RO123256B1 - Procedeu pentru obţinerea soluţiilor coloidale de atelocolagen hipoimunogen de înaltă puritate - Google Patents
Procedeu pentru obţinerea soluţiilor coloidale de atelocolagen hipoimunogen de înaltă puritate Download PDFInfo
- Publication number
- RO123256B1 RO123256B1 ROA200700766A RO200700766A RO123256B1 RO 123256 B1 RO123256 B1 RO 123256B1 RO A200700766 A ROA200700766 A RO A200700766A RO 200700766 A RO200700766 A RO 200700766A RO 123256 B1 RO123256 B1 RO 123256B1
- Authority
- RO
- Romania
- Prior art keywords
- solution
- collagen
- solutions
- process according
- colloidal
- Prior art date
Links
- 108010045569 atelocollagen Proteins 0.000 title abstract 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract 2
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 74
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 claims abstract description 62
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 claims abstract description 62
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 claims abstract description 62
- 230000008569 process Effects 0.000 claims abstract description 42
- 230000003750 conditioning effect Effects 0.000 claims abstract description 20
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims abstract description 16
- 238000007781 pre-processing Methods 0.000 claims abstract description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 210
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 70
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 46
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 41
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 37
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 claims description 34
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 claims description 34
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 claims description 33
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 claims description 33
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 claims description 32
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 27
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 24
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 21
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 20
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 19
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 19
- 238000007792 addition Methods 0.000 claims description 18
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 17
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 claims description 16
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 16
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 16
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 15
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 14
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 14
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 claims description 14
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 14
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 14
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims description 14
- 238000000227 grinding Methods 0.000 claims description 14
- 229940055729 papain Drugs 0.000 claims description 14
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 claims description 14
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 14
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 14
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 11
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 11
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 10
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol Chemical compound CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 10
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 claims description 9
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 claims description 9
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 9
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims description 9
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims description 9
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 claims description 9
- 239000011734 sodium Substances 0.000 claims description 9
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 9
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 108010059712 Pronase Proteins 0.000 claims description 8
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 claims description 8
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 claims description 8
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 claims description 8
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 8
- 230000035800 maturation Effects 0.000 claims description 8
- -1 polyethylene Polymers 0.000 claims description 8
- 239000013049 sediment Substances 0.000 claims description 8
- 229960001322 trypsin Drugs 0.000 claims description 8
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 claims description 8
- 238000005054 agglomeration Methods 0.000 claims description 7
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 claims description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 7
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 claims description 6
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 claims description 6
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 6
- MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N diethylene glycol Chemical compound OCCOCCO MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 claims description 6
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 claims description 6
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 claims description 5
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 5
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims description 5
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 claims description 5
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 claims description 5
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 claims description 5
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 5
- RDEIXVOBVLKYNT-VQBXQJRRSA-N (2r,3r,4r,5r)-2-[(1s,2s,3r,4s,6r)-4,6-diamino-3-[(2r,3r,6s)-3-amino-6-(1-aminoethyl)oxan-2-yl]oxy-2-hydroxycyclohexyl]oxy-5-methyl-4-(methylamino)oxane-3,5-diol;(2r,3r,4r,5r)-2-[(1s,2s,3r,4s,6r)-4,6-diamino-3-[(2r,3r,6s)-3-amino-6-(aminomethyl)oxan-2-yl]o Chemical compound OS(O)(=O)=O.O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H](CC[C@@H](CN)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N.O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H](CC[C@H](O2)C(C)N)N)[C@@H](N)C[C@H]1N.O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N RDEIXVOBVLKYNT-VQBXQJRRSA-N 0.000 claims description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 4
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 claims description 4
- 102000034240 fibrous proteins Human genes 0.000 claims description 4
- 108091005899 fibrous proteins Proteins 0.000 claims description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 4
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 4
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 claims description 4
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 claims description 4
- 238000003860 storage Methods 0.000 claims description 4
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 claims description 4
- 229920002565 Polyethylene Glycol 400 Polymers 0.000 claims description 3
- 229920002582 Polyethylene Glycol 600 Polymers 0.000 claims description 3
- 230000001476 alcoholic effect Effects 0.000 claims description 3
- 210000003484 anatomy Anatomy 0.000 claims description 3
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 claims description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 3
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims description 3
- HCFPRFJJTHMING-UHFFFAOYSA-N ethane-1,2-diamine;hydron;chloride Chemical compound [Cl-].NCC[NH3+] HCFPRFJJTHMING-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 3
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 claims description 3
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 claims description 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 3
- 230000002535 lyotropic effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 3
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 claims description 3
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims description 3
- 238000010079 rubber tapping Methods 0.000 claims description 3
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 claims description 3
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims description 3
- WBYWAXJHAXSJNI-VOTSOKGWSA-N trans-cinnamic acid Chemical compound OC(=O)\C=C\C1=CC=CC=C1 WBYWAXJHAXSJNI-VOTSOKGWSA-N 0.000 claims description 3
- UYPYRKYUKCHHIB-UHFFFAOYSA-N trimethylamine N-oxide Chemical compound C[N+](C)(C)[O-] UYPYRKYUKCHHIB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- WBYWAXJHAXSJNI-VOTSOKGWSA-M .beta-Phenylacrylic acid Natural products [O-]C(=O)\C=C\C1=CC=CC=C1 WBYWAXJHAXSJNI-VOTSOKGWSA-M 0.000 claims description 2
- 206010011416 Croup infectious Diseases 0.000 claims description 2
- 241001430197 Mollicutes Species 0.000 claims description 2
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 claims description 2
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 claims description 2
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 claims description 2
- 108091000054 Prion Proteins 0.000 claims description 2
- 102000029797 Prion Human genes 0.000 claims description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- ZZTCCAPMZLDHFM-UHFFFAOYSA-N ammonium thioglycolate Chemical compound [NH4+].[O-]C(=O)CS ZZTCCAPMZLDHFM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229940075861 ammonium thioglycolate Drugs 0.000 claims description 2
- 239000003429 antifungal agent Substances 0.000 claims description 2
- 230000002358 autolytic effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 2
- 201000010549 croup Diseases 0.000 claims description 2
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims description 2
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 claims description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 claims description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 claims description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 claims description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 claims description 2
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 claims description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- WEEMDRWIKYCTQM-UHFFFAOYSA-N 2,6-dimethoxybenzenecarbothioamide Chemical compound COC1=CC=CC(OC)=C1C(N)=S WEEMDRWIKYCTQM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N Amphotericin-B Natural products O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1C=CC=CC=CC=CC=CC=CC=C[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N 0.000 claims 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 claims 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 claims 1
- APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N amphotericin B Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N 0.000 claims 1
- 229960003942 amphotericin b Drugs 0.000 claims 1
- 238000012993 chemical processing Methods 0.000 claims 1
- 210000004207 dermis Anatomy 0.000 claims 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims 1
- 239000011229 interlayer Substances 0.000 claims 1
- 238000003475 lamination Methods 0.000 claims 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 claims 1
- 239000004292 methyl p-hydroxybenzoate Substances 0.000 claims 1
- 235000010270 methyl p-hydroxybenzoate Nutrition 0.000 claims 1
- LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N methylparaben Chemical compound COC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 claims 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 claims 1
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 claims 1
- 239000012047 saturated solution Substances 0.000 claims 1
- 238000010008 shearing Methods 0.000 claims 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims 1
- 239000003206 sterilizing agent Substances 0.000 claims 1
- 229960002385 streptomycin sulfate Drugs 0.000 claims 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 claims 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 claims 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 claims 1
- 238000004018 waxing Methods 0.000 claims 1
- 238000004804 winding Methods 0.000 claims 1
- 238000013316 zoning Methods 0.000 claims 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 3
- 230000004907 flux Effects 0.000 abstract 1
- 230000003381 solubilizing effect Effects 0.000 abstract 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 25
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 10
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 9
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 9
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 7
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 7
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 7
- 238000003801 milling Methods 0.000 description 7
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 7
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000013626 chemical specie Substances 0.000 description 6
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 6
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 5
- 102000013373 fibrillar collagen Human genes 0.000 description 5
- 108060002894 fibrillar collagen Proteins 0.000 description 5
- 230000009471 action Effects 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 4
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 3
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 3
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 3
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 3
- 230000003619 fibrillary effect Effects 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000011403 purification operation Methods 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 description 2
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 2
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 2
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 2
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 239000012670 alkaline solution Substances 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 2
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 2
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 2
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 2
- 239000012045 crude solution Substances 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 2
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 2
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 2
- 210000002435 tendon Anatomy 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonium chloride Substances [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 231100000699 Bacterial toxin Toxicity 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical compound O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 241001536628 Poales Species 0.000 description 1
- 108010009736 Protein Hydrolysates Proteins 0.000 description 1
- 102000016611 Proteoglycans Human genes 0.000 description 1
- 108010067787 Proteoglycans Proteins 0.000 description 1
- 241000576755 Sclerotia Species 0.000 description 1
- YIQKLZYTHXTDDT-UHFFFAOYSA-H Sirius red F3B Chemical compound C1=CC(=CC=C1N=NC2=CC(=C(C=C2)N=NC3=C(C=C4C=C(C=CC4=C3[O-])NC(=O)NC5=CC6=CC(=C(C(=C6C=C5)[O-])N=NC7=C(C=C(C=C7)N=NC8=CC=C(C=C8)S(=O)(=O)[O-])S(=O)(=O)[O-])S(=O)(=O)O)S(=O)(=O)O)S(=O)(=O)[O-])S(=O)(=O)[O-].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+] YIQKLZYTHXTDDT-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 241000187392 Streptomyces griseus Species 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 238000005904 alkaline hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 1
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 239000000688 bacterial toxin Substances 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000000739 chaotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 238000002983 circular dichroism Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 210000004087 cornea Anatomy 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000015961 delipidation Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003467 diminishing effect Effects 0.000 description 1
- 239000000982 direct dye Substances 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N dl-hydroxyproline Natural products OC1C[NH2+]C(C([O-])=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011143 downstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 description 1
- 239000008151 electrolyte solution Substances 0.000 description 1
- 229940021013 electrolyte solution Drugs 0.000 description 1
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003248 enzyme activator Substances 0.000 description 1
- 239000002532 enzyme inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 238000005206 flow analysis Methods 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960002591 hydroxyproline Drugs 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000009434 installation Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 210000003254 palate Anatomy 0.000 description 1
- 238000003825 pressing Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 239000003531 protein hydrolysate Substances 0.000 description 1
- 239000002510 pyrogen Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000007670 refining Methods 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N trans-L-hydroxy-proline Natural products ON1CCCC1C(O)=O FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Colloid Chemistry (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Prezenta invenţie se referă la un procedeu pentru obţinerea soluţiilor coloidale de atelocolagen hipoimunogen de înaltă puritate, cu aplicabilitate în medicină, farmacie, biochimie. Procedeul conform invenţiei constă în aplicarea succesivă, conform unui flux parcurs integral sau parţial, a următoarelor etape de procesare intercondiţionate: izolarea şi preprocesarea surselor tisulare de colagen, solubilizarea hidrolitică a colagenului din sursele tisulare, purificarea soluţiilor coloidale obţinute, conferirea caracterului hipoimunogen formelor atelocolagenice prezente în soluţiile coloidale rezultate în urma purificării, ultrapurificarea soluţiilor coloidale atelocolagenice hipoimunogene şi condiţionarea finală a soluţiilor coloidale de atelocolagen hipoimunogen de înaltă puritate.
Description
Invenția se referă la un procedeu pentru obținerea soluțiilorcoloidale de atelocolagen hipoimunogen de înaltă puritate, caracterizate prin aceea că prezintă concentrații ridicate de unități triplu-helicale, cvasi-native și minimal denaturate, precum și o polidispersitate redusă a caracteristicilor structurale și de reactivitate ale formelor colagenice pe care le conțin. Respectivele soluții sunt destinate aplicațiilor din ingineria tisulară, culturii celulare, obținerii substraturilor și structurilor utile în refacerea tisulară ghidată, tratării rănilor extinse și a arsurilor, realizării mediilor elective de biosinteză, obținerii biomaterialelor cu componentă scleroproteică, obținerii vehiculanților pentru specii farmaceutice, de interes biochimicși/sau a factorilor de modulare a activității celulare în țesuturi vii ori în substraturi artificiale, obținerii vectorilorîn terapia genetică și/sau în producerea anticorpilor, precum și realizării surogatelor și substituenților matricei extracelulare, prin conjugare cu alți compuși macromoleculari naturali, ori cu (co)polimeri de sinteză. Toate clasele de aplicații citate impun utilizarea de forme colagenice cu edificii moleculare cât mai apropiate de starea nativă, dar lipsite de capacitatea de a induce reacții imunologice sau xeno-genice semnificative. Speciile tripluhelicale, obținute conform procedeului ce face obiectul prezentei invenții, îndeplinesc aceste condiții.
Dintre cele 28 de tipuri de colagen a căror existență a fost demonstrată până în anul 2006 (Khoshonoodi J., Cartailler J. P., Alvares K., Veis A., Hudson B. G., Journal of Biologica! Chemistry, 281 (50), 2006, p. 38117-38121), doar circa o pătrime și-au găsit aplicații practice, mai ales datorită dificultăților legate de izolarea lor în stare nealterată fizicochimic (Ratner B. D., Hoffman A. S., Schoen F. J., Lemons J. E. (editors), BiOmaterials Science. An Introduction to Materials in Medicine, 1996, Academic Press, New York, cap. 2.7). Din literatura de specialitate și din cea de brevete, este cunoscut faptul că forme colagenice fibrilare apte utilizării în sfera biomedicală (în special aparținând tipurilor I, II și III) se pot obține prin clivarea și/sau detașarea acestora din matricea extracelulară a organelor alcătuite predominant din țesuturi conjunctive (piele, tendon, cartilaj, cornee și sclerotică, os etc.) (Liu S. Q. - Bioregenerative Engineering: Principles and Applications, 2007, Wiley Interscience, Hoboken, New Jersey, cap. 4 și 24).
Clivarea unităților colagenice triplu-helicale se realizează prin extracție în soluții de electroliți slabi (acizi și săruri), obținându-se, cu randamente deosebit de reduse, forme native ale scieroproteinei (numite generic, în cazul speciilor fibrilare, macromolecule de tropocolagen), ori forme renaturabile prin procese fizico-chimice, care reformează macromolecule triplu-helicale, sau care conțin domenii triplu-helicale net evidențiabile. Tehnica clivării este însă fezabilă doar la nivel de laborator, ori la scară micropilot, oferind cantități reduse de tropocolagen din tipurile I, II, III, V și XI, ce sunt utilizate drept etalon analitic sau pentru studii asupra conformației spațiale și reactivității formelor colagenice fibrilare, dat fiind faptul că soluțiile rezultate prezintă o polidispersitate suficient de redusă și o reactivitate foarte apropiată de cea pe care colagenul fibrilar nativ o exprimă in vivo. Majoritatea tipurilor de colagen nefîbrilar (de asociere fibriIară - tipurile IX, XII, XIV, XVI, XIX, XX, de ancorare - în special tipul VII, membranare - în special tipul IV, transmembranare tipurile XIII și XVII, de multiplexare - tipurile XV, XVI, XVIII, microfibrilare - tipul VI, rețelare tipurile VIII și X) se obțin, și ele, în stare nativă, prin tehnici de clivare/extracție protejată, fiind destinate mai ales studiilor științifice și nu aplicațiilor practice.
Cantități de forme colagenice suficiente, pentru a putea fi avute în vedere în aplicații practice, se obțin doar pe calea detașării din structurile fibrilare ale matricei extracelulare, prin tehnici echivalente solubilizării hidrolitice, mediatăde specii chimice cu acțiune energică (electroliți, agenți liotropi și agenți chaotropi), sau de specii enzimatice. Principala deficiență a tehnicii solubilizării hidrolitice, imposibil de ocolit chiar și în cazul tratamentelor exclusiv
RO 123256 Β1 enzimatice, constă în variabîlitatea largă a caracteristicilor formelor colagenice rezultate, 1 concretizată mai ales într-o mare polidispersitate la nivelul structurii terțiare, care generează importante diferențe de spațialitate și masă moleculară, dar și la nivelul structurii catenelor 3 aminoacidice laterale, soldată cu diferențe de reactivitate, comparativ cu scleroproteina nativă. 5
Atunci când își mențin spațialitatea triplu-heîicală, formele colagenice rezultate în urma solubilizării hidrolitice poartă denumirea generică de atelocolagen, dat fiind faptul că 7 porțiunile terminale, nehelicale, ale macromoleculei de tropocolagen, denumite telopeptide, au fost scindate hidrolitic, aceasta fiind singura modalitate prin care unitățile triplu-helicale 9 pot fi detașate din agregatele fibrilare. în plus, mai ales în cazul solubilizării pornind de la țesuturi mature, o serie de punți de reticulare, ce stabilizează structura cuaternară a 11 colagenului fibrilar, au fost și ele scindate hidrolitic. Din acest punct de vedere, solubilizarea hidrolitică a colagenului fibrilar, pornind de la țesuturi mature, poate fi considerată ca fiind un 13 proces de dereticulare. Formele colagenice rezultate prin solubilizare hidrolitică protejată (fără intervenția temperaturii și presiunii ridicate, a pH-urilor extreme, ori a concentrațiilor 15 mari de agenți liotropi), care își păstrează în mare măsură integritatea lanțurilor polipeptidice, dar care au pierdut structura triplu-helicală, poartă denumirea generică de eucolagen. Ele 17 pot fi considerate gelatine cu mase moleculare ridicate, deoarece conferă viscozitate ridicată soluțiilor și, în plus, pot forma spontan hidrogeluri atunci când depășesc o concentrație limită 19 (mai mică în comparație cu gelatinele clasice, din tipurile A și B).
Practic toate soluțiile de atelocolagen Sunt impurificate, în măsură variabilă, dar 21 ridicată, cu eucolagen. Alături de fracția eucolagenică, în soluțiile coloidale obținute prin solubilizare hidrolitică, se regăsesc și fragmente peptidice cu diverse mase moleculare, inclusiv 23 tronsoanele telopeptidice scindate. Separarea avansată a speciilor atelocolagenice tripluhelicale, cvasi-native, de speciile divers alterate de eucolagen și de peptidele prezente în 25 soluție, se poate realiza prin tehnici de fracționare a amestecurilor complexe, între care: precipitarea fracționată, separarea cromatografică preparativă, atacul enzimatic nespecific 27 al formelor denaturate (Walker J. M. (editor), The Proteomics Protocols Handbook, 2005, Humana Press Inc., Totowa - New Jersey, cap. 11; Walker J. M. (editor), The Protein 29 Protocols Handbook, Second Edition, 2002, Humana Press Inc., Totowa - New Jersey, cap. 82). De regulă, în urma aplicării tehnicilor de fracționare citate, rezultă soluții diluate, cu 31 volum ridicat, dificil de postprocesat și/sau de stocat. De aceea, fracțiile cvasi-native sunt supuse, imediat după separare, unor operații de concentrare specifice speciilor proteice, 33 care nu le alterează structural, compozițional și din punctul de vedere al reactivității. între operațiile aplicabile volumelor mari de soluții atelocolagenice se citează: ultrafiltrarea, 35 diafiltrarea, filtrarea prin curgere tangențială, centrifugarea în prezența gradienților unor specii precipitante (Desai M. A. (editor), Downstream Processing ofProteins. Methods and 37 Protocols, 2000, Humana Press Inc., Totowa, New Jersey, cap. 1,3,4,5,6). Deși separarea prin simplă precipitare este mai economică, ea nu asigură selectivitatea necesară, chiar și 39 atunci când se repetă în condiții diferite (la temperaturi, pH-uri, tării ionice, compoziții diferite ale agenților de precipitare). 41
Atunci când macromoleculelor de atelocolagen li s-au îndepărtat integral (sau suficient de „adânc) telopeptidele, iar aceste catene polipeptidice nehelicale au fost eficient 43 și complet înlăturate din soluții, se obțin forme de atelocolagen hipoimunogen. Dacă soluțiile acestor specii hipoimunogene urmează a fi utilizate în aplicații grefabile la om, se impune și 45 îndepărtarea avansată a glicoproteinelor și glicoz-amino-glicanilor, ce pot conduce la reacții inflamatorii ori alergice. Aceste specii polizaharidice sau cu conținut de polizaharide se 47 îndepărtează prin hidroliză controlată, alcalină sau enzimatică.
RO 123256 Β1
Seria brevetelor ce au drept obiect obținerea formelor colagenice și atelocolagenice este relativ extinsă, abordând în special metode de inducere a solubilizării hidrolitice pe cale chimică (US 4592864/1986; US 4983721/1991) și enzimatică (US 5316942/1994; EP 1270672/2003), ori mixtă (spre exemplificare s-au selectat doar patru din multitudinea de brevete semnificative). Tehnicile brevetate până în acest moment reușesc eliminarea avansată a fracțiilor peptidice șiaceloreucolagenice (US 4294241/1981, US 6548077/2003, KR 2002-0029859). Ele nu asigură însă certitudinea separării și reținerii speciilor tripluhelicale, ci oferă doar amestecuri ale acestora cu lanțuri polipeptidice detașate, integral sau parțial, din agregarea supramoleculară specifică stării native a colagenului. Acestea din urmă pot reforma cu dificultate, prin renaturare, structuri triplu-helicale, dar probabilitatea succesului acestui proces este redusă.
Certificarea stării native a colagenului extras ori solubilizat hidrolitic pornind de la surse tisulare mature este dificil de realizatși poate fi afectată de erori semnificative, datorate imposibilității standardizării respectivelor tehnici analitice. Până la ora actuală, există trei căi de stabilire a conținutului procentual de unități triplu-helicale în soluțiile coloidale, respectiv (i) prin tehnica dicroismului circularîn ultravioletul îndepărtat, asociată sau nu cu alte tehnici spectrometrice (Shcheslavskiy V. I,, Petrov G. I., Yakolev V. V., Chemical Physics Leite rs. 402,2005, p. 170-174.), (ii) determinarea raportului între conținutul total de hidroxiprolină din soluție și conținutul aceluiași aminoacid în soluțiile tratate agresiv cu enzime nespecifice (EP 1312383/2003) și (iii) asocierea selectivă a coloranțilordirecți cu structuriletriplu-helicale intacte și cvasi-intacte (metoda Hofman, ce utilizează Sirius Red F3BA) (Marotta M., Martino G., Analytical Biochemistry, 150 (1), 1985, p. 86-90) (cu exemplificarea utilizării în WO 01/38396/2001). Aceste tehnici sunt însă fie destinate exclusiv studiilor științifice (metoda (i)), fie prea costisitoare și, din acest motiv^ acceptabile doar în aplicațiile la nivel de laborator (metoda (ii)), fie sunt intens și negativ afectate de prezența speciilor de atelocolagen denaturate (metoda (iii)).
Problema pe care o rezolvă invenția este legată de separarea cantitativă a formelor colagenice triplu-helicale cvasi-native, aparținând tipurilor I, II și III, prezente în soluțiile coloidale obținute prin solubilizare hidrolitică, pornind de la surse tisulare de colagen, cu eliminarea avansată a formelor colagenice denaturate, ori a căror structură terțiară a fost afectată parțial. Astfel, prezenta invenție soluționează problema separării avansate a formelor triplu-helicale din soluțiile de atelocolagen hipoimunogen, asigurând obținerea de soluții coloidale de înaltă puritate, libere de structuri terțiare parțial denaturate și de lanțuri polipeptidice independente.
Procedeul pentru obținerea soluțiilor coloidale de atelocolagen hipoimunogen de înaltă puritate, conform invenției, include:
- izolarea și preprocesarea unei surse tisulare de colagen,
- solubilizarea hidrolitică a colagenului din sursa tisulară în prezența unei enzime proteolitice sau a unui agent slab liotrop,
- purificarea soluției coloidale obținute prin solubilizarea hidrolitică,
- conferirea caracterului hipoimunogen prin tratarea cu papaină a soluțiilor atelocolagenice rezultate în urma purificării,
-ultrapurificarea soluțiilor coloidale atelocolagenice hipoimunogene utilizând pronaza, în prezența unor agenți cosmotropi și a unor amestecuri ternare ce conțin agenți de aglomerare macromoleculară,
- condiționarea finală a soluțiilor de atelocolagen hipoimunogen ultrapurificate prin diafiltrare contra unor soluții ce conțin agenți cosmotropi, inhibitori enzimatici și antibiotice,
RO 123256 Β1
- conservarea și stocarea soluțiilor coloidale obținute în vase sterile închise ermetic, 1 incluse la rândul lor în pungi din polietilenă în care se introduce o soluție alcoolică a unui agent antifungic, pungi ce se închid apoi sub vid. 3 în principiu, procedeul pentru obținerea soluțiilor coloidale de atelocolagen hipoimunogen de înaltă puritate, procedeu care face obiectul prezentei invenții, implică 5 parcurgerea următoarelor etape (acolo unde nu se specifică în mod expres, operațiile se efectuează la temperatura ambientală, care nu va depăși însă plaja 15 + 25°C): 7
i. - prelevarea sursei tisulare de colagen matur, pornind de la organe sau structuri anatomice cu conținut ridicat de scleroproteine; această etapă include curățarea fizică și 9 chimică a suprafețelor, secționarea primară, și spălarea cu soluții saline;
ii. - formarea de loturi cu mase egale, de circa 0,3 + 1 kg, care vor parcurge apoi în 11 paralel operațiile de solubilizare hidrolitică, purificare și ultrapurificare;
iii. - tratarea loturilor cu agenți de sterilizare generală, în vederea stopării activității 13 microorganismelor prezente în eșantioanele de țesut; se utilizează antibiotice și/sau azidă de sodiu; 15 iv. - mărunțirea țesutului și defibrarea flzico-mecanică a acestuia; eșantioanele de țesut se congelează înaintea mărunțirii/defibrării, iar în cursul acestei operații se adaugă 17 bucăți de gheață;
v. - îndepărtarea preliminară a componentelor necolagenice solubile în soluții saline, 19 prin suspendarea țesutului mărunții, de cel puțin trei ori, în soluție apoasă a unui amestec + 9% NaCI și 2 + 5% Na2SO4, la final aplicându-se o spălare abundentă cu apă deionizată; 21 vi. - inhibarea activității autolitice a enzimelor proprii țesutului, prin dozarea de inhibitori enzimatici generali; această etapă este opțională, fiind recomandată mai ales în 23 cazul țesuturilor cu populație celulară însemnată numeric;
vii. - delipidarea structurilor tisulare defibrate mecanic, utilizând soluții de n-propanol; 25 acesta induce și un efect de dezinfecție suplimentară;
viii. - afânarea structurilor tisulare defibrate mecanic, utilizând soluții de perhidrol; 27 ix. - îndepărtarea avansată a excesului de perhidrol, prin centrifugare și spălarea repetată, eventual în centrifugă, a structurilor tisulare defibrate mecanic; 29
x. - condiționarea structurilortisulare în vederea solubilizării hidrolitice; această etapă se conduce diferențiat, în funcție de agentul de solubilizare; astfel, dacă solubilizarea se va 31 realiza enzimatic utilizând pepsină (cea mai ieftină dintre enzimele proteolitice nespecifice), condiționarea constă în conferirea unei umflări acide limitate; dacă solubilizarea se va realiza 33 utilizând acid acetic, condiționarea implică inducerea unei umflări alcaline controlate, utilizând baze energice, urmată de neutralizarea excesului de alcalii și spălarea cu soluții 35 slab acide; în vederea solubilizării cu alte enzime decât pepsina, condiționarea prevede labilizarea avansată a structurilorcolagenice utilizând clorhidrat de etilen-diamină, lapH slab 37 alcalin (8,2 + 9,5), continuată cu corecția pH-ului la valoarea optimă pentru atacul enzimatic;
xi. - aplicarea solubilizării hidrolitice, în oricare dintre variantele ce utilizează enzime, 39 cum ar fi pepsina, tripsina ori papaina, sau un agent slab liotrop, ionogen, așa cum este acidul acetic: ia finalul acestei etape se obține soluția brută de atelocolagen; Operația se 41 efectuează în condiții de termoștatare la 2 + 10°C;
xii. - separarea avansată a debriuri lor ti sulare, prin demicrofibrilare repetată și filtrarea 43 soluției coloidale obținute; operația se efectuează la temperaturi de 10 + 15°C;
xiii. - precipitarea fracționată preliminară a varietăților de atelocolagen solubilizat, 45 utilizând concentrații bine precizate, crescânde, de NaCI; se aplică cinci precipitări distincte, diferențiate prin adaosul de NaCI și prin valoarea pH-ului de lucru; (i) mai întâi cu 0,7 M 47 NaCI, la pH 2,5, în vederea îndepărtării telopeptidelor și a fracțiilor polipeptidice hidrolizate
RO 123256 Β1 ori necolagenice; (ii) apoi cu 1,2 M NaCI, la pH 2,5, pentru separarea fracțiilor de colagen IV și V, reduse ca și participație în soluție, dar care incomodează în operațiile de purificare ulterioare; (iii) se continuă cu 1,76 M NaCI, la pH 7,5, pentru colectarea fracției de atelocolagen III; (iv) apoi cu 2,4 M NaCI, la pH 7,5, pentru colectarea fracției de atelocolagen I; (v) seîncheie cu 4,5 M NaCI, la pH 7,5, pentru colectarea fracției de atelocolagen II; după fiecare precipitare se realizează centrifugări în vederea recuperării fracțiilor separate, iar creșterea concentrației de NaCI și eventualele corecții de pH se aplică, succesiv, supernatantului; fracția dominantă masic depinde de țesutul de la care s-a pornit; de regulă se colectează fracția de atelocolagen I, cea mai abundentă; toate operațiile se realizează în condiții de termostatare la 4 - 6°C;
xiv. - eliminarea conținutului de proteoglicani și glicoz-amino-glicani eventual prezenți în soluția atelocolagenică obținută pornind de la cartilaje; se realizează prin tratarea formelor colagenice cu o soluție concentrată de guanidină, în care s-a dozat o sare anti-chaotropă;
xv. - sterilizarea chimică energică și hidroliza eventualelor urme de prioni și toxine bacteriene, se realizează prin tratament cu soluții puternic alcaline, capabile să hidrolizeze la rece (4 6°C) speciile chimice potențial toxice și/sau patogene;
xvi. - condiționarea soluției de atelocolagen în vederea ultrapurificării vizează asigurarea condițiilor optime enzimelor cu acțiune hidrolitică extinsă asupra telopeptidelor; se realizează dozând activatori enzimatici specifici, agenți anti-chaotropi și specii puternic bactericide;
xvii. - ajustarea finală uniformă a porțiunilor terminale nehelicale prezente încă în macromoleculele de atelocolagen hipoimunogen, se realizează prin tratament enzimatic cu papaină, care este capabilă să elimine în întregime tronsoanele telopeptidice care conțin aminoacidul tirozină, ceea ce asigură caracterul hipoimunogen soluției de atelocolagen; porțiunile scindate de către papaină conțin însă și punțile covalente de intra-reticulare, ce stabilizează triplul helix (Sato K., Ebihara T., Adachi E., Kawashima S., Hattori S., The Journal of Biologica! Chemistry, 275 (33), 2000, p. 25870-25875); în plus, papaina prezintă o activitate proteolitică remarcabilă chiar și la temperaturi coborâte (Stockell A., Smith E. L., Journal of Biological Chemistry, 227 (1), 1957, p. 1-26; Gul S., Meilor G. W., Thomas E. W., Brocklehurst K, Biochemical Journal, 396, 2006, p. 12-21; Ikada Y., Tissue Engineering. Fundamentate and Applications, 2006, Elsevier Ltd., London, cap. 1.2.1), condiție impusă de faptul că macromoleculele de atelocolagen hipoimunogen își pierd integritatea structurală (starea cvasi-nativă de triplu-helix) atunci când temperatura mediului apos crește peste 10-^12“C, în absența cosmotropilor și/sau a agenților macromoleculari de „aglomerare; la finalul acestei etape se obține soluția brută de atelocolagen hipoimunogen; conferirea caracterului hipoimunogen al soluției de atelocolagen utilizând papaină se realizează după o condiționare chimică cu cel puțin un agent cosmotrop, care poate fi un compus selectat dintre sărurile anorganice neutre prezente în seria Hofmeister, compușii organici neionizabili, cu mase moleculare mici și medii și săruri ale acestora din urmă cu contraioni anorganici din seria Hofmeister, și cu cel puțin un agent de aglomerare macromoleculară, care poate fi un compus selectat dintre speciile macromoleculare înalt solubile, dar neionogene, capabile să stabilizeze proteinele în starea lor nativă, de tipul polietilenglicolilor și polizaharidelor, acestea din urmă în stare naturală sau modificate chimic.
xviii. - eliminarea fracțiilor peptidice scindate, realizată prin diafiltrare utilizând membrane cu limita de trecere de 100 kDa (100.000 MWCO/NMWL); pe parcursul filtrării, volumul soluției de atelocolagen hipoimunogen se menține constant adăugând tampon TRIS/TRIS-clorhidrat cu pH-ul 7,3 - 7,5, preparat utilizând apă deionizată și liberă de pirogeni (răcită la 10°C); în soluția tampon se dozează 50 mM/Ι CaHPO4 · 2H2O și 0,01% azidă de sodiu, sau un alt antimicrobian;
RO 123256 Β1 xix. - rafinarea enzimatică a formelor atelocolagenice hipoimunogene vizează 1 degradarea controlată a fracțiilor denaturate, a căror structură triplu-helicală a fost afectată chiar și doar parțial; se realizează utilizând produsul Pronase® (un amestec de circa zece 3 enzime proteolitîce extrase din culturi de Streptomyces griseus, cu o foarte largă specificitate, capabile să inducă degradări hidrolitice avansate ori chiar totale porțiunilor de 5 catenă neimplicate în structuri spațial regulate, stabilizate cel puțin prin punți de hidrogen (Walker J. M. (editor), The Protein Protocols Handbook, Second Edition, 2002, Humana 7 Press Inc., Totowa - New Jersey, cap. 82)); acest tratament enzimatic deosebit de energic poate conduce la atacuri hidrolitice haotice asupra triplului helix, diminuând sever randa- 9 mentul procesului de ultrapurificare a soluțiilor de atelocolagen hipoimunogen; pentru controlul strict al acțiunii pronazei se impune lucrul în medii apoase „aglomerate și în 11 prezența unor agenți cosmotropi eficienți; agenții de „aglomerare (crowding agents) utilizați în prezenta invenție sunt polietilenglicolii (PEG) și amestecurile de polietilenglicoli cu diverse 13 mase moleculare; se preferă amestecuri ternare de polietilenglicoli cu mase moleculare mici, medii și mari, în proporții variabile, dar favorabile polietilenglicolilor cu mase moleculare 15 medii; ca agenți cosmotropi se pot utiliza compuși selectați dintre sărurile anorganice neutre prezente în seria Hofmeister, compușii organici neionizabili, cu mase moleculare mici și 17 medii și săruri ale acestora din urmă cu contraioni anorganici din seria Hofmeister; enzimele complexului Pronase® acționează eficient și la temperaturi reduse (Wieckowski E. U., Kokai- 19 Kun J. F., McLane B. A., Infection and Immunity, 66 (12), 1998, p. 5897-5905), dar pentru a asigura cinetici suficient de rapide, în prezenta invenție se prevede lucrul cu cantități 21 ridicate de pronază, de circa trei ori peste valorile uzuale (Helseth D. L., VeiS A., Journal of Biological Chemistry, 256 (4), 1981, 7118-7128); la finalul acestei etape se obțin soluții 23 coloidale pure de atelocolagen hipoimunogen, în care acesta din urmă este secondat doar de polipeptide scurte, ușor de îndepărtat prin diafiltrare; 25 xx. - condiționarea finală a soluției pure de atelocolagen hipoimunogen, are în vedere asigurarea condițiilor de stabilitate a edificiului triplu-helical al atelocolagenului hipo- 27 imunogen, precum și prevenirea atacului hidrolitic mediat de către microorganisme (bacterii și fungi); se realizează prin diafiltrare utilizând membrane cu limita de trecere de 100 kDa 29 (100.000 MWCO/NMWL), urmată de reglarea tăriei ionice a soluției coloidale prin adaos de săruri; se impun și adaosuri de antimicrobieni și antioxidanți; pe parcursul operațiilor de 31 condiționare, temperatura soluției se menține la maximum 10°C; ca agenți antimicrobieni se pot utiliza antibiotice cu spectru larg, de preferință active și împotriva micoplasmelor. 33
Prezenta invenție mai prezintă și o variantă suficient de expeditivă și de exactă pentru determinarea conținutului procentual de atelocolagen triplu helical din soluțiile coloidale 35 obținute prin procedeul brevetat. Conform prezentei invenții, stabilirea concentrației de forme triplu-helicale cvasi-native în soluția atelocolagenică hipoimunogenă de înaltă puritate, 37 precum și în oricare dintre soluțiile coloidale rezultate pe parcursul procesării, se realizează pornind de la cantitățile de azot proteic în soluția supusă determinării și respectiv în cea 39 rezultată după îndepărtarea entităților proteice atacate de tripsină, din soluția supusă determinării. 41
Soluția de atelocolagen hipoimunogen de înaltă puritate, obținută Conform descrierii din prezenta invenție, își menține neschimbate caracteristicile timp de cel puțin un an, dacă 43 este stocată la 4 + 8°C, în condiții sterile, la întuneric și în absența vibrațiilor ori șocurilor mecanice. 45
Procedeul de obținere a soluțiilor coloidale de atelocolagen hipoimunogen de înaltă puritate, conform prezentei invenții, prezintă următoarele avantaje: 47
- asigură concentrații ale formelor atelocolagenice triplu-helicale cvasi-native de peste 95% în soluția finală; valorile medii obținute uzual sunt de 97 ± 1,8%; 49
RO 123256 Β1
- asigură randamente masice de peste 25%, calculate raportând substanța proteică a soluției finale la substanța proteică a sursei colagenice (țesutul conjunctiv de la care se pornește); valorile medii uzuale ale randamentului masic al procedeului sunt de 28 ± 2,2%;
- asigură eliminarea fracțiilor proteice, polizaharidice și lipidice prezente în țesutul de start;
- asigură eliminarea efectelor cito-toxice ale componentelor soluției finale, făcând-o aptă utilizărilor în ingineria tisulară și în medicina regenerativă;
- asigură eliminarea efectelor imunogene, patogene și inflamatorii ale soluției finale, făcând-o aptă utilizărilor bio-medicale;
- asigură menținerea caracteristicilor formelor atelocolagenice triplu-helicale cvasinative pe o durată de cel puțin un an, în condiții adecvate de stocare;
- la diluțiile finale și în urma condiționării finale, formele atelocolagenice triplu-helicale cvasi-native nu prezintă tendință de asociere supramoleculară în soluție, asociere ce s-ar solda cu separarea de entități proteice la scară coloidală ori la mezo-scară și care ar afecta gradul de polidispersitate al soluției coloidale;
- permite obținerea de produse colagenice și atelocolagenice cu diferite grade de puritate prin simpla parcurgere parțială a fluxului operațiilor;
- toate produsele și subprodusele colagenice și atelocolagenice obținute prin parcurgerea parțială a fluxului sunt apte utilizărilor tehnice (12 ± 4,7% participație la randamentul total), cosmetice (14 ±1,3% participație la randamentul total), farmaceutice și biomedicale (46 ± 1,9% participație la randamentul total);
- subprodusele cu aplicații tehnice sunt reprezentate de hidrolizatele proteice; cele cu aplicații cosmetice sunt reprezentate de fracțiile de colagen și atelocolagen recuperate în urma precipitărilor și/sau filtrărilor ce separă tipurile de colagen prezente în sursa colagenică, precum și de fracțiile eucolagenice; subprodusele cu aplicații farmaceutice și biomedicale sunt reprezentate de fracțiile atelocolagenice cu diverse grade de purificare, ori divers condiționate.
în continuare se prezintă exemple de aplicare a procedeului conform invenției.
Descrierile ce urmează au titlu exemplificativ din următoarele puncte de vedere:
- sursa colagenică (organul, structura anatomică, țesutul de start);
- tipul de colagen vizat a se solubiliza (I, II, III);
- natura și cantitățile de specii chimice (reactivi și/sau adjuvanți) utilizate;
- parametrii de operare (timpi, temperaturi, pH-uri, regimuri hidrodinamice ale agitării, condiții de precipitare, centrifugare, filtrare/diafiltrare, dializă, rapoartele de amestecare, modul de maturare, regimurile de termostatare);
- ordinea, cadența, repetarea proceselor și operațiilor din fluxul de procesare.
Toate elementele enumerate admit variații ce țin de alegerea și preprocesarea surselor colagenice, de seriile de specii chimice utilizate (similare acțiunii, rolului și eficacității în raport cu cele incluse în descrierile exemplificative) și de plajele uzuale de lucru.
Exemplele vizează procesarea la nivel semiindustrial și industrial a surselor colagenice. Pentru asigurarea fezabilității procesării acestora, loturile medii sunt de 60 -120 kg per șarjă, în cazul pieilor și de 40 * 80 kg per șarjă, în cazul tendoanelor și cartilajelor. Pentru lucrul la nivel pilot, loturile medii vor reprezenta a patra parte, iar pentru lucrul la nivel de laborator, acestea vor reprezenta a douăzecea parte.
Exemplul 1. Obținerea soluțiilor coloidale de atelocolagen I hipoimunogen
Exemplul 1.1. Fluxul operațiilor preliminare
Se pornește de la piei de vițel nou născut, având masa, după jupuire, de circa 6 kg. Acestea se supun spălării cu flotă de 200% soluție de sare industrială, cu densitatea de 1,025 ±1,050 g/ml, la 16 25°C, timp de 30 60 min, prin agitare în butoi tăbăcăresc din oțel inoxidabil. După scurgerea flotei, pielea se agită la sec timp de 10 15 min. în continuare, se îndepărtează aderențele și fasciile hipodermice prin procedeul ștrecuirii și șeruirii tăbăcărești.
RO 123256 Β1
1.1. A. Pielea se supune depărării enzimatice prin procedee tăbăcărești, aplicând mai 1 întâi o labilizare a învelișului pilos (utilizând reducători) și apoi tratamentul enzimatic propriuzis. La final se individualizează porțiunile de interes tăbăcăresc (crupon, poale, gât), care se 3 regularizează prin operația tăbăcărească de ștuțuire a marginilor.
1.1. B. Pielea se secționează, individualizând porțiunile de interes tăbăcăresc 5 (crupon, poale, gât). Porțiunile marginale ale acestora se regularizează prin operația tăbăcărească de ștuțuire. Porțiunile de poale și gât se prelucrează în continuare conform 7 subexemplului 1.1. A. Porțiunea cruponului se fixează în stare întinsă, părul se tunde uniform, iar apoi firele scurtate se rad utilizând lame metalice bine ascuțite. Cruponul se re-ștrecuiește 9 și apoi se despică prin operația tăbăcărească de șpăltuire, individualizând stratul central (cel al învelișului pilos și cel învecinat hipodermei se îndepărtează, putând fi utilizate în vederea 11 obținerii de hidrolizate colagenice).
1.1. C. Porțiunile de crupon obținute aplicând subexemplele 1.1 .A și 1.1.Bsesecțio- 13 nează sub forma unor pătrate cu latura de aproximativ 10 cm, formând apoi loturi de câte un kg; acestea se spală de două ori, câte 30 + 60 min, în flote saline de 100% (densitatea 15 1,025 ± 1,050 g/ml), se clătesc în două flote de 200%, iar apoi se mențin timp de 6 +12 h în flotă de 150% apă deionizată, cu adaos de 0,3 + 0,5 g/l antibiotic de uz veterinar, la tem- 17 peraturi de 6 + 10°C. Opțional, dar mai ales dacă pieile au urmat prelucrarea conform subexemplului 1.1.B, în flota de stocare se adaugă 0,01% azidă de sodiu. Dacă pieile au fost 19 prelucrate conform subexemplului 1.1.A, se aplică 3 + 6 clătiri cu flote de 200% apă deionizată având temperatura de 20 + 25°C, până la îndepărtarea avansată a tensioactivilor 21 anterior utilizați. La final, loturile de piele se scurg prin presare și se congelează la -15 + 18°C, în condiții sterile (incluseîn pungi din polietilenă în care s-au introdus mici cantități din 23 soluția unui antibiotic de uz veterinar), menținându-se în stare congelată 24 + 72 h. în vederea defibrării mecanice, loturile de piele congelată se lasă la temperatura ambientală 25 timp de 1 + 3 h, după care se mărunțesc prin măcinare, adăugând bucăți de gheață în utilaj. Măcinătura se suspendă apoi succesiv, de trei ori câte 2 + 5 h, în flote de 200% apă 27 deionizată cu adaos de 3 + 9% NaCI și 2 + 5% Na2SO4, la temperatura ambiantă. în continuare măcinătura se spală abundent, pe filtru metalic, cu apă deionizată, parțial recirculată 29 (raportul de recirculare fiind de 60 + 80%). în continuare, măcinătura se suspendă, timp de 1 - 5 h în flotă 150% apă deionizată cu adaos de 2-6 ml/l amoniac soluție și 0,6 + 2,0% 31
EDTA, sub agitare energică. La final, măcinătura se spală abundent, pe filtru metalic, cu apă deionizată, parțial recirculată (raportul de recirculare fiind de 60 - 80%), până la readucerea 33 pH-ului la neutru. în continuare, măcinătura se centrifughează și se spală în centrifugă cu apă caldă (25 - 35°C). Măcinătura încălzită se tratează, de trei ori câte o oră, cu soluție caldă 35 (25 - 35°C) de 5 + 15% n-propanol, cu pH-ul tamponat la 6,0 - 6,8. După spălarea timp de trei ore cu apă deionizată,conținând doar sistemul tampon, măcinătura se tratează încă de 37 trei ori, câte trei ore, cu soluție rece (2 + 10°C) de 20 + 50% n-propanol, cu pH-ul tamponat la 6,0 + 6,8. După fiecare tratament cu n-propanol, la rece, se aplică spălări ale măcinăturii 39 cu soluție tampon, la aceeași temperatură. în continuare măcinătura se suspendă în soluție rece (2 + 10°C) de perhidrol 2 + 8%, menținându-se sub termostatare și agitare lentă timp 41 de 6 + 36 h, în funcție de natura sursei tisulare de colagen. La final, măcinătura se supune centrifugării și spălării abundente, în centrifugă, cu apă deionizată rece (2 + 10°C). Apa de 43 spălare se poate recircula parțial (raportul de recirculare fiind de 60 + 80%). După îndepărtarea completă a urmelor de perhidrol, măcinătura afânată se zvântă în centrifugă. 45
Exemplul 1.2. Fluxul operațiilor de solubilizare hidrolitică a colagenului în continuare, măcinătura provenită din loturile de piele inițiale, prelucrată conform 47 subexemplului 1.1.C, se procesează după proceduri diferențiate, în funcție de natura agentului de solubilizare hidrolitică. 49
RO 123256 Β1
1.2. A. Dacă solubilizarea hidrolitică se va realiza prin tratament cu pepsină, măcinătura se spală pe filtru metalic cu soluție de HCI în apă deionizată, având pH-ul de 2,2 + 3,5 și temperatura de 2 + 10°C, timp de 5 + 30 min, cu recircularea integrală a apei acide și eventuala corecție de pH.
1.2. B. Dacă solubilizarea hidrolitică se va realiza utilizând enzime cu acțiune optimă în mediu neutru sau slab alcalin (cele mai accesibile fiind tripsina și papaina), măcinătura se suspendă în 400% soluție 0,8 1,2 M clorhidrat de etilen-diamină în apă deionizată rece (2 10°C), cu adaos de 20 + 40% NaCI, sub agitare lentă, timp de 2 + 10 h, în funcție de natura sursei colagenice. La final, măcinătura se spală abundent pe filtru metalic, cu apă rece (2 + 10°C) recirculată în proporție de 75 + 95%, în care se adaugă soluție 30% acetat de sodiu.
1.2. C. Dacă solubilizarea hidrolitică se va realiza utilizând acid acetic, măcinătura se suspendă în 200% soluție salină obținută dizolvând în apă deionizată următoarele specii chimice: 20 + 40% NaCI, 10 + 25% Na2SO4,3 + 8% p-hidroxi-benzoat de metil, 2 + 5% ZnCI2, la temperatura de 2 + 10°C, timp de 1 + 6 h. în continuare, în flotă se adaugă, în fir subțire, soluție 40% NaOH până la atingerea unei concentrații echivalente cu 10% raportat la volumul flotei. Măcinătura se agită lent în flota alcalină, în regim termostatat, timp de 6 + 12 h. La final, măcinătura moderat umflată se separă pe filtru metalic și se spală, pe același filtru, mai întâi cu apă deionizată rece (2 + 10°C), iar apoi cu soluție 3 + 8% HGI, rece și ea. Soluția acidă de spălare se poate recircula parțial (la un raport de recirculare de 75 + 95%), cu corecția pH-ului, atunci când este necesar, până la îndepărtarea alcalinității din măcinătura. La final, soluția acidă se reține în vederea separării fracțiilor colagenice hidrolizate.
1.2. D. în vederea solubilizăriI hidrolitice a colagenului I, utilizând papaină, măcinătura se împarte în loturi de câte 300 g și se introduce în săculeți din sită filtrantă de nylon. Săculeții umpluți se introduc într-un utilaj tip „butoi tăbăcăresc din oțel inoxidabil, sterilizat în prealabil la interior și în regiunea capacului. Se adaugă 300+ 500% flotă cu pH-ul reglat în plaja 2,2 + 3,2 utilizând HCI și se termostatează la 25 + 35°C, sub agitare lentă. Pentru asigurarea sterilității pe durata procesului de solubilizare, în flotă se dozează 0,01% azidă de sodiu. înainte de a fi montat, capacul și zona sa de închidere se spală cu soluție 0,03% azidă de sodiu. După ce temperatura flotei s-a stabilizat, în utilaj se adaugă o suspensie acidă (pH 2,2 + 2,8 realizat cu HCI, în apă deionizată) obținută prin ampastarea și apoi diluarea a 60 + 80 g pepsină pulverulentă per 100 ml. Cantitatea de suspensie dozată se calculează astfel încât să asigure în flota de solubilizare o concentrație de 14 22%.
Săculeții cu măcinătura se agită lent în flota enzimatică timp de 6 +18 h, la temperatura de 15 + 35°C. în funcție de creșterea viscozității flotei de solubilizare, aceasta se poate schimba de trei până la cinci ori. Pentru fiecare cantitate de soluție colagenică prelevată din utilaj, se determină conținutul de substanță uscată, conținutul de substanțe minerale, conținutul total deazotși conținutul de specii triplu-helicalecvasi-native. De regulă, prima cantitate prelevată se orientează spre alte aplicații. Doar cele ce urmează se reunesc și se vor procesa în continuare în vederea obținerii formelor atelocolagenice hipoimunogene de înaltă puritate.
1.2. E. în vederea solubilizării hidrolitice utilizând enzime cu activitate proteolitică optimă în mediu neutru sau slab alcalin, loturile de măcinătură se pregătesc după tehnica descrisă la Subexemplul 1.2.D. Condițiile de lucru sunt de asemenea aceleași (utilaj, pregătirea utilajului, raport de flotă, temperatură, durate, regimul agitării). Flota se aduce în plaja optimă de acțiune a enzimei. Suspensia de enzimă se prepară utilizând apă deionizată. Soluțiile se prelevă și se caracterizează după aceleași reguli.
1.2. F. în vederea solubilizării liotrope utilizând acidul acetic, loturile de măcinătură se pregătesc după tehnica descrisă la subexemplul 1.2.D. Condițiile de lucru sunt de asemenea aceleași (utilaj, pregătirea utilajului, raport de flotă, temperatură, durate, regimul agitării).
RO 123256 Β1
Flota se prepară pornind de la apă deionizată, prin adaos de acid acetic glacial, sub agitare, 1 până la atingerea unui pH stabil cuprins între 3,2 și 3,5 unități. în flotă se dozează, în loc de azidă de sodiu, 0,2 + 0,5% sulfat de gentamicină. Soluțiile se prelevă și se caracterizează 3 după aceleași reguli.
Exemplul 1.3. Fluxul operațiilor de purificare a soluției coloidale de atelocoiagen 5 Soluția coloidală brută, obținută în urma reunirii cantităților prelevate din utilajul în care s-a efectuat solubilizarea, se supune purificării prin tratamente fizico-chimice. în urma 7 operațiilor de purificare se obține soluția coloidală de atelocoiagen.
1.3. A. Soluția coloidală brută se termostatează la 10 + 15°C, după care se filtrează 9 prin trecerea de 20 + 50 ori prin site filtrante cu 40 + 60 ochiuri/cm2. După îndepărtarea debriurilortisulare grosiere, soluția coloidală brută se laminează trecând-o de 5 + 30 ori, sub 11 presiune, prin sisteme filtrante cu porozitatea de 180 + 250 μ. în continuare, soluția se lasă spre maturare timp de 16 + 36 h, în vase și incinte sterile, la temperatura de 2 + 10°C. încă 13 rece, soluția se trece apoi de 5 + 30 ori, sub presiune, prin sisteme filtrante cu porozitatea de 20 + 50 μ , în vederea demicrofibrilării. La final, soluția se lasă spre maturare timp de 16 + 15 h, în vase și incinte sterile, la temperatura de 2 + 10°C.
1.3. B. Soluția coloidală eliberată de debriuri tisulare și de orice alte impurități fizice 17 se termostatează la 4 + 6°C și se aduce la pH 2,5 ± 0,3, prin adaos de soluție 15 + 25% HCI în apă deionizată. Utilizând o soluție de 330 g/l NaCI în apă deionizată, în soluția coloidală 19 se dozează, sub agitare eficientă, o cantitate echivalentă cu 0,7 ± 0,02 M NaCI. După circa 30 + 60 min de la încheierea dozării saramurei, suspensia formată, răcită la la 4 + 6°C, se 21 supune centrifugării la 7.000 g, cu separarea fracției proteice sedimentate. Sedimentul se înlătură și se poate utiliza în vederea recuperării fracțiilor telopeptidice și/sau oligopeptidice. 23 pH-ul supernatantului se corectează, dacă este cazul, la 2,5 ± 0,3, după care, prin aceeași procedură, i se adaugă o cantitate de NaCI echivalentă cu 1,2 ± 0,05 M. După aceeași 25 perioadă de maturare a precipitatului, suspensia formată se supune centrifugării la 7.000 g, cu separarea fracției proteice sedimentate. Din sediment se pot recupera fracțiile de colagen 27 IV și V. pH-ul supernatantului se reglează la 7,5 ±0,1, după care, prin aceeași procedură, i se adaugă o cantitate de NaCI echivalentă cu 1,75 ± 0,02 M. După aceeași perioadă de 29 maturare a precipitatului, suspensia formată se supune centrifugării la 7.000 g, cu separarea fracției proteice sedimentate. Din sediment se poate recupera fracția de colagen III. pH-ul 31 supernatantului se corectează, dacă este cazul, la 7,5 ±0,1, după care, prin aceeași procedură, i se adaugă o cantitate de NaCI necesară pentru a atinge o concentrație echi- 33 valență cu 2,4 ± 0,05 M. După 30 + 60 min, suspensia răcită la 4 + 6°C se supune centrifugării la 7.000 g, cu separarea fracției proteice sedimentate. Respectivul sediment, ce conține 35 fracția de atelocoiagen I, se va supune în continuare operațiilor de purificare și apoi ultrapurificare. pH-ul supernatantului se reglează la 7,5 ± 0,1, după care, prin aceeași procedură, 37 i se adaugă o cantitate de NaCI echivalentă cu 4,5 ± 0,02 M. După aceeași perioadă de maturare a precipitatului, suspensia formată se supune centrifugării la 7.000 g, cu separarea 39 fracției proteice sedimentate. Din sediment se poate recupera fracția de colagen II.
1.3. C. Sedimentul de atelocoiagen I se resuspendăîn soluție 0,1 M NaOH, preparată 41 cu apă deionizată având temperatura de 4 + 6°C, pentru a forma, sub agitare eficientă, o soluție coloidală cu concentrația de 16 + 25 g/l proteină. în soluție se adaugă o cantitate de 43 EDTA echivalentă cu 0,05 + 0,15 M/l. Sub termostatare, agitarea eficientă se menține timp de 30 + 150 min, evitând încorporarea de bule de aer în soluția vâscoasă. La final, soluția 45 se neutralizează lent, prin adăugarea, în picături, la început, și apoi în fir subțire, a unei soluții de 0,6 ± 0,05 M HCI. După atingerea neutralității, soluția se aduce lent la pH 2,5 ± 0,3, 47 prin adaos de soluție 0,2 M HCI în apă deionizată. Soluția acidifiată se termostatează la 4 + 6°C și se menține sub agitare alte 20 + 60 min, efectuând eventuale corecții de pH. în 49
RO 123256 Β1 continuare, se adaugă soluție de NaCI cu concentrația de 330 g/l, într-un volum egal cu o treime din volumul soluției de atelocolagen I acidulată. Precipitatul format se menține, spre maturare, timp de 6Ή8 h, la 10 +1 5°C, după care se centrifughează la 7.000 g, recuperând sedimentul. Acesta din urmă se resuspendă în soluție de acid acetic cu pH-ul 3,0 3,5 și temperatura de 4 + 12“C, sub agitare eficientă. Soluția obținută se supune diafiltrării prin sisteme cu membrane având limita de trecere de 100 kDa, menținându-i permanent volumul constant, prin adăugare de soluție de acid acetic cu pH 3,0 - 3,5, preparată utilizând apă deionizată liberă de pirogeni. Volumul de soluție de acid acetic adăugată va fi dublul până ia triplul volumului inițial al soluției de atelocolagen supus diafiltrării. După diafiltrare, soluția se menține, spre maturare, timp de 12 - 72 h, la 4 +12°C, în vase și în incinte sterile.
Exemplul 2. Purificarea și uitrapurificarea soluțiilor coloidale de atelocolagen I hipoimunogen
Exemplul 2.1. Condiționarea soluției de atelocolagen I în vederea ultrapurificării
Soluția coloidală de atelocolagen tip I, rezultată la finalul operațiilor reunite în exemplul 1, se supune precipitării cu soluție rece (2 6°C) de 330 g/l NaCI dizolvată în apă deionizată liberă de pirogeni. Procedura generală de precipitare și separare a precipitatului este similară celei prezentateîn subexemplul 1.3.C. Precipitatul se resuspendăîn soluție 1M NaCI preparată cu apă deionizată liberă de pirogeni având temperatura de 2 - 6°C, la care se adaugă 0,01% azidă de sodiu, 2-^12 mM/Ι tioglicolat de amoniu și 80 + 240 ml/l polietilengîicol cu masa moleculară medie de 600 Da, sterilizat anterior prin încălzire, în condiții etanșe, la 115°C, timp de o oră. Soluția coloidală obținută se supune filtrării prin sisteme filtrante cu porozitatea de 180>-250 μ, după care se supune dializei față de o soluție cu pH 6,0 + 6,5, ce are același conținut de specii chimice (exceptându-le pe cele proteice), timp de 18 + 72 h, sub controlul variațiilor conductivității și în condiții de termostatare la 2 6°C. în continuare, sub agitare lentă soluția coloidală se lasă să ajungă la temperatura ambiantă, după care se aduce la 30 36°C, prin încălzire cu o pantă de 0,2 0,3°C/min, menținând apoi temperatura constantă timp de 30 + 120 min.
Exemplul 2.2. Conferirea caracterului hipoimunogen soluției de atelocolagen I
Sub agitare lentă, soluției coloidale condiționate i se adaugă 1 + 2,5 g/l papaină sub formă de soluție în apă deionizată liberă de pirogeni, cu temperatura de 15 - 25°C. Dozarea soluției de papaină se realizează prin picurare. După încheierea dozării, soluția coloidală se aduce și se menține, la 6 + 10°C, sub agitare lentă, timp de 8 + 18 h, după care se adaugă 0,2 + 1,5 ml/l perhidrol 32% și se continuă agitarea timp de alte 60 + 90 min. La final, soluția coloidală se termostatează la 4 + 6°C și se supune diafiltrării în sisteme cu membrane având limita de trecere de 100 kDa. Pe durata acestui proces, volumul soluției coloidale se menține constant, adăugând tampon TRIS/TRIS-HCI cu pH-ul 7,3 + 7,5, preparat utilizând apă deionizată liberă de pirogeni. în soluția tampon se adaugă 50 mM/Ι CaHPO4 · 2H2O și 0,1 g/l gentamicină. Volumul de soluție tampon adăugat va fi de trei până la cinci ori mai mare decât volumul inițial, menținut constant, al soluției coloidale. Diafiltratul se îndepărtează și nu se recirculă. La finalul diafiltrării, temperatura soluției coloidale se aduce și se menține la 4 + 8°C, timp de 3 +12 h, sub agitare lentă.
Exemplul 2.3. Uitrapurificarea soluției de atelocolagen I hipoimunogen în soluția de colagen I hipoimunogen purificată conform exemplului 2.2, se adaugă, în condiții de termostatare la 4 - 8°C și agitare lentă, o masă de 6 +15% raportat la volumul soluției dintr-un amestec, anterior formulat în condiții sterile, ce conține 60 + 70% masic polietilengîicol cu masa moleculară medie 10.000, 10 + 15% masic Na2SO4 anhidru și 15 + 25% TMAO cristalizat (GAS 62637-93-8), dizolvate în tampon TRIS/TRIS-HCI cu pH-ul 7,3 + 7,5, format utilizând apă deionizată liberă de pirogeni. Polietilen-glicolul citat (PEG 10.000)
RO 123256 Β1 se poate înlocui cu un amestec, separat formulat, de PEG 400, PEG 6.000 și PEG 20.000, 1 sau PEG 600, PEG 8.000 și PEG 10.000, sau încă PEG 400, PEG 600 și PEG 8.000. Rapoartele de amestecare ale polietilenglicolilor enumerați se stabilesc prin optimizarea 3 recepturilor, astfel încât participația respectivelor amestecuri să nu depășească 60 + 70% din amestecul final cu TMAO și Na2SO4 anhidru. După o agitare lentă, cu durata de 60 + 180 5 min, în soluția coloidală condiționată se adaugă o soluție sterilă de pronază, proaspăt preparată și liberă de suspensii, într-o cantitate care să asigure o concentrație de 3,0 ± 0,2% 7 masic raportat la substanța proteică regăsită în soluția coloidală supusă ultrapurificării. Tratamentul enzimatic se conduce în condiții de termostatare la 5 ± 0,5°C, sub agitare lentă 9 dar eficientă, timp de 12 +16 h. La final, pH-ul soluției coloidale se coboară lent la 4,2 + 4,6, adăugând, în picături, o soluție 1N H3PO4. Soluția coloidală Se menține apoi, în aceleași 11 condiții de temperatură și pH, sub agitare lentă, timp de 30 + 90 min.
Exemplul 2.4. Condiționarea finală a soluției de atelocolagen I hipoimunogen 13
Soluția obținută conform prescripțiilor prezentate în exemplul 2.3, se supune diafiltrării în sisteme cu membrane având limita de trecere de 100 kDa, în condiții de termostatare la 15 5 ± 0,5°C. Volumul soluției atelocolagenice se menține constant prin adaosul unei soluții de 1% acid acetic în care s-au dozat 8,6 ±0,1 g/l NaCI, 0,4 ± 0,03 g/l KCI, 0,2 + 0,5 g/l sulfat de 17 gentamicină, 0,5 g/l streptomicină și 0,1 + 0,3 g/l acid trans-cinamic (CAS 140-10-3), preparată utilizând apă deionizată liberă de pirogeni, răcită apoi la 10°C. Volumul de soluție 19 acidă trecută prin instalația de diafiltrare va fi de trei ori mai mare decât volumul inițial al soluției atelocolagenice. Caracteristicile diafiltratului se urmăresc conductometric. Diafiltratul 21 se îndepărtează, iar soluția atelocolagenică hipoimunogenă de înaltă puritate, astfel obținută, se închide în vase sterile din sticlă sau din materiale plastice inerte chimic, cu volume de 1 + 23 litri, care se stochează apoi la temperaturi de 6 + 10°C, la întuneric, introduse în pungi din polietilenă închise sub vid, cu adaos de antifungici. 25
Exemplul 3. Stabilirea conținutului de specii triplu-helicale, cvasi-native, din soluțiile de atelocolagen, atelocolagen hipoimunogen și atelocolagen hipoimunogen de înaltă puritate 27
Indiferent de natura și de gradul de puritate al soluțiilor cu conținut de colagen, eucolagen și/sau atelocolagen, din acestea se preiau două loturi a câte cinci probe al căror 29 volum se stabilește astfel încât, fiecare probă, să conțină echivalentul a circa 1,0 +1,5 grame formă colagenică. Opțional, probele pot fi supuse diafi Itrări i pentru a elimina excesul de săruri 31 ori speciile chimice necolagenice. în soluțiile coloidale aparținând ambelor loturi, termostatate la 8 ± 2°C, se adaugă, prin picurare, soluție 50% CaCI2 într-un volum suficient 33 pentru a asigura o concentrație de 0,1 M ioni Ca2+. în continuare, soluțiile coloidale se aduc la la pH 7,8 ±0,2, dozând în picături o soluție 0,2 M NaOH și apoi li se adaugă o cantitate 35 de soluție 1:3 alcool izopropilicîn apă, suficientă pentru a asigura o concentrație de 80 mM alcool izopropilic în soluția coloidală. în continuare, în soluția coloidală se dozează o 37 cantitate de soluție concentrată de tripsină echivalentă cu 15 mg tripsină pură raportat la conținutul de proteină al soluției coloidale luată inițial în lucru. Soluțiile coloidale cu adaos 39 de tripsină se termostatează și se mențin la 8 ± 2°C, timp de 12 h, sub agitare lentă. La final, se adaugă o cantitate de 20 ml soluție 2 M ZnCI2 și se continuă agitarea timp de încă o oră. 41 în continuare, cele două loturi de câte cinci probe se procesează diferențiat. Primul lot se aduce la sec, pe baie de apă, se aduce la pond constant, la 105°C și apoi se determină 43 conținutul de azot total, prin tehnica Kjeldahl. Cele cinci valori numerice obținute se prelucrează statistic, iar valoarea medie obținută se notează Ntotai. Cel de-al doilea iot se 45 diafiItrează peste membrane cu limita de trecere de 100 kDa, adăugând soluție alcalină (pH 7,8 ± 0,2), îndepărtând diafiltratul și reținând soluția coloidală. Aceasta din urmă se aduce 47
RO 123256 Β1 apoi la sec pe baie de apă, se aduce la pond constant la 105°C și apoi se determină conținutul de azot total, prin tehnica Kjeldahl. Cele cinci valori numerice obținute se prelucrează statistic, iar valoarea medie obținută se notează Nnatjv. Conținutul procentual de specii triplu-helicale, cvasi-native din soluția coloidală luată în lucru se calculează aplicând relația:
Fracție colagenică rezistentă la digestia triptică Nnativ % Colagen triplu-helical =--------------------------------------------------------------=-------x 100.
Conținut total de colagen în soluție Ntota,
Valorile numerice obținute pentru mai multe serii de soluții de același tip (colagenice brute, atelocolagenice brute, atelocolagenice hipoimunogene, atelocolagenice hipoimuno13 gene de înaltă puritate) se utilizează drept referință pentru etalonarea citirilor de densitate optică în tehnica Hofman, de determinare a conținutului de specii colagenice native în soluții.
Această din urmă tehnică este mult mai rapidă, pretându-se analizelor de rutină.
Claims (25)
- Revendicări 11. Procedeu pentru obținerea soluțiilor coloidale de atelocolagen hipoimunogen de 3 înaltă puritate, caracterizat prin aceea că include:- izolarea și preprocesarea unei surse tisulare de colagen, 5- solubilizarea hidrolitică a colagenului din sursa tisulară în prezența unei enzime proteolitice sau a unui agent slab liotrop, 7- purificarea soluției coloidale obținute prin solubilizarea hidrolitică,- conferirea caracterului hipoimunogen prin tratarea cu papaină a soluțiilor atelo- 9 colagenice rezultate în urma purificării,- ultrapurificarea soluțiilor coloidale atelocolagenice hipoimunogene utilizând pronaza, 11 în prezența unor agenți cosmotropi și a unor amestecuri ternare ce conțin agenți de aglomerare macromoleculară, 13- condiționarea finală a soluțiilor de atelocolagen hipoimunogen ultrapurificate prin diafiltrare contra unor soluții ce conțin agenți cosmotropi, inhibitori enzimatici și antibiotice, 15- conservarea și stocarea soluțiilor coloidale obținute în vase sterile închise ermetic, incluse la rândul lor în pungi din polietilenă în care se introduce o soluție alcoolică a unui 17 agent antifungic, pungi ce se închid apoi sub vid.
- 2. Procedeu conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că izolarea și prepro- 19 cesarea sursei tisulare de colagen cuprinde prelevarea sursei tisulare de colagen, formarea de loturi cu mase egale din sursa tisulară de colagen prelevată, tratarea loturilor cu agenți 21 de sterilizare generală, mărunțirea țesutului și defibrarea fizico-mecanică a acestuia, îndepărtarea preliminară a componentelor necolagenice solubile în soluții saline, opțional inhibarea 23 activității autolitice a enzimelor proprii țesutului prin dozarea de inhibitori enzimatici generali, delipidarea structurilor tisulare defibrate mecanic, afânarea structurilor tisulare defibrate 25 mecanic utilizând perhidrol, îndepărtarea avansată a excesului de perhidrol, condiționarea structurilor tisulare în vederea solubilizării hidrolitice. 27
- 3. Procedeu conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că enzima proteolitică utilizată pentru solubilizarea hidrolitică a colagenului din sursele tisulare este pepsina, 29 tripsina sau papaina.
- 4. Procedeu conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că agentul slab liotrop 31 utilizat pentru solubilizarea hidrolitică a colagenului din sursele tisulare este acidul acetic.
- 5. Procedeu conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că purificarea soluțiilor 33 coloidale obținute prin solubilizarea hidrolitică se realizează prin laminări și filtrări repetate, utilizând medii filtrante cu porozități controlate.35
- 6. Procedeu conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că, în vederea conferirii caracterului hipoimunogen, soluția rezultată în urma purificării se supune condiționării 37 chimice, utilizând cel puțin un agent cosmotrop și cel puțin un agent de aglomerare macromoleculară.39
- 7. Procedeu conform revendicărilor 1 și 6, caracterizat prin aceea că agentul cosmotrop utilizat în vederea condiționării chimice a soluțiilor purificate, precum și în etapa41 de ultrapurificare a soluțiilor coloidale atelocolagenice, este selectat dintre sărurile anorganice neutre prezente în seria Hofmeister, compușii organici neionizabili, cu mase43 moleculare mici și medii și săruri ale acestora din urmă cu contraioni anorganici din seria Hofmeister.45
- 8. Procedeu conform revendicării 6, caracterizat prin aceea că agentul de aglomerare macromoleculară utilizat în vederea condiționării chimice a soluțiilor purificate este 47 selectat dintre speciile macromoleculare înalt solubile, dar neionogene, capabile să stabilizeze proteinele în starea lor nativă, de tipul poli eti leng I icol îl or și polizaharidelor, acestea din 49 urmă în stare naturală sau modificate chimic.RO 123256 Β1
- 9. Procedeu conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că agenții de aglomerare macromoleculară utilizați în etapa de ultrapurificare a soluțiilor coloidale atelocolagenice hipoimunogene sunt polietilenglicoli cu mase moleculare medii sau amestecuri ternare de polietilenglicoli cu mase moleculare mici, medii și mari, în proporții variabile, dar favorabile polietilenglicolilor cu mase moleculare medii.
- 10. Procedeu conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că antibioticul utilizat în etapa de condiționare finală a soluțiilor de atelocolagen hipoimunogen ultrapurificate este selectat dintre antibioticele cu spectru larg, de preferință active și împotriva micoplasmelor.
- 11. Procedeu conform revendicărilor 1 10, caracterizat prin aceea că sursa tisulară de colagen este orice organ sau structură anatomică, provenite de la un mamifer sau de la un animal aparținând seriei cordatelor, cu conținut ridicat de scleroproteine.
- 12. Procedeu conform revendicărilor 1-^11, caracterizat prin aceea că sursa tisulară de colagen este pielea.
- 13. Procedeu conform revendicării 12, caracterizat prin aceea că pielea proaspăt jupuită se supune spălării în flotă salină, după care se prelucrează prin operații tăbăcărești uzuale de ștrecuire, șeruire, spălare abundentă în flote cu tensioactivi neionogeni, labilizare a învelișului pilos utilizând reducători, depărare enzimatică utilizând produse de uz industrial tăbăcăresc, fățuire mecanică, fățuire chimică, clătire abundentă în flote fără tensioactivi, secționare conform zonării tăbăcărești, regularizare a porțiunilor marginale prin ștuțuire, rezultând porțiuni care vor reprezenta sursa tisulară de colagen pentru operațiile următoare.
- 14. Procedeu conform revendicării 12, caracterizat prin aceea că pielea proaspăt jupuită se secționează conform zonării topografice tăbăcărești, iar porțiunea de crupon se spală în soluție salină și apoi în flote de tensioactivi neionogeni, se clătește abundent cu apă deionizată, se eliberează pe cale mecanică de aderențele hipodermice și de învelișul pilos, prin operații mecanice tăbăcărești de ștrecuire și șeruire, după care se despică prin operația tăbăcărească de șpăltuire, cu individualizarea zonei mediene a secțiunii dermei, porțiune care va reprezenta sursa tisulară de colagen pentru operațiile următoare.
- 15. Procedeu conform revendicărilor 13 și 14, caracterizat prin aceea că, în scopul îndepărtării preliminare a componentelor necolagenice, sursa tisulară de colagen se secționează în porțiuni cu aria aproximativă de 1 dm2, care apoi se spală în flote saline, se sterilizează superficial prin menținere în flote de apă deionizată cu adaos de antibiotice și opțional azidă de sodiu, se presează și se congelează în condiții sterile, se mențin congelate timp de 24 * 72 h, se decongelează parțial, se mărunțesc prin măcinare mecanică în prezența adaosului de gheață, iar măcinătura se suspendă în flote sterile ce conțin NaCI și Na2SO4, se spală abundent cu apă deionizată, se suspendă și se agită energic în soluție de amoniac și EDTA, se spală din nou abundent cu apă deionizată, se centrifughează și se spală în centrifugă, se tratează cu soluții calde de n-propanol, tamponate la pH 6,0 + 6,8, se suspendă în soluție de 2 ± 8 % perhidrol, la rece, timp de 6 + 36 h, se centrifughează și se spală abundent în centrifugă cu apă deionizată, iar la final se zvântă prin centrifugare.
- 16. Procedeu conform revendicării 15, caracterizat prin aceea că, în scopul solubilizării hidrolitice a colagenului, măcinătura zvântată se spală pe filtru metalic cu soluție rece de HCI având pH-ul 2,2 - 3,5, se împarte în loturi care se introduc în săculeți din sită filtrantă de nylon, iar aceștia se introduc în butoi tăbăcăresc din oțel inoxidabil sterilizat, se agită lent în flota acidă termostatată la 25-^- 35 °C, se adaugă 14 22 % suspensie acidă de pepsină cu pH 2,2 * 2,8, care conține 60 + 80 % masic pepsină, se agită lent 6-M8 h, eu schimbarea de 3 5 ori a flotei din utilaj, se prelevă soluțiile vâscoase, se înlătură prima prelevare, iar celelalte se reunesc într-o soluție coloidală brută.RO 123256 Β1
- 17. Procedeu conform revendicării 15, caracterizat prin aceea că, în scopul 1 solubi Uzării hidrolitice a colagenului, măcinăturazvântată se suspendăm soluție de clorhidrat de etilen-diamină și NaCI, la rece, sub agitare lentă, după care se spală abundent pe filtru 3 metalic, cu soluție de acetat de sodiu, apoi se tratează similar tehnicii prezentate în revendicarea 17, dar înlocuind pepsina cu 8 +15% tripsină sau 10 +18% papaină și reglând 5 pH-ul la 7,5 + 8,5, respectiv 6,0 + 6,8.
- 18. Procedeu conform revendicării 15, caracterizat prin aceea că, în scopul solubili- 7 zării hidrolitice a colagenului, măcinătura zvântată se suspendă în flotă ce conține NaCI, Na2SO4, p-hidroxi-benzoat de metil și ZnCI2, cu temperarura de 2 + 10°C, timp de 1 + 6 h, 9 după care se adaugă 10% soluție 40% NaOH, se agită la rece 6-^-12 h, apoi se spală pe filtru metalic cu apă deionizată rece și cu soluție de HCI rece, până la îndepărtarea alcali- 11 nității, iar apoi se tratează simiIar tehnicii prezentate în revendicarea 16, înlocuind suspensia sau soluția de enzime cu soluție de acid acetic cu pH-ul de 3,2 + 3,4, cu adaos de sulfat de 13 gentamicină.
- 19. Procedeu conform revendicărilor 16,17 sau 18, caracterizat prin aceea că, în 15 scopul purificării, soluția coloidală brută răcită se supune operațiilor de îndepărtare ă debriurilor tisulare prin trecerea repetată prin site filtrante și prin medii filtrante cu porozitatea 17 de 180 + 250 μ și apoi de 20 + 50 μ, în condiții de termostatare la 2 + 10°C, cu intercalarea unor etape de maturare. 19
- 20. Procedeu conform revendicării 19, caracterizat prin aceea că, în scopul separării tipurilor colagenice, soluția coloidală colagenică liberă de debriuri tisulare și impurități 21 solide se termostatează la 4 + 6°C, se aduce la pH 2,5 + 0,3, apoi i se adaugă 0,7 +0,02 moli/l NaCI, se separă precipitatul, care conține fracții telopeptidice și/sau oligopepti- 23 dice, prin centrifugare la 7000 g, apoi, supernatantului i se adaugă, la aceeași valoare de pH, un plus de NaCI până la 1,2 ± 0,05 moli/l, se separă precipitatul, care conține fracțiile de 25 colagen IV și V, prin centrifugare la 7000 g, apoi, supernatantului i se ajustează pH-ul la 7,5 ± 0,1, i se adaugă un plus de NaCI până la 1,75 ± 0,02 moli/l și se separă precipitatul, 27 care conține fracția de atelocolagen III, prin centrifugare la 7000 g, apoi, supernatantului, la același pH, i se adaugă un plus de NaCI până la 2,4 ± 0,05 moli/l, se lasă la maturare și apoi 29 se separă precipitatul prin centrifugare la 7000 g, acest precipitat conținând fracția de atelocolagen I, iar opțional, la același pH, se adaugă un plus de NaCI până la 4,5 ± 0,02 31 moli/l și se separă un ultim precipitat, prin centrifugare la 7000 g, care conține fracția de atelocolagen II.33
- 21. Procedeu conform revendicării 20, caracterizat prin aceea că, în scopul sterilizării energice, hidrolizei și separării urmelor de prioni și toxine, precipitatul care conține35 fracția de atelocolagen I se suspendă în soluție 0,1 M NaOH, la temperatura de 4 6°C, pentru a forma o soluție coloidală cu concentrația de 16 + 25 g/l, la care se adaugă 0,05 +370,15 moli/l EDTA, iar aceasta se agită eficient timp de 30 + 150 min, se neutralizează lent utilizând o soluție de HCI, apoi i se ajustează pH-ul la 2,5 ± 0,3 unități, după care i se adaugă 39 un volum de soluție saturată de NaCI egal cu o cincime până la o treime din volumul soluției coloidale acidulate, precipitatul format se menține spre maturare, apoi se separă prin 41 centrifugare, recuperând sedimentul, care se suspendă apoi în soluție de acid acetic, se termostatează, iar soluția coloidală astfel obținută se diafiltrează prin membrane cu limita de 43 trecere de 100 kDa, adăugând permanent soluție de acid acetic cu pH 3 + 3,5, pentru a menține constant volumul, iarîn final soluția coloidală obținută se supune maturării la rece. 45
- 22. Procedeu conform revendicării 21, caracterizat prin aceea că, în scopul conferirii caracterului hipoimunogen, soluția coloidală se precipită cu un volum de soluție saturată de 47 NaCI egal cu o cincime până la o treime din volumul inițial al soluției coloidale, iar precipitatul se separă centrifugal și se suspendă în soluție 1 M NaCI, în care s-au adăugat azidă de 49 sodiu, tioglicolat de amoniu și polietilenglicol cu masa moleculară medie 600 Da, după care soluția rezultată se filtrează prin filtre cu porozitatea de 180 250 μ, se dializează contra 51RO 123256 Β1 unei soluții saline cu aceeași compoziție, apoi se aduce la 30 * 36°C, prin încălzire cu pantă de 0,2 + 0,3 grade/min, se lasă pentru maturare la această temperatură, după care se adaugă lent 1 + 2,5 g/l papaină dizolvată în apă deionizată liberă de pirogeni la temperatura de 15 25°C, după dozare, se răcește și se menține sub agitare timp de 8 -ί-18 h, apoi i se adaugă 0,2 + 1,5 ml/l perhidrol și se agită încă 60 * 90 min, în final, se tratează enzimatic, se răcește și se diafiltrează prin membrane cu limita de trecere de 100 kDa, menținându-i volumul constant prin adaos de tampon TRIS/TRIS-HCI cu pH-ul 7,3 + 7,5 în care se dozează CaHPO4 · 2H2O și sulfat de gentamicină, volumul de soluție tampon adăugată fiind de trei până la cinci ori mai mare decât volumul inițial al soluției coloidale supuse diafiItrării, iarîn final soluția coloidaIă se maturează, după care se supune, în continuare, ultrapurificării.
- 23. Procedeu conform revendicării 22, caracterizat prin aceea că, în scopul ultrapurificării soluției de atelocolagen hipoimunogen, aceasta se termostatează la 4 - 8°C și i se adaugă 6 +15% soluție de amestec ce conține PEG 10.000 sau amestecuri, separat formulate, de PEG 400, PEG 600, PEG 6.000, PEG 8.000, PEG 10.000 și PEG 20.000, sau PEG și PPG cu alte mase moleculare medii, în diverse rapoarte de amestecare, optimizate în funcție de condițiile concrete de lucru, alături de Na2SO4 anhidru și TMAO cristalizat, după care soluției coloidale astfel condiționată i se adaugă 3,0 + 0,2% pronază raportat la substanța proteică, iar în final, soluția coloidală se termostatează la 5 ± 0,5°C și se agită eficient timp de 12 + 16 h, după care se acidulează până la pH 4,2 + 4,6 prin adăugare de soluție de H3PO4.
- 24. Procedeu conform revendicării 23, caracterizat prin aceea că, în scopul condiționării finale a soluțiilor de atelocolagen hipoimunogen ultrapurificate, acestea se termostatează la 5 + 0,5°C și apoi se supun diafiltrării prin membrane cu limita de trecere de 100 kDa, menținând volumul constant prin adăugarea unei soluții de acid acetic în care s-au dizolvat NaCI, KCI, sulfat de gentamicină, sulfat de streptomicină și acid trans-cinamic, preparată utilizând apă deionizată liberă de pirogeni, iar volumul de soluție acidă adăugat la diafiltrare este de trei până la cinci ori mai mare decât volumul inițial al soluției coloidale.
- 25. Procedeu conform revendicării 24, caracterizat prin aceea că, în scopul conser- vării, soluțiile ultrapurificate se introducîn vase sterilizate, din sticlă sau din materiale plastice chimic inerte, cu dop înfiletabil, având volume de 1 51, care se închid ermetic și apoi se introduc în pungi din polietilenă în care s-a adăugat soluție alcoolică de Amfotericina B sau un produs farmaceutic care o conține, cum ar fi Fungizon, pungile fiind apoi închise sub vid și fiind păstrate la întuneric și la 6 + 1CTC.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ROA200700766A RO123256B8 (ro) | 2007-11-07 | 2007-11-07 | Procedeu pentru obţinerea soluţiilor coloidale de atelocolagen hipoimunogen de înaltă puritate |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ROA200700766A RO123256B8 (ro) | 2007-11-07 | 2007-11-07 | Procedeu pentru obţinerea soluţiilor coloidale de atelocolagen hipoimunogen de înaltă puritate |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RO123256B1 true RO123256B1 (ro) | 2011-04-29 |
| RO123256B8 RO123256B8 (ro) | 2011-05-30 |
Family
ID=44502561
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ROA200700766A RO123256B8 (ro) | 2007-11-07 | 2007-11-07 | Procedeu pentru obţinerea soluţiilor coloidale de atelocolagen hipoimunogen de înaltă puritate |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RO (1) | RO123256B8 (ro) |
-
2007
- 2007-11-07 RO ROA200700766A patent/RO123256B8/ro unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RO123256B8 (ro) | 2011-05-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR100676285B1 (ko) | 동물의 다양한 조직으로부터의 콜라겐 분리방법 및 콜라겐 용액의 제조방법 그리고 이를 이용하여 생산한 매트릭스 | |
| US4268131A (en) | Fiber collagen contact lens | |
| KR100977744B1 (ko) | 콜라겐과 그 생산방법 | |
| JP5277480B2 (ja) | 高純度コラーゲンの調製 | |
| KR20170098951A (ko) | 진주단백질 제조방법 및 이 제조방법에 의해 얻은 수용성 진주단백질과 산 용해성 진주단백질 | |
| Kabir et al. | Biowaste transformation to functional materials: structural properties, extraction methods, applications, and challenges of silk sericin | |
| CN112778412B (zh) | 一种低内毒素胶原蛋白的制备方法 | |
| KR101871395B1 (ko) | 고수율로 콜라겐을 제조하는 방법 | |
| KR101916759B1 (ko) | 고농도, 고순도의 동종 콜라겐 제조 방법 및 동종 콜라겐 지지체의 제조방법 | |
| CN101570772A (zh) | 一种天然骨胶原的制备方法 | |
| KR101760890B1 (ko) | 콜라겐 제조방법 | |
| CN113599281A (zh) | 胶原多肽羧甲基壳聚糖纳米缓释颗粒及其制造方法 | |
| KR100532153B1 (ko) | 어류 비늘을 이용한 단백질 가수분해물의 제조방법 | |
| KR101618726B1 (ko) | 명태껍질로부터 엘라스틴을 포함하는 단백질추출물을 제조하는 방법 | |
| CN117442780B (zh) | 一种重组角蛋白可注射凝胶及其制备方法 | |
| RU2562581C1 (ru) | Способ получения биологически активного средства из голотурий, обладающего общеукрепляющими и иммуномодулирующими свойствами | |
| KR101085940B1 (ko) | 콜라겐 파티클을 함유한 콜라겐 현탁액 제조방법 | |
| TWI236501B (en) | Process for extracting soluble collagen from animal tissue and products containing soluble collagen prepared therefrom | |
| JP2004083451A (ja) | 皮膚外用剤 | |
| CN104497101B (zh) | 一种小麦胚芽细胞活性蛋白的制备方法 | |
| RU2610669C1 (ru) | Способ получения протеолитического препарата для медицинского применения | |
| RU2115662C1 (ru) | Способ получения гиалуроновой кислоты | |
| RU2265052C2 (ru) | Способ получения препарата коллагеназы | |
| JP4239143B2 (ja) | 非ウシ起源変性コラーゲンの製造方法 | |
| JPH07241200A (ja) | ヒアルロン酸の製造法 |