado para extractar esteróides) eliminou também a sua actividade. 8.2.2. Desenvolvimento Morular Promovido por GPA-1 0 número de mórulas tratadas com a fracção de PM <3 000 (GPA) que sofrera maturação para formar blastocistos foi cerca de três vezes superior ao número de blastocistos que se formaram de mórulas tratadas só com tampão. Esta observação ocorreu quando as mórulas foram tratadas com 10 microlitros de GPA-1, a qual tem um teor em proteína de cerca de 0,2 μg/ml. A exposição dos embriões a 50 microlitros de fracção contendo GPA-1 mostrou aumentar a sobrevivência dos blastocistos para o dobro em relação ao controlo, numa medição por um período de 48 horas. A GPA-1 inactivada pelo calor não conseguiu afectar o desenvolvimento morular. 8.2.3. Desenvolvimento do Trofoblasto Promovido pela GPA-1

Quando se avaliou o desenvolvimento do trofoblasto usando placas de cultura revestidas com colagénio, verificou-se que o nível de desenvolvimento conseguido por controlos normais em 24 horas tinha sido conseguido por embriões tratados com fracções contendo GPA-1 somente em 14 horas. Estas alterações do desenvolvimento incluem a adesão do blastocisto à superfície do colagénio e a penetração do colagénio pelas células trofoblasticas em diferenciação. 0 processo acelerado in vitro pela GPA corresponde ao processo de implantação in vivo, e indica que a GPA-1 pode ser usada para facilitar a implantação e, portanto, aumentar a fertilidade nos seres humanos.

73 405 7050-004-118 -32 São aqui citadas várias publicações as quais estão deste modo incorporadas para referência na sua totalidade.

J

Claims

73 405 7050-004-118 -33- KEIVINDICACÕES -33-

1 - Processo de preparação de uma proteína substancialmente purificada, possuindo um peso molecular inferior a 10000 daltons, com efeito antiproliferativo sobre certas células cancerosas e sobre certas células embrionárias de mamífero caracterizado por compreender: (a) a extracção dos orgãos viscerais ou dos orgãos neurais ou de uma combinação de orgãos viscerais e neurais, recolhidos de um embrião de mamífero em Tris-HCl a pH 7,4 contendo ditiotreitol 10 mM e fluoreto de fenilmetilsulfonilo 2 mM, por tratamento com ultrassons, em gelo, seguida por centrifugação durante 10 minutos a 40 Hz e recolha do sobrenadante? e (b) a selecção das moléculas do sobrenadante que tenham um peso molecular inferior a 10000 daltons de modo a formar uma fracção; (c) a sujeição da fracção a cromatografia líquida de elevada pressão usando uma coluna RP-18 e usando, como tampão de eluição, uma mistura de 40 por cento de água e 60 por cento de metanol; e (d) a recolha do material da coluna de HPLC, correspondente ao pico I do cromatograma seguinte:
2 - Processo de preparação de uma proteína substancialmente purificada, possuindo um peso molecular inferior a 10000 daltons, com efeito antiproliferativo sobre certas células cancerosas e sobre certas células embrionárias de mamífero, caracterizado por compreender: (a) a extracção dos orgãos viscerais ou dos orgãos neurais ou de uma combinação de orgãos viscerais e neurais, recolhidos de um embrião de mamífero em solução salina tamponada com fosfato a 73 405 7050-004-118

-34- pH 7,4 contendo ditiotreitol 10 mM e fluoreto de fenilmetilsulfonilo 2 mM, por tratamento com ultrassons, em gelo, seguida por centrifugação durante 10 minutos a 40 Hz e recolha do sobrenadante; e (b) a selecção das moléculas do sobrenadante que tenham um peso molecular inferior a 10000 daltons de modo a formar uma fracção; (c) a sujeição da fracção a cromatografia líquida de elevada pressão usando uma coluna RP-18 e usando, como tampão de eluição, uma mistura de 40 por cento de água e 60 por cento de metanol; e (d) a recolha do material da coluna de HPLC, correspondente ao pico II do cromatograma apresentado na reivindicação 1.
3 - Processo de preparação de uma proteína substancialmente purificada, possuindo um peso molecular inferior a 10000 daltons, com efeito antiproliferativo sobre certas células cancerosas e sobre certas células embrionárias de mamífero, caracterizado por compreender: (a) a extracção dos orgãos viscerais ou dos orgãos neurais ou de uma combinação de orgãos viscerais e neurais, recolhidos de um embrião de mamífero em solução salina tamponada com fosfato a pH 7,4 contendo ditiotreitol 10 mM e fluoreto de fenilmetilsulfonilo 2 mM, por tratamento com ultrassons, em gelo, seguida por centrifugação durante 10 minutos a 40 Hz e recolha do sobrenadante; e (b) a selecção das moléculas do sobrenadante que tenham um peso molecular inferior a 10000 daltons de modo a formar uma fracção; (c) a sujeição da fracção a cromatografia líquida de elevada pressão usando uma coluna RP-18 e usando, como tampão de eluição, uma mistura de 40 por cento de água e 60 por cento de metanol; e (d) a recolha do material da coluna de HPLC, correspondente ao pico III do cromatograma apresentado na reivindicação 1.
4 - Processo de acordo com as reivindicações anteriores, caracterizado por a proteína substancialmente purificada possuir um peso molecular entre cerca de 6300 e 6600 daltons. 73 405 7050-004-118

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5 - Processo de inibição da proliferação de células cancerosas caracterizado por compreender a exposição das referidas células a uma concentração eficaz de uma proteína substancialmente purificada de acordo com a reivindicação 4.
6 - Processo de inibição da proliferação de células cancerosas caracterizado por compreender a exposição das referidas células a uma concentração eficaz de uma proteína substancialmente purificada de acordo com a reivindicação 1.
7 - Processo de inibição da proliferação de células cancerosas caracterizado por compreender a exposição das referidas células a uma concentração eficaz de uma proteína substancialmente purificada de acordo com a reivindicação 2.
8 - Processo de inibição da proliferação de células cancerosas caracterizado por compreender a exposição das referidas células a uma concentração eficaz de uma proteína substancialmente purificada de acordo com a reivindicação 3.
9 - Processo de inibição da proliferação de células cancerosas caracterizado por compreender a exposição das referidas células a um extracto preparado de acordo com o seguinte processo: (a) tratar por ultrassons, em gelo, uma mistura de (i) orgãos viscerais ou orgãos neurais ou uma mistura de orgãos viscerais e neurais, recolhidos de um embrião de mamífero e (ii) uma solução fisiologicamente compatível; (b) centrifugar do produto tratado por ultrassons a cerca de 40 Hz durante cerca de dez minutos e recolha do sobrenadante; e (c) seleccionar a porção do sobrenadante que tem um peso molecular inferior a cerca de 10000 daltons, compreendido num veículo farmacêutico adequado.
10 - Processo de preparação de uma composição farmacêutica destinada ao tratamento do cancro, caracterizado por se associar uma quantidade eficaz de uma proteína de acordo com as reivindicações 1, 2, 3 ou 4, com um veículo farmaceuticamente -36- 73 405 7050-004-118 aceitável.
11 - Processo de preparação de uma composição farmacêutica destinada à contracepção, caracterizado por se associar uma quantidade eficaz de uma proteína de acordo com as reivindicações 1, 2, 3 ou 4, com um veículo farmaceuticamente aceitável.
12 - Processo de preparação de uma proteína substancialmente purificada, caracterizado por compreender: (a) a sonicação, em gelo, de uma mistura de (i) orgãos viscerais ou orgãos neurais ou de uma mistura de orgãos viscerais e neurais, recolhidos de um embrião de mamífero e (ii) uma solução fisiologicamente compatível? (b) centrifugação do produto da sonicação a cerca de 40 Hz durante cerca de dez minutos e recolha do sobrenadante; e (c) selecção da porção do sobrenadante que tenha um peso molecular inferior a cerca de 3000 daltons; (d) separação da porção do sobrenadante preparada de acordo com o passo (c) por electroforese em gel de poliacrilamida? e (e) eluição do gel preparado de acordo com o passo (d) para produzir a proteína substancialmente purificada GPA-1, em que a GPA-1 promove o desenvolvimento da mórula a blastócito ou aumenta a secreção de gonadotrofina coriónica humana por um explante placentário.
13 - Processo de preparação de uma composição farmacêutica destinada ao aumento da fertilidade, caracterizado por se associar uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma proteína de acordo com a reivindicação 12 com um veículo farmaceu- ticamente aceitável. tl B» 199·* Lisboa, Por EYTAN R. BARNEA =0 AGENTE OPICIAL=