RO116777B1

RO116777B1 - Analog de peptida p277, compozitie farmaceutica si metoda pentru diagnosticarea diabetului mellitus insulino-dependent, cu acesta

Info

Publication number: RO116777B1
Application number: RO97-01173A
Authority: RO
Inventors: Irun R Cohen; Dana Elias; Matityahu Fridkin
Original assignee: Yeda Res & Dev
Priority date: 1994-12-21
Filing date: 1995-12-20
Publication date: 2001-06-29
Also published as: AU4686696A; SI0820303T1; MX9704738A; HU224160B1; JP3554319B2; KR100400480B1; CN1233417C; JP3420245B2; ES2201137T3; DE69531004T2; PL321091A1; HUT78092A; EP0820303A1; RS49517B; IS4510A; BR9510102A; NO972849L; NZ301440A; IS1966B; EP0820303A4

Abstract

Prezenta inventie se refera un analog de peptida p 277, la o compozitie farmaceutica si la o metoda pentru diagnosticarea diabetului Mellitus insulino-dependent, cu acesta. Analogul de peptida, conform inventiei, este constituit din secventa DI nr.2: Val-Leu-Gly-Gly-Gly-X1Ala-Leu-Leu-Arg-X2-Ile-Pro-Ala-Leu-Asp-Ser-Leu- X3-Pro-Ala-Asn-Glu-Asp in care X1 si X2 este fiecare un fragment Cys sau Val si X3 este un fragment Thr sau Lys, dar X1 si X2 nu pot fi amandoi fragmentul Cys, cand X3 este Thr si saruri si derivati functionali ai acestuia. Compozitia farmaceutica, conform inventiei, cuprinde un analog de peptida p277 cu secventa mentionata intr-o cantitate eficienta si un purtator acceptabil farmaceutic si este utilizata pentru prevenirea si tratarea diabetului Mellitus insulino-dependent. Metoda pentru diagnosticarea diabetului Mellitus insulino-dependent, conform inventiei, consta in testarea sangelui sau a urinei cu ajutorul unui analog de peptida p277, folosit ca antigen pentru determinarea prezentei anticorpilor sau celulelor T, care reactioneaza imunologic cu hsp60 uman, cu ajutorul careia, se observa prezenta pozitiva a anticorpilor anti-hsp60 sau celulelor T care imuno-reactioneaza cu hsp60, indicand o mare posibilitate ca diabetul Mellitus insulino-dependent sa fie prezent intr-o stare incipienta.

Description

Prezenta invenție se referă la un analog de peptidă p 277, o compoziție farmaceutică și la o metodă pentru diagnosticarea diabetului Mellitusinsulino dependent, cu aceasta.

Diabetul de tip I sau IDDM este o boală autoimună, cauzată de celeule T, care atacă și distrug celulele β producătoare de insulină, care sunt localizate în insulele pancreasului (Castano și Eisenbarth, 1990). Procesul autoimun, care culminează cu IDDM, începe și apoi progresează fără simptome. Boala debutează clinic numai când pierderea cumulativă de celule β este mai mare decât capacitatea celulelor β reziduale de a suplini insulina. într-adevăr, colapsul homeostatic de glucoză precum și cel clinic IDDM se crede că apare numai după ce 80...90% din celulele β sunt inactivate de către sistemul imunitar. Astfel, pacienții care sunt identificați că suferă de IDDM sunt într-un stadiu avansat de distrugere a autoimunității celulelor β. Mai mult, diagnosticul de diabet incipient, preclinic, prin detecția markerilor imunologici ai celulelor β autoimune, se poate stabili numai după izbucnirea procesului autoimun. De aceea, scopul terapeutic este de a găsi o cale sigură, specifică și efectivă de a întoarce un proces autoimun, care deja este pe cale să se desfășoare.

Autorii acestei invenții au examinat această întrebare, înainte de a studia diabetul dezvoltat în mod spontan, în șoarecii de rasă NOD, care se consideră că este un model foarte apropiat de cel uman IDDM (Castano și Eisenbarth, 1990). Șoarecii NOD prezintă insulitis, în jurul vârstei de 4 săptămâni, care începe cu o ușoară infiltrare perinsulară și evoluează la o inflamație severă intrainsulară. Hiperglicemia care atestă o insuficiență de insulină, apare la femelele din colonie la vârsta de aproximativ 14...17 săptămâni. La vârsta de 35...40 de săptămâni, aproape toate femelele șoarece prezintă diabet sever și majoritatea mor, în lipsa unui tratament cu insulină. Masculii șoarece NOD prezintă o incidență mai mică a bolii, din motive care nu sunt clare. Diabetul la șoarecii NOD că este cauzat de celulele T autoimune (Bendelac et al., 1987).

Reactivitatea celulelor T și autoanticorpii diferiților antigeni au fost detectate în pacienții umani cu IDDM ca și în șoarecii NOD (Elias, 1994) și nu este clar dacă imunitatea unui singur antigen din mai mulți posibili antigeni, care sunt țintiți, este prima cauză a bolii. în spatele întrebării despre cauza acestei boli stă întrebarea despre terapia ei.

S-a demonstrat că inițierea procesului autoimun în șoarecii NOD poate fi prevenită, prin introducerea, la șoareci, înainte de izbucnirea diabetului, a unor diferite elemente cum ar fi dietă, infecții virale sau stimulări nespecifice ale sistemului imunitar restrictive (Bowman et al., 1994). Diabetul la NOD se poate, totodată, preveni prin inducerea unei toleranțe imunologice la șoarecii pre-diabetici la antigenul decarboxilazei acidului glutamic (GAD) (Kaufman et al., 1993; Tisch et al., 1993).

Invenția se referă la un analog de peptidă p 277, constituit din secvența Dl nr.2;

11 Val-Leu-Gly-Gly-Gly-X.j-Ala-Leu-Leu-Arg-Xg-lle-Pro-Ala-Leu-Asp-Ser19

Leu-X₃-Pro-Ala-Asn-Glu-Asp în care X_n și Xg este, fiecare, un fragment Cys sau Val și este un fragment Thr sau Lys, dar X₁ și Xg nu pot fi amândoi fragmentul Cys când Xg este Thr și săruri și

RO 116777 Bl derivați funcționali ai acestuia; analogul de peptidă p277 este ales din analogi de peptidă p₂₇₇(Val⁶), în care X, este Val, Xg este Cys, iar Xj este Thr; p^77(Val¹¹Xn care X! este Cys, este Val, iar Xg este Thr; p277(Val⁶ - Val¹¹) unde ambele Xt și sunt Val și X3 este Thr; p277(Lys¹⁹) unde ambele X, și Xg sunt Cys și Xg este Lys; p277(Val⁶- 50

Lys¹⁹) unde Xq este Val, X2 este Cys și X3 este Lys; p277(Val¹¹ - Lys unde X, este Cys, X2 este Val, iar X₃ este Lys; p₂₇₇(Val^6,11-Lys¹⁹) unde Xt și X2 sunt Val și X3 este Lys; analogul de peptidă este ales dintre p277(Val¹¹)în care Xd este Cys, X₂ este Val, iar X₃ este Thr; p₂₇₇(Val⁶-Val¹¹) unde ambele X, și X, sunt Val și X3 este Thr; f^77(VăT Lys¹⁹) X·! este Cys, X2este Val, și X₃este Lys; analogul de peptidă este p ₂P/al - ⁶ 55

Val¹¹); analogul de peptidă este utilizat la prepararea unei compoziții pentru diagnosticarea diabetului Mellitusinsulino dependent; analogul de peptidă poate activa celulele T umane, care manifestă specificitate față de secvența p277 a hsp6O uman; analogul de peptidă cu celulele T umane sunt autoloage cu celulele T, obținute de la pacientul cu diabet Mellitusinsulino dependent, care este tratat, iar specificitatea celulelor Ta 6 o fost dezvoltată printr-un contact in vitro cu analogul de peptidă p₂₇₇ definit în revendicarea 1; celulele T au specificitate in vitro pentru analogul de peptidă p₂₇₇ definit în revendicarea 1; Compoziția farmaceutică cuprinde un analog de pepetidă p₂₇₇cu secvența manționată într-o cantitate eficientă și un purtător acceptabil farmaceutic și este utilizată pentru prevenirea și tratarea diabetului Mellitusinsulino dependent; 65 Compoziția farmaceutică cuprinde analogul de pepetidă p₂₇₇ care este ales dintre p₂₇₇(Val⁶), în care X, este Val, \ este Cys, iar este Thr; ^77(Val¹¹) în care X, este Cys, X2 este Val, iar X₃ este Thr; p₂₇₇(Val⁶-Val¹¹) unde ambele Χή și X2 sunt Val și X3 este Thr; p277(Lys¹⁹) unde ambele X, și sunt Cys și K, este Lys; p^77(VaF-Lys¹⁹)unde

X_n este Val, Xg este Cys și Xg este Lys; p^₇₇(Val¹¹-Lys¹³) unde X, este Cys, este Val, 7o iar X₃ este Lys; p₂₇₇(Val⁶¹¹-Lys¹⁹) unde X., și X2 sunt Val și X3 este Lys; Compoziția farmaceutică cuprinde analaogul de peptidă p277 ales dintre p277(Val¹¹), în care X1 este Cys, X₂ este Val, iar X₃ este Thr; p₂₇₇(Val⁶-Val¹¹) unde ambele Xq și X2 sunt Val și X3 este Thr; p277(Val¹¹-Lys¹⁹) unde Χή este Cys, X₂ sunt Val și X₃ este Lys și p₂₇₇(Val⁶·¹¹Lys¹⁹) unde ambele X! și X2 sunt Val și X3 este Lys; Compoziția farmaceutică cuprinde 75 analogul de peptidă p277(Val⁶-Val¹¹). Metoda pentru diagnosticarea diabetului Mellitus insulino-dependent cuprinde testarea sângelui sau a urinei cu ajutorul unui analog de peptidă p277, folosit ca antigen pentru determinarea prezenței anticorpilor sau celulelor T, care reacționează imunologic cu hsp6O uman cu ajutorul căreia se observă prezența pozitivă a anticorpilor anti-hsp6O sau celulelor T, care imuno-reacționează cu 8 o hsp6O, indicând o mare posibilitate ca diabetul Mellitus insulino dependent să fie prezent într-o stare incipientă. Metoda pentru diagnosticarea diabetului Mellitus insulino-dependent incipient indică prezența anticorpilor anti-hsp6O care este testată cu ajutorul unei analize de radioimunologie sau al unui test ELIZA. Metoda pentru diagnosticarea diabetului Mellitus insulino-dependent incipient indică faptul că prezența 8 5 unei celule T, care imuno-reacționează cu hsp6O, este testată printr-un test de proliferare a celulelor T care cuprinde etapele:

i/ se prepară o fracție de celule mononucleare, conținând celule T dintr-o probă de sânge de la pacient;

ii/ se adaugă la fracția de celule mononucleare un antigen ales dintre un 9o analog de peptidă p₂₇₇ din revendicarea 1;

iii/ se incubează fracția de celule în prezența antigenului pentru o anumită perioadă de timp și în condiții corespunzătoare unei culturi;

RO 116777 Bl iv/ se adaugă o nucleotidă inscripționată în cultura de celule incubate la faza (iii) pentru o perioadă de timp corespunzătoare, înainte de sfârșitul perioadei de incubare, pentru a asigura încorporarea nucleotidei inscripționate în AND-ul celulelor T care proliferează;

v/ se determină o cantitate de celule T care proliferează prin analizarea cantității de nucleotidă inscripționată, incorporată în celule T; Metoda pentru diagnosticarea diabetului Mellitus insulino-dependent incipient indică prezența unei celule T, care imuno-reacționează cu hsp6O și care este testată printr-un test de răspuns la citocină a celulelor T care cuprinde etapele:

i/ se prepară o fracție de celule mononucleare conținând celule T dintr-o probă de sânge de la pacient;

ii/ se adaugă la fracția de celule mononucleare un antigen ales dintre un analog de peptidă p₂₇₇ din revendicarea 1;

iv) se măsoară prezența citocinei secretate de limfocite în mediu, în care citocină este IFN-gama, IL-2, IL-4, IL-6, IL-1O, TFN-alfa sau TFN-beta.

Inventatorii au descoperit, anterior, că diabetul la șoarecii NOD poate fi prevenit prin vaccinarea celulelor T, folosind celule T exact pentru secvența de peptidă p277 din molecula umană hsp6O (Elias et al., 1991). Această proteină a fost mai înainte denumită hsp65, dar acum se numește hsp6O pentru o vedere mai clară a informației despre greutatea moleculară; oricare ar fi denumirea, proteina este aceeași.

Peptidă p277 fiind epitopul proteinei umane hsp6O implicată în IDDM și care corespunde pozițiilor 437 - 460 din secvența umană hsp6O, a fost prima descrisă în brevetul israelian 94241 al actualului solicitant precum și în Elias and Cohen, 1994, și are următoarea secvență:

Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Cys-Ala-Leu-Leu-Arg-Cys-lle-Pro-Ala-Leu-Asp-Ser-Leu-Thr-Pro-Ala-AsnGlu-Asp (Secvența ID nr. 1)

Administrarea peptidei p277 însăși, la izbucnirea insulitisului a fost arătată tot pentru a preveni dezvoltarea diabetului, probabil prin reglarea scăzută a imunității antip277 care este esențială pentru diabetul NOD (Elias et al., 1991; Israeli Patent Application 94241). Studiile recente au arătat că peptidă p277 poate fi, de asemenea, utilizată pentru a inversa autoimunitatea celulei β care a evoluat la un stadiu avansat (Elias and Cohen, 1994).

Laboratorul în care au lucrat prezenții inventatori a raportat, recent, că o formă de diabet autoimun poate fi indus în sodiul C57BL/KsJ de șoareci prin administrarea unei doze foarte mici de streptozotocină toxică în celulele β (STZ) (Elias et al., 1994). Dacă standardul de doză mică de STZ de 40 mg/kg administrată zilnic timp de 5 zile, în mod uzual induce diabetul clinic într-o perioadă de 3 săptămâni, administrarea de 30 mg/kg, timp de 5 zile, induce diabetul clinic după numai o perioadă de aproximativ 3 luni. Acest model de diabet indus este marcat de apariția, în perioada de prodrom, a autoanticorpilor pentru insulină, anticorpii anti-idiotipic pentru autoanticorpii insulinei și autoanticorpii pentru hsp60. Șoarecii, de asemenea, manifestă reactivitate spontană a celulelor T la hsp6O și la peptidă acestora p277 (Elias et al., 1994). Astfel, se pare că doza mai mică decât doza standard de STZ pare să impulsioneze procesul autoimun nu în mod neplăcut ca acela observat în dezvoltarea spontană a diabetului în șoarecii NOD (Elias etal., 1990).

RO 116777 Bl

Un obiectiv al prezentei invenții este de a prezenta variante ale peptidei p277, astfel de variante fiind utile pentru diagnosticarea și tratamentul IDDM.

într-un studiu al fragmentelor și variantelor peptidei p277, s-a descoperit, în mod neașteptat, că peptidele în care restul de bază al treoninei este înlocuit cu restul lizină și/sau una sau ambele resturi cisteină sunt înlocuite cu restul valină, sunt la fel 145 de active ca p277 în tratamentul diabetului. Aceste rezultate sunt și mai surprinzătoare, de când înlocuirea resturilor cisteină prin resturile serină au loc în peptidele inactive.

De aceea, prezenta invenție se referă la o peptidă care cuprinde secvența I:

11 150

Val-Leu-Gly-Gly-Gly-X^AIa-Leu-Leu-Arg-X^lle-Pro-Ala-Leu-Asp-Ser19

Leu-X₃-Pro-Ala-Asn-Glu-Asp în care X, și X₂ fiecare este un rest Cys sau Val și X₃ este un rest Thr sau Lys, dar X! și X₂ nu pot fi ambele resturi Cys când X₃ este Thr. 155 în realizările specifice ale invenției, peptidele constau din secvența I în care ambele X, și X₂ sunt Cys iar X₃ este Lys, în p277(Lys¹⁹) (Secvența ID nr.3) sau X τ este Val, X2 este Cys iar Xg este Thr sau Lys, în p277(Lys¹⁹) (Secvența ID nr.4) și, respectiv p277(Lys¹⁹ (Secvenșa ID nr.5); sau Xt este Cys, este Val și X3 este Thr sau Lys, în p277(Val¹¹) (Secvența ID nr.6) și, respectiv, p277(Val¹¹-Lys¹⁹) (Secvența ID 160 nr.7]; sau ambii X, și X2 sunt Val iar X ₃este Thr sau Lys, în p277 (Val⁶-Val¹¹) (Secvența ID nr.8) și, respectiv, p277(Val^6,11' Lys (Secvența ID nr.9). Peptida p277(Val⁶-Val¹¹) ne vom referi la ea aici ca la p277(V).

Invenția descrie și o metodă și un chit pentru diagnosticarea timpurie a IDDM, folosind peptida cu secvența I din această invenție. Pe parcursul dezvoltării IDDM, ani- ies malele au molecule hsp6O sau molecule care interreacționează cu acestea și care își fac drum în sângele sau urina animalelor. Ele totodată au anticorpi și celule T, care sunt îndreptate exact spre astfel de molecule. Astfel, prezența hsp60 (sau a moleculelor care interreacționează cu acestea) sau anticorpilor sau celulelor T prezente în mod specific în urină sau sânge, servesc pentru încercarea depistării procesului 170 IDDM, înainte ca distrugerea celulelor beta să fie completă și, individual, să fie condamnat la o viață întreagă cu diabet.

Prezența sau starea incipientă a IDDM, la un pacient, poate fi diagnosticată prin testarea urinei sau sângelui respectivului pacient pentru detectarea prezenței anticorpilor anti-hsp6O sau a celulelor T care sunt imunologic active cu hsp6O uman, 175 folosind ca antigen o peptidă cu secvență I din aceasta invenție. într-adevăr, oricare dintre procedurile anterioare descrise ca fiind operabile, folosind peptida p277, cum ar fi cele descrise în PCT publicat sub WO 90/10449, care este citat aici ca referință, pot fi folosite substituind peptida p277 cu secvența I, din prezenta invenție.

în conformitate cu aceasta, prezenta invenție descrie o metodă pentru diagnos- 180 ticarea prezenței sau stării incipiente a IDDM la un pacient, care cuprinde testarea pacientului pentru determinarea prezentei anticorpilor anti-hsp60 sau a celulelor T care imunoreacționează cu hsp60, cu ajutorul acestui test, se obține un rezultat care indică prezența pozitivă a anticorpilor anti-hsp60 sau a celulelor T care imunoreacționează cu hsp60 sau o celulă T sau a celulelor T care imunoreacționează cu 18 5 hsp6O, indicând o probabilitate crescută a existenței stării incipiente a IDDM.

RO 116777 Bl în metoda pentru diagnosticarea IDDM, pacientul poate fi testat pentru detectarea prezenței anticorpilor anti-hsp6O, în care respectiva metodă de testare poate cuprinde un test de încercare a radioimunologiei sau un test ELISA.

Pacientul poate, de asemenea, să fie testat pentru detectarea prezenței unei celule T, care imunreacționează cu hsp6O. într-o realizare a acestui aspect, metoda de testare cuprinde testarea proliferării celulelor T, care are următoarele etape:

(i) prepararea unei fracții de celule mononucleare conținând celule T din sângele de testat, obținut de la pacient;

(ii) adăugarea la fracția de celule mononucleare a unui antigen ales dintre o peptidă cu secvența I din această invenție;

(iii) incubarea fracției de celule în prezența antigenului pentru o anumită perioadă de timp și în condiții corespunzătoare unei culturi;

(iv) adăugarea unei nucleotide inscripționate în cultura de celule incubate (iii), pentru o perioadă de timp corespunzătoare înainte de sfârșitul perioadei de incubare, pentru furnizarea incorporării nucleotidei inscripționate în ADN-ul celulelor T care proliferează;

și (v) determinarea unei cantități de celule T care proliferează, prin analizarea cantității de nucleotidă inscripționată incorporată în celulele T.

în etapa (iv) de mai sus, nucleotidă inscripționată este, preferabil, ³H-timidină. Determinarea cantității de celule T care proliferează este efectuată prin calcularea indicelui de stimulare a celulelor T după metode standard.

într-o altă realizare a acestui aspect al invenției, metoda de testare cuprinde testul de răspuns la citocină a celulelor T, în care etapele (i) până la (iii) sunt la fel ca în testul de proliferare a celulelor T, iar în etapa a patra (iv) prezența citocinei, cum ar fi IFN-Y, IL-2, IL-4, IL-6, IL-1O, TFNa sau TGNp, secretate de limfocitele corespunzătoare în mediu, este detectabilă prin metode standard cu ajutorul chiturilor comerciale.

într-un alt aspect, invenția prezintă o metodă in vivo în care antigenul ales dintre o peptidă cu secvența I este injectat subcutanat la un pacient și se observă o reacție detectabilă a pielii (DTH).

în descriere, sunt prezentate și dispozitive pentru efectuarea unor astfel de testări, ca și la chituri, pentru realizarea unor astfel de experimente. Chiturile pot fi preparate pentru efectuarea de diferite încecări folosite pentru realizarea acestei invenții. Fiecare astfel de chit cuprinde toate materialele necesare pentru efectuarea unei singure încercări sau a unui număr stabilit de testări. De exemplu, un astfel de chit pentru determinarea prezenței anticorpilor anti-hsp6O poate conține o peptidă imobilizată, în fază solidă având secvența I și un anticorp anexat capabil de a recunoaște regiunea invariabilă a anticorpului anti-hsp6O pentru a fi detectată, cum ar fi Fab antiuman anexat. Chitul poate, de asemenea, conține direcțiile de folosire ale chitului precum și containerele în care se țin materialele pentru chit. Se poate folosi orice anexă sau etichetă convențională, cum ar fi un radioizotop, o enzimă, un cromofor sau un fluorofor. Un radioizotop tipic este iodul -125 sau sulful -35. Enzimele tipice pentru acest scop sunt peroxidaza hreanului, β-galactosidaza și fosfataza alcalină.

Un chit pentru diagnosticarea prezentei IDDM, prin testarea prezentei anticorpilor anti-hsp6O cuprinde:

(i) un antigen ales dintre o peptidă cu secvența I; și

RO 116777 Bl (ii) un anticorp anexat capabil să recunoască regiunea invariabilă a anticorpilor anti-hsp6O ca să fie detectată.

Un chit pentru diagnosticarea prezenței IDDM, prin testarea prezenței unei 235 celule T, care imunoreacționează cu hsp6O cuprinde:

(i) un antigen ales dintre o peptidă cu secvența I;

(ii) un mediu de cultură corespunzător pentru cultura limfocitelor (celulelor T);

și (iii) fie o nucleotidă inscripționată pentru testul de proliferare a celulelor T, fie 240 o citocină, de exemplu, IFN-Y, IL-2, IL-4, IL-6, IL-1O, TFNa sau TGNp, chituri de încercare, pentru testul cu citocină.

Pentru testul in vivo, chitul cuprinde numai o peptidă cu secvența I într-o formă corespunzătoare pentru a fi injectată.

Prezenta invenție descrie, în continuare, dispozitive pentru prevenirea sau 245 tratarea IDDM. Vaccinarea cu peptidă cu secvența I din prezenta invenție ca antigen poate determina o regulare scăzută specifică a autoimunității la antigen, și creează, în mod efectiv, o rezistență la procesul autoimun al IDDM. Același lucru este adevărat și vis-a-vis de vaccinarea cu celule T, specific acestor antigeni, pentru formele atenuate sau avirulente sau după ce au fost tratate pentru îmbunătățirea antigenității lor, 250 sau a fragmentelor sau fracțiunilor active ale acestora. Dacă pacientul este deja într-o stare preclinică incipientă a IDDM, injecția cu astfel de antigeni sau cu celule T (sau fracțiuni) poate determina o scădere a autoimunității față de acest antigen și, de aceea, oprește procesul autoimun, înainte de a se fi întâmplat □ erodare semnificativă și permanentă. Peptidă poate fi, de asemenea, folosită ca agent terapeutic pentru 255 oprirea procesului autoimun chiar și după ce acesta este destul de avansat, așa cum a fost arătat recent de către iventatorii prezentei invenții, referindu-se la tratamentul șoarecilor NOD, cu peptidă p277 (Elias and Cohen, 1994).

în conformitate cu aceasta, prezenta invenție descrie o compoziție pentru prevenirea sau tratarea diabetului Mellitus insulino dependent (IDDM), cuprinzând un 2 60 produs format din celula T, ales din grupul constând dintre: (a) celule T umane, care manifestă specificitate pentru secvența p277 a hsp6O uman, celule care sunt activate prin incubarea în prezența respectivei peptide cu secvența I; (b) respectivele celule umane T de la (a) care au fost iradiate sau atenuate în alt mod; (c) respectivele celule umane T de la (a) care au fost introduse la un tratament cu presiune, prin intermediul 265 presiunii hidrostatice, tratament cu un agent chimic reticulat și/sau tratamentul cu un agent citoscheletal reticulat; (d) fragmente din, sau fragmente de proteine de suprafață din celule T de la (a), (b) sau (c); sau (e) o peptidă constând în principal dintr-o regiune variabilă a receptorului de la (a) care este specific pentru respectiva proteină, sau o sare, un derivat funcțional, precursor sau fracție activă a acestuia. 270 într-o realizare preferată a invenției, preparatul cuprinde celule T umane autoloage obținute de la pacienți cu IDDM pentru a fi tratate, celule T care sunt activate printr-un contact in vivo cu respectiva peptidă cu secvența I. Astfel de celule T specifice și activate, sunt apoi administrate la același pacient de la care au fost luate. 27 5

Prezenta invenție descrie, de asemenea, o compoziție farmaceutică, pentru prevenirea sau tratarea IDDM care cuprinde un purtător acceptabil farmaceutic și, ca ingredient activ o cantitate efectivă din peptidă cu secvența I, o sare sau un derivat

RO 116777 Bl funcțional a acesteia. Purtătorul acceptabil farmaceutic este, preferabil, un vehicul uleios, cum ar fi o emulsie a unui ulei mineral, cunoscut sub numele de adjuvantul lui Freund (IFA). Totuși, IFA, ca și adjuvantul complet al lui Freund (CFA; un preparat din ulei mineral conținând cantități variabile de organisme moarte de Mycobacterium] nu sunt permise pentru administrare la oameni datorită uleiului mineral care nu este metabolizabil și nu poate fi degradat în corp.

Așa cum s-a descoperit de către inventatorii prezentei invenții, că unele emulsii grase, care se folosesc de mulți ani, pentru hrănirea intravenoasă a pacienților umani, pot, de de asemenea, acționa ca un vehicul în terapia cu peptide, folosind peptidă din prezenta invenție. Două exemple de astfel de emulsii sunt emulsii grase, disponibile comercial, cunoscute sub numele de Intralipid și Lipofundin. “Intralipid” este o marcă înregistrată de Kabi Pharmacia, Suedia, și este o emulsie grasă pentru hrănire intravenoasă, descrisă în brevetul american US 3169094. “Lipofundin” este înregistrată de B. Braun Melsungen, Germania. Ambele conțin ulei de soia drept grăsime (1OO sau 200 g în 1000 ml de apă distilată: 10% sau, respectiv, 20%). Fosfolipidele din gălbenușul de ou sunt folosite ca emulsifianți în Intralipid (12 g/l de apă distilată) și lecitina din gălbenușul de ou în Lipofundin (12 g%l de apă distilată). Izotonicitatea rezultă prin adăugarea de glicerol (25 g/l) atât în Intralipid, cât și în Lipofundin.

Invenția descrie, în continuare, o metodă de prevenire sau tratare a IDDM, care cuprinde administrarea la un pacient în suferință, a unei compoziții farmaceutice, care cuprinde o peptidă cu secvența (I) sau a unui preparat care conține celule T, care se dezvoltă în mod specific în respectiva peptidă cu secvența I din această invenție.

Când este menționată o “peptidă cu secvența I”, în această invenție, se subînțeleg și săruri sau derivați funcționali ai acesteia, cât timp activitatea biologică a peptidei față de diabet se menține.

“Sărurile” peptidei I, prezentate în invenție, sunt săruri organice sau anorganice, acceptabile posologic.

“Derivați funcționali” ai peptidei I, așa cum sunt utilizați aici, se referă la derivați protectori, care pot fi preparați din grupări funcționale care apar ca ramificații ale fragmentelor sau ca grupări terminale ale N- sau C-, cunoscute în domeniu, și care sunt incluse în invenție atât timp, cât ei rămân acceptabili farmaceutic, adică, ei nu distrug activitatea peptidei într-atât încât se referă la similitudinea lor cu activitatea cunoscută a p277, nu conferă proprietăți toxice compozițiilor care o conțin și nu au efecte adverse asupra proprietăților antigenice ale acesteia. Astfel de derivați funcționali” nu intenționează să determine astfel de schimbări care transformă efectiv un aminoacid în altul.

Acești derivați pot, de exemplu, include esteri alifatici ale grupărilor carboxil, amide ale grupărilor carboxil produse prin reacția cu amoniacul sau cu amine primare sau secundare, N-acil derivați cu grupe amino libere ale fragmentelor de aminoacizi formate prin reacția cu resturi acil (de exemplu, grupări alcanoil sau aroil carbociclice) sau derivați 0-acil cu grupe hidroxil libere (de exemplu aceea a fragmentelor serii sau treonil) formate prin reacția cu resturile acil.

Peptidă cu secvența I, din prezenta invenție poate fi folosită, ca imunogen în compoziții farmaceutice, în special, în vaccinuri pentru ușurarea sau tratamentul IDDM, ca și antigen în compozițiile de diagnosticare pentru diagnosticarea IDDM.

RO 116777 Bl

Aceste compoziții farmaceutice și de diagnosticare, care pot fi preparate într-un mod cunoscut în domeniu, fac parte, de asemenea, din prezenta invenție. 325

Când se folosesc pentru tratamentul terapeutic sau ca vaccin profilactic, peptida din prezenta invenție este administrată, preferabil, cu un purtător activ din punct de vedere biologic, care determină schimbarea TH1-TH2 a celulelor T autoimune. Celulele T de tipul CD4 se clasifică în două grupe, după citocinele pe care le secretă când sunt activate (Mosmann and Coffman, 1989): celulele TH1 secretă IL-1 330 și IFN-Y, în timp ce celulele TH2 secretă IL-4 și IL-1O. Astfel de vehiculi sunt preferați unei emulsii grase conținând 10...20% trigliceride de origină vegetală și/sau animală,

1.2.. .2.4% fosfolipide de origine vegetală și/sau animală, 2,25...4,5% regulator osmotic, 0...0,5% antioxidant și apă sterilă până la 100%. Cele mai preferabile astfel de vehicule sunt Intralipid sau Lipofundin. Utilizarea unor astfel de vehicule este des- 335 crisă într-o cerere de brevet de invenție israeliană (identificată după numărul solicitantului 9523) înregistrată la o aceeași dată ca data de înregistrare a cererii de brevet israeliene a prezentei invenții (identificată după numărul solicitantului 9451 A), având același solicitant cu al prezentei cereri, cu întregul conținut care aici este încorporat ca material bibliografic. 340

Compoziția terapeutică, în conformitate cu prezenta invenție, poate fi administrată oral sau parental, cum ar fi subcutanat, intramuscular, intravenos, intranazal sau intrarectal.

Exemplele de aici stabilesc eficacitatea tratamentului terapeutic cu ajutorul compușilor și compozițiilor din prezenta invenție, aplicate pe modele animale acceptate 345 științific care au IDDM uman.

- fig. 1, este un grafic care arată stabilitatea lui p277 și a lui p277(Val⁶-Val¹¹). Cercurile înnegrite reprezintă rezultatele obținute, prin folosirea lui p277, iar cercurile de culoare descrisă cele obținute prin utilizarea lui p277(Val⁶Val¹¹). Cercurile mari reprezintă rezultatele, după 1 săptămână de depozitare, cer- 350 curile de dimensiune medie, după 9 săptămâni, iar cercurile cele mai mici după 20 de săptămâni;

- fig.2, arată că celulele T NOD ale clonei diabetogenice C9 care proliferează ca răspuns la peptida p277 (cercurile înnegrite) și p277(Val⁶-Val¹¹) cercurile de culoare deschisă); 355

- fig.3, arată că celulele T din splina special NOD proliferează în prezența peptidei p277(Lys¹⁹). Splinele de la 5 șoareci femele NOD au fost testate în fiecare grupă de vârstă pentru proliferarea celulelor T ca răspuns la peptidele p277(Lys¹⁹) (cercuri înnegrite), p277 (cercuri de culoare deschisă) și peptida de control p278 (pătrate înnegrite); 360

- fig.4, arată că celulele T din NOD ale clonei diabetogenice C9 proliferează ca răspuns la peptida p277(Lys¹⁹);

- fig.5, este un grafic care arată eficacitatea pretratamentului cu p277(V) în

IFA în prevenirea diabetului indus de STZ comparativ cu tratamentul de control sau tratamentul cu GADp34. 365

Se dau, în continuare, 11 exemple de realizare a invenției în legătură și cu fig.

1.. .5, prezentate mai sus:

RO 116777 Bl

Materiale și metode (i) Șoareci. Șoarecii femele, rezultate din încrucișări selective de rasă NOD/Lt, sunt furnizați de Centrul de încrucișări animale de la Institutul de Știință Weizmann, Rehovot, Israel. Acești șoareci dezvoltă, în mod spontan, diabet autoimun, la vârsta de 14 până la 17 săptămâni, ceea ce imită IDDM la oameni.

(ii) Peptide. Peptidele sunt sintetizate prin chimia standard Fmoc folosind un sintetizator ABIMED (FRG) și sunt purificate pe HPLC prin cromatografie cu fază inversă. Secvențele sunt confirmate prin analiza aminoacizilor. Sunt sintetizate următoarele peptide: peptida p277, peptida de control p278 având secvența: Asn-GluAsp-GIn-Lys-lle-Glu-lle-lle-Lys-Arg-Thr-Leu-Lys-lle (Secvența ID nr. 10], care corespunde pozițiilor 458-474 din molecula umană hsp6O; fragmente de p277; jumătatea amino din p277 (p277.N), jumătatea carboxi din 0277 (p277.c) și p277 combinată cu p278 (p277.C-p278); peptida p277(Lys¹⁹); și peptida p277 cu diferiți substituenți ai aminoacizilor pentru două fragmente de cisteină într-o secvență ca cea care urmează: p277 cu punți de grupări -SH (p277 (punte Cys-Cys]); p277 cu ambele fragmente de cisteină înlocuite de valină (p277(Val⁶-Val¹¹]] sau de serină (p277(Ser⁶-Ser¹¹)).

(iii) Tratament și urmări. Șoarecii sunt tratați cu emulsii de p277, de alte peptide sau de albumină din ser de bovine (BSA, fabricat de Sigma, St.Louis, MO, USA) în volume de 0,1 ml injectate subcutanos în spate. Antigenii se diluează în PBS și se emulsionează într-un volum egal de ulei mineral (adjuvant incomplet al lui Freund (IFA); Sigma] sau 10% Intralipid. La șoareci este testat nivelul de glucoză din sânge la ora 10 dimineața într-o stare de nemâncare așa cum este descris de (Elias et al., 1991) în momentul tratamentului (vârsta de 7, 12, 15 sau 17 săptămâni și, la acei șoareci care supraviețuiesc, la vârsta de 40 de săptămâni. Hiperglicemia semnificativă este considerată, când se atinge un nivel de concentrație a glucozei de 11,1 mM/L sau mai mare deoarece această concentrație a glucozei din sânge este de 3 ori mai mare decât concentrația inferioară a glucozei din sânge măsurată la 100 de șoareci sănătoși (nearătată). Examinarea histologică a insulelor din pancreas a fost efectuată în secțiuni stropite cu hematoxilină și eozină. Secțiunile sunt numărate în mod independent de doi observatori când ambii sunt în necunoștință de cauză despre identitatea grupelor. Testul pătrat chi este folosit pentru a stabili diferențele statistice dintre diferitele tratamente.

(iv) încercări de proliferare a celulelor T. Celulele din clona C9 și din suspensiile celulelor din splină obținute de la șoarecii femele NOD sunt supuse proliferării celulelor T așa cum a fost descris anterior (Elias et al., 1991). Pe scurt, sunt incubate 1 x 10⁵ celule de clonat/ml sau 1 x 1 CP splenocite/ml în cuadruplicate timp de 72 de ore în 0,2 ml de mediu de cultură în camerele de microtitrare în prezența sau absența diferiților antigeni de 5 ^g/ml. Proliferarea este măsurată prin încorporarea de [³H]-timidină în ADN, în timpul ultimelor 12 h de incubație. Rezultatele sunt adunate sub forma unui indice de stimulare: raportul dintre cpm test inferior în prezența antigenului și cpm suport inferior în absența antigenului. Deviațiile standard între cvadruplicate sunt întotdeauna <105% decât cpm inferior. Suportul este <1000 cpm în experimentele cu splenocite și <200 cpm cu celulele C9. Splina fiecărui șoarece este testată separat. Rezultatele de la fiecare grup de șoareci sunt prezentate ca limita inferioară ±SD.

RO 116777 Bl

415

Exemplul 1. Tratamentul șoarecilor NOD cu p27 7 sau fragmente ale acesteia. Pentru a testa dacă doi din cele 12 jumătăți de aminoacizi ai peptidei p277, singuri sau în combinație, care se găsesc efectiv în șoarecii NOD, așa cum se găsește p277, șoarecii femele NOD sunt tratați de la vârsta de 7 săptămâni, prin inocularea subcutanatăa 50 /zg de diferite peptideîn ulei. Starea șoarecilor este determinată la vârsta de 40 de săptămâni.

Rezultatele sunt prezentate în Tabelul 1. Se poate vedea că hsp60 din peptida de control p278 nu a afectat dezvoltarea bolii: din 40 de șoareci tratați, toți sunt diabetici și 90% mor la vârsta de 40 de săptămâni. Prin contrast, peptida p277 previne complet moartea și vindecă 60% din cei 20 de șoareci tratați. Fragmentele de p277 sunt mai puțin active: jumătatea amino a p277 (p277.N), jumătatea carboxi a p277(p277.C) și un amestec al amâdoura (p277.N, p277.C) lucrează aproape la jumătate față de peptida intactă p277. Peptida p277.C este sintetizată prin atașare la peptida p278 pentru a produce o peptidă mai lungă; totuși, p277.C-p278 nu este mai bună decât p277.C singură. De aceea, se poate concluziona că efectul terapeutic complet necesită peptida p277 intactă.

Tabelul 1

420

425

430

Tratamentul șoarecilor NOD cu p277 sau fragmente ale acesteia Starea după 40 de săptămâni de diabet

Tratamentul cu peptide (50 A/g)	Numărul de șoareci	Sănătatea %	Hiperglicemia %	Moartea %
p278	40	0	100	90
p277	20	60 *	40	0 *
p277.N	20	20	80	50*
p277.C	20	30	70	40
p277.N, p277.C	20	35*	65	40*
p277.C-p278	20	25	75	50*

* p<0,01 comparativ cu grupul tratat cu peptida de control p278.

435

Exemplul 2. Tratamentul șoarecilor NOD cu peptidele substituite p277. Următoarele peptide sunt testate pe șoarecii NOD: p277, p277 (punte Cys-Cys], p277(Val⁶-Val¹¹) și p277(Ser⁶-Ser¹¹). 445

Femelele NOD sunt tratate cu 100 /zg de peptidă în 0,2 cc de emulsie de ulei mineral (IFA) administrată subcutanos. Șoarecii sunt tratați la vârsta de 12 săptămâni, iar diabetul apare la 30 de săptămâni.

Așa cum este arătat și în Tabelul 2, p277(Val⁶-Val¹¹) este la fel de eficientă ca p277 în tratamentul diabetului, incidena diabetului la șoarecii netratați fiind de 80%, 4 50 în timp ce p277 și p277(Val⁶-Val¹¹) determină o incidență a diabetului în șoarecii tratați de 22%, respectiv de 23%. Pe de altă parte, nici p277 (punte Cys-Cys) nici p277(Ser⁶-Ser¹¹) nu au efect terapeutic. Două variante adiționale de p277, în care fragmentele de cisteină din pozițiile 6 și 11 sunt înlocuite cu fragmentele alanină sau acid y-aminobutiric, de asemenea, nu sunt eficiente când au fost testate in vitro atât 4 55 în celulele clonă C9 cât și în celulele T din splina șoarecilor NOD. Cum aceste două peptide nu sunt recunoscute de celulele T specifice anti-p277 (nearătat), ele nu vor mai fi în continuare testate in vivo pentru efect terapeutic.

RO 116777 Bl

Tabelul 2

Tratamentul șoarecilor NOD cu substituenți ai p277

Tratamentul cu peptide	Incidența diabetului (%)	Numărul de destinatari
niciuna	80	100
p277	22*	200
p277(punte Cys-Cys)	70 π	10
p277(Val⁶-Val¹¹)	23*	52
p277(Ser⁶-Ser¹¹)	85n	20

* p< 0,01 comparativ cu incidența diabetului la șoarecii tratați doar cu adjuvant.

π nu este o diferență semnificativă comparativ cu incidența diabetului în șoarecii tratați doar cu adjuvant.

Exemplul 3. Stabilitatea p277(Vaf³-Vaf¹). Deoarece motivul înlocuirii cisteinelor a fost instabilitatea peptidei p277, stabilitatea p277(Val⁶-Val¹¹) este testată la câteva intervale de timp după ce a fost sintetizată. Peptida p277 este instabilă și se dete- ‘ riorează chiar și în condiții stricte (pudră liofilizată în vacuum, - 2O°C).

Pentru a compara stabilitatea peptidei p277 cu analogul ei p277(Val⁶-Val¹¹), ambele peptide sunt sintetizate în același timp și depozitate sub formă de pudră uscată la - 2O°C. La 1, 9 și 20 de săptămâni după ce au fost sintetizate, o alicotă este cântărită, dizolvată și testată. Avantajul pentru stabilitatea peptidei a fost abilitatea sa de a stimula clona C9 a celulelor T. Fig.1 demonstrează rezultatele experimentului. Se poate vedea că, în timp ce p277 nativă pierde cea mai mare parte din efectul său în 9 săptămâni și toate celelalte în 20 de săptămâni de la sinteză, p277(Val⁶-Val¹¹) este neschimbată după 20 de săptămâni de depozitare.

Așa cum se crede că instabilitatea lui p277 este cauzată de fragmentele de cisteină, este de așteptat ca oricare dintre analogii din prezenta invenție care menține activitatea biologică a lui p277 va avea o stabilitate îmbunătățită față de p277 într-un fel similar cu cel demonstrat în acest exemplu pentru p277(Val⁶-Val¹¹].

Exemplul 4. Tratamentul șoarecilor femele NOD cu p277 sau p277(Val^B-Vai’¹) schimbă total insulitisul. Șoarecii femele NOD sunt tratate la vârsta de 12 săptămâni cu 100 /zg/șoarece de p277 nemodificată sau p277(Val⁶-Val¹¹) în 0,1 cc de emulsie de ulei mineral (adjuvant incomplet Freund] introdus subcutanat. Șoarecii de control primesc o emulsie de PBS și ulei mineral. La vârsta de 6 luni, 5 șoareci din fiecare grup sunt sacrificați, pancreasul lor este îndepărtat și fixat iar secțiunile sunt colorate cu hematoxilină:eozină. Insulițele au fost numărate într-o manieră oarbă. Cât timp șoarecii de control dezvoltă un diabet sever, ei sunt sacrificați la vârsta de 5 luni. De atunci, nivelul glucozei din sângele șoarecilor de control este în domeniul 29... 48 mmol/l. Rezultatele sunt arătate în Tabelul 3.

RO 116777 Bl

500

Tabelul 3

Tratamentul șoarecilor femele cu p277 sau p277(VaP-Val¹¹) schimbă în mod radical insulitisul

Tratamentul cu peptide (12 săptămâni)	Număr de insule	Examinare histologică
Rezolvate (%)	Insulitis
periinsular %	intrainsular %
nici una	83	10	23	67
p277	49	25	69	6
p277(Val⁶-Val¹¹)	62	52	31	17

505

La vârsta de 12 săptămâni, în timpul tratamentului, aproximativ 60% dintre insulele din șoarecii netratați prezintă insulitis. Infiltrarea intrainsulară este considerată a fi o formă severă de insulitis asociată cu lipsa funcționării celulelor β. Așa cum este arătat în Tabelul 3, este o mare diferență în apariția insulelor dezvoltate la cele două grupe tratate comparativ cu șoarecii de control tratați doar cu ulei. Șoarecii tratați cu ulei (de control] prezintă o scădere progresivă a insulelor neafectate și numai 10% din insulele normale pot fi văzute la vârsta de 22 de săptămâni, un timp în care toți șoarecii erau în mod fățiș diabetici. Aproximativ 67% dintre insule prezentau insulitis intrainsular la 22 de săptămâni iar restul de 23% dintre insule prezentau insulitis periinsular. în contrast, șoarecii tratați cu p277 sau cu p277(Val⁶-Val¹¹) prezintă o creștere a numărului de insule normale (între 25% și 52%) și o scădere a numărului de insule cu insulitis intrainsular (între 6% și 17%). Insulele cu insulitis periinsular ajung la aproximativ 315...69%. Astfel, tratamentele cu p277 și p277(Val⁶-Val¹¹) se asociază cu un tablou histologic îmbunătățit constând din reversia gradului de insulitis care persistă mai mutl de 3 luni după tratament.

510

515

520

Rezultate adiționale folosind p277(v) în șoarecii femele NOD

S-au efectuat cincisprezece experimente adiționale prin care grupe de 10 șoareci femele NOD sunt tratate fiecare cu p277(V) în ulei sau numai cu ulei la vârsta de 12...15 săptămâni. Din totalul de 150 de șoareci tratați numai cu ulei, 90% au 525 prezentat diabet și 85% au murit la vârsta de 32 de săptămâni. Prin contrast, șoarecii tratați cu p277(V] au prezentat o incidență a diabetului de numai 50% (p<0,01) și numai 20% au murit de boală grea (p<0,01). De aceea, tratamentul târziu cu p277(V) este eficient în stoparea dezvoltării diabetului letal.

Exemplul 5. Terapia cu peptide a diabetului de tip I folosind p277[Val^B-Val¹¹) 530 în emulsii de lipide. Distrugerea autoimună a celulelor β producătoare de insulină din pancreas este mediată de limfocitele T. 0 infiltrare inflamatorie se dezvoltă în jurul insulelor pancreatice la vârsta de 5...8 săptămâni și distrugerea celulelor β conduce la deficiență de insulină și diabetul se manifestă deschis la vârsta de 14...20 de săptămâni afectând aproape 100% din șoarecii femele NOD la vârsta de 35...40 de 535 săptămâni.

Șoarecii femele NOD sunt tratate subcutanat cu 100 ^g de peptidă p277(Val⁶Val¹¹) per șoarece în 0,1 ml de PBS sau o emulsie de 10% emulsie de lipide compusă

RO 116777 Bl din 10% ulei de soia, 1,2% fosfolipide din ou și 2,25% glicerol (Intralipid, Kabi Pharmacia AB, Suedia).

Incidența diabetului la vârsta de 6 luni este urmată de producerea de anticorpi anti-p277(Val⁶-Val¹¹]. Diabetul este diagnosticat ca o hiperglicemie persistentă, nivelul glucozei din sânge fiind peste 11,1 mmol/l măsurat de cel puțin două ori pe săptămână cu un analizor analyzer II Beckman Glucose. Tratamentul de succes cu peptidă este încercat prin menținerea concentrației normale a glucozei în sânge (mai puțin de 11,1 mmol/1) remisia inflamației intrainsulare a insulelor pancreatice (insulitis) și inducerea de anticorpi de către peptida terapeutică ca un indicator al răspunsului imun de tip TH2. Rezultatele sunt prezentate în Tabelul 4.

Tabelul 4

Incidența diabetului la 6 luni

Tratament	Incidența diabetului %	Moarte
p277(Val⁶-Val¹¹)/PBS	90	80
p277(Val⁶-Val¹¹)/lntralipid	45 n	20°
niciuna	100	90

n p<O,O1 comparativ cu șoarecii NOD netratați.

Așa cum se poate vedea din Tabelul 4, tratamentul cu peptida din prezenta invenție administrată în Intralipid este eficientă în reducerea incidenței diabetului și morții. Pe de altă parte, tratamentul administrat în PBS nu este eficient.

Exemplul 6. Peptidele p277 și p277(VaP-Val¹¹) interacționează imunologic. Celulele din clona G9 de celule t izolate din șoarecii NOD prediabetici sunt incubate cu peptidele p277 (cercuri înnegrite), p277(Val⁶-Val¹¹) (cercuri de culoare deschisă), p277(Val⁶-Val¹¹) (pătrate înnegrite) și p277(punte Cys-Cys) romburi de culoare deschisă). Rezultatele sunt prezentate în Fig.2. Clona C9 s-a găsit că manifestă un răspuns pozitiv de proliferare numai la peptidele p277 și p277(Val⁶-Val¹¹). Aceasta dovedește că p277 și p277(Val⁶-Val¹¹) interacționează și că peptidele p277(Ser⁶Ser¹¹) și p277(punte Cys-Cys), care nu sunt eficiente din punct de vedere terapeutic, nu interacționează imunologic.

Exemplul 7. Pacienții recent diagnosticați cu IDDM prezintă un răspuns proliferativ al celulelor T la ambele peptide p277 și p277(VaF-Val¹¹). Pacienții recent diagnosticați (2...4 săptămâni) cu IDDM sunt supuși unui test de proliferare. Limfocitele periferice din sânge sunt izolate din întreaga cantitate de sânge heparinizat pe ficolhypaque și vizualizat in vitro pentru proliferare, măsurată incorporarea de ³Htimidină indusă prin hsp60 din peptidele p277, p277(Val⁶-Val¹¹) și peptida de control p278. Răspunsul proliferativ al celulelor T este prezentat sub forma unui indice de stimulare (SI): raportul dintre încorporarea de timidină stimulată de peptidă și încorporarea de timidină pe suport (fără antigen adăugat) de către celulele T.

RO 116777 Bl

580

Tabelul 5

Pacienții recent diagnosticați cu IDDM prezintă un răspuns proliferativ al celulelor T al ambele peptide p277 și p277[VaT-Val¹¹)

Pacient	Proliferarea celulelor T (SI)
p77	p277(Val⁶-Val¹¹)	p278
IDDM#68	3,5	3,2	0,8
IDDM#69	2,5	5,0	0,5

585

Așa cum este arătat în Tabelul 5, pacienții recent diagnosticați cu IDDM răspund atât la p277(Val⁶-Val¹¹) cât și la peptida p277. De aceea, p277(Val⁶-Val¹¹] este, din punct de vedere imunologic, echivalentă cu p277. Din moment ce efectul terapeutic al p277 este mediat de recunoașterea imunologică, faptul că p277(Val⁶Val¹¹) interacționează din punct de vedere imunologic cu p277, indică faptul că ea poate fi folosită în locul lui p277 în tratarea diabetului.

Exemplul 8. Răspunsul celulelor T la hsp6O și peptide în IDDM și la indivizii sănătoși. Douăzeci și unu de pacienți cu IDDM și patrusprezece donori de sânge sănătoși sunt vizualizați pentru anti-hsp6O și p277(V) cu ajutorul testului proliferativ din Exemplul 7. Tabelele 6 și 7 arată răspunsul proliferativ al celulelor T (indice de stimulare; SI) al fiecărui individ pentru controlul antigenului (control Ag), adică tetanus și virusul gripei-ramura Texas, la toate hsp6O recombinant și la p277(V). Valorile lui SI mai mari de 3 se consideră a fi pozitive.

Tabelul 6

590

595

600

Răspunsul proliferativ al celulelor T la pacienții cu IDDM

Pacient	Vârsta (ani)	Timpul de la diagnostic (săp./luni)	Răspunsul celulelor T (indice de stimulare) la:
control Ag	hsp 60	p277(V)
1. LM	32	3,5 luni	+	+	-
2. G	25	24 luni	+	+	-
3. H	23	6 luni	+	+	-
4. DV	20	3 săpt. 5 săpt.	+	+	+
5. SD	15	6 săpt.	+	+	+
6. P	15	4 săpt.	+	-	-
7. G	60°	5 săpt. 7 săpt.	+	+	+ +
8. F	45°	6 săpt.	+	+	+
9. IS	53	2 săpt.	+	+	-
10. T	20	4 săpt.	+	+	+
11. KK	21	4 săpt.	+	+	-

605

610

RO 116777 Bl

Tabelul 6 (continuare]

Pacient	Vârsta (ani)	Timpul de la diagnostic (săp./luni)	Răspunsul celulelor T (indice de stimulare) la:
control Ag	hsp 60	p277(V)
13. MS	5	1 săpt.	+	-	-
14. KB	5	2 luni	+	+	+
15. Bl	11,3	3 săpt.	+	-	-
16. YY	60	2 luni	+	+	-
17. KA	12	4 săpt.	-	-	-
18. ZA	12	4 săpt.	+	+	+
19. A	17,5	11,5 ani	+	+	+
20. N	17,5	7,5 ani	+	+	+
21. A	19,7	5,7 ani	+	+	0

π Pacienții pozitivi la anticorpii anti-GAD au diabet de tipul I și nu de tipul II în ciuda vârstei avansate de la izbucnirea bolii.

Tabelul 7

Răspunsul proliferativ al celulelor T la donorii de sânge sănătoși

Donor	Răspunsul celulelor T (indice de stimulare] la:
control Ag	hsp60	p277(V]
1	+	-	-
2	+	-	-
3	+	nd	+
4	+	+	-
5	+	+	+
6	+	-	-
7	+	-	-
8	+	-	-
9	+	-	-
10	+	-	-
11	+	+	-
12	+	-
13	+	+	-
14	+	-	-

nd = nefăcut

Tabelul 8 este un tabel care însumează și arată că 86% și 52% din pacienți răspund la hsp6O și la p277(V) comparativ cu 21% și 14% dintre cei controlați (p<0,05). Astfel, grupul cu IDDM prezintă un răspuns al celulelor T esențialmente

RO 116777 Bl pozitiv la hsp6O și p277(V). Aceasta conduce la concluzia că incidența reacției hsp6O 650 și p277(V) la indivizi este mai mare printre pacienții cu IDDM decât printre oamenii sănătoși.

Tabelul 8

Incidența răspunsului pozitiv al celulelor t la IDDM și la indivizii sănătoși

Cei care răspund	Incidența răspunsului celulelor T la (%)
hsp60	p277(V)
IDDN	18/21 (86)	11/21(52)a
sănătoși	3/14(21)	2/14 (14)

π p<O,O5 la analiza X², comparativ cu incidența răspunsurilor la p277(V) în donorii de sânge sănătoși.

Exemplul 9. Proliferarea celulelor T în NOD la p277(Lys¹⁹) 660

Peptidă p277(Lys¹⁹) diferă de p277 printr-un amoniacid. Pentru confirmarea faptului că p277(Lys¹⁹) este un autoantigen în IDDM NOD, vom compara proliferarea celulelor T la peptidă p277 și la peptidă p277(Lys¹⁹. Fig.3 demonstrează că celulele T din splinele femelelor NOD proliferează la peptidă p277(Lys¹⁹) la fel ca la p277. Nu a avut loc nici un răspuns la peptidă de control p278. 665

Rezultatele de mai sus sunt confirmate folosind clona c9, o clonă diabetogenică a celulelor T din NOD care s-a descoperit că răspunde la peptidă umană p277 (Elias etal., 1991). Celulele C9 s-a descoperit că proliferează la peptidă p277(Lys¹⁹) la fel ca la peptidă p277(Fig.4).

Exemplul 10. Tratamentul șoarecilor femele NOD cu p277[Lys¹⁹). Prezenții 6?o inventatori au raportat anterior că insulitisul avansat prezent în șoarecii NOD femele în vârsta de 3 luni poate fi oprit prin tratarea șoarecilor cu o singură injecție de p277 uman; șoarecii tratați prezintă o incidență scăzută a izbucnirii diabetului clinic și morții datorită hiperglicemiei severe. Pentru a testa dacă peptidă p277(Lys¹⁹), care este peptidă p277 pentru șoareci înșiși, este eficientă, se tratează șoarecii NOD femele 67 5 în vârstă de 3 luni cu 100 ^g fie de p277 umană fie p277(Lys¹⁹) în IFA.

Peptidele p277 sau p277(Lys¹⁹) la o concentrație de 2 mg/ml într-o soluție tampon salină fosfatată (PBS) este emulsifiată cu un volum egal de adjuvant incomplet al lui Freund (IFA). Grupe de câte 10 șoareci NOD femele în vârstă de 3 luni sunt injectate subcutanat cu 0,1 ml (100 ^g) de emulsie conținând oricare dintre peptide. 68 0

Șoarecii de control au fost injectați cu o emulsie de PBS și IFA. Șoarecilor li s-a luat sânge la fiecare 4 săptămâni iar nivelul glucozei din sânge a fost determinat cu un analizor de glucoză Beckman. Incidența hiperglicemiei și morții datorită diabetului a fost înregistrată la vârsta de 6 luni. Șoarecii sunt considerați diabetici dacă glucoza lor din sânge este mai mare de 11 mmol/1. 68 5

Rezultatele sunt arătate în Tabelul 9. La vârsta de 6 luni, 90% dintre șoarecii de control erau clar hiperglicemiei și 60% au murit de diabet. Prin contrast, tratamentul fie cu p277 fie cu p277(Lys¹⁹) previne ambeler diabete (40% și, respectiv, incidența cu 50%) și moartea (10% și, respectiv, incidența cu 20%). Astfel, peptidă specifică șoarecilor p277(Lys¹⁹) pare să fie eficientă ca și cea menționată anterior 690 p277 în terapia insulitisului avansat.

RO 116777 Bl

Tabelul 9

Tratamentul diabetului cu p277 sau p277[Lys¹⁹)

Tratament la 3 luni	Diabet la 6 luni
Hiperglicemia(%)	Mortalitatea(%)
p277(Lys¹⁹)	50°	20°
p277	40°	10°
PBS	90°	60

Aceste rezultate arată că răspunsurile proliferative ale celulelor T din NOD detectate folosind molecula umană hsp6O și peptida acesteia p277 sunt echivalente cu răspunsul autoimun la hsp6O al șoarecelui și cu secvența p277(Lys¹⁹) a șoarecelui. Acest fapt a fost demonstrat cu ajutorul clonei diabetogenice C9 a celulelor T ca și cu ajutorul răspunsului spontan apărut în splinele șoarecilor prediabetici. Mai mult, p277(Lys¹⁹) este mai eficientă decât p277 în tratamentul diabetului la șoaecii NOD. Celulele T din splina șoarecilor de vârstă și același sex dar de altă rasă, nu manifestă un răspuns spontan de proliferare a celulelor T la p277 (nearătat).

Găsirea autoimunității la o secvență hsp6O din șoarece care este țintită de celulele T diabetogenice suportă credința generală că IDDM este cauzat de un proces autoimun.

Exemplul 11. Tratamentul diabetului indus de STZ cu p277(V). Streptozotocina (STZ) este o toxină specifică celulei β care poate cauza diabetul toxic prin distrugerea celulelor β în 24...48 de ore dacă este injectată o doză de 200 mg/kg. în doze mici subtoxice, ea induce insulitis în șoarecii genetic susceptibili care conduce la diabet. Procesul inflamator poate dura 20...30 de zile, depinde de doza de STZ. Protocolul regular pentru diabetul indus de STZ este o doză de 200 mg STZ la kg corp, dată în 5 doze egale de 40 mg/kg în zile consecutive (Like and Rossini, 1976) iar modelul este denumit doză minimă de STZ. S-a descoperit că dacă doza totală este redusă la 150 mg/kg (30 mg/kg x 5), diabetul se dezvoltă în 80...100 zile. Această formă de progres ușor a diabetului indus de STZ seamănă probabil bine cu diabetul autoimun la oameni și are aceeași durată cu stadiul preclinic din diabetul spontan în șoarecii NOD (Castano and Eisenbarth, 1990). Mai mult, efectele acute toxice sunt diminuate dacă doza este redusă.

Proteina inflamabilă la șoc de 60 kDa (hsp60) joacă un rol atât în diabetul NOD (Elias et al., 1990) cât și diabetul indus de STZ (Elias et al., 1994). S-a arătat anterior că ambele răspunsuri la anticorpi și cel proliferativ al celulelor T la hsp60 apar înainte de izbucnirea diabetului deschis. Clonele de celule T specifice pentru hsp60 sunt derivate de la șoarecii NOD prediabetici și pot transfera adoptiv insulitis și hiperglicemie în NOD tineri (Elias et al., 1991) sau în șoarecii NOD τγιβ. Clonele diabetogenice de celule T recunosc o peptidă lungă de 24 de aminoacizi a secvenței 437-460 din hsp60 denumită p277. Diabetul indus de STZ este totodată acompaniat de răspunsul celulelor T anti-p277 în stadiul preclinic.

Exemplele anterioare ne-au arătat că peptida p277(Val⁶-Val¹¹) protejează șoarecii NOD. Prezentul experiment testează eficiența tratamentului cu p277(V) întrun model cu doza minimă de STZ.

RO 116777 Bl

Șoarecii masculi, zece per grup, sunt tratați cu o doză de 30 mg/kg de STZ, zilnic, timp de 5 zile. După o săptămână, șoarecii sunt tratați cu 1D0 ,ug fie de p277(V) în ulei, o peptidă a decarboxilazei acidului glutamic (GADp34) descris de Kaufman et al., 1993, care este implicată în diabetul din șoarecii NOD, fie doar cu ulei. Tratamentul se repetă în ziua 85. în ziua 100, șoarecilor li se ia sânge care este 740 testat pentru hiperglicemie (concentrația de glucoza mai mare de 15 nmol/l). Rezultatele sunt însumate în Fig.5. Se poate observa că glucoza inferioară din sângele de la grupul de șoareci tratați cu GADp34 sau netratați este în domeniul hiperglicemic. Prin contrast, glucoza inferioară din sângele de la șoarecii tratați cu p277(V] este în limite normale. Astfel, p277(V) poate fi eficientă în tratarea diabetului indus 745 de STZ la șoareci masculi C57BL/ksj ca și în dezvoltarea spontană a diabetului în șoarecii femele NOD genetic diferite. Aplicabilitatea terapiei cu p277(V) nu este limitată la diabetul având o singură cauză sau la un singur genotip sau gen.

Toate referințele citate aici, inclusiv articole din jurnal sau abstracte, publicate sau corespunzând unor cereri anterioare de brevet U.S. sau străine, unor brevete 750 U.S. sau străine, sau oricare alte referințe bibliografice, sunt incorporate în totalitate aici, inclusiv toate datele, tabelele, figurile și textele prezentate în referințele citate, în plus, înregul conținut al referințelor bibliografice citate în referințele de aici, sunt în totalitate incorporate.

Referințele privind etapele metodei cunoscute, etapele metodelor convențio- 755 nale, metode cunoscute sau metode convenționale nu includ faptul că vreun aspect, descriere sau exemplu al prezentei invenții este dezvăluit, prezentat sau sugerat de către stadiul cunoscut al tehnicii.

Descrierea prezentată a exemplelor specifice va dezvălui complet natura generală a invenției încât alții pot, prin aplicarea cunoștințelor specialiștilor din domeniu 7 60 (incluzând conținutul referințelor citate aici), să modifice ușor și/sau să adapteze pentru diferite aplicații astfel de exemple, fără o parte experimentală necuvenită, fără să plece de la conceptul general al prezentei invenții. De aceea, astfel de adaptări și modificări trebuie să fie în sensul și domenii echivalente ale exemplelor dezvăluite, bazate de lecțiile și ghidajele prezentate aici. Se înțelege că frazeologia sau termino- 7 65 logia de aici este pentru scopul descrierii și nu pentru limitare, astfel încât terminologia sau frazeologia prezentei descrieri este pentru a fi interpretată de către artizanii în domeniu în lumina lecțiilor și ghidajelor prezentate aici, în combinație cu învățăturile specialiștilor în domeniu.

770

LISTAREA SECVENȚELOR (1) INFORMAȚII GENERALE:

(i) SOLICITANT:

(A) NUME: YEDA RESEARCH AND DEVELOPMENT CO. LTD.

(B) STRADA: P.O.BOX 95 775 (C) ORAȘ: Rehovot (D) ȚARA: Israel (E) COD POȘTAL: 76100 (A) NUME: Irun R.COHEN (B) STRADA: 11 Hankin Street

780

RO 116777 Bl (C) ORAȘ: Rehovot (D) ȚARA: Israel (E) COD POȘTAL: 76354 (A) NUME: Dana ELIAS (B) STRADA: 57 Derech Yavne (C) ORAȘ: Rehovot (D) ȚARA: Israel (E) COD POȘTAL: 76344 (A) NUME: Matityahu FRIDKIN (B) STRADA: 23 Miller Street (C) ORAȘ: Rehovot (D) ȚARA: Israel (E) COD POȘTAL: 76284 (ii) TITLUL INVENȚIEI : ANALOGI DE PEPTIDĂ p277 Șl COMPOZIȚII FARMACEUTICE CARE îl CONȚIN PENTRU TRATAMENTUL Șl DIAGNOSTICAREA DIABETULUI (iii) NUMĂR DE SECVENȚE: 10 (iv) FORMĂ CITIBILĂ PE COMPUTER:

(A) MEDIU : floppy disc (B) COMPUTER: IBM PC compatibil (C) SISTEM DE OPERARE: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFT: Patentin Release #1,0, Version #1,30 (EPO) (v) DATE DESPRE CEREREA ANTERIOARĂ (A) NUMĂRUL CERERII: IL 112094 (B) DATA DE ÎNREGISTRARE: 21-DEC-1994 (vi) DATE DESPRE CEREREA ANTERIOARĂ:

(A) NUMĂRUL CERERII: IL 114460 (B) DATA DE ÎNREGISTRARE: 05-IUL-1995 (2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID NR.1:

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI:

(A) LUNGIME: 24 aminoacizi (B) TIP: aminoacid (C) TIPUL LEGĂTURII: simplă (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIPUL MOLECULEI: peptidă (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECVENȚA ID NR.1:

Val Leu Gly Gly Gly Cys Ala Leu Leu Arg Cys lle Pro Leu Asp 15 10 15

Ser Leu Thr Pro Ala Asn glu Asp

RO 116777 Bl

830 (2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID NR.2:

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI:

(A) LUNGIME: 24 aminoacizi (B) TIP: aminoacid (C) TIPUL LEGĂTURII: simplă (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIPUL MOLECULEI: peptidă (ix) CARACTERISTICI:

(A) NUME/CHEIE: Peptidă (B) LOCALIZARE: 6, 11, 19 (D) ALTE INFORMAȚII:/ notă=”Xaa la poz-6/11=Cys sau Val;

Xaa la poz-19=Thr sau Lys; în care Xaa la poz.6/11 nu sunt ambele Cys când Xaa la poz. 19 este Thr” (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECVENȚA ID NR.2:

Val Leu Gly Gly Gly Xaa Ala Leu Leu Arg Xaa lle Pro Leu Asp 15 10 15

Ser Leu Xaa Pro Ala Asn Glu Asp

835

840 (2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID NR.3:

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI:

(A) LUNGIME: 24 aminoacizi (B) TIP: aminoacid 850 (C) TIPUL LEGĂTURII: simplă (D) TOPOLOGIE; liniară (ii) TIPUL MOLECULEI: peptidă (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECVENȚA ID NR.3:

Val Leu Gly Gly Gly Cys Ala Leu Leu Arg Cys lle Pro Leu Asp 15 10 15

Ser Leu Lys Pro Ala Asn Glu Asp (2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID NR.4:

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI:

(A) NUME/CHEIE: Peptidă (B) LOCALIZARE: 19 (D) ALTE INFORMAȚII:/notă=”Xaa la poziția 19 este Thr sau Lys” (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECVENȚA ID NR.4:

Val Leu Gly Gly Gly Val Ala Leu Leu Arg Cys lle Pro Leu Asp

860

865

870

RO 116777 Bl

10 15

Ser Leu Xaa Pro Ala Asn Glu Asp (2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID NR.5:

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI:

(A) LUNGIME: 24 aminoacizi (B) TIP: aminoacid (C) TIPUL LEGĂTURII: simplă (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIPUL MOLECULEI: peptidă (xi] DESCRIEREA SECVENȚEI: SECVENȚA ID NR.5:

Val Leu Gly Gly Gly Val Ala Leu Leu Arg Cys lle Pro Leu Asp

10 15

Ser Leu Lys Pro Ala Asn Glu Asp (2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID NR.6:

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI:

(A) NUME/CHEIE:Peptidă (B) LOCALIZARE: 19 (D) ALTE INFORMAȚII:/notă=”Xaa la poziția 19 este Thr sau Lys” (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECVENȚA ID NR.6:

Val Leu Gly Gly Gly Cys Ala Leu Leu Arg Val lle Pro Leu Asp 15 10 15

Ser Leu Xaa Pro Ala Asn Glu Asp (2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID NR.7:

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI:

(A) LUNGIME: 24 aminoacizi (B) TIP: aminoacid (C) TIPUL LEGĂTURII: simplă (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIPUL MOLECULEI: peptidă (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECVENȚA ID NR.7:

Val Leu Gly Gly Gly Val Ala Leu Leu Arg Cys lle Pro Leu Asp

10 15

Ser Leu Xaa Pro Ala Asn Glu Asp (2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID NR.8:

RO 116777 Bl (i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI:

(A) LUNGIME: 24 aminoacizi (B) TIP: aminoacid (C) TIPUL LEGĂTURII: simplă (D) TOPOLOGIE: liniară (ix) CARACTERISTICI:

[A] NUME/CHEIE: Peptidă (B) LOCALIZARE: 19 (D) ALTE INFORMAȚII:/notă=”Xaa la poziția 19 este Thr sau Lys” (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECVENȚA ID NR.8:

Val Leu Gly Gly Gly Val Ala Leu Leu Arg Val lle Pro Leu Asp 15 10 15

Ser Leu Xaa Pro Ala Asn Glu Asp (2] INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID NR.9:

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI:

(A) LUNGIME: 24 aminoacizi (B) TIP: aminoacid (C) TIPUL LEGĂTURII: simplă (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIPUL MOLECULEI: peptidă (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECVENȚA ID NR.9:

Val Leu Gly Gly Gly Val Ala Leu Leu Arg Val lle Pro Leu Asp 15 10 15

Ser Leu Lys Pro Ala Asn Glu Asp (2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID NR.10:

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI:

(A) LUNGIME: 17 aminoacizi (B) TIP: aminoacid (C) TIPUL LEGĂTURII: simplă (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIPUL MOLECULEI: peptidă (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECVENȚA ID NR.10:

Asn Glu Asp Gin Lys lle Gly lle Glu lle lle Lys Arg Thr Leu Lys

Claims

955

Revendicări

960

1. Analog de peptidă p 277, caracterizat prin aceea că este constituit din secvența Dl nr.2;

6 11 Val-Leu-Gly-Gly-Gly-X^AIa-Leu-Leu-Arg-Xg-lle-Pro-Ala-Leu-Asp-Ser19

965

RO 116777 Bl

Leu-Xg-Pro-Ala-Asn-Glu-Asp în care Χ_Ί și Xg este, fiecare, un fragment Cys sau Val și Xg este un fragment Thr sau Lys, dar X_n și X₂ nu pot fi amândoi fragmentul Cys când X₃ este Thr și săruri și derivați funcționali ai acestuia
2. Analog de peptidă p277, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că este ales din analogi de peptidă p₂₇₇(\/al⁶], în care Xq este Val, X2 este Cys, iar X3 este Thr; p277(Val¹¹)în care X1 este Cys, Xg este Val, iar Xg este Thr; p₂₇₇(Val⁶ - Val¹¹) unde ambele Xn și X2 sunt Val și X3 este Thr; p277(Lys¹⁹) unde ambele Xq și X₂ sunt Cys și X₃ este Lys; p₂₇₇(Val⁶-Lys¹⁹) unde X, este Val, X2 este Cys și X3 este Lys; p277(Val¹¹ - Lys¹⁹) unde X-, este Cys, X2 este Val, iar X₃ este Lys; p₂₇₇(Val^B,11-Lys¹⁹) unde Xt și X₂ sunt Val și X₃ este Lys.
3. Analog de peptidă p277, conform revendicării 1 caracterizat prin aceea că este ales dintre p₂₇₇(Val¹¹)în care Χή este Cys, X2 este VAL, iar Xj este Lys și p277 (VAL^6,11-Lys¹⁹) unde ambele Xq și X₂ sunt VAL și X₃ este Lys.
4. Analog de peptidă p 277, conform revendicării 3, caracterizat prin aceea că este p 277(Val⁶-Val¹¹).
5. Analog de peptidă p 277, conform revendicărilor 1 la 4 caracterizat prin aceea că este utilizat la prepararea unei compoziții pentru diagnosticarea diabetului Mellitus insulino dependent.
6. Analog de peptidă p277, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că poate activa celulele T umane care manifesta specificitate față de secvența p₂₇₇ a hsp6O uman.
7. Analog de peptidă p 277, conform revendicării 6, caracterizat prin aceea că celulele T umane sunt autoloage cu celulele T obținute de la pacientul cu diabet Mellitus insulino dependent care este tratat, iar specificitatea celulelor T a fost dezvoltată printr-un contact in vitro cu analogul de peptidă p₂₇₇ definit în revendicarea 1.
8. Analog de peptidă p 277, conform revendicărilor 6 și 7, caracterizat prin aceea că celulele T au specificitate in vitro pentru analogul de peptidă p₂₇₇ definit în revendicarea 1.
9. Compoziție farmaceutică, caracterizată prin aceea că cuprinde un analog de pepetidă p₂₇₇ cu secvența definită în revendicarea 1 într-o cantitate eficientă și un purtător acceptabil farmaceutic și este utilizată pentru prevenirea și tratarea diabetului Mellitus insulino dependent.
10. Compoziție farmaceutică, conform revendicării 9, caracterizată prin aceea că analogul de pepetidă p₂₇₇ este ales dintre p₂₇₇(Val⁶), în care X| este Val, Xg este Cys, iar X3 este Thr; p277(Val¹¹) în care X| este Cys, Xg este Val, iar ><3 este Thr; p277(Val^B-Val¹¹) unde ambele X, și Xg sunt Val și Xg este Thr; p277(Lys¹⁹) unde ambele X1 și X₂ sunt Cys și X₃ este Lys; p₂₇₇(Val⁶-Lys¹⁹)unde X., este Val, X2 este Cys și X3 este Lys; p277(Val¹¹-Lys¹⁹) unde X.| este Cys, Xg este Val, iar X3 este Lys; p₂₇₇(Val⁶·¹¹Lys¹⁹) unde X₁ și X₂ sunt Val și X₃ este Lys.
11. Compoziție farmaceutică, conform revendicării 9, caracterizată prin aceea că, analaogul de peptidă p₂₇₇ este ales dintre p₂₇₇(Val¹¹), în care X1 este Cys, Xg este Val, iar X3 este Thr; p277(Val⁶-Val¹¹) unde ambele X.j și X2 sunt Val și X₃ este Thr; p₂₇₇(Val¹¹-Lys¹⁹) unde X., este Cys, X₂ sunt Val și X₃ este Lys și p₂₇₇(Val⁶¹¹RO 116777 Bl

Lys¹⁹) unde ambele Xt și X₂ sunt Val și X₃ este Lys
12. Compoziție farmaceutică conform revendicării 9 caracterizată prin aceea că cuprinde analogul de peptidă p₂₇₇(Val⁶-Val¹¹).
13. Metodă pentru diagnosticarea diabetului Mellitus insulino dependent incipient, caracterizată prin aceea că, constă în testarea sângelui sau a urinei cu ajutorul unui analog de peptidă p₂₇₇ folosit ca antigen pentru determinarea prezenței anticorpilor sau celulelor T, care reacționează imunologic cu hspBO uman cu ajutorul căreia se observă prezența pozitivă a anticorpilor anti-hsp6O sau celulelor T care imuno-reacționeazță cu hsp6O, indicând o mare posibilitate ca diabetul Mellitus insulino dependent să fie prezent într-o stare incipientă.
14. Metodă pentru diagnosticarea diabetului Mellitus insulino dependent incipient, conform revendicării 13, caracterizat prin aceea că prezența anticorpilor anti-hsp6O care este testată cu ajutorul unei analize de radioimunologie sau a unui test ELIZA.
15. Metodă pentru diagnosticarea diabetului Mellitus insulino dependent incipient, conform revendicării 13, caracterizat prin aceea că prezența unei celule T, care imuno-reacționează cu hsp6O este testată printr-un test de proliferare a celulelor T care cuprinde etapele:

i/ se prepară o fracție de celule mononucleare conținând celule T dintr-o probă de sânge de la pacient;

ii/ se adaugă la fracția de celule mononucleare un antigen ales dintre un analog de peptidă p₂₇₇ din revendicarea 1;

iii/ se incubează fracția de celule în prezența antigenului pentru o anumită perioadă de timp și în condiții corespunzătoare unei culturi;

iv/ se adaugă o nucleotidă inscripționată în cultura de celule incubate la faza (iii) pentru o perioadă de timp corespunzătoare, înainte de sfârșitul perioadei de incubare, pentru a asigura încorporarea nucleotidei inscripționate în AND-ul celulelor T care proliferează;

v/ se determină o cantitate de celule T care proliferează prin analizarea cantității de nucleotidă inscripționată, incorporată în celule T.
16. Metodă pentru diagnosticarea diabetului Mellitus insulino dependent incipient, conform revendicării 13 caracterizat prin aceea că prezența unei celule T care imuno-reacționează cu hsp6O este testată printr-un test de răspuns la citocină a celulelor T care cuprinde etapele:

i/ se prepară o fracție de celule mononucleare conținând celule T dintr-o probă de sânge de la pacient;

ii/ se adaugă la fracția de celule mononucleare un antigen ales dintre un analog de peptidă p₂₇₇ din revendicarea 1;

iii/ se incubează fracția de celule în prezența antigenului pentru o anumită perioadă de timp și în condiții corespunzătoare unei culturi;

iv) se măsoară prezența citocinei secretate de limfocite în mediu, în care citocină este IFN-gama, IL-2, IL-4, IL-6, IL-1O, TFN-alfa sau TGF-beta.