RO120268B1 - Vaccin polienv, pentru virusul imunodeficienţei umane - Google Patents

Vaccin polienv, pentru virusul imunodeficienţei umane Download PDF

Info

Publication number
RO120268B1
RO120268B1 RO98-01218A RO9801218A RO120268B1 RO 120268 B1 RO120268 B1 RO 120268B1 RO 9801218 A RO9801218 A RO 9801218A RO 120268 B1 RO120268 B1 RO 120268B1
Authority
RO
Romania
Prior art keywords
vaccine
hiv
recombinant
env
protein
Prior art date
Application number
RO98-01218A
Other languages
English (en)
Inventor
Julia Hurwitz
Christopher Coleclough
Randall Owens
Karen Slobod
Original Assignee
St. Jude Children's Research Hospital
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by St. Jude Children's Research Hospital filed Critical St. Jude Children's Research Hospital
Publication of RO120268B1 publication Critical patent/RO120268B1/ro

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/21—Retroviridae, e.g. equine infectious anemia virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/08—RNA viruses
    • C07K14/15—Retroviridae, e.g. bovine leukaemia virus, feline leukaemia virus human T-cell leukaemia-lymphoma virus
    • C07K14/155—Lentiviridae, e.g. human immunodeficiency virus [HIV], visna-maedi virus or equine infectious anaemia virus
    • C07K14/16—HIV-1 ; HIV-2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/24143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24171—Demonstrated in vivo effect
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
    • C12N2740/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
    • C12N2740/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16211—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV gagpol
    • C12N2740/16222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Vaccinul polienv cuprinde cel puţin 4 până la aproximativ 10.000 virusuri recombinate, diferite, fiecare cuprinzând un acid nucleic, variantă env (EV), care codifică o variantă diferită de proteină de înveliş, în cazul unei proteine de înveliş, a virusului imunodeficienţei umane (HIV), în care: a) acidul nucleic EV codifică ambele regiuni, variabilă şi constantă, ale variantei de proteină de înveliş; b) vaccinul polienv este capabil să provoace cel puţin un răspuns imun celular şi un răspuns imun umoral, la un mamifer, împotriva unei tulpini HIV; şi c) vaccinul polienv este capabil să provoace un răspuns imun, faţă de o tulpină HIV, pentru care proteinele de înveliş nu sunt incluse în vaccinul polienv.

Description

Invenția se referă la un vaccin polienv pentru virusul imunodeficienței umane (HIV), care cuprinde un amestec de cel puțin 4 și până la 10.000 virusuri vaccinia recombinante, care exprimă fiecare un acid nucleic variantă env (EV) care codifică o variantă diferită de proteină de înveliș HIV.
Vaccinurile sunt corespunzătoare pentru vaccinarea mamiferelor, inclusiv oameni, în scopul de a asigura răspunsuri imune surprinzător de intensificate celulare și/sau umorale față de infecția HIV. Suplimentar, invenția se referă la o metodă pentru obținerea și utilizarea unui astfel de vaccin.
Virusul SIDA va revendica probabil 10 milioane de vieți în jurul anului 2000 constituind o preocupare de vârf pretutindeni în ceea ce privește sănătatea [vezi, DeVita, et a/., AIDS, Etiology, Diagnosis, Treatment and Prevention, 3rd edition, J.B. Lippincott Co., Philadelphia, PA (1992); Wong-Staal, în Virology, p. 1529-1543; și Hirsch, et al., în Virology, p.1545-1570], Modelarea unui vaccin HIV eficient constituie o provocare deosebită pentru imunologi, deoarece enzima transcriptază inversă implicată în replicarea HIV are o rată ridicată de eroare. Aceasta are ca urmare numeroase tulpini HIV mutante care au proteinele învelișului exterior sau învelișului cu secvențe de proteină vacante. Aceste proteine ale învelișului sunt recunoscute adesea ca antigeni diferiți de către sistemul imun al mamiferelor, care produc mai mult de 109 limfocite noi pe zi numai pentru scopul unic de contracarare a antigenilor străini. Celule B și respectiv T constituie conponentele celulare și umorale ale răspunsului imun.
Un exemplu bun al puterii calitative a unor astfel de răspunsuri imune este prezentat în pacienți infectați HIV și macaci infectați SIV. în fiecare caz, au loc reprize succesive de infecție, imunitate și stabilirea de variante ale HIV sau SIV [Wrin, et al., J. Acquir. Immune Defic. Syndr. 7:211-219 (1994); Bums and Desroisiers, Cur. Topics Microbiol. Immunol. 188:185-219 (1994)]. Cu fiecare ciclu, diversitatea determinanților antigenici ai HIV (și răspunsurile imune corespondente) sunt crescute, astfel că aceste răspunsuri imune neutralizează un domeniu larg de variante ale SIV sau HIV și suprainfecția este în mare măsură inhibată.
Cu toate acestea, pacienții SIDA dezvoltă răspunsuri imune compromise, ce devin insuficiente pentru prevenirea infecției virale HIV de la depășirea sistemului imun al pacientului. Aceasta se poate datora în parte stabilirii variantelor HIV ale căror proteine variante ale învelișului nu sunt recunoscute de sistemul imun al pacientului și astfel scapă de distrugere (Sci. Amer. August 1995 pp). în astfel de cazuri, chiar dacă răspunsul imun este capabil să prevină infecția de novo (de exemplu, mutația persistentă a virusului în situri sechestrate privilegiat), infecția HIV poate în final să depășească răspunsul imun al pacientului [Pantaleo et al., Nature 362:355-358(1993); Embreston et al., Nature 362:359-362 (1993)].
Identificarea determinanților antigenici ai celulelor B și T printre proteinele HIV rămâne incompletă. Proteina de înveliș a HIV a fost caracterizată ca având regiuni variabile (V1-V5) și regiuni constante (C1-C5). O peptidă reprezentativă a regiunii a fost denumită determinantul principal de neutralizare (PND) et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 86:67686772 (1989)], deși alte regiuni ale proteinei de înveliș pot fi, de asemenea, implicate în provocarea unui răspuns imun. Proteina de lungime întreagă a învelișului de la HIV conține circa 850 la 900 aminoacizi, cu variația în lungime datorată hipermutației [Starcich et al., Cell 45:637(1986)].
Primele vaccinuri împotriva HIV evaluate în experimente clinice au fost concepute să prezinte numai proteinele învelișului, sau porțiuni ale acestuia, la sistemul imun. Totuși, răspunsurile de neutralizare față de o singură proteină sau câteva proteine ale învelișului nu recunosc izolate diverse ale HIV și indivizii nu au fost protejați de infecție [Belshe et al., J.
RO 120268 Β1
Am. Med. Assoc. 272:431-431 (1994); U.S. Patent No. 5,169,763; PCT publication WO 1 87/06262; Zagury et al., Nature 332:728-731 (1988); Kieny et al., Int. Conf. AIDS 5:541 (1989); Eichberg, Int. Conf. AIDS 7:88 (1991); Cooney et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 3 90:1882-1886 (1993); Graham et al., J. Infect. Dis. 166:244-252 (1992); J. Infect. Dis.
167:533-537 (1993); Keefer et al., AIDS Res. Hum. Retrovlr. 10 (Suppl. 2):S139-143 (1994);5
Gors.e, AIDS Res. Hum. Retrovir. 10 (Suppl. 2):141-143 (1994); McEIrath et al., J. Infect.
Dis. 169:41-47 (1994); Fauci, Science 264:1072-1073 (May 1994)].7
Ca urmare, există necesitatea presantă să se descopere vaccinuri și metode care să provoacă un răspuns imun suficient pentru a trata sau pentru a preveni infecțiile HIV.9
Prin prezenta invenție se intenționează să se depășească una sau mai multe dintre deficiențele lucrărilor din domeniu. în special, vaccinul polienv conform invenției asigură în 11 mod avantajos un răspuns imun mai robust. Acesta se bazează pe forța sa de a recruta compartimentele celulei B, celulei helper T și celulei T citotoxice ale răspunsului imun pentru imu- 13 nitate umorală și celulară eficientă. De exemplu, vaccinul conform prezentei invenții provoacă o complexitate mare a activităților anticorpului specific HIV. Analizele de neutralizare HIV 15 demonstrează că anticorpii provocați sunt de calitate superioară.
în mod surprinzător, invenția poate genera răspunsuri imune împotriva tulpinilor HIV 17 naive, adică tulpini HIV pentru care proteinele învelișului nu sunt incluse în amestecul polienv. 19
Pentru a asigura vaccinuri HIV mai eficiente, conform invenției se realizează un vaccin polienv care cuprinde cel puțin 4 până la aproximativ 10000 virusuri recombinante 21 diferite, fiecare cuprinzând un acid nucleic variantă env (EV) care codifică o variantă diferită de proteină de înveliș, în cazul unei proteine de înveliș a virusului imunodeficienței umane 23 (HIV), în care:
a) acidul nucleic EV codifică ambele regiuni, variabilă și constantă, a variantei de pro- 25 teină de înveliș;
b) vaccinul polienv este capabil să provoace cel puțin un răspuns imun celular și un 27 răspuns imun umoral la un mamifer, împotriva unei tulpini HIV; și
c) vaccinul polienv este capabil să provoace un răspuns imun față de o tulpină HIV 29 pentru care proteinele de înveliș nu sunt incluse în vaccinul polienv.
într-o variantă de realizare, vaccinul cuprinde de la 10 la aproximativ 100 virusuri 31 recombinante, care cuprind variante env diferite ale HIV.
într-o realizare preferată, virusurile recombinante sunt vaccinia, virusul canary pox, 33 adenovirus și virusul adeno asociat (AAV).
într-o variantă de realizare, varianta de proteină de înveliș cuprinde gp120 și o 35 porțiune a gp41 suficientă să permită oligomerizarea proteinelor env. în această variantă de realizare a invenției, acidul nucleic EV cuprinde un fragment de restricție Kpnl-Bsml al unei 37 secvențe de nucleotidă care codifică proteina de înveliș HIV.
într-o altă formă preferată de realizare, acidul nucleic EV este izolat de la pacienți cu 39 un virus HIV dintr-o zonă geografică restrânsă, sau de la pacienți infectați cu un virus HIV provenind din grupări genetice cu strămoș comun. 41 într-o altă formă preferată, vaccinul cuprinde variante ale proteinei exprimate de virusul recombinant. 43 într-o variantă de realizare, vaccinul polienv cuprinde în plus cel puțin un purtător acceptabil farmaceutic, un adjuvant și un compus chemoterapeutic antiviral. 45
Vaccinul conform invenției se utilizează în sensul provocării unui răspuns umoral sau a unui răspuns imun celular, sau atât a unui răspuns umoral, cât și a unui răspuns imun 47 celular, împotriva unui virus al imunodeficienței umane.
RO 120268 Β1 într-o realizare preferată, virusul recombinant este un virus în care vaccinul polienv vaccinia se administrează subcutanat. Un avantaj în plus al invenției este că administrarea subcutanată a virusului vaccinia nu are ca urmare formarea unei leziuni, evitând astfel eliberarea vacciniei infecțioase, care este o amenințare potențială pentru o populație imunocompromisă.
Invenția realizează, de asemenea, un vaccin polienv care mai conține:
a) cel puțin o proteină env HIV recombinantă, sau
b) o cantitate eficientă din cel puțin un vector AND care codifică conform expresiei pentru o proteină env HIV recombinantă, sau
c) atât o proteină cu HIV recombinantă, cât și o cantitate eficientă din cel puțin un vector AND care codifică conform expresiei pentru o proteină env HIV recombinantă, pentru producerea, inițierea sau susținerea unui răspuns imun umoral sau celular, sau ambelor, în care vaccinul polienv conform invenției, proteina env HIV recombinantă și/sau vectorul ADN care codifică, conform expresiei, pentru o proteină env HIV recombinantă, pot fi administrate în orice succesiune. Vectorul ADN este adaptat pentru administrare prin proiectil de gene, iar proteina env HIV recombinantă reprezintă un amestec cu un adjuvant sau este adaptată pentru administrare intramusculară, sau ambele.
într-o variantă preferată de realizare a invenției, cel puțin unul dintre virusurile recombinante menționate este o plasmida bifuncțională care poate servi ca vaccin ADN și ca vector recombinant al virusului, cuprinzând un situs heterolog de inserții sub controlul atât al unei secvențe de control de expresie de la animal, cât și al unei secvențe de control de expresie virală. în cazul acestei variante, secvența de control de expresie animală este un promotor timpuriu direct citomegalovirus (CMV) și secvența de control a expresiei virale este un promotor timpuriu al virusului vaccinia, un promotor târziu al virusului vaccinia, sau ambele.
Vaccinul cuprinde o genă heterologă, în care gena heterologă este un acid nucleic variantă env (EV) care codifică atât regiunile variabile, cât și regiunile constante ale unei variante de proteină de înveliș ale unei proteine de înveliș HIV.
Conform invenției, se asigură, de asemenea, o metodă pentru realizarea unui vaccin polienv, care cuprinde combinarea în amestec a cel puțin 4 până la 10000 virusuri recombinante diferite, pentru a obține vaccinul polienv menționat, și, opțional, adăugarea a cel puțin unui purtător acceptabil farmaceutic, a unui adjuvant sau a unui compus chemoterapeutic antiviral.
Avantajele invenției constau în aceea că provoacă răspunsuri imune neașteptat de intense prin expresia și/sau prezentarea a numeroase variante ale proteinei de înveliș, fiecare conținând atât regiuni constante, cât și variabile, având de preferință o structură care este substanțial similară celei a unei proteine de înveliș nativ a HIV. Răspunsurile imune intensificate recunosc tulpini HIV în plus față de acele tulpini care exprimă proteinele de înveliș furnizate în vaccinul polienv. Astfel, scopul unui astfel de vaccin este de a asigura răspunsuri imune intensificate la o gamă largă de tulpini HIV, răspunsuri imune care sunt corespunzătoare pentru tratarea sau prevenirea infecției (sau infecției continuate datorită mutației) prin diferite tulpini ale virusului.
Răspunsul imun specific HIV, generat cu vaccinul virus recombinant polienv, poate fi amplificat în continuare prin inițierea sau susținerea unui răspuns imun umoral sau celular, sau a ambelor, prin administrarea unei cantități eficiente din cel puțin o proteină env recombinantă HIV, sau un vector ADN, sau a ambelor. De preferință, proteina recombinantă sau vectorul ADN este, de asemenea un vaccin polienv. Oricare dintre metodele de vaccinare furnizate pot fi folosite în orice ordine. De exemplu, un subiect poate fi inițiat cu un vaccin polienv virus recombinant, urmat de susținere cu vaccin ADN, cu o susținere finală cu un
RO 120268 Β1 vaccin proteină recombinantă. De preferință, proteina recombinantăenv HIV este în amestec 1 cu un adjuvant. într-o realizare specifică, exemplificată, infra, proteina recombinantă env HIV se administrează intramuscular. De preferință, un vaccin ADN se administrează cu o genă 3 accelerată.
Alte obiecte, trăsături, avantaje, utilizări și realizări ale prezentei invenții vor fi evi- 5 dente pentru persoanele de specialitate în domeniu, din descrierea detaliată care urmează și exemplele referitoare la prezenta invenție. 7 în continuare, se prezintă pe scurt figurile care însoțesc invenția:
FIG. 1. Reprezentare schematică a orientării genei HIV-1 în genomul unui virus 9 vaccinia. Gena de înveliș a HIV-1 este plasată între segmentele drept și stâng ale locusului timidin kinazei.Există un sit Hindll la C-terminusul genei învelișului HIV-1. Inserția corespun- 11 zătoare dă un fragment Hindill de aproximativ 7 kb în mărime. Southern blot-uri cu această imagine au confirmat poziția și orientarea corectă a genei învelișului HIV-1. 13
FIG. 2. Reprezentare grafică a datelor care arată că răspunsul anticorpului s pecific HIV este de lungă durată la mamifere. Sunt prezentate rezultate ale serurilor de șoarece 15 reprezentative testate în ELISA pentru anticorpi specifici HIV. Fiecare probă s-a diluat 1:100 (bare negre), 1:1.000 (bare hașurate) și 1:10.000 (bare albe) înaintea testării pe plăci ELISA 17 acoperite HIV-1. Șoarecii de testat s-au probat la diverse momente (1 lună, 4 luni și 6 luni) după injectarea a 107 pfu dintr-un construct de virus vaccinia care exprimă o proteină de 19 înveliș a HIV-1. Șoarecele de control s-a imunizat cu un virus vaccinia care nu conține nici o secvență a învelișului. Sunt prezentate bare cu eroarea standard. 21
FIG. 3. Reprezentare grafică a datelor care arată cum doza de virus vaccinia afectează inducerea cel puțin a unui răspuns imun, inclusiv producerea anticorpului specific 23
HIV. Probe reprezentative din ser de șoarece s-au testat prin ELISA pe plăci acoperite HIV-1. Probele de ser s-au luat de la șoareci injectați cu 105,106, și 107 pfu dintr-un virus vaccinia 25 care exprimă proteina de înveliș HIV-1. Probele de ser s-au testat la aproximativ 3 săptămâni după injectare. Fiecare probă s-a diluat 1:100 (bare negre), 1:1.000 (bare hașurate) și 27 1:10.000 (bare albe) înaintea testării pe plăci ELISA acoperite HIV-1. Sunt prezentate bare cu eroarea standard. 29
FIG. 4. Reprezentare grafică care arată că amestecarea constructelor de virus vaccinia nu compromite provocarea anticorpului specific HIV la mamifere injectate. S-au 31 testat probe reprezentative de ser de la șoarece prin ELISA la aproximativ 2 luni după injectarea a IO7 pfu virus vaccinia care exprimă proteina(ele) de înveliș HIV-1. Single identifică 33 o probă de la un șoarece care a primit un singur virus vaccinia. Mix reprezintă o probă de la un șoarece care a primit un amestec de virusuri vaccinia care exprimă 5 proteine distincte 35 ale învelișului. Fiecare probă s-a diluat 1:100 (bare negre), 1:1.000 (bare hașurate) și 1:10.000 (bare albe) înaintea testării pe plăci ELISA acoperite HIV-1. Sunt prezentate bare 37 ale erorii standard.
FIG. 5. Producerea recombinării noi prin substituția produselor PCR pentru sec- 39 vențeie pEvenv4 BH10. Este prezentată metoda substituirii secvenței. Produsele PCR s-au substituit pentru secvențe BH10 env respective la siturile unice de restricție enzimatică Kpnl 41 și Bsml. După tăierea plasmidei și ligare cu produsele PCR, plasmidele noi s-au recombinat cu tipul sălbatic VV pentru a crea vectori de expresie W-. 43
FIG. 6. Răspunsuri în ELISA Abbott după imunizare. S-au testat seruri de la toți cei cimpanzei cu testul clinic Abbott (vezi Materiale și metode, infra). Rezultatele pentru fie 45 care probă de ser (axa Y) sunt înregistrate pentru fiecare dată a testului (axa X). S-au observat răspunsuri crescute la cimpazeii imunizați cu vaccinul amestecat Vvenv. 47
RO 120268 Β1
FIG. 7. Harta plasmidei difuncționale care poate acționa atât ca un vaccin ADN, cât și ca un vector recombinant 14/. Prezența promotorului timpuriu direct citomegalovirus (CMV) și a promotorilor timpuri și târzii ai virusului vaccinia (W) permite expresia genei străine în celule mamifere, sau celule infectate W.
Descoperirea răspunsurilor imune intensificate surprinzător față de vaccinuri mixte polienv HIV. încercările anterioare de a asigura vaccinuri împotriva diferitelor tulpini ale HIV s-au axat pe una sau mai multe regiuni variabile ale gpl20 sau gpl60. A fost de așteptat ca astfel de regiuni variabile, furnizate într-un vaccin să poată asigura protecție largă împotriva infecției HIV. Cu toate acestea, astfel de vaccinuri nu au avut, deoarece răspunsul imun indus nu recunoaște numeroase tulpini diferite ale HIV. Prin urmare, există o nevoie critică de a asigura vaccinuri care provoacă răspunsuri imune la numeroase tulpini ale HIV, astfel încât vaccinurile să fie corespunzătoare pentru tratamentul și/sau prevenirea HIV.
S-a constat că răspunsuri imune neașteptat de intensificate ințiale și secundare (susținere) pot fi induse împotriva câtorva sau a numeroase tulpini HIV diferite, prin folosirea vaccinurilor polienv care conțin un amestec de cel puțin până la în jur de 1.000 și, posibil, în jur de 10.000 virusuri recombinante care codifică flecare o variantă diferită a proteinei de înveliș (EPV). De asemenea, vaccinul poate să conțină EPV exprimate de virusuri, de exemplu, cum s-au produs în celulele gazdă folosite pentru producerea virusurilor.
Termenii inițiere sau primar și susținut sau susținere sunt folosiți aici cu referire la imunizări inițiale și, respectiv ulterioare, adică în conformitate cu definițiile acestor termeni folosite normal în imunologie.
Acidul nucleic care codifică EPV (acid nucleic variant al învelișului (EV) poate fi izolat de la aceeași populație sau populații diferite (de exemplu, geografic) de oameni infectați cu HIV. Alternativ, acizi nucleici EV diferiți se pot obține din orice sursă și se pot selecta pe baza căutării diferențelor de secvențe în secvența de codificare, sau prin evaluarea diferențelor răspunsurilor imune provocate umorale și/sau celulare față de tulpini HIV multiple, in vitro sau in vivo, conform metodelor cunoscute.
Descoperirea inițială a fost în legătură cu vaccinuri virus vaccinia recombinant. Cu toate acestea, așa cum poate fi apreciat imediat de către un specialist cu pregătire obișnuită în domeniu, se poate folosi orice virus recombinant pentru a exprima antigeni polienv pentru un vaccin al invenției. Mai mult, folosirea vaccinurilor virale multiple poate preîntâmpina răspunsuri imune antivirale, care pot fi atribuite unui rapel cu vaccinul viral mai puțin eficient (datorită posibilei potențări a unui răspuns viguros antivirus).
Așa cum se apreciază imediat de către o persoană de specialitate în domeniu, inventatorii au găsit în plus că susținerea cu proteina sau proteinele env HIV recombinate, de preferință, proteine potențează suplimentar metodele de imunizare ale invenției. Proteina sau proteinele env HIV pot să corespundă proteinelor env HIV exprimate în vaccinul polienv, sau ele pot fi diferite de proteinele env HIV.
în mod similar, se poate aprecia de către persoana de specialitate, că metodele de imunizare ale invenției de față sunt intensificate de folosirea unui vaccin ADN. Vaccinul ADN se poate folosi ca un sprijin, de exemplu, cum s-a descris mai sus referitor la proteinele HIV recombinante. Alternativ, vaccinul ADN poate fi folosit pentru a iniția imunitatea, cu vaccinul sau vaccinurile virale recombinante folosite pentru susținerea răspunsului imun anti-HIV. La fel ca vaccinul rapel cu proteină env recombinantă, vaccinul ADN poate să cuprindă unul sau mai mulți vectori pentru expresia unei sau mai multor gene envHIV. Suplimentar, genele env HIV pot să corespundă genelor exprimate de vaccinul virus recombinant, sau ele pot fi diferite. într-o realizare preferată, vectorii sunt preparați pentru expresie în vaccinul virus recombinant și în celule mamifere transfectate ca parte a unui vaccin ADN.
RO 120268 Β1
Răspunsul imun (umoral și/sau celular) se dovedește a fi eficient pentru un domeniu 1 mai larg de tulpini ale unui virus infecțios, cum ar fi HIV și nucleic se limitează la tulpinile virusului care exprimă variantele specifice proteinei de înveliș (EPV) asigurate prin vaccinul 3 polienv. Astfel, invenția de față asigură EPV multiple codificate de un vaccin viral recombinant care dă răspunsuri imune intensificate neașteptat la numeroase tulpini ale HIV. 5
Vaccinuri și vaccinare polienv
Astfel, conform invenției, se furnizează, într-un aspect, vaccinuri polienv care folo- 7 sesc amestecuri de cel puțin 4, și până la 10.000 virusuri vaccinia recombinante diferite, care exprimă, fiecare, o variantă diferită a proteinei învelișului sau o porțiune antigenică a 9 acesteia. Așa cum poate fi apreciat cu ușurință de către un specialist în domeniu, s-ar putea folosi 4 la circa 1.000, sau de preferință, circa 10 la circa 100 virusuri recombinante diferite. 11 Un specialist cu pregătire obișnuită în domeniu poate aprecia imediat că, în plus, alte virusuri pot fi folosite pentru vaccinuri. Exemple de virusuri corespunzătoare care pot acționa ca 13 gazde virale recombinante pentru vaccinuri suplimentar în plus la vaccinia, includ canary pox, adenovirus și virusul asociat adeno. De asemenea, sunt furnizate metode de obținere 15 și utilizare a unor astfel de vaccinuri polienv.
Un vaccin polienv al prezentei invenții induce cel puțin un răspuns imun umoral și un 17 răspuns imun celular la un mamifer căruia i-a fost administrat vaccinul polienv, dar răspunsul la vaccin este subclinic, sau este eficient în intensificarea a cel puțin unui răspuns imun față 19 de cel puțin o tulpină a HIV, astfel că administrarea vaccinului este adecvată pentru scopurile vaccinării. 21
Vaccinuri virale. Diverse gazde virale prelucrate prin inginerie genetică (virusuri recombinante) pot fi folosite pentru a prepara vaccinuri virale polienv pentru administrarea 23 antigenilor polienv HIV. Vaccinurile virale sunt deosebit de avantajoase, prin aceea că, componenta infecției virale inițiază un răspuns imun viguros care țintește activarea limfocitelor 25 B, limfocitelor helper T și limfocitelor citotoxice T. Numeroase specii de virusuri pot fi folosite ca gazde virale recombinante pentru vaccinurile invenției. Un virus recombinant preferat 27 pentru un vaccin viral este virusul vaccinia [Internațional Patent Publicatin WO 87/06262, Octomber 22, 1987, de Moss et al.; Cooney et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 90:1882- 29
6(1993); Graham et al., J. Infect. Dis. 166:244-52 (1992); McEIrath et al., J. Infect. Dis. 169:41-7 (1994)]. în altă variantă de realizare, poate fi sit virusul recombinant canary pox 31 [Pialoux et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses 11:373-81 (1995), erratum in AIDS Res. Hum. Retroviruses 11:875 (1995); Anderson et al., J. Infect. Dis. 174:977-85 (1996); Fries et al., 33 Vaccine 14:428-34 (1996); Gonczol et al., Vaccine 13:1080-5 (1995)]. Altă alternativă sunt virusurile adenovirus imperfect sau adenovirus [Gilardi-Hebenstreit et al., J. Gen. Virol. 35 71:2425-31 (1990); Prevec etal., J. Infect. Dis. 161:27-30 (1990); Lubecket a/., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6763-7 (1989); Xiang et al., Virology 219:220-7 (1996)]. Alți vectori virali 37 corespunzători includ retrovirusuri care sunt introduși în celule cu domeniul de gazdă amfotropică [vezi Miller, Human Gene Ther. 1:5-14 (1990); Ausubel et al., Current Protocols 39 in Molecular Biology, § 9] și virusuri ADN atenuate sau imperfecte, cum ar fi dar fără a se limita la, virus herpes simplex (HSV) [vezi, de exemplu, Kaplitt et al., Molec. Cell. Neurosci. 41
2:320-330 (1991)], pappilomavirus, virus Epstein Barr (EBV), virus asociat adeno (AAV) [vezi, de exemplu, Samulki et al., J. Virol. 61:3096-3101 (1987); Samulki et al., J. Virol. 43 63:3822-3828 (1989)] și altele.
Vaccinuri ADN. O alternativă la un vaccin tradițional care cuprinde un antigen și un 45 adjuvant implică introducerea directă in vivo a ADN-ului care codifică antigenul în țesuturile unui subiect pentru expresia antigenului de către celulele țesutului subiectului. Astfel de 47 vaccinuri sunt denumite aici vaccinuri ADN sau vaccinuri bazate pe acid nucleic. Vaccinuri ADN sunt descrise în Internațional Patent Publication WO 95/20660 și Internațional 49
RO 120268 Β1
Patent Publication WO 93/19183. Capacitatea ADN-ului injectat direct care codifică o proteină virală de a provoca un răspuns imun protector a fost demonstrată în numeroase sisteme experimentale [Conry et al., Cancer Res., 54:1164-1168 (1994); Cox et al., Virol, 67:5664-5667 (1993); Davis et al., Hum. Mole. Gene/.,2:1847-181 (1993); Sedegah et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 9Λ:9866-9870 (1994); Montgomery et al., DNA Cell Bio., 12:777-783; Ulmer etal., Science, 259:1745-1749 (1993); Wang et al., Natl. Acad. Sci., 90:4156-4160 (1993); Xiang etal., Virology, 199:132-140 (1994)]. Studii pentru analizarea acestei strategii în neutralizarea virusului influenza au folosit atât proteine ale învelișului viral, cât și proteine virale interne pentru inducerea producerii anticorpilor, dar, în special, s-au focalizat asupra proteinei virale hemaglutinină (HA) [Fynan etal., DNA Cell. Biol., 12:785-789 (1993A); Fynen et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 90:11478-11482 (1993B); Robinson et al., Vaccine, 11:957 (1993); Websteretal., Vaccine, 12:1495-1498 (1994)].
Vaccinarea prin introducerea directă de ADN care codifică o proteină env HIV pentru a provoca un răspuns imun protector produce atât răspunsuri mediate celular, cât și umorale. Aceasta este analoagă rezultatelor obținute cu virusuri vii [Raz etal., Proc. Natl. Acad. Sci., 91:9519-9523 (1994); Ulmer, 1993, supra; Wang, 1993, supra; Xiang, 1994, supra]. Studii cu dihori albi arată că vaccinuri ADN împotriva proteinelor virale interne, conservate, ale influenza, împreună cu glicoproteine de suprafață, sunt mai eficiente împotriva variantelor antigenice ale virusului influenza decât sunt fie vaccinurile inactivate, fie vaccinuri subvirionice [Donnelly et al., Nat. Medicine, 6:583-587 (1995)]. în schimb, răspunsuri imune reproductibile la ADN care codifică nucleoproteine ce durează în esență pe toata viața animalului au fost raportate la șoareci [Yankauckas et al., DNA Cell Biol., 12:771-776 (1993)].
Așa cum este binecunoscut în domeniu, un număr mare de factori pot influența eficiența expresiei genelor antigenului și/sau imunogenicitatea vaccinurilor ADN. Exemple de asemenea factori includ reproductibilitatea inoculării, construcția vectorului plasmid, alegerea promotorului folosit să conducă expresia genei antigenului și stabilitatea genei introduse în plasmid. în funcție de originea lor, promotorii diferă în specificitatea țesutului și eficiență în inițierea sintezei mARN [Xiang et al., Virology, 209:564-579 (1994); Chapman et al., Nucle. Acids Res., 19:3979-3986 (1991)]. Până în prezent, majoritatea vaccinurilor ADN din sisteme mamifere s-au bazat pe promotori virali derivați de la citomegalovirus (CMV). Aceștia au eficiență bună atât în inocularea în mușchi, cât și în piele, la un număr de specii mamifere. Alt factor cunoscut pentru afectarea răspunsului imun provocat prin imunizare ADN este metoda eliberării ADN-ului; căile parenterale pot da rate scăzute ale transferului genei și pot să producă variabilîtate considerabilă a expresiei genei [Montgomery, 1993, supra]. Plasmidele pentru inoculare cu viteză ridicată, folosind o genă accelerată, au intensificat răspunsurile imune ale șoarecilor [Fynan, 1993B, supra; Eisenbrown et al., DNA Cell Biol., 12:791-797 (1993)], probabil datorită unei eficiente mai mari a transfecției ADN și prezentării mai eficiente a antigenului de către celulele dendritice. Vectori care conțin vaccinul bazat de acid nucleic al invenției pot fi introduși, de asemenea, în gazda dorită, prin alte metode cunoscute în domeniu, de exemplu, transfecție, electroporare, microinjecție, transducție, fuziune de celule, dextran DEAE, precipitare fosfat de calciu, lipofecție (fuziune de lizozomi), sau un transportator de vector ADN [vezi, de exemplu, Wu etal., J. Biol. Chem. 267:963-967 (1992); Wu și Wu, J. Biol. Chem. 263:14621-14624 (1988); Hartmut et al., cerere de brevet CA 2012311, depusă în 15 martie 1990].
Plasmide bifuncționale pentru virus și vaccinuri ADN
Un aspect preferat al prezentei invenții se referă la obținerea prin inginerie a plasmidelor bifuncționale care pot servi ca un vaccin ADN și un vector virus recombinant. Injectarea directă a plasmidei ADN purificat, adică, ca un vaccin ADN, va provoca un răspuns imun față de antigenul exprimat de către plasmidă la subiecții test. De asemenea, plasmida va fi utilă ca vehicul de imunizare cu virusuri recombinante vii.
RO 120268 Β1
Plasmida bifuncțională a invenției asigură o genă heteroloagă, sau un sit de inserție 1 pentru o genă heterologă, sub controlul a două secvențe diferite de control a expresiei: o secvență de control al expresiei animale și o secvență de control al expresiei virale. Ter- 3 menul sub control se folosește în sensul său obișnuit, adică operabil sau asociat operativ cu, în sensul că secvența de control al expresiei, cum ar fi un promotor, asigură expresia 5 pentru expresia unei gene heteroloage. într-o realizare preferată, secvența de control al expresiei animale este un promotor mamifer (de asemenea, promotorii aviani sunt avuți în 7 vedere de prezenta invenție); într-o realizare specifică, promotorul este promotorul timpuriu direct citomegalovirus (CMV) (vezi, fig. 7). într-o realizare specifică suplimentară, promotorul 9 virusului este un promotor timpuriu al virusului vaccinia sau un promotor târziu al virusului vaccinia sau, de preferință, ambii (fig. 7). Subiecții ar putea fi vaccinați cu un regim multi- 11 serie, cu plasmida bifuncțională administrată ca ADN și, la un moment diferit, dar în orice ordine, ca un vaccin virus recombinant. Invenția are în vedere administrări unice sau multiple 13 ale plasmidei bifuncționale ca un vaccin ADN sau ca un vaccin virus recombinant, sau ambele. Acest regim de vaccinare poate fi avut în vedere cu administrarea vaccinurilor de 15 proteină recombinante (infra), sau poate fi folosit cu vehicule de vaccinare suplimentare.
O persoană de specialitate cu pregătire obișnuită în domeniu poate să aprecieze ime- 17 diat că plasmidele bifuncționale din invenție pot fi folosite ca vectori de vaccinare polienv. Astfel, prin inserarea a cel puțin 4 până la circa 10.000, de preferință, 4 la 1.000 și mai 19 preferat, 10 la 100 gene env HIV diferite în plasmide bifuncționale se poate prepara un set correspondent de plasmide bifuncționale, util ca un vaccin polienv. 21
Vaccinuri de proteină recombinantă
Imunitatea activă provocată prin vaccinare cu o proteină env HIV sau proteine con- 23 form prezentei invenții, pot să inițieze sau să susțină un răspuns imun celular sau umoral. Proteina sau proteinele env HIV, sau fragmente antigenice ale acestora, se pot pregăti într- 25 un cu un adjuvant pentru prepararea unui vaccin, ermenul adjuvant se referă la un compus sau amestec care intensifică răspunsul imun față de un antigen. Un adjuvant poate servi ca 27 un depozit în țesut care eliberază lent antigenul și, de asemenea, ca un activator al sistemului limfoid care intensifică nespecific răspunsul imun [Hood, et al., Immunology, SecondEd., 29 1984, Benjamin/Cummings: Menlo Park, California, p.384]. Adesea, o provocare primară numai cu un antigen, în absența unui adjuvant, va eșua în a provoca un răspuns imun 31 umoral sau celular. Adjuvanții includ, dar nu sunt limitați la, adjuvantul complet al lui Freund, adjuvantul incomplet al lui Freund, saponină, geluri minerale cum ar fi hidroxidul de aluminiu, 33 substanțe active de suprafață, cum ar fi lizolecitină, polioli pluronici, polianioni, peptide, emulsii de ulei sau hidrocarburi, hemocianine de la melci, dinitrofenol și adjuvanți umani utili 35 potențiali, cum arfi BCG (bacili Calmette-Gueril) și Corynebacterium parvum. Alegerea unui adjuvant depinde de subiectul care trebuie vaccinat. De preferință, se folosește un adjuvant 37 acceptabil farmaceutic. De exemplu, un vaccin pentru om va evita adjuvanții emulsie de ulei sau hidrocarburi, incluzând adjuvantul complet și incomplet al lui Freunt. Un exemplu de 39 adjuvant adecvat pentru utilizare la oameni este alumul (gel de alumină). într-o realizare specifică, infra, proteina env HIV recombinantă se administrează intramuscular în alum. 41 Alternativ, vaccinul proteină env HIV recombinantă poate fi administrat subcutanat, intradermal, intraperitoneal, sau prin intermediul altor căi de administrare acceptabile pentru vaccin. 43
Administrarea vaccinului. Conform invenției, imunizarea împotriva HIV poate fi realizată cu un vaccin viral recombinant al invenției singur, sau în combinație cu un vaccin ADN 45 sau un vaccin proteină recombinantă, sau ambele. într-o realizare specifică, proteina env HIV recombinantă în alum este asigurată i.m. pentru susținerea răspunsului imun. 47
RO 120268 Β1
Fiecare doză de vaccin virus poate să conțină aceleași 4 la de preferință 4 la 1.000 și mai preferat, 10 la 100 recombinante diferite, fiecare exprimând o genă env HIV diferită. Alternativ, virusurile din vaccinurile subsecvente pot să exprime gene env HIV diferite. într-o altă realizare, vaccinurile virale polienv subsecvente pot să exprime gene env HIV diferite, într-o altă realizare, vaccinurile virale polienv ulterioare pot avea unele dintre virusuri în comun și altele care sunt diferite de vaccinul mai timpuriu. De exemplu, vaccinul de inițiere poate să conțină virusul vaccinia care exprimă proteine env HIV desemnate arbitrar 1-10. Un al doilea vaccin (rapel) poate să conțină virusul vaccinia (sau, de preferință, un virus diferit, cum ar fi canarypox sau adenovirus) care exprimă proteine env HIV 6-15, sau 11-20, etc.
Un vaccin ADN sau un vaccin proteină recombinantă poate avea un singur antigen proteină env HIV, sau antigeni multipli. De preferință, un vaccin ADN sau proteină recombinantă pentru utilizare în invenție cuprinde mai mult decât un antigen al proteinei env HIV. La fel ca vaccinurile virale ulterioare, proteina sau proteinele env HIV ale unui vaccin ADN sau vaccin al proteinei recombinante, poate să corespundă la o proteină env HIV exprimată în vaccinul viral polienv, sau poate fi diferită de oricare proteină env polienv.
în general, o realizare preferată a invenției are în vedere asigurarea celei mai mari varietăți posibile în fiecare protocol de vaccinare, pentru a expune receptorul la cel mai mare număr de proteine env HIV și să asigure astfel cea mai mare posibilitate pentru neutralizarea reactivității încrucișate cu un izolat HIV naiv.
Variante ale proteinei înveliș
Așa cum s-a arătat, EPV pentru utilizare în vaccinurile invenției se poate obține de la izolate geografice restrânse, sau diverse. Așa cum se poate aprecia de un specialist cu pregătire în domeniu, obținerea nucleotidelor env că, a genelor) din izolate naturale are numeroase avantaje: ele sunt ușor accesibile, EPV corespunde la proteine iteîn mod natural pentru care este dorit imunitatea și mutații HIV pot fi prinse repede din izolate noi.
EPV include, de asemenea polipeptide care au activitate imunogenică provocată de o secvență aminoacidă o secvență aminoacidă EPV are cel puțin un epitop sau determinant antigenic. Această secvență aminoacidă corespunde la cel puțin un fragment de 10-900 aminoacizi și/sau secvența consens a unei EPV HIV cunoscute. Astfel de EPV poate avea omologia globală sau identitatea de cel puțin 50% față de secvența aminoacidă a unei proteine cunoscute a învelișului, cum ar fi 50-99% omologie sau orice domeniu sau valoare de aici, provocând în același timp un răspuns imunogenic împotriva a cel puțin o tulpină a unui HIV.
Procentul omologiei se poate determina, de exemplu, prin compararea informației de secvență folosind programul de computer GAP, versiunea 6.0, accesibil de la University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG). Programul GAP utilizează metoda de aliniere a lui Needleman și Wunsch [J. Mol. Biol. 48:443 (1970)], cum s-a revizuit de Smith și Waterman [Adv. Appl. Math. 2:428 (1981)]. Pe scurt, programul GAP definește similaritatea ca numărul simbolurilor aliniate (adică, nucleotide sau aminoacizi) care sunt similari, împărțiți prin numărul total de simboluri în cea mai mică dintre cele 2 secvențe. Parametrii impliciți preferați pentru programul GAP includ: (1) o comparație unitară a matricei (conținând o valoare de 1 pentru identități și 0 pentru neidentități) și comparația matricei cântărite a lui Gribskov și Burgess, Nuci. Acids Res. 14:6745 (1986), cum s-a descris de către Schwartz și Dayhoff, ed., Atlas of Protein Sequence and Structure, Național Biomedical Research Foundation, Washington, DC (1979), pp. 353-358; (2) o penalizare de 3,0 pentru fiecare pauză și o penalizare suplimentară de 0,10 pentru fiecare simbol din fiecare pauză; și (3) nici o penalizare pentru pauzele finale.
RO 120268 Β1 într-o realizare preferată, o EPV a prezentei invenții este o variantă a cel puțin unei 1 proteine de înveliș HIV. De preferință, EPV include gpl20 și domeniul de oligomerizare al gp 41,cagpl40[Hallenberger, etal., Virology 190:510-514 (1993)]. Proteine cunoscute ale înve- 3 lișului HIV conțin circa 750 la 900 aminoacizi. Exemple de astfel de secvențe sunt accesibile cu ușurință din secvența HIV din baze de date comerciale și instituționale cum ar fi 5
GENBANK, sau copii publicate, cum ar fi Myers et al., Ed. Human Retroviruses and AIDS, A Compilation and Analysis of Nucleic Acid and Amino Acid Sequences, Voi. I and II, 7
Theoretical Biologyand Biophysics, LosAlamos, NM (1993). Substituții sau inserții ale unei EPV pentru obținerea EPV suplimentar, codificată printr-un acid nucleic pentru utilizare într- 9 un virus recombinant sau vaccinul polienv al prezentei invenții, pot include substituții sau inserții acel puțin unui rest aminoacid (1-25 aminoacizi). Alternativ, cel puțin un aminoacid 11 (de exemplu, 1-25 aminoacizi) poate fi îndepărtat dintr-o secvență EPV. De preferință, astfel de substituții, inserții sau deleții sunt identificate pe baza determinării secvenței proteinelor 13 învelișului obținută prin secvențare nucleotidică a cel puțin unui acid nucleic care codifică EPV de la un individ infectat cu HIV. 15
Exemple nelimitative de astfel de substituții, inserții sau deleții sunt făcute, de preferință, prin amplificarea secvențelor ADN env sau ARN de la pacienți infectați HIV-1, care 17 pot fi determinate prin experimentare de rutină pentru a furniza proprietățile structurale și funcționale modificate ale unei proteine de înveliș sau EPV. EPV astfel obținută are, de pre- 19 ferință, proprietăți antigenice diferite de EPV original. Astfel de diferențe antigenice pot fi determinate prin analize adecvate, de exemplu, prin testare cu un tablou de anticorpi mono- 21 clonali specifici pentru proteinele învelișului HIV într-un test ELISA.
Orice substituție, inserție sau deleție poate fi folosită atât timp cât proteina EPV rezul- 23 tată provoacă anticorpi care se referă la proteinele învelișului HIV, dar EPV are o imagine mărită față de anticorpii provocați de o a doua EPV. Fiecare din substituțiile, inserțiile sau 25 delețiile de mai sus poate include, de asemenea, un aminoacid modificat sau neobișnuit, de exemplu, cum s-a prevăzut în 37 C.F.R. § 1,822(p)(2). 27
Tabelul 1 care urmează prezintă exemple nelimitative ale variantelor alternative de proteine de înveliș HIV, care pot fi codificate printr-un virus recombinant, conform prezentei 29 invenții.
TABEL 1: Variante proteină de înveliș HIV
O m 1-4 b- O X£J ca > 55 O <M CU
ox 0 >* ε-
<5X < ox O z o
00 X 0 - t- n
CO M Q co E-·
Γ* βέ X X
r- X M X CU
X E-«
u> 2- w >
UT o
ir» > 1-4 UT V
X X ’β· Oi •Ψ
Cd X 0 »-H co rn > H •CC >- o
CM 3: X <N u CM Cd X
rd *-3 3t cd X £0 rM >» cd «: r-4 <
3= X O cd O*
o r*4 SO >♦, O « 3= O
CF» a fl* 2 ' X X CM > <n > »-t
OO >£ O b* X O CO t· CC X X
r* >A z Cd Cx3 r* > r- X
<9 x cx X ϋ Η Ό i * >* MO > X Ot X
CA Ot <x x <2 03 «T -J LT> w
ca >—1 £ X •V X O ta Ά τΤ e-« Cd < X cu
<—t M U X m Cd w o O ΓΤ o ca X «ς Cd
CM x X 5-· ci CM > rfî M (M >« X E-·
s-l > —4 < > 0 »-4 ss ·—t < H Cd •J
o r-1 X P» l—l o 5Γ O b fti z
or X στ UI »-3 ox -=c cd
co ·< oo ω cd « Q ω
Γ > Σ r· H a O r~ CO
ic E- IO £ M e-» Ol xo *x
in X in -3 >-4 X ld
Ό* Or *3* O X J-4 ui rt *a» u.
<-n ω X n ui U. «£ X t-4 m k3
ΓΜ ΓΜ >—< X < £-* H >
- Cd ·—< £ UI W4 t-I ¢-
r—I L.—. r-4 m r-4 xo
RO 120268 Β1
a Μ E—< o un rd z ai ț-* M O A cn e X W
ΟΝ W > ση ε- cn z s- X A·
CO Q eo Q o 00 cn E-»
Γ* W Eh r- X *< r* M > O X î-i
So 5C O u> X E- o « bJ u> X > o
X un U > >· z Cu un b« >-
τ O r— xr en a « X o X T cn a. t- ca
-*n GJ e 2 X l-d X O re ζ_> •
>
CN CJ CM Z X
*4 X «-4 X X Q cn hd i—i X f- « o
] no a X cn ►* O <r rd u £ • O r· >—1 X > Di
<n sz σ\ w H Z o O £ύ X o At -4
09 bd X E- aa > V CO O Cd < «n X
b* X r* CJ > r* Cd « o o X
£ H |J U V£J Cd Q o
in X Q un CU LH x Ud E-1 kd >
Ct« H *5* H Cd X
Z O X a X m J e r*i Z oi ω t>
fst ca O Q CN X > o <N w X X z O
rd r4 > ca rd ΰί z cn o
100 > O <-n rd U Vî Kd z Ud ω
Ch X cn <01 £U cn ¢0 X £-1
CD > σ bl Ct a> X 00 ω e* > C5
r* E O UI cn L·· X
Ό > U Q tn KC cn u>
un > Ud £ u. un o M IX X
Cfl ’T Q bl - <n
rr o X X a m X cn
fN cu cn i-3 <s cn jx CJ
rd X Q W •H cn X rd l·* 3 - -L Ud
rd fN r-i 'rd m rd
RO 120268 Β1
a CM a t/3
z £3 fr* C/>
co X
r* CU
W z
a 1-4
z
-*î o tn
cm X O Z C3
*4 a u! σ bl Z
O O ΓΜ >
<Ti cu σ X ta z
co l·-« > < £ Ui
t- M >
ςο (3
Lft X c* eu tn
xj* X z X H >
n >* cd X Z
<N tu
•M 6U >· e- X
190 9) t-
σ\ >· Z « cn =
CD ca o > u
r· bd o X fr*
so O x X bq
ιΛ > M X X a
X a o bl
Π 0 Q z
CM ss o X S·^
—4 >-< J > X X
rH CO
1 —- 240 I O ω O Q
b.
co M fr*
f* > W fr·
K0 X
<n CU cn
u
m <
CX Of
“* fr* x
O f*l ΓΗ k-i > >4 -
<r> > fr*
00 co fr* t
r* E- X ta
10 Z OT Q
ΙΛ o
X« 03 X 2 fr*
1*5 fr* n
Oi LI
r* fr* Q£ f-C X X
O ΓΜ CX b> x b«
σ'. z Z
co X l·* X σ
Γ*
%0 03 2
LT) fr* FC
X· z n
r*> fr* Ss
OJ H tn
>~4 r* ca cn I
r* CX
o r* ÎX z
fr* X X m oi
00 o
r- cu O co H H
tp o ω
tn fr* x co
tî* u
z ω bî
ΓΜ X
r-t E- Μ G> c*
I 260 w < X CQ fr*
σι 2 Q Uî
oa X X
r- CJ
U3 x
m Cu
H X <-3
m «: >
CM X b*
r-1
o U3 CN fr*
C\ eu e
co ·< ε-·
r- O
io ίχ Cu X
LA Z
vF M X
rO X Cu
Oi >-»
1U £U
241
RO 120268 Β1
O o rn X fti >-1 Z
01 > o CD
CP ω CD 2 X O
t- M o M 2
C4 M Dd
in fiC UI
m co H
o
•H 2
O A* H co
oi J
CC J
O «r> ;
U5 t->
UI w t-
>
m •-1 e-
ΓΤ o*
-H tt! « <n
O oO Ci HM
ex O
CJ X
H
\o u
tn o Eh w
«· > Oi
m OJ >
04 CO ir-
r-4 > j*-i
rH rCJ
o r-1 <·» 2 > o
O\ Z w ω X
co c- o» 04
04
u> t- w M SC
un O >1
T Z > f-> Σ
ro Ή >
CN M o > H
t-1, > M >4
3 m L0 a< f- fi
01 O <4 a Em
© z M ț-
r-
w o> Bt H
u> >
M· >
ro ►1 X
fr- Kh Λ >
54 Γ*“ Λ1 D
ou 1 < fe- 13 Z
σι 2: UI 0
m O X M
r- E- Co X rt »1
\P u M ►4 O- Si
•n 2 Q Q M cn 34
rC w 0 *=C >
ri 2 S
r-1 r-1 > X
«-< o n
Ό ro
σ> o 34 J 2 >
« a CD
Γ' X w U CO Eh
w 2 a 2 &- ♦—1
in σ en Cu Z
*a« u w 2 > <
ro - 34 Λ CD >
Γ4 Î4 ai O Q rf
r4 CD C4 X Q te
O un ro M H 2 i-3 X
01 F· < > 2 2
αα > 35 b M
Cu hH 5 > >·
<p > r1 co 2
tfl o 14 X
CD K a X
Cb co J
a O <
rM D£ k—| co
O τ ro Gt X Λ >4
Ol M 2 X W
co X bd
r* « >* > « A
10 H
LA <0 2 Z H <3
4J1 X « u o
2 2 co 13« >
<N &- > 14 2
►S Z >+ &H V]
<-i ro ro
RO 120268 Β1
RO 120268 Β1
O
cr» X
co W
r- <fl l-l tt > F
yj u u.
LO cd U9 &ri E-
T w u
O W -
ΓΜ CD K
CQ O O u
o Γ·* l-l cu c-
ΟΊ CU
CD Oi 4)
o
U**i X F 41 h-1
’T w
cn X ct Ori
CN e» cri
iH > r* <
o SO ·* Ed O CA Sri >
Ol O
00 X
Γ- X t-< a cn 4]
SO a Pi Sri
«n ►H >
f-4 Λ.
cn O M
CV W
- h-4
451
1 510 X w
σι Q X
co X M
r* X M
Uk Q X Cri
Lft ϋ
•β» O
n e F c > n
m cu 41
r4 ai cn
oos Cb h-1
0\ >
co Cri > iț 4)
f OJ F fi» X m
o cr> tT «o Cri Q o cri E-
cn X cn «c X
X F 03 < w
Cri O E- Q
Pî X Q cn CD Cri
H <e E-> cq O O
u >
o co
co Q
r- cn
H > M
m 41
47 h-4
*n 43 F HH
<n CD
- F
r~1 CO VS
o 7 1Λ X
σ» o M << X X
oo > X
f > M
\o AC CU X
in OS
•q· bd X cn «C
no < GO £. X I H4
CN ki cri
1-H F cn
O rt «n cu
σι <
co n
f o w
«D •J h-1 Cu
tn 41 £-·
ca «
rn 4< >
tN cri F O fi)
r-f > l-l
o rV M*1 > Q
Ci
00 >
f bri X
io >·
in 45
ca hd
m cn X F
Pl Oi w
r-1 3 cri
«-4 rH tn
RO 120268 Β1
O în -q P-
0\ ti <
<3D Σ M > i-
£*· cn < Λ
rt > αύ O t-i
ΙΛ rt
•3* o rt
«-Λ Σ
Ci £-
<Λ
o un O
CFl «<
CO «c
r* CJ CD
5£* -4
tr> Cm >
«r e
rC k-i Οι
ÎM Cu <0 ►Λ h-1
X > Cm w
O rt :> Ζ
σχ O
CD i-f > u Σ
Γ“- M M Η < X
50 C5 Cu >
ΙΛ > »-< rt
^î· rt
r» Oi
Cl Ui td
- ω O
m
] 009 O ui w
Ol »a
CB •q £
r* X O
M> o
m OI
·*? rt o
m ω td a o
w
rt
O σι LA rt s 04
<n
co J \
z
U5 z co a
LA o*
cx
m o M
ci >
i—i
O CC* Lrt o Q
cr% CO ui
CD hJ Σ
r~ >
10 o w -4 u: co
la (X X
* rt cu •j
ΓΛ o< Oi cu
O > O
i—< H rt
•H r* in
o m 50 O X
01 X u
<o M Cu £ Z u
r· (3 aa oi V3 z
50 u Σ
Lf) ai M
Tf o rt Sd
i*5 o *
Ci , o at z
»4 uî rt o P
Q Λ? 50 M
σι >< Cu J
CD rt cn
r* ω
xO > u >—1
LA rt
M· o
Γ*Ί 1-4 > J
Ci rt
rt J t*
O r-i U3 o rt
Ox
CO O
r- u: rt
«0 w >
lA o
*0«
·*» > M
Oi i- CO
rH *-3
r—4 O 10
RO 120268 Β1
e H [ Z
σι z £-» a z
<13 te 3Î w
r- X A V o »
W a
tn w <X«
* o a £ ot hi
¢4 te CQ hi
J s o > ai
CQ X σ
O tn X fid >4
σ» z X
CD <ZJ σ
Γ- &
IO Vi ț- <
in < W) (*· X
z;
rv cu X
r—1 >
►ț Em 77
K
en &· Qj >4
r· u
10 H >
4Λ t-3 t* X M rt
•tf· fcî X
*n e>
CH cn
u a
m <0
. o cr» \a M Or >
<r\ 2*
CS >: K4 O X
r- M A
<0 Of
in o
*r z M &4 a >
m O<
U)
rH ta Q 0 X
O co Ui ca f- 0 1
Vt w
CD *4 M
Γ* CQ l·· X
w X >- £t<
LH
V ►4 M > ca
r» XQ te « Q u
Γ4 i- &)
ri b-i > M
o Γ 10 X w
o> X Q ui
a> M >
Γ' J X 0
10 o; hi 0
in a £0
f·* X ca O bd
ra Σ u3 h-t 0
r—1 3
γ·I 10 <0
720 L £ H
<Λ μ-l >
PL,
c— γΊ 1—«
<0 hi X
m M
’T >* tfl
m
CM »4
«H 3
0 Γ» 2 o< M
Λ fr. 03
<0 M
z in O a
\0 u. w X
tn X
fe «3
te
>3
•H « te o
O O r· «: tal
O> 3
rt hl W A 0
C Q X
f4
O e < bl a
'r ►J
m •4
CM Es3 Q «c
<4 0 J X
01 UD
RO 120268 Β1
O in r* Bu U O 03 c- arf CD O fit «< o -“1 t-H 6- > O tC
V> OX l-t > e z tn <r> u £0 u
00 U 00 CO 3 J < M
r- A r* « H u r- J fiu O
Φ O LO Q O 0« <4 x© a Z co
UI in D£ X “» Pi H cn
·<, o *1* a CD N· U
1*1 O < m Oi O CD W rO a a»
iN CU co z CS fe Q rs 3? tf o
•K > kt t-i rrf CD rS >1
o c* «> X O r* r* e a o O .-3 f*
cn z fii ci σχ M CD e» fe CQ 3:
co P» w co fe o 1 03 CQ M
r* > M A M Q O Cu M CD
w CQ O z <0 h-i t- ·© CJ h-1
<Λ fe in O rt (4 m H z rt
Φ > H a 0 N“ X X o
ro •ț C0 E-* W GU J Cf m |J o
ΓΜ tu X rs ai o E-* — CM Q
> M rS a O W r-< Q ca > O &*
o w > 09^· ...... 1 a >4 o σι fs. &
ei Oi σχ o W -- ax ►4 Cu
00 ♦4 > CD a M O o> CD U o
r- O r- cw O p£ CQ f-- «i E-* £L o
XC > xp > ζ-* < tD <q w
ΐίΊ u »-i in CU te Z M m w Cu >4
σ cd Ν’ E* •t CU fe a» CD
ro ta < ro w «t ►4 cu πχ z a » w
ci > >4 rs H CM > n.
-“* M > w O r-i J * CQ
>-4 n r* r-t m r* 781
RO 120268 Β1
O 00
<n b3
00 O id a
r-> 03 1—1 o fr* •4
KO
ia
O U t-i
- :> s -=- —j
(N u >
te « < CJ
o m co te e *<
o o
co 5 a w
r*- & O£
N0 J hi O
iA < O > te
CU Q te
3
ni O M
»—l 04 O >4
o CM CO Di X ►4
O fad te
00
r* M £-<
U3 M Q C4 bd
IA > hi
M* w f- ** -4 >
rt 04
<N < > £
~4 > h-i
r+ CO
c rCQ >» O *3 c? >
o» < w ta
a> O te ΜΪ e*
r- O oe
1ΰ > <
tA > l—1 O
ω -4
rn h-
CM t> 1—1
H Cd O îZ
Q W aâ Q
<XJ w W (BS 3=
Γ* 01 a te
K£ <
un >
tf < > <n
r*> M >
m <
e-t M > ►J
© V) CQ E-
σ> 3 CJ
co Cu >
r* ►4 3
ko Vt te
<A > t-i 03
< > te
C*l <A
<S z 1-1 <n
<“1 bd te a
co
0» ca ea *4 O >
CO -4
r- >4 «< te «
\D te <□
un te
•r 1-4 te Λ
r*n <3
C4 O*
«—· te
O co co n >
0 te
CD te H
r* te m
LC> l-l >
un te te
OS h4
M te >
CN O i W
r-4 te O
•—1 rCQ
RO 120268 Β1
Corespunzător, bazat pe exemplele de substituții specifice prezentate, pot fi făcute substituții alternative prin experimentare de rutină, pentru a asigura EPV alternative ale prezentei invenții, de exemplu, prin obținerea unei sau mai multor substituții, inserții sau deleții în proteinele învelișului sau EPV care dau naștere la răspunsuri imune diferențiate.
Variațiile secvenței aminoacide în EPV a prezentei inveții se pot prepara, de exemplu, prin mutații în ADN. Asemenea EPV includ, de exemplu, deleții inserții sau subsitituții ale nucleotidelor care codifică pentru diferite resturi aminoacide din secvența aminoacidă. Evident, mutațiile care vor fi făcute în acidul nucleic care codifică EPV trebuie să nu înlocuiască secvența din afara cadrului de citire și, de preferință, nu vor crea domenii complementare care ar putea produce structuri mARN [vezi, de exemplu, Ausubel (1995 rev.), Infra; Sambrook (1989), Infra],
Acidul nucleic care codifică EPV a prezentei invenții poate fi preparat, de asemenea, prin amplficare sau prin mutageneză directă în sit a nucleotidelor din ADN sau ARN care codifică o proteină a învelișului sau EPV și, după aceea, sintetizarea sau transcrierea inversă a ADN-ului codificator pentru a produce ADN sau ARN care codifică EPV [vezi, de exemplu, Ausubel (1995 rev.), Infra; Sambrook (1989), Infra] pe baza informației și îndrumărilor prezentate aici.
Virusuri recombinante care exprimă EPV ale prezentei invenții, EPV recombinante sau vectori de acid nucleic care codifică pentru acestea includ un set finit de secvențe care codifică EPV ca nucleotide de substituție care pot fi obținute în mod uzual de către un specialist în domeniu, fără a mai fi nevoie de experimentare, bazat pe informațiile și îndrumarea prezentată aici. Pentru o descriere detaliată a chimiei și structurii proteinei, vezi, Schultz, G.E. etal., PrinciplesofStructure, Springer-Verlag, New York, NY (1978), andT.E., Proteins: StructureandMolecularProperties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, CA (1983). Pentru o prezentare a substituțiilor secvenței nucleotidice cum ar fi preferințele de codoni, vezi, Ausubel etal., eds, CurrentProtocols in MolecularBiology, Greene Publishing Assoc, New York, NY (1987, 1988, 1989, 1990, 1991, 1992, 1993, 1994, 1995) (până aici, Ausubel (1995 rev.)) la §§ A.1.1-A.1.1.24 și Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989) la Anexele C și D.
Astfel, un specialist cu pregătire obișnuită în domeniu, date fiind informațiile și îndrumarea prezentate aici, va ști cum să substituie alte resturi aminoacide în alte poziții ale unui ADN envsau ARN pentru a obține EPV alternative, incluzând variante de substituție, deleție sau inserție.
Teste de screening a activității HIV
Pentru screening-ul activității anti-H IV, serurilor sau celulelor de la un individ imunizat cu un vaccin al invenției pot fi folosite oricare dintre testele de screening cunoscute și/sau adecvate, cunoscute din stadiul tehnicii. De exemplu, analize HIV cunoscute includ analize ale infectivității virale [vezi, de exemplu, Chesebro et al., J. Virol. 62:3779-3788 (1988); Aldovini et al., eds., Techiques in HIV Research pp. 71-76 (1990)]; teste de neutralizare [vezi, de exemplu, Golding et al., AIDS Res. Hum. Retrovir. 10:633-643 (1994); Hanson, AIDS Res. Hum. Retrovir. 10:645-648 (1994); Laal et al., Res. Hum. Retrovir. 9:781-785 (1993); Hanson, J. Acquir. Immune Defic. Syndr. 7:211-219 (1994)]; testele celulei mononucleare periferice (PMN) [vezi, de exemplu, Arduino et al., Antimicrob. Agents Chemother. 37:1095-1101 (1990)]; și testele limfocitei Tcitotoxice (CTL) [vezi, de exemplu, Hammond et al., J. Exp. Med. 176:1531 -1542 (1992); Eltrah et al., J. Virol. 68:5076-5083 (1994); Walker et al., Immunol. 119:470-475 (1989); Weinhold et al., AIDS Res. etrovir. 8:1373 (1992)]. Alte activități corespunzătoare, separate sau în orice combinație, includ, dar nu sunt limitate la măsurarea cantitativă și/sau calitativă a transcripției, replicării, translației, încorporarea virionului, virulență, randament viral și/sau morfogeneză.
RO 120268 Β1
Realizare specifică: virus vaccinia recombinant care codifică EPV, vaccinuri polienv 1 și metode de obținere și folosire a acestora
Prezentare generală. Virusuri vaccinia recombinante (W)care exprimă proteine ale 3 învelișului HIV (de exemplu, gp41, gpl20 și/sau gpl60, sau o porțiune a acestora, asigură materiale utile pentru producerea și testarea vaccinurilor mixte care induc cel puțin un răs- 5 puns imun umoral sau celular împotriva virusului, precum și pentru analize ale celulei B și determinanților CTL. 7
Un vaccin polienv conform prezentei invenții constă dintr-un amestec de n virusuri vaccinia recombinante distincte, unde n este un număr întreg de la circa 4 la circa 10.000 9 (sau orice domeniu sau valoare de aici), în care fiecare construct vector vaccinia exprimă o variantă a proteinei de înveliș HIV-1 (EPV) (de exemplu, gp 41, gp 120 sau gp 160). Virusul 11 vaccinia recombinant funcțional codifică o EPV și este preparat prin recombinarea tipului sălbatic W cu o plasmidă. Pot fi preparate numeroase plasmide distincte, care codifică EPV 13 prin substituirea unei secvențe care codifică EPV cu alta, de exemplu, folosind un fragment de restricție sau mutageneză. 15
Prepararea virusurilor vaccinia recombinante. Metode pentru prepararea plasmidelor individuale (care exprimă fiecare o secvență a proteinei HIV unică) pot utiliza amplificarea 17 ADN sau ARN pentru substituția secvențelor proteinei de înveliș variante izolate într-un vector (de exemplu, pVenv4sau pVenvl[Hallenbergerefa/., Virology 193:510-514 (1993)], vec- 19 tor care codifică o secvență cunoscută a proteimei de înveliș HIV (de exemplu, accesibilă de la NIAID AIDS Research & Reference Reagent, Rockville, MD). Metode de amplificare a 21 ARN-ului sau ADN-ului sunt bine cunoscute în domeniu și pot fi folosite în conformitate cu prezenta invenție fără a mai fi nevoie de experimentare pe baza informației și îndrumărilor 23 prezentate aici. Metode cunoscute de amplificare ADN sau ARN includ, dar nu sunt limitate la reacție polimerazică de catenă (PCR) și procedee de amplificare înrudire (vezi, de 25 exemplu, brevetele US 4683195,4683200,4800159,4965188, pentru Mullis etal.; 4795699 și 4921794 pentru Taboret al.; 5142033 pentru Innis; 5122464 pentru Wilson etal.; 5091310 27 pentru Innis; 5066584 pentru Gyllensten et al., 4889818 pentru Gelfand et al., 4994370 pentru Silver et al., 4776067 pentru Biswass; 4656134 pentru Rinbold) și amplificarea 29 mediată ARN care folosește ARN anti-sens față de secvența țintă ca o matriță pentru sinteza ADN-ului cu bandă dublă (brevet US 5130238 pentru Malek et al., cu numele comercial 31 NASBA).
De exemplu, constructele virus vaccinia recombinant, preparate pe această cale, se 33 pot folosi pentru imunizări și provocarea răspunsurilor celulă T și/sau B specifice HIV. Primeni folosesc secvențe HIV conservate și, astfel, se amplifică cu succes gene envdin nume- 35 roase și diverse probe de la pacientul HIV-1. Tehnicile de bază descrise aici pot fi folosite în mod similar cu primeri PCR sau alte tipuri de primeri de amplificare, în scopul de a 37 substitui bucăți mai mici sau mai mari ale secvenței env din domeniul de izolate dintre cele găsite în vectori care codifică o proteină de înveliș HIV. Vezi, de exemplu, Ausubel, Infra; 39 Sambrook Infra.
Acizi nucleici care codifică EPV. Tehnica începe cu izolarea ADN-ului din celule 41 infectate HIV și amplificarea secvențelor env prin PCR. PCR sau alte produse de amplificare asigură cele mai simple mijloace pentru izolarea secvențelor HIV, dar pot fi folosite orice alte 43 metode potrivite cunoscute cum ar fi donarea și izolarea acidului nucleic sau proteinelor care codifică EPV (vezi, de exemplu, Ausubel, Infra; Sambrook Infra). Siturile de restricție 45 enzimatică sunt încorporate în PCR sau alte secvențe primer de amplificare pentru a facilita donarea genei. 47
RO 120268 Β1
ADN izolat pentru PCR se poate prepara din numeroase surse de virus, inclusiv sânge integral proaspăt sau congelat de la pacienți HIV+ și celule care au fost infectate in vitro cu izolate de virus.
în scopul de a produce constructe env HIV noi, reacția polimerazică de catenă (PCR) se folosește de preferință pentru a amplifica 100-2700 baze perechi (bp) ale unei gene env din fiecare probă diferită a pacientului HIV. Primerii PCR pot reprezenta secvențe HIV bine conservate care sunt corespunzătoare pentru amplificarea genelor env din probe cunoscute de gene env, izolate HIV sau diverse probe de la pacient HIV. De preferință, ADN-ul amplificat cuprinde o porțiune care codifică 10-900 (cum ar fi 100-400,400-600. sau 600-900, sau orice domeniu sau valoare de aici) aminoacizi ai unei gpl20 și gp41 (ambele dând gpl60). Una sau mai multe dintre regiunile variabile (V1-V5) și regiuni constante (C1-C5) sunt incluse, de preferință, în produsele PCR, mai preferat majoritatea regiunilor VI, CI, V2, C2, V3, C3, V4, C4, și V5. Suplimentar, secvențele amplificate pot să codifice 1-200 aminoacizi dincolo de situl de clivaj pentru gpl20/gp41. De preferință, cea mai mare parte sau în totalitate întreaga genă env se amplifică. Opțional, secvența care codifică gpl60 amplificată este lipsită parțial sau total de secvențele care codifică domeniul transmembranar și/sau domeniul cozii citoplasmatice [vezi, de exemplu, Hallenberger, et al., (1993)].
Primerii PCR pot fi desemnați astfel încât siturile enzimatice să flancheze secvența genei de înveliș din plasmida vaccinia, astfel încât ele sunt încorporate în produsele ADN amplificate. Prin folosirea tehnicilor de donare de substituție bine cunoscute, derivați ai plasmidei vaccinia care exprimă secvențe variante ale proteinei de înveliș de la 1-10.000 icienți, se pot genera prin substituirea unei porțiuni a de codificare EPV de la pacienți pentru o porțiune îzătoare a secvenței env din plasmida vaccinia, astfel încât să se folosească fragmente de restricție pentru substituție. De exemplu, plasmida pVenv4 și produsele PCR sunt tratate cu Kpnl și Bsml pentru a obține o secvență gpl60 scurtată de aminoacizii 1-639, căreia îi lipsesc atât domeniul transmembranar, cât și domeniul cozii citoplasmice [vezi, de exemplu, Hallenberger, et al., (1993)].
După ligarea produselor PCR și a produselor pVenv, celulele bacteriene gazdă sunt transformate cu amestecul de ligare prin intermediul oricăreia dintre numeroasele metode binecunoscute în domeniu, de exemplu, electroporare și ridicarea coloniilor recombinante, și examinarea prin secvențare.
Constructe virus vaccinia recombinant care codifică proteine de înveliș HIV. Vaccinia care codifică EPV este recombinat apoi cu virusul de tip sălbatic și sunt selectate plăcile de virus care exprimă EPV și se fac stocuri de virus. Stocuri de virus ca Vvenv conțin fiecare o secvență de codificare EPV diferită, care apoi sunt amestecate folosind cel puțin 4-40 și până la circa 10.000 virusuri recombinante diferite, pentru a forma un vaccin polienv al prezentei invenții.
Plasmidele vaccinia recombinante care conțin secvențele EPV sunt apoi opțional secvențate sau cercetate cu anticorpi specifici proteinei de înveliș HIV pentru a identifica EPV diferite. Este preferată secvențarea prin metoda terminării dideoxi a catenei a lui Sânger. Procedura este adaptată, de preferință, de la metodele descrise anterior [Sambrook et al. (1989), Infra; United States Biochemical, Sequenase Version 2.0 -DNA Sequencing Kit, Ninth Edition, Amersham Life Science, Inc., (1994)] și artrebui să citească aproximativ 50-300 bp de la poziția primerului. Metode pentru producerea vectorilor de expresie W sunt binecunoscute în domeniu [vezi, de exemplu, Mackett, M. et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 79:7415-7419 (1982); Panicali, D., and Paoletti, E., Proc. Natl. Acad. Sci (USA) 79:49274931 (1982); U.S. Patent No. 4,169,763; Mazzara, G.P. ei al., Methods 'm Enz. 217:557-581 (1993), Ausubel eta/., infra, la 16.15-16-19], Vectorul pSCII descris anterior [Chakrabarti, S. et al., Mol. Cell. Biol. 5:3403-3409 (1985)] poate fi folosit, de preferință. Pentru a crea o plasmida care codifică env, cum ar fi pVenv4.
RO 120268 Β1
Ca vector viral, virusul vaccinia are un număr de caracteristici utile, incluzând capa- 1 citatea care permite donarea fragmentelor mari de ADN străin (mai mari de 20 kb), păstrarea infectivității după inserarea ADN-ului străin, un domeniu larg de gazde, un nivel relativ ridicat 3 al sintezei proteinei și modificări și transport adecvat, secreție, procesare și modificări posttranslaționale așa cum sunt dictate de structura primară a proteinei exprimate și tipul celulei 5 gazdă folosite. De exemplu, N-O-glicozilarea, fosforilarea, miristilarea și clivajul, precum și asamblarea proteinelor exprimate, au loc într-un mod fidel. 7
Au fost dezvoltate câteva variații ale vectorului vaccinia și sunt potrivite pentru folosire în prezenta invenție (de exemplu, vezi, Ausubel et al., infra, §§ 16.15-16.19). Cel mai des, 9 după obținerea stocului de virus (Ausubel, infra, la § 16.16), o secvență de acid nucleic care codifică EPV se plasează sub controlul unui promotor al virusului vaccinia și se integrează 11 în genomul vaccinia astfel încât să rețină infectivitatea (Ausubel, infra, la § 16.17). Alternativ, expresia poate fi obținută prin transfectarea unei plasmide care conține gena care codifică 13 EPV sub controlul promotorului vaccinia într-o celulă care a fost infectată cu vaccinia de tip sălbatic. 15
De preferință, celula gazdă și vectorul vaccinia sunt adecvate și aprobate penrtu folosire în vaccinarea mamiferelor și oamenilor. Aceste virusuri recombinante sunt apoi 17 caracterizate folosind diverse metode cunoscute (Ausubel, infra, la § 16.18). înaltă variație, catena ARN polimerazei bacteriofagului T7 se poate integra în genomul vacciniei astfel 19 secvențele care codifică EPV vor fi exprimate sub controlul unui promotor T7, fie în plasmă transfectată, fie plasmida, fie un vector vaccinia recombinant. 21
Utilizarea promotorilor virusului pox este preferată deoarece alți promotori celulari și virali nu sunt recunoscuți de obicei de aparatul transripțional al vacciniei. De preferință, se 23 folosește un promotor compus timpuriu/târziu în vaccinia recombinant pentru vaccinuri polienv, deoarece este de dorit să se exprime EPV ca un antigen care este prezentat în 25 virusul vaccinia recombinant în celula gazdă infectată în asociere cu clasa pincipală de histocompatibilitate (MHC) I sau II. Asemenea MHC asociate proteinei de înveliș HIV vor forma 27 apoi ținte pentru celula T citotoxică și vor iniția mamifere vaccinate pentru un răspuns celulă T citotoxică și/sau un răspuns umoral împotriva EPV HIV exprimate. Aceasta datorită capa- 29 citații vectorilor virali vaccinia de a induce prezentarea MHC în celule gazdă pentru acest tip de antigen pare să diminueze în sfârșit în stadiul infecției. Transcriptele de origine timpurie 31 se vor termina după secvența Ί I ΓΊΤΝΤ și vor conduce la prezentare de MHC inadecvat.
Alternativ, orice astfel de motiv de terminare din secvența de codificare a genei poate 33 fi modificat prin mutageneză dacă se folosește un promotor timpuriu al virusului pox, în scopul de a intensifica prezentarea MHC a antigenilor proteinei învelișului în celule gazdă 35 (Earl etal., infra, (1990)). Pentru a imita mARN-urile virusului vaccinia, secvențele liderului netranslat și 3'-terminale sunt păstrate de obicei scurte, dacă ele sunt folosite în plasmide 37 vaccinia care încorporează secvențe care codifică EPV HIV.
De preferință, plasmida folosită pentru obținerea constructelor vaccinia conform 39 prezentei invenții a fost concepute cu situri endonucleazice de resticție pentru inserarea genei M în aval de promotroul vaccinia (Ausubel, infra, la § 16.17). Mai preferat, plasmida 41 conține deja o secvență care codifică proteina de înveliș în care siturile de restricție se întâlnesc unic lângă fiecare început și capăt ale secvenței care codifică proteina de înveliș. Ace- 43 lași fragment de restricție care codifică EPV poate apoi să înlocuiască secvența corespondentă din plasmida. în astfel de cazuri, porțiunea principală a secvenței care codifică EPV 45 se poate insera după îndepărtarea în cea mai mare parte sau în totalitate a secvenței care codifică proteina de înveliș din plasmidă. 47
RO 120268 Β1
De preferință, constructul vaccinia rezultat (conținând secvența de codificare EPV și promotorul vaccinia) este mărginit de ADN vaccinia pentru a permite recombinarea omoloagă când plasmida se transfectează în celule care au fost infectate inițial cu virusul vaccinia de tip sălbatic. ADN-ul de flancare al virusului vaccinia este ales astfel încât recombinarea să nu întrerupă o genă virală esențială.
Fără selecție, raportul virusului recombinant la virus vaccinia parental este de obicei circa 1:1.000. Deși această frecvență este suficient de ridicată pentru a permite hibridizarea de placă (Ausubel, infra, la §§ 6.3-6.4) sau imunoscreening-ul (Ausubel, infra, la § 6.7), pentru a culege virusuri recombinante au fost folosite o diversitate de metode pentru a facilita identificarea virusului recombinant. Exemple nelimitative de asemenea tehnici de selecție sau căutare sunt cunoscute în domeniu (Ausubel, infra, la § 16.17). De obicei, caseta de expresie este flancată de genele timidin-chinază vaccinia (TK) astfel încât recombinarea are ca urmare inactivarea TK. Apoi, virusul cu un fenotip TK poate fi distins de cel cu un fenotip de cel cu un fenotip TK+ prin infectarea unei linii de celule TK în prezență de 5-bromodeoxiuridină (5-Brdll), care trebuie să fie fosforilată de TK pentru a fi încorporată letal în genomul virusului. Alternativ sau suplimentar, virusuri recombinante pot fi selectate prin coexpresia unei gene bacteriene de rezistență la antibiotic cum ar fi ampicilina (amp) sau guanin fosforibozil transferază (GPT). Ca un exemplu suplimentar, coexpresia genei lac Z Escherichia coli permite creening-ul plăcilor de virus recombinant cu Xgal (Ausubel, la § 16.17). rusurile recombinante vaccinia care exprimă EPV a prezentei invenții pot fi opțional atenuate sau inactivate conform metodelor cunoscute cum ar fi încălzire, tratament paraformaldehidă, iradiere cu ultraviolete, tratament cu propriolactenă, formarea de hibrid sau himere sau prin alte metode cunoscute [vezi, de exemplu, Zagury et al., Nature 332:728-731 (1988); Ito et al., Cancer Res. 50:6915-6918 (1990); Wellis et al., J. Immunol. 99:1134-9 (1967); D'Honcht, Vaccine 10(Suppl.):548-52 (1992); Selenka et al., Arch. Hyg. Bakteriol. 153:244-253 (1969); Grundwald-Bearch et al., J. Cancer Res. Clin. Oncol. 117:561-567 (1991)]. De exemplu, inactivarea termică la 60°C va reduce titrul virusului considerabil. Asemenea tehnici de atenuare sunt testate în siguranță, deoarece inactivarea incompletă poate avea ca urmare moartea pacientului [Dorozynski și Anderson Science 252:501-502 (1991)].
Astfel de vaccinia recombinant atenuat sau inactivat se poate folosi când pacienții pot avea sistemul imunitar compromis, deoarece complicațiile sau moartea pot avea loc când se administrează vaccinia viu.
Compoziții farmaceutice
Preparatele farmaceutice ale prezentei invenții, corespunzătoare pentru inoculare sau pentru administrare parenterală sau administrare orală, includ un vaccin virus recombinant polienv care cuprinde cel puțin 4 și până la circa 10.000, de preferință 4 la circa 1.000 și mai preferat, circa 10 la circa 100, virusuri recombinante diferite, sub forma unui lizat celular, fracție legată la membrană, formă parțial purificată sau purificată. De preferință, vaccinul polienv cuprinde virus recombinant conținând lizat celular (sau fracțiile legate la membrană ale acestuia) care cuprind în plus proteine EPV deja exprimate de către virusurile recombinante. Includerea EPV exprimată este găsită acum ca intensificând răspunsul corp primar.
Compoziția de vaccin polienv poate fi sub forma unor soluții sterile apoase sau neapoase, suspensii sau emulsii și, de asemenea, poate să conțină agenți auxiliari sau excipienți care sunt cunoscuți în domeniu. Fiecare dintre cele cel puțin circa 4-40 la 10.000 virusuri diferite codifică și exprimă EPV diferite așa cu s-a arătat aici. ADN care codifică EPV poate fi selectat să reprezinte EPV care există într-o comunitate izolată specifică de pacienți SIDA. De exemplu, un vaccin ar putea reprezenta secvențe din Memphis, TN și să fie destinate utilizării în Memphis, TN. Vaccinurile destinate să reprezinte zone geografice restrâse pot fi, de asemenea, utile pentru utilizare în comunități din afara comunității destinate.
RO 120268 Β1
Alternativ, ADN-uri care codifică EPV se pot selecta să reprezinte comunității geo- 1 grafice depărtate, orașe sau țări. De exemplu, numeroase clone pot fi reprezentate într-un vaccin polienv. O compoziție de vaccin polienv poate să cuprindă în plus imunomodulatori 3 cum ar fi citokine care accentuează răspunsul imun la o infecție virală. Vezi, de exemplu, Berkow et al., eds., The Merck Manual, Fiftheenth Edition, Merck and Co., Rathway, NJ 5 (1987); Goodman et al., eds., Goodmad and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, Eighth Edition, Pergamon Press, Inc., Elmsford, NY (1990); Avery’s Drug 7 Treatment: Priciples and Practice of ClinicalPharmacology and Therapeutics, Third edition, AIDS Press, LTD., Williams and Wilkins, Baltimore, MD (1987); and Katzung, ed. Basicand 9 ClinicalPharmacology, Fifth Edition, Appleton and Lange, Norwalk. CT (1992), referințe care și referințele citate aici arată stadiul tehnicii din domeniu. 11
Așa cum ar fi înțeles de către un specialist cu pregătire obișnuită în domeniu, când un vaccin polienv al prezentei invenții se asigură la un individ, el poate fi într-o compoziție 13 care poate cuprinde în plus cel puțin una dintre săruri, tampoane, adjuvanți sau alte substanțe care sunt de dorit pentru îmbunătățirea eficacității compoziției. Adjuvanții sunt sub- 15 stanțe ce pot fi folosite pentru a amplifica specific cel puțin un sistem imun. în mod normal, adjuvantul și compoziția sunt amestecate înainte de prezentare la sistemul imun, sau sunt 17 prezentate separat, dar în același loc care trebuie imunizat. Adjuvanții pot fi împărțiți în câteva grupuri pe baza compoziției lor, aceste grupuri includ adjuvanți uleioși, săruri minerale 19 (de exemplu, Alk(SO4)2, AINa(SO} 2 A1NH ASO I, silice, caolin și cărbune), polinicleotide (de exemplu, acizi nucleici poli IC și poli AU), și anumite substanțe naturale (de exemplu, ceară 21 D de la Mycobacterium tuberculosis, substanțe găsite în Coryne bacterium parvum, sau Bordetella pertussis și membri ai genului Brucella). Dintre acele substanțe utile în mod 23 deosebit ca adjuvanți pentru utilizare în compoziții de vaccin sunt discutate, de exemplu, Osol A., ed., Remington'sPharmaceutica Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA (1980), 25 pp.1324-1314.0 compoziție farmaceutică de vaccin polienv a invenției de față poate să conțină suplimentar cel puțin un compus chemoterapeutic antiviral. Exemple nelimitative pot fi 27 selectate de la cel puțin unul din grupurile care constau din gamaglobulină, amantadină, guanidină, hidroxi benzimidazol, interferon-a, interferon-(3, interferon-y, interleukină-16 (IL-16; 29
Kurth, Nature, 8 decembrie, 1995); tiosemicarbazone, metisazon, rifampin, ribvirin, un analog pirimidină (de exemplu, AZT și/sau 3TC), un analog purină, foscarnet, acid fosfonoacetic, 31 aciclovir, dideoxinucleozide, un inhibitor de protează (de exemplu, saquinavir (Hoffmann La Roche); indinavir (Merck); ritonavir (Abbott Labs); AG1343 (Agouron Pharmaceuticals); VX- 33
2/78 (Glaxo Wellcome)), chemokine, cum ar fi RANTES, MlPIa sau MIP1(3 [Science 270:1560-1561 (1995)] sau ganciclovir. Vezi, de exemplu, Richaman: AIDs Res. Hum. Retro- 35 viruses 8:1065-1071 (1992); Annu Rev Pharmacol Toxico 33:149-164 (1993); Antimicrob Agents Chemother 37: 1207-1213 (1993); AIDs Res. Hum. Retroviruses 10:901 (1994); 37
Katzung (1992), intra, și referințele citate aici pe paginile 798-800 și respectiv 680-681.
Utilizări farmaceutice 39
Administrarea unui vaccin polienv (sau a antiserurilor pe care le provoacă) poate să fie, fie într-un scop profilactic, fie unul terapeutic, și de preferință pentru scopuri pro- 41 filactice. Când se asigură profilactic, compoziția de vaccin polienv viu se asigură în avans față de orice detectarea sau simtom al infecției HIV sau bolii SIDA. Administrarea profilactică 43 a compusului(lor) servește la prevenirea sau la atenuarea oricărei infecții HIV ulterioare.
Când se administrează terapeutic, vaccinul polienv se administrează la detectarea 45 unui simptom al unei infecții prezente. Administrarea unui vaccin polienv viu după infecție HIV este făcută numai unde se determină că sistemul imun al pacientului este capabil să răs- 47 pundă la administrarea vaccinului polienv viu fără risc important de complicații nedorite, unde administrarea unui virus viu este asigurată în dozajul necesar care servește la atenuarea 49 oricărei infecții HIV prezentă.
RO 120268 Β1
Alternativ, unde răspunsul imun al pacientului este compromis, administrarea terapeutică implică de preferință folosirea unei compoziții de vaccin atenuat sau inactivat unde virusurile recombinante sunt atenuate sau inactivate, cum s-a prezentat mai sus. Vezi, de exemplu, Berkow (1987), infra, Goodman (19909, infra, Avery (1987), infra și Ktzung (1992), infra, Dorozynski și Anderson, Science 252:501-502 (1991).
compoziție este numită acceptabilă farmacologic dacă administrarea sa poate fi tolerată de un pacient receptor. Un asemenea agent este numit administrat într-o cantitate eficientă terapeutic sau profilactic dacă, cantitatea administrată este semnificativă fiziologic. Un vaccin sau o compoziție a invenției de față este semnificativă fiziologic dacă prezența sa are ca urmare o schimbare detectabilă în fiziologia pacientului receptor, de preferință prin intensificarea răspunsului imun umoral sau celular față de un HIV.
“Protecția asigurată nu este necesar să fie absolută, infecția HIV sau boala SIDA nu este necesar să fie total eradicată, cu condiția să existe o îmbunătățire semnificativă statistic față de o populație de control.
Protecția poate fi limitată la ameliorarea severității sau rapidității apariției simptomelor de boală.
Administrare farmaceutică
Un vaccin al prezentei invenții poate conferi rezistență la una sau mai multe tulpini ale unui HIV. Prezenta invenție se referă astfel și asigură un mijloc pentru prevenirea sau atenuarea infecției prin cel puțin o tulpină HIV. Așa cum s-a folosit în prezenta lucrare, un vaccin este considerat că previne sau atenuează o boală dacă administrarea sa la un individ are ca rezultat fie atenuarea torală, fie atenuarea parțială (adică, suprimarea) unui simptom sau stare a bolii, ori imunitatea totală sau parțială a individului față de boală.
Cel puțin un vaccin polienv al invenției de față se poate administra prin orice mijloc ce atinge scopul propus, folosind o compoziție farmaceutică cum s-a descris anterior.
De exemplu, administrarea unei asemenea compoziții poate fi pe diverse căi parenterale cum ar fi subcutanată, intravenoasă, intradermală, intraperitoneală, intranazală, transdermală sau bucală. Este preferată administrarea subcutanată. Administrarea parenterală poate fi prin injectarea unui bol sau prin perfuzare gradată în timp. Vezi, de exemplu, Berkow (1987), infra, Goodman (1990), infra, Avery (1987), infra, și Katzung (1992), infra.
Un regim tipic pentru prevenirea, suprimarea sau tratarea unei boli sau condiții care poate fi ameliorată printr-un răspuns imun celular prin imunoterapie celulară activă specifică, cuprinde administrarea unei cantități eficiente dintr-o compoziție de vaccin cum s-a descris anterior, administrată ca tratament unic, sau repetat ca dozaje de intensificare sau rapel, pe o perioadă de până la și inclusiv 1 săptămână la circa 24 luni.
Conform invenției de față, o cantitate eficientă dintr-o compoziție de vaccin este este suficientă să atingă un imun celular sau umoral față de HIV. Se înțelege că dozajul eficient va fi dependent de vârsta, sexul, sănătatea și greutatea receptorului, tipul tratamentului concurent, dacă există vreunul, frecvența tratamentului și natura efectului dorit. Domeniile de doză eficientă date mai jos nu intenționează să limiteze invenția și reprezintă domenii de doză preferată. Totuși, dozajul cel mai preferat va fi ajustat pentru subiectul individual, așa cum este înțeles și determinabil de către un specialist în domeniu, fără să fie nevoie de experimentare. Vezi, de exemplu, Berkw (1987), infra, Goodman (1990), infra, Avery (1987), infra, Ebadi, Pharmacology, little, Brown and Co., Boston, MA (1985), și Katzung (1992), infra.
în general vorbind, dozajul pentru un adult uman va fi de la circa 105-109 unități formatoare de plăci (pfu)/kg sau unități formatoare de colonie (CFU)/kg per doză, cu 106-108 preferat. De câte ori se folosește dozajul, el trebuie să fie o cantitate sigură și eficientă, așa cum s-a determinat prin metode cunoscute, cum, de asemenea, s-au descris și aici.
RO 120268 Β1
Subiecți 1
Receptorii vaccinurilor prezentei invenții pot fi orice mamifere care pot dobândi imunitate specifică prin intermediul unui răspuns imun celular sau umoral față de HIV, unde 3 răspunsul celular este mediat de o proteină MHC de clasa I sau clasa II. Dintre mamifere, receptorii preferați sunt mamiferele Ordinelor Primata (incluzând oamenii, cimpanzei, 5 maimuțe antropoide și maimuțe cu coadă). Receptorii cei mai preferați sunt oamenii. Subiecții preferați sunt infectați cu HIV sau asigură un model de infecție HIV [de exemplu, Hu 7 etal., Nature 328:721-723 (1987)].
Invenția este descrisă în continuare prin referire la exemplele care urmează, care 9 sunt prin intermediul ilustrării și nu intenționează să fie ire a prezentei invenții.
Exemple 11
Exemplul 1. Prepararea vectorilor virus vaccinia pentru expresia proteinei env HIV Nomenclatură: Ca referință, un construct virus vaccinia recombinant este denumit 13 alternativ în prezenta lucrare un construct Vvenv, constructele virus vaccinia specifice fiind desemnate conform unui pacient, sau unui depozit (de exemplu, ATCC sau sursă GenBank 15 a ADN-ului env din construct). De exemplu, Vvenv-Doe se va referi la un construct vector virus vaccinia având secvențele env de la pacientul Doe, și Vvenv-U28305 se va referi la un 17 vector virus vaccinia având secvențele env găsite în GenBank număr de acces U28305.
Vaccinul polienv constă din 4-100 virusuri vaccinia recombinante distincte, dintre care 19 fiecare exprimă o proteină unică a învelișului HIV. Pentru scopurile referinței, fiecare virus individual este desemnat ca Vvenv, și amestecul final de virus este denumit polienv. 21
Prepararea fiecărui Vvenv folosește plasmida desemnată pVenv4 și un virus vaccinia de tip sălbatic desemnat NYCDH, descris mai jos. Pentru detalii suplimentare, vezi Ryan et 23 al., Preparation and Use of Vaccinia Virus Vectors for HIV Protein Expression and Immunization în Immunology Methods Manual, Lefkovits, ed., Academic Press (1996). 25
Vectori și celule gazdă. Vectorul descris anterior pSCII [Chakrabarti, S. et al., Mol.
Cell. Biol. 5:3403-3409 (1985)] se poate folosi la recombinarea a numeroase gene HIV în 27 genomul W. Elemente ale plasmidei pSCII includ gena lacZ (o genă reporter prin care recombinanți W și bacterii transformate pot fi identificate cu ușurință, precum cele care au 29 activitate (3-galactozidază), o porțiune a genei care codifică timidin kinază (TK) și o genă de rezistență la ampicilina (amp). Gene donate în pSCII sunt inserate în genomul W prin 31 recombinare omoloagă re gena TK a virusului de tip sălbatic și porțiunile genei TK inute în pSCII. Inserția plasmidei ADN în locusul TK viral inactivează gena virală astfel că virusuri 33 recombinante pot fi selectate imediat din fondul de virus TK+ prin creștere in bromodeoxiuridina (BudR). Pentru ca virusul recombinant TIC să supraviețuiască acestei selecții, el 35 trebuie să fie crescut în celule care nu furnizează o enzimă TK activă, cum ar fi linia celulară TK143, care este un derivat TK deficient al liniei celulare umane R970-5, o linie celulară 37 osteosarcomică [Rhim, J.S. et al., Int. J. Cancer 15:23-29 (1975)] care susține creșterea W [Weir et al., infra (1982)]. Producerea expresiei segmentului genei HIV poate fi expresia 39 integrală a genei într-un sit Smal al vectorului pSCII. Gene de lungime integrală pot fi exprimate sub controlul promotorului P7.5K. 41
Ca o alternativă pentru donarea genelor HIV complete, se pot substitui parțial secvențele genei pentru genele HIV care au fost deja donate în pSCII. De exmplu, s-a 43 preparat un construct denumit pVenvl de la pSCII și s-a exprimat gena (env) proteinei de înveliș BH10 HIV. [Hallenberger et al., infra (1993); Kilpatrick et a/., J. Biol. Chem. 262:116- 45
121 (1987)]. Constructul se poate folosi ca un vector parental pentru a substitui și exprima regiuni variabile ale proteinei învelișului de la izolate din domeniul HIV. în mod similar, s-a 47 construit un vector denumit pVenv4 de la pSCII pentru a exprima o proteină BH10, scurtată
RO 120268 Β1 pentru a exclude secvențele gp41 care codifică domeniul transmembranar și domeniul cozii citoplasmice, păstrând în același timp domeniul de oligomerizare [Hallenberger et al., (1993) infra]. Așa cum poate fi apreciat de către specialistul în domeniu, termenul domeniul de oligomerizare se folosește funcțional, pentru a se referi la o porțiune a genei gp 41, care permite oligomerizarea proteinelor env, adică, există suficientă structură pentru oligomerizare. Vectorul pVenv4 codifică o gpl60 truncată (de asemenea: gpl60t, gpl 40), care s-a descoperit formând o structură terțiară care este similară celei a oligomerului gp 41 /gpl 20 prelucrat (dimer, trimer, sau tetramer) cum este prezent la suprafața celulelor infectate HIV.
Această structură terțiară este menținută în ambele forme secretate și asociată membranei [Hallenberger et al., (1993)]. Acest vector este folosit, de preferință, ca un vector parental pentru substituția secvențelor env alternativei izolate. în acest exemplu, prepararea fiecărui construct Vvenv implică utilizarea unui pVenv4 și unui virus vaccinia NYCDH de tip sălbatic și celule gazdă corespunzătoare, cum este descris în detaliu mai jos.
pVenv4: Vectorul pVenv4 s-a preparat anterior prin inserția unei secvențe care codifică învelișul HIV-1 în vectorul de recombinare virus vaccinia pSCII [Hallenberger et al., Virology 193:510-514 (1993); Chakrabarti et al., Mol. Cell Biology 5:3403-3409 (1985)]. Secvența HIV-1 s-a derivat de la un stoc de laborator de virus viu. Secvența s-a numit BH10 [Ratner et al., Nature 313:277-284 (1985)]. Cu tehnici PCR pot fi amplificate secvențe unice ale învelișului de la pacienți infectați HIV-1 și substituite în secvența env BH10 pentru a crea vectori noi. De exemplu, pentru PCR se pot folosi următorii primeri.
(A) Sens, Poziție 5785 (SEQ ID NR: 1): AGCAGAAGACAGTGGCAATGAGAGTGA.
(B) Antisens, Poziție 7694 (SEQ ID NR:2): CCACTCCATCCAGGTCATGTTATTGGAAAT.
(C) Kpnl-Sens, poziție 5903 (SEQ ID NR.3):
GTGGGTCACAGTCTATTATGGGGTACCTGTGT.
(D) Bsml-Antisens, poziție 7659 (SEQ ID NR:4): CCAGAGATTTATTACTCCAACTAGCATTCCAAGG.
(E) (opțional) Dralll-Sens, poziție 6153 (SEQ ID NR:5): CCATGTGTAAAATTAACCCCACTCTGTG.
(F) (opțional) Bsu36l-Anti-sens, poziție 6917 (SEQ IDNR:6): TACAATTTCTGGGTCCCCTCCTGAGG.
Acești primeri sunt scriși 5 la 3. Situri de restricție sunt subliniate (poziții numerotate se bazează pe secvența BH10 er et al., Nature 313:277-284 (1985)].
Strategie PCR: în scopul de a produce noi constructe env HIV-1 se folosește reacția polimerazică de catenă (PCR) pentru a amplifica 1.800 perechi baze (bp) ale genei învelișului de la probe ale 40 de pacienți HIV-1 diferiți. Primerii PCR reprezintă secvențe HIV-1 bine conservate și astfel, au amplificat cu succes gene env din numeroase probe diverse ale pacientului HIV-1. ADN-ul amplificat cuprinde întreaga proteină gpl20 cu excepția a aproximativ 10 aminoacizi puternic conservați la terminusul amino al proteinei. Toate regiunile variabile ale învelișului (V1-V5) sunt incluse în produsele PCR. Suplimentar, secvențele amplificate codifică aproximativ 100 de aminoacizi dincolo de situl de clivaj pentru gpl 20/ gp 41.
Primerii PCR care conțin situri de restricție enzimatică pentru Kpnl și Bsml care mărginesc secvența genei învelișului BH10 din pVenv4, sunt încorporați în produsele ADN amplificat.
Prima repriză PCR: în tub 500 pl de microcentrifugă, amestec:
-1 pl primer A (SEQ ID NR:1), 300 ng/pl;
RO 120268 Β1
-1 μΙ primer Β (SEQ ID NR:2), 300 ng/μΙ;1
- 2,5 μΙ 10 mM din fiecare 4 dNTP-uri;
-1 μΙ ADN;3
-10 μΙ 10X tampon PCR; și
- HPLC H20 la 99 μΙ.5
Amestecare stoc taq și repartizare 1 ui la reacția PCR. Amestecat bine. Acoperire cu ulei mineral. Rulare pe un cicler termic după cum urmează:7
- Incubare 95°C, 3 minute pentru topire ADN
- Rulat 40 cicluri: 95°C, 1 minut, 45°C, 2minute; 72°C, 3,5 minute.9
A doua repriză PCR: Reacția PCR se prepară ca mai sus, dar cu primerii C și D (SEQ
ID NR:3 și respectiv, 4) și fără ADN. Se aduce soluția finală la 95 pi. Acoperire cu ulei mine- 11 ral. Cu un tub cu tampon, se îndepărtează 5 ui din prima reacție PCR (de sub ulei, Se amestecă proba în a doua reacție, sub stratul de ulei și se încep ciclurile ca mai înainte. De obicei, 13 30 cicluri sunt corespunzătoare. Poate să se dorească să se urmărească produsul prin îndepărtarea a 2 pi din gelul analizei după fiecare ciclu, până când se identifică o bandă 15 clară de aproximativ 1800 bp.
Folosind tehnicile donării de substituție binecunoscute, s-au generat derivați pVenv4 17 care exprimă o secvență env de la unul dintre cei 40 pacienți, în locul secvenței de înveliș BH10. Pe scurt, plasmida pVenv4 și produsele PCRsuntîn continuare tăiate cu Kpnlși Bsml 19 și tăiatul pVenv4 s-a migrat pe un gel de agaroză și s-a izolat fragmentul mare. Fragmentul mic (fragmentul de 1800 bp) al BH10envs-a eliminat. De asemenea, produsul PCR tăiat s-a 21 izolat și s-a ligat la fragmentul mare pVenv4 pentru a crea o secvență himerică a învelișului, care conține 1800 bp ale variantei env de la ADN-ul pacientului. După ligarea produsului 23 PCR și produselor pVenv, celule gazdă bacteriene sunt transformate cu amestecul de ligare prin intermediul oricăreia dintre numeroasele metode binecunoscute în domeniu, incluzând, 25 de exemplu, electroporarea, iar coloniile recombinante sunt culese și examinate prin secvențare. 27
Plasmida pVenv4 sau recombinanți realizați cu pVenv4 facilitează inserția genelor în genomul virusului vaccinia prin recombinare omoloagă între gena timidin kinază (Tk) a 29 virusului de tip sălbatic și secvențele Tk din plasmida. Inserția ADN-ului pVenv4 în locusul viral Tk dă un virus vaccinia cu gena de înveliș HIV-1 exprimată sub controlul promotorului 31 timpuriu/târziu P75K. Virusul se atenuează în activitatea descreștere datorită distrugerii locusului Tk. Un element suplimentar al pVenv4 este gena lacZ care codifică activitatea (3- 33 galactozidază. Activitatea lacZ se poate folosi pentru selectarea de recombinanți ai virusului vaccinia (vezi în continuare). 35
Gena învelișului exprimată prin pVenv4 este scurtată pentru a exclude secvența transmembranar/C-terminal gp41. Vectorul este exprimat ca o structură oligomerică care 37 este găsită în celule formă secretată.
Virus vaccinia-NYCDH. Fiecare plasmid nou substituit este individual cu virus 39 vaccinia NYCDH de tip sălbatic.
Acest virus s-a obținut de la ATCC (Număr de acces VR-325) și s-a purificat pe placă 41 înainte de folosire (Buck, C, și Paulino, M.S., ed., American Type Culture Collection Catalogue of Animal Viruses and Antisera, Chlamydiae and Rickettsiae, 6th ed., American 43 Type Culture Collection, Rockville, MD (1990), p.138). Celule bacteriene gazdă. Plasmida poate fi crescută pe orice gazdă corespunzătoare, după cum este cunoscut în domeniu [vezi, 45 de exemplu, Ausubel, infra (1995 rev), §§ 16.15-16.19]. Un exemplu nelimitativ sunt celulele DH5a. 47
RO 120268 Β1
Celule deficiente TK. Transformarea și substituția virusului vaccinia se face pe linia celulară Tk143B umană, care este un derivat deficient TK al liniei celulare umane R970-5, o linie celulară osteosarcomica [Rhim et al., (1975), infra] care susține creșterea W [Weir et al., (1982), infra]. Se selectează fiecare virus vaccinia recombinant care conține o secvență a genei env HIV unică pe baza expresiei genei lacZ (plăcile de virus sunt acoperite cu Bluo-gal și selectate pentru activitate (3-galactozidază după cum s-a apreciat prin dezvoltarea unei culori albastre). S-au realizat două reprize PCR.
Exemplul 2. Prepararea vaccinului polienv Celule Vero: Etapa finală de fabricare este creșterea de n constructe Vvenv pe celule Vero procurate de curând de la ATCC (Nr. acces CCL81 sau X38) și donate și extinse pentru creșterea virusului. Linia de celule Vero a fost aprobată de OMS (Organizația Mondială a Sănătății) pentru dezvoltarea de vaccin [Hay, R., et al., ed., American Type Culture Collection Catalogue of Cell Lines and Hybridomas, 7th Ed., American Type Culture Collection, Rockville. MD (1992), pagina 48],
Celule Vero sunt crescute cu mediu Dulbecco modificat Eagles (Bio-Whittaker), un supliment de glutamină (Bio-Whittaker) și ser fetal de vițel inactivat termic (Hyclone, Inc.), alternativ, se folosi mediu lipsit de ser. Fiecare construct Wenvse că pe un strat confluent separat de celule Vero și s-au recoltat când celulele au demonstrat efecte citopatice datorită infecției virale. Extractele de celule s-au spălat extensiv cu PBS (Bio-Whittaker) după recoltare și înaintea înghețării. Apoi, celulele sunt rupte prin congelare-dezghețare, sonicare sau centrifugare la viteză redusă, într-o centrifugă (opțional). în continuare, alicote de supernatant sunt stocate la -70°C. Proteina învelișului este prezentă în lizat la concentrații suficiente pentru a provoca anticorp specific proteinei învelișului HIV (detectabil prin ELISA) întrun model mamifer, chiardacă Weste atenuat, de exemplu, preparatul se încălzește la 60°C, 1 oră.
Produsul vaccin. Fiecare stoc de virus (construct Wenv) de la celule Vero este congelat individual și în continuare titrat și testat pentru siguranță. După ce testele s-au definitivat, alicote din fiecare virus sunt amestecate pentru a da un stoc de vaccin total de IO® pfu/ml (pfu înseamnă unități formatoare de placă). Dacă sunt utilizate 40 de constructe Wenv, fiecare Wenv este de preferință, reprezentat în mod egal, fiecare Wenv folosit la un titru de 2,5xlO6 pfu/ml în produsul vaccin. Acesta va da un randament total de IxlO8 pfu.
Evaluarea vaccinului polienv
Șoareci. Șoarecii pot fi infectați cu o injecție intraperitoneală de W care exprimă Ο,ΙχΙΟ7 pfu env. Anticorpul poate fi identificat prin ELISA HIV sau teste de neutralizare, cum s-a descris mai sus, la 3 săptămâni după injectările W.
înainte de fabricarea vaccinului polienv pentru utilizare umană, s-a preparat un grup similar de virusuri în scopul testării vaccinului la șoareci. Aceste virusuri s-au administrat la șoareci fie pe calea intraperitoneală, fie pe cale subcutanată. Apoi, noi am testat serul anticorp specific HIV-1 într-o analiză ELISA. Analiza a implicat etalarea în întregime a HIV-1 distrus (HTLV|nB) pe plăci ELISA și plăcile s-au blocat cu albumină ică bovină. Apoi s-au adăugat probe de ser la diluții de 1:1.000 și 1:10.000 în fosfat tamponat salin. Analiza s-a efectuat cu fosfatază alcalină conjugată anticorp capră antiimunoglobulină de șoarece și fosfat de p-nitrofenil. Reacția de culoare s-a stopat cu o soluție de hidroxid de sodiu și citirea densității optice s-a făcut pe un cititor de plăci ELISA la 405 nm.
Așa cum s-a arătat în fig. 2, o singură inoculare cu preparat de lizat celular de 106-107 pfu virus vaccinia (conținând o singură secvență care codifică proteina învelișului HIV-1 și proteina de înveliș exprimată legată la membrană) a provocat un răspuns anticorp puternic împotriva HIV-1 care a fost susținut pe durata timpului experimental de 6 luni. Un asemenea răspuns anticorp a fost semnificativ mai ridicat decât cele raportate anterior cu alte imunizări.
RO 120268 Β1
Acest răspuns anticorp puternic poate fi atribuit prezenței proteinei de înveliș legată la mem- 1 brană în preparatul de vaccin. Așa cum s-a arătat în fig. 3, aceste răspunsuri au fost dependente de doză. Răspunsuri mai slabe s-au observat la mamifere la o doză de IO6 pfu față de 3 mamiferele care au primit o doză de IO7.
S-au preparat, de asemenea, amestecuri de virusuri vaccinia care exprimă proteine 5 diferite ale învelișului HIV-1. Când șoarecii au primit IO7 dintr-un amestec de 5 virusuri, răspunsurile lor au fost esențial identice ca mărime față de răspunsurile generate împotriva 7 107 pfu dintr-un singur virus vaccinia recombinant (fig. 4). Amestecarea a numeroase virusuri vaccinia care exprimă env în numere mari nucleic a fost raportată și este de așteptat să se 9 asigure un spectru larg al anticorpului de neutralizare.
Om. S-au realizat teste cu stoc de virus amestecat înainte de experimentele clinice, 11 dintre care primul va fi pentru scopul extinderii dozei și siguranța testării.
Experimentele clinice vor fi un studiu de extindere a dozei care implică amsamblul 13 de grupuri de 4 voluntari. Fiecare grup primește una din următoarele doze de vaccin:
(1) 2x104 pfu15 (2) 2x105 pfu (3) 2x106 pfu17 (4) 2x107 pfu
Fiecare voluntar primește vaccinul de virus amestecat în 0,5 ml soluție salină, 19 administrat printr-o injecție subcutanată.
Exemplul 3. Inducerea imunității de neutralizare a izolatului primar cu un vaccin virus21 vaccinia multiînveliș bazat HIV-1, la cimpanzei
Populația de izolate HIV-1 este înarmată cu un sistem sofisticat de proteine ale 23 învelișului. Proteinele env sunt virtual singurele proteine externe codificate și țintele activității anticorpului de neutralizare; totuși, anticorpii provocați împotriva unui izolat nucleic vor 25 neutraliza în mod necesar altul. Din acest motiv, s-a preparat un amestec de vaccin HIV-1, PoliEnv care exprimă numeroase proteine Env. Producerea vaccinului începe cu prepararea 27 a 30 de recombinanți W distincți, fiecare exprimând o proteină Env distinctă. Apoi, s-au testat VVenv, individual și în combinație (PoliEnv) într-un model cimpanzeu. S-au imunizat 29 subcutanat 4 cimpanzei cu 3 injecții de Wenv singur (Cimpanzeii 1 și 3) sau PoliEnv (Cimpanzeii 3 și 4), urmat de o injecție intramusculară cu proteină recombinantă gpl20/gp41 în 31 alum. Siguranța a fost demonstrată la toate cele 4 animale, dintre care numai două au prezentat semne de ulcerare la locul de injectare. 33
Probele de ser s-au urmărit prin numeroase teste pentru legare HIV și neutralizare. Anticorpii cimpanzeilor 3 și 4 au demonstrat cea mai ridicată calitate a activității anticorpului. 35 Funcția de neutralizare s-a demonstrat atât împotriva unui izolat de laborator, cât și a unui izolat HIV-1 primar, din care nici unul nucleic a fost reprezentat specific în vaccin. Astfel, 37 inițierea limfocitelor cu proteine env amestecate asigură o metodă promițătoare prin care anticorpi de calitate superioară pot fi provocați împotriva diverșilor HIV-1. 39
Materiale și metode pVenv4, un vector Wrecombinant. S-a preparat anterior pVenv4 prin introducerea 41 unui codon stop în secvența BHIO-env și inserția genei de înveliș BH10 (env) în pSCII. pVenv4 s-a exprimat ca un produs proteină Env care s-a scurtat la aminoacidul 640 și a fost 43 capabil atât de secreție, cât și de polimerizare. Producerea unui recombinant W, Wenv4, care exprimă această proteină scurtată BH10 Env a fost descrisă anterior [Hallenberger et 45 al., Virology, 193:510-514 (1993)].
RO 120268 Β1
PCR pentru amplificarea secvențelor env de la indivizi infectați HlV-1. S-a folosit PCR pentru a amplifica secvențe HIV env. în general, s-au luat probe derivate din sângele indivizilor infectați cu HIV-1 la prima diagnosticare HIV. Alte probe au fost de la indivizi cu simptome clinice de SIDA sau din produse asigurate de cercetarea SIDA și păstrate ca reactivi de referință. Pentru probele de sânge, inițial s-a preparat ADN prin adăugarea în picătură a sângelului sau celulelor infectate într-un tampon de liză celulară bazat SDS și incubare la 65°C timp de 30 min. S-a adăugat pronază la o concentrație de 0,5 mg/ml și lizatul s-a incubat în continuare peste noapte, la 45°C. Două extracții fenol au urmat după precipitarea etanol și resuspendarea ADN-ului în apă.
S-au realizat două reprize de PCR cu toate probele ADN prin metode standard. Secvențele primer s-au ales pe baza secvenței BH10 publicate [Ratner et al., Nature 313:277-284 (1985)]. Pentru a obține fragmente care să includă secvențe din toate regiunile variabile și o porțiune a gp41, s-au folosit primeri PCR cum s-au descris în exemplul 1.
Produsele PCR au fost donate în continuare prin substituție în vectorul pVenv4 folosind metode standard. S-a realizat secvențarea asupra plasmidelor noi, prin folosirea metodei Sânger și primerul ccatgtgtaaaattaaccccactctgtg (SEQ ID NR:5).
nararea Wenv. S-au preparat recombinanți W noi (Wenv) insfecția celulelor infectate W (NYCDH, ATCC) cu plasmide de recombinare nou substituite (vezi mai sus). S-au folosit Transfectam (Promega) și Lipofectamină (Gibco, BRL) pentru a facilita transfecția urmând recomandările fabricantului. Apoi, VV au fost purificate pe placă.
Imunizări. Lizate celulare infectate Wenv s-au administrat la cimpanzei prin injecții subcutanate. Wenv s-au folosit fie singure, fie în combinație. Cantitățile totale de W prin pfu au fost similare în fiecare injecție (aproximativ IO7 pfu) per animal. Injecțiile intramusculare au fost cu un amestec de aproximativ 40 ug gpl20 (Cat.#12101, Intracel, Cambridge, MA), 20 ug gp41 (Cat. #036001, Intracel) și 50 ug alum (Rehsorbtar Aluminum hydroxide Adsorptive Gel, Intergen Co., Purchase, N.Y.) per inocul.
ELISA. Au fost realizate 5 ELISA după cum urmează: ELISA #1. ELISA clinică Abbott s-a procurat de la Laboratoarele Abbott și s-a realizat cum s-a recomandat de fabricanți (HIVAB HIV-l/HIV-2 (rDNA) EIA, Abbott Laboratories, Abbott Park, I.L.). ELISA #2: s-au realizat ELISA prin etalarea recombinantului Mn-gpl60 (Quality Biologica!, Inc. Gaithersburg, MD) la 1 ug/ml. Plăcile s-au blocat și s-au realizat teste cu diluții seriale 3 ori de seruri. Apoi, plăcile s-au spălat și s-au acoperit cu un conjugat fosfatază alcalină IgG anti-uman. ELISA #3: plăci ELISA s-au acoperit cu 1 ug/ml LAI-gpl20 (proteină derivată CHO, Intracel). Probele de ser s-au etalat după o diluție de 1:100 și s-au acoperit cu un conjugat fosfatază alcalină IgG anti-uman (Mouse anti-human IgGI-AP, cat. #9050-04, Southern Biological Associates. Inc., Birmingham, A.L.) Și fosfat de p-nitrofenol. Citirile O.D. s-au luat la 405 nm. ELISA #4: ELISA s-a realizat ca în analiza #3, cu excepția faptului că plăcile s-au acoperit cu 1 ug/ml de gpl20-IIIB (proteină derivată baculovirus, Intracel, cat. #12001, cambridge, MA). ELISA #5: Elisa s-a realizat ca în analiza #3 cu excepția că plăcile s-au acoperit cu 1 ug/ml Uzat virus IIIB (Organon Teknika Co., Durham, N.Y.).
Teste de neutralizare. Testele de neutralizare s-au realizat cu filate de laborator sau primare [Montefiori et al., J. Clin. Microbiol. 26:231-237 (1988), Montefiori et al., Journal of Infectious disease 173:60-67 (1996)]. Izolate de laborator. Virusul s-a amestecat cu o diluție 1:20 din fiecare probă de ser, și s-a întins pe celule MT-2 sau CEM-xl74. S-a folosit colorație roșu neutru pentru a analiza viabilitatea celulelor. O reducere 35-40% în moartea celulelor comparat la culturi de control s-a definit ca deviere pozitivă. Izolate primare: Virusul s-a amestecat cu o diluție 1:4 din fiecare probă de ser și s-a etalat pe PBMC stimulate PHA. Analizele au primit scoruri pentru p24. O reducere a infectivității de cel puțin 75% comparat la culturi de control a fost necesară pentru un scor pozitiv.
RO 120268 Β1
Rezultate 1
Prepararea de virusuri vaccinia recombinante Wenv noi. în scopul preparării de noi recombinanți W (Wenv), fiecare exprimând o proteină HIV-1 Env unică, ADN-ul a fost izolat 3 inițial din probe HIV-1. Majoritatea ADN-urilor au fost din sângele indivizilor care nu au prezentat semne exterioare de boală și au fost probabil la primul diagnostic pentru infecție 5 HIV-1. ADN-uri suplimentare au fost de la pacienți SIDA furnizate de AIDS Research and Reference Reagent Repository. S-a realizat PCR cu perechi de primeri care cuprind situri 7 de restricție Kpnl și Bsml. Apoi fragmentele s-au substituit în vectorul pVenv4 ilustrat în fig.
(pVenv a exprimat inițial o proteină HIV-1 truncată, BH10) la situri de restricție Kpnl și 9 Bsml. în acest mod, s-au înlocuit secvențele gpl20 (V1-V59 și gp41 din BH10 prin secvențele respective din produsele PCR. Cu fiecare plasmidă substituită, s-a preparat un nou virus 11 recombinant W (Wenv).
Această metodă asigură un mijloc simplu prin care s-ar putea încorpora o mare diver- 13 sitate de secvențe Env în recombinanți unici W (Wenv). Ceea ce este interesant, majoritatea secvențelor au fost productive, sugerând că secvențe Env din genomi provirali (de la care 15 s-au derivat majoritatea produselor PCR) au fost rareori imperfecte. Există diversitate printre Wenv folosite în amestecul de vaccin. 17
Imunizarea cimpanzeilor cu Wenv singur sau amestecat. S-au folosit 4 cimpanzei pentru testarea vaccinurilor W recombinante singure sau amestecate. Schemele imuni- 19 zărilor sunt prezentate în tabelul 2. Primele 3 injecții au conținut W în timp ce ultima injecție a conținut o combinație a gpl20, gp41 și alum, dată intramuscular. Cimpanzeii 1 și 2 au primit 21 numai un virus vaccinia și respectiv proteină a învelișului, date în fiecare dintre primele 3 injecții. Cimpanzeii 3 și 4 au primit un amestec de 10 recombinanți VV (și respectiv Env în 23 prima injecție), 10 Env suplimentare în a doua injecție și 10 suplimentare Env unic în ultima imunizare, dând un total de 30 vectori înainte de susținerea proteinei. Toți cimpanzeii au 25 primit cantități similare de virus vaccinia total în pfu și cantități similare de proteine totale recombinante. 27
Tabelul 2
Schema de imunizare pentru cimpanzei cu recombinanți W amestecați29
Data Injectare
Cimpanzeii 1 și 2: 1/9/96 W(Env#1) 31
4/16/96 W(Env#1)
6/11/96 VV(Env#1)33
7/30/96 recombinant gp120 și recombinant gp41 +alum35
Cimpanzeii 3 și 4: 1/9/96 W (Env #1-10)
4/16/96 W (Env #11-20)37
6/11/96 W (Env #21-30)
7/30/96 recombinant gp120 și39 recombinant gp41 +alum
Vvenv recombinant se poate administra fără erupția leziunii,ei patru cimpanzei s-au 41 urmărit pentru semne ale bolii și formarea leziunii la locul infecției. Animalele s-au analizat pe bază zilnică pentru diaree, rinoree, tuse, strănut, respirație rapidă, letargie, deplasare res- 43 trânsă și pierderea apetitului. Nici unul dintre aceste semne nu au fost evidente la nici un animal, în nici un moment. Fotografii făcute la locurile de injectare la intervale regulate, după 45 prima imunizare W, au arătat umflarea evidentă la toate cele patru animale. La cimpanzeii 1 și 3 au apărut leziuni medii, în locurile de injectare, reprezentând o vaccinare variolă, în 47 timp ce la cimpanzeii 2 și 4 nu a fost evidentă nici o leziune. Nici un simptom de boală, umflare sau leziuni nu au fost evidente la a doua, a treia sau a patra injectare, la nici un 49 animal, demonstrând că imunitatea specifică VV a fost provocată de prima inoculare.
RO 120268 Β1
Injectări de Wenv urmate de imunizări de rapel cu proteină au dat anticorp ELISA pozitiv. Anticorpi specifici HIV au fost urmăriți în timpul schemei de imunizare prin 5 ELISA diferite. ELISA s-au folosit pentru a măsura calitatea relativă mai degrabă, decât cantitatea absolută de anticorp la fiecare animal; în majoritatea cazurilor, testele au fost cu fragmente de virus care a pierdut structura tipică tridimensională și oligomerică a Env nativ. în aceste cazuri, ar fi fost de așteptat ca ELISA să lege numai un subset de anticorpi specifici HIV. Rezultatele obținute cu ELISA Abbott sunt prezentate în fig. 6. Cimpanzeul 3 a depășit limita pentru pozitivitate după prima imunizare W, în timp ce cimpazeul 4 a depășit limita după a doua imunizare Wenv. Răspunsurile cimpanzeilor 3 și 4 la sfârșitul schemei de imunizare depășesc pe departe pe cele ale cimpanzeilor 1 și 2. în ELISA #2 cu MN gpl6O, numai cimpanzeul 3 a răspuns puternic. Acest răspuns s-a întâlnit înainte de susținerea cu proteină și nu a fost perturbat de injectarea de rapel. Răspunsul la CHO-LAI legat la o placă ELISA (ELISA #3) folosind același antigen ca cel folosit pentru proteina de susținere purificată, a arătat că numai cimpanzeul 3 a răspuns puternic. în ELISA #4 cu placă \ IIIB-gpl20, cimpanzeul 2 a prezentat un fond crescut și datorită fondului crescut, cea mai ridicată valoare de virus 11IB Organon Technika, au fost pozitive cu serul de la toate cele 4 animale.
Răspunsul de neutralizare față de izolate primare și de laborator.
Teste de neutralizare s-au realizat cu seruri de la fiecare animal împotriva izolatelor de laborator. Prima analiză s-a realizat pe o linie de celule T, în timp ce ultima analiză s-a realizat pe PBMC stimulate PHA seronegative. în toate cazurile izolatele nu se potrivesc celor reprezentate în vaccinurile HIV-1. Așa cum s-a demonstrat în tabelul 3, probe de la cimpanzeul 2, cimpazeul 3 și cimpanzeul 4 au dat o deviere pozitivă (35-40% inhibare în creșterea virusului) împotriva izolatului de laborator MN în celule T. Analize cu alte două virusuri de laborator (unul IIIB [Lockye et al., Aids Res Hum Retroviruses 12:1297-1299 (1996)] și unul stoc SF2) nu au primit un scor pozitiv cu nici o probă. Sunt prezentate rezultatele analizelor de neutralizare [Montefiori et al., 1988, supra; Montefiori et al., 1996, supra] cu 4 izolate primare testate pe PBMC stimulate PHA. Virusul este considerat dicifil de neutralizat în aceste analize, deoarece serul pacientului a dat adesea rezultate negative, chiar când sunt folosite diluții 1:2 [Fenyo et al., AIDS 1O:S97-S1O6 (1996); Moore și Ho, AIDS 9:S117-S136 (1995); Montefiori et al., 1996, supra]. Interesant, o diluție 1:4 de ser al cimpanzeului 4 a fost capabil să neutralizeze unul dintre izolatele primare testate. Situația a diferit de experiențele altor vaccinuri cu Env, deoarece în majoritatea cazurilor anterioare, ser de la indivizi imunizați Env au dat rezultate negative în analize de neutralizare cu izolat primar [Steele, Journal ofNIH research 6:40-42 (1994); Moore, Nature 376:115 (1995)].
Tabelul 3
Neutralizarea prin antiseruri de cimpanzeu a virusurilor nereprezentate specific în vaccin
Izolat Cimpanzeu 1 Cimpanzeu 2 Cimpanzeu 3 Cimpanzeu 4
Tulpină MN laborator - Deviere pozitivă Deviere pozitivă Deviere pozitivă
Primar #1 - - - -
Primar #2 - - - -
Primar #3 - - - Pozitiv
Primar #4 - - - -
RO 120268 Β1
Vvenv amestecat provoacă anticorpi specifici HIV-1 de calitate mai ridicată decât 1 l/Venv singur. Rezultatele ELISA și ale analizelor de neutralizare sunt rezumate în tabelul 4 care listează acei cimpanzei ale căror seruri au dat răspunsuri mai puternice în cele 7 teste 3 descrise mai sus. Așa cum se poate remarca din tabel, cimpanzeii 3 și 4 au primit scoruri pozitive într-un compozit de 5 din cele 7 teste, în timp ce cimpanzeii 1 și 2 au primit scor 5 pozitiv în numai 3 din cele 7. Acest rezultat poate reflecta o calitate mai ridicată a anticorpilor provocați prin Poli Env așa cum s-a comparat pentru vaccinuri Env singure. 7
Tabelul 4 9
Rezumatul analizelor ELISA și de neutralizare
Analiză Răspunsuri mai puternice printre cimpanzei care au primit W singur Răspunsuri mai puternice printre cimpanzei care au primit W amestecat
ELISA #1Abbott (IIIB-gp41) Cimpanzeu 3 și 4
ELISA #2MN gp160-BAC Cimpanzeu 3
ELISA #3 IIIB-gp120-BAC Cimpanzeu 2
ELISA #4 LAI-gp120-CHO Cimpanzeu 3
ELISA #5 lizat virus IIIb Cimpanzeu 1 și 2 Cimpanzeu 3 și 4
Neutralizare izolat la laborator (deviere) Cimpanzeu 2 Cimpanzeu 3 și 4
Neutralizare izolat primar Cimpanzeu 4
Evaluare
Experimentele descrise în acest exemplu au fost desemnate să testeze siguranța 23 unui vaccin virus vaccinia - bazat HIV-1 și să compare eficacitatea inițierii cu vaccinuri din amestecuri înveliș și înveliș singur. Rezultatele au demosntrat mai întâi că virusul vaccinia 25 ar putea fi folosit ca imunogen fără inducerea unei leziuni deschise și, în al doilea rând, că s-ar putea provoca o lărgime mare a activității specifice HIV-1 cu amestecul înveliș. 27
Modelul cimpanzeu a permis să se examineze siguranța PoliEnv la primate. Noi am fost interesați în mod deosebit să determinăm extinderea formării leziunilor deschise, deoa- 29 rece inoculări W ar putea fi o amenințare din parte virusului viu transferat la indivizi neimunizați. în cazul HIV, aceasta este o preocupare serioasă prin faptul că un pacient SIDA nu 31 poate fi capabil să blocheze infecția W. Pentru abordarea acestei preocupări noi am testat utilizarea vaccinărilor subcutanate la cimpanzei, punându-ne întrebarea dacă s-ar putea evita 33 o leziune deschisă. în schimb, numai doi din cei patru cimpanzei au demonstrat leziuni deschise. Rezultate similare s-au observat când s-au folosit inoculări subcutanate de stoc 35 de virus vaccinia NYCDH în experimente clinice de vaccin variolă [Connor et al., Journal of Infectious Diseases 135:164-175 (1977); Benenson et al., Journal of Infectious Diseases 37 135:135-144(1977)].
Probabil că folosind o procedură de injectare cu atenție suplimentară și având grijă 39 de locul injectării, leziunile deschise pot fi evitate în toate cazurile. Aceste rezultate demonstrează că necesitatea abordării siguranței nu împiedică virusului vaccinia ca un 41 vector pentru vaccin HIV-1. Amestecurile de înveliș au fost testate în experimente cu (exemplul 2) și iepure. în experimentele cu șoarece, anticorpii anti-HIV s-au urmărit după o 43
RO 120268 Β1 singură injectare de Wenv, în timp ce la iepuri Wenv s-au folosit pentru a susține răspunsurile provocate cu ADN. Experimentele au arătat că anticorpi specifici HIV-1 s-ar putea provoca sau susține cu Wenv și că izolate primare ar putea fi neutralizate prin răspuns anticorp. Pentru examinarea potențialului Wenv amestecate (PoliEnv), cimpanzeii s-au împărțit în două grupuri. Primii doi cimpanzei au primit numai un Wenv, în timp ce cimpanzeii 3 și 4 au primit amestecuri compuse dintr-un total de 30 Wenv diferite.
După ce au primit imunizări cu virusuri vaccinia, tuturor celor 4 cimpanzei li s-a dat un rapel cu un singur amestec de proteine gpl20/gp41 în alum. Serurile de la fiecare din cei patru cimpanzei s-au testat în 5 ELISA diferite, fiecare folosind un fragment diferit și/sau configurație a Env. Interesant, cimpanzeii 1 și 2 ca un compozit, au răspuns puternic în una din aceste ELISA, în timp ce serurile de la cimpanzeii 3 și 4 ca un compozit au răspuns puternic în 4 asemenea teste. Așa cum s-a măsurat în fiecare test, numai o fracțiune a anticorpului specific HIV-1 din fiecare animal, a reflectat rezultate probabile ale spectrului superior de activități de legare anticorp provocate de vaccinul amestecat.
De asemenea, s-au realizat analize de neutralizare atât împotriva izolatelor de laborator, cât și primare. Interesant, s-a remarcat un răspuns pozitiv împotriva unui izolat primar la cimpanzeul 4, chiar dacă izolatul primar nu a fost reprezentat specific în vaccinul amestec. Din nou, aceste rezultate au demonstrat un spectru mai mare de anticorpi provocați prin vaccinul amestec PoliEnv. Creșterea complexității antigenului unui vaccin poate fi de așteptat să conducă la o diversitate crescută a limfocitului și, respectiv, răspunsurilor anticorp.
Demonstrația că anticorpii de neutralizare pot fi provocați unui izolat primar care nu este reprezentat indică faptul că proteine distinct lineare împărtășesc structuri conformaționale. Această noțiune este demostrată de asemenea, de răspunsurile imune ale pacienților infectați HIV-1, prin faptul că doi indivizi care sunt expuși la un miliard de virusuri mutual exclusive, sunt protejați în general de suprainfecție când are loc expunerea încrucișată. Utilizarea PoliEnv reprezintă o primă încercare într-un sistem cimpanzeu de a imita situația HIV-1 la pacienți. Astfel, anticorpi de neutralizare sunt provocați cu un larg sistem, mai degrabă cu o singură proteină env.
în rezumat, noi am testat un amestec de vaccin HIV-1 bazat pe VV numit PoliEnv întrun model cimpanzeu. Acest exemplu a demonstrat:
1) W ar putea fi folosit ca un vaccin fără inducerea unei leziuni deschise a pielii;
2) un spectru mare al activităților anticorpului specific HIV-1 ar putea fi provocat cu acest vaccin;
3) un amestec de constructe Env (PoliEnv) a dat o calitate superioară a anticorpilor specifici HIV comparat cu un singur construct Env.
Virusul vaccinia a fost cunoscut de mult timp ca un vaccin potențial, atât în forma tipului sălbatic, cât și în formă recombinantă. Tăria W se bazează pe puterea sa de a recruta ambele compartimente, limfocitele B și limfocitele citotoxice T, ale răspunsului imun. W a cuprins numai vaccinul capabil de eradicare a unei boli (variolă din populația umană). Datele din acest exemplu arată că vectorii recombinanți W vor contribui la controlul în viitor al HIV-1.
Exemplul 4. Prepararea unei plasmide bifuncționale Vaccinuri ADN s-au dovedit a provoca anticorp puternic și răspunsuri CTL în câteva sisteme distincte (influenza, HIV-1, etc). Vaccinuri ADN bazate pe influenza și HIV-1 sunt deja în experimentări clinice cu voluntari adulți sănătoși. De asemenea, virusul vaccinia servește ca o bază puternică pentru programe de vaccinare. De fapt, virusul vaccinia a fost singurul capabil de are a unei boli (variolă) din populația umană. Numeroase virusuri vaccinia recombinante au provocat
RO 120268 Β1 răspunsuri imune protectoare așa cum s-a demonstrat în studii pe animale. Datele de mai 1 sus demonstrează eficacitatea unui vaccin polienv și a strategiilor de vaccinare combinate, de exemplu, vaccinuri ADN și vaccinuri virale. 3
Este construită o plasmidă bifuncțională care poate acționa atât ca un vaccin ADN, cât și ca un vector recombinant W. Fig. 7 arată o hartă a acestui plasmid, care include un 5 promotor CMV pentru expresie în celule mamifere și promotorii vaccinia timpuriu și târziu pentru prepararea vacciniei recombinante. Injectarea directă a plasmidei ADN purificat ar 7 putea fi folosită pentru a provoca răspunsuri imune împotriva unei proteine env HIV la subiecți test. Plasmida ar putea fi folosită, de asemenea, pentru prepararea virusurilor vacci- 9 nia recombinante vii, de testare, ca vehicule de imunizare proteină env HIV.
Subiecții ar putea fi vaccinați potențial cu un regim multișir, care cuprinde atât vacci- 11 narea(rile) ADN, cât și imunizarea(ările) cu virus vaccinia recombinant, dat în orice ordine, în injectări unice sau multiple și/sau în legătură cu vehicule vaccin suplimentare. 13
Prezenta invenție nu trebuie să fie limitată în întinderea ei prin realizările specifice descrise aici. în schimb, diverse modificări ale invenție,i suplimentare celor descrise aici, vor 15 deveni evidente pentru cei cu pregătire în domeniu, din descrierea anterioară și figurile însoțitoare. Astfel de modificări se intenționează să intre în cuprinsul revendicărilor anexate. 17 Trebuie să se înțeleagă în plus că toate mărimile bazelor sau mărimile aminoacizilor și toată greutatea moleculară sau valorile maselor moleculare, date pentru acizii nucleici sau 19 polipeptide sunt aproximative și sunt date pentru descriere.
Lista de referințe
Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc, New
York, NY (1987, 1988, 1989, 1990, 1991, 1992, 1993, 1994, 1995)25
Avery's Drug Treatment: Principles and Practice of Clinical Pharmacology and Therapeutics, Third Edition, ADIS Press, LTD., Williams and Wlkins, Baltimore, MD (1987)27
Belshe, R.B. et al., J. Am. Med. Assoc. 272:431-431 (1994)
Berkow et al., eds., The Merck Manual, Fefteenth Edition, Merck and Co., Rahway, 29 NJ (1987)
Bimboim, H.C. și Doly, J., Nucleic Acids Res. 7:1513-1523 (1979)31
Buck, C, și Paulino, M.S. eds., American Type Culture Collection Catalogue of Animal Viruses and Antisera, Chlamydiae and Rickettsiae, 6th Ed., American Type Culture 33 Collection, Rockville, MD (1990)
Burns, D.P.W. și Desrosiers, R.C., Cur. Topics Microbiol. Immunol. 188:185-35
219(1994)
Chakrabarti, S. et al., Mol. Cell. Biol. 5:3403-3409 (1985) Cooney et al., Proc. Natl. 37 Acad. Sci.USA 90:1882-1886 (1993)
Creighton, T.E., Proteins: Structure andMolecularProperties, W.H. Freeman & Co., 39 San Francisco, CA (1983)
DeVita Jr., V.T. et al., AIDS, Etiology, Diagnosis, Tratment eyention, 3rd ediion, J.B. 41 Lippincott Co., Philadelphia, PA
D'Honcht, Vaccine 10 Supl.:548-52 (1992)43
Dorozynski și Anderson, Science 252:501-502 (1991)
Ebadi, Pharmacology, Little, Brown and Co.,Boston, MA (1985)45
Eichberg, Int. Conf. AIDS 7:88 (1991)
Embretson, J. et al., Nature 362:359-362 (1993)47
Enami et al., J. Virol. 65:2111-2113 (1991)
RO 120268 Β1
Enami et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 87:3802-3805 (1990)
Fauci, Science 264:1012-1013 (1994)
Goodman et al., eds., Goodman and Gilman's The PharmacologicalBasisof Therapeutics, Eighth Edition, Pergamon Press, Inc., Elmsford, NY (1990)
Gorse, AIDSRes. Hum. Retrovir. 20(Suppl 2):141-143 (1994) Gribskov și Burgess, Nuci. Acids Res. 24:6745 (1986)
Graham et al., J. lfect.Dis.166:244-252(1992)·, J. lnfect.Dis. 167:533-531 (1993)
Grundwald-Bearch et al., J. Cancer Res. Clin. Oncol. 127:561-567 (1991) Hallenberger et a/., Virology 253:510-514 (1993)
R., et al., eds., American Type Culture Collection of Cell Lines and Hybridomas, Ed., American Type Culture Collection, Rockville, MD (1992)
Hirsch, M.S. și Curran, J. Human iimmunodeficiency viruses, bilogy and medical aspects în Virology, Fields și Knipe, eds., Raven Press, Ltd., New York, NY (1990), pp, 1545-1570
Hu et al., Nature 328:121-123 (1987)
Ish-Horowicz, D și Burke, J.F., Nucleic Acids Res. 9:2989-2998 (1981)
Ito et al., J. Virol. 65:5491-5498 (1991) Ito et al., Cancer Rse. 50:6915-6918 (1990) Javaherin, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 86:6768-6772 (1989)
Katzung, ed., Basic and clinical Pharmacology, Fifth Edition, Appleton and Lange, Norwalk, CT(1992)
Keeferet al., AIDS Res. Hum. Retrovir, 19(Suppl. 2):S139-143 (1994)
Kieny et al., Int. Conf. AIDS 5:541 (1989) Kilpatrick et al., J. Biol. Chem. 262:116-121 (1987) Luytjes et al., Cell 59:1107-1113 (1989)
Mackett, M. et al., Proc. Nații. Acad. Sci. (USA) 79:7415-7419(1982)
Mazzara, G.P. et al., Methods in Rnz. 217:557-581 (1993)
McEIrath et al., J.lnfect.Dis. 169:41-47 (1994) Needleman și Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443(1970)
Osol, A., ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA (1980), pp.1324-1341
Panicali, D„ și Paoletti, E„ Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 79:4927-4931 (1982)
Pantaleo, G. et al., Nature 362:355-358 (1993) Rhim, J.S. et al., Int. J. Cancer 15:2329 (1975) Richman, AIDs Res. Hum. Retroviruses 8:1065-1071 (1992) Richman, Annu Rev Pharmacol Toxico 33: 149-164 (1993) Richman, Antimicrob Agents Chemother 37:12071213)1993) Richman, AIDs Res. Hum. Retroviruses 10:901 (1994)
Richmond și McKinney, eds. Biosafety in microbiological and biomedical laboratories, 3rd Edition, U.S.Dept. Of Health & Human Servicies, Washington DC (1993)
Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)
Schulz, G.E. etal., PrinciplesofProteinStructure, inger-Verlag, NewYork, NY(1978)
Schwartz și Dayhoff, eds, Atlas of Protein Sequence and ure, Național Biomedical Research Foundation, [Washington,DC ?-wp](1979), pp. 353-358
Selenka et al., Arch. Hyg. Bakteriol. 253:244-253 (1969)
Smithși Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981) Starcich et a/., Cell45:631 (1986)
Towbin, H. et al., Proc.Natl.Acad.Sci. (USA) 76:4350 (1979)
United States Biochemical, Sequenase Version 2.0-DNA Sequencing Kit, Ninth Edition, Amersham Life Science, Inc., Boise, Idaho (1994)
Weiref al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 75:1210-1214 (1982) Welliseta/., J. Immunol. 99:1134-9 (1967)
RO 120268 Β1
Wong-Staal, F., Human immunodeficiency virusesandtheirreplication,în Virology, 1 Fields și Knipe, ed., Raven Press, Ltd., New York, NY (1990) p.1529-1543
Wrin et al., J'. Acquir. Immune Defic.Syndr. 7:211-219 (1994) Wu et al., 3 Prog.Nuci.Acid.Res.Molec.Biol. 21:101-141 (1978)Zaguryeta/., Nature332:728-731 (1988)
LISTA DE SECVENȚE (1) INFORMAȚIE GENERALĂ: ’7 (i) SOLICITANT: St. Jude Chidren's Research Hospital
332 North Lauderdale PO Box 3189
Memphis, TN 38101-0318 Statele Unite ale Americii
SOLICITANȚI/INVENTATORI: Hurwitz, Julia L.11
Coleclough, Christopher Owens, Randall J. Slobod, Karen (ii) TITLUL INVENȚIEI: PREPARAEA Șl UTILIZAREA VECTORILOR VIRALI 13
PENTRU VACCINURI MIXTE DE PROTEINĂ DE ÎNVELIȘ ÎMPOTRIVA VIRUSULUI IMUNODEFICIENTEI UMANE15 (iii) NUMĂR DE SECVENȚE: 7 (iv) ADRESA PENTRU CORESPONDENȚĂ:17 (A) DESTINATAR: KLAUBER & JACKSON (B) STRADA: 411 HACKENSACK AVENUE19 (C) ORAȘ: HACKENSACK (D) STAT: NJ21 (E) ȚARA: SUA (F) ZIP: 0760123 (v) FORMA CITIBILĂ PE COMPUTER:
(A) TIP MEDIU: Floppy disk25 (B) COMPUTER: compatibil IBM PC (C) SISTEM DE OPERARE: PC-DOS/MS-DOS27 (D) SOFTWARE: Patentln Release #1,0, Versiune #1,30 (vi) DATELE CERERII CURENTE:29 (A) NUMĂRUL CERERII: va fi atribuit (B) DATA DEPUNERII: prin aceasta31 (C) CLASIFICARE:
(viii) INFORMAȚIE MANDATAR/AGENT:33 (A) NUME: Paul F. Fehlner (B) NUMĂR DE ÎNREGISTRARE: 35.13535 (C) NUMĂR REFERINȚĂ/DOSAR: 13401011/PCT (ix) INFORMAȚIE PENTRU TELECOMUNICAȚIE:37 (A) TELEFON: 201-487-5800 (B) TELEFAX: 201-343-168439 (2) INFORMAȚIE PENTR SEQ ID NR: 1:
(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:41 (A) LUNGIME: 27 baze perechi (B) TIP: acid nucleic43 (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară45 (E) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 1:47
AGCAGAAGAC AGTGGCAATG AGAGTGA 27
RO 120268 Β1 (2) INFORMAȚIE PENTR SEQ ID NR: 2:
(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:
(A) LUNGIME: 30 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 2:
CCACTCCATC CAGGTCATGT TATTCCAAAT 30 (2) INFORMAȚIE PENTR SEQ ID NR: 3:
(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:
(A) LUNGIME: 32 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 3:
GTGGGTCACA GTCTATTATG GGGTACCTGT GT 32 (2) INFORMAȚIE PENTR SEQ ID NR: 4:
(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:
(A) LUNGIME: 34 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 4:
CCAGAGATTT ATTACTCCAA CTAGCATTCC AAGG 43 (2) INFORMAȚIE PENTR SEQ ID NR: 5:
(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:
(A) LUNGIME: 28 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (E) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 5:
CCATGTGTAA AATTAACCCC ACTCTGTG 28 (2) INFORMAȚIE PENTR SEQ ID NR: 6:
(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:
(A) LUNGIME: 2 6 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 6:
TACAATTTCT GGGTCCCCTC CTGAGG 2 6 (2) INFORMAȚIE PENTR SEQ ID NR: 7:
(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:
(A) LUNGIME: 880 aminoacizi
RO 120268 Β1 (B) TIP: aminoacid (C) ÎMPLETIRE: ambele (D) TOPOLOGIE: ambele (ii) TIPUL MOLECULEI: proteină (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 7:
Lys Glu Gin Lys Thr Val Ala Met Arg Val Lys Glu Ser Gin Met Lys 1 5 1015
Lys Gin His Leu Trp Arg Trp Gly Trp Arg Trp Gly Thr Met Leu Leu
2530
Gly Leu Met Ile Cys Ser Ala Thr Glu Lys Leu Trp Val Thr Val Tyr
4045
Tyr Gly Val Pro Val Trp Lys Glu Ala Thr Thr Thr Leu Phe Cys Ala
5560
Ser Asp Ala Lys Ala Tyr Asp Thr Glu Val His Asn Val Trp Ala Thr
60 6580
His Ala Cys Val Pro Thr Asp Pro Asn Pro Gin Glu Val Val Leu Val
9095
Asn Val Thr Glu Asn Phe Asn Met Trp Lys Asn Asp Met Val Glu Gin 100 105110
Met His Glu Asp Ile Ile Ser Ser Leu Trp Asp Gin Ser Leu Lys Cys
115 120125
Val Lys Leu Thr Pro Leu Cys Val Ser Leu Lys Cys Thr Asp Leu Lys
130 135140
Asn Asp Thr Ser Asn Asn Val Thr Ser Ser Ser Trp Gly Arg
145 150 155160
Asn Ile Met Glu Glu Gly Glu Ile Lys Asn Cys Ser Phe Asn Ile Ser
165 170175
Thr Ser Ile Arg Gly Lys Val Gin Lys Glu Tyr Ala Phe Phe Tyr Lys
180 185190
Leu Asp Ile Ile Pro Ile Asp Lys Gly Asn Asp Ser Asn Asp Thr Thr
195 200205
Ser Tyr Lys Phe Thr Leu Thr Ser Cys Asn Thr Ser Val Ile Thr Gin
210 215220
Ala Cys Pro Lys Val Ser Phe Glu Pro Ile Pro Ile His Tyr Cys Ala
225 230 235240
Pro Ala Gly Phe Ala Ile Leu Lys Cys Asn Asn Lys Thr Phe Asn Gly
245 250255
Thr Gly Pro Cys Thr Asn Val Ser Thr Val Gin Cys Thr His Gly Ile
260 265270
Arg Pro Val Val Ser Thr Gin Leu Leu Leu Asn Gly Ser Leu Ala Glu
275 280285
Glu Glu Val Val Ile Arg Ser Ala Asn Phe Thr Asn Asn Ala Lys Thr
290 295300
Ile Ile Val Gin Leu Asn Gin Ser Val Glu Ile Asn Cys Thr Arg Pro
305 310 315320
Asn Asn Asn Thr Arg Lys Ser Ile Arg Ile Gin Arg Gly Phe Gly Arg
325 330335
Ala Phe Val Thr Ile Gly Lys Ile Leu Gly Asn Met Arg Gin Ala His
340 345350
RO 120268 Β1
385
Cys Asn Ile Ser Arg Ala Lys Trp Asn Asn Thr Leu Lys Gin Ile Asp
355 360365
Ser Lys Leu Arg Glu Gin Phe Gly Asn Asn Lys Thr Ile Ile Phe Lys
370 375380
Gin Ser Ser Gly Gly Asp Pro Glu Ile Val Thr His Ser Phe Asn Cys
390 395400
Gly Gly Glu Phe Phe Tyr Cys Asn Ser Thr Gin Leu Phe Asn Ser Thr 405 410415
Trp Phe Asn Ser Thr Trp Ser Thr Lys Gly Ser Asn Asn Thr Glu Gly 420 425430
Ser Asp Thr Ile Thr Leu Pro Cys Arg Ile Lys Gin Ile Ile Asn Met
435 440445
Trp Gin Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Pro Pro Ile Ser Gly Gin
450 455460
Ile Arg Cys Ser Ser Asn Ile Thr Gly Leu Leu Leu Thr Arg Asp Gly 465 470 475480
Gly Ala Asn Glu Asn Asn Glu Ser Glu Ile Phe Arg Pro Gly Gly Gly 485 490495
Asp Met Arg Asp Asn Trp Arg Ser Glu Leu Tyr Lys Tyr Lys Val Val 500 505510
Lys Ile Glu Pro Leu Gly Val Ala Pro Thr Lys Ala Lys Arg Arg Val â 515 520525
Val Gin Arg Glu Lys Arg Ala Val Gly Glu Ile Gly Ala Leu Phe Leu 530 535540
Gly Phe Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly Ala Ala Ser Met Thr
545 550 555560
Leu Thr Val Gin Ala Arg Gin Leu Leu Ser Gly Ile Val Gin Gin Gin
565 570575
Asn Asn Leu Leu Arg Ala Ile Glu Ala Gin Gin His Leu Leu Gin Leu 580 585590
Thr Val Trp Gly Ile Lys Gin Leu Gin Ala Arg Ile Leu Ala Val Glu
595 600605
Arg Tyr Leu Lys Asp Gin Gin Leu Leu Gly Ile Trp Gly Cys Ser Gly 610 615620
Lys Leu Ile Cys Thr Thr Ala Val Pro Trp Asn Ala Ser Trp Ser Asn 625 630 635640
Lys Ser Leu Glu Gin Ile Trp Asn Asn Met Thr Trp Met Glu Trp Asp 645 650655
Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Ser Leu Ile His Ser Leu Ile Glu Glu
660 665670
Ser Gin Asn Gin Gin Glu Lys Asn Glu Gin Glu Leu Leu Glu Leu Asp 675 680685
Lys Trp Ala Ser Leu Trp Asn Trp Phe Asn Ile Thr Asn Trp Leu Trp 690 695700
Tyr Ile Lys Leu Phe Ile Met Ile Val Gly Gly Leu Val Gly Leu Arg
705 710 715720
Ile Val Phe Ala Val Lau Ser Val Val Asn Arg Val Arg Gin Gly Tyr
725 730735
RO 120268 Β1
Ser Pro Leu Ser Phe Gin Thr His Leu Pro Ile Pro Arg Gly Pro Asp1
740 745750
Arg Pro Glu Gly Ile Glu Glu Glu Gly Gly Glu Arg Asp Arg Asp Arg3
755 760765
Ser Ile Arg Leu Val Asn Gly Ser Leu Ala Leu Ile Trp Asp Asp Leu5
770 775780
Arg Ser Leu Cys Leu Phe Ser Tyr His Arg Leu Arg Asp Leu Leu Leu7
785 790 795800
Ile Val Thr Arg Ile Val Glu Leu Leu Gly Arg Arg Gly Trp Glu Ala9
805 810815
Trp Trp Asn Leu Leu Gin Tyr Trp Ser Gin Glu Leu Lys11
820 825830
Asn Ser Ala Val Ser Leu Leu Asn Ala Thr Ala Ile Ala Val Ala Glu13
835 840845
Gly Thr Asp Arg Val Ile Glu Val Val Gin Gly Ala Tyr Arg Ala Ile15
850 855860
Arg His Ile Pro Arg Arg Ile Arg Gin Gly Leu Glu Arg Ile Leu Leu17
865 970 975880

Claims (18)

1. Vaccin polienv, care cuprinde cel puțin 4 până la aproximativ 10000 virusuri recombinante diferite, fiecare cuprinzând un acid nucleic variantă env (EV) care codifică o variantă23 diferită de proteină de înveliș, în cazul unei proteine de înveliș a virusului imunodeficienței umane (HIV), în care:25
a) acidul nucleic EV codifică ambele regiuni, variabilă și constantă, a variantei de proteină de înveliș;27
b) vaccinul polienv este capabil să provoace cel puțin un răspuns imun celular și un răspuns imun umoral la un mamifer, împotriva unei tulpini HIV; și29
c) vaccinul polienv este capabil să provoace un răspuns imun față de o tulpină HIV pentru care proteinele de înveliș nu sunt incluse în vaccinul polienv.31
2. Vaccin polienv, conform revendicării 1, cuprinzând de la 10 la aproximativ 100 virusuri recombinante, care cuprind variante env diferite ale HIV.33
3. Vaccin polienv, conform revendicării 1 sau 2, în care virusurile recombinante sunt vaccinia, virusul canary pox, andeovirus sau virusul adeno asociat (AAV).35
4. Vaccin polienv, conform oricăreia din revendicările 1...3, în care varianta de proteină de înveliș cuprinde gp120 și o porțiune a gp41 suficientă să permită oligomerizarea37 proteinelor env.
5. Vaccin polienv, conform revendicării 4, în care acidul nucleic EV cuprinde un 39 fragment de restricție Kpnl-Bsml al unei secvențe de nucleotidă care codifică proteina de înveliș HIV.41
6. Vaccin polienv, conform oricăreia din revendicările 1 ...5, în care acidul nucleic EV este izolat de la pacienți cu un virus HIV dintr-o zonă geografică restrânsă, sau de la pacienți 43 infectați cu un virus HIV provenind din grupări genetice cu strămoș somun.
7. Vaccin polienv, conform oricăreia din revendicările 1 ...6, în care vaccinul cuprinde 45 variante ale proteinei exprimate de virusul recombinant.
8. Vaccin polienv, conform oricăreia din revendicările 1 ...7, în care vaccinul polienv 47 cuprinde în plus cel puțin un purtător acceptabil farmaceutic, un adjuvant și un compus chemoterapeutic antiviral. 49
RO 120268 Β1
9. Vaccin polienv, conform oricăreia din revendicările 1 ...8, pentru utilizare în sensul provocării unui răspuns umoral sau a unui răspuns imun celular, sau atât a unui răspuns umoral, cât și a unui răspuns imun celular, împotriva unui virus al imunodeficienței umane.
10. Vaccin conform revendicării 8, în care virusul recombinant este un virus vaccinia și în care vaccinul polienv este adecvat administrării subcutanate.
11. Metodă pentru realizarea unui vaccin polienv, ca cel definit în oricare dintre revendicările 1-8, care cuprinde combinarea în amestec a cel puțin 4 până la 10000 virusuri recombinante diferite, pentru a obține vaccinul polienv menționat, și opțional adăugarea a cel puțin unui purtător acceptabil farmaceutic, a unui adjuvant sau a unui compus chemoterapeutic antiviral.
12. Un prim vaccin polienv, conform oricăreia din revendicările 1-8 și un alt vaccin polienv conform oricăreia din revendicările 1-8, în care virusurile recombinante ale celuilalt vaccin polienv aparțin unor specii diferite față de virusurile recombinante ale primului vaccin polienv, și în care primul și respectiv celălalt vaccin polienv sunt adecvate administrării la un mamifer.
13. Vaccin polienv, conform oricăreia din revendicările 1-8, care mai conține:
a) cel puțin o proteină env HIV recombinantă, sau
b) o cantitate eficientă din cel puțin un vector AND care codifică conform expresiei pentru o proteină env HIV recombinantă; sau
c) atât o proteină env HIV recombinantă, cât și o cantitate eficientă din cel puțin un vector AND care codifică conform expresiei pentru o proteină env HIV recombinantă, pentru producerea, inițierea sau susținerea unui răspuns imun umoral sau celular, sau ambelor, în care vaccinul polienv conform oricăreia dintre revendicările 1 -8, proteina env HIV recombinantă și/sau vectorul ADN care codifică conform expresiei pentru o proteină env HIV recombinantă, pot fi administrate în orice succesiune.
14. Vaccin polienv, conform revendicării 13, în care vectorul ADN este adaptat pentru administrare prin proiectil de gene.
15. Vaccin polienv, conform revendicării 13, în care proteina env HIV recombinantă reprezintă un amestec cu un adjuvant sau este adaptată pentru administrare intramusculară, sau ambele.
16. Vaccin polienv, conform oricăreia dintre revendicările 1-9, în care cel puțin unul dintre virusurile recombinante menționate este o plasmidă bifuncțională, care poate servi ca vaccin ADN și ca vector recombinant al virusului, cuprinzând un situs heterolog de inserție sub controlul atât al unei secvențe de control de expresie de la animal, cât și al unei secvențe de control de expresie virală.
17. Vaccin polienv, conform revendicării 16, care cuprinde secvența de control de expresie animală este un promotor timpuriu direct citomegalovirus (CMV) și secvența de control al expresiei virale este un promotor timpuriu al virusului vaccinia, un promotor târziu al virusului vaccinia, sau ambele.
18. Vaccin polienv, conform revendicării 16, care cuprinde o genă heterologă, în care gena heterologă este un acid nucleic variantă env (EV) care codifică atât regiunile variabile, cât și regiunile constante ale unei variante de proteină de înveliș ale unei proteine de înveliș HIV.
RO98-01218A 1996-01-23 1997-01-23 Vaccin polienv, pentru virusul imunodeficienţei umane RO120268B1 (ro)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/590,288 US5741492A (en) 1996-01-23 1996-01-23 Preparation and use of viral vectors for mixed envelope protein vaccines against human immunodeficiency viruses
PCT/US1997/000669 WO1997027311A1 (en) 1996-01-23 1997-01-23 Mixture of recombinant vaccinia vectors as polyenv vaccines for hiv

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RO120268B1 true RO120268B1 (ro) 2005-11-30

Family

ID=24361647

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RO98-01218A RO120268B1 (ro) 1996-01-23 1997-01-23 Vaccin polienv, pentru virusul imunodeficienţei umane

Country Status (28)

Country Link
US (3) US5741492A (ro)
EP (2) EP1378516A1 (ro)
JP (2) JP2000504326A (ro)
KR (1) KR100571479B1 (ro)
CN (1) CN1229501C (ro)
AP (1) AP1200A (ro)
AT (1) ATE278790T1 (ro)
AU (1) AU709174B2 (ro)
BG (1) BG64711B1 (ro)
BR (1) BR9707611A (ro)
CA (1) CA2243570C (ro)
CZ (1) CZ296575B6 (ro)
DE (1) DE69731075T2 (ro)
DK (1) DK0876498T3 (ro)
EA (1) EA002390B1 (ro)
ES (1) ES2230596T3 (ro)
GE (1) GEP20032902B (ro)
HU (2) HU0402182D0 (ro)
IL (2) IL156919A0 (ro)
NO (1) NO322261B1 (ro)
NZ (1) NZ331024A (ro)
OA (1) OA10814A (ro)
PL (1) PL188641B1 (ro)
PT (1) PT876498E (ro)
RO (1) RO120268B1 (ro)
TR (1) TR199801418T2 (ro)
UA (1) UA73712C2 (ro)
WO (1) WO1997027311A1 (ro)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116981448A (zh) * 2021-01-14 2023-10-31 益生生物科技有限公司 包括工程化的植物来源的细胞外囊泡的组合物及其用作疫苗的用途

Families Citing this family (58)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7488485B2 (en) * 2003-09-16 2009-02-10 University Of Kansas Medical Center DNA vaccine compositions and methods of use
US20030138454A1 (en) * 1997-06-09 2003-07-24 Oxxon Pharmaccines, Ltd. Vaccination method
GB9711957D0 (en) * 1997-06-09 1997-08-06 Isis Innovation Methods and reagents for vaccination
US6919318B1 (en) * 1998-04-22 2005-07-19 Chiron Corporation Enhancing immune responses to genetic immunization by using a chemokine
WO1999061049A2 (en) * 1998-05-22 1999-12-02 University Of Massachusetts Medical Center Model for infection by a pathogen using administration of nucleic acids
US6562800B1 (en) * 1998-10-30 2003-05-13 University Of Southern California Use of immunopotentiating sequences for inducing immune response
US6759237B1 (en) 1998-11-05 2004-07-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Adeno-associated virus serotype 1 nucleic acid sequences, vectors and host cells containing same
AU780231B2 (en) * 1998-11-10 2005-03-10 University Of North Carolina At Chapel Hill, The Virus vectors and methods of making and administering the same
JP4776075B2 (ja) 1998-12-31 2011-09-21 ノバルティス バクシンズ アンド ダイアグノスティックス，インコーポレーテッド 改変ｈｉｖｅｎｖポリペプチド
AU2221600A (en) 1998-12-31 2000-07-31 Chiron Corporation Improved expression of hiv polypeptides and production of virus-like particles
AU2487300A (en) * 1998-12-31 2000-07-31 Chiron Corporation Polynucleotides encoding antigenic hiv type c polypeptides, polypeptides and uses thereof
US7935805B1 (en) * 1998-12-31 2011-05-03 Novartis Vaccines & Diagnostics, Inc Polynucleotides encoding antigenic HIV Type C polypeptides, polypeptides and uses thereof
AU2579600A (en) * 1999-01-28 2000-08-18 Stichting Biomedical Primate Research Centre Product and method for obtaining specific immunisation with one or more antigens
DE19907485B4 (de) * 1999-02-12 2008-01-17 Strathmann Ag & Co. Virus-Vakzine
US6420545B1 (en) * 1999-05-24 2002-07-16 The Trustees Of The University Of Pennsylvania CD4-independent HIV envelope proteins as vaccines and therapeutics
AU3793701A (en) * 1999-11-29 2001-06-04 Orchid Biosciences, Inc. Methods of identifying optimal drug combinations and compositions thereof
US20040105871A1 (en) * 2000-03-02 2004-06-03 Robinson Harriet L. Compositions and methods for generating an immune response
EP2388015A1 (en) 2000-03-02 2011-11-23 Emory University DNA expression vectors and methods of use
US8623379B2 (en) * 2000-03-02 2014-01-07 Emory University Compositions and methods for generating an immune response
CA2417240A1 (en) * 2000-08-07 2002-02-14 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Method and composition for immunization using mixed pools of mutated nucleic acids or peptides
CA2434546C (en) * 2001-01-12 2012-09-11 Chiron Corporation Induction of immune response by a replication-defective venezuelan equine encephalitis-sindbis chimeric virus replicon particle encoding an antigen
JP4554887B2 (ja) * 2001-03-08 2010-09-29 アメリカ合衆国 改変ＨＩＶエンベロープ、ｇａｇ、およびｐｏｌ遺伝子を発現するＭＶＡ
EP1411770A4 (en) 2001-07-05 2006-05-10 Chiron Corp POLYNUCLEOTIDES CODING FOR ANTIGENIC C-TYPE HIV POLYPEPTIDES, POLYPEPTIDES AND THEIR USE
EP2280074A3 (en) * 2001-07-05 2011-06-22 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Polynucleotides encoding antigenic HIV type B and/or type C polypeptides, polypeptides and uses thereof
GB0118532D0 (en) * 2001-07-30 2001-09-19 Isis Innovation Materials and methods relating to improved vaccination strategies
CA2458995C (en) * 2001-08-31 2013-04-30 Chiron Corporation Polynucleotides encoding antigenic hiv type b polypeptides, polypeptides and uses thereof
US20030170614A1 (en) * 2001-08-31 2003-09-11 Megede Jan Zur Polynucleotides encoding antigenic HIV type B polypeptides, polypeptides and uses thereof
US20070269456A1 (en) * 2001-11-05 2007-11-22 Lasher Alfred W DNA-based plasmid formulations and vaccines and prophylactics containing the same
US20030228327A1 (en) * 2001-11-05 2003-12-11 Lasher Alfred W. DNA-based plasmid formulations and vaccines and prophylactics containing the same
CA2467486A1 (en) 2001-11-30 2003-06-12 Isis Innovation Limited Vaccine
US6923958B2 (en) * 2002-03-02 2005-08-02 The Scripps Research Institute DNA vaccines encoding CEA and a CD40 ligand and methods of use thereof
US7094410B2 (en) * 2002-03-02 2006-08-22 The Scripps Research Institute DNA vaccine against proliferating endothelial cells and methods of use thereof
US20040106566A1 (en) * 2002-05-17 2004-06-03 Shi-Lung Lin RNA-splicing and processing-directed gene silencing and the relative applications thereof
DK1523582T3 (da) * 2002-07-18 2009-03-02 Univ Washington Hurtig, effektiv rensning af HSV-specifikke T-lymfocytter samt HSV-antigener identificeret derved
JP2006509039A (ja) * 2002-12-03 2006-03-16 ユニバーシティ オブ マサチューセッツ 多価初代ｈｉｖ−１糖タンパク質ｄｎａワクチンおよびワクチン接種方法
US7658927B2 (en) * 2003-05-12 2010-02-09 University Of Florida Research Foundation, Inc. Materials and methods for immunizing against FIV infection
MXPA05012270A (es) 2003-05-12 2006-02-10 Univ Florida Materiales y metodos para inmunizar en contra de la infeccion por virus de inmunodeficiencia de felino.
US8076060B2 (en) * 2003-08-04 2011-12-13 Emil William Chynn Vaccination and immunotherapy as new therapeutic modalities in the treatment of glaucoma
EP2055316A1 (en) * 2003-09-09 2009-05-06 VIRxSYS Corporation Lentivirus vector-based approaches for generating an immune response to HIV in humans
WO2005027840A2 (en) * 2003-09-15 2005-03-31 Chiron Corporation Combination approaches for generating immune responses
WO2005034992A2 (en) * 2003-09-15 2005-04-21 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Hiv vaccines based on env of multiple clades of hif
US20050175627A1 (en) * 2003-09-24 2005-08-11 Oxxon Therapeutics Ltd. HIV pharmaccines
US7622125B2 (en) 2004-05-05 2009-11-24 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Polycistronic HIV vector constructs
AU2005249450A1 (en) 2004-05-27 2005-12-15 Centocor, Inc. Cynomolgus prostate specific antigen
CA2570563A1 (en) * 2004-06-15 2006-09-28 Centocor, Inc. Method for screening agents against human prostate disease
AU2005274948B2 (en) * 2004-07-16 2011-09-22 Genvec, Inc. Vaccines against aids comprising CMV/R-nucleic acid constructs
WO2006044864A2 (en) * 2004-10-19 2006-04-27 Duke University Vaccine adjuvant
CN101072585A (zh) 2004-11-01 2007-11-14 诺华疫苗和诊断公司 产生免疫应答的组合方法
JP5136766B2 (ja) * 2004-12-15 2013-02-06 ユニバーシティ オブ ノース カロライナ アット チャペル ヒル キメラベクター
WO2008048984A2 (en) * 2006-10-18 2008-04-24 St. Jude Children's Research Hospital Methods and compositions for preparing a universal influenza vaccine
WO2010093784A2 (en) 2009-02-11 2010-08-19 The University Of North Carolina At Chapel Hill Modified virus vectors and methods of making and using the same
EA025417B1 (ru) * 2010-11-22 2016-12-30 Борис Славинович ФАРБЕР Вакцины с повышенной иммуногенностью и способы их получения
US20120244174A1 (en) * 2011-01-31 2012-09-27 Intellect Neurosciences Inc. Treatment of tauopathies
US9839684B2 (en) 2011-04-06 2017-12-12 Biovaxim Limited Pharmaceutical compositions comprising inactivated HIV viral particles and non-pathogenic lactobacilli for the induction of antigen-specific immunotolerance
CN104271155A (zh) 2011-11-14 2015-01-07 诺华股份有限公司 聚阴离子卡波姆和Env多肽的免疫原性复合物及其制造方法和用途
WO2013126622A1 (en) 2012-02-24 2013-08-29 President And Fellows Of Harvard College Methods for displaying polypeptides and uses thereof
DK3584252T3 (da) * 2015-12-15 2021-11-15 Janssen Vaccines & Prevention Bv Human immundefektvirus-antigener, -vektorer, -sammensætninger og fremgangsmåder til anvendelse deraf
WO2020201828A1 (en) 2019-04-05 2020-10-08 Tauc3 Biologics Limited Anti-tauc3 antibodies and uses thereof

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5198214A (en) * 1983-08-31 1993-03-30 Stolle Research & Development Corporation Anti-mastitis polyvalent vaccine, method of administration and method for production thereof
NZ217645A (en) * 1985-09-25 1991-11-26 Oncogen Recombinant viruses expressing lav/htlv-iii related epitopes and vaccine formulations
US5169763A (en) * 1986-04-08 1992-12-08 Transgene S.A., Institut Pasteur Viral vector coding glycoprotein of HIV-1
IL82104A0 (en) * 1986-04-08 1987-10-30 Usa Recombinant vaccinia virus expressing human retrovirus genes and method for producing htlb-iii envelope proteins
US5081226A (en) * 1986-12-30 1992-01-14 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Synthetic peptides sharing sequence homology with the HIV envelope protein
DE69031735T2 (de) * 1989-04-18 1998-03-12 Applied Biotechnology Inc Erzeugung von hybrid-genen und proteinen durch rekombination mittels viren
AU672581B2 (en) * 1991-03-07 1996-10-10 Virogenetics Corporation Immunodeficiency virus recombinant poxvirus vaccine
US5643578A (en) * 1992-03-23 1997-07-01 University Of Massachusetts Medical Center Immunization by inoculation of DNA transcription unit
ATE475668T1 (de) * 1994-01-27 2010-08-15 Univ Massachusetts Medical Immunisierung durch impfung von dns transkriptionseinheit
FR2728794B1 (fr) * 1994-12-30 1997-03-21 Rhone Merieux Vaccin recombinant aviaire a base de virus herpes aviaire, notamment contre la maladie de gumboro

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116981448A (zh) * 2021-01-14 2023-10-31 益生生物科技有限公司 包括工程化的植物来源的细胞外囊泡的组合物及其用作疫苗的用途

Also Published As

Publication number Publication date
EP0876498B1 (en) 2004-10-06
HK1016218A1 (en) 1999-10-29
HUP9900389A3 (en) 2001-06-28
DE69731075D1 (de) 2004-11-11
HU224344B1 (hu) 2005-08-29
EA199800638A1 (ru) 1999-02-25
AU1829997A (en) 1997-08-20
TR199801418T2 (xx) 1998-10-21
JP2000504326A (ja) 2000-04-11
BR9707611A (pt) 1999-07-27
EP1378516A1 (en) 2004-01-07
AP9801325A0 (en) 1998-09-30
UA73712C2 (en) 2005-09-15
US5846546A (en) 1998-12-08
PL328193A1 (en) 1999-01-18
HUP9900389A2 (hu) 1999-06-28
EA002390B1 (ru) 2002-04-25
GEP20032902B (en) 2003-02-25
US5741492A (en) 1998-04-21
CZ229398A3 (cs) 1998-12-16
ES2230596T3 (es) 2005-05-01
CN1214083A (zh) 1999-04-14
US6086891A (en) 2000-07-11
KR19990081931A (ko) 1999-11-15
DE69731075T2 (de) 2006-03-09
ATE278790T1 (de) 2004-10-15
AU709174B2 (en) 1999-08-26
IL125497A (en) 2007-07-04
NO983377D0 (no) 1998-07-22
DK0876498T3 (da) 2005-02-07
EP0876498A1 (en) 1998-11-11
NO322261B1 (no) 2006-09-04
BG102712A (en) 1999-04-30
CN1229501C (zh) 2005-11-30
HU0402182D0 (en) 2004-12-28
WO1997027311A1 (en) 1997-07-31
IL125497A0 (en) 1999-03-12
KR100571479B1 (ko) 2007-06-07
PL188641B1 (pl) 2005-03-31
CA2243570A1 (en) 1997-07-31
CZ296575B6 (cs) 2006-04-12
OA10814A (en) 2003-01-28
PT876498E (pt) 2005-02-28
CA2243570C (en) 2001-08-14
JP2007259870A (ja) 2007-10-11
NO983377L (no) 1998-09-23
IL156919A0 (en) 2004-02-08
AP1200A (en) 2003-08-29
BG64711B1 (bg) 2005-12-30
NZ331024A (en) 2000-02-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RO120268B1 (ro) Vaccin polienv, pentru virusul imunodeficienţei umane
WO1997027311A9 (en) Mixture of recombinant vaccinia vectors as polyenv vaccines for hiv
JP4805511B2 (ja) Ｈｉｖに対する免疫応答における改善、または免疫応答に関する改善
JP5123343B2 (ja) Ｈｉｖｃｏｎ：ｈｉｖ免疫原及びその使用
RU2302461C2 (ru) Химерный ген cr3 и кодируемый им химерный белок cr3 (варианты), индуцирующий иммунный ответ против вич-1
JP2000506727A (ja) 組換え生ネコ免疫不全ウイルスおよびプロウイルスｄｎａワクチン
JP2006514549A (ja) Ｉｌ−１５を発現する組換えワクチンウイルスおよびその使用方法
US20090227658A1 (en) Methods and compositions for immunization against hiv
ES2396915T3 (es) Secuencias consenso, antígenos y transgenes del VIH-1 del clado A
US20080306244A1 (en) Renta: an HIV immunogen and uses thereof
US6723558B1 (en) Preparation and use of viral vectors for mixed envelope protein vaccines against human immunodeficiency viruses
PT1877549E (pt) Vacina contra o vih
WO2013126469A1 (en) Chimeric dna vaccine compositions and methods of use
HK1016218B (en) Mixture of recombinant vaccinia vectors as polygeur vaccines for hiv