PT99896A - Metodo para a expressao de uma enzima sintetase de aceto-hidroxiacidos (ahas) resistente a herbicidas - Google Patents

Description

Este invento está relacionado com nóvàs sequências de DNA que codificam novas formas variantes da enzima ácido acetoxi--hidroxi-sintetase (daqui em diante AHAS). A enzima AHAS é uma enzima crítica normalmente produzida numa variedade de plantas e numa gama larga de microorganismos. A função normal de AHAS é inibida por uma série de diferentes tipos de herbicidas, no entanto, as novas enzimas AHAS codificadas pelas sequências de DNA mutantes funcionam normalmente de forma catalítica mesmo na presença de tais herbicidas e, portanto, conferem resistência a herbicidas à planta ou microorganismo que as contêm.

As novas sequências de DNA são baseadas na observação inesperada de que a deleção de um ou mais aminoácidos específicos em certas regiões da sequência do gene normal de AHAS resulta numa enzima totalmente funcional, mas torna a enzima resistente à inibição por uma variedade de tipos diferentes de herbicidas, incluindo imidazolinonas, triazolopirimidinas e sulfonilureias. A disponibilidade destas sequências variantes proporciona um instrumento para a transformação de uma variedade de plantas cultivadas diferentes para resistência a herbicidas, assim como proporciona novas marcas seleccionáveis para usar noutros tipos de experiências de transformação genética.

FUNDAMENTO DO INVENTO A utilização de herbicidas em agricultura encontra-se largamente espalhada. Se bem que exista um largo número compostos disponíveis que destroem eficazmente ervas daninhas, nem todos os herbicidas são capazes de se direcionarem selectivamente para as plantas indesejáveis no meio das plantas cultivadas, assim como não serem tóxicos para animais. Muitas vezes, é necessário estabelecer compostos que sejam simplesmente menos tóxicos para as plantas cultivadas do que para as ervas daníhhás. Para ultrapassar este problema, o desenvolvimento de plantas cultivadas resistentes a herbicidas tornou-se um dos principais focos da investigação agrícola.

Um aspecto importante do desenvolvimento de resistência a herbicidas é tuna compreensão de como o herbicida funciona na inibição do crescimento da planta e depois manipulação da via bioquímica afectada na planta cultivada de forma a que seja evitado o efeito inibidor enquanto a planta mantém a sua função biológica normal. Uma das primeiras descobertas do mecanismo bioquímico dos herbicidas relacionada com uma série de compostos herbicidas não relacionados estruturalmente, as imidazolinonas, as sulfonilureias e as triazolopirimidinas. Sabe-se agora (Shaner et al. Plant Phvsiol. 76:545-546, 1984. Patente U.S. N2 4,761,373) que cada um destes herbicidas inibe o crescimento das plantas por interferência com uma enzima celular integral, aceto-hidroxiácido--sintetase (AHAS; também referida como acetolacetato-sintetase ou ALS). AHAS é necessária para a síntese dos aminoácidos isoleuci-na, leucina e valina.

Sabe-se que a enzima AHAS está presente em todas as plantas superiores, sendo encontrada também numa variedade de microorganismos, tais como leveduras Saccharomvces cerevisiae e bactérias entéricas, Escherichia coli e Salmonella typhimurium. A base genética para a produção de AHAS normal numa série destas espécies também foi bem caracterizada. Por exemplo, tanto em E. coli como em S. typhimurium existem três isozimas de AHAS; duas destas são sensíveis a herbicidas enquanto uma terceira não é. Cada uma destas isozimas possui uma subunidade proteica grande e uma pequena; e estão mapeadas nos operóes IlvIH, IlvGM e IlvBN. Na levedura uma só isozima AHAS foi mapeada no lucus ILV2. Em cada um dos casos, formas sensíveis e resistentes foram identificadas e determinadas sequências dos -vários alelos (Friden et al.. Nucl. Acid Res. 13: 3979-3993, 1985; Lawther et al.. PNAS USA 78: 922-928, 1982; Squires et al. . Nucl. Acid. Res. 811: 5299-5313, 1983; Wek et al., Nucl. Acids Res. 13:4011-4027, 1985; Falco e Dumas, Genetics 109, 21-35; falco et al., Nucl. Acids Res. 13:4011-4027. 1985).

No tabaco, a função de AHAS é codificada por dois genes não ligados, SuRA e SuRB. Existe substancial identidade entre os dois genes tanto a nível de nucleótidos como de aminoã-cidos na proteína madura, se bem que a região putativa de trânsito N-terminal difira mais substancialmente (Lee et al.. EMBQ J. 7: 1241-1248, 1988). Por outro lado Arabidopsis tem um sô gene AHAS, o qual também foi completamente sequenciado As comparações entre sequências dos genes AHAS em plantas superiores indica um nível elevado de conservação de certas regiões da sequência; especificamente, existem pelo menos 10 regiões de conservação de sequência. Foi anteriormente assumido que estas regiões conservadas são críticas para a função da enzima e que a retenção daquela função está dependente de conservação substancial de sequências.

Foi recentemente descrito (EP 0257993) que os mutantes apresentando resistência a herbicidas possuem mutações em pelo menos um aminoácido numa ou mais destas regiões conservadas. Em particular, a substituição de aminoácidos selvagens por certos aminoácidos nestes sítios específicos na sequência AHAS mostrou--se ser tolerada e de facto resultou em resistência a herbicidas das plantas possuidoras desta mutação, se bem que mantendo a função catalítica. Mostrou-se que estas mutações ocorrem em ambos os loci SuRA e SuRB no tabaco; mutações semelhantes foram isoladas em Arabidopsis e levedura.

Descobriu-se agora inesperadamente. íqUè as deleções de um ou mais aminoácidos dentro de uma ou mais destas regiões "conservadas” resulta não só numa enzima AHAS funcional como também resulta em resistência a herbicidas. A conservação de sequências normalmente implica que qualquer alteração nestas regiões não será tolerada e portanto resultará numa proteína não funcional. No entanto, no presente caso, é particularmente surpreendente que a função da enzima é mantida, face ao facto de não só eliminarem um resíduo e aminoãcido que é um componente estrutural da enzima como também resultam necessariamente em desfasamento de resíduos, destruindo assim a aparente conservação da sequência contendo a mutação. Assim são proporcionadas novas sequências de ácido nucleico úteis na transformação de plantas sensíveis a herbicidas para dar plantas resistentes a herbicidas. As plantas assim transformadas proporcionam a base para o desenvolvimento de novas variedades de plantas resistentes a herbicidas.

SUMARIO DO INVENTO 0 presente invento proporciona novas sequências de ácido nucleico codificadoras de enzimas AHAS funcionais insensíveis a uma variedade de herbicidas, as sequências em questão compreendem a deleção de um ou mais dos codões codificadores de um aminoácido específico dentro de uma ou mais das chamadas regiões conservadas na molécula AHAS selvagem. A identidade destes sítios será discutida mais detalhadamente abaixo. As sequências de DNA alteradas são úteis em métdos para a produção de células vegetais resistentes a herbicidas, os referidos métodos compreendendo transformação de uma célula vegetal alvo com uma ou mais das sequências alteradas proporcionadas aqui. Como alternativa, a mutagénese é utilizada para criar mutantes de deleção em células vegetais ou sementes conteríàò umm sequência de ácido nucleico codificadora de uma AHAS sensível a herbicida. Tais células vegetais foram então passadas a cultura de tecidos para regenerar plantas que possuem resistência a herbicidas ou característica insensível. O invento também engloba células vegetais, culturas de tecidos vegetais, plantas adultas e sementes de plantas que possuem as sequências de ácido nucleico mutante de deleção e que expressam enzimas AHAS funcionais resistentes a herbicidas. A disponibilidade destas novas plantas resistentes a herbicidas permite novos métodos de cultura de plantas cultivadas na presença de herbicidas. Em vez de crescerem plantas não resistentes, os campos podem ser plantados com as plantas resistentes do presente invento e o campo ser tratado rotineiramente com herbicida, sem danificação das plantas cultivadas. Os herbicidas preferidos para este fim são as imidazolidonas, sulfonil-ureias e triazolopirimidinas.

Os ácidos nucleicos mutantes deste invento também proporcionam novas marcas seleccionáveis para usar em experiências de transformação. A sequência de ácido nucleico codificadora de uma AHAS resistente está ligado a um segundo gene antes da transferência para uma célula hospedeira e toda a construção usada para transformar o hospedeiro. As células transformadas putativas são então crescidas em cultura na presença de quantidades inibidoras de herbicida; as células sobreviventes terão adquirido o segundo gene com interesse.

As definições que se seguem devem ser entendidas como aplicando-se ao longo da especificação e reivindicações. Uma enzima AHAS "funcionar· ou "normal" é uma que é capaz de catali-zar o primeiro passo na via para a síntese dos aminoácidos -7- -7-

essenciais isoleucina, leucina e valina. Uma-séquência ou região "conservada" de AHAS é uma série de ácidos nucleicos ou aminoáci-dos dentro da sequência de ácido nucleico ou aminoãcidos de AHAS que é a mesma em pelo menos duas das espécies tendo a enzima AHAS. Uma sequência AHAS "selvagem" é uma sequência presente num membro sensível a herbicidas de uma dada espécie. Uma planta "resistente" é uma que produz uma enzima AHAS normal e que é capaz de atingir a maturidade quando crescida na presença de níveis normalmente inibidores de herbicida. O termo "resistente", como aqui é usado destina-se a englobar plantas "tolerantes", i.e., as plantas que fenotipicamente evidenciam reacções adversas mas não letais a herbicidas.

BREVE DESCRICÃO DAS FIGURAS

As Figuras la e 1b (Listagem de Sequências 1 e 2) mostram, respectivamente, as sequências de aminoácidos e de nucleótidos de AHAS selvagem de Arabidoosis. Na Figura la, as regiões inseridas em caixas indicam exemplos de subsequências em que as deleções podem ser feitas para produzir resistência a herbicidas. Os resíduos dentro de círculos identificam sítios específicos onde tais deleções podem ser feitas. Na Fihgura lb, uma seta indica o começo da região codificadora. A Figura 2 (a-c) mostra três fotografias de progénie (primeira geração), resultante de uma planta do tabaco transgéni-ca (10-1) transformada com uma construção contendo uma mutação de deleção Trp574 de AHAS de Arabidopsis pulverizada apõs a emergên-cia com o herbicida imidazolinona Pursuit a 0, 10, 20, 40, 60, 80 e 160 gramas/hectare (g/ha). Todas as três fotografias foram tiradas 25 dias após pulverização. Em todas as fotografias, plantas testemunhas (um cultivar do tabaco selvagemn relativamente à sensibilidade a herbicidas, Wiscarisin 38 [W38]) estão na fila da frente. (a) Testemunha W38 e auto 10-1 - W38 representa a testemunha e 10-1 a progénie de tabaco transgénico auto-cruzada. n A 0 g/ha de Pursuit , tanto W38 como 10-1 parecem semelhants. A 10 g/ha, a planta W38 é ligeiramente inibida no seu crescimento comparado com 10-1; no entanto, a partir de 20 g/ha, o crescimento de W38 é quase totalmente inibido. A 80 g/ha, o crescimento da planta 10-1 parece ser ligeiramente inibido e a 160 g/ha, o crescimento da planta 10-1 é claramente inibido. (b) Testwmuna W38 e 0 x 10-1 - W38 como anteriormente descrito. 0 x 10-1 representa W38 como progenitor maternal (0) e 10-1 como progenitor parental. Os resultados são muito semelhantes aos observados nas fotografias de 10-1 autocruzada. (c) Testemuna W38 e 10 x 0 - W38 como anteriormente descrito. 10-1 x 0 representa 10-1 como progenitor maternal e W38 como progenitor parternal (0). Os resultados são muito semelhantes aos observados na fotografia de 10-1 autocruzada excepto que nesta foto a segregação da característica resistência a herbicidas pode ser obervada na progénie 10-1. A Figura 3 ilustra o efeito da aplicação pós-emergência de Pursuit no crescimento de plantas do tabaco derivadas de semente, conforme medido pela altura da planta. C* representa a média do controle (cultivar progenitor susceptivel), enquanto que cada barra subsequente representa uma progénie transgénica individual. A Figura 4 ilustra o efeito do herbicida imidazolinona Pursuit sobre enzimas AHAS derivadas de uma E. coli transformada -9-

com uma sequência de AHAS tendo uma deleção^ .Trp574 [DEL], uma substituição Trp574 [SUB] e uma E. coli transformada com a sequência de AHAS selvagem. A Figura 5 ilustra o efeito do herbicida sulfonilureia p

Glean sobre as enzimas AHAS extraídas de transformantes de E. coli. As abreviaturas são como na Figura 4. A figura 6 ilustra os efeitos do herbicida imidazoli-nona Pursuit nas enzimas AHAS extraídas dos transformantes de Eh_ k coli. As enzimas são derivadas de uma E. coli transformada com uma deleção Ser653 [DEL], uma E. coli transformada com uma substituição Ser653 [SUB] e uma E. coli transformada com uma sequência AHAS selvagem [WT]. A Figura 7 ilustra o efeito do herbicida sulfonilureia Glean nas enzimas AHAS extraídas dos transformantes de E. coli. As abreviaturas são como na Figura 6. A Figura 8 ilustra o efeito do herbicida imidazolinona Pursuit na enzima AHAS derivada de uma planta do tabaco com uma estirpe de Aarobacterium contendo um alelo mutante de AHAS de Arabidopsistendo a deleção Trp574. 1

DESCRICÃO DETALHADA DO INVENTO

Toda a sequência de nucleõtidos do gene AHAS numa série de organismos incluindo levedura, E. coli. Brassica. Arabidopsis. beterraba açucareira e tabaco foi anteriormente divulgado (Mazur et al.. supra. Lee et al.. EMBO J. 7:1241, 1988). Ainda, notou-se que a resistência a herbicidas está associada a uma ou mais mutações dentro da sequência AHAS; especificamente, a resistência -10- -10-

notou-se estar associada a certas substituições específicas de aminoácidos dentro da sequência. (EP 259 793; Yadav et al. PNAS USA 83.:4418-22, 1986; Sathasivan et al.. Nucl, Acids. Res. 18: 2188, 1990). Foi no entanto deduzido (Hartnett et al.. em Manaaincr Resistance to Aqrichemicals. cap. 31, pp. 459-473, American Chemical Society, 1990; EP 259 793) que estas regiões de conservação nas quais ocorrem as mutações que conferem resistência devem geralmente ser mantidas para conservar a função enzimática.

Descobriu-se agora inesperadamente que a conservação destas sequências não é aparentemente essencial para a função catalítica da molécula. No decurso do desenvolvimento do presente invento, a mutagénese dirigida da região codificadora de AHAS de Arabidopsis á utilizada para criar mutações de deleção em que um resíduo que anteriormente se mostrou ser substituível é então eliminado da sequência. A deleção de um resíduo claramente destrói a natureza conservada das regiões em que ocorre. No entanto, as mutações de deleção assim criadas retêm todas a função de AHAS, ao mesmo tempo apresentando resistência a herbicidas. Especificamente, as deleções simples dos resíduos Trp574, Prol97 e Ser653 e as deleções duplas de Prol97 e Ser653 são feitas para criar plantas resistentes a herbicidas totalmente funcionais. Toda a numeração dos aminoácidos apresentada baseia--se na sequência AHAS de Arabidopsis. No entanto, será compreendido que ao longo da especificação e reivindicações, a referência a um sítio específico de deleção na sequência de Arabidopsis pretende englobar os sítios correspondentes na sequência AHAS de qualquer outra espécie tendo um gene AHAS.

Face aos resultados, torna-se aparente que a conservação destas regiões associadas â resistência a herbicidas da molécula de AHAS não é crítico para a aactividade catalítica e que uma ou mais deleções de aminoácidos numa ou mais sequências

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de aminoácidos conservadas pode ser facilemtè' tolerado pela enzima e ainda, conferirá resistência a herbicidas à planta. 0 presente invento engloba sequências de DNA de AHAS nas quais foram feitas uma ou mais deleções relativamente à sequência selvagem, deleções essas que não alteram a função catalítica da enzima AHAS resultante, mas que conferem resistência a herbicidas. Tais mutações de deleção incluem, mas não estão limitadas a deleção de um ou mais codões, codificadores das chamadas "subse-quências conservadas” como definido em EP 257 793. Estas são sequências de DNA codificadoras dos aminoácidos 119-122, 194-197, 201-208, 255-257, 348-353, 373-377 e 569-578 na AHAS de Arabidopsis. Em adição, uma outra "sequência conservada" na qual a substituição foi descrita e em que a deleção é útil para proporcionar resistência a herbicidas, é 650-653. A deleção de um codão, mais de um codão e até todos os codões nas "subsequências" descritas atrás, está considerado dentro do âmbito do invento. São preferidos os mutantes codificadores de deleções de codões tendo uma deleção de pelo menos uma posição de resíduo seleccio-nada do grupo constituído por aminoácidos 120, 121, 197, 205, 256, 351, 376, 571, 574, 578 e 653. São particularmente preferidas as sequências codificadoras das deleções 197, 574 ou 653.

Se bem que as deleções atrás identificadas representem regiões em que se sabe que a variação é tolerada, é provável face â "flexibilidade" substancial da molécula que outras deleções são também possíveis. Por exemplo, outras regiões aparentemente conservadas da enzima AHAS também existem para além das descritas atrás. Se bem que não pretendendo estar ligado a qualquer teoria particular, parece provável que mais do que sendo sítios ligados à actividade catalítica da molécula e portanto necessitando de conservação estrutural essencial, a maior parte das regiões conservadas representam sítios de ligação para o herbicida. A deleção de um ou mais aminoácidos nestes sítios logicamente evitariam a ligação do herbicida e consequentçmèhtè evitariam a interferência do herbicida com a actividade de AHAS. Usando este raciocínio, o conhecimento disponível relativamente às sequências conservadas de AHAS (Ver, e.g. Mazur et al.. Plant Physiol. 115:1110-1117, 1987) e técnicas conhecidas, tais como mutagénese dirigida, será uma questão de rotina projectar mutantes de deleção adicionais com probabilidade de serem resistentes a herbicidas. Os mutantes putativos podem ser então despistados por crescimentona presença de quantidades inibidoras do herbicida com interesse para determinar se foi ou não conferida resistência a herbicidas.

Como acontece com todas as proteínas, a enzima AHAS funcional possui uma estrutura tridimensional que é o eventual resultado do arranjo linear dos aminoãcidos componentes. A interacção dos grupos laterais dos aminoãcidos produz uma estrutura secundária da proteína e posterior enrolamento resulta nuam estrutura terciária da proteína. Uma arquitectura específica de uma dada proteína que finalmente resulta da sequência de aminoá-cidos pode ser crítica para a função da proteína. Assim, a substituição de um aminoácido retem a integridade estrutural da proteína, enquanto que a deleção de um aminoácido destrói eficaz-mente esta integridade estrutural e pode-se esperar que altere significativamente a estrutura tridimensional da proteína e ao fazê-lo altere a função da molécula. Assim, face à potencial danificação que pode ser causada pela deleção é particularmente surpreendente que a molécula resultante retenha a fracções suficientes da sua estrutura tridimensional para permanecer não só cataiiticamente funcional como também para causar resistência a herbicidas. os familiarizados com a matéria reconhecerão que os mutantes de deleção do presente invento não estão limitados à -13-

fonte de DNA ou enzima. Se bem que a presente programação experimental utilize principalmente a sequência do gene AHAS de Arabidopsis. mutações semelhantes podem ser feitas de rotina na sequência AHAS de qualquer organismo possuidor de tal gene, e.g. outrasplantas superiores, leveduras, E. coli e outros microorga-nismos. As semelhanças no gene AHAS tipo selvagem entre todas as sequências conhecidas são tão grandes que torna-se uma questão de rotina criar mutantes idênticos nas sequências AHAS diferentes das de Arabidopsis. Como alternativa, podem ser construídos genes quiméricos que contêm a fracção do mutante de deleção do gene AHAS de Arabidopsis recombinado com fracções inalteradas do gene AHAS de outras fontes.

Os novos tipos de genes descritos aqui podem conferir resistência a um ou mais de um tipo de herbicida. Conforme já foi bem estabelecido, AHAS é o local de acção de várias classes distintas de herbicidas, nomeadamente imidazolinonas, sulfonil-ureias, triazolopirimidinas, sulfamoilureias e sulfonilcarbo-xamidas. Tal como acontece com a resistência a herbicidas conferida pela substituição de aminoãcidos a resistência a herbicidas conferida por tais mutações pode ser selectiva para um herbicida particular ou pode haver resistência cruzada a mais de um herbicida. Por exemplo, as deleções de Trp574 e Ser653 criam resistência cruzada a imidazolinonas e a sulfonilureias. No entanto alguém familiarizado com a matéria determinará facilmente a especificidade de qualquer mutante particular detectando separadamente na presença de e.g. imidazolinonas sozinhas ou sulfonilureias sozinhas e isolamento de plantas sobreviventes. A resistência cruzada pode ser determinada pelo crescimento na presença de mais de uma classe de herbicida. Os tipos de herbicida com os quais o presente invento é útil estão descritos por exemplo na Patente U.S. N2 4188487, 4,201,565; 4,221,586; 4,297,128; 4,554,013; 4,608,079; 4,638,068; 4,647,301; 4,650,514; 4,698,092; ν/··· ·-. -14-

4,701,208; 4,709,036; 4,752,323; 4,772,311jj ;.e\ 4,798,619 ; Pat. U.S. Nos. 4,127,405; 4,435,206; 4,424,703; 4,417,917; 4,398,939; 4,394,506; 4,391,627; 4,383,113; 4,378,991; 4,372,778; 4,371,391; 4,370,480; 4,370,479; 4,369,320 (sulfonilureias).

Nesta altura demonstrou-se que AHAS não só está presente numa larga variedade de plantas, como também é um sítio crítico que determina a sensibilidade a herbicidas numa larga gama de plantas essencialmente não relacionadas, e.g. milho, Brassica. tabaco, linho, Arabidopsis e beterraba açucareira (Stougaard et al.. Mol. Gen. Genet.219: 413-420, 1989; Jordan & McHughen, J. Plant. Phvsiol. 131; 333-338, 1987; McHughen, Plant Cell Reports j5: 445-449, 1989). Como se observou atrás, em seguida é possível criar a mutação importante directamente na planta de interesse por técnicas mutagénicas conhecidas. (Ver por exemplo, Maniatis, et al.. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, cold Spring Harbor Laboratory, 1982; e Exemplo II, infra). No entanto, será frequentemente mais conveniente criar plantas transformadas com uma sequência de DNA conhecida e isoladacompreendendo as deleções requeridas, como sejamos mutan-tes de deleção de Arabidopsis descritos no presente caso. os plasmídeos contendo mutantes de deleção nas posições 574 e 653 foram depositados na American Type culture Collection, Rockville, MD, em 6 de Dezembro, 1990 repectivamente com os números de acesso ATCC 68488 e 68489.

As sequências de DNA de AHAS do presente invento são úteis para transformar cultivares alvo e portanto conferir resistência a herbicidas sem a necessidade de mutagénese. Existe uma larga gama de técnicas para se conseguir transformação directa ou indirecta de plantas superiores com DNA exógeno e qualquer método pelo qual a nova sequência pode ser incorporada no genoma do hospedeiro e estavelmente herdada pela sua progénie, JA -15-

está englobado no presente invento. Uma descriçs.ao detalhada de tal método é proporcionada nos exemplos que se seguem.

A transformação indirecta de células vegetais pode ser conseguida pela utilização de vectores. Um método comum de se conseguir a transformação é a utilização de Aorobacterium tumefaciens para introduzir um gene estranho na célula vegetal alvo. Por exemplo no presente caso, a sequência mutante de AHAS é inserida num vector plasmideo contendo as sequências delimitantes no T-DNA do plasmideo Ti. O plasmideo é então usado para transformar E. coli. Realizou-se então uma conjugação triparental entre esta estirpe, uma estirpe de Aorobacterium contendo um plasmideo Ti sem braços contendo as funções de virulência necessárias para efectuar a transferência das sequências de T-DNA contendo AHAS para o cromossoma da planta alvo e uma segunda estirpe de E. coli contendo um plasmideo tendo sequências necessárias para mobilizar a transferência da construção de AHAS de E. colipara Aorobacterium. Uma estirpe de Aorobacterium recombinante, contendo as sequências necessárias para a transformação de plantas foi usada para infectar discos de folhas. Os discos foram cultivados em meios selectivos e os regenerantes transformados foram identificados. As plantas recuperadas são resstentes aos efeitos de herbicidas quando cultivadas na sua presença. Outros vectores de plantas, tais como virus de plantas, também proporcionam um meio possível para a transferência de DNA exógeno. A transformação directa de células vegetais, em vez da utilização de vectores pode também ser empregue. Tipicamente os protoplastos da planta alvo são colocados em cultura na presença do DNA a ser transferido e um agente que promove a internaiização de DNA pelos protoplastos é absorvido â sua superfície. São agentes úteis para isto o polietilenoglicol ou fosfato de cálcio.

Como alternativa, a internaiização^ de DNA pode ser estimulada por electroporação. Neste método, um pulso eléctrico ê usado para abrir poros temporários numa membrana celular de protoplasto e o DNA na solução envolvente é então paassado para o interior da célula através dos poros. De forma semelhante, a microinjecção pode ser empregue para libertar o DNA directamente numa célula e preferencialmente directamente no núcleo da célula.

Em cada uma das técnicas anteriores, a transformação ocorre numa célula vegetal em cultura. Subsequentemente à trans-formaçã, as células vegetais devem ser regeneradas para dar plantas completas. Técnicas para a regeneração de plantas maduras a partir de culturas de calos ou de protoplastos não são bem conhecidas para um grande número de espécies diferentes (ver, e.g., Handbook of Plant Cell Culturef Vols. 1-5, 1983-1989 McMillan, N.Y.). Assim, uma vez conseguida a transformação, está dentro do conhecido na área regenerar plantas maduras a partir de células vegetais transformadas. São também conhecidos métodos alternativos que não requerem necessariamente a utilização de células isoladas e portanto, técnicas regenerativas, para se conseguir a transformação. Estas são geralmente referidas como métodos "balísticos'· ou de "aceleração de partículas", em que partículas de metal revestidas com DNA são propeladas para as células vegetais por uma carga de pólvora (Klein et al. . Nature 327: 70-73, 1987) ou descarga eléctrica (EPO 270356). Desta forma, as células vegetais em cultura ou orgãos reprodutores vegetais ou células, e.g. pólen, podem ser transformados estavelmente com a sequência de DNA com interesse. O presente invento pode ser aplicado à transformação de virtualmente qualquer tipo de planta tanto monocotiledónia como -17-

dicotiledónia. Entre os cultivares para os quais a transformação para resistência a herbicidas está contemplada esão o milho, trigo, milho painço, aveia, cevada, sorgo, alfafa, beterraba sacarina, espécies de Brassica. tomateiro, pimenteiro, soja, tabaco, melão, abóbora, batata, amendoim, ervilha, algodão ou cacau. As novas sequências podem ser também usadas para transformar espécies ornamentais, como a seja a rosa e espécies que dão madeira, como seja o pinho.

As novas sequências do invento também são úteis como marcas selectivas em estudos genéticos com plantas. Por exemplo, na transformação de plantas, sequências codificadoras de resistência a herbicidas podem ser ligadas a um gene de interesse o qual se destina a usar para transformar um alvo do herbicida -célula vegetal sensível. A construção compreendendo o gene com interesse e a sequência resistente a herbicidas são introduzidos na célula vegetal e as células vegetais são então cultivadas na presença de uma quantidade inibidora do herbicida. As células vegetais sobreviventes a tal tratamento presumivelmente adquiriram o gene de resistência assim como o gene com interesse e, portanto, os transformantes putativos são facilmente identificáveis. 0 invento é ainda ilustrado pelos exemplos não limitan-tes que se seguem.

EXEMPLO I

Isolamento de um Clone Genómico Codificador de AHAS de Arabidoosis

Um fragmento EcoRI cde 2,1 Kb englobando o promotor, peptídeo de trânsito e uma fracção da região codificadora madura 32 de AHAS de Arabidoosis foi marcado com Ppor "nick translation*' (Maniatis et al.. Molecular Clonong: A Laboartory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982) e utilizou como sonda de hibridação para o despiste de uma biblioteca genómica preparada a partir de DMNA genõmico de Arabidoosis thaliana (Clontech, Paio Alto, CA) . Os filtros foram hibridados durante 24 horas a 42°C em 6xSSC, 5X solução de Denhardt, fosfato de sódio 50 mM, pH 7,2, 0,1% SDS e 100 jug/ml de DNA de esperma de salmão desnaturado. Os filtros foram lavados várias vezes a 60°C em lx SSC e 0,1% SDS. Seis bacteriófagos recombinantes (A22, A31, A42, A52, A72, A83) foram classificados como positivos putativos. Estes bacteriófagos foram purificados em placas e usados para infectar a baixa multiplicidade E. coli estirpe 802 em caldo líquido NZY (NZCYM é 10 g de NZ amina, 5g de NaCl, 5g de extrato de levedura, 1 g de casaminoãcidos, 2 g de MgS04~7H20 e 10 ml de 1M Tris-HCl, pH 7,2) como descrito por Maniatis et al., supra. As culturas líquidas foram incubadas durante a noite com agitação constante (300 rpm) a 37°C. Os 50 ml de suspensão foram ajustados a 1M NaCl e 8% de PEG pela adição de NaCl sólido e polietilenogli-col sólido. A suspensão foi incubada durante a noite a 4°C para precipitar o bacteriófago. 0 bacteriófagos foram sedimentados via centrifugação a 18 000 xg durante 20 minutos. 0 sedimento foi ressuspenso em 2 ml de tampão TM (10 mM Tris-HCl, pH 7,5; 10 mM MgCl2), colocado sobre um gradiente de descontínuo de CsCl (4,8M CsCl, 4,0M CsCl e 3,2M CsCl) e centrifugado a 50 000 xg durante 1 hora num rotor basculante SW60. A banda de fagos foi removida da

interface de 4,0/3,2M CsCl para um tubo Eppepdòirf de 1,5 ml e o bacteriófago foi lisado pela adição de 1 volume de formamida e incubação â temperatura ambiente durante 30 minutos. 0 DNA foi recuperado ajustando a solução a lOmM Tris-HCl, pH 8,0 e lmM Na2-EDTA e precipitação do DNA pela adição de 2 volumes de etanol a 100%. O DNA do bacteriófago foi recuperado por centrifugação, lavado com etanol a 70% e ressuspenso em tampão TE (tampão TE é 10 mM Tris-HCl, pH 7,5; 1 mM Na2~EDTA) . O DNA purificado foi extraído de rotina uma a várias vezes com fenol:clorofórmio:álcool isoamílico (24:24:1), precipitado com etanol e ressuspenso em 50-100 μΐ de tampão TE antes da digestão com várias enzimas de restrição.

As preparações de DNA de seis fagos recombinantes foram digeridas com várias enzimas de restrição e resolvidas por electroforese num gel de 1% de agarose. O DNA foi transferido para nitrocelulse (Southern) e hibridado (24 hr a 60°c em 2xSSC, 5x solução de Denhardt, 50 mM fosfato de sódio, pH 7,2, 0,1% SDS e 100 Mg/ml de DNA de esperma de salmão desnaturado) contra um fragmento NcoI/EcoRI de 900 pb marcado radioactivamente representando a região 3' do fragmento EcoRI de 2,1 Kb (o peptídeo de trânsito e a fracção 5'da região codificadora madura). O filtro foi lavado duas vezes a 65°C em 0,5xSSC e 0,1% SDS. O fragmento NcoI/EcoRI de 900 pb hibrida com um fragmento Xbal de 5,5 Kb e com um fragmento EcoRI de 2,1 Kb de A42 e A52. Estes resultados estão de acordo com com informação publicada respeitante à clonagem e caracterização da sequência genómica codificadora de AHAS Arabidonsis (Mazur et al.. Plant Phvsiol.. 85: 1110-1117, 1987) . O bacteriófago A52 foi escolhido para posterior análise. O fragmento Xbal de 5,5 Kb de A52 foi isolado a partir de um gel de 1% de agarose e purificado através de um sistema de 20

electroeluição IBI como sugerido pelo fabricante. O fragmento Xbal de 5,5 Kb foi precipitado com etanol e ressuspenso em H20 destilada. Estes fragmentos foram ligados ao DNA de plasmídeo pSK(-) digerido com Xbal (adquiridoà Stratagene, La Jolla, CA). Os fragmentos foram ligados durante 16-24 horas a 14eC num volume de 20 μΐ como descrito em Maniatis, et .al.. supra. Após incubação, o volume de reacção de 20 μΐ foi diluído para 100 μΐ com 100 mM Tris-HCl, pH 7,2. Vinte cinco μΐ desta amostra foi ainda diluido para 100 μΐ com 100 mM Tris-HCl, pH 7,2 e incubado com 100 μΐ de células competentes HB101 [preparadas exactamente como ^ descrito por Morrison (Meth. Enzymol. 68: 326-331, 1979)]. A mistura de transformação plasmideo/E. coli foi incubada em gelo durante 20 minutos; transferido para 42°C durante 2 minutos; temperatura ambiente durante 10 minutos; seguido imediatamente da adição de 1 ml de caldo LB (caldo LB é 10 g de bacto-triptona; 5 g de extracto de levedura; 5 g de NaCl e 10 ml de 1M Tris-HCl, pH 7,2 por litro) e ainda incubação a 37°C durante 20 minutos. Os veículos de clonagem plasmídeos usados neste trabalho são portadores do gene que confere resistência à ampicilina ou canamicina. Portanto, 200 μΐ de cada uma das misturas de transformação foram semeados directamente em placas LB ou LB (100 μg/ml de c amp can ' qualquer um dos antibióticos) e incubado a 37°C durante 12-20 horas, dependendo do tamanho das colónias. >

As colónias foram transferidas para 3 ml de LB ou amp LB e incubadas durante a noite a 37°C com agitação constante, can

As preparações de DNA de plasmídeo em pequena escala foram preparadas por modificações pequenas do método de lise alcalina descrito por Maniatis, et al. supra. De rotina, 400 μΐ da cultura de 3 ml crescida durante a noite foram semeados num tubo Eppendorf cde 1,5 ml e ressuspenso em 150 gl de solução GTE (solução GTE é 50 mM glucose; 25 mM Tris-HCl, pH 8,0 e 10 mM Na2EDTA) e incubado em gelo durante 20 minutos, seguido da adição de 300 μΐ de solução alcalina contendo SDS e 200 μΐ de. , 5M,K+/3M OAc nos intervalos de tempo recomendados. O sedimento de DNA final foi ressuspenso em 40 μΐ de RNase A a 50 jug/ml em tampão TE. Quinze μΐ de DNA de plasmídeo foi removido para digestão de restrição. Dois plasmídeos, pAC301 (5#—>3') e pAC302 (3'—>5'), representam construções contendo o fragmento Xbal de 5,5 Kb ligado ao sitio Xbal do pSK(-). Posterior análise de restrição de pAC301 e de pAC302 confirmou a presença da região do promotor, peptídeo de trânsito, região codificadora madura e regiões 3' não traduzidas da sequência genõmica codificadora de AHAS de Arabidoosis (Mazur et al.. supra).

EXEMPLO II

Mutaoénese dirigida com olicronucleôtidos da região codificadora de AHAS de Arabidopsis (a) Preparação de molde de cadeia simples de pAC301 - o plasmídeo pAC301 foi usado para transformar E. coli estirpe XL-1 (Stratagene). O molde de cadeia simples de pAC301 foi gerado a partir desta construção do "fagemideo" pSK(-) seguindo o protocolo do fabricante. De rotina, uma cultura de 3 ml SB crescida amp durante a noite foi adicionada a um frasco estéril contendo 50 ml de SBamp (SB é 35 g de bacto-triptona, 20 g de extracto de levedura, 5 g de NaCl e 10 ml de 1M Tris-HCl, pH 7,5 por litro) e incubado a 37°C com agitação constante (300 rpm) até a cultura aingir uma D0600 de 0,3. Nesta altura a cultura foi inoculada com . . 10 o fago auxiliar, R408 (1 x 10 fagos) e fez-se agitação a 300 rpm, 10°C, durante a noite. As bactérias foram sedimentadas a 10 000 xg durante 10 minutos. O sedimento de bactérias foi rejeitado e o sobrenadante (aproximadamente 45 ml) contendo o molde de cadeia simples pAC301 foi guardado a 4°C até ser usado. 0 ν' sobrenadante foi de rotina usado durante até.cêrca de um mês para preparações de fagemídeos de cadeia simples. As preparações em pequena escala (1,2 ml) de DNA do fagemídeo de cadeia simples pAC301 foram preparadas essencialmente como descrito pelo fabricante (Stratagene). Os fagos foram precipitados pela adição de 300 μΐ de uma solução 3,5 M NH4Ac, pH 7,5; 20% PEG. A solução foi bem misturada num tubo Eppendorff e incubada à temperatura ambiente durante 20 minutos. 0 fago de cadeia simples foi sedimentado por centrifugação durante 20 minutos numa microcentrífuga Eppendorf. O sobrenadante foi decantado, o sedimento seco e eventualmente ressuspenso em 300 μΐ de tampão TE. Os fagos foram lisados pela adição de 200 μΐ de fenol:clorofórmio:álcool isoamí-lico (24:24:1) e sujeito a vortex durante 1 minuto. Este passo foi repetido uma vez mais e seguido de mais duas extracções com clorofórmio:álcool isoamílico (24:1). A fase aquosa final foi precipitada com etanol (um décimo do volume de 5M K+/3MOAc e dois volumes de 100% etanol), lavada com etanol a 70%, ressuspensa em 2 0 μΐ de tampão TE e transferido para um tubo novo Eppendorf de 1,5 ml. (c) Preparação do oligonucleótido - Todos os oligonu-cleótidos foram adquiridos â New England Biolabs.Os oligonucleó-tidos foram utilizados para introduzir (1) uma substituição de aminoácidos no resíduo Trp574 da região codificadora de AHAS de Arabidopsis (Trp —> Leu) e (2) uma deleção de aminoácidos no resíduo de aminoácidos Trp574.

Substituições Trp —> Leu

V M Q W E D R selvagem 5'-GTT ATG CAA TGG GAA GAT CGG-3'

V M Q L E D R mutante 5'-GTT ATG CAA TTG GAA GAT CGG-3' (21-meros) -23-

Deleção Trp574 , .· - ' V M Q W E D R selvagem 5' -GTT ATG CAA TGG GAA GAT CGG-3'

V M Q E D R mutante 5'-G GTT ATG CAA---GAA GAT CGC-3' (21 meros)

I

Duzentas nanogramas de cada um dos oligonucleótidos foi sujeito a uma reacção de permuta com cinase antes da hibridação com o molde de cadeia simples pAC301. Um volume de reacção de 40 μΐ incluiu 50 mM Tris-HCl, pH 7,5; 10 mM MgCl2, 50 mM DTT, 0,1 mM espermidina e 0,1 mM Na2~EDTA. A reacção foi iniciada via adição de 10 unidades de polinucléotido-cinase de T4 (Pharmacia) e foi incubada a 37°C durante 30 minutos. A reacção foi parada levando a mistura de reacção a 90°C durante 3 minutos. Metade da reacção com cinase foi adicionada a 20 μΐ de preparação de cadeia simples de pAC301 e foi incubado a 65°C durante 10 minutos para promover a hibridação. A estes 40 μΐ de mistura cinase/oligonucleótidos adicionou-se 6 μΐ de lmM dNTPs, 6 μΐ de tampão ligase lOx (500 mM Tris-HCl, pH 7,5; 70 mM MgCl2 e 1Ό mM DTT), 2 μΐ rATP, 5 unidades de DNA-polimerase Klenow (Pharmacia), 8 unidades de DNA-liga-se (Stratagene) e 4 μΐ de água destilada. A reacção polimerase/li-gação foi incubada à temperatura ambiente durante 3 horas. Metade da mistura foi usada para transformar cálulas competentes E. coli XL-l. A mistura de transformação foi espelhada em placas LBamp e incubada durante a noite a 37°C. Os transformantes foram novamente semeados em placas frescas LBamp segundo um padrão tipo grelha. 0 despiste de colónias por hibridação foi realizado exactamente como descrito por Stratagene Technical Service (Junho 1988/pBSII Exo/Mung Bean Sequencing System). Ambos os oligonucleó- 32 tidos foram marcados com P por uma reacção de permuta com cinase (300 ng de oligonucleótido na presença de 40 μθΐ de gama P-ATP utilizando as condições de cinase anteriormente 32 * · · descritas). 0 P-ATP não incorporado foi removido por -24-

:χ - electroforese da reacção de fosforilação atravçs: de um gel de 20% acrilamida/7M ureia. A banda radioactiva correspondendo a um oligonucleõtido de 21-meros foi cortada do gel com uma lâmina de barbear e eluida por (1) método de esmagamento e embebição de

Maxam e Gilbert (PNAS USA 74: 560-566, 1977) ou (2) electroeluição usando um sistema de electroeluição IBX. Os oligonucleótidos marcados radioactivamente e purificados foram hibridados com colónias transferidas para filtros de nitrocelulose em condições de hibridação não restringentes (37°C durante 24 horas em 6xSSC, 5 x solução de Denhardt, 50 mM Na-P, pH 7,2 e 500 Atg/μΐ de DNA de

timo de vitela). Os filtros foram lavados uma vez à temperatura ambiente em 6xSSC e 50 mM Na-P, pH 7,2 e novamente a 37°C em 6xSSC e 50 mM Na-P, pH 7,2. Finalmente, os filtros foram lavados duas vezes a 60°C durante 15 minutos em cloreto de tetrametilamó- nio 3M, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 2 mM Na2~EDTA e lmg/ml de SDS. Um oligonucleõtido de 21-meros com um emparelhamento de bases perfeito (i.e. oligo mutante para fagemídeo mutante) não se liberta do DNA de fagemídeo a 60°C, enquanto que um ligeiro desemparelhamento (i.e. oligo mutante para fagemídeo selvagem) é removido. Os positivos putativos foram semeados a partir da placa LB original para uma placa LB fresca. Dez transformantes de amp amp

cada um dos positivos putativos novamente semeados foram então semeados segundo um padrão tipo grelha e repetida a hibridação de colónias. Os positivos secundários foram então confirmados via análise de sequências de DNA na região codificadora de Trp574. (Sanger et al.. PNAS VSA 74: 5463-5467, 1977). Dois mutantes positivos, pAC324 (substituição Trp574 —> Leu) e pAC325 (deleção Trp574) foram seleccionados para posterior análise.

EXEMPLO III

Transformacao de Tabaco Mediada oor Aarobacterium (a) Construção de vectores - Ambos osvectores e a estirpe de Acrrobacterium foram adquiridas à Clontech. O plasmídeo pBIN19 é um vector vai-vem binário E. coi/Aarobacterium que possui as sequências delimitantes de T-DNA do plasmídeo Ti, um poliadaptador e uma origem de replicação bacteriana RK2 funcional tanto em E. coli como em Aarobacterium e um gene que confere resistência à canamicina (Bevan, Nucl. Acids Res. 12:8711-8721, 1984). Os plasmídeos pAC324 e pAC325 foram digeridos com Xbal e sujeitos a electroforese num gel de 1% de agarose. O fragmento Xbal de 5,5 Kb contendo a respectiva mutação de pAC324 e pAC325 foi isolado como anteriormente descrito. 0 plasmídeo pBN19 foi digerido com Xbal e incubado numa reacção de ligação separada com o fragmento Xbal de 5,5 Kb do pAC324 e pAC325. Toda a mistura de ligação foi usada para transformar células E. coli XL-1 e os transformantes positivos foram escolhidos por selecção de cor branco/azul em placas LB . (placas LB com 100 jug/ml de ampicili-na, 80 jug/ml de X-gal e 20 mM IPTG) . As preparações de plasmídeo em pequena escala, análise por digestão com enzimas de restrição e electroforese em gel de agarose para confirmar os transformantes positivos foram realizadas como descrito anteriormente. Das quatro construções de plasmídeo baseadas em pBIN19, pAC348-pAC349 (ambas as orientações do fragmento Xbal de 5,5 Kb contendo a substituição Trp—>Leu em pBIN19) e pAC350-pAC351 (ambas as orientações do fragmento Xbal de 5,5 Kb contendo a deleção Trp574 em pBIN19), uma construção de cada mutação foi escolhida para transformação de tabaco. (b) Mobilização de pAC348 - pAC351 para Agrobacterium -26-

I > 0 plasmídeo pRK2013 é um plasmídeo' de conjugaçãoque contem sequências que actuam em trans necessárias para mobilizar construções baseadas em pBIN19 de e. coli para Aqrobacterium estirpe LB4404 (pAL4404). Esta estirpe de Aqrobacterium é resistente à estreptomicina e contem o plasmídeo pAL4404 sem braços Ti (Ooms et al.. Plasmid 7: 15-29, 1982) este plasmídeo Ti contribui para as funções de transactuação de virulência necessárias para facilitar a transferência da região de T-DNA baseado em pBIN19 para o cromossoma de tabaco. A conjugação triparental dos vecto-res baseados em pBIN19, o plasmídeo conjugativo (pRK2013) e a estirpe de Aqrobacterium (LBA4404), foram realizados essencialmente como descrito por Bevan (Nucl. Acids Res. 12: 8711-8721, 1984). Os plasmídeos pAC348-351 (Kanr) e pRK2013 (Kanr) e pRK2013 (Kanr) foram usados para transformar células competentes de E. coli HB101 ou XL-1 como descrito anteriormente. Os transformantes contendo cada um dos plasmídeos foram inoculados em culturas de 3 ml de caldo de LB^ane incubados a 37°C com agitação constante. Aqrobacterium estirpe LBA4404 foi inoculado em meio ABestr (20 x AB é 20g NH4C1, 6g MgS04-7H20, 3g KC1, 60 g K2HP04, 20g NAH2P04, 3g CaCl2 e 50 mg FeS04~7H20. A glucose é adicionada de um stock lx para uma concentração final de 0,5x) e incubado com agitação constante a 28°C durante 36-48 hr. A conjugação triparental é iniciada por combinação de 1 ml de cada uma das três culturas (uma construção baseada em pBIN19, pRK20l3 e LBA4404) num tubo estéril e continuação da incubação a 28°C durante 1 hr. A cultura foi concentrada via vácuo através de um filtro 0,45 Mm e incubada durante a noite a 28°C numa placa NB (NB é 4g de pó de caldo nutriente Difco e 10 ml de 1M Tris-HCl, pH 7,2). O filtro foi colocado em 2 ml de meios AB frescos e rodado lentamente durante 1 hora. Uma série de diluições foi espalhada em placas ^®estre-/can e incubada a 28°c durante 3-4 dias. Apenas Agrobacterium (estre^) portadora da construção baseada em pBIN19 (canr) cresceu em meio ÀBestrep/can* c°l°nias isoladas a partir de placas -27-

^estrep/can foram inoculadas em caldo ABegtrepòkn e incubadas a 28°C com agitação constante durante 36-48 horas. Estas culturas foram novamente inoculadas em placas ^ . . , r estrep/can' 28°C durante 3-4 dias e guardadas a 4°C até serem usadas.

(c) Transformação de tabaco mediada por Agrobacterium pAC348 e pAC351foram inoculadas em 50 ml de AB can

eincubadas com agitação constante a 28eC durante 36-48 horas. As bactérias foram sedimentadas por centrifugação a 2500 rpm durante 10 minutos numa centrífuga de bancada Damon/IEC. 0 sedimento de bactérias foi ressuspenso em 5 ml de meio BAT (meio BAT é lx sais MS (Murashige e Skoog, Plant Physiol. 15: 473-497, 1962) lx vitaminas B5 [lOOx B5 é 10 mg de mio-inositol, 100 mg de ácido nicotínico, 100 mg de piridoxina-HCl e lOOOmg de Tiamina-HCl por 1 litro], 3% sucrose, 5 μΜ 6-benzilaminopurina a pH 5,7). Folhas jovens de tabaco Wisconsine 38 crescidas em estufa foram cortadas em 2 secções longitudinais e embebidas em água quente contendo sabão de mãos ivory. As secções de folhas foram lavadas em água destilada estéril, embebidas numa solução a 10% de Clorox + Tween 20 durante 10 minutos com agitação e lavadas com H2Q aestiiada

incubadas

AB

Os discos foram cortados das secções de folha usando uma furadeira de cortiça ou punção de buracos. Estes discos são colocados num tubo de 50 ml contendo a cultura de Agrobacterium ressuspen-sa. A suspensão foi misturada suavemente durante 5 min e enxuta sobre uma toalha de papel estéril e cultivada em placas de meio BAT (100 placas de 200 mm com aproximadamente 10 discos por placa). As placas foram incubadas a 25°C com luz fluorescente durante 48 horas. Os discos foram então transferidos para meio de selecção (BATCK; meio BAT mais carbenicilina ecanamicina) e voltaram para as condições de incubação iniciais até à formação de rebentos, os rebentos resistentes à canamicina foram transferidos para meio de selecção OTCK (enraizamento) (o meio OTCK é meio BATCK menos 6-benzilaminopurina) em caixasde Magenta (GA7) e continuaram ascondições de incubação anteriormente descritas. Quando os rebentos resistentes à canamicina formaram um sistema radicular apreciável (pelo menos 3 raízes com comprimentos superiores a lcm), as plantas foram transferidas para o solo. Resumidamente, o rebento baseado em agar foi removido da caixa GA7, o agar foi cuidadosamente removido por lavagem com água da torneira quente e os rebentos foram transferidos para metromix em potes de turfa em vasos GA7. As plantas forma colocadas na estufa e deixadas a fortalecer. Um total de 5 rebentos resistentes à canamicina contendo pAC348 e 9 rebentos resistentes à canamicina contendo pAC350 foram transferidos para o solo. Aproximadamente 10-14 dias mais tarde, os potes de turfa foram transplantados para potes maiores. pAC348 pAC351

Transformante #: Transformante #; 1) 19-1 1) 10-1 2) 33-1 2) 20-1 3) 33-1 3) 20-2 4) 46-1 4) 20-3 5) 46-2 5) 27-1 6) 27-2 7) 27-3 8) 30-1 9) 42-4

EXEMPLO IV

Determinação e Caracterização de Mutantes que Conferem Resistência a Herbicidas

Ensaio da enzima AHAS (tecido foliar) - Pouco após a transferência para a estufa, prepararam-se extractos de cada um dos transformantes resistentes à canamicina e testaram-se relati- r vamente à insensibilidade ao herbicida imidazolinona Pursuit .A aceto-hidroxiácido-sintetase foi extraída e testada como descrito na secção anterior. Dois transformantes resistentes à canamicina (33-1 e 46-2) que contêm o alelo mutante da substituição Trp574—>Leu do alelo AHAS de Arabidopsis apresentam actividade

R AHAS na presença do herbicida Pursuit . Em adição, a actividade de AHAS de um transformante de deleção resistente à canamicina

R (10-1) apresenta insensibilidade à adição do herbicida Pursuit (Figura 7). Este transformante de deleção Trp574 foi autocruzado e cruzado com progenitores Wisconsin 38. A progénie de 10-1 apresenta tolerância a aplicações pós-emergência do herbicida Pursuit 4-8x superior à concentração letal para plantas do tabaco testemunha.

As Figuras 2(a)-(c) mostram comparações fotográficas dos fenótipos dos cruzamentos e testemunhas discutidas atrás. Estas observações indicam a herança da resistência observada no ensaio AHAS inicialde tecido foliar transformado e expressão desta característica a nível de planta completa.

Num ensaio mais quantitativo, sementes de progénie do autocruzamento do tabaco transgénico (10-1) contendo a mutação de deleção Trp574 de AHAS Arabidopsis assim como sementes do cultivar parental susceptível "Wisconsine 38" foram semeadas em Metro Mix 350 em vasos Azalea de 5 polegadas. As plantas derivadas das Ά \ -30-

sementes espalhadasapós dois dias para fortalecimento. Onze dias

mais tarde, estas plantas foram vaporizadas apôs emergência com R

Pursuit a 0, 10, 20, 40, 80 e 160 g/ha. Cinco plantas de cada tipo de tabaco (transgénicas e testemunha) foram vaporizadas para cada concentração de herbicida. Tween 20 foi adicionado a 0,25 v/v às soluções de herbicida antes da vaporização. O herbicida foi aplicado com um vaporizador de laboratório de correia numa concentração de 4001/ha a uma distância de 18 polegadas acima das plantas com uma velocidade de correia de 8,2 seg/rev e bocal de vaporizador #65015E. As alturas das plantas foram medidas 1, 2, 3, e 4 semanas após o tratamento, os dados do peso fresco das plantas foram colhidos às quatro semanas e meia.

Os resultados destas vaporizações estão descritos na Figura 4. Os resultados da progénie no gráfico estão apresentados com o indivíduo mais tolerante em primeiro lugar e o indivíduo mais susceptivel em último lugar para cada concentração de herbicida. Como se pode ver por este gráfico e como seria de esperar de uma progénie de autocruzamento da planta transgénica original, a progénie é segregada relativamente à tolerância ao herbicida. Podem ser observados tanto a progénie susceptivel como os indivíduos com vários graus de tolerância ao herbicida.

Os pesos frescos das plantas (g) e médias para cada concentração de herbicida estão apresentados na Tabela 2 com os pesos frescos médios (g) resumidos abaixo (Tabela 1): ,'χ . ·

Tabela 1

Peso Fresco médio do tabaco: Testemunha Progénie Transgénica (5 reps cada)

Concentração de herbicida: 0 g/ha 52,1 53,7 10 g/ha 8,1 36,4 20 g/ha 2,0 to 00 00 40 g/ha 0,8 20,9 80 g/ha 0,6 26,5 160 g/ha 0,2 21,4

Como se pode ver por esta tabela, a progénie autocruza-da da planta do tabaco transgénica (10-1) apresentou um elevado grau de tolerância ao Pursuit aplicado apôs emergência. 0 cultivar parental susceptível não apresenta tolerância aos herbicidas em qualquer uma das concentrações usadas.

As sementes resultantes da planta transgénica 10-1 foram também testadas quanto á resistência à imidazolinona Pursuit . As sementes foram semeadas em meio contendo Pursuit a 0, 1,25, 2,5, 3,75 e 5,0 μΜ . Vinte sementes foram semeadas por placa de Petri com duas placas por tratamento. A tolerância aos herbicidas das plantas derivadas de sementes foi avaliada três semanas mais tarde. Os resusltados do tratamento com 5,0 μΜ estão apresentados na Tabela 2. mesmo na concentraçã mais baixa (tratamento com 1,25 μΜ), ads plantas testemunha apresentam sensibilidade ao herbicida. Estes resusltados ilustram a hereditariedade da caracterxstica de resistência a herbicidas da planta parental 10-1 para a sua progénie.

Tabela 2

Resultados do ensaio com sementes do tabaco p Concentração de Pursuit : 5 s* D R Progénie: W38 (selvagem) 20 0 0 20 0 0 10-1 autocruzada 7 6 6 3 11 6 10-1 x 0 11 9 0 11 9 0 0 X 10-1 10 9 0 8 8 0 * S = Susceptível; D = Danificado; R = Resistente

EXEMPLO V

Ensaio Enzimático de AHAS em E. coli

Ensaio com enzima AHAS (expressão em E. coli) - Os mutantes dirigidos, pAC224 e pAC225, foram utilizados como moldes para a geração de um sistema de expressão baseado em E. coli. A insensibilidade ao herbicida foi testada quando o gene da planta superior com interesse é expresso numa estirpe bacteriana sem qualquer actividade AHAS endógena. Com esta finalidade, o fragmento NcoI/PstI de AHAS de Arabidoosis selvagem (pAC301), a -33- -33-

-V - substituição Trp574-Leu (pAC224) e a deleçãa: Trp574 (pAC225) foram subclonados no sítio NcoI/PstI do vector de expressão de E. coli. pKK233-2 (adquirido à Pharmacia). Este plasmídeo de expressão contem um promotor induzível IPTG assim como uma sequência de termibnação da transcrição. Ambas as regiões rodeiam uma sequência de adaptadores Ncol, HindIII e PstI que permite a orientação correcta do gene com interesse em relação ao promotor bacteriano. A subclonagem e ligação dos respectivos fragmentos NcoI/PstI no DNA de pKK233-2 digerido com NcoI/PstI (resistência à ampicilina) foi como anteriormente descrito. A reacção de ligação foi usada para transformar E. coli estirpe MF2000 [ilvB800:mu-l, Bgl32, ilvI15, thi-1, argE3, RPSL31, (ara-leu, ilvHI) 863, mtl-1, xyl-5, galK2, lacYI, recAl]. Esta estirpe bacteriana não possui activi-dade endógena de AHAS. Portanto, o crescimento num meio mínimo sem isoleucina e valina (os produtos finais da via de biossíntese de aminoãcidos na qual a enzima AHAS está envolvida) numa estirpe MF2000 transformada com pAC224 (trp574-Leu) ou pAC225 (Trp del) requere a expressão e função do gene de Arabidopsis em E. coli. Cada uma das três construções complementa MF2000 em meio com agar assim como em culturas em caldo.

Colónias isoladas de MF2000 contendo a construção de plasmídeo pAC210, pAC224 ou pAC225 foram inoculadas em culturas em caldo de 3 ml de meio mínimo M63 (amp) contendo os aminoãcidos arginina, leucina, isoleucina e valina. [M63 é 30 g de KH2P04, 70g de K2HP04, 20 g de (NH4)2S04, 5 mg de FeSC>4, 100 μΐ de 1M MgS04, 200 μΐ de tiamina. A concentração de glucose oi aumentada para 1,2%]. As culturas foram incubadas durante a noite a 37°C com agitação constante. As células bacterianas foram sedimentadas, ressuspensas em vários ml de M63 (amp) suplementado com arginina e leucina, mas sem isoleucina e valina (meio ilv menos). As células foram transferidas para 10-50 ml de meio ilv menose agitação constante a 37°C continuou durante a noite. As células ->v Γ foram sedimentadas e usadas directamente em ensàios enzimáticos de AHAS ou congeladas a -20°C até serem usadas. A extracção e ensaio de AHAS de Arabidoosis em células bacterianas foi essencialmente como descrito por Singh, et al., (J. Chromatography 444: 251-261, 1988). O sedimento de bactérias foi reduzido a pó em azoto líquido e homogenizado em tampão de fosfato de potássio 100 mM (pH 7,5) contendo piruvato 10 mM, cloreto de magnésio 5 mM, Na2~EDTA 5 mM, flavina-adenina-dinucleó-tido (FAD) ΙΟΟμΜ, valina lmM, leucina lmM, 10% (v/v) de glicerol e cxsteina lOmM. O homogenato foi filtrado através de um filtro de nylon (53 μΜ mesh) e centrifugado a 25000 xg durante 20 minutos. A fracção de sobrenadante foi levada a 50% de saturação relativamente a sulfato de amónio e deixou-se em repouso durante 20-30 minutos em gelo. 0 precipitado foi sedimentado via centrifugação a 25000 xg durante 20 minutos. 0 sobrenadante foi rejeitado e o sedimento de sulfato de amónio foi usado imediatamente ou congelado com azoto líquido e guardado a -20°c até ser usado. A actividade AHAS na presença ou ausência de herbicida foi medida por cálculo do produto acetolactato, após conversão por descarboxilação ácida para acetoína. As misturas de reacção convencionais contêm a enzima (e herbicida) em tampão fosfato de potássio 50 mM (pH 7,0) contendo piruvato de sódio 100 mM, cloreto de magnésio 10 mM, pirofosfato de tiamina (TPP) lmM e FAD 10μΜ. Esta mistura foi incubada a 37°C durante 1 hr. A reacção foi parada com a adição de ácido sulfúrico para dar uma concentração final de 0,85%. O produto de reacção foi deixado a descar-boxilar a 60°C durante 15 minutos. A acetoína formada foi determinada por incubação com creatina (0,17%) e 1-naftol (1,7%) pelo método de Westerfeld (J. Biol. Chem. 161:495-502, 1945). Durante os ensaios das enzimas foram feitos os testes adequados da formação directa de acetoína. AHAS selvagem de Arabidopsis (pAC201)' ê sensível ao

R herbicida imidazolinona Pursuit e o herbicida sulfonilureia 15

Glean enquanto tanto a substituição Trp574-Leu como a deleção Trp574 (pAC225) são insensíveis a concentrações crescentes do herbicida Pursuit (Figura 4) e do herbicida Glean (Figura 5). Surpreendentemente, a deleção confere um nível de insensibilidade a estes herbicidas que é equivalente ou superior ao da correspondente substituição. Portanto, a deleção do resíduo Trp574 da região codificadora de AHAS de Arabidopsis resulta numa forma funcional da enzima que é insensívelà adição de dois herbicidas não relacionados capazes de inibir a forma selvagem da enzima.

Os processos referidos atrás também são usados para criar substituição de uma arginina por uma serina na posição 653, assim como uma deleção nesta posição. Os plasmídeos contendo a substituição (pAC229) ou a deleção (pAC230) foram usados para transformar E. coli MF2000 e e determinada a actividade de AHAS dos mutantes de deleção e substituição na presença de herbicids Pursuit e Glean para cada um como descrito atrás. 0 AHAS produzido por substituição de asparagina por serina é insensível à inibição por Pursuit (Figura 6) como anteriormente descrito (Sathasivan et al.f supra), mas sensibilidade a Glean foi apenas ligeiramente reduzida (cerca de 10%) comparado com a enzima selvagem (Figura 7). Pelo contrário, a AHAS produzida pela deleção Ser653 é altamente resistente à inibição por Pursuit e Glean (Figuras 6 e 7).

DEPÓSITOS DE MATERIAIS BIOLÓGICOS

Os microorganismos que se seguem foram depositados na American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, 20857, em 6 de Dezenmbro, 1990 e dado os números de acesso como se segue:

Microorcranismo_Ns de Acesso

Agrobacterium estirpe LBA4404 68488 portadora de pAC351 (Agro/351) [deleção Trp574] 68489

Agrobacterium estirpe LBA4404 portadora do plasmídeo pAC324 [deleção Ser653]

Claims (3)

1. REIVINDICAÇÕES: ia. - Método para a expressão de uma enzima sintetase de aceto-hidroxiácidos (AHAS) resistente a herbicidas numa célula hospedeira, caracterizado por compreender a transformação da célula hospedeira com uma sequência de ácido nucleico codificadora de uma enzima AHAS funcional, enzima essa que tem uma sequência de aminoácidos a qual difere da da sequência de AHAS tipo selvagem por ter pelo menos uma deleção de aminoácidos que confere à enzima resistência a herbicida, e a cultura da célula hospedeira em condições que permitem a expressão da enzima.
2. 2 a. - Método de acordo com a Reivindicação lcaracteri-zado por se encontrar presente uma deleção numa região conservada da sequência AHAS.
3. 3 â. - Método de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1-2, caraterizado por ocorrer uma deleção numa região da sequência tipo selvagem de AHAS de Arabidopsis seleccionada de entre o grupo constituído pelos aminoácidos 119-122, 194-197, 201-208, 255-257, 348-353, 373-377, 569-578 e 650-653, ou as regiões homólogas numa espécie diferente. 4â. - Método de acordo com as Reivindicações 1-3, caracterizado por a deleção ocorrer em pelo menos uma posição seleccionada de entre o grupo constituído pelos aminoácidos 121, 122, 197, 205, 256, 351, 376, 571, 574, 578 e 653. 5â, - Método de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1-4, caracterizado por a resistência ser a pelo menos um herbicida seleccionado de entre o grupo constituído por uma imidazolinona, uma sulfonilureia e uma triazolopirimidina. 6a. - Método de acordo cora qualquer uma dasReivindica-ções 1-5, caracterizado por a célula hospedeira ser uma célula vegetal. 7 â. - Método de acordo com a Reivindicação 6, caracterizado por a célula vegetal transformada ser regenerada para dar uma planta madura expressando um fenótipo de resistência a herbicidas. 8a. - Método para a produção de um vector útil para conferir resistência a herbicidas a uma célula hospedeira, caracterizado por compreender a ligação num vector adequado de uma sequência de ácido nucleico codificadora de uma enzima AHAS funcional, enzima essa que tem uma sequência de aminoácidos diferindo da AHAS tipo selvagem por ter pelo menos uma deleção de aminoácidos que confere à enzima resistência a herbicidas. 9a. - Método para conferir resistência a herbicidas a uma célula vegetal, caracterizado por se fornecer à célula vegetal uma sequência de ácido nucleico codificadora de uma enzima AHAS funcional, enzima essa que tem uma sequência de aminoácidos que difere de uma sequência AHAS tipo selvagem por ter pelo menos uma deleção de aminoácidos que confere à enzima resistência a herbicidas. 10a. - Método para o crescimento de plantas resistentes a herbicidas, caracterizado por compreender a cultura de uma planta que produz uma enzima AHAS funcional com uma sequência de aminoácidos que difere da sequência tipo selvagem de AHAS por ter pelo menos uma deleção de aminoácidos que confere à enzima resistência a herbicidas, na presença de uma quantidade inibidora do herbicida. -39- 11a. - Método de selecção de células hospedeiras transformadas com êxito com um gene de interesse, caracterizado por se fornecer às células hospedeiras prospectivas o gene com interesse ligado a uma sequência de ácido nucleico codificadora de uma enzima AHAS funcional, enzima essa que tem uma sequência de amnoácidos que difere da sequência AHAS tipo selvagem por ter pelo menos uma deleção de aminoácidos que confere â enzima resistência a herbicidas, crescimento das células na presença de uma quantidade inibidora de um herbicida e identificação das células sobreviventes como contendo o gene com interesse. Lisboa 20 de Dezembro de 1991

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