RO127524A2 - Tulpină de bacillus subtilis antagonistă faţă de ciuperci fitopatogene - Google Patents
Tulpină de bacillus subtilis antagonistă faţă de ciuperci fitopatogene Download PDFInfo
- Publication number
- RO127524A2 RO127524A2 ROA201001381A RO201001381A RO127524A2 RO 127524 A2 RO127524 A2 RO 127524A2 RO A201001381 A ROA201001381 A RO A201001381A RO 201001381 A RO201001381 A RO 201001381A RO 127524 A2 RO127524 A2 RO 127524A2
- Authority
- RO
- Romania
- Prior art keywords
- strain
- subtilis
- production
- soil
- bacillus subtilis
- Prior art date
Links
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 title claims abstract description 45
- 241000233866 Fungi Species 0.000 title claims abstract description 24
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 title claims abstract description 13
- 230000003032 phytopathogenic effect Effects 0.000 title claims description 21
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 title 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 20
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 13
- 229930192334 Auxin Natural products 0.000 claims abstract description 11
- 239000002363 auxin Substances 0.000 claims abstract description 11
- 101000693619 Starmerella bombicola Lactone esterase Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 230000008635 plant growth Effects 0.000 claims abstract description 8
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 4
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 claims abstract description 3
- 240000008067 Cucumis sativus Species 0.000 claims description 14
- 241000813090 Rhizoctonia solani Species 0.000 claims description 12
- 241000221696 Sclerotinia sclerotiorum Species 0.000 claims description 12
- SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N indole-3-acetic acid Chemical compound C1=CC=C2C(CC(=O)O)=CNC2=C1 SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 241001495426 Macrophomina phaseolina Species 0.000 claims description 11
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 8
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 8
- 241000918584 Pythium ultimum Species 0.000 claims description 7
- UHPMCKVQTMMPCG-UHFFFAOYSA-N 5,8-dihydroxy-2-methoxy-6-methyl-7-(2-oxopropyl)naphthalene-1,4-dione Chemical compound CC1=C(CC(C)=O)C(O)=C2C(=O)C(OC)=CC(=O)C2=C1O UHPMCKVQTMMPCG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 241000223218 Fusarium Species 0.000 claims description 6
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 claims description 6
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 claims description 5
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 claims description 5
- 241000918585 Pythium aphanidermatum Species 0.000 claims description 5
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 claims description 5
- 229940106157 cellulase Drugs 0.000 claims description 5
- 235000003222 Helianthus annuus Nutrition 0.000 claims description 4
- 241000223261 Trichoderma viride Species 0.000 claims description 4
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 claims description 4
- 241000223600 Alternaria Species 0.000 claims description 3
- 241000123650 Botrytis cinerea Species 0.000 claims description 3
- 235000009849 Cucumis sativus Nutrition 0.000 claims description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 claims description 3
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 claims description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims description 3
- 241000223195 Fusarium graminearum Species 0.000 claims description 2
- 244000020551 Helianthus annuus Species 0.000 claims 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 claims 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 claims 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 claims 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 abstract description 26
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract description 14
- 230000000843 anti-fungal effect Effects 0.000 abstract description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 20
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 18
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 16
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 16
- 241000208818 Helianthus Species 0.000 description 10
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 10
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 9
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 8
- 235000010799 Cucumis sativus var sativus Nutrition 0.000 description 8
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 8
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 8
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 6
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 5
- 102000003712 Complement factor B Human genes 0.000 description 5
- 108090000056 Complement factor B Proteins 0.000 description 5
- 241000223221 Fusarium oxysporum Species 0.000 description 5
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 5
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 5
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 5
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 5
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 5
- KUAZQDVKQLNFPE-UHFFFAOYSA-N thiram Chemical compound CN(C)C(=S)SSC(=S)N(C)C KUAZQDVKQLNFPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102000012286 Chitinases Human genes 0.000 description 4
- 108010022172 Chitinases Proteins 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 4
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000001674 Agaricus brunnescens Nutrition 0.000 description 3
- 241000478483 Collaria <Myxogastria> Species 0.000 description 3
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 3
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- SIHHLZPXQLFPMC-UHFFFAOYSA-N chloroform;methanol;hydrate Chemical compound O.OC.ClC(Cl)Cl SIHHLZPXQLFPMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 229930195732 phytohormone Natural products 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- IPYNIQBMIIXLIG-UHFFFAOYSA-N 1h-indol-3-ylmethyl(trimethyl)azanium Chemical compound C1=CC=C2C(C[N+](C)(C)C)=CNC2=C1 IPYNIQBMIIXLIG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ROWKJAVDOGWPAT-UHFFFAOYSA-N Acetoin Chemical compound CC(O)C(C)=O ROWKJAVDOGWPAT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 2
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000233639 Pythium Species 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 230000008485 antagonism Effects 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 2
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 2
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 2
- 229940105329 carboxymethylcellulose Drugs 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 244000038559 crop plants Species 0.000 description 2
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 2
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 2
- 244000053095 fungal pathogen Species 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N perchloric acid Chemical compound OCl(=O)(=O)=O VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 235000020238 sunflower seed Nutrition 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 230000009182 swimming Effects 0.000 description 2
- 239000010409 thin film Substances 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MUJHZQRRTJXWOT-UHFFFAOYSA-N 2,3-dihydroxybutanedioic acid;propanoic acid Chemical compound CCC(O)=O.OC(=O)C(O)C(O)C(O)=O MUJHZQRRTJXWOT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001530056 Athelia rolfsii Species 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- XFOUAXMJRHNTOP-UHFFFAOYSA-N Bacilysin Natural products CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1CCC(=O)C2OC12 XFOUAXMJRHNTOP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AFWTZXXDGQBIKW-UHFFFAOYSA-N C14 surfactin Natural products CCCCCCCCCCCC1CC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(C(C)C)C(=O)NC(CC(O)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)O1 AFWTZXXDGQBIKW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000002566 Capsicum Nutrition 0.000 description 1
- 240000008574 Capsicum frutescens Species 0.000 description 1
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 description 1
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 1
- 241000437818 Cercospora vignicola Species 0.000 description 1
- 229920002101 Chitin Polymers 0.000 description 1
- 241000588879 Chromobacterium violaceum Species 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 241000222199 Colletotrichum Species 0.000 description 1
- 241001529387 Colletotrichum gloeosporioides Species 0.000 description 1
- 241000223208 Curvularia Species 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-CUHNMECISA-N D-Cellobiose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-CUHNMECISA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 241001208371 Fusarium incarnatum Species 0.000 description 1
- 241000879804 Fusarium oxysporum f. sp. radicis-lycopersici Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 241000208152 Geranium Species 0.000 description 1
- 241000218922 Magnoliophyta Species 0.000 description 1
- OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-L Malonate Chemical compound [O-]C(=O)CC([O-])=O OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 241000282320 Panthera leo Species 0.000 description 1
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 description 1
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 241001646398 Pseudomonas chlororaphis Species 0.000 description 1
- 241000589776 Pseudomonas putida Species 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N Raffinose Natural products O(C[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O[C@@]2(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O1)[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N 0.000 description 1
- 241001361634 Rhizoctonia Species 0.000 description 1
- 241000221662 Sclerotinia Species 0.000 description 1
- 241001558929 Sclerotium <basidiomycota> Species 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 240000004460 Tanacetum coccineum Species 0.000 description 1
- 241000182983 Thielavia basicola Species 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N UNPD196149 Natural products OC1C(O)C(CO)OC1(CO)OC1C(O)C(O)C(O)C(COC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000589634 Xanthomonas Species 0.000 description 1
- ROVGZAWFACYCSP-MQBLHHJJSA-N [2-methyl-4-oxo-3-[(2z)-penta-2,4-dienyl]cyclopent-2-en-1-yl] (1r,3r)-2,2-dimethyl-3-(2-methylprop-1-enyl)cyclopropane-1-carboxylate Chemical compound CC1(C)[C@H](C=C(C)C)[C@H]1C(=O)OC1C(C)=C(C\C=C/C=C)C(=O)C1 ROVGZAWFACYCSP-MQBLHHJJSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000009604 anaerobic growth Effects 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XFOUAXMJRHNTOP-PFQXTLEHSA-N bacilysin Chemical compound C[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@H](C([O-])=O)C[C@@H]1CCC(=O)[C@@H]2O[C@H]12 XFOUAXMJRHNTOP-PFQXTLEHSA-N 0.000 description 1
- 108700023668 bacilysin Proteins 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 description 1
- 238000005452 bending Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012474 bioautography Methods 0.000 description 1
- 238000010876 biochemical test Methods 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000007474 bm medium Substances 0.000 description 1
- OWBTYPJTUOEWEK-UHFFFAOYSA-N butane-2,3-diol Chemical compound CC(O)C(C)O OWBTYPJTUOEWEK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 239000001390 capsicum minimum Substances 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000035605 chemotaxis Effects 0.000 description 1
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 1
- IQFVPQOLBLOTPF-HKXUKFGYSA-L congo red Chemical compound [Na+].[Na+].C1=CC=CC2=C(N)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3)C3=CC=C(C=C3)/N=N/C3=C(C4=CC=CC=C4C(=C3)S([O-])(=O)=O)N)=CC(S([O-])(=O)=O)=C21 IQFVPQOLBLOTPF-HKXUKFGYSA-L 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- IJKVHSBPTUYDLN-UHFFFAOYSA-N dihydroxy(oxo)silane Chemical compound O[Si](O)=O IJKVHSBPTUYDLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 229940093499 ethyl acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000019439 ethyl acetate Nutrition 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 125000001475 halogen functional group Chemical group 0.000 description 1
- GFAZHVHNLUBROE-UHFFFAOYSA-N hydroxymethyl propionaldehyde Natural products CCC(=O)CO GFAZHVHNLUBROE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 150000002475 indoles Chemical class 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000749 insecticidal effect Effects 0.000 description 1
- 108010082754 iturin A Proteins 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000000034 method Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 1
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 235000011007 phosphoric acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 229940015367 pyrethrum Drugs 0.000 description 1
- 230000018612 quorum sensing Effects 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N raffinose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- GHMLBKRAJCXXBS-UHFFFAOYSA-N resorcinol Chemical compound OC1=CC=CC(O)=C1 GHMLBKRAJCXXBS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000004576 sand Substances 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 235000021262 sour milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- NJGWOFRZMQRKHT-UHFFFAOYSA-N surfactin Natural products CC(C)CCCCCCCCCC1CC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(C(C)C)C(=O)NC(CC(O)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)O1 NJGWOFRZMQRKHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NJGWOFRZMQRKHT-WGVNQGGSSA-N surfactin C Chemical compound CC(C)CCCCCCCCC[C@@H]1CC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)O1 NJGWOFRZMQRKHT-WGVNQGGSSA-N 0.000 description 1
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 1
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000009105 vegetative growth Effects 0.000 description 1
- 230000017260 vegetative to reproductive phase transition of meristem Effects 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Prezenta invenţie se referă la o tulpină deB30, cu număr de depozit NCAIM (P) B001359 şi număr GenBankEU334510, destinată utilizării ca bioinoculant pentru tratamentul seminţelor şi solului, rezultată prin selecţia în trepte a unor izolate naturale din sol. Tulpinaprezintă un spectru larg de acţiune antifungică faţă de o serie de ciuperci fitopatogene şi, totodată, stimulează creşterea plantelor prin producere de auxine. Tulpina modelează, de asemenea, formarea de consorţii microbiene de consens cu alte bacterii utilizate ca bioinoculanţi, datorită activităţii lactonazice care influenţează semnalele AHL implicate în realizarea sensibilităţii de grup.
Description
Prezenta invenție se referă la tulpina de Bacillus subtilis B30, destinată utilizării ca bioinoculant pentru tratamentul seminței și/sau al solului, inclusiv sub forma unor biopreparate complexe.
Sunt cunoscute mai multe tulpini de Bacillus subtilis care au activitate de combatere a agenților fitopatogeni. Brevetul WO 2007/043771 se referă la compoziții pentru prevenirea bolilor plantelor pe baza tulpinilor KCCM 10639 sau KCCM 10640 de B. subtilis și un procedeu de aplicare a acestor compoziții. O serie de brevete SUA (6 060 051, 6 103 228, 6 291 426 și 6 417 163) protejează tulpina AQ / QST 713 de B. subtilis (cu număr de depozit NRRL BO-21661) care este înalt producătoare de antibiotice și cu un spectru larg de activitate insecticidă, antifungică și antibacteriană.
De asemenea au fost descrise până în prezent mai multe tulpini de Bacillus subtilis care au concomitent activitate de combatere a agenților fitopatogeni și de stimulare a creșterii plantelor. Cererea de brevet SUA 2008/0152684 descrie o tulpină de B. subtilis WG6-14 (număr de depozit NRRL B-30954), care prezintă atât activitate de stimulare a creșterii plantelor (datorită producerii de metaboliți volatili, ca de ex. acetoină și 2,3 butandiol), cât și activitate antagonistă față de ciuperci fitopatogene (Pythium aphanidermatum, Rhizoctonia solani, Colletotrichum gloesporoides, Sclerotium rolfsii) și față de bacterii fitopatogene (Xanthomonas axenopodis pv. citri, X. axenopodis pv. vesicatoria, Xanthomonas oryzae pv. oryzae). Brevetul SUA 7 211 428 expune o tulpină de B. subtilis (număr de depozit MTTC 5130) cu caracteristici de inhibarea a creșterii ciupercilor patogene (Rhizoctonia solani, Fusarium oxysporum, Fusarium semitectum, Pythium aphanidermatum, Curvularia andropogonis, Alternaria alternata, Colletotrichum acutatum, Colletotrichum capsici, Colletotrichum gloeosporiodes, Corynespora cassiicola, Thielavia basicola) și care stimulează dezvoltarea plantelor de cultură (de geranium și piretru).
Nu s-au descris până în prezent tulpini de Bacillus subtilis care să aibă concomitent activitate de antagonism față de agenții fitopatogeni din sol, de stimulare a creșterii plantelor și de modulare a sensibilității de grup, cu rol în realizarea consorțiilor și biopreparatelor multitulpinale.
Tulpina B. subtilis B30 prezintă următoarele avantaje:
creștere bogată pe mediile uzuale utilizate pentru creșterea bacililor gram pozitivi sporulați;
OFICIUL DE STAT PENTRU INVENȚII Șl MĂRClI
Cerere de brevet de invenție j
Data depozit .....2,|
-2010-01381-2 1 Ί2- 2010
capacitate de a modula formarea consorțiilor microbiene de consens cu alte bacterii utilizate ca bioinoculanți datorită activității lactonazice prin care influențează semnalele AHL implicate în realizarea sensibilității de grup;
spectru larg de acțiune împotriva atacului a numeroase ciuperci fitopatogene;
stimularea creșterii plantelor datorită producerii in situ de fitohormoni.
Prezenta invenție se ilustrează cu exemplul prezent mai jos
Exemplu. Tulpina B30 de Bacillus subtilis a fost izolată la Institutul de Cercetare-Dezvoltare pentru Protecția Plantelor, București, din probe de sol provenite din Bărăgan. Această tulpină a fost selectată dintr-o colecție de peste 250 izolate de Bacillus spp., pe baza acțiunii benefice exercitate asupra diferitelor plante de cultură (tomate, castraveți, floarea-soarelui), datorită acțiunii de protecție a plantelor față de următoarele ciuperci fitopatogene: Rhizoctonia solani, Pythium ultimum, Pythium aphanidermatum, Fusarium graminearum, Fusarium oxisporum f. sp. radicis-lycopersici, Sclerotinia sclerotiorum, Sclerotium bataticola, Alternaria spp., Botrytis cinerea, Trichoderma viride), producerii de fitohormoni și activității lactonazice prin care influențează semnalele AHL implicate în sensibilitatea de grup.
In vederea încadrării taxonomice tulpina B30 a fost caracterizată din punct de vedere morfologic (tabel 1), biochimic (tabel 2) și pe baza secvenței 16S rADN.
Tab. 1. Morfologia coloniilor de Bacillus subtilis B30 pe diferite medii după cultivare timp de 24 ore.
| Mediul utilizat | Morfologia coloniilor tulpinii B30 | |||
| culoare | aspect exterior | dimensiuni (24h) | ||
| Medii gelifiate semi-sintetice | mediul cu decoct de cartof - glucoza agar (CGA) | brune | rugoase, margini neregulate sub forma de filamente | colonii mari |
| mediu cu extract de carne (beef extract) | crem | rugoase, centrul proeminent, încrețit, margini neregulate | colonii mari | |
| mediul cu decoct de fasole | crembrun | rugoase, margini neregulate | colonii medii | |
| mediul cu extract de sol | crembrun | rugoase, margini neregulate | colonii medii | |
| Medii solide naturale | felii de cartof sterile | brun | rugoase, margini neregulate, centru cu rugozități fine | colonii mari |
| Medii lichide | mediul cu decoct de cartof - glucoza | - | peliculă fină la suprafața, rugoasă, turbiditate slabă | - |
| mediu cu extract de carne | - | peliculă fină la suprafață, rugoasă, turbiditate slabă | - |
t7C2 O 1 O - O 1 3 8 1 2 1 -12- 2010
Tab. 2. Caracteristicile fiziologice ale tulpinii de B. subtilis B30.
| Testul biochimic | Tulpina B30 |
| Reacția Gram | + |
| Reacția Voges-Proskauer | + |
| Hidroliza amidonului | + |
| Hidroliza gelatinei | + |
| Reducerea NO3->NO2 | + |
| Creștere anaeroba | - |
| Catalaza | + |
| Sursa de carbon: malonat | + |
| citrat | + |
| propionat | - |
| tartrat | + |
| trehaloza | + |
| glucoza | + |
| Acidifica: xiloza | + |
| glucoza | + |
| arabi noza | + |
| manitol | + |
| rafinoza | + |
| celobioza | + |
| Toleranta la NaCI 7% | + |
Identificarea pe baza secvenței 16S rADN s-a realizat prin amplificarea PCR utilizând primerii 27fm (5'-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3') si r1522 (5'-AAG GAG GTG ATC CAG CCG CA-3') (Weisberg et al., 1991). Produșii de amplificare enzimatică au fost separați în gel agarizat 1%, iar fragmentul 16S rADN a fost extras din gel si purificat cu chitul QIAGEN (QIAGEN Benelux BV, Venlo,Olanda). Secvențierea a fost efectuata la ServiceXS (Leiden, Olanda), fiind urmată de procesarea cu programul Vector NTI 10 (Invitrogen, SUA). Pentru identificarea taxonomică pe baza secvențelor s-au realizat cercetări referitoare la similaritatea secvențelor în Genbank, utilizând softul NCBI Taxonomy BLAST. Secvențele rezultate au fost depuse la GenBank. încadrarea taxonomică a tulpinii B30 s-a bazat pe o similaritate de cel puțin 98% între secvența 16S rADN a acestei tulpini cu cele ale altor tulpini a căror încadrare taxonomică este recunoscută. Secvențele 16S rADN pentru tulpina B30, depuse la GenBank, au numărul de acces EU334510.
Testarea activității antagoniste in vitro a tulpinii B30 a fost efectuată pe mediul cu cartof dextroza agar (CGA - PDA). Tulpina B30 (dintr-o cultura de 24 ore) a fost însămânțată pe mediu prin strierea cu ansa a unei linii drepte o distanta de 3 cm de o rondea calibrata de miceliu (5mm) din cele nouă ciuperci studiate. Plăcile Petri astfel însămânțate au fost incubate la 28°C si analizate în
<2010-01381-2 1 -12- 2010
ceea ce privește zona de inhibiție (mm) la 24, 48 si 72 ore. Experiența a fost repetata de trei ori.
Tab. 3. Testarea in vitro a activitatii antagoniste a tulpinii de Bacillus subtilis B30 asupra creșterii miceliene a unor ciuperci fitopatogene (zona de inhibiție la 72 ore, mm).
| Ciuperca fitopatogenă | Zona de inhibiție indusa de tulpina B30 (mm) |
| Rhizoctonia solani | 12 |
| Pythium ultimum | 9 |
| Pythium aphanidermatum | 6 |
| Fusarium oxisporum f. sp. graminearum | 5 |
| Fusarium oxisporum f. sp. radicislycopersici | 6 |
| Sclerotinia sclerotiorum | 5 |
| Sclerotium bataticola | 4 |
| Trichoderma viride | 8 |
| Alternaria spp. | 6 |
| Botrytis cinerea | 8 |
Rezultatele au demonstrat că tulpina B30 produce metaboliți antifungici care au inhibat dezvoltarea tuturor ciupercilor luate in studiu. Cea mai mare zona de inhibiție s-a înregistrat fata de ciuperca R. solani (12 mm) aceasta fiind urmată de P. ultimum (9 mm) si T. viride (8 mm).
Tulpina B30 a fost testată în condiții de sera in ceea ce privește eficacitatea in combaterea ciupercilor fitopatogene de sol (Rhizoctonia solani, Pythium ultimum, Fusarium oxisporum, Sclerotinia sclerotiorum și Sclerotium bataticola), care apar frecvent în stadiul de plantulă/ răsad și produc pagube datorită pierderilor de material săditor (care pot atinge până la 30% răsaduri) și care duc implicit la reducerea producției.
Operațiunile implicate au constat in pregătirea inoculului bacterian prin împrospătarea in eprubete (incubate la 27°C timp de 2-3 zile) pe mediul cartofglucoza-agar (CGA) si realizarea suspensiilor bacteriene in tampon fosfat cu titrul de 108 ufc/ml. Inoculul fungic s-a obținut in placi Roux, pe mediul natural alcătuit din boabe de ovăz dublu sterilizate la 1 atm. timp de 20 minute, prin inocularea cu miceliu si incubarea la 27°C timp de 3-4 zile.
Substratul utilizat in sera a constat din 1/2 pământ de grădină + 1/4 mraniță + 1/4 nisip. Acesta a fost amestecat uniform cu inoculul fungic ( ~ 2 x 106 spori/ kg sol) si apoi distribuit in tăvi din plastic (32/24 cm) cu 48 ore înainte de semănat.
Materialul vegetal, respectiv semințele de floarea soarelui (Festiv), tomate (Unirea) si castravete (Cornichon) au fost tratate înainte de semănat prin imersie, timp de 20 minute, in suspensiile bacteriene al căror titru a fost stabilit la 108 ufc/ml.
',x
CV 2 Ο 1 ο - Ο 1 3 8 1 - 2 1 -12- 2010
In primul experiment au fost testate împreuna cu B30 alte 5 tulpini de B.
subtilis si anume: Bs23, Bs27, Bs36, Bs45, Bs48. Inocul fungic aplicat a constat in complexul R. solani + F. oxysporum f. sp. graminearum + P. de baryanum (RFP), S. sclerotiorum si S. bataticola. Au fost utilizate semințe de floarea soarelui (Festiv) si castraveți (Cornichon).
Experimentul a fost analizat după 3 săptămâni de la semănat în ceea ce privește eficacitatea tulpinilor în combaterea ciupercilor fitopatogene. De asemenea, s-a analizat efectul de stimulare a creșterii plantelor prin măsurarea lungimii rădăcinii, a tulpinii și lungimea totală a plantelor.
Calculul analizei variantei s-a efectuat cu programul ANOVA.
Analiza variantei pentru cei trei parametri luați in considerare, lungimea rădăcinii, a tulpinii și lungimea totală a plantelor, pentru cele doua culturi, floarea soarelui și castraveți a evidențiat următoarele:
La cultura de floarea-soarelui, lungimea rădăcinii a fost influențată de factorul A (inoculul fungic) independent de factorul B - inoculul bacterian (Tab. 4). Complexul fungic R.F.P (Rhizoctonia-Fusarium-Pythlum) a înregistrat cele mai mari valori, asigurate statistic fata de celelalte doua ciuperci studiate, care au exercitat un efect egal.
Tab. 4. Lungimea rădăcinii (mm) plantelor de floarea-soarelui (cv. Festiv) sub influența tratamentelor biologice cu diferite izolate de B. subtilis la sămânță și cu inoculanți fungici aplicați în sol.
| Factor A (inocul fungic) | Tiradin 70 PU (4g/kg) | Martor nebact., inoculat | Bs23 | Bs27 | Bs30 | Bs36 | Bs45 | Bs48 | Medii factor A |
| R-F-P | 59,05bcd | 27,77i | 68,68b | 59,57bcd | 94,82a | 65,27bc | 39,40ghi | 55,87b-f | 63,25a |
| Ss | 49,03c-g | 27,85i | 40,31f-i | 37,61ghi | 60,83bc | 30,96hi | 59,76bcd | 36,67ghi | 45,78b |
| Sb | 51,02c-g | 27,33i | 40,35f-i | 32,44hi | 41,79e-i | 26,51 i | 56,78b-e | 44,6d-h | 41,19b |
| Medii factor B | 53,04b | 27,65e | 49,781 bc | 43,208bc | 65,817a | 40,917cd | 52,01b | 45,70bc |
Valorile urmate de aceeași litera nu diferă semnificativ pentru P<0,05 (DS A5%=5,306 DS B5%=10,202 DS AB5%= 15,919)
Studiul interacțiunii tratamentelor biologice asupra rădăcinilor plantelor de floarea-soarelui, au relevat următoarele: (/) în cazul utilizării complexului ciupercilor fitopatogene de sol R.F.P. tulpina B30 a determinat cele mai mari creșteri ale rădăcinilor plantelor (asigurate statistic față de martorul netratat) urmate de izolatele de B. subtilis Bs23 și Bs36; (//) în variantele solulului inoculat cu ciuperca S. sclerotiorum, cele mai mari creșteri vegetative ale rădăcinilor s-au notat la plantulele rezultate din semințele bacterizate cu tulpina de B. subtilis B30.
Ο 1 Ο - Ο 1 3 81 - 2 1 -12- 2010
Inoculul fungic, independent de cel bacterian, a influențat cel mai semnificativ dezvoltarea plantelor de floarea soarelui, respectiv lungimea totala a acestora, in cazul complexului fungic Rhizoctonia-Fusarium-Pythium.
Tab. 5. Lungimea totala a plantelor de floarea-soarelui (mm) sub influența tratamentelor biologice cu inoculanți bacterieni la sămânță și fungici aplicați în sol
| Factor A (inocul fungic) | Tiradin 70 PU (4g/kg) | Martor nebact. Inoculat | Bs23 | Bs27 | Bs30 | Bs36 | Bs45 | Bs48 | Medii factor A |
| R-F-P | 136,11d-f | 73,11lm | 150,39cd | 134,68def | 186,53a | 129,35efg | 104,15ij | 117,23g-j | 133,57a |
| Ss | 115,66g-j | 65,23m | 124,66fgh | 123,36fgh | 127,74efg | 113,71g-j | 133,86def | 128,29efg | 119,60b |
| Sb | 127,23e-h | 78,22lm | 118,80f-j | 100,24jk | 144,51cde | 105,88ij | 121,38f-i | 113,83g-j | 118,43b |
| Medii factor B | 126,34bc | 72,19d | 131,28b | 119,42bc | 152,92a | 116,32c | 119,80bc | 119,78bc |
Valorile urmate de aceeași litera nu diferă semnificativ pentru P<0,05 (DS A5%= 6,263 DS B5%= 12,041 DS AB5%= 18,789)
Izolatele de B. subtilis, independent de ciupercile de sol testate, au determinat cele mai mari creșteri ale lungimii totale a plantelor, pe solul infectat cu complexul R.F.P. și cel infectat cu ciuperca S.bataticola, asigurate statistic fata de martorul netratat, in varianta bacterizată cu B. subtilis B30. Acestea au avut valori distinct semnificative față de tulpinile Bs23, Bs27, Bs45, Bs48 și Bs36.
Interacțiunea celor două tipuri de inocul biologic a demonstrat faptul că tulpina B30 a favorizat distinct semnificativ creșterea totală a plantelor de floareasoarelui comparativ cu martorul netratat și cu varianta tratată chimic.
Calculul eficacității tratamentelor cu B. subtilis la sămânța de floareasoarelui (cv. Festiv), în prevenirea atacului ciupercilor de sol luate în studiu, a reflectat faptul că tulpina B30 a avut o eficacitate de combatere a complexului ciupercilor fitopatogene de sol R.F.P. superioară (77%) comparativ cu martorul etalon chimic (70%).
Lungimea totală a plantelor de castraveți (tab.6) a fost influențată de tratamentele biologice cu inoculanții fungici, valori distinct semnificative, asigurate statistic fata de martorul netratat, rezultând în varianta inoculată cu S. bataticola. Tratamentul cu tulpina de B. subtilis B30, independent de tratamentele cu patogenii fungici, a influențat pozitiv lungimea totală a plantelor, valorile rezultate în urma analizei varianței fiind distinct semnificative comparativ martorul netratat. Interacțiunea celor doua tipuri de inoculanți, bacterian si fungic, a relevat faptul ca tulpina B30 a determinat creșteri distinct semnificative ale lungimii totale a plantelor de castraveți față de martorul netratat si varianta tratata chimic.
(^-2 0 1 0 - 0 1 3 8 1 -2 1 -12- 2010
Tab. 6. Lungimea totala a plantelor de castraveți (Cornichon) sub influenta inoculului bacterian aplicat la semințe (factor B) si a celui fungic (factor A) aplicat in sol.
| Factor A (inocul fungic) | Tiradin 70 PU (4g/kg) | Martor nebact. inoculat | Bs23 | Bs27 | Bs30 | Bs36 | Bs45 | Bs48 | Medii factor A |
| R-F-P | 100,34d-f | 43,33lm | 78,11 hk | 77,77h-k | 123,59ab | 95,74e-g | 88,55e-i | 89,44e-i | 89,921b |
| Ss | 110,20bc | 35,82m | 97,06eg | 87,33f-j | 119,00abc | 81,26g-i | 104,11cde | 73,83ijk | 91,56ab |
| Sb | 88,626e-j | 38,92m | 65,08j-l | 93,030eh | 125,85ab | 101,10df | 104,167cde | 114,627bcd | 95,97a |
| Medii factor B | 99,725b | 39,35e | 80,08d | 86,04cd | 122,81a | 92,70bc | 98,94b | 92,63bc |
Valorile urmate de aceeași litera nu diferă semnificativ pentru P<0,05 (DS A5%= 5,413; DS B5%= 10,408; DS AB5%= 16,241).
Tab. 7. Eficacitatea unor tulpini de B. subtilis în combaterea ciupercilor telurice la cultura de castraveți (Cornichon) în condiții de seră (21-24°C și 70% umiditate relativă).
| Inocul fungic* | R.F.P. | S. s. | S.b. | |||
| Varianta (cod izolat) | % plante sănătoase răsărite | Eficacitatea (%) | % plante sănătoase răsărite | Eficacitatea (%) | % plante sănătoase răsărite | Eficacitatea (%) |
| Bs 23 | 60 | 27 | 87 | 74 | 80 | 57 |
| Bs 27 | 58 | 24 | 70 | 40 | 87 | 72 |
| Bs 30 | 98 | 96 | 100 | 100 | 90 | 79 |
| Bs 36 | 72 | 49 | 78 | 56 | 73 | 43 |
| Bs 45 | 74 | 53 | 79 | 58 | 79 | 55 |
| Bs 48 | 79 | 62 | 82 | 64 | 85 | 68 |
| Tiradin 70 PU (4g/kg) | 93 | 87 | 98 | 96 | 90 | 79 |
| Mt. Netratat | 45 | - | 50 | - | 53 |
* RFP = R. solani + F. oxysporum + P. de baryanum; S.s. = S. sclerotiorum; S.s. = S. bataticola.
Calculul eficacității (%) tratamentelor cu B. subtilis la sămânța de castraveți (Cornichon), tab.7, a reflectat următoarele:
- In variantele infectate cu complexul R.F.P. si cu S. sclerotiorum cea mai mare eficacitate (96 și respectiv 100%) s-a înregistrat in variantele tratate cu tulpina B30.
- In varianta infectată cu S. bataticola, cea mai mare eficacitate a rezultat în cazul utilizării tulpinii Bs30 (79%).
- In varianta infectată cu S. Sclerotiorum eficacitatea tratamentului semințelor cu B30 a fost egală cu cea din varianta martorului etalon chimic (79%).
^-2010-01381--
I -12- 2010
In cadrul unei alte serii de experimente semințele de castraveți (varietatea Cornishon) au fost inoculate prin imersie cu cu următoarele tulpini de Bacillus subtilis; Bs 1.98a; Bs sal; Bs lobi; Bs 98 și B30urmărindu-se analiza capacității de protecție a culturii de castraveți față de infecția cu 5 ciuperci fitopatogene telurice: Fusarium oxysporum, Sclerotium bataticola, Pythium de baryanum, Rhizoctonia solani și Sclerotinia sclerotiorum.
Tabel 9. Eficacitatea tulpinilor de B. subtilis în combaterea ciupercilor fitopatogene de sol la cultura de castraveți (Cornichon) în condiții de seră (2124°C și 70% umiditate relativă).
| Inocul | Fusarium | Sclerotium | Sclerotinia | Pythium | Rhizoctonia | ||||
| fungic-> | oxysporum | bataticola | sclerotiorum | ultimum | solani | ||||
| Variant | % | Eficaci | % | Eficaci | % | Eficaci | % Eficaci | % | Eficaci |
| a | plante | -tatea | plante | -tatea | plante | -tatea | plante -tatea | plante | -tatea |
| (cod | sânâtoa | (%) | sânâtoa | (%) | sânâtoa | (%) | sânâtoa (%) | sânâtoa | (%) |
| izolat) | -se | -se | -se | -se | -se | ||||
| răsărite | răsărite | răsărite | răsărite | răsărite | |||||
| Bs | 70 | 50 | 70 | 40 | 90 | 82 | 70 50 | 45 | 15 |
| 1.98a | |||||||||
| Bs sal | 76 | 60 | 80 | 60 | 93 | 87 | 77 62 | 63 | 43 |
| Bs lobi | 87 | 78 | 83 | 66 | 98 | 96 | 90 88 | 87 | 80 |
| Bs 98 | 70 | 50 | 70 | 40 | 90 | 82 | 65 42 | 83 | 74 |
| Bs 30 | 93 | 88 | 90 | 80 | 100 | 100 | 100 100 | 93 | 89 |
| Tiradin | 77 | 65 | 90 | 80 | 87 | 76 | 93 88 | 77 | 65 |
| 70 PU | |||||||||
| (4g/kg) | |||||||||
| Mt. | 40 | - | 50 | - | 45 | - | 40 | 35 | - |
| netratat |
Calculul eficacității tratatamentelor cu B. subtilis aplicate la semințele de castraveți a condus la următoarele observații (tab. 9):
- în variantele tratate cu B. subtilis B30 s-au înregistrat cele mai mari valori ale eficacității pentru toate cele 5 ciuperci studiate, iar în cele în care solul a fost infectat cu S. sclerotiorum și P. ultimum, eficacitatea a fost de 100%, valoare absentă în varianta martorului etalon chimic (care a înregistrat valori de 76 și respectiv 88%).
- In variantele infectate cu F. oxysporum, cea mai mare eficacitate s-a obținut în urma utilizării tulpinii de B. subtilis B30 (88%) urmată de B. subtilis Bs lob 1 (78%).
- Pe solul infectat cu S. bataticola, varianta inoculată cu B. subtilis B30 a avut cea mai mare eficacitate (80%). Cea mai slabă eficacitate s-a înregistrat în variantele tratate cu tulpinile Bs 1.98a și Bs 98 (au avut o eficacitate egală de 40%).
¢^-2 0 1 0 - 0 1 3 8 1 -2 1 -12- 2010
- Pe solul infectat cu P. ultimum, eficacitatea maximă s-a înregistrat în varianta tratată cu tulpina de B. subtilis B30 (100%), aceasta fiind urmată de varianta tratată cu B. subtilis Bs lob 1 (88%).
- Eficacitatea tratamentelor biologice pe solul infectat cu R. solani, a evidențiat varianta tulpinii B. subtilis B30 (89%), urmată de tulpinile de B. subtilis Bs lobi și Bs 98. Cea mai mică eficacitate a avut-o varianta în care semințele s-au tratat cu B. subtilis Bs 1.98 (15%).
- Pe solul infectat cu S. sclerotiorum, cea mai mare eficacitate s-a obținut în varianta tratată cu B. subtilis B30(100%), urmată de varianta B. subtilis Bs lobi (96%).
In vederea extracției metaboliților antifungici a fost selectat mediul cel mai favorabil pentru producerea acestora si anume mediul Landy (Akpa et al., 2001) si mediul optimizat pentru producerea de antibiotice (Jacques, 1999). De asemenea s-au selectat solvenții pentru extracție si anume etilacetat + 1% acid formic, care au permis obținerea unui extract brut cu cea mai mare acțiune antagonistă față de ciupercile fitopatogene de sol.
Baloane Erlenmayer (250 ml) cu 25 ml mediu Landy au fost inoculate cu tulpina B30 și incubate la 28°C, cu agitare la 150 rpm timp de 72 ore. Supernatantul a fost amestecat in proporție de 1:1 cu solventul și incubat la 28°C si agitat la 150 rpm/min timp de 8 ore, după care a urmat extracția propriu-zisă prin centrifugare la 4000 rpm/min si 4°C timp de 20 minute.
Faza organica a fost colectata si concentrata pe un evaporator rotativ in vid pana la uscare.
In vederea separării si identificării fracțiunilor active din extractul brut, placi cromatografice din aluminium cu silicagel (HPTLC 20x20 cm silica gel60 F254S, Merck) au fost revelate in sistemul de solvenți cloroform - metanol - apa (65:25:4 v/v/v). Din extractul brut au fost aplicați 10 μΙ per spot, iar frontul de migrare s-a limitat la 7 cm. Plăcile au fost vizualizate in lumina UV la 254 nm și s-au notat factorii de retenție.
Pentru identificarea spoturilor active fata de Fusarium oxysporum f. sp. radicis-lycopersici (Forl) și Rhizoctonia solani (Rs), s-a făcut testul bioautografie, care a constat în acoperirea cu 1% mediu cu cartof dextroza agar (PDA), inoculat cu sporii ciupercilor în concentrație de 2x106 spori/ml. Plăcile cromatografice au fost incubate la 28°C timp de 72-96 ore după care s-au vizualizat.
Rezultatele sunt prezentate în tabelul 10. Rezultatele au aratat că B30 produce 2 metaboliți antifungici și anume Bacilysin și Iturin A, fapt confirmat de zonele clare prezente pe plăcile auto(bio)grafice ^-2010-01381-2 1 “12- 2010
Tabel 10. Valorile Rf ale extractului brut provenit din tulpina B30 în sistemul cloroform - metanol - apa (65:25:4 v/v/v) vizualizate la 254 nm și pe plăcile auto(bio)grafice.
| Tulpina | Valori Rf în sistemul cloroform metanol - apa (65:25:4 v/v/v) vizualizat la 254 nm | Antibiotic antifungic (Loeffer, 1986) | Valorile Rf ale spoturilor active față de : | |
| Fort | Rs | |||
| B30 | 0,09 0,20 0,35 0,40 | Bacilizină Iturină A | ++ +++ | ++ ++++ |
Legenda: zona de inhibiție ++ > 5 mm; +++ > 7 mm; ++++ >10 mm; Rf= factor de retenție
Tulpina B30 a fost caracterizată în ceea ce privește producerea unor compuși care pot contribui la activitatea de protecție biologică a acesteia. Chitinaza și proteaza au un rol în antagonism prin degradarea peretelui celulelor fungice, celuloza este importanta pentru colonizarea rădăcinilor plantelor, iar lactonaza acționează asupra fitopatogenilor gram-negativi care utilizează acilhomoserin-lactona (AHL) ca semnal implicat în sensibilitatea de grup (quorum sensing).
Testul pentru producerea de proteaze a fost efectuat pe mediul Bazai (BM; Meyer and Abdallah, 1978) agarizat completat cu lapte smântânit 5%. Tulpina B30 a fost inoculată prin înțeparea mediului, după care plăcile au fost incubate la 28°C. După 5 zile acestea au fost analizate pentru prezenta zonelor clare in jurul locului de inoculare, acestea indicând producerea de proteaze.
Activitatea celulazică o fost determinata prin descompunerea substratului carboxi-metil-celuloza. Tulpina B30 a fost însămânțată pe plăci cu mediu LC agarizat care în partea superioară s-au acoperit cu un strat de agar + 1% carboxi-metil-celuloza. După 5 zile de incubare la 28°C, plăcile au fost colorate pentru 30 minute cu 0,3% roșu de Congo. Ulterior acestea au fost clătite cu apă de robinet, iar colorantul a fost fixat prin incubare pentru 15 min cu 10% acid acetic. Prezența unei zone clare a indicat producerea de celulaze.
Producerea de chitinaze a fost analizată prin descompunerea substratului CM-chitin-RBV (Carboxi-metil-chitină cuplată cu Remazol Brilliant Violet, Loewe Biochemica GmbH, Germania). B30 a fost însămânțată pe plăci cu mediu BM agarizat, care în partea superioară s-au acoperit cu un strat de agar + 50% (v/v) CM-Chitin-RBV ca sursa de carbon. După 5 zile acestea au fost analizate pentru prezența zonelor clare în jurul locului de inoculare, acestea indicând producerea de chitinaze.
¢^2010-01381-2 1 -12- 2010
Producerea de lactonază de către B30 a fost analizata prin inocularea a 2 ml de LB suplimentat cu 5 μΜ C6-hexanoil-homoserin-lactona (C6-HHL) si crescut peste noapte la 28 °C și agitare 150 rpm/min. A fost folosit un martor negativ reprezentat de un mediul neinoculat care a fost incubat în aceleași condiții pentru a verifica dacă se produce lactoliză. Plăci Petri cu mediul LB + 50 pg/ml Km au fost însămânțate cu tulpina biosenzor Cv026 de Chromobacterium violaceum (transformata sa nu producă A/-acil homoserin lactona). Godeuri tăiate (5 mm 0) in mediul inoculat in plaja cu Cv06 au fost umplute cu 100 μΙ din cultura de B30. Plăcile au fost incubate peste noapte la 28°C si analizate pentru prezenta/ absenta halourilor violacee in jurul godeurilor inoculate cu bacteria. Absenta culorii a indicat faptul ca toata C6-HHL a fost degradata si deci producerea de lactonaza.
Rezultatele au demonstrat ca tulpina B30 produce protează, celulaza și lactonază, dar nu produce chitinază.
In alte experimente s-a realizat testarea mobilități tulpinii B30. Mobilitatea joaca un rol major în colonizarea rădăcinilor plantelor și este factorul direct implicat în mecanismul de combatere biologica prin competiție pentru nutrienți si spațiu. Bacillus subtilis B30 a fost testat pentru mobilitatea de migrare la suprafața agarului (swimming) și de agregare ca urmare a chemotaxiei (swarming), împreuna cu o tulpina martor cunoscută ca fiind nemobilă, P. putida PCL1760.
Testul a constat in utilizarea unor culturi proaspete care au fost inoculate prin înțepare in centru plăcilor Petri cu mediu LB suplimentat cu agar in procent de 0,3% (pentru swimming) și 0,5% (pentru swarming).
Tulpina B30 a demonstrat că posedă ambele tipuri de mobilitate, acest rezultat confirmând și producerea de către această tulpină de protează și surfactin.
Prezenta auxinei în supernatantul culturii tulpinii B. subtilis B30 a fost detectată printr-o metoda colorimetrică specifică pentru compușii indolici. Pe scurt, patru tulpini de B. subtilis au fost inoculate in mediul nutrient broth (NB: peptonă 5 g; extract drojdie 1,5 g, extract carne 1,5 g, NaCI 5 g) cu și fără triptofan (precursorul auxinei; 100 mg/ml) și incubate la 30°C și 150 rpm. După o zi, 4 si 8 zile de la incubare, 5 ml au fost centrifugați la 13.000 rpm timp de 10 minute. Doi mililitri din supematant au fost transferați într-un tub nou, în care s-au adăugat 100 μΙ 10 mM acid ortofosforic si 4 ml reactiv Salkowski (2% soluție FeCI3 0,5 M în 35% acid percloric). Absorbanța a fost citită la 530 nm, după menținerea tuburilor pentru 30 minute la temperatura camerei.
^“2 0 1 0 - 0 1 3 8 1 -2 1 -12- 2010
Atunci când compușii auxiriici sunt produși în mediu adăugarea reactivului Salkowski determină virarea culorii către roz. Concentrația acidului indolil 3 acetic (IAA) în culturile studiate s-a determinat prin utilizarea unei curbe standard realizate cu concentrații diferite de auxină. Toate tulpinile analizate au atins faza staționară de creștere în 24 ore, dar la acel moment nu s-a detectat auxina în mediile de cultură. După 8 zile de cultivare în mediul NB, cu și fără triptofan, toate tulpinile cercetate au produs auxina.
Toate tulpinile de Bacillus subtilis testate au răspuns pozitiv la prezența triptofanului în mediu. Tulpina B30 a produs 6,64 pg/ml auxină fără triptofan și 8,4 pg/ml cu triptofan. Cantitatea de auxina produsă de către toate izolatele testate a variat între 6 si 6,64 pg/ml (NB fără triptofan) și 7,64 - 8,4 pg/ml cu triptofan (NB suplimentat cu triptofan, 100 pg/ml mediu).
In concluzie tulpina B30 a demonstrat că are calități de agent de combatere biologică față de un număr mare de ciuperci fitopatogene de sol, având și o activitate de stimulare a creșterii plantelor datorită producerii de auxine.
Tulpina B30 produce bacilizină și iturină A, antibiotice lipopolipeptidice, sintetizate nonribozomal, cu acțiune de inhibare a dezvoltării ciupercilor fitopatogene. De asemenea tulpina B30 produce celulază, protează și lactonază, enzime care joacă un rol important stoparea / inhibarea unor mecanisme care stau la baza fitopatogenității unor microorganisme. Lactonaza interfera cu sensibilitatea de grup a bacteriilor care utilizează semnale AHL, deci poate modula formarea de consorții bacteriene și poate fi utilizat pentru producerea de biopreparate politulpinale.
B. subtilis B30 a dovedit ca este mobil pe medii (semi)agarizate, proprietate care poate fi corelată cu producerea de protează.
Tulpina B30 are capacitatea de a transforma precursorii aminoacizi (triptofan) în fitohormoni auxinici.
Utilizarea tulpinii B. subtilis B30 (număr de depozit NCAIM (P) B001359 și număr GenBank EU 334510) ca bioinoculant reprezintă o soluție alternativă la utilizarea pesticidelor în combaterea ciupercilor fitopatogene.
Claims (1)
- Revendicare1. Tulpina de Bacillus subtilis B30, cu numărul de depozit NCAIM (P) B001359 caracterizată prin aceea că: este antagonistă față de ciupercile fitopatogene: Rhizoctonia solani, Pythium ultimum, Pythium aphanidermatum, Fusarium graminearum, Fusarium oxisporum f. sp. radicis-lycopersici, Sclerotinia sclerotiorum, Sclerotium bataticola, Alternaria spp., Botrytis cinerea, Trichoderma viride, datorită producerii de antibiotice lipopetidice, baciizină și iturină A, precum și de enzime hidrolitice: celulază și protează, are activitate de stimulare a creșterii plantelor de tomate, castraveți și floarea-soarelui datorită producerii de hormoni auxinici, modulează formarea consorțiilor microbiene de consens cu alte bacterii utilizate ca bioinoculanți datorită activității lactonazice prin care influențează semnalele AHL implicate în realizarea sensibilității de grup.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ROA201001381A RO127524A2 (ro) | 2010-12-21 | 2010-12-21 | Tulpină de bacillus subtilis antagonistă faţă de ciuperci fitopatogene |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ROA201001381A RO127524A2 (ro) | 2010-12-21 | 2010-12-21 | Tulpină de bacillus subtilis antagonistă faţă de ciuperci fitopatogene |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RO127524A2 true RO127524A2 (ro) | 2012-06-29 |
Family
ID=46319374
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ROA201001381A RO127524A2 (ro) | 2010-12-21 | 2010-12-21 | Tulpină de bacillus subtilis antagonistă faţă de ciuperci fitopatogene |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RO (1) | RO127524A2 (ro) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113677207A (zh) * | 2019-03-19 | 2021-11-19 | 地中海感染基金会 | 突变型内酯酶的新用途以及组合物 |
-
2010
- 2010-12-21 RO ROA201001381A patent/RO127524A2/ro unknown
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113677207A (zh) * | 2019-03-19 | 2021-11-19 | 地中海感染基金会 | 突变型内酯酶的新用途以及组合物 |
| CN113677207B (zh) * | 2019-03-19 | 2023-10-13 | 地中海感染基金会 | 突变型内酯酶的新用途以及组合物 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Thilagavathi et al. | A combination of biocontrol agents improves the management of dry root rot (Macrophomina phaseolina) in greengram | |
| Messiha et al. | Stenotrophomonas maltophilia: a new potential biocontrol agent of Ralstonia solanacearum, causal agent of potato brown rot | |
| Fouda et al. | Biotechnological applications of fungal endophytes associated with medicinal plant Asclepias sinaica (Bioss.) | |
| KR101065262B1 (ko) | 항진균 물질과 식물 생장조절 물질을 동시에 생산하는신규한 바실러스 서브틸리스 ｅｂ-045(ｋａｃｃ-91355ｐ)및 그의 배양물을 포함한 식물병 방제제 | |
| Kulimushi et al. | Efficacy of Bacillus amyloliquefaciens as biocontrol agent to fight fungal diseases of maize under tropical climates: from lab to field assays in south Kivu | |
| CN115637241B (zh) | 一株大豆根腐病防病促生细菌RH_Pc03及其应用 | |
| Khalil et al. | Involvement of secondary metabolites and extracellular lytic enzymes produced by plant growth promoting rhizobacteria in inhibiting the soilborne pathogens in Faba Bean Plants | |
| Abada et al. | Management Fusarium wilt of sweet pepper by Bacillus strains | |
| Benaissa et al. | Antagonistic effect of plant growth promoting rhizobacteria associated with Rhus tripartitus on gram positive and negative bacteria. | |
| US8250806B2 (en) | Microbial blend compositions and methods for their use | |
| El-Akshar et al. | Endophytic chitinase and antifungal metabolites-producing actinobacteria for biological control of cucumber damping off disease | |
| CN107075459A (zh) | 芽孢杆菌属的新型细菌及其用途 | |
| Shobha et al. | Induction of systemic resistance by rhizobacterial and endophytic fungi against foot rot disease of Piper nigrum L. by increasing enzyme defense activity | |
| KR20080045346A (ko) | 신규한 바실러스 서브틸리스 엠27 균주 및 이를유효성분으로 한 식물 균핵병 방제 방법 | |
| CN120060380B (zh) | 一种用于生物防治的链霉菌发酵液的制备方法 | |
| RO127514B1 (ro) | Tulpina de bacillus subtilis cu activitate de combatere a agenţilor fitopatogeni din sol, stimulare a creşterii plantelor şi biodegradare controlată a materialului vegetal | |
| CN102925394A (zh) | 一种防病促生长植物内生枯草芽孢杆菌 | |
| RO127468A2 (ro) | Tulpină de bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum cu acţiuni benefice diverse asupra plantelor de cultură | |
| RO127524A2 (ro) | Tulpină de bacillus subtilis antagonistă faţă de ciuperci fitopatogene | |
| KR20120035534A (ko) | 스트랩토마이세스 에시디스케비에스 ｊａ（ⅱ）-10 균주, 이를 함유하는 식물 잿빛곰팡이병 방제용 미생물 제제 및 잿빛곰팡이병 방제방법 | |
| CN104982459B (zh) | 一株短小芽孢杆菌n103‑1及其应用 | |
| Patel-Ishita et al. | Evaluation of antagonistic potential of actinomycetes against phytopathogenic fungi | |
| RO125650A2 (ro) | Tulpină de bacillus subtilis utilizabilă ca bioinoculant | |
| Pérez-Cordero et al. | Antifungal activity of secondary metabolites produced by Burkholderia cepacia against Colletotrichum gloesporioides | |
| Abdel-Monaim | Salicylic acid and Pseudomonas fluorescens as safe control means against Rhizoctonia solani in guar (Cyamopsis tetragonoloba (L.) Taub.) |