RO125385A2 - Derivaţi de 1,3-oxatiolan, compoziţie farmaceutică care îi conţine şi metodă pentru tratarea infecţiei cu hiv la om prin administrarea acestora - Google Patents

Abstract

Invenţia se referă la derivaţi de β(-)-D-2-hidroximetil-5-(5-fluorcitozin-1-il)-1,3-oxatiolan. Derivaţii de 1,3-oxatiolan se utilizează în tratamentul infecţiei cu virusul imunodeficienţei umane.

Description

IOHCIUL de STAT PENTRU ΚορΤΠβ Cerere de brevet de invenție

Invenția se referă un procedeu separare a unui amestec de derivați de 1,3 oxatiolan utilizați în tratamentul infecției cu HIV

Este cunoscut încă din 1981, faptul că sindromul imunodeficienței dobândite (SIDA) este o boală care afectează sever sistemul imunitar uman și care aproape fără excepție, duce la deces. în 1983, cauza etiologică a sindromului imunodeficienței dobândite (SIDA) a fost determinată a fi virusul imunodeficienței umane (HIV), în decembrie 1990, Organizația Mondială a Sănătății a estimat că între 8 și 10 milioane de oameni din lumea întreagă sunt infectați cu virusul imunodeficienței umane (HIV) din care între 1000000 și 1400000 sunt din Statele Unite ale Americii.

în 1985, s-a raportat că nucleozida sintetică 3’-azido-3'-dezoxitimidina (AZT) inhiba replicarea virusului imunodeficienței umane. De atunci, s-au prezentat și alte nucleozide sintetice eficiente față de virusul imunodeficienței umane (HIV) incluzând 2 ,3-didezoxiinozina (DDI), 2',3'-didezoxicitidina (DDC), 3'-fluoro-3'dezoxitimidina (FLT) și 2',3'-didezoxi-2',3'-didehidrotimidina (D4T).

S-a demonstrat, de asemenea, că și alte 2',3'-didezoxinucleozide inhibă dezvoltarea in vitro a unei varietăți din aceste virusuri. Se pare că, după fosforilare celulara la 5'-trifosfat cu ajutorul kinazelor celulare, aceste nucleozide sintetice sunt încorporate în filamentul de dezvoltare al acidului dezoxiribonucleic (ADN) viral producând astfel oprirea catenei datorită absenței grupării 3'-hidroxil.

Succesul diferitelor 2',3'-didezoxinucleozide în inhibarea replicării virusului imunodeficienței umane HIV in vivo sau in vitro a condus la un număr de teme de cercetare pentru găsirea și testarea nucleozidelor care substituie un heteroatom la atomul de carbon din poziția 3' a nucleozidei. Norbeck și colaboratorii, descriu faptul că (±)-1-((23,43)-2-(hidroximetil)-4-dioxolanil)timina (se referă la forma de (±)-dioxolan-T) prezintă o activitate modestă față de virusul imunodeficienței HIV (EC₅₀ de 20 pm în celulele ATH 8) și nu este toxic față de celulele martor neinfectate, la o concentrație de 200 μΜ, Tetrahedron Letters 30 (46), 6246, (1989). Cererea de brevet europeană cu publicația WO/0337713 și brevetul US 5041449 având ca titular IAF BioChem International, Inc., descriu 1,3-dioxolanii-2-substituiți-4-substituiți care prezintă o activitate antivirală.

& US 5047407 și cererea de brevet european nr. 0382526 având, de asemenea

ϊ ca titular IAF BioChem International, Inc,, descriu un numârde nucleozide 1,3-oxatiolan 2-substrtuite-5-substituite, cu activitate antivirală și raportează, în mod specific, că amestecul racemic (aproximativ poziția C4') de izomer C1 '-β _a| 2-hidroximetil-5-(citozin1-il)-1,3-oxatiolanului (se referă, mai departe, la (±)-BCH-189) are aproximativ aceeași activitate față de virusul imunodeficienței ca AZT și nu este toxic la nivelurile testate S-a descoperit, de asemenea, că (±)-BCH-189 inhibă replicarea virusului imunodeficienței HIV rezistent ia AZT care se izolează in vitro de la pacienții care au fost tratați cu nucleozida sintetică 3'-azido-3'-dezoxitimidina (AZT) timp de mai mult de 36 de săptămâni.

Un alt virus care cauzează probleme serioase în sănătatea omului, este virusul hepatitei B (HBV). Virusul hepatitei B este inferior numai tutunului ca și cauză a cancerului uman. Mecanismul prin care virusul hepatitei B induce cancerul este necunoscut, așadar este postulat că acesta poate declanșa direct dezvoltarea tumorii sau poate declanșa dezvoltarea tumorii indirect prin inflamație cronică, ciroză și prin regenerarea celulară asociată cu infecția.

După o perioadă de incubare de două până la șase luni în care gazda este infectata cu virusul hepatitei B, evoluția bolii ajunge la stadiul de hepatită acută și la distrugerea ficatului, ceea ce produce dureri abdominale, icter și niveluri ridicare ale enzimelor în sânge. Virusul hepatitei B poate determina hepatita fulminantă, cu progresie rapidă, adesea fatală ca formă de boală, în care porțiuni masive din ficat sunt distruse.

Pacienții bolnavi de hepatită acută sunt, adesea, recuperați. La unii pacienți totuși, nivelurile ridicate de antigen viral persistă în sânge o perioadă îndelungată sau nedefinită, producând o infecție cronică. Infecțiile cronice pot duce la hepatite cronice persistente. Pacienții infectați cu virusul hepatitei B persistent, în majoritate se găsesc în țările dezvoltate. La mijlocul anului 1991, existau aproximativ 225 milioane de purtători cronici de virus al hepatitei B numai în Asia și aproape 300 milioane de purtători în lumea întreaga. Hepatita cronică persistentă poate cauza extenuare, ciroza ficatului și carcinomul hepatocelular, un cancer primar hepatic.

în țările industrializate occidentale, grupurile cu un risc mare de infectare cu virusul hepatitei B includ acele persoane care vin în contact cu purtătorii de virus al

¢-2 0 0 9 - 0 0 7 5 3 - 2 0 - 0 2 - 1 9 9 2 hepatitei B sau cu probe din sângele acestora. Epidemiologie virusului hepatitei B este foarte asemănătoare cu cea a sindromului imunodeficienței dobândite, ceea ce explică de ce infecția cu virusul hepatitei B este comună printre pacienții cu sindromul SIDA sau cu complexul legat de sindromul imunodeficienței dobândite (SIDA). Cu toate acestea, virusul hepatitei B este mult mai contagios decât virusul imunodeficienței umane (HIV).

Un vaccin derivat din serul uman a fost dezvoltat pentru imunizarea pacienților față de virusul hepatitei B. în timp ce acesta a fost găsit eficient, producerea vaccinului este complicată deoarece furnizarea serului uman de la purtătorii cronici este limitată și procesul de purificare este lung și costisitor. Mai mult decât atât, fiecare serie de vaccinuri preparate din diferite seruri trebuie să fie testată pe cimpanzei pentru o siguranță mai bună. Vaccinurile au fost așadar produse prin inginerie genetică. Tratamentele zilnice cu interferonul alfa, o proteina de inginerie genetică, s-au arătat a fi promițătoare. Cu toate acestea, pentru datare, nu există nici un agent farmaceutic cunoscut care să inhibe efectiv replicarea virusului.

Pentru a lansa pe piață o nucleozidă pentru scopuri farmaceutice, aceasta trebuie să fie nu numai eficientă, cu o toxicitate scăzută, dar trebuie, de asemenea, să aibă un cost convenabil pentru a fi fabricată. O temă însemnată de cercetare și dezvoltare a fost orientată către procedee noi, cu costuri scăzute pentru producția de nucleozide pe scară largă. 2 ,3-didezoxinucleozidele sunt preparate, în mod curent printr-una din următoarele două căi: derivatizarea unei nucleozide intacte sau condensarea unui fragment de zahăr cu o bază heterociclică. Deși există numeroase dezavantaje asociate obținerii unor noi analogi de nucleozide prin modificarea unor nucleozide intacte, un avantaj major al acestui procedeu este acela că stereochimia absolută convenabilă a fost deja stabilită în mod natural. Cu toate acestea, procedeul nu poate fi utilizat în producerea de nucleozide care conțin fie baze care se produc în mod nenatural, fie fragmente de carbohidrați care se produc în mod nenatural (și care, pentru acest motiv, nu sunt preparate din nucleozide intacte), cum ar fi, de exemplu, 1,3-oxatiolan nucleozidele și 1,3-dioxolan nucleozidele.

în cazul în care se condensează un fragment carbohidrat sau un compus cu o structură asemănătoare unui carbohidrat cu o bază pentru a se forma o nucleozidă sintetică, nucleozidă care se produce are două centre chiralice (în pozițiile CT și C4')

2009-00755-“20 0 2~ 1 992-c și astfel există ca pereche diastereomerică. Fiecare diastereomer există ca un set de enantiomeri. De aceea, produsul este un amestec de patru enantiomeri.

Adesea s-a găsit că nucleozidele cu stereochimie produsă în mod nenatural fie în poziția ΟΓ, fie în poziția C4', sunt mai puțin active decât aceleași nucleozide cu stereochimie stabilită în mod natural. De exemplu, Carter și colaboratorii au raportat că, concentrația de (-)-enantiomer de carbovir (2',3'-didehidro-2',3'-didezoxiguanozina) în cultura de celule necesară pentru reducerea activității revers transcriptazei cu 50% (EC₅₀) este de 0,8 pM, în timp ce EC₅₀ pentru (+)-enantiomerul de carbovir este mai mare de 60 μΜ. AntimicrobialAgentsand Chemotherapy, 34: 6,1297-1300 (June 1990).

WO 91/11186, descrie că 1,3-oxatiolan nucleozidele pot fi preparate cu o diastereoselectivitate superioară (procentaj superior de nucleozide cu configurație (3 la legătura dintre atomul de carbon C1' și baza heterociclică), printr-o selecționare minuțioasă a acidului Lewis utilizat în procedeul de condensare. S-a descoperit, de asemenea, că condensarea nucleozidei 1,3-oxatiolan cu o bază, se produce cu o (3stereo specificitate aproape completă, atunci când clorura stanică este utilizată drept catalizator de condensare. Alți acizi Lewis determină o selectivitate d'-β joasă (sau nulă) sau nu pot cataliza reacțiile.

Având în vedere faptul că sindromul imunodeficienței dobândite, complexul legat de SIDA și virusul hepatitei B au înregistrat în lumea întreagă nivele epidemice și au efecte tragice asupra pacienților infectați, apare o mare necesitate de a se furniza noi agenți farmaceutici eficienți pentru tratamentul acestor boli care să aibă o toxicitate scăzută față de organismul gazdă.

Apare, de asemenea, necesitatea de a se găsi un procedeu viabil comercial, având un cost rentabil, pentru a se produce nucleozide importante din punct de vedere farmaceutic și care să atingă o β-stereospecificitate în poziția C4' a nucleozidelor sintetice preparate prin condensarea unui fragment cu o structură asemănătoare unui carbohidrat cu o bază.

Problema pe care o rezolvă invenția este de a prezenta un procedeu de separarare a derivaților de 1,3-oxatiolan.

Procedeul pentru separarea derivaților de 1,3 oxatiolan conform invenție, înlătură dezavantajele de mai sus prin aceea că, amestecul racemic de 2 hidroximetil-5-(5-

fluorocitosin-1 -il)-1,3-oxatiolan se supune unei etape de rezoluție sub acțiunea unei enzime selectată din grupul constând din esterază, lipază, substilizină, a-chimotripsină, citidin-dezoxicitidin dezaminază, care catalizează preferențial o reacție într-unul dintre enantiomeri, urmată de expunerea produsului rezultat la acțiunea unei a doua enzime selectată din grupul esterază, lipază, subtilizină α-chemotripsină care intensifică rezoluția prin favorizarea reacției de legare a unuia dintre enantiomeri, recristalizarea produsului de rezoluție și tratarea acestuia cu un acid chiral ales dintr-un grup constând din acid malic, acid mandelic, acid 10-camforsulfonic, acid 3-bromocamfor-8-sulfonic, acid di-benzoil tartric și acid di-para-toluoiltartric.

Prin aplicarea invenției se obțin următoarele avantaje:

- se obțin derivați de 1,3-oxatiolan cu activitate antivirală mărită;

- prezenta metoda este regioselectivă.

Procedeul pentru prepararea 2-hidroximetil-5-(5-fluorocitozin-1-il)-1,3-oxatiolan constă în reacția 5-fluorocitozinei, opțional protejată cu 1,3-oxatiolan având formula s-----^u în care R_1a este un atom de hidrogen sau o grupare de protecție hidroxi, o grupare acil și L este o grupare labilă; și opțional se îndepărtează orice grupare de protecție a grupării hidroxi.

Un alt procedeu pentru prepararea 2-hidroximetil-5-(5-fluorocitozin-1-il)-1,3oxatiolan constă în reacția unui compus de formula următoare

NHR_țt>

Ri. o

în care R_1a este o grupare de protecție a grupării hidroxi și R_1b este o grupare de protecție a grupării amino, cu un agent de fluorurare care introduce atomul de fluor în poziția 5 a ciclului citozinei și apoi, opțional, se îndepărtează grupele de protecție.

Un alt procedeu pentru prepararea 2-hidroximetil-5-(5-fluorocitozin-1-il)-1,3oxatiolan constă în reacția unui compus având formula

O

F

R,.°

în care R_1a este o grupă de protecție hidroxi, cu un agent care convertește grupa oxo în poziția 4 a ciclului uracil în grupa amino și apoi se îndepărtează grupele de protecție.

Derivatul de 1,3-oxatiolan se prepară prin (i) ozonizarea compusului cu formula CH₂=CH-CH₂-OR sau ROCH₂-CH=CHCH₂OR, în care radicalul R este o grupă de protecție, obținându-se compusul cu formula

H

R.

la (ii) reacționarea compusului obținut în faza (I) cu acid mercaptoacetic pentru a forma compusul cu structura ^R1a°

O (iii) reducerea compusului obținuți in faza (ii) și apoi aducerea în reacție a acestuia cu anhidrida acidului carboxilic, cu un agent de alchilare sau agent de halogenare pentru a se obține compusul cu formula

în care L este o grupă labilă.

Un alt obiect al invenției de față constă in compoziție farmaceutică ce conține drept compus activ un derivat de 1,3-oxatiolan și un purtător pentru administrare orală și este condiționat sub formă de capsulă sau sub formă de tabletă.

^-2009-00755--20-02-1992-ν | η,.Ου,ιί I

Deci, un obiect al prezentei invenții este o metodă și o compoziție pentru tratamentul pacienților umani infectați cu virusul imunodeficienței umane, HIV.

Un alt obiect al prezentei invenții este acela de a furniza o metodă și o compoziție pentru tratamentul pacienților umani sau a altor animale gazdă, infectate cu virusul hepatitei B, HBV.

Un alt obiect al prezentei invenții constă, de asemenea, în nucleozide îmbogățite enantiomeric în 1,3-oxatiolan.

Prezenta invenție mai conține o metodă de descompunere a enantiomerilor C4' ai nucleozidelor 1,3-oxatiolan.

Pentru tratamentul infecțiilor cu virusul imunodeficienței umane HIV și cu virusul hepatitei B, HBV, la oameni și la alte animale gazdă, conform prezentei invenții, pentru tratamentul menționat mai sus, se prevede administrarea unei cantități eficiente de 2hidroximetil-5-(5-fluorocitozin-1-il)-1,3-oxatiolan, un derivat al acestui compus acceptabil din punct de vedere farmaceutic, incluzând derivatul 5' sau N⁴ alchilat sau derivatul 5' sau N⁴ acilat sau o sare a acestui compus acceptabilă din punct de vedere farmaceutic, într-un vehicol acceptabil din punct de vedere farmaceutic.

De asemenea, s-a constatat că 2-hidroximetil-5-(5-fluorocitozin-1 -il)-1,3-oxatiolan (FTC), prezintă în mod surprinzător o activitate intensă față de virusul imunodeficienței umane, cu o toxicitate foarte redusă față de celula gazdă. De asemenea, s-a mai constatat că, compusul 2-hidroximetil-5-(5-fluorocitozin-1-il)-1,3-oxatiolan (FTC), prezintă o activitate foarte semnificativă față de virusul hepatitei B, HBV și de aceea poate fi utilizat pentru tratamentul pacienților care au o varietate de maladii asociate infecției cu virusul hepatitei B, HBV.

Studiile de toxicitate și de farmacocinetică confirmă completa utilizare a compusului 2-hidroximetil-5-(5-fluorocitozin-1 -il)-1,3-oxatiolan (FTC), ca agent antiviral pentru administrarea farmaceutică. Compusul FTC și enantiomerii acestuia sunt netoxici față de celulele măduvei osoase umane, periferice, la concentrații de peste 50 μΜ și alte linii celulare la concentrații de peste 200 μΜ. Compusul FTC-TP este un metabolit intracelular major în PBMC și celulele HepG2. Compusul FTC-TP inhibă competitiv virusul imunodeficienței umane HIV-1 ca revers transcriptaza (RT) cu K1 pentru 0,2 μΜ utilizându-se un poli(l)oligo(dC)templat-primer. Utilizându-se analize secvențiale,

--------_σ -----------compusul FTC-TP demonstrează a fi un terminator potent al catenei acidului dezoxiribonucleic ADN, când se utilizează virusul imunodeficienței umane HIV-RT (Cstop-uri).

Tratamentul cronic cu compusul FTC nu este toxic pentru animalele rozătoare, chiar în doze orale de 85 mg per kilogram pentru o zi, timp de cel puțin două luni. Studiile farmacocinetice ale compusului 2-hidroximetil-5-(5-fluorocitozin-1 -il)-1 3oxatiolan (FTC) la maimuțele rhesus indică o biodisponibilitate orală mare (aproximativ 73±6%) și o perioadă de înjumătățire plasmatică terminală de aproximativ 1,34±0,18 (media administrării orale și intravenoase).

în prezenta descriere se tratează, de asemenea, un procedeu pentru descompunerea unui amestec racemic al enantiomerilor nucleozidei, incluzând amestecul racemic de FTC, acesta incluzând faza de expunere a amestecului racemic la acțiunea unei enzime care în mod preferențial catalizează o reacție într-unul din enantiomeri. Procedeul poate fi utilizat pentru rezolvarea unei game largi de nucleozide, incluzând pirimidin nucleozidele și purin nucleozidele care, opțional, sunt substituite la partea de carbohidrat sau la partea de bază. Procedeul poate fi așadar utilizat pentru rezolvarea derivaților de nucleozide care conțin heteroatomi adiționali în partea de carbohidrat, de exemplu (±)-FTC și (±)-BCH-189. Rezoluția nucleozidelor poate fi realizată pe scară largă la costuri moderate. Utilizându-se modelele descrise în prezenta invenție, FTC poate fi separat în enantiomerii săi (+)-beta-D și (-)-beta-L. Enantiomerul (-)-beta-L pare a fi mult mai activ decât enantiomerul (+)-beta-D față de HIV, HBV și SIV. Enatiomerul (+) al FTC este, așadar, activ față de HIV, HBV și HIV.

Așa cum se utilizează în prezenta invenție, termenul de nucleozidă îmbogățită enantiomeric se referă la o compoziție de nucleozidă, inclusiv cel puțin 95% dintr-un singur enantiomer al acelei nucleozide.

Așa cum se utilizează în prezenta invenție, termenul de FTC se referă la compusul 2-hidroximetil-5-(5-fluorocitozin-1-il)-1,3-oxatiolan (forma racemică sau enantiomerii), așadar la compusul 2'-dezoxi-5-fluor-3'-tiacitidină.

Așa cum se utilizează în prezenta invenție, termenul (±)-FTC se referă la (±)beta-D, L-2-hidroximetil-5-(5-fluorocitozin-1-il)-1,3-oxatiolan.

Așa cum se utilizează în prezenta invenție, termenul (-)-FTC se referă la (-)-beta-

Ο Ο 9 Ο Ο 7 5 5 - -20-02-1992-“

7/3 ί '

L-2-hidroximetil-beta-5-(5-fluorocitozin-1-il)-1,3-oxatiolan.

Așa cum se utilizează în prezenta invenție, termenul (+)-FTC se referă la (+)beta-D-2-hidroximetil-5-(5-fluorocitozin-1 -il)-1,3-oxatiolan.

Așa cum se utilizează în prezenta invenție, termenii FTC-MP, FTC-DP și FTC-TP se referă la monofosfatul FTC, difosfatul FTC și respectiv trifosfatul FTC.

Așa cum se utilizează în prezenta invenție, termenul BCH-189 se referă la 2hidroximetil-5-(5-citozin-1 -il)-1,3-oxatiolan.

Așa cum se utilizează în prezenta invenție, termenul de cataliză enzimatică preferențială se referă la cataliza cu ajutorul unei enzime a unui substrat în locul altui substrat.

Așa cum se utilizează în prezenta invenție, o grupare mobilă reprezintă o grupare funcțională care se formează la o carbonatare incipientă, atunci când se separă de molecula de care este legată de această grupare.

în concluzie, în prezenta invenție se prezintă un procedeu de separare a unui amestec de derivați de 1,3 oxatiolan, iar prepararea compusului 2-hidroximetil-5-(5fluorocitozin-1-il)-1,3-oxatiolan, constă în:

(i) reacția dintre 5-fluorocitozină, opțional protejată, cu 1,3-oxatiolan având formula A:

în care R_1a este hidrogen sau o grupare de protecție a grupării hidroxil, incluzând o grupare acil și L este o grupare mobilă; și opțional se îndepărtează orice grupare de protecție a grupării hidroxil.

(ii) reacția compusului cu formula B:

L -^U. i.L. _y (în careR_1a este definit ca mai sus și R_1b este o grupare de protecție a grupării amino), cu un agent de fluorurare care participă la introducerea unui atom de fluor în poziția 5 a ciclului citozinic; sau (iii) reacția unui compus având formula C:

(în care radicalul R_1a este definit ca mai sus), cu un agent care participă la transformarea grupării oxo din poziția 4 a ciclului uracil, în grupare amino; orice grupare de protecție rămasă poate fi îndepărtată pentru a se obține compusul dorit.

f) un procedeu pentru separarea unui enantiomer (-) sau (+) al 2-hidroximetil-5(5-fluorocitozin-1-il)-1,3-oxatiolanului care constă în supunerea compusului sau derivatului (de exemplu a 5'-esterului) acestui compus sub forma unui amestec de enantiomeri (-) și (+) condițiile respective sau supunerea acțiunii reactivilor care servesc la separarea enantiomerilor și dacă este necesar, transformarea derivatului rezultat, în compusul de origine.

în procedeu, în etapa (i), gruparea de protecție a grupării hidroxi include grupările de protecție descrise în detaliu mai jos, incluzând grupările acil (de exemplu acetil), arilacil (de exemplu, benzoil sau benzoil substituit), tritil sau monometoxitritil, benzii sau benzii substituit, silii trisubstituit incluzând trialchilsilil (de exemplu, dimetil-t-butilsilil) sau difenilmetilsilil. Compusul 5-fluorocitozin poate fi, opțional, protejat cu grupări silii trisubstituite. Grupările de protecție pot fi îndepărtate prin orice metodă convențională. Gruparea mobilă L este o grupare mobilă tipică cunoscută în literatura de specialitate privind chimia nucleozidelor, de exemplu, un halogen cum arfi clorul sau bromul, alcoxi cum ar fi, de exemplu, metoxi sau etoxi sau acil cum ar fi, de exemplu, acetil sau benzoil.

Reacția (i) poate fi efectuată într-un solvent organic (de exemplu, 1,2-dicloretan sau acetonitril) în prezența unui acid Lewis, de preferință clorura stanică sau trimetilsilil triftalat.

Oh-2 009-00753-20-02-1992'' -A

Compușii cu formula A (în care L reprezintă o grupare acil, de exemplu, o grupare acetil), pot fi obținuți prin reacția compusului cu formula D

(în care R_1a este definit ca mai sus) cu un agent de reducere, de exemplu, hidrura de aluminiu-litiu, după care urmează tratarea cu un reactiv convențional potrivit, pentru a se obține compusul intermediar dorit, de exemplu, anhidrida acidului carboxilic, cum este anhidrida acetică, pentru acilare, reactivi de clorurare sau bromurare pentru halogenare sau reactivi de alchilare.

Compusul cu formula D poate fi preparat prin reacția compusului cu formula E

R $ ^B1a cu compusul HSCH₂CO₂H la o temperatură ridicată.

Compusul cu formula E poate fi preparat prin ozonoliză plecând de la un alil eter sau alil ester având formula CH₂=C-CH₂-OR sau un dieter sau un diester de 2-buten1,3-diol având formula RO-CH₂-CH=CH-CH₂-OR, în care R este o grupare de protecție, cum ar fi, de exemplu, o grupare alchil, silii sau acil.

Cu privire la etapa (ii) din procedeu, substituentul 5-fluor poate fi introdus prin metode cunoscute în literatura de specialitate (M. J. Robins și colaboratorii, în Nucleic Acid Chemistry, Part 2, L. B. Townsend and R. S. Tipson, editors, J. Wiley and Sons, New York, 895-900 (19/8) și referințele cuprinse; R. Duschinsky în Nucleic Acid Chemistry, Part 1, L. B. Townsend and R. S. Tipson, editors, J. Wiley and Sons, New York 43-46 (1978) și referințele cuprinse). Agentul de fluorurare poate fi, de exemplu, trimetilhipofluorit în fluortriclormetan.

Cu privire la etapa (iii) din procedeu, compusul cu formula C poate fi tratat cu 1,2,4-triazol, împreună cu 4-clorfenil diclorfosfat, pentru a forma compusul 4-(1,2,4-

ίΧ-2 Ο Ο 9 - Ο Ο 7 5 3 -2 Ο ~ Ο 2 ~ 1 9 9 2 ;]<)η triazoiIii) corespunzător, care este apoi transformat în compusul 4-amino(citidină) dorit, de exemplu prin reacția cu metanol.

Materialele inițiale cu formulele B și C pot fi preparate, de exemplu, prin reacția unei baze corespunzătoare (opțional protejate), cu un compus cu formula Ά într-o manieră asemănătoare celei descrise în etapa de procedeu (i). Compușii 5-fluorouracil și 5-fluorocitozină sunt compuși comerciali furnizați de la firma Aldrich Chemical Co., Milwaukee, Wl 53233, USA.

Rezoluția enantiomerilor (±) poate fi completată așa cum se va specifica în detaliu în continuare.

Compusul FTC poate fi transformat în esterul acceptabil din punct de vedere farmaceutic, prin reacția cu un agent de esterificare convenabil, de exemplu, o halogenură acidă sau o anhidridă. Compusul FTC sau derivatul acceptabil din punct de vedere farmaceutic al acestui compus, poate fi transformat într-o sare acceptabilă din punct de vedere farmaceutic, într-o maniară convenabilă, de exemplu, prin tratarea cu o bază corespunzătoare. Esterul sau sarea compusului FTC se pot transforma în compusul FTC, de exemplu prin hidroliză.

I. Prepararea compușilor activi.

Amestecul racemic al compusului FTC poate fi preparat conform metodei descrise în detaliu în publicarea cererii PCT, WO 91/11186, publicat pe 8 august 1991, având ca titular Emory University, sau prin procedeul descris în exemplul 1. în general, metoda include ozonizarea fie a unui eter alilic sau a unui ester alilic avâd formula CH₂=CH-CH₂-OR sau a unui dieter sau diester al 2-buten-1,3-diolului având formula RO-CH₂-CH=CH-CH₂-OR, în care radicalul R este o grupare de protecție, cum ar fi de exemplu alchil, silii sau o grupare acil, pentru a forma o glicoaldehidă având formula OHC-CH₂-OR; adăugarea acidului tioglicolic la glicoaldehidă pentru a forma o lactonă cu formula 2-(R-oxi)-metil-5-oxo-1,3-oxatiolan; reducerea lactonei la diferiți compuși conținând o grupare mobilă în poziția 5 a ciclului oxatiolanic; cuplarea acestor compuși cu 5-fluorocitozin-siliat în prezența SnCI₄ pentru formarea izomerului beta al FTC; și opțional îndepărtarea grupelor de protecție.

Se dau în continuare exemplele de realizare a invenției în legătură cu figurile 112, care reprezintă:

<Χ_-2 Ο Ο 9 - Ο Ο 7 5 3 - -

- 2 Ο - Ο 2 - 1 9 9 2 - - < . . ---------_ν-;

- figura 1, ο ilustrare a structurii chimice a compusului 2-hidroximetil-5-(5fluorocitozin-1 -il)-1,3-oxătiolan (FTC);

- figura 2, o ilustrare a procedeului pentru prepararea compusului 2-hidroximetil5-(5-fluorocitozin-1 -il)-1,3-oxatiolan;

- figura 3, o diagramă a fluxului specificității fosfatazei alcaline și a fosfodiesterazei din veninul de șarpe, pentru enantiomerii (+) și (-) ai compusului FTC;

- figura 4, un grafic indicând evoluția hidrolizei catalizate de lipază, a esterului 5¹butiril al compusului FTC în timp, utilizându-se enzimele Amano PS-800® (pătrat deschis) și PLE (cerc deschis punctat);

- figura 5, un grafic al efectului concentrației (μΜ) a compușilor racemici și enantiomerilor îmbogățiți ai FTC (preparați prin metoda din exemplul 4) față de procentul de inhibare al celulelor PBM umane infectate cu HIV-1 (cerc închis, (±)-FTC), (cerc deschis, (-)-FTC), (suprafață închisă, (+)-FTC);

- figura 6, un grafic al concentrației de compus FTC (μΜ) îmbogățit racemic și enantiomeric (preparat prin procedeul din exemplul 3) asupra procentului de inhibare a celulelor PBM umane infectate cu HIV-1 (cerc închis, (±)-FTC), (cerc deschis, (-)FTC), (pătrat închis, (+)-FTC);

- figura 7, un grafic al absorbției compusului (±)-FTC saturat cu tritiu, în celulele PBM umane (media a două determinări) în timp (ore) față de celulele pmol/10⁶;

- figura 8, un grafic al ieșirii compusului (±)-FTC radiomarcat din celulele PBM umane, măsurată în ore față de celulele pmol/10⁶;

- figura 9, prezența compusului [³H](±)-FTC și a derivaților fosforilați ai acestuia în celulele HepG-2 umane (media a două determnări), incubate într-un mediu care conține 10 μΜ [³H](±)-FTC, măsurat în celulele pmol/10⁶ în timp;

- figura 10, ieșirea compusului [³H](±)-FTC și a derivaților fosforilați ai acestuia în celulele HepG-2 umane în pmol/10⁶ celule față de celule depășite ca timp după impulsionarea celulelor cu 10 μΜ [³H](±)-FTC (700 DPM/pmol) pentru 24 de ore și evaluarea concentrației compusului la 24 de ore după eliminare;

- figura 11, descreșterea în concentrația combinată a [³H](±)-FTC și în derivații fosforilați ai acestuia din celulele HepG-2 umane după incubare cu 10 μΜ [³H](±)-FTC (700 DPM/pmol) timp de 24 de ore, în pmol/10⁶ celule depășite ca timp;

(χ-2009'00753--2 0 - 0 2 - 1 9 9 2 --

- figura 12, un grafic al efectului enantiomerilor FTC asupra formării coloniei de celule precursoare granulocitmacrofage, așa cum s-au măsurat, în procente de supraviețuire față de concentrația în pM (-)-FTC, cerc deschis; (+)-FTC cerc închis; AZT, pătrat închis.

Exemplul 1. Prepararea compusului(±)-beta-D,L-2-hidroximetil-5-(5-fluorocitozin1-il)-1,3-oxatiolan

Procedeul pentru prepararea amestecului racemic al compusului FTC este ilustrat în figura 2 și este descris în detaliu mai jos.

Protecția 2-buten-1,4-diolului într-un flacon de 2 litri, cu 3 gâturi, uscat, în atmosferă inertă, 100 grame (93,5 mililitri = 1,135 moli = 1,00 echivalenți) 2-buten-1,4-diol și 15 grame (aproximativ 0,1 echivalenți) de DMAP (4-dimetilaminopiridiă) se dizolvă în 800 mililitri de piridină uscată și se menține sub agitare în timp ce amestecul de reacție se răcește până la 0°C. Apoi se adaugă încet pentru prevenirea supraîncălzirii, clorura de butiril (260 mililitri = 2,2 echivalenți) și amestecul se mai lasă sub agitare timp de o oră. Reacția este terminată prin adăugarea în ulei de cantități mici de apă cu gheață. Lichidul este apoi decantat din sare și evaporat sub vid. Sarea care rămâne este dizolvată în apă și soluția apoasă este extrasă de două ori cu eter etilic. Celelalte straturi combinate sunt spălate odată cu o soluție saturată de CuSO₄, de două ori cu o soluție saturată de NaHCO₃ conținând Norit® și apoi se filtrează sub vid printr-un filtru de celită®.

Amestecul de reacție concentrat este dizolvat în eter și spălat, urmând același procedeu ca mai sus pentru soluția de sare. Straturile organice combinate sunt concentrate pe evaporatorul rotativ și apoi sunt aduse sub vid. Pentru ca această reacție să decurgă cantitativ, este necesar mediul închis. Vidul poate fi crescut atât cât este necesar. Produsul, 1,4-dibutiril-2-buten-1,4-diol, este incolor până la ușor galben, sub forma unui lichid clar.

Ozonoliza diolului protejat

Compusul 1,4-dibutiril-2-buten-1,4-diol (1,365 moli) este dizolvat în 4 litri de clorură de metilen (CH₂CI₂) uscată, într-un flacon uscat prevăzut cu 3 gâturi, de 5 litri capacitate, echipat cu un tub larg de uscare și un tub deschis pentru introducerea gazului. Tubul este un tub de barbotare a gazului, nefritat, care se va obtura prin ον 2 0 0 9 - 0 0 7 5 3 --

- 2 0 - 0 2 - 1 9 9 2 -- ^Ί ' ' - - —,---expunere la soluția concentrată. Soluția este apoi agitată și răcită până la temperatura de -70°C, în timp ce gazul inert este barbotat prin soluție. Orificiul de intrare a gazului este sigilat în timp ce soluția este răcită suficient și flaconul și aparatul de agitare este transferat la generatorul de ozon. Oxigenul este barbotat prin soluția menținută sub agitare, timp de cel puțin 20 de minute, în timp ce se menține pe o baie de gheață. Un aparat Cryocool este ideal pentru menținerea unei temperaturi scăzute pentru o reacție de durată îndelungată. Ozonul este apoi introdus la 0,56 kg/cm²-0,60 kg/cm² (8 până la 8,5 psi). După completare, fluxul de ozon este oprit și oxigenul este barbotat prin soluție, timp de aproximativ o jumătate de oră, înainte de adăugarea a 3 echivalenți de Me₂S. Flaconul este apoi îndepărtat de pe baia de gheață și transportat într-o nișă, unde se menține sub agitare timp de aproximativ 2 zile pentru a obține o reducere completă. Soluția este apoi evaporată și adusă sub vid pentru mai multe ore.

Această reacție produce, în mod obișnuit, aproximativ 95% de aldehidă protejată (2-butiriloxiacetaldehidă), un lichid clar, incolor până la galben.

Ciclizarea aldehidei cu acid mercaptoacetic

Aldehidă (1,0 echivalenți) este dizolvată în toluen pentru a se obține o soluție de 0,80 până la 0,85 M, care se aduce într-un flacon prevăzut cu un dispozitiv separator de tip Dean Stark. Se adaugă acidul tioglicolic (1,1 echivalenți) și amestecul este încălzit la temperatura de reflux. Apa este îndepărtată azeotropic cu ajutorul separatorului. Recția este completă în 3 ore și amestecul este menținut la rece la temperatura camerei. Soluția organică este spălată de două ori cu volume egale de soluție apoasă saturată de bicarbonat de sodiu NaHCO₃ și apoi este spălată o dată cu apă, uscată pe sulfat de magneziu MgSO₄ și Norit, după care se filtrează sub vid prin celită, înainte de a fi evaporată sub vid. Prima soluție apoasă de bicarbonat de sodiu NaHCO₃ este extrasă o dată cu eter; eterul este spălat o dată cu apă, uscat pe sulfat de magneziu MgSO₄ și Norit®, filtrat prin celită® sub vid și evaporat la un loc cu alte materiale organice, din soluția de toluen. Materialul combinat este plasat sub vid până a doua zi.

în mod uzual, prin reacție se obține un randament de 90% din compusul 2(butiriloxi)-metil-5-oxo-1,3-oxatiolan.

Reducerea lactonei și conversia în acetat

Compusul 2-butiriloxi-metil-5-oxo-1,3-oxatiolan (1,00 echivalent) se dizolvă în

6C-2 Ο Ο 9 - Ο Ο 7 5 3 ' ... ... ' Lvv^U' . _ζ tetrahidrofuran (THF) uscat, pentru a se obține o soluție 0,23 M care se aduce într-un flacon uscat prevăzut cu 3 gâturi și echipat cu un agitator mecanic și se menține în atmosferă inertă. Soluția este agitată și răcită până la temperatura de 0°C, după ce s-a adăugat, prin canulă, un echivalent de 1,0 M Li (t-BuO)₃AIH în tetrahidrofuran (THF). Reducerea este completă în aproximativ trei ore, așa cum este observat prin cromatografie în strat subțire TLC, utilizându-se ca sistem de solvenți, 2 părți eter și 1 parte hexan și anisaldehidă drept colorant.

Aproximativ 10 echivalenți de Ac₂O proaspăt distilat se adaugă apoi și se ține sub agitare timp de 2 zile, pentru a se obține produsul acetilat. Reacția este finalizată prin adăugarea soluției saturate de bicarbonat de sodiu NaHCO₃, care se menține sub agitare până a doua zi. Soluția este apoi evaporată și supusă agitării cu mai multă soluție de bicarbonat de sodiu NaHCO₃ până a doua zi. Această soluție este, apoi extrasă cu eterul care este apoi spălat (cu atenție) de două ori cu soluție saturată de bicarbonat de sodiu NaHCO₃ și o dată cu apă, apoi este uscată pe sulfat de magneziu MgSO₄ și Norit®, după care se filtrează prin celită® sub vid și se evaporă. Produsul este un lichid clar, de culoare galben închis. Analiza gaz-cromatografică (Temperatura inițială - 80°C; Timp inițial = 5 minute; Gradul de progresie - 10/minut; Temperatura finală = 240°C) indică o puritate tipică de aproximativ 70%.

Sililarea compusului 5-fluorocitozină

5-fluorocitozina (1,05 echivalenți pe baza cantității de lactol acetilat obținut în faza precedentă utilizându-se metoda gaz-cromatografică pentru indicarea purității) este sililată prin refluxare în cel puțin 10 echivalenți de hexametildisilazan conținând o cantitate catalitică de sulfat de amoniu pur (0,05 până la 0,10 echivalenți) timp de două ore, după care soluția devine clară. Flaconul este apoi sigilat strâns și solventul este îndepărtat, utilizându-se o pompă de vacuum cu un separator auxiliar. Produsul, în formă solidă de culoare albă este lăsat sub vid până a doua zi până ce este gata de utilizare în următoarea fază de reacție de cuplare.

Cuplarea compusului 5-fluorocitozină sililată, cu lactol acetilat

Compusul 5-fluorocitozină sililată (33,86 grame, 0,124 moli), în diclormetan uscat (350 mililitri) formează o soluție la care se adaugă o soluție de tetraclorură de staniu SnCI₄ (135,6 mililitri o soluție 1 molară în clorură de metilen CH₂CI2) în atmosferă de

O-“ 2 0 0 9 ”00 7 5 5 ^m - 2 0 - 0 2 - 1 9 9 2 -^rod. 7’ ‘------- “ azot. Soluția este agitată timp de 15 minute la temperatura camerei. Această soluție este adăugată la soluția de lactol acetat printr-un tub subțire (38 grame, 0,113 moli) în diclormetan (400 mililitri) sub atmosferă de azot, timp de peste 30 de minute.

Soluția de reacție este agitată timp de 2 ore, punct în care reacția este completă, așa cum s-a indicat prin analiza cromatografică în strat subțire. Soluția de reacție este apoi diluată cu diclormetan (500 mililitri) și reacția este oprită la adăugarea soluției de hidroxid de amoniu. Soluția de hidroxid de amoniu (100 de mililitri) se adaugă lent menținând temperatura de reacție sub 30°C, având ca rezultat formarea unui precipitat alb. Amestecul este apoi ținut sub agitare pentru încă 30 de minute și apoi se trece printr-o coloană sub formă de dop de silica gel (7 inchi 17,78 cm diametru și 2 inchi 5,08 înălțime). Coloana este eluată secvențial cu diclormetan (2 litri), acetat de etil (2 litri) și amestec format din 9 părți acetat de etil și 1 parte etanol (4 litri). Eluentul acetat de etil și amestecul de acetat de etil și etanol conțin produsul dorit. Aceste soluții sunt combinate și evaporate la presiune redusă. Produsul solid lipicios rezidual este apoi spălat cu eter uscat (20 mililitri) pentru a se obține un produs solid alb (25,35 grame; 71%), de FTC-5'-butirat.

Produsul FTC-5'-butirat (8,74 grame; 0,026 moli) este dizolvat în 250 mililitri de metanol. Metoxidul de sodiu (2,85 grame; 0,052 grame) se adaugă la temperatura camerei. Amestecul de reacție este menținut sub agitare timp de 1 oră, punct în care reacția este completă, așa cum s-a confirmat prin analiza cromatografică în strat subțire TLC. Soluția de clorură de amoniu NH₄CI (10 mililitri) se adaugă pentru oprirea reacției și apoi solventul este îndepărtat sub presiune redusă. Reziduul este apoi absorbit pe gel de silice (5 grame) și trecut pe o coloană îngustă, utilizându-se ca eluant un amestec format din 9 părți acetat de etil și 1 parte etanol. Fracțiunile care conțin produsul sunt combinate și evaporate, când se obține un produs solid lipicios care este spălat cu eter uscat, când se formează un produs solid de culoare albă FTC (6 grame, 88%).

Analiza de rezonanță magnetică nucleară are următoarele rezultate:

(¹H RMN: (DMSO-d₆) 8,18 (1H, d, H₆, J = 8,4 Hz), 7,81 & 7,57 (2H, extins, NH₂), 6,12 (1H, dd, H₁₍ J = 5,7 &4,2 Hz), 5,40 (1H, t, OH, J = 5,7 Hz), 5,17 (1H, t, 1H₄, J = 3-6 Hz), 3,74 (2H, m, 2H₅), 3,41 (1H, dd, 1H₂, J = 5,7 & 11,7 Hz), 3,11 (1H, dd, 1H₂, J = 4,2 % 11,7 Hz);

^-2009-00753“2 0 “ 0 2 - 1 9 9 2 ^Ugusi ν, ζ.''- ‘'m') ¹³ C RMN: (DMSO-d₆) 157,85 (d, J = 13,4 Hz), 153,28, 136,12 (d, J = 241 Hz), 126,01 (d, J = 32,6 Hz), 86, 90, 86, 84, 62, 48, 37, 07; punct de topire 195-196°C.

II. Rezoluția enantiomerilor nucleozidei

O metodă este prezentată în prezenta invenție, pentru rezoluția amestecurilor racemice a enantiomerilor nucleozidei, incluzând fără a se limita la aceasta, enantiomerii FTC (+) și (-). Metoda poate fi utilizată așadar, pentru separarea amestecurilor racemice de carbohidrați sau porțiunii cu structură asemănătoare carbohidraților, cum arfi, de exemplu, derivații de 1,3-oxatiolan și 1,3-dioxolan. Metoda constă în utilizarea unei enzime care catalizează preferențial o reacție a unui enantiomer într-un amestec racemic. Enantiomerul reacționat este separat de enantiomerul nereacționat pe baza unei noi diferențe în structura fizică. Prin descrierea dată și din literatura de specialitate apare posibilitatea de a se alege o enzimă care este selectivă pentru enantiomerul nucleozidei la alegere (sau selectivă pentru enantiomerul nedorit, ca o metodă de eliminare a acestuia), prin selectarea uneia din enzimele care se vor discuta mai jos sau prin evaluarea sistematică a altor enzime cunoscute. Din literatura de specialitate, se cunoaște așadar modul în care se modifică substratul atât cât este necesar pentru a se ajunge la rezoluția dorită. Prin utilizarea agenților de deplasare prin rezonanță magnetică nucleară chirală, prin polarimetrie sau cromatografie lichidă de înaltă performanță chirală, se poate determina înnobilarea optică a esterului separat. Următoarele exemple ilustrează, în continuare, utilizarea enzimelor pentru separarea amestecurilor racemice a enantiomerilor. Alte metode cunoscute de rezoluție a amestecurilor racemice, se pot utiliza în combinație cu metoda de rezoluție descrisă în prezenta invenție. Toate aceste modificări sunt considerate ca făcând parte din scopul acestei invenții.

Rezoluția bazată pe hidroliza esterilor nucleozidei C5'

Metoda include reacția gruparerii C5’-hidroxil a amestecului racemaților nucleozidei cu un compus acil pentru a forma esterii C5' în care nucleozidă este la capătul carbinol al esterului. Amestecul racemic al esterilor C5' de nucleozidă este apoi tratat cu enzima care taie sau hidrolizează preferențial la unul din enantiomeri și nu în celălalt, într-o perioadă de timp dată.

Un avantaj al acestei metode este acela că, metoda poate fi utilizată pentru ^“2009’00753- 2 0 - 0 2 - 1 9 9 2 Cod.

separarea unei varietăți largi de nucleozide, incluzând pirimidin nucleozida și purin nucleozida care sunt, în mod opțional, substituite în partea de carbohidrat sau în partea de bază. Metoda poate fi, așadar, utilizată pentru separarea derivaților nucleozidici care conțin heteroatomi adiționali în partea de carbohidrat, de exemplu FTC și BCH-189. Aplicabilitatea largă a acestor metode rezidă parțial în faptul că, deși porțiunea de carbinol a esterului joacă un rol în abilitatea unei enzime de diferențiere a enantiomerilor, porțiunea de recunoaștere majoră pentru aceste enzime este porțiunea acidului carboxilic al esterului. Mai mult decât atât, se poate extrapola cu succes rezultatul obținut de la o enzimă față de studiul pe substratul altei enzime în sistem aparent diferit, asigurând că porțiunile acidului carboxilic ale celor două substraturi sunt aceleași sau substranțial similare.

Un alt avantaj al acestei metode este acela că metoda aceasta este regioselectivă. Enzimele care în mod tipic hidrolizează esterii, nu catalizează reacțiile străine în alte porțiuni ale moleculei. De exemplu, enzima lipază, catalizează hidroliză esterului de 2-hidroximetil-5-oxo-1,3-oxatiolan fără să hidrolizeze lactona internă. Aceasta contrastează marcant cu metodele chimice de hidroliză a esterului.

încă un avantaj al acestei metode este acela că separarea enantiomerul nehidrolizat și a enantiomeruli hidrolizat din amestecul de reacție, este foarte simplă. Enantiomerul nehidrolizat este mai lipofilic decât enantiomerul hidrolizat și poate fi recuperat eficient prin simpla extracție cu unul dintr-o largă varietate de solvenți organici nepolari sau din amestecuri de solvenți, incluzând hexanul și amestecul de hexan și ester. Enantiomerul hidrolizat, mai polar, cel mai puțin lipofilic, poate fi obținut apoi prin extracție cu solvenți organici mult mai polari, de exemplu, acetatul de etil, sau prin liofilizare, după care urmează extracția cu etanol sau metanol. Alcoolul trebuie să fie evitat în timpul hidrolizei, deoarece acesta poate denatura enzimele în anumite condiții.

Enzimele și substraturile

Cu o combinare potrivită a enzimei și substratului, condițiile pot fi stabilite pentru izolarea oricărui enantiomer de nucleozidă. Enantiomerul dorit poate fi izolat prin tratamentul amestecului racemic cu o enzimă care hidrolizează enantiomerul dorit (după care urmează extracția hidrolizatului polar cu solvent polar) sau prin tratamentul cu o enzimă care hidrolizează enantiomerul nedorit (după care urmează îndepărtarea

enantiomerului nedorit cu un solvent nepolar).

Enzimele care catalizează hidroliza esterilor, includ esterazele, de exemplu esteraza din ficat de porc, lipazele incluzând lipaza pancreatică de porcine și Amano PS-Boo, lipaza, substillisin șl alfa-chimotripsina.

Figura 3 reprezintă diagrama fluxului specificității fosfatazei alcaline și fosfodiesterazei din veninul de șarpe, pentru enantiomerii (+) și (-) ai compusului FTC. Așa cum este indicat, fosfataza alcalnă hidrolizează trifosfatul ambilor enantiomeri la compusul FTC și de aceea nu este eficientă ca un mijloc de separare. Fosfodiesteraza I, hidrolizează preferențial izomerul (+) al compusului FTC în monoesterul acestuia, care apoi poate fi expus la 5'-nucleotidază pentru a obține compusul (+)-FTC.

Gruparea acil cea mai eficientă pentru esterificareaîn poziția C5' a nucleozidei, poate fi determinată fără o experimentare nepotrivită, prin evaluarea unui număr de omologi, utilizându-se un sistem de enzime selectate. De exemplu, când 1,3-oxatiolan nucleozidele sunt esterificate cu acidul butiric, rezoluțiile atât cu esteraza din ficat de porc cât și cu esteraza Amano PS-800, se procedează cu o enantioselelctivitate superioară (94-100% exces enantiomeric) și selectivitate opusă. Esteraza în ficatul de porc hidrolizează preferențial enantiomerul (+) al compusului FTC și enzimă Amano800C hidrolizează preferențial enentimerul (-) al compusului FTC. Procentul de exces enantiomeric raportat la tabelul 1 este cantitatea de ester butirat purificată, care rămâne în amestecul tratat enzimatic (de exemplu, esterul butiric al enantiomerului (-) al compusului FTC în cazul esterazei din ficatul de porc și esterul butiric al enantiomerului (+) al compusului FTC în cazul Amano PS-800).

Exemplele nelimitate de grupări acil care pot fi evaluate pentru utilizare cu un amestec enantimeric de nucleozide și în special enzime, include acizii alchil carboxilici și acizii carboxilici alchilați substituiți, incluzând acidul acetic, acidul propionic, acidul butiric și acidul pentanoic. împreună cu anumite enzime, se preferă să se utilizeze un compus acil care este lipsit, în mod semnificativ, de electroni liberi pentru a facilita hidroliza prin slăbirea legăturii esterice. Exemplele de grupări acil lipsite semnificativ de electroni liberi includ alfa-haloesterii cum ar fi acidul 2-cloropropionic, acidul 2clorobutiric și acidul 2-cloropentanoic. Alfa-haloesterii sunt substraturi excelente pentru lipaze.

Condițiile de rezoluție

Hidrolizele enzimatice sunt efectuate, în mod obișnuit, cu o cantitate catalitică de enzimă într-o soluție apoasă de tampon care are pH-ul optim apropiat de enzima discutată. Așa cum se desfășoară reacția, valorile pH rezultă din eliberarea acidului carboxilic. Baza apoasă se va adăuga pentru menținerea valorii de pH aproape de valoarea optimă pentru enzimă. Procesul reacției poate fi ușor determinat prin monitorizarea schimbării de pH și prin cantitatea de bază necesară pentru menținerea pH-ului. Esterul hidrofobic (enantiomerul nehidrolizat) și alcoolul mult mai polar (enantiomerul hidrolizat pot fi secvențial și selectivi extrași din soluție printr-o alegere judicioasă a solvenților organici. în mod alternativ, materialul care trebuie separat, poate fi trecut printr-o coloană care conține enzima imobilizată pe un suport solid. Hidrolizele enzimatice realizate în condiții heterogene pot suferi de o reproductibilitate redusă. De aceea, este de preferat ca hidroliza să se efectueze în condiții omogene. Solvenții alcoolici nu sunt preferați, deoarece aceștia pot denatura enzimele. Omogenitatea poate fi obținută prin utilizarea unor agenți tensioactivi neionici, ca de exemplu Triton X-100. Cu toate acestea, adiția acestor agenți tensioactivi nu ajută numai la dizolvarea materialului inițial, ci ei contribuie, de asemenea, la solubilitarea în apă a produsului. De aceea, reacția enzimatică poate să aibă loc mult mai eficient prin adiția unui agent tensioactiv neionic decât în condiții heterogene, izolarea atât a materiei prime cât și a produsului rezultat, putând fi efectuată mult mai dificil. Produsul poate fi izolat prin procedee chimice și cromatografice mult mai convenabil (de exemplu, formarea sării selective). Nucleozidele diacilate pot fi utilizate, dar adesea sunt foarte lipofile și tari, pentru a putea fi dizolvată în mediul utilizat.

Exemplul 2: Hidroliza enantioselectivă a compusului FTC, catalizată de lipază

Un număr de derivați 5'-O-acil ai compusului FTC sunt preparați prin O-acilare selectivă a sării N-clorhidrat (vezi tabelul 1 și Figura 4) a compusului (±)-FTC. A fost investigată eficiența hidrolizei derivaților prin lipaze. Așa cum se arată în tabelul 1, esteraza din ficatul de porc (PLE) prezintă un nivel superior de selectivitate pentru hidroliza esterului enantiomerului (+) al compusului FTC, prin eliminarea predominantă a butiratului enantiomerului (-) al compusului FTC în amestecul analizat prin cromatografie lichidă de înaltă performanță. Din contra, enzima PS-800 hidrolizează

' v —r-«) esterul enantiomerului (-) al compusului FTC preferențial, prin eliminarea predominantă a butiratului compusului enantiomerului (+) al FTC în amestecul analizat prin cromatografie lichidă de înaltă performanță. Gradul de hidroliză s-a găsit a fi dependent de natura grupării acil; derivatul acetil este semnificativ mai inactiv decât derivatul butiril. S-a descoperit acum că, gradul de hidroliză a esterului acidului propionic al compusului FTC este chiar mai rapid decât cel· observat pentru derivatul butirat. Procentul de separare și procentul de exces enantiomeric se determină, ambele, utilizându-se cromatografia lichidă de înaltă performanță HPLC. Așadar, enantioselectivitatea este ^eXCe^^{tă Când Se utilizează esteraza} din ficatul de porc (PLE) (în mod obișnuit este de 97%, sau mai mare), îmbogățirea adițională poate fi însoțită de reacții de hidroliză -fc___ enzimatice secvențiale, în care butiratul enantiomeric îmbogățit de hidroliză catalizată de enzima din ficatul de porc PLE, este supus la o hidroliză enzimatică cu PS-800.

Tabelul 1

Compararea efectului esterului asupra hidrolizei enzimatice

Substratul	%Separare	%E.E. (s.m.)
Esteri de FTC cu PLE:
		(-)-FTC (butirat)
acetat	32,68	N.D.
propionat	39,87	N.D.
butirat	48,00	98
butirat	45,71	98,6
Esteri de FTC cu PS-800:
		(+)-FTC (butirat)
acetat	73,17	N.D.
propionat	52,67	___________N.D._________
butirat	58,34	___________N.D,________
butirat	________41,50_________	___________94___________

Exemplul 3. Procedeu de preparare a (+)- și (-)-FTC prin hidroliza enantioselectivă a butiratului de FTC, catalizată de lipază

5'-0-butiratul compusului (±)-FTC (0,47 mmoli, 149 miligrame) se dizolvă în 16 mililitri de soluție formată din 4 părți· soluție tampon și 1 parte CH₃CN la pH=8. Soluția clară este agitată și tratată cu 26 miligrame de esterază din ficatul de porc (PLE-A). Evoluția reacției este monitorizat prin cromatografie lichidă de înaltă performanță (HPLC) (Figura 4). După 20 de ore (conversie 52%), amestecul de reacție este extras de două ori cu câte 80 mililitri de CHCI₃ cloroform și apoi cu 80 de mililitri de acetat de etil. Stratul organic al extractelor este combinat, uscat pe sulfat de magneziu anhidru MgSO₄, apoi este filtrat și concentrat prin evaporare la rotavapor. Reziduul astfel rezultat este eluat pe discuri 2x1000 m pTLC utilizându-se acetatul de etil ca eluant (eluție dublă) pentru a se obține după izolare 53 miligrame (36% pe baza materialului inițial) de butirat FTC care este determinat prin analiza cromatografică lichidă de înaltă performanță HPLC ca având un exces enantiomeric de 98%. Butiratul enantiomeric îmbogățit este apoi tratat cu 1,6 mililitri de metanol și apoi cu 0,38 mmoli (20 miligrame) de metoxid de sodiu. Amestecul care rezultă este agitat la temperatura camerei și evoluția reacției este monitorizată prin cromatografie lichidă deînaltă performanță, HPLC. Reacția este completă în 30 de minute. Solventul este îndepărtat prin evaporare la rotavapor pentru a se obține un produs brut solid, de culoare albă (76 miligrame) care este eluat pe 1000 m pTLC utilizând ca eluant un amestec format din 5 părți de acetat de etil și 1 parte de etanol. Enantiomerul (-) al FTC este izolat ca produs solid de culoare albă (33 miligrame; 82% randament). Prin analiza cromatografică de înaltă performanță HPLC a compusului FTC ca derivat 5'-O-acetat, arată 97% exces enantiomeric (e.e.): [a](^2o,D)-12O, 5° (c=0,88; în etanol absolut). Emulsiile în fază de prelucrare trebuie să fie evitate prin adăugare de cloroform HCCI₃ la amestecul de reacție pentru completare (care servește așadar pentru denaturarea enzimei), urmând apoi striparea solvenților sub vid și apoi extragerea cu cloroform HCCI₃.

în mod similar, 1,2 mmoli (375 miligrame) de 5'-0-butirat de (±)-FTC se dizolvă în 40 mililitri de amestec format din 4 părți soluție tampon pH=8 și 1 parte CH₃CN. Soluția clară este agitată și tratată cu 58 miligrame de esterază de ficat de porc (PLEA). Evoluția reacției este monitorizat prin cromatografie lichidă de înaltă performanță

0-1009-00755HPLC. După 90 de minute (38% conversie), amestecul de reacție este adăugat la 150 mililitri de cloroform HCCI₃. Straturile sunt separate și stratul apos estediofilizat pentru îndepărtarea solventului. Reziduul alb de la liofilizare este extras de 3 ori cu câte 10 mililitri de etanol absolut. Extractele sunt filtrate, combinate și concentrate în vacuum pentru a se obține 179 miligrame de ulei brut. Materialul brut este apoi eluat pe o coloană de silica gel de 45 x 30 milimetri utilizându-se ca eluant un amestec format din 3 x 75 mililitri de acetat de etil și 5 părți acetatul de etil cu 1 parte etanol. Produsul (+)FTC este izolat sub formă de solid alb (109 miligrame; 37% pe baza butiratului inițial). Analiza cromatografică de înaltă performanță HPLC a compusului (+)-FTC ca derivat 5'-O-acetat, arată 97,4% exces enantiomeric; [a]O(20,D)+113,4°(c=2,53; etanol absolut).

O reacție similară este efectuată utilizând 0,12 mmoli (37 miligrame) de 5'-Obutirat de FTC și 7 miligrame de PS-800 în 4,0 mililitri amestec format din 4 părți soluție tampon pH=8 și 1 parte metilcian CH₃CN. Reacția este considerabil mai slabă decât cea cu esterază din ficatul de porc PLE-A și necesită 74 de ore pentru 59% conversie. Butiratul separat (11,4 miligrame; 31% din cantitatea inițială) prezintă 94% exces enantiomeric e.e., prin cromatografie lichidă de înaltă performanță HPLC.

Rezoluția enantiomerilor nucleozidei, cu citidin-dezoxicitidin dezaminaza în mod alternativ, citidin-dezoxicitidindezaminazaeste utilizată pentru separarea amestecurilor racemice de 2-hidroximetil-5-(citozin-1 -il)-1,3-oxatiolan și derivații acestui compus, incluzând 2-hidroximetil-5-(5-fluor-citozin-1 -il)-1,3-oxatiolan.

Enzima catalizează dezaminarea jumătății de citozină, la un uracil. S-a descoperit că unul din enantiomerii 1,3-oxatiolan nucleozidei este substrat preferat pentru citidindezoxicitidindezaminaza. Enantiomerul care nu este convertit în derivatul de uracil (și de aceea este încă bazic), este extras din soluție cu o soluție acidă. Se va avea grijă să se evite soluțiile puternic acide (pH-ul sub 3,0), care pot desface ciclul oxatiolanic. Citidin-dezoxicitidinodezaminaza poate fi izolată din ficatul de șobolan sau din ficatul uman, sau pot fi exprimată din secvențe recombinate într-un sistem procariot, cum ar fi, de exemplu, Escherdchia Coli.

Metoda de rezoluție a enantiomerilor citidin nucleozidei utilizând citidindezoxicitidinodezaminaza, poate fi utilizată ca unică metodă de rezoluție sau poate fi

că-2 009-00753

-20-02-1992 utilizată în combinație cu alte metode de rezoluție, incluzând rezoluția prin hidroliză enzimatică a esterilor 5'-O-nucleozidei, așa cum s-a descris mai sus.

Combinația dintre rezoluția enzimatică și metodele clasice de rezoluție

Procedeul descris mai sus pentru separarea amestecurilor racemice ale enantiomerilor nucleozidei poate fi combinat cu alte metode clasice de separare enantiomerică, pentru creșterea purității optice a produsului finit.

Metodele clasice de separare includ o varietate de tehnici fizice și chimice. Adesea tehnica mult mai eficientă și cea mai simplă este recristalizarea, bazată pe principiul că, racemații sunt adesea mult mai solubili decât enantiomerii individuali corespunzători. Recristalizarea poate fi efectuată în orice fază, incluzând compușii acilați sau produsul enantiomeric finit. Dacă rezultatul este cu succes deplin, această cale simplă reprezintă o metodă care merită aleasă.

Atunci când prin recristalizare nu se ajunge la obținerea unui material cu o puritate optică acceptabilă, pot fi evaluate alte metode. Dacă nucleozida este bazică, (de exemplu, o citidină) se pot utiliza acizi chirali care formează amestecuri diastereomerice care pot avea proprietăți de solubilitate diferite semnificativ. Exemplele nelimitative de acizi chirali includ acidul malic, acidul mandelic, acidul dibenzoil tartric, acidul 3-bromcamfor-8-sulfonic, acidul 10-camforsulfonic și acidul di-para-toluiltary(ric. în mod asemănător, acilarea grupării hidroxil libere cu un derivat acid chiral are ca rezultat așadar, formarea amestecurilor diastereomerice ale căror proprietăți fizice pot fi diferite suficient pentru a permite separarea.

Cantități mici de nucleozide îmbogățite enantiomeric pot fi obținute sau purificate prin tratarea amestecului racemic printr-o coloană HPLC care a fost desemnată pentru separări chirale, incluzând coloanele cu legături de ciclodextrină, comercializate de Rainin Corporation.

Exemplul 4: Separarea amestecurilorracemice denucleozideprin cromatografie lichidă de înaltă performanță HPLC.

Rezoluțiile enantiomerilor C4¹ ai (±)-FTC sunt efectuate utilizând o coloană chirală cu legături de ciclodextrină (ciclolegătura AC-I), obținută de la Rainin Corporation (Woburn, MA). Condițiile sunt următoarele:metanol 0,5% izocratic, în apă; debitul fluidului de 1 mililitru pe minut, detecție în ultraviolet la 262 nm. Metanol de puritate

HPLC este obținut de la J.T.Baker (Phillipsburg, N J). Amestecurile racemice sunt injectate și fracțiunile sunt colectate. Fracțiunile conținând fiecare dintre enantiomerii menționați sunt colectate, congelate și apoi liofilizate. Compușii sunt caracterizați prin spectroscopie în ultraviolet și prin timpii lor de retenție, prin cromatografie lichidă de înaltă performanță HPLC. în general enantiomerii (-) au timpi de retenție mai scăzuți decât enantiomerii (+) (vezi J. Liquid Chromatography, 7:353-376,1984). Concentrațiile de compuși sunt determinate prin spectroscopie în ultraviolet, utilizând o soluție stoc de concetrație cunoscută (15 μΜ) preparată în apă pentru evaluare biologică. Timpii de retenție pentru enantiomerii separați sunt prezentați în tabelul 2.

Tabelul 2

Timpii de retenție ai enantiomerilor compusului FTC

Compusul	Rf (minute)
(-)-FTC	8,3
(+)-FTC	8,7

Exemplul 5. Metode alternative pentru separarea enantiomerilor FTC utilizând o coloană chirală.

Utilizând o coloană Cyclobond l-Ac (cu legătură ciclică) (5 pm, 25 centrimetri x 4,6 militri, Rainin Corporation, Wobum, MA, Catalog no. AST-41049) cu un debit al fluidului de 0,6 mililitri pe minut de metanol izocratic 0,5% (Fisher Scientific, Inc. HPLC grade catalog nr. A-452-4 în apă) și detecția în ultraviolet la 262 nm, enantiomerii FTC prezintă timpi de retenție de 12,68 minute ((-)-FTC) și 13,20 minute ((+)-FTC).

Utilizând o coloană Chiralpak AS (10 pm, 25 centimetri x 4,6 milimetri J.T.Baker Inc., Phillsburg, NJ, catalogul nr. 7406-00, serial nr. 09-29-10320) cu un debit de fluid de 0,8 mililitri pe minut de alcool izopropilic (grad pentru cromatografiere lichidă de înaltă performanță HPLC, Fisher Scientific, Inc. cat nr. A-451 -4)și detecția în ultraviolet la 262 nm, enantiomerii compusului FTC prezintă timpi de retenție de 5,9 minute ((-)FTC) și 9,8 minute ((+)-FTC)

III. Abilitatea compusului 2-hidroximet*-5-(5-fluorocitosin-1 -il)1,3-oxatiolan

(FTC) de a inhiba replicarea virusului HIV

Deseori este de dorit efectuarea screefting-ului unui număr de amestecuri «e— racemice de nucleozide ca o fază preliminară pentru determinare^ dacă se justifică în continuare separarea ulterioară în componentele îmbogățite enantiomeric și o evaluare ulterioară a activității antivirale. Capacitatea nucleozidelor de a inhiba virusul imunodeficienței uman HIV poate fi măsurată prin tehnici experimentale diverse. Tehnicile utilizate în prezenta invenție și care sunt descrise în detaliu în continuare, măsoară inhibarea replicării virale în fitohemaglutinină (PHA) în celulele mononucleare sanguine periferice umane stimulate (PBM) cu fitohematoglutinină (PHA) infectate cu HIV-1 (tulpina LAV). Cantitatea de virus produsă este determinată prin măsurarea enzimei revers transcriptază pe virusul codificat. Cantitatea de enzimă produsă este proporțională cu cantitatea de virus produs. Tabelul 3 prezintă valorile EC₅₀ (concentrația nucleozidei care inhibă replicarea virusului la 50% din celulele mononucleare sanguine periferice umane stimulate (PBM) estimate cu un factor de eroare de 10%) și valorile IC₅₀ (concentrația nucleozidei care inhibă 50% dezvoltarea celulelor mononucleare sanguine periferice umane mitogen-stimulate (PBM) neinfectate) a unui număr de (±)-1,3-oxatiolan și nucleozide.

Exemplul 6: Activitatea anti-HIV a (±)-1,3-oxatiolan nucleozidelor.

A. Celulele PBM fitohemaglutinin stimulate, de 3 zile ca vârstă (10⁶ celule per rnililitru) de la donori sănătoși seronegativi față de HIV-1 și față de virusul B al hepatitei, sunt infectate cu HIV-1 (tulpina LAV) la o concentrație de aproximativ 100 ori doza care infectează 50% cultura tisulară (TICD) per rnililitru și acestea se cultivă în prezența și —- absența diferitelor concentrații ale compușilor antivirali.

B. La aproximativ o oră după infectare, mediul cu compusul care trebuie testat (de 2 ori concentrația finală în mediu) sau fără compus, se adaugă în flacoane (5 mililitri, având volumul final de 10 mililitri). Se utilizează AZT ca un martor pozitiv.

C. Celulele sunt expuse virusului (aproximativ 2 x 10⁵ dpm/mililitru, așa cum s-a determinat prin analiza revers transcriptazei) și apoi sunt plasate într-un incubator cu CO₂. HIV-1 (tulpina LAV) se obține de la Centrul de Control al Bolilor din Atlanta, Georgia. Metodele utilizate pentru cultivarea celulelor PBM, recoltarea virusului și determinarea activității revers transcriptazei, sunt cele descrise de către Mc Dougal și

Tl

0-1009-00755-“20-02-1992-colab., (J. Immun. Meth. 76, 171-183, 1985) și Spira și colab., (J.CIin. Meth. 25,9799,1987) exceptând faptul că fungizona nu s-a inclus în mediu (vezi Schinazi și colab., Antimicrob. Agents Chemother. 32, 1784-1787 (1988); Id 34: 1061-1067 (1990)).

D. în ziua a 6-a, celulele și supernatantul sunt transferate într-un tub de 15 mililitri și centrifugate la aproximativ 900 g, timp de 10 minute. Cinci mililitri de supernatant sunt îndepărtați și virusul este concentrat prin centrifugare la 40000 rotații pe minut timp de 30 de minute (Beckman 70,1 Ti rotor). Peleta cu virus solubilizat, este prelucrată pentru determinarea nivelelor de revers transcriptază. Rezultatele sunt exprimate în dpm/mililitru de probă de supernatant. Virusul din volumele mai mici de supernatant (1 mililitru) poate fi așadar concentrat prin centrifugare înainte de solubilizare și determinarea nivelelor revers transcriptazei.

Concentrația mediană eficientă (EC₅₀) este determinată prin metoda efectului median (Antimicrob. Agents Chemother. 30, 491-498 (1986)). Pe scurt, procentul de inhibiție al virusului așa cum a fost determinat din măsurătorile revers transcriptazei, este reprezentat grafic față de concentrația micromolară a compusului. EC₅₀ este concentrația compusului la care există o inhibare de 50% a dezvoltării virale.

E. Celulele PBM umane neinfectate stimulateMÎtogen (3,8 x 10⁵ celule per mililitru), sunt cultivate în prezența și în absența medicamentului în condiții similare cu cele utilizate pentru analiza antivirală descrisă mai sus. Celulele sunt numărate după 6 zile, utilizându-se un hemacitometru și metoda de excluziune cu Trypan Blue, așa cum s-a descris de către Schinazi și colab., AntimicrobialAgents and Chemotherapy22 (3), 499 (1982). Valoarea IC 50 este concentrația compusului care inhibă 50% din creșterea normală a celulelor.

Tabelul 3

EC₅₀ și IC₅₀ la diferiții analogi de 1,3-oxatiolan nucleozide în celulele umane PBM

Cod	X sau Y	R	Citotoxicitate antivirală
EC50, pM	IC50, pM
DLS-009	X=O	H	>100	>100
DLS-010	X=O	Me	64,4	>100

9--1 009-00753-~2O~O2-1 992~“ fy²) ‘ - TlM. , , ;

DLS-027	x=o	F	>100	>100
DLS-028	x=o	CI	60,8	>100
DLS-044	x=o	Br	>100	>100
DLS-029	x=o	I	>100	>100
DLS-020	y=nh2	H	0,02	>100
DLS-011	y=nh2	Me	>10	>100
DLS-022	y=nh2	F	0,1	>100
DLS-023	y=nh2	CI	38,7	>100
DLS-021	y=nh2	Br	77,4	>100
DLS-026	y=nh2	|	0,72	>100
DLS-058(-)	y=nh2	F	0,008	>100
DLS-059(+)	y=nh2	F	0,84	>100
DLS-053	y=nh2	cf3	60,7	>100

Așa cum s-a indicat în tabelul 3, în general, nucleozidele citozin 1,3-oxatiolan substituite sunt mult mai active decât nucleozidele uracil corespunzătoare. Erorile în măsurătorile EC₅₀ și IC₅₀ sunt estimate la ±10%.

Unul dintre compușii (±)-FTC (menționat ca compusul 8 CțS 022) prezintă nu numai o activitate excepțională (de aproximativ 10 nM în celule PBM), ci și o toxicitate foarte scăzută (>100 pm în celule PBM, Vero și GEM).

IC₅₀ ale (±)-FTC sunt peste 100 pM, indicând că, compusul nu este toxic în celulele PBM neinfectate evaluate până la 100 pm.

sau

Exemplul 7: Activitatea antivirală a enantiomerilor compusului FTC, separat prin HPLC.

Enantiomerii compusului FTC sunt izolați prin metoda din exemplul 4 și activitatea antivirală este evaluată prin metoda din exemplul 6. Rezultatele sunt prezentate în tabelul 4 și ilustrate în figura 5.

Tabelul 4

Activitatea antivirală a enantiomerilor (+) și (-) ai FTC

Concentrația de tratament pM	DPM/ml	%lnhibitie (corectată)	EC50: pM
FTC(+)	0,0001	73,755	26,6	0,018
	0,005	83,005	16,3
	0,01	60,465	41,3
	0,05	34,120	70,4
	0,1	14,160	92,4
	0,5	18,095	88,1
	1	7,555	99,7
	5	7,940	99,3
	10	5,810	101,7
FTC(-)	0,001	76,275	23,8	0,02
	0,005	58,590	43,3
	0,01	75,350	24,8
	0,05	28,890	76.20

0 0 9 - 0 0 7 5 3 ”

20-02-1992 //

Cc 042

	o,1	13,175	93,5
	0,5	9,485	97,6
FTC(+)	0,001	94,340	3,8	0,28
	0,005	107,430	-10,6
	0,01	99,465	-1,8
	0,05	87,120	11,8
	0,1	86,340	12,7
	0,5	33,225	71,4

Așa cum este indicat în tabelul 4, în acest experiment enantiomerul (-) al compusului FTC pare să fie mai activ cu aproximativ un ordin de mărime decât enantiomerul (+) al compusului FTC și are aproximativ aceeași activitate anti-HIV ca a amestecului racemic. Nici enantiomerii și nici amestecul racemic nu au toxicitate, până la 100 pM așa cum s-a măsurat prin metoda de excluziune Tryptan Blue în celulele umane PBM.

Exemplul 8: Activitatea antivirală a enantiomerilorFTC separați prin metoda din exemplul 3.

Enantiomerii (±)-FTC sunt așadar separați prin metoda din exemplul 3 și activitatea antivirală este evaluată prin metoda din exemplul 6. Rezultatele sunt ilustrate în figura 6. Așa cum s-a indicat în figura 6, EC₅₀ a amestecului racemic al compusului FTC are valoarea de 0,017 pM, EC₅₀ a compusului (-)-FTC la 0,0077 pM și EC₅₀ a compusului (+)-FTC la 0,84 pM.

Exemplul 9: Absorbția (+)-FTC în celulele PBM umane.

Au fost efectuate studii utilizând compusul FTC radiomarcat, pe următoarele profile intracelulare ale medicamentului de origine și pe metaboliții detectați în celule. Toate studiile au fost conduse în duplicat. Celulele mononucleare sanguine periferice umane (celulele PBM) au fost suspendate în RPML1640 mediul conținând 10% ser de vițel fetal și antibiotice (2 x 10⁶ celule pe mililitru), 10 mililitri per timpul fixat și incubate cu adițiede 10 pM FTC (activitate specifică de aproximativ 700 dpm/pmol) Celulele sunt expuse apoi medicamentului timp de 2,6,12 și 24 ore. La acești timpi fixați, mediul este

(^-2 0 0 9 - 0 0 7 5 3 -“2 0 - 0 2 - 1 9 9 2 --

separat și celulele sunt spălate de două ori cu o soluție de sare, răcită, Hank, echilibrată. Extracția este efectuată cu adiție de 0,2 mililitri de 60% metanol/apă rece și se menține până a doua zi la temperatura de -70°C. în următoarea dimineață, suspensiile sunt centrifugate și extracțiile sunt repetate de două ori, timp de 0,5 ore la temperatura de -70°C. Supernatanții totali (0,6 mililitri) sunt liofilizați până la sec. Reziduurile sunt resuspendate în 250 microlitri de apă și părțile alicote cuprinse între 50 și 100 microlitri sunt analizate prin cromatografie lichidă de înaltă performanță HPLC. Analiza cantitativă a medicamentului de origine intracelular și a derivaților metabolici este condusă prin cromatografie lichidă de înaltă performanță HPLC. Deoarece unii dintre acești compuși au o labilitate acidă potențială, sistemul tampon apropiat de pH-ul fiziologic este utilizat pentru separarea metaboliților.

Figura 7 reprezintă un grafic al prezenței (consum) compușilor (±)-FTC tritiați în celule PBM umane (media a două determinări) în timp (ore) față de pmol/10⁶ celule. Studiile de consum indică faptul că, compusul FTC radiomarcat este deja absorbit în limf ocitele umane, care produc cantități foarte mari de derivat 5'-trifosfat al compusului FTC.

Exemplul 10. Activitatea antiretrovirală a compusului FTC în diferite linii celulare Activitatea antiretrovirală a compusului FTC este măsurată într-un număr de linii celulare utilizându-se proceduri asemănătoare, dar nu identice cu cele menționate în exemplul 6. Liniile celulare sunt obținute fie de la donori umani, fie de la AIDS Research and Reference Reagent Program, NIH, Rockville, Maryland, ATCC sau Red Cross. Celulele deficiente în timidin kinază CEM sunt preparate prin trecerea secvențială a celulelor CEM în prezența 5-brom-2'-dezoxiuridinei. Rezultatele sunt prezentate în tabelul 5.

Tabelul 5

Activitatea antiretrovirală a FTC, în diferite sisteme celulare

Sistemul celular (tulpina de virus)	EC50 (pM (+) - FTC
HIV-1
PBMC (LAV-1)	0,027
MT2 (HTLV1118)_______________________	__________________0,89 _____________

Χ-2 0 0 9 - 0 0 7 5 3 -C

CEM (LAV-1)	0,08
CEM-TKW (LAV-1)	0,026
CEM (HTLV1118) NTH	0,09
HIV-2
PBMC (ROD2)	0,0038(±)-FTC 0,0007(-)FTC 0,026(+)-FTC
SIV
AA-2 (SIV251)	4,6
C-8166 (SIV251)	<8,0
FIV
CrFK(61E)	<1

Exemplul 11: Ieșirea compușilor (±)-FTC din celulele PBM umane.

Au fost efectuate studii care au utilizat compusul FTC radiomarcat, pentru a urmări profilele intracelulare ale medicamentului de origine și metaboliții detectați în celulă după incubare în mediul cu medicament timp de 24 ore, după care se îndepărtează medicamentul. Acest studiu măsoară timpul necesar pentru ca nivelele intracelulare ale trifosfaților, să scadă. Studiile sunt realizate în duplicat. Celulele neinfectate (2 x 10⁶ mililitri), sunt suspendate într-un mediu corespunzător suplimentat cu ser (10 mililitri per timpul fixat) și incubate la temperatura de 37°C în incubatorul cu 5% CO₂. Concentrația compusului FTC radiomarcat este de 10 μΜ. După pulsația celulelor cu compusul marcat un timp de 24 ore, celulele sunt spălate temeinic și apoi sunt umplute cu mediu proaspăt fără medicamente antivirale (0 ore). La 0, 2, 4, 6, 12, 24 și 48 de ore (timpul de incubare secundar), celulele sunt îndepărtate și apoi sunt imediat extrase cu un amestec rece de metanol/apă de 60%. Extractele sunt obținute prin centrifugarea și îndepărtarea peletelor celulare. Extractele sunt liofilizate și apoi sunt păstrate la temperatura de -70°C. înainte de analiză, materialul este resuspendat în 250 microlitri de amestec tampon pentru HPLC. Analiza cantitativă a medicamentului de origine intracelular și a derivaților metabolici este efectuată prin cromatografie lichidă

0^~ 2OO9-OO755-

-20-02-1992-

Uf de înaltă performanță FPLC, utilizându-se fie un Micrometrics, sau un sistem HPLC 1090 model Hewlett-Packard, cu o coloană de schimbători anionici de tip Partisil 10 SAX (Whatman Inc.) cu un debit al fluidului de 1 mililitru per minut, la o presiune de 0,07 kg/cm² (1 kpsi), cu o detecție în ultraviolet la 262 nm. Faza mobilă constă din apa neionozată (A), 2 mM NaH₂PO₄/16 mM NaOAc (pH=6,6) (B), 15 mM NaH₂PO₄/120,2 mM NaOAc (pH=6,6) (C) și 100 mM NaH₂P0₄/800 mM NaOAc (pH=6,6) (D).

Metoda de separare: izocratic pentru 5 minute cu A, urmat de gradient linear 15 minute până la 100% B, urmat de gradient linear 20 de minute până la 100% C, urmat de gradient linear 10 minute până la 100% D, urmat de izocratic 30 de minute cu 100% D.

Timpii de retenție (minute) în celulele umane

Compusul	Neschimbat	Monofosfat	Difosfat	T rifosfat
(±)-FTC	5,0	39,0	55,0	68,0

Figura 8 este o reprezentare grafică a ieșirii compușilor (±)-FTC marcat din celulele PBM umane, măsurată în ore după îndepărtarea medicamentului față de concentrația (pmol/10⁶ celule). Așa cum este indicat în această figură, FTC-trifosfatul are o perioadă de înjumătățire intracelulară de aproximativ 12 ore și poate fi ușor detectat intracelular la concentrațiile de 1-5 pM la 48 ore după îndepărtarea medicamentului extracelular care este valoarea de mai sus EC₅₀ pentru acest compus, în continuare, afinitatea (K¹) pentru (±)-FTC trifosfat utilizând HIV RT este de 0,2 μΜ, care este sub nivelul concentrației la 48 de ore.

Exemplu 12. Activitatea anti-HIV a derivaților acceptabili farmaceutic a compușilor (±)-FTC.

a. Numărul de derivați acceptabili din punct de vedere farmaceutic ai compusului (±)-FTC preparați prin derivatizarea pozițiilor 5'și N⁴ se evaluează pentru activitatea antiHIV în celulele PBM, utilizând un procedeu asemănător cu cel descris în exemplul 6 Rezultatele sunt după cum urmează. Esterul 5'-O-butirat al compusului (±)-FTC prezintă o valoare a EC50 de 0,0017. Derivatul N⁴-acetil al compusului (±)-FTC prezintă o valoare a EC50 de 0,0028. N⁴-esterul 5'-0-butirat al compusului (±)-FTC prezintă o valoare a EC₅₀ de 0,0058.

^-2009-00755

-2 0 - 0 2 - 1 9 9 2

η)

b. Activitatea anti-HIV a esterului 5'-O-butirat al compusului (±)-FTC în sistemul MT4(EC₅₀) este de 0,04 pM. în aceeași analiză compusul neacilat (±)-FTC prezintă o valoare a IC₅₀ de 0,52 μΜ. Valoarea IC₅₀ pentru AZT în acest sistem este de 0,09 μΜ.

V. Abilitatea compusului FTC de inhibare a replicării HBV.

Exemplul 13. Evaluarea activității enantiomerilor (+) și (-) ai FTC în culturile celulare 2.2.15.

Abilitatea enantiomerilor compusului FTC de inhibare a dezvoltării virusului în culturile celulare 2.2.15 (celulele HepG2 transformate cu virionul hepatitei) este descrisă în detaliu mai jos. Au fost descrise un sumar și o descriere a analizei pentru efectele antivirale în acest sistem de cultură și analiza acidului dezoxiribonucleic ADN în virusul hepatitei B (Korba și Milman, 1991, Antiviral Res., 15:217). Evaluările antivirale sunt efectuate pe două pasaje separate de celule. Toate godeurile din toate plăcile sunt însămânțate cu aceeași densitate și în același timp.

Parametrii de analiză. Datorită variațiilor inerente în nivelele de HBV DNA intracelular și extracelular, numai depresiunile mai mari de 3,5 ori (pentru acidul dezoxiribonucleic ADN al virionului HBV) sau de 3,0 ori (pentru intermediarii de replicație ai acidului dezoxiribonucleic ADN la HBV) de la nivelele medii pentru aceste forme de ADN la HBV, care se formează în celulele netratate, sunt considerate a fi semnificativ statistic. (P < 0,05). Nivelele de acid dezoxiribonucleic ADN integrat la virusul hepatitei B HBV la fiecare preparare de acid dezoxiribonucleic ADN celular (care rămâne constant, raportat la o pereche celule, în aceste experimente), se utilizează pentru calcularea nivelelor formelor de acid dezoxiribonucleic ADN intracelular al HBV, asigurându-se astfel că între probele separate au fost comparate cantități egale de acid dezoxiribonucleic ADN celular.

Valorile tipice pentru acidul dezoxiribonucleic ADN al virionului HBV extracelular în celulele netratate, sunt cuprinse între 50 și 150 pg/mililitru de mediu de cultură (media a aproximativ 76 pg/mililitru). Intermediarii de replicare ai acidului dezoxiribonucleic ADN la virusul HBV intracelular în celulele netratate sunt cuprinse între 50 și 100 pg/pg de acid dezoxiribonucleic ADN celular (media a aproximativ 74 pg/pg de acid dezoxiribonucleic ADN celular). în general, scăderile în nivelele de acid dezoxiribonucleic ADN al virusului HBV intracelular datorită tratamentului cu compuși

GL -2009-00753antivirali sunt mai puțin pronunțate și se produc mult mai încet decât scăderile în nivelele de acid dezoxiribonucleic ADN la virionul HBV (Korba și Milman, 1991, Antiviral Res., 15:217).

Maniera în care analizele de hibridizare sunt realizate pentru aceste experimente a avut ca rezultat echivalența a aproximativ 1,0 pg de acid dezoxiribonucleic ADN HBV intracelular până la 2-3 copii genomice per celulă și 1,0 pg/mililitru de acid dezoxiribonucleic ADN la HBV extracelular până la 3 x 10⁵ particule virale per mililitru.

Analiza toxicității. Analizele de toxicitate sunt realizate pentru a se stabili dacă efectele antivirale observate se datorează unui efect general privind viabilitatea celulară. Metoda utilizată în prezenta invenție a fost măsurarea absorbției colorației roșie naturală, o analiză standard și utilizată pe scară largă pentru viabilitatea celulară într-o varietate de sisteme gazdă pentru virusuri, incluzând HSV și HIV. Analizele de toxicitate sunt efectuate pe plăci de culturi de țesuturi plate la partea inferioară cu 96 de godeuri. Celulele pentru analizele de toxicitate sunt cultivate și tratate cu compușii de testat cu aceeași schemă descrisă mai jos pentru evaluările antivirale. Fiecare compus este testat la 4 concentrații, fiecare în culturi triplicat (godeuri A, B și C). Absorbția colorantului roșu natural este utilizată penru determinarea nivelului relativ al toxicității. Absorbanta colorantului internalizat la 510 nm (A_sin) este utilizată pentru analiza cantitativă. Valorile sunt prezentate ca procent al mediei valorilor A_sin în 9 culturi separate ale celulelor netratate menținute pe aceeași placă cu 96 de godeuri, ca și compuși de testat. Absorbția colorantului în cele 9 culturi de control pe placa 5 este cuprinsă între 91,6% până la 110,4% și pe placa 6 de la 96,6% până la 109%. Rezultatele sunt date în tabelul 6.

Tabelul 6

Analiza toxicității compușilor de testare în celulele 2.2.15

Discul	Compus	Conc. (μΜ)	Absorbția colorantului (% din control)
Godeu A	Godeu B	Godeu C
5	DMSO	10,0*	0,7	1,6	0,9
3,3	55,9	68,7	61,7

Ο—- 2 Ο Ο 9 - Ο Ο 7 5 5 - “ 2 0 - 0 2 - 1 9 9 2 --

		1,0	91,2	96,4	106,8
0,3	98,7	102,9	93,5
6	(-)-FTC	300	53,0	51,1	51,5
100	64,1	66,6	77,6
30	98,7	94,3	96,4
10	94,3	94,9	92,2
6	(+)-FTC	300	43,4	56,7	58,5
100	77,7	66,3	72,1
30	81,1	88,3	88,1
10	90,9	99,4	90,5

pentru DMSO, concentrațiile sunt prezentate ca procente de soluție originală stoc.

Evaluarea toxicității. Așa cum s-a indicat în tabelul 6 nu s-a observat nici o toxicitate semnificativă (mai mare decât scăderea 50% a nivelelor de absorbție observate în celulele netratate) pentru compușii detestat la concentrațiile utilizate pentru evaluările antivirale. Ambii compuși de testat, (-)-FTC și (+)-FTC apar a fi toxici la concentrații mai ridicate utilizate pentru testele de toxicitate (330 μΜ).

Evaluările antivirale.

Control.

în cadrul variațiilor normale, nivelele de acid dezoxiribonucleic ADN pentru virionul HBV și intermediarii de replicație HBV intracelular (HBV Rl) rămân constante la celulele netratate peste perioada testată. DMSO la o concentrație de 1% nu afectează nivelele replicației HBV în culturile celulare 2.2.15.

Compușii de testare.

Așa cum s-a indicat în tabelul 7, ambii compuși (-)-FTC și (+)-FTC inhibă semnificativ replicația HBV la nivelele de testare. Așa cum este indicat în tabelul 8, compusul (-)-FTC inhibă încă semnificativ sinteza acidului dezoxiribonucleic ADN la virionul HBV și sinteza acidului dezoxiribonucleic ADN la HBV intracelular la concentrațiile de 4,1 și 0,25 μΜ.

Οσ2 009-0075320-02-1992Tabelul 7

Efectul compușilor de testat asupra producerii HBV în culturile celulare 2.2.15.

Godeu	Tratamentul	ADN la virion HBV* (pg/ml mediu de cultură)	ADN la HBV intracelular (pg/pg ADN celular)
Ziua 0	Ziua 4	Ziua 9	MONO	Rl
7A	Celule netratate	59	75	94	2,7	93
7B	Celule netratate	47	64	88	2,5	93
8A	Celule netratate	65	100	71	2,2	97
8B	Celule netratate	77	65	110	2,4	62
7K	DMSO @ 1,00%	100	50-	48	1,9	95
7L	DMSO @ 1,00%	48	96	54	2,8	98
8K	DMSO @ 1,00%	93	63	68	2,2	86
8L	DMSO @ 1,00%	66	57	59	1,6	97
9U	(-)-FTC @ 10 μΜ	120	36	1	1,1	14
9V	(-)-FTC @10 pM	89	48	1	1,5	19
10U	(-)-FTC @10 μΜ	58	41	0,1	1,9	13
10V	(-)-FTC @ 10 pM	110	32	0,1	1,2	16
9W	(+)-FTC @ 10 pM	88	42	0,1	0,8	14
9X	(+)-FTC @ 10 μΜ	58	57	0,2	0,4	19
10W	(+)-FTC @ 10 pM	69	55	0,1	0,7	17
10X	(+)-FTC @ 10 pM	45	39	o,1	0,4	15

*Senzitivitatea de separare pentru ADN la virionul HBV este de 0,1 pg/ml.

@ ADN HBV intracelular a fost analizat 24 de ore urmând după a 9-a zi de tratament. Nivelele de ADN HBV integrat în fiecare preparare a ADN celular sunt utilizate pentru calcularea nivelelor genomelor HBV episomale 3,2 kb (MONO.) și a intermediarilor (Rl) de replicație a acidului dezoxiribonucleic ADN In cazul virusului HBV.

¢^2009-00753 “20-02-1992

Tabelul 8

Efectul compușilor de testat asupra producerii HBV în culturile celulare 2.2.15.

Godeu	Tratamentul	ADN la virion HBV* (pg/ml mediu de cultură)	ADN la HBV intracelular* (pg/pg ADN celular)
Ziua 0	Ziua 4	Ziua 9	MONO.	Rl
31A	Celule netratate	64	54	65	2,8	65
31B	Celule netratate	51	54	77	2,0	53
32A	Celule netratate	100	76	56	3,5	81
32B	Celule netratate	53	97	83	3,1	68
35A	(-)-FTC @4 pM	74	27	>0,1	1,4	1
35B	(-)-FTC @ 4 pM	87	28	>0,1	0,5	1
36A	(-)-FTC @ 4 pM	120	20	1	0,9	1
36B-	(-)-FTC @ 4 pM	59	16	0,2	0,2	2
35C	(-)-FTC @ 1 pM	70	13	>0,1	17	2
35D	(-)-FTC @ 1 pM	62	15	>0,1	1,2	3
36C	(-)-FTC @ 1 pM	60	22	1	1,4	2
36D	(-)-FTC @ 1 pM	89	28	0,3	1,5	4
35E	(-)-FTC @ 0,25 pM	84	15	>0,1	1,5	4
35F	(-)-FTC @ 0,25 pM	89	16	4	2,2	4
36E	(-)-FTC @ 0,25 pM	66	13	1	1,8	8
36F	(-)-FTC @ 0,25 pM	49	19	0,1	0.3	9

*Senzitivitatea de separare pentru acidul dezoxiribonucleic ADN la virionul HBV este de 0,1 pg/ml.

+ Analiza ADN HBV intracelular a fost la 24 de ore urmând după a 9-a zi de tratament. Nivelele de ADN HBV integrat în fiecare preparare a ADN celular sunt utilizate pentru calcularea nivelelor genomelor HBV episomale 3,2 kb (MONO) și a intermediarilor (Rl) de replicație a acidului dezoxiribonucleic ADN în cazul virusului HBV.

Exemplul 14: Absorbția (±)-FTC în celulele ficatului uman: activitatea HBV asupra compusului FTC.

0^-2 009-00753

Procedeul din exemplul 9 este repetat cu celulele din ficatul uman (celulele HepG2, disponibile de la ATCC) pentru determinarea absorbției și metabolismului compusului FTC în aceste celule. Așa cum s-a arătat în figura 9, compusul (±)- FTC este absorbit de către celulele HepG2 în cantități mari. Aceste celule din ficatul uman metabolizează un procentaj mare de (±)- FTC până la (±)-FTC trifosfat.

Aceste date, în conjuncție cu alte date prevăzute în prezenta invenție, arată că (±)-FTC ca și enantiomerii (-) și (+) ai acestui compus, sunt fosforilați în celulele din ficat. Aceste celule pot fi transformate cu virusul hepatitei B.

Exemplul 15: Ieșirea compusului FTC din celulele umane HepG2.

Figura 10 ilustrează ieșirea compusului [³H]-(±)-FTC și a derivaților fosforilați ai acestuia în HepG2 uman în pmol/10⁶ celule în timp, după pulsarea celulelor cu 10 pM [³H]-(±)-FTC (700 DPM/pmol) pentru 24 de ore și evaluarea concentrației compusului la 24 ore după separare.

Figura 11 ilustrează descreșterea în concentrație combinată a [³H]-(±)-FTC și a derivaților fosforilați ai acestui compus, din celulele umane HepG2 după incubare cu 10 pM [³H]-(±)-FTC (700 DPM/pmol) timp de 24 de ore, în celule pmol/10⁶ în timp.

Așa cum se ilustrează, chiar la 48 de ore, mai mult decât 1 pM din compusul activ (care este semnificativ mai mare decât EC₅₀ pentru compus) este încă prezent în celule.

V. Toxicitatea în celulele precursoare granulocit-macrofage.

Exemplul 16: Efectul compusului FTC asupra formării coloniei de celule precursoare granulocit-macrofage.

Figura numărul 12 este o reprezentare grafică a efectului enantiomerilor (+) și (-) ai compusului FTC asupra formării coloniei de celule precursoare granulocitemacrofage, așa cum s-a măsurat în procente de supraviețuire în raport cu concentrația în pM de (-)-FTC în cerc deschis; (+)-FTC în cerc închis; AZT pătrat închis. Așa cum s-a indicat, enantiomerul (-) al compusului FTC pare să fie mai puțin toxic, de exemplu acesta are o valoare mai mare pentru IC₅₀, fie decât enantiomerul (+) sau AZT în această linie celulară.

VI. Farmacocinetica compusului FTC.

Exemplul 17: Metabolismul compusului FTC la administrarea la șobolani.

o^l Ο Ο 9 - Ο 0 7 5 3 -2 0 - 0 2 - 1 9 9 2-

Co’ -- .. ,

Compusul (±)-FTC este administrat intravenos în doze de 10,50 și 10O miligrame per kilogram la șobolani. Au fost evaluate suprafața sub curba concentrația medicamentului în plasmă în raport cu timpul (AUC), clearance total (CL_T), volumul în regim staționar al distribuției (V_ss), timpul mediu de staționare (MRT) și perioada de înjumătățire (t_1/2). Rezultatele sunt prezentate în tabelul 9.

Tabelul 9

Parametrii farmacocinetici ai FTC după administrarea intravenoasă a 10, 50,100 miligrame per kilogram la șobolani

Doza	AUC	CLT	Vss	MRT	^1/2
mg/kg	mg h/L	L/h/kg	L/kg	h	h
10	9,65	0,988	0,758	0,768	0,757
50	57,11	0,874	0,699	0,800	0,815
100	120,72	0,830	0,663	0,798	0,969

*AUC = suprafața sub curba concentrație medicament în plasmă în raport cu timpul; CL = eliberare totală; Vss = volum în regim staționar a distribuției; MRT = timp mediu de staționare (clearence) și t_1/2 = perioadă de înjumătățire.

Exemplul 18. Parametrii farmacocinetici pentru FTC după administrarea orală și intravenoasă a compusului FTC.

Parametrii farmacocinetici cu model independent sunt derivați pentru (±)-FTC prin administrarea (intravenoasă (i.v.) și orală (p.o.)) a 33,3 miligrame/kilogram la maimuțe rhesus. Rezultatele sunt prezentate în tabelul 10. Important este că biodisponibilitatea medie a compusului la maimuțe este de 73% (± 6%).

CL.~29u9-uu755- 2 0 - 0 2 - 1 9 9 2 Tabelul 10

Parametrii farmacocinetici cu model independent derivați pentru FTC după administrarea intravenoasă (i.v.) sau orală (p.o.) a 33,3 miligrame/kilogram la maimuțele rhesus*

Maimuța	AUC mg h/L	CLT L/h/kg	vss L/kg	MRT h	^1/2 h	Ka h1	F %
I.V.
Ruh	19,14	1,74	2,71	1,56	1,28
Rmi	26,31	1,26	1,97	1,56	1,22
RJd	22,51	1,48	2,00	1,36	1,47
Media	22,65	1,49	2,23	1,49	1,32
±S.D.	3,59	0,24	0,42	0,12	0,13
P.O.
Ruh	13,21			2,07	1,58	0,48	71
Rmi	21,11			2,32	1,08	0,43	80
Rjd	15,29			3,23	1,47	0,31	68
Media	16,54			2,54	1,38	0,41	73,00(±6)
S.D.	4,09			0,61	0,26	0,09	6,24

*AUC = suprafața sub curba concentrației de medicament în plasmă în timp; CL = eliberare totală; Vss = volum în regim staționar a distribuției; MRT = timp mediu de staționare și t_1/2 = perioadă de înjumătățire; F = biodisponibilitate; și K_a = constanta de ordinlîntâi a vitezei de absorbție.

Tabelul 11

Raportul CSF/ser al compusului FTC și metabolitul dezaminat al acestui compus la 1 oră după tratament

Maimuța	Calea	FTC	Metabolitul (FTU)
RUh	I.V.	0,076	0,024
RMi	I.V.	0,062	0,032

^nna /1

RJd	I.V.	0,162	0,052
Media		0,100	0,036
±S.D.		0,054	0,014
RUh	P.O.	0,048	0,026
RMi	P.O.	0,039	0,037
RJd	P.O.	0,117	0,055
Media		0,068	0,039
±S.D.		0,043	0,015

Exemplul 19. Raportul CSF/ser al compusului FTC și metaboliții acestuia la maimuțele rhesus.

Capacitatea compușilor (±)-FTC de a traversa bariera hematoencefalică a fost evaluată prin administrarea a 33,3 miligrame per kilogram din compusul activ la maimuțele Rhesus și prin măsurarea cantității de compus (±)-FTC în fluidul cerebrospinal (CSF) și în ser sanguin la o oră după administrare. Rezultatele sunt prezentate în tabelul 11. Datele arată că, o cantitate semnificativă din compusul activ trece bariera hematoencefalică la acest mamifer.

VII. Prepararea compozițiilor farmaceutice.

Oamenii care suferă de boli cauzate de o infecție cu virusul hepatitei B HBV sau cu virusul imunodeficienței HIV, pot fi tratați prin administrarea la pacient a unei cantități eficiente din compusul (±)-FTC sau enantiomerii (-) sau (+) ai acestui, compus, sau dintr-un derivat sau o sare a acestui compus acceptabili din punct de vedere farmaceutic, în prezența unui vehicul sau a unui diluant acceptabil din punct de vedere farmaceutic. Materialele active pot fi administrate pe orice cale convenabilă, ca de exemplu pe cale orală, parenterală, intravenoasă, intradermală, subcutanată sau topică, sub formă lichidă sau solidă.

Compusul activ este inclus într-un vehicul sau un diluant acceptabil din punct de vedere farmaceutic, într-o cantitate suficientă pentru a se elibera către pacient o cantitate eficientă terapeutic din compusul care inhibă replicare virală in vivo, în special în cazul replicării virusurilor HIV și HBV, fără să cauzeze efecte toxice serioase la

O O 9 “ O U 7 ο ο - -20-02-1992-,Μ pacientul tratat. Prin cantitate inhibitoare se înțelege cantitatea de ingredient activ care este suficientă pentru a exercita un efect de inhibare, așa cum s-a măsurat, de exemplu, prin analiza efectuată așa cum s-a menționat mai înainte.

O doză preferată de (-), (+) sau (±)-FTC pentru toate condițiile menționate mai înainte, se va situa în intervalul de la aproximativ 1 la 50 miligrame per kilogram, de preferință 1 până la 20 miligrame per kilogram greutate corporală pe zi, mult mai general 0,1 până la aproximativ 100 miligrame per kilogram greutate corporală a organismului care primește doza, pe zi. Intervalul de dozaj efectiv al derivaților acceptabili din punct de vedere farmaceutic, poate fi calculat pe baza greutății nucleozidei de origine care trebuie să fie eliberată. Dacă derivatul prezintă el însuși activitate, dozajul efectiv poate fi estimat ca mai sus, utilizând greutatea derivatului sau prin alte mijloace cunoscute în literatura de specialitate.

Compusul este administrat în mod convențional în unități de orice formă de dozaj convenabilă, incluzând dar fără a se limita la acestea, de la 7 până la 3000 miligrame, de preferință de la 70 până la 1400 miligrame de ingredient activ per unitate de formă de dozare unitară. O dozare orală de la 50 la 1000 miligrame este convenabilă de obicei. în mod ideal, ingredientul activ va fi administrat astfel încât să se obțină vârful de concentrații ale compusului activ în plasmă de la aproximativ 0,2 până la 70 μΜ, preferabil de la aproximativ 1,0 la 10 μΜ. Aceasta poate fi obținută de exemplu, prin injectarea intravenoasă a unei soluții 0,1% până la 5% din compusul activ, opțional în soluție salină sau se administrează ca un bolus de ingredient activ.

Concentrația de compus activ în compoziția de medicament va depinde de vitezele de absorbție, inactivare și excreția medicamentului, ca și de alți factori cunoscuți în literatura de specialitate. Este de notat că, valorile de dozare vor varia și cu gradul de severitate a afecțiunii care trebuie să fie îmblânzită. Trebuie în continuare să se înțeleagă că pentru oricare subiect particular, regimurile de dozaj specifice trebuie ajustate în timp conform nevoilor individuale și a judecății profesionale a persoanei care administrează sau supraveghează administrarea compozițiilor și ca intervalele de dozare stabilite în prezenta invenție să fie date numai ca exemple, fără a se intenționa limitarea la scopul sau la practica compoziției revendicate. Ingredientul activ poate fi administrat deodată sau poate fi divizat într-un număr de doze mai mici care să fie

Ce st' administrate la diferite intervale de timp. Un mod preferat de administrare a compusului activ este calea orală. Compozițiile farmaceutice care potfi administrate oral vor include în general un diluant inert sau un vehicul comestibil. Aceste compoziții pot fi incluse în capsule gelatinoase sau pot fi comprimate în tablete. Pentru scopul administrării terapeutice pe cale orală, compusul activ poate fi încorporat cu excipienții și utilizat sub formă de tablete, pastile sau capsule. Agenții lianți compatibili farmaceutic și/sau materialele adjuvante pot fi incluse ca o parte a compoziției. Tabletele, pilulele, capsulele, pastilele și alte forme asemănătoare pot conține oricare dintre ingredientele următoare sau compuși având o natură asemănătoare: un agent liant ca de exemplu celuloza microcristalină, guma tragacant sau gelatina; unexcipientcum arfi de exemplu amidonul sau lactoza, un agent de dezintegrare cum ar fi acidul alginic, primogelul sau amidonul de porumb; un lubrifiant cum ar fi de exemplu stearatul de magneziu sau Steroții; un glidant cum ar fi de exemplu dioxidul de siliciu coloidal; un agent de edulcorare cum ar fi de exemplu zaharoza sau zaharina sau un agent aromatizant, cum ar fi, de exemplu, menta, salicilatul de metil sau aromele de portocale. Când forma unității de dozare este capsula, aceasta poate conține în plus față de tipul de materiale menționate mai sus, un vehicul lichid cum arfi de exemplu un ulei gras. în plus, formele unitare de dozare pot conține diferite alte materiale care să modifice forma fizică a unității de dozare, ca de exemplu acoperirile de zahăr, shellacul pentru drajefiere sau alte substanțe cu rol de agenți enterici.

(±)-FTC sau enantiomerii (-) sau (+) ai acestuia sau derivații sau sărurile acestuia acceptabili din punct de vedere farmaceutic pot fi administrate ca un component de elixir, suspensie, sirop, pișcot, gumă de mestecat sau alte forme asemănătoare. Un sirop poate conține în plus față de compușii activi, zaharoză sau un agent edulcorant și anumite substanțe cu rol de conservare, coloranți, vopsele și substanțe de aromatizare.

(±)-FTC sau enantiomerii (-) sau (+) sau derivații sau sărurile acestui compus acceptabile din punct de vedere farmaceutic, pot fi amestecate de asemenea cu alte materiale active care să nu stânjenească activitatea dorită sau cu alte materiale care să suplimenteze acțiunea dorită, cum ar fi antibioticele, substanțele antifungice, antiinflamatoare sau alte substanțe antivirale, incluzând alți compuși de nucleozide anti-

^2 0 0 9 - 0 0 7 5 5 --20-02-092-/24 ⁽ _ .)

HIV.

Soluțiile sau suspensiile utilizate pentru aplicare parenterală, intradermică, subcutanată sau topică, pot include următoarele componente: un diluant steril cum ar fi apa pentru injecții, o soluție salină, uleiurile fixe, polietilen glicolii, glicerina, propilenglicolul sau alți solvenți sintetici; agenții antibacterieni cum ar fi, de exemplu, alcoolul benzilic sau metil parabenii; anti-oxidanții cum arfi acidul ascorbic sau bisulfitul de sodiu; agenți de chelare ca, de exemplu, acidul etilendiaminotetraacetic, agenți de tamponare ca acetății, citrații sau fosfații, agenți pentru redarea tonicității ca de exemplu clorura de sodiu sau dextroza. Preparatul original poate fi inclus în fiole, seringi dispozabile sau flacoane cu doze multiple fabricate din sticlă sau din material plastic.

Dacă administrarea este intravenoasă, se preferă vehicule din soluție fiziologică salină sau soluție salină tamponată cu fosfat (PBS). într-o realizare preferată, compușii activi sunt preparați cu vehicule care vor proteja compusul față de eliminarea rapidă din organism, cum arfi o formulare cu eliberare cotrolată, incluzând implantele și sistemele de eliberare microîncapsulate. Polimerii biocompatibili, biodegradabili pot fi utilizați de asemenea, cum arfi, de exemplu, etilen vinii acetatul, polianhidridele, acidul poliglicolic, colagenul, poliortoesterii și acidul polilactic. Metodele pentru prepararea acestor formulări sunt evidente pentru persoanele de specialitate. Materialele pot fi și obținute comercial de la Alza Corporation and Nova Pharmaceuticals, Inc.

Suspensiile lipozomale (incluzând lipozomii țintiți la celulele infectate cu anticorpi monoclonali, până la antigeni virali) sunt de asemeni preferați ca vehicule acceptabile din punct de vedere farmaceutic. Aceste suspensii pot fi preparate conform unor metode cunoscute persoanelor de specialitate, cum sunt de exemplu cele descrise în brevetul US 4522811 (care sunt încorporate în întregime ca referințe, în prezenta invenție). De exemplu, formulările cu lipozomi pot fi preparate prin dizolvarea de lipide corespunzătoare (ca de exemplu stearoil fosfatidil etanolamina, stearoil fosfatidil colina, arachadoil fosfatidil colina, și colesterolul) într-un solvent anorganic care este apoi evaporat și care lasă în urmă un fir subțire de lipidă uscată pe suprafața conteinerului. O soluție apoasă din compusul activ sau derivații lui monofosfat, difosfat și/sau trifosfat sunt apoi introduși în container. Containerul este apoi răsucit manual, pentru a se elibera materialul lipidic de pe părțile laterale ale conteinerului și pentru a dispersa

^2 0 0 9 - 0 0 7 5 3 -- /7.Γ ~2 0-02-1992-C agregatele lipide, obținându-se astfel o suspensie lipozomală.

Derivații monofosfați, difosfați și trifosfați ai compusului FTC pot fi preparați, așa cum se va descrie mai jos.

Monofosfatul, poate fi preparat conform procedeului dat de Imai și colaboratorii, din J.Org.Chem. 34 (6), 1547-1550 (June 1969). De exemplu, aproximativ 100 miligrame din compusul FTC și aproximativ 280 pl de clorură de fosforil reacționează sub agitare în aproximativ 8 mililitri de acetat de etil uscat la aproximativ 0°C, timp de aproximativ patru ore. Reacția este oprită cu gheață. Faza apoasă este purificată pe o coloană de cărbune activ, iar eluarea se efectuează cu 5% hidroxid de amoniu într-un amestec de părți egale de etanol și apă. Prin evaporarea eluantului se obține FTC-5'monofosfatul de amoniu.

Difosfatul poate fi preparat conform procedeului descris de către Davisson și colaboratorii în J. Org. Chem. 52 (9), 1794-1801 (1987). Difosfatul compusului FTC poate fi preparat din tosilatul corespunzător, care poate fi preparat, de exemplu, prin reacția nucleozidei cu clorura de tosil în piridină la temperatura camerei timp de aproximativ 24 de ore, prelucrând apoi produsul într-o manieră obișnuită (de exemplu prin spălare, uscare și cristalizarea produsului).

Trifosfatul poate fi preparat conform procedeului lui Hoard și colaboratorii, din J. Am. Chem. Soc. 87(8), 1785-1788 (1965). Compusul FTC este activat (fiind transformat în imidazolidă conform unor metode cunoscute în literatura de specialitate) și tratat cu tributil amoniu pirofosfat în dimetilformamidă DMF. Reacția duce în primul rând la formarea trifosfatului de nucleozidă, alături de cantități mici de monofosfaț și difosfat nereacționate. Purificarea prin cromatografie schimbătoare de anioni pe o coloană DEAE este urmată de izolarea trifosfatului, ca de exemplu sare tetrasodică.

, d j

Claims (14)

1. -20’0 2 - 1 9 9 2 -REVENDICĂRI

   1. Derivați de 1,3-oxatiolan caracterizați prin aceea că ei sunt reprezentați de (-)-p-D-2-hidroximetil-5-(5-fluorocitozin-1-il)-1,3-oxatiolan sau derivatul său acceptabil fiziologic, sau sarea lui acceptabilă fiziologic.
2. 2. Derivați de 1,3-oxatiolan caracterizați prin aceea că ei sunt reprezentați de (-)-P-D-2-hidroximetil-5-(5-fluorocitozin-1-il)-1,3-oxatiolan ca enantiomer izolat sau derivatul său acceptabil fiziologic, sau sarea lui acceptabilă fiziologic.
3. 3. Derivați de 1,3-oxatiolan caracterizați prin aceea că ei sunt reprezentați de (-)-p-D-2-hidroximetil-5-(5-fluorocitozin-1-il)-1,3-oxatiolan într-o formă îmbogățită enantiomeric, sau derivatul său acceptabil fiziologic, sau sarea lui acceptabilă fiziologic.
4. 4. Derivați de 1,3-oxatiolan, conform cu revendicarea 1, caracterizați prin aceea că ei au următoarea formulă chimică structurală generală:

   0<-2 Ο Ο 9 Ο 0 7 5 3 - “20-02-1992-” /23

   în care Ri și R₂ sunt în mod independent, alchil, un ester de acid carboxilic în care fragmentul necarbonilic al grupării esterice este selectat din grupa constând din alchil linear, ramificat sau ciclic; alcoxialchil; aralchil; ariloxialchil; arii incluzând fenil opțional substituit cu halogen; alchil C(-C4 sau alcoxi Cr C4; ester sulfonat; alchil sau aralchil sulfonil; mono, di sau trifosfat ester sau ester de aminoacid; și unul dintre Ri sau R₂ poate fi hidrogen.
5. 5. Derivați de 1,3-oxatiolan, conform cu revendicarea 4, caracterizați prin aceea că Ri și R₂ sunt în mod independent selectați din grupul constând din metil, etil, propil, butii, pentil, hexil, izopropil, izobutil, sec-butil, t-butil, izopentil, amil, t-pentil, 3-metilbutiril, hidrogen succinat, 3-clorobenzoat, ciclopentil, ciclohexil, benzoil, acetil, pivaloil, mesilat , propionil, butiril, valeril, caproic, caprilic, capric, lauric, miristic, palmitic, stearic, oleic, aminoacizi m ^{49 V} . ^· · ' bj·. '.·

   incluzând, dar fără a se limita la alanil, valinil, leucinil, izoleucinil, prolinil, fenilalaninil, triptofanil, metioninil, glicinil, serinil, treoninil, cisteinil, tirozinil, asparaginil, glutaminil, aspartoil, glutaoil, lizinil, argininil și histidinil, și unul dintre Ri și R2 poate fi hidrogen.
6. 6. Derivați de 1,3-oxatiolan, conform cu revendicarea 5, caracterizați prin aceea că Ri este n-propil și R2 este hidrogen.
7. 7. Compoziție farmaceutică, caracterizată prin aceea că aceasta cuprinde (-)P-P-2-hidroximetil-5-(5-fluorocitozin-1-il)-1,3-oxatiolan sau derivatul său acceptabil fiziologic, sau sarea lui acceptabilă fiziologic și un purtător acceptabil farmaceutic.
8. 8. Compoziție farmaceutică, caracterizată prin aceea că aceasta cuprinde (-)p-P-2-hidroximetil-5-(5-fluorocitozin-1-il)-1,3-oxatiolan ca enantiomer izolat sau derivatul său acceptabil fiziologic, sau sarea lui acceptabilă fiziologic și un purtător acceptabil farmaceutic.
9. 9. Compoziție farmaceutică, caracterizată prin aceea că aceasta cuprinde (-)p-P-2-hidroximetil-5-(5-fluorocitozin-1-il)-1,3-oxatiolan într-o formă îmbogățită enantiomeric, sau derivatul său acceptabil fiziologic, sau sarea lui acceptabilă fiziologic și un purtător acceptabil farmaceutic.
10. 10. Compoziție farmaceutică conform revendicărilor 7-9, caracterizată prin aceea că purtătorul este adecvat pentru administrare orală.
11. 11. Compoziție farmaceutică conform revendicărilor 7-9, caracterizată prin aceea că aceasta este sub formă de capsulă sau tabletă.
12. 12. Metodă pentru tratarea infecției cu HIV la om, caracterizată prin aceea că aceasta cuprinde administrarea compusului (-)-p-D-2-hidroximetil-5-(5-

    /27 ο^-2 Ο Ο 9 - Ο Ο 7 5 3 - -20-02-1992-fluorocitozin-1-il)-1,3-oxatiolan sau derivatul său acceptabil fiziologic, sau sarea lui acceptabilă fiziologic într-o cantitate eficientă terapeutic.
13. 13. Metodă pentru tratarea infecției cu HIV la om, caracterizată prin aceea că aceasta cuprinde administrarea compusului (-)-p-D-2-hidroximetil-5-(5fluorocitozin-1-il)-1,3-oxatiolan ca enantiomer izolat sau derivatul său acceptabil fiziologic, sau sarea lui acceptabilă fiziologic într-o cantitate eficientă terapeutic.
14. 14. Metodă pentru tratarea infecției cu HIV la om, caracterizată prin aceea că aceasta cuprinde administrarea compusului (-)-p-D-2-hidroximetil-5-(5fluorocitozin-1-il)-1,3-oxatiolan într-o formă îmbogățită enantiomeric, sau derivatul său acceptabil fiziologic, sau sarea lui acceptabilă fiziologic într-o cantitate eficientă terapeutic.