RO130324B1

RO130324B1 - Sistem pentru proliferarea celulelor stem

Info

Publication number: RO130324B1
Application number: ROA201400715A
Authority: RO
Inventors: Bogdan Constantin Vlădilă
Original assignee: Bogdan Constantin Vlădilă
Priority date: 2012-03-21
Filing date: 2013-03-21
Publication date: 2018-10-30
Also published as: IL234764B; HK1203871A1; EP2827948B1; IL234764A0; CN104203342B; US10137309B2; CN104203342A; MX356503B; MX2014011369A; RO130324A2; AU2013237428A1; EA201491739A1; EP2827948A1; WO2013139915A1; EA029985B1; US20150140633A1; KR20140147853A; AP2014008022A0; RO128805A2; RO128805B1

Description

Prezenta invenție se referă la un sistem de proliferare a celulelor stern și la o metodă de proliferare a celulelor stern. în particular, prezenta invenție se referă la un sistem și o metodă corespunzătoare pentru aplicarea locală a unui câmp magnetic (MF) de extrem de joasă frecvență (ELF) la celulele stern din țesutul celular, în care țesutul celular este in vivo, sau cultivate in vitro.

Studiile efectuate la centre de cercetare precum MIT (Massachusetts Institute of Technology) și Albert Einstein Medicine College au arătat că aplicarea câmpurilor electromagnetice sub forma unor impulsuri de foarte de foarte joasă frecvență, similare undelor cerebrale, conduc la o creștere a potențialului electric la nivelul membranei celulare. Acest rezultat are efecte benefice, precum împiedicarea penetrării celulelor de către microbi și viruși, cât și împiedicarea ratei de dezvoltare a acestora în corp și îmbunătățirea circulației sanguine care, la rândul său, îmbunătățește oxigenarea celulelor. Un alt efect benefic care a fost observat este o îmbunătățire a schimbului de ioni de calciu (Ca₂), care rezultă dintr-un influx extracelular la nivel celular, și o rezistență crescută a corpului la factori apoptotici.

Un sumar al studiilor din acest domeniu a fost realizat de Richard A. Luber et. al. în Efectele stimulilor electromagnetici asupra oaselor și celulelor osoase in vitro^-. Inhibarea răspunsurilor la hormonul paratiroid prin câmpuri de joasă frecvență, de mică putere (în engleză: Effects of electromagnetic stimuli on bone and bone cells în vitro: Inhibition of responses to parathyroid hormone by low-energy low-frequency ftelds, publicată în Proc. NatL. Acad. Sci. USA, voi. 79, pp. 4180-4184, iulie 1982: Științe Medicale). în această referință, o îmbunătățire semnificativă în vindecarea fracturilor compuse este descrisă ca rezultat al supunerii acestora la o pulsație de câmp ELF cu o frecvență care variază de la 10 la 90 Hz.

Utilizarea frecvenței joase este cunoscută în domeniul stomatologiei, pentru creșterea circulației sanguine la nivelul gingiilor, spre exemplu așa cum este cunoscută din cererea de brevet internațional WO 2006001644. Dispozitivul descris în această cerere constă dintr-un generator de joasă frecvență care este conectat la suportul unui electrod de silicon printr-un cablu. Electrodul de silicon este aplicat pe gingie în zona cerută pentru intensificarea circulației sanguine și pentru ajutor în atenuarea durerilor.

Principalul dezavantaj al acestei tehnici este că, în mod contrar efectelor căutate ale aparatului și ale metodei prezentei invenții, conform căreia aplicarea câmpului magnetic ar trebui să rămână nemodificată prin aplicarea unui curent constant fără variații, frecvența joasă din WO 2006001644 nu poate fi aplicată pe durate lungi de timp.

Un alt exemplu de câmp magnetic sau electromagnetic ELF comparabil este prezentat în cererea canadiană de brevet CA 1202804, care descrie utilizarea ELF pentru corectarea anomaliilor poziționale ale dinților. Efectul obținut prin această tehnică ajută refacerea țesuturilor moi ale maxilarului superior și inferior, prin aplicarea unor magneți permanenți, electromagneți sau bobine de inducție electromagnetică supuse unui câmp de foarte joasă frecvență la nivelul regiunii bucale relevante. Gama de frecvențe ELF este produsă de mișcările mandibulei, care interacționează cu niște electroliți adiacenți pentru producerea unui curent de regenerare.

Principalul dezavantaj al acestei tehnici este că valoarea curentului ELF obținut nu poate fi constant și nici nu poate fi ajustată în funcție de cerințele tratamentului celular, întrucât depinde de acțiunile umane de scurtă durată.

Cererea japoneză de brevet JP 2001026529 prezintă un aparat care este prevăzut cu un generator de joasă frecvență și cu un generator de înaltă frecvență pentru curățarea tartrului sau a gingiei, în scopul de a stimula funcțiile limfatice ale gingiei și de a preveni și trata bolile parodontale.

RO 130324 Β1

Principalul dezavantaj al acestei tehnici este că, din nou, contrar efectelor dorite ale aparatului și metodei acestei invenții, frecvențele joase și înalte din JP 2001026529 nu pot fi aplicate pe perioade lungi de timp, iar aparatul curăță numai dinții și nu poate fi folosit în scopul terapiei gingivale.

Astfel, aparatele cunoscute în domeniu generează impulsuri electromagnetice de foarte joasă frecvență, cu intensități și amplitudini uneori în mod semnificativ mai mici decât cele atribuibile magnetismului terestru. Totuși, astfel de câmpuri electromagnetice includ o componentă de curent și afișează oscilații din același motiv, de aceea efectele la nivel celular ale acestor aparate rămân sub cele optime.

Cercetări anterioare asupra culturilor de celule gingivale, ale căror rezultate sunt prezentate pe scurt în WO 2012/093277, au arătat că generarea unui câmp electromagnetic de extrem de joasă frecvență (ELF) și supunerea celulelor organice la acest câmp produce un efect de regenerare semnificativ asupra celulelor. Culturile de celule gingivale au fost introduse în vase Petri și au fost supuse unui câmp electromagnetic având diferite impulsuri și intensități, pentru perioade de timp diferite, atunci când vasele Petri au fost plasate în interiorul unor structuri de tip Helmholtz.

Aparatul folosit pentru generarea de câmp electromagnetic în această cerere internațională are două canale pentru generarea impulsurilor electromagnetice, fiecare constând în două oscilatoare cu blocare, fiecare dintre ele generând o frecvență ELF și funcționând alternativ, astfel ca numai un oscilator dintr-un canal operează la un anumit moment conform unei periodicități. De asemenea, aparatul mai include un circuit final și o bobină de inducție, care generează câmpuri electromagnetice având frecvența oscilatorului din canalul selectat, amestecată cu frecvența unui oscilator pilot și a unui circuit de selecție controlat printr-un oscilator pilot, care alternează operațiunea de blocare a oscilatoarelor, efectuând schimbarea frecvenței selectate emise de fiecare canal prin intermediul a două semnale de control. în tehnica de mai sus, în mod dezavantajos, curentul nu rămâne constant și astfel prezintă variații și oscilații în cadrul aceleiași frecvențe aplicate, în care câmpul magnetic aplicat este perturbat pe durata aplicării asupra țesutului celular.

Este cunoscut faptul că celulele stern sunt celule nediferențiate biologic, care se pot diferenția în celule specializate și se pot diviza (prin mitoză) pentru a produce mai multe celule stern. Acestea se găsesc în organisme multicelulare. Le mamifere, există două tipuri de celule stern: celule stern embrionare, care sunt izolate din masa de celule interioară a blastocitelor și celule stern adulte, care se găsesc în diferite țesături. în organismele adulte, celulele stern și celulele progenitoare acționează ca un sistem de reparare pentru organism, completând țesuturile adulte. într-un embrion în curs de dezvoltare, celulele stern se pot diferenția în toate celulele specializate-ectoderm, endoderm și mesoderm. Dar, de asemenea, se menține regenerarea normală a organelor, cum ar fi sângele, pielea, sau țesuturile intestinale. Există trei surse cunoscute accesibile de celule stern adulte la om:

- măduva osoasă, care necesită recoltarea prin extracție, de exemplu perforarea osului (de obicei a femurului);

- țesut adipos (celule lipidice), care necesită extracție de liposucție;

- sânge, care necesită extracție prin aforeză, în care sângele este recoltat de la donator (similar cu o donare de sânge), și trecut printr-o mașină care extrage celulele stern și se întoarce alte porțiuni ale sângelui donatorului.

Celulele stern pot fi, de asemenea, luate din sângele ombilical imediat după naștere. Dintre toate tipurile de celule stern, recoltarea autologă implică cel mai mic risc. Prin definiție, celulele autologe sunt obținute de la propriul corp, așa că fiecare poate fi propria sa bancă de sânge pentru proceduri chirurgicale.

RO 130324 Β1

Celulele stern adulte sunt frecvent utilizate în terapii medicale, de exemplu, în transplant de măduvă osoasă.

Celulele stern pot fi acum cultivate în mod artificial și transformate (diferențiat) în tipuri de celule specializate, cu caracteristici compatibile cu celule de diferite țesuturi, cum ar fi mușchi sau nervi. Liniile de celule embrionare și celulele stern embrionare autologe sunt, de asemenea, promițătoare pentru terapii viitoare.

în practică, celulele stern sunt identificate prin aceea că pot regenera țesuturi. De exemplu, testul definitoriu pentru măduvă osoasă sau celule stern hematopoietice (HSC) este capacitatea de a transplanta celulele și de a salva un individ fără CSH. Acest lucru demonstrează că celulele pot produce alte celule pe un termen lung. Ar trebui să fie, de asemenea, posibil să se izoleze celule stern de la un individ transplantat, care pot fi transplantate la un alt individ fără HSC, demonstrând că celula stern a fost capabilă să se auto-reînnoiască.

Proprietățile celulelor stern pot fi ilustrate in vitro, folosind metode cum ar fi studiile clonogenice, în care celulele singulare sunt evaluate pentru capacitatea lor de a diferenția și de auto-refacere. Celulele stern pot fi, de asemenea, izolate prin posesia lor într-un set distinctiv de markeri de suprafață celulară. Cu toate acestea, în condiții de cultură in vitro se poate modifica comportamentul de celule, astfel că este neclar dacă celulele se vor comporta într-un mod similar in vivo.

Se pune problema, în primul rând, la posibilitatea de a crește artificial numărul de celule stern, atât la cele aflate in vitro, cât și acelora care se găsesc în diverse țesuturi în organisme.

O serie de studii au documentat efectele asemănătoare ale câmpului electromagnetic de frecvențe joase asupra proliferării. Cel mai recent studiu in vivo (Komaki A., Khalili A., Salehi I., Shahidi S., Sarihi A., Effects of exposure to an extremely low frequency electromagnetic field on hippocampal long-term potentiation in rat, 2014.03.041) evidențiază modularea activității neuronale pe șobolani wistar, ipoteza fiind că este modificată plasticitatea sinaptică. Condițiile experimentale (frecvență și intensitate) sunt însă mai ridicate decât în cazul sistemului conform invenției.

Mai mult, o serie de studii anterioare au evidențiat potențialul de a influența neurogeneza, prin activarea de câmpul electromagnetic a celulelor neuroprogenitor adulte (AriasCarrion, O., Verdugo-Diaz, L., Feria-Velasco, A., Millan-Aldaco, D., Gutierrez, A. A., Hemandez Cruz A., Drucker-Coim, R., 2004, Neurogenesis in the subventricular zone following transcranial magnetic field stimulation and nigrostriatal lesions. J. Neurosci. Res.78, 16-28).

S-a demonstrat in vitro stimularea diferențierii celulelor stern neurale, fenomen mediat de reglarea pozitivă a expresiei și activității canalelor Cavi (Piacentini et al., 2008).

Pe de altă parte, trecerea ionilor de Ca prin aceste canale influențează transcripția unor gene implicate în supraviețuirea celulară, proliferare și diferențiere (Hardingham et. al., 1998; Orrenius et. al., 2003; West et. al., 2001).

Conform Ma et. al., expunerea la un câmp de 50 Hz modulează expresia mRNA pentru o serie de molecule implicate în proliferarea celulară.

Efecte ale expunerii la EMF, constând în modularea transucției pe cascadele de proteinfosforilare MAP/ERK au fost demonstrate de Sheik et. al. (2013) pentru celule endoteliale.

Efectul asupra proliferării celulelor stern dermale este demonstrat de Zhang et. al. (2012); conform acestor autori, efectul depinde de frecvența și durata expunerii, dar se situează la frecvențe mai mari, în timp ce au fost, de asemenea, demonstrate astfel de efecte în proliferarea și diferențierea chondrocitelor din celule stern mezenchimale (Vanonietal, 2012).

RO 130324 Β1

Problema tehnică rezolvată constă în generarea unui câmp electromagnetic ELF nedeformat de valoare medie constantă, și localizarea celulelor stern pentru proliferarea celulară.

Conform unui aspect al prezentei invenții, este prevăzut sistemul pentru proliferarea celulelor stern, prin aplicarea locală a unui câmp magnetic de extrem de joasă frecvență (ELF) compus dintr-un generator pentru producerea unui semnal de curent sinusoidal de extrem de joasă frecvență, și cel puțin un mediu de rezonanță conectat la generator, în care, într-o primă variantă:

- generatorul produce un semnal de curent constant sinusoidal de extrem de joasă frecvență, ce are o valoare IRMs = 0,195 A, o frecvență predeterminată aleasă în mod substanțial în intervalul 7,65 Hz și 7,75 Hz, și o inducție a câmpului magnetic ce are, în mod substanțial, o valoare BRMs = 0,75 mT la o distanță de 3 mm față de suprafața solenoidului suportului de rezonanță, cu armonici în mod substanțial mai mici de 0,2%, care conține:

- un oscilator cu cuarț care generează un semnal rectangular de înaltă frecvență de mare precizie, care este divizat succesiv printr-un prim circuit integrat, la ieșirea căruia se obține frecvența dorită între 3 și 30 Hz, și printr-un al doilea circuit integrat de tip filtru Butterworth de ordinul 8, cu care semnalul dreptunghiular este convertit în semnal sinusoidal;

- un atenuator de semnal în trepte, pentru a furniza numai o valoare pentru un curent care să determine o inducție în domeniul 0,25...2 mT, fiecare treaptă a acestui atenuator ducând la o creștere cu 0,25 mT a inducției câmpului magnetic obținută la un emițător al mediului de rezonanță;

și în care:

- cel puțin mediul de rezonanță conectat funcțional la generator conține cel puțin un element de bobină ce are un număr de spire înfășurate în jurul unui emițător fabricat din material magnetic, suportul de rezonanță fiind supus la menționatul semnal de curent ce are o frecvență optimă predeterminată aleasă în mod substanțial în intervalul 7,65 Hz and 7,75 Hz, inducția câmpului magnetic având în mod substanțial o valoare BRMs 0,75 mT la o distanță de 3 mm față de suprafața solenoidului suportului de rezonanță, cu armonici în mod substanțial mai mici de 0,2%;

- câmpul magnetic este aplicat într-o direcție transversală pe o regiune localizată a celulelor stern.

Conform unui alt aspect al invenției, primul circuit integrat conține un numărător sincron, un prim și un al doilea numărător asincron, o multitudine de rezistoare și o multitudine de comutatoare, primul circuit integrat fiind configurat să comute unul sau mai mulți rezistori din multitudinea de rezistoare prin unul sau mai multe comutatoare din multitudinea de comutatoare, și să dividă frecvența prin N = 1 la 256, iar numărătorul sincron să dividă frecvența prin 2⁸ cu primul numărător asincron ca o funcție a rezistorilor comutați.

Conform unui alt aspect al invenției, atenuatorul de semnal în trepte conține 8 trepte și fiecare treaptă este adaptată să crească inducția câmpului magnetic al mediului de rezonanță cu 0,25 mT.

Conform unui alt aspect al invenției, generatorul este configurat suplimentar să ajusteze semnalul de curent în conformitate cu o adâncime anatomică cunoscută, care este adâncimea la care se află celulele organice în interiorul regiunii relative.

Conform unui alt aspect al invenției, adâncimea este în intervalul de la 1 mm la 100 mm, de preferat 3 mm.

Conform unui alt aspect al invenției, suportul este fabricat din material paramagnetic.

Conform unui alt aspect al invenției, emițătorul conține două porțiuni ramificate paralele, care se proiectează dintr-o porțiune de bază, definind o formă de U și care este fabricat integral din material magnetic, și în care cel puțin un element de bobină este înfășurat pe porțiunea de bază.

RO 130324 Β1

Conform unui al doilea aspect al prezentei invenții, este prevăzut un sistem pentru proliferarea celulelor stern în țesut celular in vivo, prin aplicarea locală a unui câmp magnetic de extrem de joasă frecvență (ELF) compus dintr-un generator pentru producerea unui semnal de curent sinusoidal de extrem de joasă frecvență, și cel puțin un mediu de rezonanță conectat la generator, în care, într-o a doua variantă:

- generatorul produce un semnal de curent constant sinusoidal de extrem de joasă frecvență ce are o singură valoare, o frecvență predeterminată aleasă în mod substanțial în intervalul 7,65...7,75 Hz, astfel încât inducția câmpului magnetic să aibă, în mod substanțial, o valoare BRMs = 0,75 mT la o distanță dorită de suprafața solenoidului mediului de rezonanță, cu armonici în mod substanțial mai mici de 0,2%, care conține:

- un Sintetizator Digital Direct adaptat să genereze direct semnalul sinusoidal cu armonici în mod substanțial mai mici de 0,2% și să genereze un semnal de curent sinusoidal precis cu o singură frecvență în interiorul intervalului 7,65...7,75 Hz comandat de un procesor;

- o unitate de amplificare a curentului constant sinusoidal pentru a asigura, la nivelul emițătorului, o inducție de până la 3 mT, controlată de procesor, ieșirea unității de amplificare fiind aplicată la terminalele relevante ale generatorului care este funcțional conectat cu elementul bobină a mediului de rezonanță;

- și în care cel puțin mediul de rezonanță conectat funcțional la generator conține cel puțin un element de bobină ce are un număr de spire înfășurate în jurul unui emițător fabricat din material magnetic, suportul de rezonanță fiind supus la menționatul semnal de curent ce are o frecvență optimă predeterminată aleasă în mod substanțial în intervalul 7,65...7,75 Hz, și inducția câmpului magnetic are în mod substanțial o valoare BRMs 0,75 mT la o distanță de 3 mm de suprafața solenoidului suportului de rezonanță, cu armonici în mod substanțial mai mici de 0,2%;

Conform unui aspect al prezentei invenții, suportul este selectat dintr-un grup care conține cel puțin o centură, o mască, un pansament, o cască, cu o multitudine de medii de rezonanță conectate la generator și poziționate fix pentru a asigura la adâncimea dorită o uniformitate a semnalului și pentru a nu se permite distorsionări sau perturbații ale câmpului magnetic obiectiv măsurat cu teslametru.

Se dă, în continuare, două exemple de realizare a invenției în legătură cu fig. 1 ...24, care reprezintă:

- fig. 1, o diagramă bloc a aparatului generator și a mediului de rezonanță pentru aplicarea locală a unui câmp magnetic de extrem de joasă frecvență ELF conform invenției;

- fig. 2A, o diagramă bloc a primei realizări a circuitului aparatului din fig. 1, pentru producerea câmpului magnetic ELF conform invenției;

- fig. 2B, diagrama circului din realizarea din fig. 2A, pentru producerea câmpului magnetic ELF conform invenției;

- fig. 2C, o diagramă bloc a unei alte realizări a circuitului aparatului din fig. 1 pentru producerea câmpului magnetic ELF conform invenției;

- fig. 3, o vedere laterală a primei realizări a mediului de rezonanță pentru aplicarea locală a unui câmp magnetic de extrem de joasă frecvență ELF, în forma unui element bobină montat pe un suport;

- fig. 4, o vedere sus a elementului bobină din fig. 3;

- fig. 5, mediul de rezonanță din fig. 3 și 4 conectat funcțional la aparatul generator din fig· 1 și 2;

RO 130324 Β1

-fig. 6, măsurătorile câmpului electromagnetic emis de către elementul bobină din fig. 5 1 de către un cap de măsurare interconectat la un teslametru și un voltmetru;

-fig. 7, o vedere de sus a celei de-a doua realizări a unui mediu de rezonanță pentru 3 aplicarea locală a unui câmp magnetic ELF, în forma unui element bobină înfășurat în jurul unui element bifurcat și special adaptat pentru utilizarea în interiorul cavității bucale; 5

- fig. 8, o vedere de sus a celei de-a treia realizări a unui mediu de rezonanță pentru aplicarea locală a unui câmp magnetic ELF, bazat pe cea de-a doua realizare din fig. 7; 7

- fig. 9, o vedere laterală celei de-a treia realizări din fig. 8;

- fig. 10, cea de-a patra realizare a unui mediu de rezonanță pentru aplicarea locală a 9 unui câmp magnetic ELF, bazat din nou pe cea de-a doua realizare din fig. 7;

-fig. 11, mediul de rezonanță din fig. 7 conectat funcțional la aparatul generator din fig. 1 11 și 2;

- fig. 12, măsurătorile câmpului electromagnetic emis de către elementul bifurcat din 13 fig. 11 printr-un cap de măsurare adiacent interconectat la un teslametru și un voltmetru;

- fig. 13, mediul de rezonanță din fig. 3 și 6 montate pe un prim mediu de suport în forma 15 unui pansament;

- fig. 14, un mediu de rezonanță din fig. de la 3 la 6 montat pe un al doilea mediu de 17 suport în forma unei centuri ajustabile;

-fig. 15, mai multe medii de rezonanță din fig. 3...6, conectate la aparatele generatoare 19 montate pe un al doilea mediu de suport din fig. 14;

- fig. 16, mai multe medii de rezonanță din fig. 3...6, conectate la aparatele generatoare 21 montate pe un al treilea mediu suport sub forma unei măști;

- fig. 17, mediul de rezonanță din fig. 7...12 în utilizare în cavitatea bucală; 23

- fig. 18, mai multe medii de rezonanță din fig. 3...6, conectate la respectivele aparate generatoare, în utilizare cu țesut celular vegetal; 25

- fig. 19, diagrama curentului prin bobină și densitatea de flux corespunzătoare;

- fig. 20, graficul rezultatelor simulării; 27

- fig. 21, graficul de creștere a celulelor stern testate;

- fig. 22, cultura ADSC, 48 h, neexpus Ob. (20 x); 29

- fig. 23, cultura ADSC, 48 h, bobina 7,69 Hz. Ob. (20 x);

- fig. 24, cultura ADSC, 48 h, 7,69 Hz. (Ob. 10X). 31

Se va descrie în cele ce urmează, prin exemple, modul specific avut în vedere de utilizatori. în descrierea următoare, detaliile specifice sunt stabilite în scopul de a furniza o 33 înțelegere mai aprofundată. Totuși, va fi evident, pentru cineva având cunoștințe în domeniu, că prezenta invenție poate fi aplicată fără a se limita la aceste detalii specifice. în alte exemple, 35 metoda și structura bine cunoscute nu au fost descrise în detaliu pentru a nu încărca în mod inutil descrierea. 37

Invenția se referă la un aparat pentru utilizare locală a unui câmp magnetic de extrem de joasă frecvență (ELF) într-o regiune specifică a unui țesut celular organic, uman, animal sau 39 vegetal, pentru stimularea regenerării celulare în acea zona. Cu referință la fig. 1, cel mai simplu aparat constă într-un generator 10 care include un ansamblu de circuite pentru producerea unui 41 semnal continuu constant și sinusoidal de foarte joasă frecvență, și un mediu de rezonanță 20 conectat funcțional la generatorul 10 pentru aplicare localizată a unui câmp electromagnetic 43 corespondent constant de extrem de joasă frecvență produs de un generator de semnal. O caracteristică definitorie a aparatului este reprezentată de câmpul electromagnetic constant de 45 extrem joasă frecvență produs de către mediul de rezonanță 20 din semnalul continuu constant și sinusoidal de extrem de joasă frecvență alimentat de la generatorul 10, astfel că acest câmp 47

RO 130324 Β1 este considerat a fi un câmp magnetic în zona țesutului celular supus acestuia. Cu aparatul, frecvența câmpului ELF este fixată, iar intensitatea sa la nivelul zonei țintă este în mod substanțial de 0,7 SmT, iar astfel intensitatea sa poate fi oarecum mai mare la nivelul emițătorului, potențial până la 3 mT, când zona este intra-corporală.

Cu referire la fig. 2A, în scopul de a obține un semnal continuu constant și sinusoidal de extrem de joasă frecvență, prima realizare a circuitelor generatorului 10 conține un Sintetizator Digital Direct 101 adaptat pentru a genera direct semnalul sinusoidal, cu oscilații substanțial mai mici de 0,2% și care nu necesită nicio procesare a semnalului cu componentele descrise cu referință la fig. 2C din cele ce urmează, SDD 101 generează un semnal sinusoidal precis cu o variație de la 2 la 50 Hz, în exemplu, este fixat la 7,692 Hz. Semnalul generat de SDD are o înaltă precizie și stabilitate condusă de procesorul 102. Semnalul sinusoidal generat de SDD intră într-o unitate de amplificare 103 cu un curent constant ajustabil care variază de la 1 la 200 mA, care, în exemplu, este fixat la 195 mA. Atât frecvența, cât și curentul sunt în mod continuu controlate de către procesor 102. Ieșirea din unitatea de amplificare 103 este aplicată terminalelor relevante alte generatorului 10 care este conectat funcțional (104) la un element bobină 30 al mediului de rezonanță 20. Un circuit corespunzător realizării circuitelor generatorului 10 este arătat în fig. 2A printr-un exemplu nelimitativ în fig. 2B.

Cu referire la fig. 2C, o altă realizare a ansamblului de circuite ale generatorului 10 conține cu oscilator cu cuarț 11 care generează un semnal rectangular, inițial cu o frecvență de înaltă precizie cunoscută a fi 3,6864 Mhz, care este succesiv divizată printr-un circuit integrat 12 la ieșire din care este obținută frecvența dorită de 3 și 30 Hz. Acest ansamblu de circuite mai include un de circuit integrat grad 8 de tip filtru Butterworth 13, prin intermediul căruia semnalul rectangular care constă într-o serie infinită de semnale rectangulare, este convertit într-un semnal sinusoidal, de exemplu este selectată o sinusoidă a unei frecvențe anume predeterminate; un atenuator de semnal în 8 trepte 14 pentru alimentarea cu curent de inducție 0,25...2 mT, fiecare treaptă a atenuatorului ducând la o creștere de 0,25 mT a inducției câmpului magnetic obținut între părțile polare 15 ale mediului de rezonanță 20; și o sursă de curent constantă 16 pentru menținerea unui curent constant.

Circuitul integrat 12, la ieșirea căruia este obținută frecvență dorită variază de la 3 la 30 Hz, constă dintr-un contor asincron 121 prin care frecvența va fi divizată prin 24; un contor sincron 122 prin care frecvența va fi divizată cu N = 1 la 256, ca funcție de comutare a unuia sau mai multor rezistori 123., ...123_a introduși în circuit prin mai multe comutatoare electronice 124.,,...124₈; și un alt contor asincron 125 prin care frecvența va fi divizată prin 2⁸. Astfel, contorul asincron 121, contorul sincron 122, contorul asincron 125 și rezistorii 123,,...123₈ și comutatoarele electronice 124,...124_a constituie un circuit integral de divizare 12.

Semnalul de ieșire din oscilatorul cu cuarț 11 este aplicat la intrarea în contorul asincron 121 prin care frecvența este divizată prin 24, apoi la intrarea în contorul sincron 122, prin care frecvența este divizată prin N = 1 la 256, în funcție de valoarea rezistori lor comutați 123,...123_a. Semnalul este apoi aplicat la intrarea într-un alt contor asincron 125 prin care frecvența este divizată cu 2⁸. La finalul etapei de divizare, care constă în două contoare asincrone 121, 125 și un contor sincron 122, este obținută o frecvență dorită care variază de la 3 la 30 Hz.

Semnalul sinusoidal este apoi aplicat unui atenuator de semnal în opt trepte 14, în scopul de a furniza un semnal continuu care variază între 0,25...2 mT. Fiecare treaptă a acestui atenuator duce la o mărire cu 0,25 mT a inducției câmpului magnetic generat de către mediul de rezonanță 20.

RO 130324 Β1

Atenuatorul de semnal în opt trepte 14 constă din cel puțin primul și al doilea circuit integrat 141 și 142, mai mulți rezistori 143_r..143₈ și mai multe comutatoare electronice

143.. ...143₈, configurate, astfel încât atunci când comutatorul 143₈ este închis, semnalul la ieșirea primului circuit integrat 141 este aplicat direct la intrarea în cel de-al doilea circuit integrat 142, valoarea maximă a tensiunii și a curentului care corespunde valorii maxime de 2 mT a inducției magnetice, și dacă comutatorul 143₁ este închis, semnalul la ieșirea din primul circuit integrat 141 este aplicat la intrarea în cel de-al doilea circuit integrat 142 prin rezistorii

143₁.. .. 143₈, valoarea minimă a tensiunii și curentului care corespund valorii minime de 0,25 mT a inducției magnetice.

Sursa de curent constant 16 face disponibile nivelele de tensiune necesare pentru operarea primului și celui de-al doilea circuit integrat 141, 142, și cel puțin primul și cel de-al doilea transistor bipolar 17, 18 care furnizează semnale de tensiune corespunzătoare, și în scopul de a menține curentul constant în aparatul ce face obiectul invenției, astfel că, în circuitul care constă din componentele 11, 12,13 și 14 incluse în generatorul 10, mediul de rezonanță 20 și orice părți polare 15 ale acestuia și conexiunea dintre generator și mediul de rezonanță, sursa de curent constant 16 este configurată să varieze în mod adecvat tensiunea la terminale, astfel încât curentul în circuitul de încărcare rămâne constant.

Sursa curentului constant 16 face disponibile nivele de tensiune necesare pentru operarea primului și celui de-al doilea circuit integrat 141, 142 și cel puțin primul și cel de-al doilea transistor bipolar 17,18. Prin oferirea unor semnale de tensiune corespunzătoare, sursa de curent constant stabilizează curentul prin încărcare, evitând orice variație de tensiune în mediul de rezonanță 20 și, prin tranziție, menține constant câmpul magnetic emis de mediul de rezonanță și orice elemente polare 15 ale acestuia, în conformitate cu următoare funcție:

B = f(H) sau U = f(l) liniar. ’ în cele de mai sus, B reprezintă inducția, H reprezintă forma semnalului de curent la ieșire, și funcția traduce de fapt că forma curentului la ieșire H respectă forma tensiunii aplicate, și anume a inducției B. Acest lucru reprezintă un avantaj pentru că permite ca un câmp magnetic non-deformat să fie obținut între orice elemente polare 15 ale mediului de rezonanță 20.

Este în mod notoriu cunoscut că fiind dificil de calculat direct câmpul unei bobine circulare în afara axei sale, și chiar intensitatea H în axă este dificil de definit, întrucât potențialul magnetic trebuie determinat mai întâi, apoi din derivata sa, distanța de la bobină ar trebui obținută ca:

Legea Biot-Savard susține că o metodă corespunzătoare pentru a calcula o valoare a unui câmp electromagnetic la un punct M pe axa solenoidului, când o distanță d > r, precum:

39

Cu toate acestea, rezultatul acestei abordări nu este foarte precis, întrucât, în contextul acestei prezentări, distanța d nu este mai mare decât r. Prin urmare, rezultatul acestei abordări 41 a fost selectat ca punct de plecare, care va fi ulterior corectat prin măsurători efective ale câmpului. 43

Calculul începe de la ipoteza inițială că mediul de rezonanță 29 are o suprafață circulară de 10:11 cm², iar o frecvență joasă a inducției câmpului sinusoidal are o valoare de B_RMS = 45 = 0,750 mT la o distanță de 3 mm de la suprafața solenoidului mediului de rezonanță 20. în această situație, dimensiunile fizice ale mediului de rezonantă sunt: 47

R, = 2 cm

R₂= 1,4 cm,

RO 130324 Β1 iar raza medie a mediului de rezonanță 20 este de:

/?! - R₂ + R₂ = 1,7 cm

Prin aplicarea legii Biot-Savard, se obține următoarea relație de dependență: Hx · f(NJ) și, respectiv, Bx · /(/, #, /),

I a unde Hx poate fi exprimat ca: H = — sin a unde sin cx. — r² + d‘

2r și unde Bx, care va fi măsurătoarea impusă ca B_RMS = 0,750 mT, poate fi exprimat ca punctul

M de-a lungul axei ca:

Ir'

2(r²+d²)

3/2

Cele de mai sus rămân valabile în cazul în care un curent alternativ sinusoidal, spre exemplu cu o frecvență f = 7,692 Hz în prezentul exemplu Hx și Bx descresc rapid dacă x crește. Prin introducerea măsurătorii sinusoidale exprimată ca i = I max sin ωί,

Bx poate fi acum exprimat ca:

' Bx = 0,21 —N-/ = 0,21-^/72 sin(48,3/)

Astfel, următoarea relație de dependent este obținută pentru aceasta realizare:

Bx = f (μ,Ν, I), ’ unde: μ = permeabilitatea magnetică a miezului;

N = numărul de spire;

I = curentul în bobină.

în utilizare, orice realizare a fig. 2A...2C poate fi folosită singular prin aplicarea unui câmp ELF în zona țesutului celular al subiectului, descris în mod substanțial în prezenta. Pentru cele mai bune rezultate, totuși, realizarea din fig. 2C poate fi mai întâi utilizată în condiții de laborator pentru a determina cea mai potrivită frecvență pentru subiect, și astfel cea mai apropiată frecvență la care va emite câmpul ELF, apoi realizarea de la fig. 2A sau 2B poate fi ajustată pentru a emite la o frecvență predeterminată. în consecință, în această realizare, celulele organice sunt prelevate din zona supusă la primul semnal constant sinusoidal prin realizarea de la fig. 2C, având prima frecvență în mod substanțial între 7,5 Hz și 7,9 Hz, spre exemplu 7,682 Hz, și o radiație electromagnetică în mod substanțial, de 0,75 mT. în plus, sunt prelevate celule organice din zona care apoi a fost supusă unuia sau mai multor semnale nonarmonice constant sinusoidale, fiecare având o frecvență diferită în intervalul de mai sus, spre exemplu un al doilea semnal cu o frecvență de 7,692 Hz. Este determinată o rată de creștere celulară pentru fiecare semnal, iar frecvența care furnizează cea mai mare rată de creștere celulară, spre exemplu cea de-a două frecvență de 7,692 Hz, este selectată ca cea mai potrivită frecvență. Realizarea din fig. 2A sau 2B este apoi ajustată ca să emită numai la frecvența selectată.

Cu referire la fig. 3...6, prima realizare a mediului de rezonanță 20 constă într-un element bobină având 251 de spire, iar valoarea curentului l_RMS este de 0,195 A. Dimensiunile fizice ale bobinei pot varia în funcție de aplicație. Elementul bobină 30 este realizat din CuEm

RO 130324 Β1

0,31 și fiecare extremitate 31 a acestuia se termină cu un conector 32, pentru fixare funcțională și declanșare la terminale relevante 19 ale atenuatorului de semnal în opt trepte 14 al generatorului 10.

Mediul de rezonanță 20 mai include un suport modular circular 40 având în secțiune în mod substanțial forma de H, care constă dintr-o secțiune central cilindrică 41, delimitată de secțiunile de prelucrare 42 la fiecare extremitate, și o deschidere coaxială 43 cu secțiunea central cilindrică 41. Elementul bobină 30 este înfășurat pe suprafața externă a secțiunii elementului cilindric 41 între cele două secțiuni de prelucrare 42. Elementul de suport modular 40 găzduiește un element de suport sau un emițător 44 cu o primă suprafață 45 orientată către țesutul celular către care câmpul magnetic ELF este emis. Emițătorul poate fi făcut din orice material paramagnetic, precum oțel medical sau, într-o realizare preferată, permalloy.

Emițătorul 44 are în mod substanțial o formă cilindrică cu un diametru central dimensionat pentru a realiza o fixare prin glisarea în deschiderea 43 și o deschidere filetată coaxială cu deschiderea 43, și care se extinde de la cea de-a doua suprafață, paralelă cu și opusă primei suprafețe 45, substanțial în spatele, în mod figurativ, mediului de suport modular circular 40. Emițătorul 44 este fixat cu o clamă 46 care angajează atât deschiderea filetată, cât și un element intermediar 47 care mărginește secțiunea de prelucrare 42 opusă primei suprafețe 45, și având un diametru mai mare decât deschiderea 43 a suportului modular circular 40.

Cu referire la fig. 5, în utilizare, elementul bobină 30 este alimentat cu un semnal electromagnetic ELF constant și nedistorsionat de către un generator 10 din fig. 2A, 2B sau 2C, care face emițătorul 44 să emită un câmp electromagnetic ELF corespunzător, constant și nedistorsionat. Cu referire la fig. 6 în mod special, care arată măsurătorile din câmpul electromagnetic emis de elementul bobină 30 cuplat la emițătorul 44 printr-un cap de măsurare adiacent 601 interconectat la un teslametru 602 și un voltmetru 603, o caracteristică importantă a câmpului electromagnetic emis este că nu conține nicio componentă de curent 604 și este, în consecință, considerat a fi exclusiv un câmp magnetic la nivelul zonei celulare la care este aplicat.

Cu referire la fig. 7 și 17 din prezenta, o realizare ulterioară a mediului de rezonanță conține din nou un element bobină, 30 având 251 de spire, iar valoarea curentului l_RMS este de 0,195 A. Dimensiunile fizice ale bobinei pot varia în funcție de aplicație. Elementul bobină 30 este realizat din CuEm 0,31 și fiecare extremitate 31 a acestuia se termină cu un conector 32, pentru fixare funcțională și declanșare la terminale relevante (nu sunt prezentate) ale atenuatorului de semnal în opt trepte 14 al generatorului 10.

în această realizare, mediul de rezonanță 20 mai include un element de suport în mod substanțial, în formă de U, și un emițător 70 definit prin două porțiuni ramificate 71, 72 care se proiectează din secțiunea de bază 73 și realizată integral dintr-o bară de permalloy, care este un aliaj nichel-fier cu o permeabilitate magnetică foarte mare la valori foarte mari ale inducției, și, în consecință, o histereză foarte scăzută, astfel încât riscul de saturației al materialului să fie cât mai scăzut și să fie menținut caracterul magnetic sinusoidal nedeformat. Această realizare este considerată în mod particular utilă pentru aplicarea în cavitatea bucală a unui câmp ELF, tipic pentru o zonă 1201 a maxilarului, a gingiei 1202 sau a dintelui 1203, cu ramificațiile 71, 72 dispuse pe fiecare parte ale zonei 1201, iar câmpul ELF este emis între cele două elemente.

Fiecare dintre cele două porțiuni ramificate 71, 72 și porțiunea bază 79 sunt în mod substanțial rectilinii cu o secțiune transversal cilindrică. Cele două porțiuni ramificate 71, 72 au în mod substanțial aceleași dimensiuni și se extind în mod substanțial, paralelă una cu cealaltă de la porțiunea bază 73, cu care acestea formează un unghi. Extremitățile libere 711, 721 ale porțiunilor ramificate 71, 72 constituie părțile polare 15, între care zona de țesut celular ce va

RO 130324 Β1 fi expusă la ELF se află în utilizare. O realizare alternativă ia în considerare o deschidere filetată implementată transversal și coaxial în fiecare porțiune ramificată 71, 72 și care se extinde de la extremitatea liberă, cel puțin parțial înclinată 711, 721 a acesteia, și adjuncția unui șurub cilindric angajat în fiecare astfel de deschidere, fiecare șurub acționând ca un element polar 15 pentru aplicarea unui câmp magnetic pe porțiunea dorită a maxilarului, gingiei sau a dintelui, în această realizare, elementul bobină 30 este înfășurat în jurul suprafeței externe a porțiunii bază 73, substanțial între extremitățile sale din care se proiectează porțiunile ramificate 71, respectiv 72.

Configurarea mediului de rezonanță 20 în realizarea din fig. 7...12 necesită reconsiderarea funcției de mai sus, după cum urmează și pe baza unui exemplu de câmp electromagnetic, în mod substanțial, de B_RMS = 0,750 mT la o frecvență de 7,692 Hz. în acest exemplu, legea circuitului magnetic se aplică astfel:

j>~Hds = Hțlț+H_sl_s = NI unde: N = numărul de spire

I = curentul în bobină

Lungimea circuitului de fier l_fe este data de:

7| = +α^2π-1δ= IScm

Ιδ = 2 cm înlocuind în formula de mai sus, obținem următoarele:

18Hj+2H_s = NI (2)

Fluxul magnetic cunoscut ca fiind constant de-a lungul tubului de flux, astfel ca:

Bj A = Β_δ · Α_δ și Β_δ= Ρο^δ (3)

Problema este rezolvată prin metoda aproximațiilor succesive: în scopul de a calcula curentul în bobină, pentru care o anumită inducție trebuie obținută în permalloy, soluția este directă. B_f și Β_δ obținute la (3) sunt măsurate și unde respectivele intensități ale câmpului, H_f și Η_δ, sunt obținute.

Curentul în bobină este atunci obținut din (2). în exemplul dat, sunt obținute următoarele rezultate:

i = i₀ sin cnt = i₀ sin (48,3 t) 'rms ⁼ 0,19 A

N = 381 sp; CuEM 0,2

Va fi ușor de înțeles pentru o persoană cu pregătire în domeniu că multe variații se pot elabora ușor pentru a îmbunătăți proprietățile ergonomice ale mediului de rezonanță 20, fără îndepărtarea de la scopul acestei prezentări. Referitor la realizarea din fig. 7, spre exemplu, o realizare alternativă ia în considerare un mecanism care articulează cel puțin un element ramificat 71, 72 cu porțiunea de bază 73, astfel localizat substanțial la joncțiunea dintre cele două, în scopul de varia distanța dintre porțiunile ramificate 71, 72 și elementele polare 15 constituite de extremitățile respective 711, 721. Dacă se dorește, cel puțin o parte porțiunii de bază 73 a mediului de rezonanță poate fi găzduită într-un material plastic în formă de manetă, așa cum este prezentată în fig. 8 și 9 pentru a ușura manevrarea sa.

Curentul electric sinusoidal constant de extrem de joasă frecvență este astfel obținut de la generatorul 10 din fig. 1 și 2, și este aplicat elementului bobină 20 pentru a obține un câmp magnetic de extrem de joasă frecvență care se aplica zonei localizate a țesutului celular.

RO 130324 Β1

Fig. 8, 9 și 10 prezintă niște realizări alternative ale elementului 70, în mod substanțial în formă de U, al mediului de rezonanță 20. Cu referire la fig. 8 și 9, porțiunea de bază 73 și cele două porțiuni ramificate 71, 72 pot păstra configurația în mod substanțial așa cum a fost descrisă anterior cu referire la fig. 7; cu toate acestea, în această realizare, fiecare din porțiunile ramificate 71, 72 conține o curbură definită prin secțiunea scurta 801 din porțiunea ramificată 71, 72, care formează un unghi drept între prima parte 802 a ramificației 71, 72 cea mai apropiată de porțiunea de bază 73 și a doua secțiune 803 din ramificației 71, 72 cea mai depărtată de porțiunea de bază 73, unde curbura este localizată în mod substanțial intermediar de porțiunea de bază 73 și extremitatea polară 15. Realizarea este în mod particular utilă pentru aplicarea orală după perioade lungi de timp, întrucât curbura permite celor două porțiuni paralele 71, 72 să se învecineze cu o suprafață de repaus în afara cavității bucale, spre exemplu buza unui subiect.

Referitor la fig. 10, porțiunea de bază rectilinie poate forma încă un unghi drept relativ la respectiva secțiune 1001 a celor două porțiuni ramificate 71, 72, cele mai adiacente porțiunii de bază 73; totuși, în această realizare, fiecare porțiune ramificată conține o secțiune curbilinie 1002 care se extinde de la secțiunea 1001 cea mai adiacentă porțiunii de baza 73. în această realizare, ambele porțiuni ramificate mențin paralelismul de-a lungul lungimii lor până la extremitățile polare 15, și astfel definește o curbă relativă la, și care se extinde de la, porțiunea de bază 73. Această realizare este în mod special utilă pentru aplicare orală pe perioade lungi de timp, întrucât curbura permite porțiunii de bază să se învecineze cu o porțiune de repaus în afara cavității bucale, spre exemplu obrazul subiectului. Aceste realizări din fig. 8 la 10 pot fi utilizate iterative sau cu referire la realizările exemplu descrise în cele ce urmează care utilizează câteva medii de rezonanță 20 în același timp, legate unele de altele, în funcție de regiune și de numărul elementelor ce urmează a fi tratate în cavitatea bucală.

Cu referire la fig. 11, în utilizare, elementul bobină 30 este din nou alimentat cu un semnal electromagnetic constant și neperturbat de ELF de un atenuator de semnal în opt trepte 14 al unui generator 10 care determină elementul în formă de U sau elementul bifurcat, elementul de sprijin 70 să emită un câmp electromagnetic corespunzător constant și neperturbat. Cu referire la fig. 12 în special, o caracteristică importantă a câmpului electromagnetic emis este aceea că, din nou, nu conține nicio componentă de curent, și este în consecință considerat a fi pur și simplu un câmp magnetic la nivelul zonei la care este aplicat.

în testele aparatului conform invenției, rezultatele optime au fost obținute atunci când culturile celulare au fost supuse unui câmp magnetic având intensitatea de maximum 0,75...0,80 mT, și o frecvență constantă fixată la 7,692 Hz. Durata optimă de expunere a fost determinată 1 h pe zi pentru minimum 5 expuneri. Testele au arătat că, urmare a acestor parametri, s-a obținut o proliferare a numărului celule de la 25 la 27% în toate culturile.

Utilizarea aparatului conform Invenției, așa cum este arătat în fig. 11, a fost testat în condiții de confidențialitate expresă, cu privire la țesutul celular din cavitatea bucală, iar detaliile și rezultatele testelor sunt descrise în cele ce urmează. Toți subiecții care se confruntă cu probleme gingivale prezintă un deficit celular în regiunea gingivală, iar toți subiecții care au fost tratați cu acest dispozitiv prezentat în invenție au prezentat un efect de regenerare a gingiei într-o perioadă mai scurtă de timp decât se estimase. S-a folosit realizarea bifurcată a mediului de rezonanță 20, deoarece ansamblul cu bobina Helmboltz nu poate fi introdus în cavitatea bucală a subiectului.

în scopul izolării și cultivării keratinocitelor primare, mucoasa orală a fost obținută de la pacienții care au suferit extracții dentare. Țesuturile au fost spălate și tăiate în bucăți mici și supuse disocierii enzimatice în Dipase II și Collagenase pentru 24 h la 4°C. După tratament, suprafața epitermală a fost înlăturată de pe țesutul conjunctiv. Pentru a obține celule viabile

RO 130324 Β1 keranocitice, straturile epiteliale au fost tratate cu tripsină pentru 30 de min la 37°C. Celulele au fost re-suspendate în mediu EpiLife® suplimentat cu calciu, suplimente de creștere și antibiotic. Celule au fost puse în vase cu un diametru de 35 mm pre-acoperite cu colagen uman tip IV.

în scopul separării celulelor keranocitice umane stern, celulele au fost incubate cu mouse integrin monoclonal a6(34. După înlăturarea excesului de anticorpi, celulele au reacționat apoi cu goat anti-mouse IgGMicroBeads (Miltenyi Biotec Inc.), apoi suspensia celulară a fost pusă într-o coloană de separare plasată într-un un câmp magnetic a unui Separator MACS® (Miltenyi Biotec Inc.). Celulele neetichetate au fost procesate prin coloană și reprezentate printr-o fracție a6(M negative (a6J J4 neg), întrucât celulele etichetate magnetic, reprezentând fracția celulară a604 pozitiv (a6fS4 pos), au rămas în coloana de separare. După 2...3 zile de la prima separare fracția celulară a6|34 pos a fost etichetată magnetic cu CD71 Microbeads și supusă aceleași proceduri de sortare celulară magnetică. Celulele etichetate magnetic CD71 pozitiv (CD71pos) au rămas în coloana de separare, în timp ce celulele neetichetate CD71 (CD71 neg) au fost procesate prin coloana de separare. După două separări magnetice, fracția a6p4 pos CD71neg reprezintă fracția de celule stern orale keranocitice.

Celulele stern orale keranocitice au fost apoi stimulate cu aparatul conform invenției timp de 7 zile, de exemplu supuse unui câmp magnetic de EFJ de 7,692 Hz și 0,75 mT, iar dezvoltarea celulară a fost evaluată la 3 și 7 zile.

La Institutul Național „Victor Babeș din București, România, au fost efectuate o serie de teste pentru sistemul și metoda conform invenției, cu privire la efectele de stimulare a proliferării celulelor stern menzechimale, respectiv a diferențierii în adipocite, condrocite și osteocite. Rezultatul acestor teste este prezentat mai jos:

1. Pentru proliferarea Celulelor stern Mesenchimale

Proliferarea celulelor stern mezenchimale s-a efectuat din pasajul nr. 3, în plăci cu 12 godeuri, utilizând mediul de proliferare complet.

Au fost efectuate teste în condiții standard (cultura control) și în condiții de expunere la sistemul conform invenției, la setările A -6,93 Hz,B-7,69 Hz.C-8,46 Hz și D-23 Hz.

Culturile au fost expuse la sistem timp de 2 h pe zi, începând cu 24 h de la instalarea în cultură, timp de 3 zile (la 24, 48 și 72 h).

La 48 h, s-a trecut la înlocuirea serului cu mediu proaspăt.

La 20 și 96 h de cultivare, mediul a fost înlocuit cu mediul la care s-a adăugat 0,1% reactiv MTS, s-a incubat pentru 3 h, apoi s-a colectat supernatantul și s-a măsurat activitatea optică la 490 nm (testul MTS).

După efectuarea testului la 20 h (test inițial), s-a trecut la schimbarea mediului cu mediul de creștere obișnuit pentru MSC, în locul mediului suplimentat cu MTS.

S-au înregistrat indicii celulari inițiali (la 20 h) și apoi la 96 h, astfel încă s-au normalizat indicii pentru fiecare cultură în parte, evitându-se astfel variațiile generate de încărcarea neuniformă cu celule.

Rezultatele din 3 experimente independente, pentru cele 3 variante și pentru control sunt sintetizate în tabelul 1:

Tabelul 1

	Nenormalizat	Normalizat 96-20 h	P
Control	100	100
A	102	104	< 0,1
B	118	123	< 0,05
C	106	109	< 0,05

RO 130324 Β1 în conformitate cu datele de mai sus, se observă o stimulare a proliferării celulelor stern la setarea B (frecvență medie) cu un factor de aproximativ 23% (p < 0, 05). Similar, dar cu un coeficient mai mic, statistic semnificativ, s-a observat și la frecvența mai mare (9%, p < 0,05) în timp ce, la frecvența cea mai scăzută, valorile nu au fost semnificative statistic.

Graficul de creștere a celulelor stern analizate este redat în fig. 21.

în conformitate cu datele de mai sus, se observă o stimulare a proliferării celulelor stern la setarea B (frecvența medie) cu un factor de aproximativ 23% (p < 0, 05). Similar, dar cu un coeficient mai mic, statistic semnificativ, s-a observat și la frecvența mai mare (9%, p < 0,05) în timp ce, la frecvența cea mai scăzută, valorile nu au fost semnificative statistic. în fig. 22...24 sunt redate imagini ale culturilor ADSC la 48 h, Obiectiv 20X (1, neexpus), comparative cu cultura expusă la frecvența optimă de 7,69 Hz (2, Ob. 20 X și 3, ob. 10x). Se poate observa morfologia tipică a celulelor stern (morfologie de celule fibroblastice) care este conservată în celulele expuse, precum și diferența de densitate celulară (mai mare la celulele expuse).

Pentru diferențierea Adipocitelor:

Diferențierea adipocitelor din celule stern mezenchimale s-a efectuat din pasajul nr. 4, în plăci cu 12 godeuri, utilizând mediile de diferențiere și menținere a diferențierii adipocitelor complete.

Au fost efectuate teste în condiții standard (cultura cotrol) și în condiții de expunere la sistemul conform invenției, la setările A, B, C.

Culturile au fost expuse la dispozitivul ED timp de 2 h pe zi, începând cu 24 h de la instalarea în cultură, timp de 3 zile (la 24, 48 și 72 h). La 48 h, s-a procedat la înlocuirea serului cu mediu proaspăt. După aceea, s-au făcut expuneri la fiecare 3 zile, câte 2 h. S-a efectuat o ultimă determinare (test MTS) la finalul experimentului (ziua 18).

La 20, 96 h și la 18 zile de cultivare, mediul a fost înlocuit cu mediul de același tip, suplimentat cu 0,1% reactiv MTS, s-a incubat pentru 3 h, apoi s-a colectat supernatantul și s-a măsurat activitatea optică la 490 nm (testul MTS). După efectuarea testului la 20 h (test inițial), s-a procedat la schimbarea mediului cu mediul de inducere a diferențierii, în locul mediului suplimentat cu MTS, iar ulterior cu mediul de menținere a diferențierii.

S-au înregistrat indicii celulari inițiali (la 20 h) și apoi la 96 h și la 18 zile, astfel încât s-au normalizat indicii pentru fiecare cultură în parte, evitându-se astfel variațiile generate de încărcarea neuniformă cu celule.

Rezultatele din 3 experimente independente, pentru cele 3 variante și pentru control sunt sintetizate în tabelul 2:

Tabelul 2

Indicii de diferențiere adipocitară

	Nenormalizat	Normalizat (96...20 h)	P
Control	100	100
A	102	104	< 0,1
B	118	123	< 0,05
C	106	109	< 0,05

în cazul frecvenței d, se observă că se reduce numărul celulelor comparativ cu martorul, ceea ce ne demonstrează ca armonica 3 a frecvenței principale are efecte negative și în consecința armonicile trebuie reduse la maxim, conform invenției, se reușește să le reducem la un nivel sub 0,2%.

RO 130324 Β1 în conformitate cu datele de mai sus, se observă stimularea diferențierii celulelor stern în adipocite la setarea B (frecvența medie) cu un factor de aproximativ 12% (p < 0,05). Similar, dar cu un coeficient mai mic, statistic semnificativ, s-a observat și la frecvență mai mare (5%, p < 0,05) în timp ce la frecvența cea mai scăzută, valorile nu au fost semnificative statistic. Frecvența cea mai ridicată (D) nu evidențiază însă aceleași efecte. Aceeași tendința a fost observată și la timpul final, chiar dacă intensitatea efectului a fost ușor mai scăzută. Aparent, efectul predominat este însă asociat cu fenomenul de proliferare celulară, în etapa în care fracția de celule stern este încă ridicată, după care se intră într-un relativ platou, numărul de celule nu mai cresc, o dată cu intrarea în faza de diferențiere. Colorația specifică pentru lipide a fost pozitivă în toate culturile.

Pentru Diferențierea Condrocitelor:

Diferențierea condrocitelor din celule stern mezenchimale s-a efectuat din pasajul nr. 4, în plăci cu 96 de godeuri, utilizând mediile de diferențiere a condrocitelor.

Au fost efectuate teste în condiții standard (cultura control) și în condiții de expunere la sistemul conform invenției, la setările A, B, C.

Culturile au fost expuse la dispozitivul ED timp de 2 h pe zi, începând cu 24 h de la instalarea în cultură, timp de 3 zile (la 24, 48 și 72 h).

La 48 h, s-a procedat la înlocuirea serului cu mediu proaspăt. După aceea, s-au făcut expuneri la fiecare 3 zile, câte 2 h. S-a efectuat o ultimă determinare (test MTS) la finalul experimentului (ziua 18).

La 20, 96 h și la 18 zile de cultivare, mediul a fost înlocuit cu mediul de același tip, suplimentat cu 0,1% reactiv MTS, s-a incubat pentru 3 h, apoi s-a colectat supernatantul și s-a măsurat activitatea optică la 490 nm (testul MTS). După efectuarea testului la 20 h (test inițial), s-a procedat la schimbarea mediului cu mediul de diferențiere obișnuit pentru condrocite, în locul mediului suplimentat cu MTS. S-au înregistrat indicii celulari inițiali (la 20 h) și apoi la 96 h și la 18 zile, astfel încât s-au normalizat indicii pentru fiecare cultură în parte, evitându-se astfel variațiile generate de încărcarea neuniformă cu celule.

Rezultatele din 3 experimente independente, pentru cele 3 variante și pentru control sunt sintetizate în tabelul 3:

Tabelul 3

	Nenormalizat	Normalizat (96...20 h)	P	Final (18 zile)
Control	100	100
A	101	101		100
B	106	105	<0,05	105	<0,05
C	103	102		102

în conformitate cu datele de mai sus, se observă o stimulare a diferențierii condrocitelor la setarea B (frecvența medie) cu un factor de aproximativ 6% (p < 0, 05), la 96 h, respectiv 5% în final. Celelalte frecvențe au rezultat într-o stimulare modestă, nesemnificativă statistic.

Colorația specifică pentru Ca a fost pozitivă în toate culturile.

Pentru Diferențierea Osteocitelor:

Diferențierea osteocitelor din celulele stern mezenchimale s-a efectuat din pasajul nr. 4, în plăci cu 12 de godeuri, utilizând mediile de diferențiere a osteocitelor.

RO 130324 Β1

Culturile au fost expuse la dispozitivul ED timp de 2 h pe zi, începând cu 24 h de la instalarea în cultură, timp de 3 zile (la 24, 48 și 72 h). La 48 h s-a trecut la înlocuirea serului, cu mediu proaspăt. După aceea s-au făcut expuneri la fiecare 3 zile, câte 2 h. S-a făcut o ultimă determinare (Test MTS) la finalul experimentului (ziua 18). La 20, 96 h și la 18 zile de cultivare, mediul a fost înlocuit cu mediul de același tip, suplimentat cu 0,1% reactiv MTS, s-a incubat pentru 3 h, apoi s-a colectat supernatantul și s-a măsurat activitatea optică la 490 nm (testul MTS). După efectuarea testului la 20 h (test inițial), s-a procedat la schimbarea mediului cu mediu de diferențiere obișnuit pentru osteocite, în locul mediului suplimentat cu MTS.

Rezultatele din 3 experimente independente, pentru cele 3 variante și pentru control, sunt sintetizate în tabelul 4.

Tabelul 4

	Nenormalizat	Normalizat (96...20 h)	P	Final (18 zile)
Control	100	100
A	102	102		102
B	109	111	< 0,05	110	<0,05
C	103	104		104

în conformitate cu datele de mai sus, se observă o stimulare a diferențierii osteocitelor la setarea B (frecvență medie) cu un factor de aproximativ 11 % (p < 0,05), la 96 h, respectiv 11% la final. Setarea C stimulează de asemenea proliferarea, cu 3%, respectiv 4% în final, semnificativ statistic. Colorația specifică pentru Ca cu Alizarin red a fost pozitivă în toate culturile. Au fost prelevate probe ce urmează să fie analizate pentru a identifica eventuale perturbări în transducția semnalului.

Concluziile generale sunt că expunerea la sistemul conform invenției, la toate setările, afectează ritmul de proliferare, respectiv cel de diferențiere.

Efectele Setării B (7,92 HZ) conduc la rezultatele maxime atât pentru proliferarea celulelor stern tumorale, cât și asupra diferențierii în lineajele celulare adipocitar, condrocitar și osteocitar.

Setarea A produce efectele minime asupra funcțiilor celulare, rezultatele de stimulare fiind lipsite de semnificație statistică.

Setarea C produce efecte semnificative statistic la proliferarea celulelor stern, dar mai puțin intense pentru diferențierea adipocitelor și osteocitelor, cu semnificație statistică redusă.

Setarea D nu produce efecte semnificative asupra proliferării celulare și nici asupra feneomenelor de diferențiere.

Analiza moleculelor de transducție a semnalului a evidențiat semnături specifice pentru tipurile de celule - ADMSC, adipocite și osteocite.

Semnăturile sunt conservate corect în cursul expunerii la câmpul magnetic, neapărând perturbări ale nivelului relativ între celulele martor și tratate, raport care este totuși specific pentru fiecare tip celular în parte. Remarcabilă este scăderea expresiei unor kinaze implicate în proliferare (de exemplu ERK V2) de la celulele proliferante la celulele diferențiate.

Compoziția celulelor din țesutul gingival include keratina, care este o substanță proteică ce se află în compoziția multor tipuri de celule. în consecință, cititorii familiarizați vor aprecia cu ușurință că aparatul poate fi folosit de asemenea pentru tratarea țesuturilor celulare care include

RO 130324 Β1 în compoziția lor keratină, precum părul și pielea, în vederea creșterii numărului de celule de regenerare și eliminarea ridurilor sau pentru alte afecțiuni ale pielii; și pentru îmbunătățirea integrării implanturilor, fie dentare sau de altă natură, prin îmbunătățirea fundației de implant înainte de implant și a accelerării regenerării după implant.

Sistemul, conform invenției, poate fi folosit, în consecință, pentru o gamă largă de utilizări cosmetice și terapeutice și realizări alternative, luând în considerare variația adâncimii regiunii supuse unui câmp electromagnetic optim relativ la suprafața externă, precum pielea sau osul maxilarului. Mai simplu, adâncimea unei emisii optime poate varia prin adăugarea sau înlăturarea unor spire la bobina 30.

Astfel, un prim exemplu de utilizare conform invenției, arătat în fig. 5, este prezentat în fig. 13, și ilustrează un mediu de rezonanță înglobat într-o bobină 30 înfășurată în jurul unui element suport 40, conectată la un generator 10, prins sau fixat altfel pe un pansament flexibil sau o bandă 1301 pusă pe abdomenul subiectului 1302 peste o zonă localizată 1303 ce urmează a fi tratată. Această realizare poate fi utilizată pentru a supune un organ intern, de exemplu ficat sau rinichi, câmpului EM ELF din invenție. în acest exemplu, regenerarea ficatului se va produce ca rezultat al celulelor progenitoare care există în ficat și care vor prolifera ca urmare a acțiunii câmpului EM ELF.

Al doilea exemplu de utilizare a sistemului conform invenției, din fig. 5, este prezentat înfig. 14, care ilustrează din nou un mediu de rezonanță 20 înglobat într-o bobină 30 înfășurată în jurul unui element suport 40, conectată la un generator 10, prins sau fixat altfel pe o curea ajustabilă 1401 fixată pe capul subiectului 1302 pe zona localizată 1303 care urmează să fie tratată. Această realizare poate fi folosită pentru a supune epiderma subiectului 1302 unui câmp EM ELF prezentat în invenție, în scopul de a îmbunătăți elasticitatea și a reduce ridurile, încrețiturile etc. în mod alternativ, aceeași realizare poate fi folosită pentru a rezolva problema căderii părului.

O alternativă a prezentei realizări, arătată în fig. 15, ia în considerare utilizarea simultană a mai multor medii de rezonanță 20, prinsă sau altfel fixată pe o curea ajustabilă 1501, care este conectată la un generator 10 care să asigure uniformitatea semnalului la fiecare mediu de rezonanță 20 și să evite orice interferență sau perturbare a respectivelor câmpuri EM ELF în respectivele regiuni 1303. Această realizare poate fi utilizată pentru tratarea ridurilor și a altor problemele ale pielii pe o arie mai mare a subiectului, precum vergeturi, celulita etc., sau rezolvarea problemei căderii părului.

Este ușor de înțeles de către o persoană cu pregătire în domeniu că foarte multe realizări alternative sunt posibile pe baza principiilor descrise mai sus, fără a se îndepărta de la scopul acestei prezentări. în special cu referire la utilizarea simultană a mai multor medii de rezonanță 20, asemenea celor descrise mai sus și arătate în fig. 15, o alternativă a acestei realizări este arătată în fig. 16, care încă o dată ia în considerare utilizarea mai multor medii de rezonanță prinse sau altfel fixate pe o mască facială 1601, fiecare dintre acestea conectate la un generator 10, prin care această realizare poate fi din nou utilizată pentru tratarea ridurilor, încrețiturilor etc. Ca o alternativă, poate fi folosită o cască care se pune pe cap, diferită de masca facială. Realizări diferite iau în considerare utilizarea mai multor medii de rezonanță 20, prinse sau altfel fixate pe un mediu suport care este în mod tipic utilizat pentru perioade mai lungi de timp, în special în forma unei saltele sau a unei perne. Asemenea realizări sunt considerate în mod special avantajoase pentru prevenirea ulceraților de decubit, care sunt cunoscute că se produc atunci când subiectul este ținut la pat după o procedură, o perioada îndelungată de timp.

RO 130324 Β1

Mai mult, utilizarea sistemului conform invenției nu este limitată la celule umane sau animale, ci, spre exemplu, a dovedit efecte benefice și asupra celulelor vegetale. în consecință, un alt exemplu de utilizare a sistemului conform invenției este arătat în fig. 18, care ilustrează o pereche de medii de rezonanță 20, fiecare înglobat într-o bobină 30 înfășurată în jurul unui element suport 22 pe un mediu suport 40 conectat la un generator 10, în această realizare prin sau altfel fixat pe o curea ajustabilă 1802 aflată pe tulpina unei plante 1801.

Mai multe efecte benefice care se nasc din aplicarea unui câmp magnetic de extrem de joasă frecvență pot fi așteptate în următoarele cazuri: reumatism acut și cronic, dureri articulare, artrită, osteoporoză, circulație sanguină deficitară, disfuncții sexuale, insomnie, nevroze, probleme de concentrare, meteo-sensibilitate, probleme de respirație, problem metabolice etc. Se poate spune că aplicarea unui câmp magnetic de joasă frecvență ELF asupra țesutului celular poate determina următoarele efecte principale: efect antiinflamator, efect neo-antigenic prin creșterea proliferării celulelor endoteliale și tubularizarea acestora, și o producere crescută de fibrobastei, efect de repartelizare prin stimularea formării de colagen; îmbunătățirea fertilității prin creșterea proliferării celulelor spermatogene.

în consecință, sistemul invenției poate fi utilizat pentru proliferarea creșterii țesuturilor celulare in vitro, precum epiderma, corneea, țesutul endotelial hepatic, ligamente, membrane, pe lângă altele. în special, după cum s-a sugerat prin experimentele descrise mai sus, depozitele de celulele prelevate pot utiliza metoda și sistemul invenției pentru o proliferare economică, a celulelor stern și celulelor progenitoare.

în descriere, termenii constă/cuprinde, a constat/a inclus - constând/incluzând, sau orice altă variație a acestora care include termenii include - a inclus - incluzând sau orice altă variație a acestora, sunt considerate a fi pe deplin interschimbabile și ar trebui să fie permisă interpretarea în forma cea mai largă posibil și vice-versa.

Invenția nu este limitată la realizările descrise în prezenta, iar acestea pot varia atât în construcție, cât și în detaliu.

Claims

Revendicări

1. Sistem pentru proliferarea celulelor stern în țesut celular in vivo, prin aplicarea locală a unui câmp magnetic de extrem de joasă frecvență (ELF) compus dintr-un generator (10) pentru producerea unui semnal de curent sinusoidal de extrem de joasă frecvență, și cel puțin un mediu de rezonanță (20) conectat la generator (10), în care, într-o primă variantă:

- generatorul (10) produce un semnal de curent constant sinusoidal de extrem de joasă frecvență ce are o valoare l_RMS = 0,195 A, o frecvență predeterminată aleasă în mod substanțial în intervalul 7,65 și 7,75 Hz, și o inducție a câmpului magnetic ce are, în mod substanțial, o valoare B_RMS = 0,75 mT la o distanță de 3 mm față de suprafața solenoidului suportului de rezonanță, cu armonici în mod substanțial mai mici de 0,2%, care conține:

- un oscilator cu cuarț (11) care generează un semnal rectangular de înaltă frecvență de mare precizie, care este divizat succesiv printr-un prim circuit integrat (11), la ieșirea căruia se obține frecvența dorită între 3 și 30 Hz, și printr-un al doilea circuit integrat (12) de tip filtru Butterworth de ordinul 8, cu care semnalul dreptunghiular este convertit în semnal sinusoidal, și

- un atenuator (14) de semnal în trepte, pentru a furniza numai o valoare pentru un curent care să determine o inducție în domeniul 0,25...2 mT, fiecare treaptă a acestui atenuator (14) ducând la o creștere cu 0,25 mT a inducției câmpului magnetic obținută la un emițător (44) al mediului de rezonanță (20);

și în care:

- cel puțin mediul de rezonanță (20) conectat funcțional la generator (10), conține cel puțin un element de bobină (30) ce are un număr de spire înfășurate în jurul unui emițător (44) fabricat din material magnetic, suportul de rezonanță (20) fiind supus la menționatul semnal de curent ce are o frecvență optimă predeterminată aleasă în mod substanțial în intervalul 7,65 și 7,75 Hz, și inducția câmpului magnetic are în mod substanțial o valoare B_RMS 0,75 mT la o distanță de 3 mm față de suprafața solenoidului suportului de rezonanță, cu armonici în mod substanțial mai mici de 0,2%;

2. Sistem, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că primul circuit integrat (11) conține un numărător sincron (122), un prim (121) și un al doilea (125) numărător asincron, o multitudine de rezistoare (123₁...123₈) și o multitudine de comutatoare (124₁...124₈), primul circuit (11) integrat fiind configurat să comute unul sau mai mulți rezistori din multitudinea de rezistoare prin unul sau multe comutatoare din multitudinea de comutatoare, și să dividă frecvența prin N = 1 la 256 cu numărătorul sincron (122) să dividă frecvența prin 2⁸ cu primul numărător asincron (121) ca o funcție a rezistorilor comutați (123₁...123₈).

3. Sistem, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că atenuatorul (14) de semnal în trepte (14) conține 8 trepte, fiecare treaptă fiind adaptată să crească inducția câmpului magnetic al mediului de rezonanță (20) cu 0,25 mT.

4. Sistem, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că generatorul (10) este configurat suplimentar să ajusteze semnalul de curent în conformitate cu o adâncime anatomică cunoscută, care este adâncimea la care se află celulele organice în interiorul regiunii relative.

5. Sistem, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că adâncimea este în intervalul de la 1 mm la 100 mm, de preferat 3 mm.

6. Sistem, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că suportul (40) este fabricat din material paramagnetic.

RO 130324 Β1

7. Sistem, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că emițătorul (44,70) conține două porțiuni ramificate paralele (71,72), care se proiectează dintr-o porțiune de bază, definind o formă de U sau de oală, este fabricat integral din material magnetic, și cel puțin un element de bobină (30) este înfășurat pe porțiunea de bază.

8. Sistem pentru proliferarea celulelor stern în țesut celular, prin aplicarea locală a unui câmp magnetic de extrem de joasă frecvență (ELF) compus dintr-un generator (10) pentru producerea unui semnal de curent sinusoidal de extrem de joasă frecvență, și cel puțin un mediu de rezonanță (20) conectat la generatorul (10), în care, într-o a doua variantă:

- generatorul (10) produce un semnal de curent constant sinusoidal de extrem de joasă frecvență ce are o singură valoare, o frecvență predeterminată aleasă în mod substanțial în intervalul 7,65 și 7,75 Hz, astfel încât inducția câmpului magnetic să aibă, în mod substanțial, o valoare B_RMS= 0,75 mT la o distanță dorită de suprafața solenoidului mediului de rezonanță, cu armonici în mod substanțial mai mici de 0,2%, care conține:

- un Sintetizator Digital Direct (101), adaptat să genereze direct semnalul sinusoidal cu armonici în mod substanțial mai mici de 0,2% și să genereze un semnal de curent sinusoidal precis cu o singura frecvența în interiorul intervalului 7,65 și 7,75 Hz comandat de un procesor;

- o unitate de amplificare (103) a curentului constant sinusoidal pentru a asigura la nivelul emițătorului (44) o inducție de până la 3 mT, controlată de procesor (102), ieșirea unității de amplificare (103) fiind aplicată la terminalele relevante ale generatorului (10) care este funcțional conectat cu elementul bobină (30) a mediului de rezonanță (20);

și în care:

- cel puțin mediul de rezonanță (20) conectat funcțional la generator (10) conține cel puțin un element de bobină (30) ce are un număr de spire înfășurate în jurul unui emițător (44) fabricat din material magnetic, suportul de rezonanță (20) fiind supus la semnal de curent menționat, ce are o frecvență optimă predeterminată, aleasă în mod substanțial în intervalul 7,65 și 7,75 Hz, și inducția câmpului magnetic are în mod substanțial o valoare BRMs 0,75 mT la o distanță de 3 mm de suprafața solenoidului suportului de rezonanță, cu armonici în mod substanțial mai mici de 0,2%;

9. Sistem, conform oricăreia dintre revendicările 1 sau 8, caracterizat prin aceea că suportul (40) este selectat dintr-un grup care conține cel puțin o centură, o mască, un pansament, o cască, cu o multitudine de medii de rezonanță (20) conectate la generator (10) și poziționate fix pentru a asigura la adâncimea dorită o uniformitate a semnalului și pentru a nu se permite distorsionări sau perturbații ale câmpului magnetic obiectiv măsurat cu teslametru.