RO139082A2 - Tulpină de trichoderma pseudokoningii care răspunde la mimicii de strigolactone - Google Patents

Abstract

Invenţia se referă la o tulpină biostimulantă de <em>Trichoderma Pseudokoningii</em> cu acţiune de biostimulare a plantelor. Tulpina de <em>T. pseudokoningii </em>Tpk20, conform invenţiei, acţionează complementar cu analogii şi mimicii de strigolactone în reducerea stresului hidric la plantele de tomate cultivate în câmp şi în stimularea de compuşi benefici în fructele de roşii, de tip licopen şi acid gamma-amino-butilic.

Description

TULPINĂ BIOSTIMULANTĂ DE TRICHODERMA PSEUDOKONINGII CARE RĂSPUNDE LA MIMICII DE STRIGOLACTONE

Prezenta invenție se referă la o tulpină de tulpină de Trichoderma pseudokoningii care are o acțiune de biostimulare a plantelor, datorită producerii specifice de compuși care biodisponibilizează nutrienți și/sau cu acțiune de activare a căilor metabolice de apărare din plante, și care răspunde la mimicii de strigolactone prin amplificarea producerii de compuși implicați în biostimularea plantelor.

Sunt cunoscute diferite tulpini de Trichoderma care au acțiune de biostimulare a plantelor de cultură. Cererea de brevet WO2022029343 A1 se referă la o tulpină biostimulantă de T. harzianum depozitată la Colecția Spaniolă de Culturi Tip (CECT), cu numărul de depozit CECT21179, și la utilizarea acesteia pentru a crește eficiența utilizării fertilizanților. Brevetul EP3764797 B1 prezintă o tulpină fungică din genul Trichoderma, codificată HSA12 și care este depozitată cu numărul DSM 32722 la Leibniz-lnstitut DSMZ - Colecția Germană de Microorganisme și Culturi Celulare. Această tulpină fungică crește toleranța plantelor de tomate, porumb și soia la stresurile abiotice - stres de lipsă de apă, stres de temperaturi scăzute și stres oxidativ. Tulpina HSA12 este utilizabilă și pentru remedierea solului și a apelor poluate, ca și pentru reconstrucție ecologică, inclusiv prin recolonizare cu populații de plante care sunt pe cale de disparție sau care sunt utile pentru un anumit mediu.

Brevetul FR2903419 B1 protejează tulpina depozitată sub numărul MUCL 45632 la Colecțiiile Coordonate Belgian de (tulpini de) Microorganisme (BCCM), care aparține speciei Trichoderma atroviride, și care are acțiune de stimulare a germinației și creșterii plantelor.

Brevetul SUA 8716001 B2 descrie utilizarea unor tulpini de Trichoderma, Trichoderma atroviride WW10TC4 (număr de depozit ATCC PTA 9707), Trichoderma harzianum RR17Bc (număr de depozit ATCC PTA 9708), Trichoderma harzianum F11 Bab (număr de depozit ATCC PTA 9709), aplicate separat sau în combinații ale acestora, pentru: inducerea rezistenței plantelor la stresuri biotice și abiotice; reducerea impactului negativ al azotatului în exces (emisii de protoxid de azot din sol, levigarea ionilor azotat în acvifer și ape de suprafață) datorită creșterii eficienței de utilizare a azotului de către plante; mărirea cantității de carbon sechestrat din atmosferă datorită intensificării proceselor de fotosinteză în plantele a căror rizosferă este colonizată de respectivele tulpini.

Brevetul US8598083 (B2) se referă la tulpina de Trichoderma harzianum TSTh20-1, depozitată cu numărul PTA-10317 la Colecția Americană de Culturi de Microorganisme (ATCC), care are capacitatea de a stimula creșterea plantelor, în condiții de stres abiotic determinate de prezența hidrocarburilor aromatice policiclice, a acizilor naftenici și a pH-ului ridicat, specifice sterilului rămas după extragerea țițeiului greu din nisipurile bituminoase.

Brevetul EP1990404 B1 prezintă tulpina Trichoderma atroviride AGR2 depusă la Colecția Națională de Culturi de Microorganisme (CNCM) a Institutului Pasteur sub numărul 1-2738 și revendică utilizări ale acesteia ca stimulator radicular, al germinației și creșterii plantelor.

Tulpinile de Trichoderma la care activitatea de biostimulare a creșterii și dezvoltării plantelor este amplificată de prezența exo-semnalelor secretate de plante în rizosferă sunt foarte utile în sistemele de agricultură conservativă (CA) / cu resturi vegetale. Aceste sisteme CA conservă resursele de mediu și reduc inputurile în tehnologiilor agricole prin eliminarea / reducerea lucrărilor solului. In sistemele CA afânarea și structurarea solului necesară germinării și dezvoltării culturilor agricole este realizată printr-o intensificare a activității biotei solului, favorizată de menținerea resturilor vegetale la suprafața solului. Acoperirea permanentă a solului cu resturi vegetale este un principiu important al sistemelor de agricultură conservativă (CA). Resturile vegetale care acoperă solul limitează evaporarea apei și facilitează infiltrarea acesteia, reduc eroziune, ameliorează structura solului, cresc conținutul de materie organică și de carbon, și moderează temperatura solului în zonele calde (Fabrizzi et al. 2005, Soil Till. Res. 81: 57-69). In pofida numeroaselor avantaje, sunt și o serie de efecte negative asociate cu sistemele cu resturi vegetale. Resturile de plante favorizează dezvoltarea agenților fitopatogeni din sol (Bockus și Shroyer 1998, Ann. Rev. Phytopath. 36: 485-500), inclusiv a celor devastanți, cum sunt de exemplu cei care produc fuzarioza spicului de grâu (Leplat et al. 2013, Agron. Sust. Develop., 33: 97111).

Este cunoscută tulpina de Td85 T. pseudokoningii, depozitată la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) cu numărul de depozit DSM 23661, care este destinată sistemelor de agricultură conservativă. Tulpina, protejată prin brevetul RO127471 B1, prezintă concomitent antagonism față de agenții fitopatogeni din sol, capacitate ridicată de mineralizare a materialului vegetal și rezistență la compușii biofumiganți eliberați din biomasă de crucifere, și este destinată 2 în special sistemelor CA care utilizează proprietățile de biofumigare ale culturilor de Accrucifere. Nu a fost însă descrisă, pentru această tulpină, o amplificare a producerii de compuși, biostimulanți și/sau cu activitate antagonistă, sub acțiunea exo-semnalelor secretate de plantele cultivate / sistemul radicular al acestora.

Un exemplu de exo-semnale cu rol în formarea asociațiilor mutualiste sunt strigolactonele. Denumirea de strigolactone se referă la o serie de compuși carotenoidici sintetizați de rădăcinile plantelor, cu rol de exo- și endo-semnale, respectiv de semio-chimicale care mediază interacțiunile din rizosferă, și de (fito)hormoni, care controlează procesele fiziologice din plante (Cavar et al. Phytochemistry Reviews, 2015, 14, 691-711). în ultimii ani s-a demonstrat existența strigolactonelor canonice, care au trei cicluri condensate (ABC) legate printr-o grupă enol-eterică de un ciclu furanonic α,β-nesaturat (D), de obicei substituit cu unul sau doi radicali metil, și a celor non-canonice, care au un ciclu deschis BC (Kee et al. 2023, Plant and Cell Physiology, 64(9), 955-966).

Datorită complexității strigolactonelor naturale și dificultății obținerii lor în cantități suficiente aplicării practice, au fost sintetizați compuși analogi care includ un ciclu de furan-2-onă și o structură tipică de lactonă cu trei cicluri aromatice specifice strigolactonelor, sau mimici de strigolactone, care care au o serie din activitățile biologice specifice strigolactonelor, includ un ciclu de furan-2-onă, dar fără a aveas structura tipică cu cele trei cicluri aromatice (Zwanenburg et al. Planta, 2016, 243, 13111326). Analogii de strigolactone urmăresc logica moleculară a strigolactonelor canonice, iar mimicii de strigolactone au o structura chimică care pornește de la strigolactonele non-canonice.

A fost descrisă o singură tulpină de Trichoderma, T. asperellum Td36b, depozitată sub numărul P(F) 001434 la NCAIM Budapesta, care răspunde la unii compuși, pe care plantele îi secretă ca exo-semnale de rizosferă sau la analogi / mimici de sinteză ai acestora, inclusiv la analogul de stigolactone GR-27, prin amplificarea biosintezei unor metaboliți care biodisponibilizează nutrienți și/sau favorizează creșterea și dezvoltarea plantelor și/sau limitează dezvoltarea agenților fitopatogeni fungici (Brevet RO131177 B1).

Nu au fost încă descrise tulpini biostimulante de Trichoderma care să acționeze complementar cu analogii și mimicii de strigolactone în reducerea stresului (în special cel hidric) la plantele de tomate cultivate în câmp și în stimularea acumulării de compuși benefici în fructele de roșii, ca de exemplu licopen și acid gama-amino-butiric.

La plantele de tomate cultivate în câmp, irigarea deficitară este una din strategiile de reducere a costurilor de producție, mai ales în condiții de câmp (Valcârcel et al., 2020, Scientia Horticulturae, 261, 108972), dar care are dezvantajul de a avea un risc ridicat de reducere semnificativă economic a nivelor de producție. (Khapte et al. 2019, Scientia horticulturae, 248, 256-264). Aplicarea GR24, un analog de strigolactone, a facilitat recuperarea plantelor de tomate după stres hidric (Visentin et al. 2020, Plant, cell & environment, 43(7), 1613-1624). Tulpinile bidstimulante de Trichoderma de asemenea cresc toleranța la stresul hidric al tomatelor (Rawal et al. 2022, Frontiers in Plant Science, 13, 869090.) Utilizarea tulpinilor de Trichoderma și a mimicilor și/sau analogilor de strigolactone reprezintă o soluție de asigurare a nivelelor de producție de tomate rentabile economic în condiții de irigare deficitară.

Nu au fost protejate până în prezent tulpini de Trichoderma care să stimuleze acumularea de compuși bioactivi în fructele de tomate, deși sunt studii care demonstrează că aplicarea tulpinilor biositmulante de Trichoderma determină o creștere a acumulării de licopen și de acid gama-amino-butiric (Carillo et al. 2020, Plants, 9(6), 771). Nu au fost descrise tulpini de Trichoderma care să interacționeze complementar cu analogii și/sau mimicii de strigolactone în stimularea acumulării de compuși bioactivi, licopen și acid gama-amino-butiric.

Tulpina de T. pseudokoningii Tpk20, conform invenției, depozitată sub numărul DSM 34838 la Leibniz-lnstitut DSMZ - Colecția Germană de Microorganisme și de Culturi de Celule, Braunschweig, are un efect antagonist față de agenții fitopatogeni care se dezvoltă pe resturile vegetale, favorizează nutriția plantelor prin producerea de compuși care solubilizează fosfații și de siderofori, biosintetizează sisteme celulazice care includ și proteine non-catalitice de tip swolenine cu acțiune de desfacere a structurii fibrilare a celulozei si de colonizare a rădăcinii, creste eficienta de utilizare a apei la plantele de tomate crescute în câmp, activează metabolismul secundar din plantele de tomate tratate, favorizând acumularea de licopen și acid gama-aminobutiric, răspunde la mimicii de strigolactone SL-20, 2-(4-metil-5-oxo-2,5-dihidrofuran-2iloxi)-6-(4-metillpiperidin-1 -il)-benzo[de]izochinolin-1,3-dionă, și SL-21, 2-(4-metil-5-oxo2,5-dihidro-furan-2-iloxi)-6-(4-benzil-piperidin-1 -il)-benzo[de]izochinolin-1,3-dionă, prin amplificarea producerii de compuși care solubilizează fosforul, siderofori și sisteme celulazice care includ proteine non-catalitice de tip swolenine, acționează complementar cu mimici de strigolactone asupra plantelor de tomate crescute în câmp, în ceea ce privește creșterea eficienței de utilizare a apei și acumularea de licopen și acid gama-amino-butiric în fructe.

La tulpina de T. pseudokoningii Tpk20 descrisă în această invenție producerea de compuși care solubilizează fosfații este amplificată în medie cu 72,3% și respectiv, 82,8%, de prezența în mediul de cultivare a mimicilor de strigolactone, SL-20, 2-(4metil-5-oxo-2,5-dihidrofuran-2-iloxi)-6-(4-metillpiperidin-1-il)-benzo[de]izochi-nolin-1,3dionă și, respectiv, SL-21, 2-(4-metil-5-oxo-2,5-dihidro-furan-2-iloxi)-6-(4-benzilpiperidin-1-il)-benzo[de]izochinolin-1,3-dionă, în concentrație de 10^-7 M.

La tulpina de T. pseudokoningii Tpk20 descrisă în această invenție, producerea de siderofori este amplificată în mediu cu 45,3% și respectiv, 63,8%, de prezența în mediul de cultivare a mimicilor de strigolactone, SL-20, 2-(4-metil-5-oxo-2,5dihidrofuran-2-iloxi)-6-(4-metillpiperidin-1-il)-benzo[de]izochi-nolin-1,3-dionă și, respectiv, SL-21, 2-(4-metil-5-oxo-2,5-dihidro-furan-2-iloxi)-6-(4-benzil-piperidin-1-il)benzo[de]izochinolin-1,3-dionă, în concentrație de 10'⁷ M.

în cazul tulpinii de T, pseudokoningii Tpk20 descrisă în această invenție producerea de sisteme celulazcie care includ și proteine non-catalitice de tip swolenine cu acțiune de desfacere a structurii fibrilare a celulozei si de colonizare a rizosferei este J I amplificată în medie cu 83,5% și respectiv, 72,6%, în prezența în mediul de cultivare a mimicilor de strigolactone, SL-20, 2-(4-metil-5-oxo-2,5-dihidrofuran-2-iloxi)-6-(4metillpiperidin-1-il)-benzo[de]izochi-nolin-1,3-dionă și, respectiv, SL-21, 2-(4-metil-5oxo-2,5-dihidro-furan-2-iloxi)-6-(4-benzil-piperidin-1-il)-benzo[de]izochinolin-1,3-dionă, în concentrație de 10 ⁷ M.

în cazul tulpinii de T. pseudokoningii Tpk20 atunci când este aplicată foliar în doză de 10¹² clamidospori/ha, împreună cu mimici de strigolactone, SL-20, 2-(4-metil-5oxo-2,5-dihidrofuran-2-iloxi)-6-(4-metillpiperidin-1-il)-benzo[de]izochi-nolin-1,3-dionă și, respectiv, SL-21, 2-(4-metil-5-oxo-2,5-dihidro-furan-2-iloxi)-6-(4-benzil-piperidin-1-il)benzo[de]izochinolin-1,3-dionă, aplicați ca tratament la sol, determină a acumulare semnificativ crescută a acumulării de licopen și acid gama-amino-butiric în fructe, comparativ cu martorul netratate, sau variantele tratate doar cu una din componente, Tpk20 sau mimici de strigolactone.

Invenția prezintă următoarele avantaje:

X Crește eficiența de utilizare a apei în cazul tomatelor cultivate în câmp în condiții de irigare deficitară.

V Amplifica acumularea de compuți bioactivi în tomatele obținute din plante cultivare în câmp.

V Crește biodisponibilitatea nutrienților pentru plantele de cultură, în special fosfor și fier.

V Reduce riscul fitosanitar pentru plantele de cultură cultivate în sisteme agricole cu nivele ridicate de resturi vegetale.

V Acclerează degradarea biomasei vegetale lignocelulozice și facilitează colonizarea rizosferei plantelor datorită producerii de sisteme celulazice care includ si swolenine.

In continuare se prezintă exemple de realizare a invenției, care o ilustrează fără a o limita.

Exemplu 1. Tulpina T. pseudokoningii Tpk20, depozitată sub numărul DSM 34838 la Leibniz-lnstitut DSMZ - Colecția Germană de Microorganisme și de Culturi de Celule, Braunschweig, a fost izolată din litiera solului, prelevată din zona Breaza Valea Târsei, Prahova, Romania. Pentru izolare s-a utilizat mediul de cultura apa-agar, iar pentru purificare mediul cartof, glucoza, agar (CGA).

Raza coloniilor dezvoltate de tulpina T. pseudokoningii Tpk20, pe mediu CGA după 72 ore, la 30°C este de (12-) 48 (-64) mm; la 35°C este de (0-)16(-24) mm, iar la 37°C: 0 mm. Acest fapt implică o patogenitate redusă pentru om și alte animale la care mediul intern are o temperatură de 37°C. Coloniile formate pe mediu CGA la 25°C, după 40 ore în întuneric, nu prezintă nici un pigment galben care să difuzeze în mediul agarizat. Coloniile cultivate pentru 72 ore pe mediu CGA, la 30°C, în întuneric, formează până la 7 inele concentrice, cu o producție densă de conidii și fără miceliu aerian. Conidiile sunt înspre centru de culoare verde închisă, iar înspre margini sunt doar în curs de formare. Conidiile formate sunt verde închis, globuloase până la subglobuloase sau ovoidale, cu dimensiuni de 4,0-5,0 (-6,0) x 2,5 - 3,0 pm. Conidioforii au un aspect simetric care se termină în două sau mai multe fialide, cu ramificări primare apărute lângă apex, frecvent împerechate și proiectate la aproape 90 de grade față de axa principală. Clamidosporii se formează abundent după incubare o săptămână la 20°C în întuneric, sau prin iradiere cu lumină roșie (LED sau laser). Clamidosporii sunt terminali și uneori intercalați, pe hifele imersate, fiind subglobuloși până la ovoidali, netezi, verzi pal. Fialidele sunt tipic produse în vârfurile ramificațiilor primare, secundare și terțiare, rareori direct pe lungimea ramificațiilor, tipic în verticiliu de 2 până la 4 fialide.

Caracteristicile fiziologice, de utilizare a diferitelor substrate, sunt descrise în cele ce urmează. Monozaharidele determină o creștere mai bună decât dizaharidele, urmate de polizaharide. Glicerina este favorabilă pentru creșterea tulpinii Tpk20. Dintre monozaharide, riboza și fructoza s-au dovedit cele mai bune surse de carbon, observându-se o dezvoltare optimă a tulpinii pe mediile care conțin aceste surse de carbon. Urmează glucoza, manita, D-manoza, D-galactoza și arabinoza, care permit o dezvoltare moderată. Dintre dizaharide, cele mai bune rezultate a dat lactoza, urmată de maltoză și zaharoza (dezvoltare mai slabă). Dintre polizaharide, cele mai bune rezultate a dat celuloza, cu dezvoltare optimă, urmată de amidon, pe mediile respective înregistrându-se dezvoltare moderată. Sporularea a fost foarte bună în majoritatea variantelor (+++), bună în cazul zaharozei (++) și mai slabă în cazul glicerinei (+).

Peptona, aminoacizii L-asparagină, L-valină, L-serină, L-cisteină și L-izoleucină, NH4H2PO4 și NaNOz s-au dovedit cele mai bune surse de azot, determinând o dezvoltare optimă. Urmează în ordine descrescândă azotații (NH4NO3, NaNOs), vitamina B12 și aminoacizii L-alanină, L-lizină, L-arginină, L-triptofan care au determinat o dezvoltare moderată. Rezultate mai slabe au avut ureea, NH4CI, KNO3, KNO2. Sporularea a fost foarte bună (+++) în majoritatea variantelor, exceptând L-lizina, Ltriptofanul, L-alanina, L-arginina și azotații, la care sporularea a fost doar bună (++).

Temperaturile de creștere sunt: temperatura optimă: 22-25°C; temperatura minimă: 2°C; temperatură maximă: 35°C. Temperaturile între 10 și 18°C determină o creștere slabă a tulpinii Trichoderma pseudokoningii Tpk20, fără sporulare la 48 ore și cu sporulare slabă la 144 ore (+). Reacția substratului de cultură: pH optim: 4.0-5.5; dezvoltare slabă a ciupercii la valori de pH de la 9,0 Ia13.0.

Identificarea a fost realizată printr-o abordare polifazică. S-a realizat o primă identificare prin folosirea sistemului Biolog Microbial ID (Biolog, Hayward, CA, USA). Acaeastă indetificare pe criterii morfologice a fost confirmată de analiza moleculară a ITS1 (internai transcribed spacers 1) a clusterului pentru gena rRNA (marker universal fungal BarCode, http://www.isth.info). S-au folosit primerii specifici ITS1 SR6R f și LR1 r (conform protocol BarCode http://www.isth. info/methods). Compararea secvențelor s-a realizat cu programul TrichoBlast (http://www.isth.info/tools/blast/index.php).

Tulpina Tpk20 este puternic antagonistă față de ciupercile fitopatogene: Rhizoctonia solanii, Fusarium graminearum, F. culmorum, Pythium ultimum, Botrytis cinerea, Alternaria alternata, Sclerotinia sclerotiorum. Gradul de antagonism al tulpinii de T. pseudokoningii Tpk20 față de ciupercile fitopatogene s-a determinat in vitro prin metoda culturilor duble (Coskuntuna și Ozer, 2008, Crop Protection, 27, 330-336). Tulpina de T. pseudokoningii Tpk20 și cele ale agenților fitopatogeni de testat (Rhizoctonia solanii ATCC 66873, Fusarium graminearum DSM4527, F. culmorum ATCC 36017, Pythium ultimum, DSM 62987, Botrytis cinerea DSM 5144, Alternaria alternata DSM 62010, Sclerotinia sclerotiorum DSM 1946) au fost cultivate separat pe mediu cartof - glucoza - agar (CGA), timp de 7 zile, la 25°C și la întuneric. Din gazonul format după 7 zile au fost prelevate cu o preducea discuri de 0,5 mm care s-au depus la 1 cm de pereții unei plăci Petri cu mediu cu diametrul de 9 cm, în părți opuse, fiecare disc fiind separat de aprox. 6 cm. Interacția dintre colonii a fost determinată după 5 zile de incubare la 25°C și la întuneric, folosind scala propusă de Bell și colab. (Bell et al., 1982, Phytopathology, 72, 379-382), cu 5 note: 1- tulpina de Trichoderma crește complet peste fitopatogen, acoperind întreaga suprafață; 2 - tulpina de Trichoderma crește pe mai mult de două treimi din suprafața mediului de cultură; 3 - tulpina de Trichoderma și patogenul cresc fiecare pe aproximativ jumătate din suprafața mediului; 4 - fitopatogenul crește pe mai mult de două treimi din suprafața mediului de cultură; 5 - fitopatogenul crește complet peste Trichoderma, acoperind întreaga suprafață Experimentele s-au realizat în triplicat și s-au repetat de trei ori.

Din analiza rezultatelor experimentale obținute in vitro (tabelul 1), se constată că tulpina de T psedukoningii Tpk20 prezintă antagonism marcat față de Rhizoctonia solanii ATCC 66873, Fusarium graminearum DSM4527, F. culmorum ATCC 36017, Pythium ultimum, DSM 62987, Botrytis cinerea DSM 5144, Alternaria alternata DSM 62010, Sclerotinia sclerotiorum DSM 1946.

Tab. 1. Antagonismul in vitro al tulpinii de Trichoderma harzianum Td50b față de agenți fitopatogeni.

Agent fitopatogen	Activitate antagonistă	Comportare
Rhizoctonia solanii ATCC 66873	1,33	Puternic antagonist (PA)
Fusarium graminearum DSM4527	1,33	Puternic antagonist (PA)
F. culmorum ATCC 36017	1,88	Puternic antagonist (PA)
Pythium ultimum, DSM 62987	1,66	Puternic antagonist (PA)
Botrytis cinerea DSM 5144	1,33 Π	Puternic antagonist (PA)
Alternaria alternata DSM 62010	1,33	Puternic antagonist (PA)
Sclerotinia sclerotiorum DSM 1946	1,33	Puternic antagonist (PA)

Printr-o altă serie de experimente s-a urmărit biotestarea efectului stimulator al tulpinii Tpk20 asupra creșterii plantulelor test de tomate. Semințele de tomate au fost dezinfectate în două etape. Prima dezinfecție a fost realizată în etanol 70%, timp de 30 de secunde cu agitare la 60 rpm. După înlăturarea etanolului, semințele au fost clătite de trei ori cu apă distilată sterilă. Cea de-a doua dezinfecție s-a făcut cu soluție de hipoclorit de sodiu 4%, timp de 15 minute. Ulterior au fost realizate clătiri cu apă distilată, din 25 în 25 de minute, timp de două ore. Semințele au fost inoculate prin imersie în 3 ml suspensie de propagule fungice, în concentrație de 10⁶ ufc/ml în tampon fosfat cu 2 % carboxi-metil-celuloză, și apoi au fost depuse in pungi sterile de creștere Cyg (Mega International, Newport, MN, SUA). Pe toată durata experimentului pungile au fost umectate zilnic cu o soluție nutritivă Hoagland 0,25%. Creșterea rădăcinuțelor plantulelor de tomate a fost analizată la 3 săptămâni, față de un martor care nu a fost inoculat. Rezultatele au evidențiat că tulpina Tpk20 determină creșteri distinct semnificative ale rădăcinuțelor plantulelor test de tomate, comparativ cu martorul neinoculat, de peste 162,3+14,2%.

Pentru detectarea producerii de compuși care solubilizează fosforul a fost folosit un mediu care conține la 1 litru: glucoză 10 g; (NH4)2SO4 0,5 g; NaCI 0,2 g; MgSO4.7H2O, 0,1 g; KCI 0,2 g; extract de drojdie 0,5 g; MnSO4.H2O 0,002 g și FeSO4.7H2O 0,002 g. (Reactivi proveniți de la Merck). In acest mediu au fost adăugate și 5 g de hidroxiapatita, Caio(P04)e(OH)2 (Sigma). Mediul s-a sterilizat prin autoclavare (121°C, timp de 20 min), a fost răcit și distribuit în plăci Petri 0 9 cm. Plăcile au fost inoculate cu tulpina Tpk20 și incubate timp de 5 zile la 25°C. După 5 zile s-a constatat apariția unor zone de liză în jurul coloniilor de T. pseudokoningii Tpk20, ceea ce demonstrează producerea de compuși care solubilizează fosforul.

S-a procedat la detectarea capacității tulpinii Tpk20 de a produce siderofori. Pentru detectarea producerii de siferofori s-a folosit ca mediu detector un mediu agarizat cu indicatori de complexare (CAS blue agar) preparat din trei soluții: Soluția 1, de 0,06 g Chrome azurol S (CAS) în 50 ml de apă dublu distilată în instalație de cuarț; Soluția 2, 0,027 g of FeCh . 6H2O în 100 ml de HCI 10 mM HCI; Soluția 3, 0,073 g bromură de hexadeciltrimetilamoniu (HDTMA) în 40 ml de apă dublu distilată. S-a amestecat soluția 1 cu 10 ml de soluție 2 și apoi a fost adăugată soluția 3. S-a sterilizat prin autoclavare la 121°C timp de 15 min, obținându-se o soluție de complecși de fier de culoare albastră. 32,24 g acid N-2-etansulfonic-N-2-hidroxietil-piperazina (PIPES) au fost dizolvați în 850 ml apă dublu distilată a cărui pH a fost adus la o valoare mai mare de 6. S-a amestecat și pH-ul a fost adus la valoarea 6,8 prin adăugare de soluție NaOH 0,1 M. Au fost adăugate și 15 g agar. S-a autoclavat și s-a răcit la 50°C. Cei 100 ml de soluție de complecși de fier, aduși la aceeași temperatură, au fost adăugați, aseptic și cu încetul, prin scurgere pe peretele vasului de sticlă și sub agitare, peste mediul cu PIPES agarizat și sterilizat. Reactivii folosiți pentru prepararea mediului detector CAS blue agar au provenit de la Sigma-AIdrich (St. Louis, MO, SUA).

In plăci Petri 0 9 cm a fost distribuit mediu extract de malț-agar (MEA). Jumătate din mediul MEA a fost decupată și înlăturată aseptic. Spațiul astfel eliberat a fost înlocuit cu mediu agarizat detector preparat ca mai sus (CAS blue agar). Jumătatea cu mediu MEA a fost inoculată cu tulpina Tpk20. După incubare timp de 6 zile la 25°C s-a constatat modificarea culorii mediului din albastru în portocaliu, ceea ce reprezintă o dovadă a producerii de siderofori.

Tulpina Tpk20 a fost cultivată pe mediu lichid pentru a se stabili capacitatea ei de a produce acid harzianic, siderofor care stimulează creșterea și dezvoltarea plantelor și are de asemenea și un efect anti-fungic (Vinale et al. 2009, J. Nat. Prod. 72, 20322035). A fost preparat un decoct de cartofi, prin fierberea a 200 grame de cartofi, spălați bine de resturile de pământ, dar necojiți, și tăiați în cuburi cu latura de aprox. 1 cm, în aprox. un litru de apă distilată, pentru 30 minute. S-a filtrat decoctul prin pânză de tifon dublă și au fost adăugate 20 grame de glucoză (Sigma-AIdrich). Mediul a fost adus la 1000 ml cu apă distilată, a fost sterilizat prin autoclavare timp de 20 min la 121°C și s-a distribuit în flacoane conice de 5 litri. Mediul lichid cartof-glucoză a fost inoculat cu 50 ml conținând 10⁸ ufc/ml propagule din tulpina Tpk20. Cultura a fost menținută în condiții staționare timp de 21 zile la 25°C. După 21 zile mediul de cultură s-a filtrat prin hârtie de filtru (Whatman No. 4, Brentford, UK).

Mediul de cultură filtrat a fost acidifiat la pH 4 cu o soluție 5 N HCI, și extras repetat cu acetat de etil (Merck, Darmstadt, Germania). Fracțiile organice au fost evaporate la vacuum la 35°C și uscate pe sulfat de sodiu anhidru (Sigma Aldrich). Reziduul roșu a fost recuperat în cloroform (Merck, Darmstadt) și extras de trei ori cu o soluție 2 N NaOH. Din extractul alcalin a fost precipitată o fracție acidă care conținea acid harzianic, prin tratare cu HCI 2 N. In fracția acidă a fost determinat conținutul de acid harzianic folosind metoda descrisă de Vinale et al. 2014, Molecules, 19, 97609772. S-a detectat producerea a 118 mg acid harzianic la 1 litru de mediu lichid cartofglucoză, incubat timp de 21 zile. Această cantitate este la un nivel apropiat de cel determinat în cazul tulpinii Trichoderma harzianum M10, tulpină la care a fost pus în evidență pentru prima oară producerea de acid harzianic (Vinale et al. 2009, J. Nat. Prod. 72, 2032-2035)

Pentru evidențierea capacității de degradare a materialului vegetal s-a realizat un experiment prin care s-a urmărit consumul de oxigen și eliberarea diferiților compuși din material vegetal tratat cu tulpina de T. pseudokoningii Tpk20, comparativ cu tulpina T. harzianum Td50b, care are o capacitate ridicată de degradare a materialului vegetal (cerere de brevet EP 2735607 A1). Materialul vegetal (tulpini de măzăriche părăasă uscate și tocate) a fost măcinat și trecut pe sita de 0,250 mm. S-au ambalat câte 10 g de pulbere care s-au sterilizat prin iradiere gamma (la IRASM, IFIN-HH, București, România). Din pulberea sterilizată s-au luat aseptic câte 0,1 g de pulbere de material vegetal, care s-au adus într-un Erlenmayer de 50 ml, steril. Peste pulberea fin măcinată s-au adăugat aseptic 19 ml tampon fosfat steril. S-a omogenizat prin agitare și s-a inoculat apoi cu 1 ml suspensie microbiană, normalizată la 10⁸ ufc/ml propagule. S-a menținut la agitator timp de 24 ore, la temperatura de 28°C, după care s-a trecut aseptic într-un vas de respirație Strathox (Strathkelvin Instruments Limited, Glasgow, Marea Britanie). Au fost efectuate determinări producere de bioxid de carbon timp de 12 ore. După efectuarea determinărilor de respirație s-au separat prin filtrare supernatantele, în care s-a determinat Carbonul Organic Total (TOC) cu un aparat Formacs HT (Skalar Analytical B.V., Breda Olanda), glucidele reducătoare (cu reactiv DNS) și fosforul solubil total (cu molibdat de amoniu și reactiv clorostanic). S-a lucrat comparativ cu un martor ne-inoculat.

Rezultatele sunt prezentate în tabelul 2.. Aceste rezultate demonstrează o activitate de mineralizare a materialului vegetal foarte ridicată pentru tulpina Tpk20.

Tab. 2. Activitatea de degradare a materialului vegetal de către tulpinile de microorganisme testate*.

Tulpina	Respirație (mg/l O2 consumați, medie orară)	Conținut de carbon organic total în supernatant (mcg/l)	Glucide solubile (mcg/l)	Fosfor solubil (mcg/l)
Martor neinoculat	0,03±0,005c	0,38±0,03c	1,78±0,08c	0,05±0,01c
T. pseudokoningii Tok20	2,32±0,16a	7,43±1,04a	28,42±4,63a	28,12±5,23a
T. harzianum Td50b	1,72±0,16b	4,72±1,23b	16,72±0,74b	15,27±2,33b

Exemplu 2. A fost testată influența mimicilor de stigolactone SL-20, 2-(4-metil-5oxo-2,5-dihidrofuran-2-iloxi)-6-(4-metillpipendin-1-il)-benzo[de]izochinolin-1,3-dionă și SL-21, 2-(4-metil-5-oxo-2,5-dihidro-furan-2-iloxi)-6-(4-benzil-piperidin-1-il)-benzo[de]izo chinolin-1,3-dionă, în condiții de deficit de nutrienți sau sub acțiunea factorilor de stres biotici și abiotici și/sau cu rol de exo-semnale pentru a stimula formarea asociațiilor mutualiste asupra caracteristicilor tulpinii Tpk20 referitoare la producerea compușilor care biodisponibilizează nutrienți pentru plante, respectiv compuși care solubilizează fosforul anorganic și sideroforii.

Pentru determinarea influenței prezenței unor compuși cu rol de exo-semnale de rizosferă asupra capacității de solubilizare a fosforului s-a utilizat un mediu care conține: glucoză 10 g; (NH₄)2SO4 0,5 g; NaCI 0,2 g; MgSO4.7H₂O, 0,1 g; KCI 0,2 g; extract de drojdie 0,5 g; MnSCU.hLO 0,002 g și FeSCUJhhO 0,002 g. (Reactivi proveniți de la Merck). Mediu a fost suplimentat cu 5 g de hidroxiapatita, Caio(P04)6(OH)2 (Merck), omogenizat și distribuit câte 100 ml în erlenmeyere de 500 ml. Erelenmeyerele astupate cu dop de vată au fost sterilizat prin autoclavare (121°C, timp de 20 min) și răcite. In probele în care s-a testat influența compușilor cu rol de semnale de rizosferă s-au introdus mimici de strigolactone, SL-20, 2-(4-metil-5-oxo-2,5-dihidrofuran-2-iloxi)-6-(4metillpiperidin-1-il)-benzo[de]izochi-nolin-1,3-dionă și, respectiv, SL-21, 2-(4-metil-5oxo-2,5-dihidro-furan-2-iloxi)-6-(4-benzil-piperidin-1-il)-benzo[de]izochinolin-1,3-dionă, în concentrație de 10^-7 M. Erlenmeyerele au fost inoculate cu tulpina Tpk20 și incubate timp de 5 zile la temperatura de 25°C. După terminarea perioadei de incubare s-au prelevat probe din mediile de cultură, s-au clarificat prin ultrafiltrare, iar în supernatant a fost determinat nivelul fosforului solubil prin utilizarea metodei cu reactiv fosfomolibdenic (Murphy și Riley, 1962, Anal. Chim. Acta 27, 31-36.).

Producerea de siderofori este amplificată în mediu cu 45,3% și respectiv, 63,8%, de prezența în mediul de cultivare a mimicilor de strigolactone, SL-20, 2-(4-metil-5-oxo2,5-dihidrofuran-2-iloxi)-6-(4-metillpiperidin-1-il)-benzo[de]izochi-nolin-1,3-dionă și, respectiv, SL-21, 2-(4-metil-5-oxo-2,5-dihidro-furan-2-iloxi)-6-(4-benzil-piperidin-1-il)benzo[de]izochinolin-1,3-dionă, în concentrație de 10'⁷ M.

Tulpina Tpk20 a fost cultivată pe mediu lichid cartof-glucoză preparat ca în Exemplul 1, în prezența și în absența mimicilor de strigolactone, SL-20, 2-(4-metil-5oxo-2,5-dihidrofuran-2-iloxi)-6-(4-metillpiperidin-1-il)-benzo[de]izochi-nolin-1,3-dionă și, respectiv, SL-21, 2-(4-metil-5-oxo-2,5-dihidro-furan-2-iloxi)-6-(4-benzil-piperidin-1-il)benzo[de]izochinolin-1,3-dionă, în concentrație de 10^-7 M. Producerea de siderofori de către tulpina Tpk20, în prezență și în absența GR24, în mediu cartof-glucoză incubat timp de 6 zile la temperatura de 25°C a fost determinată cu reactiv CAS (Schwyn și Neilands, 1987, Anal. Biochem., 160, 47-56).

Producerea de compuși care solubilizează fosforul de către tulpina TpK20 de T. pseudokoningii este amplificată în medie cu 72,3% și respectiv, 82,8%, de prezența în mediul de cultivare a mimicilor de strigolactone, SL-20, 2-(4-metil-5-oxo-2,5d i h id rof uran-2-iloxi)-6-(4-meti I Ipiperidin -1 -il)-benzo[de]izochi-nolin-1,3-dionă și, respectiv, SL-21, 2-(4-metil-5-oxo-2,5-dihidro-furan-2-iloxi)-6-(4-benzil-piperidin-1-il)benzo[de]izochinolin-1,3-dionă, în concentrație de 10^-7 M.

Exemplu 3. S-a determinat activitatea enzimatică a tulpinii T. pseudokoningii Tpk20, obținute prin creștere pe mediu lichid bazai suplimentat cu celuloză 2%. 1 litru de mediu bazai conține: 5 g tartrat de amoniu, 1 g KH2PO4, 0,5 g MgSO4-7H2O, 0,1 g extract de drojdie, 0,001 g CaCl2.2H2O - 0,1 ml dintr-o soluție stoc 10 mg/ml. la care sa adăugat 2% celuloză bacteriană cu masa moleculară medie de 500 kDa. Pe acest mediu, sterilizat prin autoclavare 20 min la 121 °C, a fost cultivată tulpina T. pseudokoningii Tpk20 timp de 21 zile. S-a recuperat supernatantul după centrifugare la 5,000 x g la 4°C pentru 20 min. Proteina totală din extract a fost determinată după metoda Bradford, folosind albumina serică bovină ca standard. Activitatea enzimatică a fost determinată folosind hârtia de filtru Whatman nr.1 ca substrat. Hârtia de filtru a fost tăiată în fâșii de 1 x 6 cm, din care s-au luat 50 mg care s-au suspendat, într-o eprubetă de 18 mm / 10 ml, într-un ml tampon citrat - sodiu 0,05 M, pH 4,8. Peste amestecul hârtie de filtru - tampon s-au adăugat 0,5 ml de extract. S-a vortexat pentru o suspendare eficientă a hârtiei de filtru și s-a incubat timp de 1 h la 45°C. După trecerea perioadei de incubare reacția s-a stopat cu 3 ml reactiv dinitrosalicilic DNS (care conține 283,2 ml apă deionizată, 2,12 g de acid 3,5 dinitrosalicilic, 3,96 g NaOH, 61,2 g de tartrat dublu de sodiu și potasiu, 1,52 ml fenol lichid 89% și 1,66 g bisulfit de sodiu). Eprubetă a fost încălzită pe baie de apă la fierbere timp de 5 min, pentru dezvoltarea reacției de culoare, după care s-a citit densitatea optică la 545 nm. Activitatea enzimatică s-a exprimat în unități FPU (Ghose, 1987, Pure Appl. Chem, 59, 257-268), folosind o curbă etalon de glucoză. 1 unitate FPU este 0,37 / activitatea enzimatică care eliberează echivalent a 2 mg glucoză * unități enzimatice (pmoli grupări reducătoare care reacționează cu DNS eliberate per min). Tulpina Tpk20 a produs în condițiile experimentale date 0,37+0,07 FPU per mg proteină, ceea ce înseamnă că este o tulpină înalt producătoare de sisteme celulazice (Kovacs et al., 2008, Enz. Microbiol., TechnoL, 43, 48-55).

A fost determinată și influența asupra tensiunii superficiale a apei, folosind un tensiometru optic OCA 50EC (Data Physics, Filderstadt, Germania). A fost constatată o modificare semnificativă a tensiunii superficiale a apei, ceea ce demonstrează existența în sistemul celulazic secretat de către tulpina TPk20 a proteinelor non-catalitice de tip swolenine, care sunt cunoscute pentru activitatea lor de modificare a tensiunii superficiale a apei. (Frischmann et al. 2013, Journal of Biological Chemistry, 288, 42784287). Aceste proteine non-catalitice amfifile de tip swolenine, au acțiune de desfacere a structurii fibrilare a celulozei (Zhou et al. 2011, World Journal of Microbiology and Biotechnology, 27, 1905-1910) și de facilitare a colonizării țesuturilor vegetale (Brotman et al. 2008, Plant physiology, 147, 779-789).

A fost determinată influența introducerii în mediul de cultură minimal suplimentat cu celuloză bacteriană a mimicilor de strigolactone SL-20 și SL-21. Producerea de sisteme enzimatice care includ proteine non-catalitice de tip swolenine cu acțiune de desfacere a structurii fibrilare a celulozei este amplificată în medie cu 83,5% și respectiv, 72,6%, în prezența în mediul de cultivare a mimicilor de strigolactone, SL-20, 2-(4-metil-5-oxo-2,5-dihidrofuran-2-iloxi)-6-(4-metillpiperidin-1-il)-benzo[de]izochi-nolin1,3-dionă și, respectiv, SL-21, 2-(4-metil-5-oxo-2,5-dihidro-furan-2-iloxi)-6-(4-benzilpiperidin-1-il)-benzo[de]izochinolin-1,3-dionă, în concentrație de 10‘⁷ M.

Exemplu 4. S-a realizat un experiment de testare a influenței tratamentului cu tulpina TpK20, aplicată singură sau împreună cu mimicii de strigolactone SL-20 și SL21 asupra producției de tomate cultivate în câmp în condiții de deficit de irigare, ca și asupra acumulării de compuși bioactivi, licopen și acid gama-amino-butiric în fructe.

Experimentul s-a realizat în anii agricoli 2022 și 2023, pe loturi experimentale amplasate la Valea Crucii (44°27’45” latitudine nordică și 26°31’35” longitudine estică). Solul din loturile experimentale a fost un cernoziom cambie, cu caracteristicile prezentate în tabelul 3

Tab. 3. Caracteristicile cernoziomului cambie din câmpul experimental de la Valea Crucii.

Caracteristică	UM	Ao	Aph
Adâncime orizont	cm	0-18	18-30
Humus (C x 1,72)	%	3,0	3, 0
Total N	%	0,179	0,169
C : N	-	11,4	11,8
CaCOs	%	0,0	0,0
pH (în H2O)	pH unit	6,3	6,5
Capacitatea totală de schimb cationi, CEC	meq/1 OOg	21,1	21,3
Fosfor total (AL)	ppm	28	14
Potasiu mobil	ppm	98	87

In zona experimentală de la Valea Crucii temperatura medie multianuală atmosferică este de 10,25°C, iar precipitații anuale însumează 571 mm. Din punct de vedere al temperaturilor sezonul 2022 a prezentat variații, cu temperaturi semnificativ mai ridicate decât normal, cu deficit de precipitații mai mare de 120 mm pe perioada de vegetație a tomatelor și cu o secetă atmosferică pronunțată. Sezonul 2023 a fost și el secetos, dar cu un deficit mai redus de precipitații - 80 mm pe perioada de vegetație în câmp a tomatelor. Solul a fost fertilizat cu 200 kg/ha echivalent îngrășământ complex NPK 15:15; 15 (Azomureș, Târgu-Mureș, România) înainte de însămânțarea culturii de acoperire, măzăriche păroasă. Au fost aplicate tehnologii de lucru conservative.

Cultura de roșii s-a înființat prin transplantarea răsadurilor (cv. Benfica) în muici format din măzăriche păroasă, conform tehnologiei adaptate petnru condițiile Europei (Campiglia et al. 2010, European Journal of Agronomy, 33, 94-102). Răsadurile folosite la înființarea culturii au fost produse în seră caldă după tehnologia specifică. S-au realizat următoarele variante experimentale:

> V1 - martor netratat, sol acoperit cu muici > V2 - sol acoperit cu muici, tratament SL-20 2-(4-metil-5-oxo-2,5dihidrofuran-2-iloxi)-6-(4-metillpiperidin-1 -il)-benzo[de]izochi-nolin-1,3dionă, doză echivalentă 1,25 g/ha > V3 - sol acoperit, tratament sol SL-21, 2-(4-metil-5-oxo-2,5-dihidro-furan-2iloxi)-6-(4-benzil-piperidi n-1 -il)-benzo[de]izochinolin-1,3-dionă, doză echivalentă 1,25 g/ha > V4 - sol acoperit cu muici, tratament foliar T. pseudokoningii Tpk20 aplicată foliar în doză de 10¹² spori/ha, > V5 - sol acoperit cu muici, tratament SL-20 2-(4-metil-5-oxo-2,5dihidrofuran-2-iloxi)-6-(4-metillpiperidin-1-il)-benzo[de]izochi-nolin-1,3dionă, doză echivalentă 1,25 g/ha, tratament foliar T. pseudokoningii Tpk20 aplicată foliar în doză de 10¹² spori/ha, > V6 - sol acoperit, tratament sol SL-21, 2-(4-metil-5-oxo-2,5-dihidro-furan-2iloxi)-6-(4-benzil-pi peridi n-1 -il)-benzo[de]izochinolin-1,3-dionă, doză echivalentă 1,25 g/ha, tratament foliar T. pseudokoningii Tpk20 aplicată foliar în doză de 10¹² spori/ha, > V7 - martor netratat, sol neacoperit cu muici

Experimentul s-a realizat în condiții de irigare cu deficit. Față de optimul estimat, irigarea prin sistemul de irigare cu picătura a fost cu 25% mai mic. Fiecare variantă a avut 3 repetiții. Micii de stigolactone s-au aplicat la sol prin srtopire, cu o soluție care conținea lignosulfonat de sodiu 0,5% ca adjuvant. Tratementele folaire s-au aplicat cu suspensii de TpK20 obținute prin cultivare pe mediu cu mălai, care simulează producerea de clamidospori (Li et al, 2026. Journal of Zhejiang University-Science B, 17, 619-627). Aplicarea soluțiilor s-a realizat cu ajutorul unei pompe de spate SG20 (Stihl AG, Waiblingen, Germania), prin stropire de la 40 cm, cu o presiune de stropire stabilită la 275 kPa, folosind o duză cu jet plat și derivă limitată (TeeJett® flat-fan TT11002 model, Spraying Systems Co., Wheaton, IL, SUA).

S-au recoltat tomatele și s-a determinat producția. în frucntele de toamte a fost determinat licopenul (Sadler et al. 1990. Journal of Food Science, 55, 1460-1461) și acidul gama-aminobutiric (Henderson et al. 2000. Amino acid analysis using Zorbax Eclipse-AAA columns and the Agilent, 1100, 1-10). Rezultatele obținute sunt prezentate în tabelul 4

Tab. 4. Influența tratamentelor cu mimici de strogolactone și cu suspensie din tulpina TPk20 asupra nivelului producțiilor în condiții de irigare de deficit și asupra acumulării de licopen și acid gama-amino-butiric.

Varianta	2022	2023
Producția (ech. t/ha)	Acid gama aminobutiric (q/kq)	Licopen (mg/kg)	Producția (ech. Kg/ha)	Acid gama aminobutiric (g/kg)	Licopen (mg/kg)
V1	57,22b	3,11b	52,3c	64,45b	3,37b	49,2c
V2	63,2ab	3,66b	58,4b	70,6ab	3,58b	55,8b
V3	60,6ab	3,25b	56,3b	72,8ab	3,43b	54,9b
V4	61,8ab	4,06ab	55,2b	69,9ab	3,97ab	53,7b
V5	74,5a	4,48a	64,2a	82,2a	4,34a	62,3a
V6	76.6a	4,56a	65,3a	83,4a	4,42a	64,6a
V7	42,3c	3,77b	51,3c	43,5c	3,42b	48,7c

Datele prezentate mai sus demonstrează făptui că tulpină de Trichoderma pseudokoningii Tpk20, atunci când este aplicată foliar în doză de 10¹² clamidosporî/ha, împreună cu mimici de strigolactone, SL-20, 2-(4-metil-5-oxo-2,5-dihidrofuran-2-iloxi)-6(4-metillpiperidin-1 -il)-benzo[de]izochi-nolin-1,3-dionă și, respectiv, SL-21, 2-(4-metil-5oxo-2,5-dihidro-furan-2-iloxi)-6-(4-benzil-piperidin-1-il)-benzo[de]izochinolin-1,3-dionă, aplicați ca tratament la sol, în doză echivalentă de 1,25 g/ha, determină a acumulare semnificativ crescută a acumulării de licopen și acid gama-amino-butiric în fructe, comparativ cu martorul netratate, sau variantele tratate doar cu una din componente, Tpk20 sau mimici de strigolactone.

Claims (5)

Revendicări

1. Tulpină de Trichoderma pseudokoningii Tpk20, conform invenției, depozitată sub numărul DSM 34838 la Leibniz-lnstitut DSMZ - Colecția Germană de Microorganisme și de Culturi de Celule, Braunschweig, caracterizată prin aceea că are un efect antagonist față de agenții fitopatogeni care se dezvoltă pe resturile vegetale, favorizează nutriția plantelor prin producerea de fitaze care mineralizează fosforului organic și de siderofori, biosintetizează sisteme celulazice care includ și proteine non-catalitice de tip swolenine cu acțiune de desfacere a structurii fibrilare a celulozei și de colonizare a rădăcinii, crește eficiența de utilizare a apei la plantele de tomate crescute în câmp, activează metabolismul secundar din plantele de tomate tratate, favorizând acumularea de licopen și acid gama-amino-butiric, răspunde la mimicii de strigolactone SL-20, 2-(4-metil-5-oxo-2,5-dihidrofuran-2-iloxi)-6-(4metillpiperidin-1-il)-benzo[de]izochinolin-1,3-dionă și SL-21, 2-(4-metil-5-oxo-2,5di h id ro-fu ran-2-i loxi)-6-(4-benzil-piperidi n-1 -il)-benzo[de]izochinolin-1,3-dionă, prin amplificarea producerii de compuși care solubilizează fosforul, siderofori și proteine non-catalitice de tip swolenine, acționează complementar cu mimici de strigolactone asupra plantelor de tomate crescute în câmp, în ceea ce privește creșterea eficienței de utilizare a apei și acumularea de licopen și acid gama-amino-butiric în fructe.

2. Tulpină de Trichoderma pseudokoningii Tpk20 conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că producerea de compuși care solubilizează fosforul este amplificată în medie cu 72,3% și respectiv, 82,8%, de prezența în mediul de cultivare a mimicilor de strigolactone, SL-20, 2-(4-metil-5-oxo-2,5-dihidrofuran-2-iloxi)-6-(4metillpiperidin-1-il)-benzo[de]izochi-nolin-1,3-dionă și, respectiv, SL-21, 2-(4-metil-5oxo-2,5-dihidro-furan-2-iloxi)-6-(4-benzil-piperidin-1-il)-benzo[de]izochinolin-1,3dionă, în concentrație de 10^-7 M.

3. Tulpină de Trichoderma pseudokoningii Tpk20 conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că producerea de siderofori este amplificată în mediu cu 45,3% și respectiv, 63,8%, de prezența în mediul de cultivare a mimicilor de strigolactone, SL-20, 2-(4-metil-5-oxo-2,5-dihidrofuran-2-iloxi)-6-(4-metillpiperidin-1 il)-benzo[de]izochi-nolin-1,3-dionă și, respectiv, SL-21, 2-(4-metil-5-oxo-2,5-dihidrofuran-2-iloxi)-6-(4-benzil-piperidin-1-il)-benzo[de]izochinolin-1,3-dionă, în concentrație de 10-⁷ M.

4. Tulpină de Trichoderma pseudokoningii Tpk20 conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că producerea de sisteme celulazice care includ și proteine non-catalitice de tip swolenine cu acțiune de desfacere a structurii fibrilare a celulozei și de colonizare a rădăcinii este amplificată în medie cu 83,5% și respectiv, 72,6%, în prezența în mediul de cultivare a mimicilor de strigolactone, SL-20, 2-(4metil-5-oxo-2,5-dihidrofuran-2-iloxi)-6-(4-metillpiperidin-1-il)-benzo[de]izochi-nolin1,3-dionă și, respectiv, SL-21, 2-(4-metil-5-oxo-2,5-dihidro-furan-2-iloxi)-6-(4-benzilpiperidin-1-il)-benzo[de]izochinolin-1,3-dionă, în concentrație de 10'⁷ M.

5. Tulpină de Trichoderma pseudokoningii Tpk20 conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că atunci când este aplicată foliar în doză de 10¹² spori/ha, împreună cu mimici de strigolactone, SL-20, 2-(4-metil-5-oxo-2,5-dihidrofuran-2-iloxi)6-(4-metillpiperidin-1-il)-benzo[de]izochi-nolin-1,3-dionă și, respectiv, SL-21, 2-(4metil-5-oxo-2,5-dihidro-furan-2-iloxi)-6-(4-benzil-piperidin-1-il)-benzo[de]izochinolin1,3-dionă, aplicați ca tratament la sol, în doză echivalentă de 1,25 g/ha, determină a acumulare semnificativ crescută a acumulării de licopen și acid gama-amino-butiric în fructe, comparativ cu martorul netratate, sau variantele tratate doar cu una din componente, Tpk20 sau mimici de strigolactone.