RO134540A2 - Sisteme antimicrobiene care conţin nanoparticule de argint şi antibiotic pentru aplicaţii biomedicale: preparare şi caracterizare - Google Patents

Abstract

Invenţia se referă la un procedeu de obţinere a unui sistem coloidal pe bază de nanoparticule de Ag funcţionalizate cu un antibiotic, cu activitate antiseptică/antimicrobiană mărită. Procedeul, conform invenţiei, constă în prepararea unui amestec de citrat trisodic şi acid tanic, care se încălzeşte la temperatura de 100°C, se adaugă sub agitare intensă o soluţie de AgNO3, cu menţinere timp de 15 min, după care suspensia de nanoparticule de Ag se răceşte la temperatura camerei, este supusă purificării, rezultând nanoparticule de Ag care se dispersează în apă deionizată, formând o soluţie coloidală de concentraţie în Ag de 0,25 mM, care se amestecă în cantitate de 2...2,8 mL cu 0,2...0,5 mL soluţie de vancomicină clorhidrat de concentraţie 50 μg/mL, rezultând un sistem coloidal antimicrobian cu efect sinergic asupra antibioticului, astfel că acesta devine activ la concentraţii inferioare, de 2 μg/mL în preparatele farmaceutice.

Description

OFICIUL DE STAT PENTRU INVENȚII Șl MĂRCI Cerere de brevet de invenție

Nr. .....

Data depozit ...1

Sisteme antimicrobiene care conțin nanoparticule de argint si antibiotic pentru aplicatii biomedicale: preparare si caracterizare

Invenția se referă la sisteme antimicrobiene pentru uz extern pe bază de nanoparticule de argint, NpAg, funcționalizate cu vancomicină cu activitate antibacteriană semnificativă împotriva bacteriilor Gram pozitive din genurile Staphylococcus (S. aureus, S. epidermidis, S. schleiferi), Streptococcus (S. bovis S. viridans), Enterococcus (E. faecalis si E. faecium), Micrococcus (M. luteus), inclusiv o anumita activitate Di împotriva unor bacterii Gram negative, genul Escherichia (E. coli), în comparație cu VCM pură.

Activitatea antiseptică a argintului este cunoscută încă din antichitate. Importanța azotatului de argint în domeniul medical, la tratamentul infecțiilor și al anumitor afecțiuni cum ar fi constipația sau pirozisul a fost evidențiată în diverse studii [1]. Cercetările recente în domeniu [2-4] au demonstrat activitatea antibacteriană, antivirală și antifungică a argintului constituind fundamentul ce a stat la baza elaborării mai multor tipuri de materiale antiseptice, diferite tipuri de pansamente cu argint, precum și creme, spray-uri sau loțiuni, utilizate la tratarea plăgilor provenite din arsuri sau a celor determinate de ulcere cronice [5-9]. Utilizarea argintului ca agent cu activitate antiseptică este pe deplin justificată pe de o parte de spectrul larg antimicrobian care cuprinde îndeosebi specii Gram pozitive si mai puțin Gram negative [10-15], precum și de toxicitatea redusă față de organismele mari [5, 6].

Mecanismul biologic de acțiune al argintului este determinat de capacitatea lui de a se asocia sau de a adera la nivelul peretelui celular al micro-organismelor, respectiv la nivelul membranei bacteriene, sau la citoplasmă, unde interacționează cu proteinele care intră în structura bacteriei pe care astfel le denaturează. Modificările suferite de proteinele din structura bacteriilor se realizează practic prin interacțiunea ionilor de argint cu gruparea tiol (-SH) din structura enzimelor inhibând dezvoltarea acestora, grupele tiol devenind (-SAg) [6]. Mai mult, ionii de argint pot cataliza reacțiile de oxidare a grupării tiol (-SH) cu formarea de legături disulfidice (-S-S-) între două molecule de aminoacizi, determinând astfel modificarea structurală a proteinelor și a enzimelor care participă la procesul de respirație celulară, producând astfel moartea bacteriei [16]. Prin intermediul reacțiilor ce duc la apariția grupărilor disulfidice (-S-S-) și (-SAg) este afectat atât ATP-ul cât și ADN-ul bacteriilor.

Din cele expuse rezultă că activitatea antibacteriană, antivirală și antifungică a argintului se poate realiza practic doar prin intermediul ionilor Ag⁺, argintul metalic neavând activitate antiseptică. In acest context azotatul de argint pare a fi un agent antiseptic foarte eficace datorită capacității lui de a pune în libertate, într-un interval scurt de timp, un număr mare de ioni de Ag⁺ care interacționează rapid cu pereții celulari ai fungilor si bacteriilor (Staphylococcus și Streptococcus), dar în același timp ei pot și chiar interacționează și cu pereții celulari ai celulelor sănătoase, ceea ce face ca acțiunea azotatului de argint să fie de scurtă durată. în felul acesta argintul poate deveni toxic și pentru organismele mari. Rezultă de aici necesitatea ca argintul să fie administrat sub o formă în care pune în libertate ioni de Ag⁺ într-o perioadă mai lungă de timp și într-o concentrație care pe de o parte să distrugă bacteriile (stafilococii și streptococii), dar care să nu atingă doza toxică pentru organismele mari. Acest deziderat se realizează prin utilizarea de Ag° de dimensiuni cât mai mici, adica sub forma de nanoparticule de argint, NpAg. S-au propus numeroase metode de obținere a nanoparticulelor de argint prin reducerea Ag⁺ cu diferiți reducători [2, 3, 17, 18], \ * ^r ' ¹ a 2019 00279

13/05/2019

S-au realizat astfel produse comerciale precum Argentum colloidal care se prezintă sub forma unei suspensii cu conținut de 70-75% Ag, utilizat în special pentru afecțiuni precum: rinite, conjunctivite, blefarite, uretrite, vaginite. Un alt produs comercial pe bază de argint Targesin reprezintă un complex coloidal având și parte organică, formată din diacetiltanin, albuminat de argint, cu un conținut de 4-7% argint coloidal, indicat a fi utilizat în gastrite, duodenite, ulcer gastric și duodenal, oftalmologie și diferite infecții.

Utilizarea argintului în scopuri medicale presupune ca acesta să se prezinte sub formă de particule de dimensiuni foarte mici (ordinul nanometrilor) ceea ce asigură o suprafață foarte mare de contact cu lichidul plasmatic și astfel condițiile pentru o viteză de reacție adecvată prin care se pune în libertate o cantitate de ioni Ag⁺ ce asigură efectul antiseptic, dar care nu este toxică pentru organismele mari.

Pentru a diminua efectele negative și pentru a-i atenua toxicitatea s-au elaborat o serie de compuși „organo-argentici” ca: sulfodiazina argentică (DERMAZÎN), alantoianatul argentic de zinc (cunoscut sub denumirea de AZAC), proteinatul de argint, dextron nitratul de argint, caracterizate printr-un conținut ridicat de argint Ag° utilizate in special la fabricarea pansamentelor sterile, a săpunurilor dezinfectante, a cateterelor urinare. In domeniul veterinar menționăm produsul Agipiu Vet Spray, utilizat ca dezinfectant, pentru uz extern, pentru orice leziune cutanata.

Neajunsurile produselor comerciale pe bază de argint derivă din faptul că ionii de Ag⁺ formează legături puternice la nivelul suprafeței celulare ceea ce poate determina un efect toxic prin inhibarea lanțului respirator și pentru celulele sănătoase. Un alt neajuns al produselor existente pe bază de argint este acela că pot provoca arsuri și necrozări mai ales în cazul concentrației ridicate în Ag și aplicării repetate pe perioade lungi de timp. Astfel de aplicări pot provoca fenomenul de intoxicație celulară [19]. Pe de altă parte, diverse antibiotice sunt disponibile pentru a combate infecțiile [20], dar datorita utilizării lor abuzive unele microorganizme au dezvoltat rezistență la antibiotic sau la mai multe medicamente (multiple drug resistance: MDR). Aceasta situație a devenit dificilă pentru domeniul medical, limitând alegerea de antibiotice. In general orice folosire de antibiotic poate produce o creștere a rezistenței la unele bacterii si aceasta permite bacteriilor rezistente să supraviețuiască iar doar bacteriile susceptibile sa moară.

Clorhidratul de vancomicină (VCM) este indicat în tratamentul infecțiilor [21-23] cu tulpini ale stafilococilor meticilino-rezistenți (MRSA), în cazul pacienților alergici la penicilină, pentru pacienții care nu răspund la alte medicamente și pentru alte infecții cauzate de microorganisme sensibile la vancomicină, dar rezistente la alte medicamente antimicrobiene. Vancomicina este, de asemenea, eficace în tratamentul infecțiilor osoase, infecții ale pielii și a structurilor acesteia [20-22],

Efectele utilizării vancomicinei în calitate de produs farmacologic cu activitate antibacteriană pot fi modificate și influențate în timp de diferiți factori inclusiv de producerea de bacteriocine [23], Utilizarea prelungită a vancomicinei, în dozele indicate, poate conduce la apariția unor tulpini de stafilococi care să devină în timp rezistente la acest antibiotic. Pe de altă parte, utilizarea prelungită a vancomicinei poate determina suprainfecții cu microorganisme cu rezistență mult sporită la antibiotice [24],

Sistemul antimicrobian care conține nanoparticule de argint (NpAg) si vancomicină conform invenției, înlătură dezavantajele produselor existente în domeniu prin aceea că este alcătuit din NpAg cu dimensiuni de 5-^40 nm de preferință 1025 nm, obținute prin reducerea Ag⁺ (concentrație 0,001 - 0,005% gr (0.1 - 0.5 mM), de preferință002-0,003% gr. (0.2 - 0.3

a 2019 00279

13/05/2019 mM) la Ag° cu un reducător format dintr-o soluție ce conține citrat trisodic, CTS (în limitele 0,1 - 0,6% gr. (4 - 23 mM), de preferință 0,1-0,2% gr. (4-8 mM ) si acid tanic. AT (în limitele (0.003 - 0,1 % gr) (0,02 - 0,6 mM), de preferință 0,004-0,01% gr. [0,025 - 0,06 mM) în care raportul masic Ag:citrat trisodic:acid tanic, Ag: CTS:AT = 1:(10-60):(1-20), funcționalizate cu vancomicină în raportul masic NpAg:VCM = 1:(0,1 + 1,5), de preferința 1:(0,13-0,45), concentrația suspensiei VCM@NpAg-CTS-AT variind în limitele: pentru Ag 10 - 25 pg/ml de preferință 15-20 pg/ml respectiv pentru VCM 2+20 pg/ml, de preferință 3+10 pg/mL

Sistemul rezultat, descris în exemplul invenției, a fost caracterizat din punct de vedere fizico-chimic prin spectroscopie UV-VIS (Fig. 1), microscopie electronică de baleiaj, SEM si spectroscopie de dispersie a razelor X, EDX (Fig. 2) si microscopie de forță atomică, AFM (Fig. 3). Toate scot în evidență prezența nanoparticulelor de argint si dau o imagine asupra distribuției dimensiunilor acestora.

în tabelul 1 sunt prezentate comparativ, eficacitatea sistemelor coloidale preparate față de diferite tulpini bacteriene în funcție de conținutul în NpAg și vancomicină. Evaluarea eficacității sistemelor coloidale NpAg - VCM s-a efectuat după metoda difuziei în gel de agar și măsurarea diametrului zonei de inhibiție (Fig. 4). Ele s-au comparat cu efectul unor soluții de VCM de aceleași concentrații, dar fără NpAg și cu efectul discului de VCM de 30 pg.

Analiza rezultatelor din tabelul 1, respectiv figura 4, arată superioritatea dispersiilor VCM@NpAg-CTS-AT față de soluțiile de clorhidrat de vancomicină de aceeași concentrație, atât în ce privește zona de inhibiție (mai mare pentru varianta a) cât și spectrul de activitate, primele fiind active și pentru E. faecalis și E. coli pentru 0,36 pg Ag/doză și la o cantitate începând de la 0,067 pg vancomicină/doză.

Exemplu

In cele ce urmează se dă un exemplu de realizare a invenției.

Tulpinile microbiene au fost însămânțate pe medii glucozate (bulion și geloză nutritive), incubarea fiind făcută la termostat la temperatura de 37°C, în condiții aerobe, timp de 18-24 de ore. Pentru determinarea efectului antibacterian, s-a lucrat după modelul efectuării antibiogramei (metoda difuzimetrică în gel de agar nutritiv), cu adaptările necesare pentru testarea unor produse condiționate sub formă lichidă, efectuând godeuri cu diametrul de 6 mm, în care s-au distribuit câte 20pl din diferitele variante ale produsului [2].

NpAg se prepară prin reducerea Ag⁺ la Ag° cu un amestec citrat trisodic - acid tanic la pH 6,8+7,1 în care scop s-a preparat 100 ml soluție cu 0,153 g citrat trisodic dihidrat, 0,00425 g acid tanic (1,25 ml soluție 0,34%) și se încălzește la temperatura de 100°C. Sub agitare intensă se adaugă 0,0027 g Ag^+I (2,5 ml soluție 10'²M de AgNO₃). Se continuă agitarea timp de 15 minute după care suspensia NpAg se răcește la temperatura camerei. După răcire, masa de reacție astfel preparată, este supusă purificării pentru îndepărtarea excesului de reactivi și a produșilor secundari de reacție (NaNO₃). Purificarea se realizează prin separarea NpAg într-o ultracentrifugă cu 10000 rot/min pentru 20 min. și spălarea de două ori cu câte 100 ml apă distilată, urmată de ultracentrifugare. NPAg ultracentrifugate și spălate se redispersează în apă deionizată, folosind o unitate de ultrasonare, astfel încât să formeze o soluție coloidală de concentrație în Ag 0.25 mM. Separat s-a preparat o soluție de vancomicină clorhidrat cu concentrația de 50 pg/ml (0.0336 mM; 0,005% gr). Din probele astfel preparate s-au luat diferite cantități de soluție coloidală de NpAg (2+2,8 ml) care s-au amestecat cu soluția de vancomicină (0,2+0,5 ml). Din amestecurile rezultate s-au prelevat probe de 20 pl pentru testarea activității a 2019 00279

13/05/2019 antibacteriene a preparatelor (figura 4a,b, pentru două concentrații ale soluției coloidale). Se observă că zonele de inhibiție sunt mai mari pentru sistemul coloidal VCM@NpAg-CTS-AT față de soluțiile care conțin numai vancomicină la aceeași concentrație (figura 4c). Aceste zone de inhibiție sunt comparabile cu cele corespunzătoare discului de vancomicină de 30 pg vancomicină clorhidrat (figura 4d). De asemenea, se constată că spectrul de activitate antibacteriană este mai larg, produsul inducând rezultate pozitive și pentru Escherichia coli si Enterococus faecalis.

In continuare redăm patente/brevete din US, EP, WO si China care folosesc diverse sisteme de NpAg cu o larga aplicabilitate [1-19]. Aceste documente prezintă metode de obținere a NpAg complet diferite de invenția prezentă.

Prin aplicarea brevetului rezultă următoarele avantaje:

Funcționalizarea NpAg cu vancomicină are efect sinergie asupra antibioticului, potențându-i activitatea antibacteriană, astfel că aceasta devine activă la concentrații inferioare, 2 pg/ml, față de cele utilizate în prezent, 8 pg/ml [25,26], în preparatele farmaceutice actuale.

- Se reduce substanțial cu 30-70% doza de vancomicină din preparatul farmaceuic ce conține nanoparticule de argint funcționalizate cu vancomicină.

- Prezența argintului în sistemul coloidal, care conține nanoparticule de argint vancomicină, NpAg - VCM, determină modificări ireversibile în structura bacteriilor si a altor microorganisme patogene, eliminandu-se astfel posibilitatea de adaptare a acestora la vancomicină.

Sistemele coloidale antimicrobiene care conțin nanoparticule de argint si un antibiotic, de preferința vancomicină, sau o combinație de antibiotice, devin active la concentrații inferioare față de cele utilizate în prezent la prevenirea creșterii bacteriilor si in tratamentul infecțiilor, sau in aplicatii medicale dentare si ortopedice.

Claims (15)

1. Revendicări

   I) Sistem coloidal care conține NpAg-antibiotic (NpAg:AN), de preferința NpAg vancomicină, cu activitate antibacteriană, antifungică, antivirală și caracterizat prin aceea că este alcătuit din NpAg cu dimensiunile 5 - 40 nm de preferință 10-^25 nm obținute prin reducerea Ag⁺ la Ag° dintr-o soluție cu concentrația 0,001 - 0,005% gr, cu un reducător format dintr-o soluție ce conține citrat trisodic de concentrație 0,1 0,6% gr si acid tanic, cu concentrația în limitele 0,003 - 0,1% gr % în care raportul masic citrat trisodic : acid tanic variază în limitele (1 - 30): 1, funcționalizate cu antibiotic, de preferința vancomicină, în raport masic NpAg:VCM = 1: (0,1+-1.5) concentrația sistemului coloidal VCM@NpAg-CTS-AT variind în limitele Ag: 10 25 gg/ml, respectiv VCM: 2+20 gg/ml.
2. 2) Sistem coloidal antimicrobian conform revendicării 1 caracterizat prin aceea că reducerea Ag⁺ (AgNOj) de concentrație de preferință 0,002-0,003% la Ag° se realizează cu un reducător format dintr-o soluție ce conține citrat trisodic (de preferință cu concentrația 0,1-0,2% și acid tanic cu concentrația de preferință 0,0040,01%, în care raportul masic citrat trisodic:acid tanic = (15 -25):1, iar raportul masic NpAg:VCM este 0.15 - 0.5; concentrația sistemului coloidal VCM@NpAg-CTS-AT fiind de preferință Ag: 15-20 pg/ml și VCM 3-10 gg/ml.
3. 3) Sistem coloidal antimicrobian conform revendicărilor 1 și 2 caracterizat prin aceea că reducerea Ag⁺ la Ag° se realizează la pH 6,5+7,2 și temperatura cuprinsă în intervalul 65+100° C de preferință 85+95° C.
4. 4) Sistem coloidal antimicrobian conform revendicărilor 1, 2 și 3 caracterizat prin aceea că reducerea Ag⁺ la Ag° se realizează prin adăugarea treptată a soluției de Ag⁺ peste cea a reducătorului, sub agitare intensă.
5. 5) Sistem coloidal antimicrobian conform revendicării 1, 2, 3 și 4 caracterizat prin aceea că îndepărtarea excesului de reactanți și a produșilor de reacție secundari rezultați la obținerea NpAg, s-a realizat prin ultracentrifugare Ia o turație de 10000 rot/min și reluarea de două ori cu apă distilată a precipitatului de Ag, la temperatura camerei.
6. 6) Sistem coloidal antimicrobian conform revendicărilor 1, 2, 3, 4 și 5 caracterizat prin aceea că funcționalizarea NpAg cu vancomicină, s-a realizat prin adăugarea soluției de vancomicină cu concentrația în limitele 50+500 gg/ml, sub agitare la temperatura camerei, peste soluția coloidală NpAg a cărei concentrații a variat în limitele 10-25 gg/ml Ag° de preferință 15-20 pg/ml Ag°.
7. 7) Metoda de prevenire a creșterii bacteriilor sau de tratament a infecțiilor care include un sistem coloidal care conține NpAg-antibiotic conform revendicărilor 1, 2, 3, 4. 5 și 6, aplicata ca tratament local unde complecșii NpAg-AN polifuncționali, preferabil VCM@NpAg-CTS-AT, acționează caagenți antimicrobieni.

   a 2019 00279

   13/05/2019
8. 8) Metoda revendicării 7, unde nanoparticulele polifuncționale sunt aplicate local, iar zona de aplicare poate fi reprezentata de o cavitate a corpului, piele, patul unghiei sau cavitatea bucală.
9. 9) Metoda revendicării 8, unde metoda ar putea avea utilizare în tratarea periodontitei.
10. 10) Metoda revendicării 8, unde metoda ar putea fi aplicata la tratarea arsurilor sau a unor forme de diabet (piciorul diabetic).

    II) Metoda revendicării 8 aplicată la tratamentul patogenilor rezistenți la vancomicina.
11. 12) Metoda revendicării 7 aplicată la dezinfecția sau sterilizarea diverselor ustensile sau dispozitive medicale.
12. 13) Metoda revendicării 7, care cuprinde atat VCM@NpAg-CTS-AT cat si alți complecși polifuncționali AN@NpAg-CTS-AT care pot acționa sinergie (împreuna) ca agenți antimicrobieni avand un spectru larg de acțiune împotriva microorganismelor patogene.
13. 14) Metoda revendicării 13 aplicată la dezinfecția sau sterilizarea diverselor ustensile sau dispozitive medicale.
14. 15) Metoda revendicării 7, unde nanoparticulele polifuncționale, NpAg-AN, sunt aplicate (adsorbite) local, pe suprafața unui implant ortopedic sau a unui implant dentar.
15. 16) Metoda revendicării 15, unde sistemul coloidal de AgNp conține un antibiotic, sau o combinație de antibiotice, selectate din grupul vancomicinei, gentamicinei si tobramicinei.