RS104404A - Kontrolne sekvence humanog korin gena - Google Patents

Kontrolne sekvence humanog korin gena

Info

Publication number
RS104404A
RS104404A YU104404A YUP104404A RS104404A RS 104404 A RS104404 A RS 104404A YU 104404 A YU104404 A YU 104404A YU P104404 A YUP104404 A YU P104404A RS 104404 A RS104404 A RS 104404A
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
corin
polynucleotide
control region
expression
gene
Prior art date
Application number
YU104404A
Other languages
English (en)
Inventor
Junliang Pan
Qingyu Wu
Original Assignee
Schering Aktiengesellschaft
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Schering Aktiengesellschaft filed Critical Schering Aktiengesellschaft
Publication of RS104404A publication Critical patent/RS104404A/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/04—Inotropic agents, i.e. stimulants of cardiac contraction; Drugs for heart failure
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2799/00—Uses of viruses
    • C12N2799/02—Uses of viruses as vector
    • C12N2799/021—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/008—Vector systems having a special element relevant for transcription cell type or tissue specific enhancer/promoter combination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Pronalazak obezbeđuje novi kontrolni region ekspresije izolovan iz sisarskih korin gena. Ovaj kontrolni region pretpostavljeno aktivira transkripciju srčanih ćelija. Postupci i sastavi su obezbeđeni da uposle ovaj kontrolni region za identifikaciju agenasa sposobnih da moduliraju ekspresiju korina i za tretman bolesti srca.

Description

KONTROLNE SEKVENCE HUMANOG KORIN GENA
Ova prijava se poziva na U.S. Provisional Application Serial No. 60/384,108 podnesenu 31.maja 2002.godine koja je vode u celini inkorporisana putem reference.
OBLAST PRONALASKA
Ovaj pronalazako obezbeđuje novi kontrolni region ekspresije izolovan iz sisarskih korin gena.. Ovaj kontrolni region poželjno aktivira transkripciju srčanih ćelija. Postupci i sastavi su obezbeđeni da uposle ovaj kontrolni region za identifikaciju sredstava sposobnih da moduliraju ekspresiju korina i za lečenje srčanih bolesti.
STANJE TEHNIKE
Korin, serin proteaza srčane transmembrane, igra važnu ulogu u konverziji pro-atrijalnih natriuretičkih peptida (pro-ANP) u ANP (Yan, W. et al.
(2000)PNAS, 97:8525-8529; Wu et al. (2002) J.Biol.Chem. 277016900-16905). ANP je srčani hormon koji smanjuje visoki krvni pritisak promovišući ekskreciju soli, povećavajući urinarno izlučenje, smanjujući zapreminu krvi, i opuštanjem tenzije sudova na od receptora zavisni način. ANP je umešan u glavne kardiovaskularne bolesti kao što je hipertenzija i prestanak srčanog rada (Burnett, J. C. Et al. (1986) Science, 231:1145-1147). Kod miševa bez svesti, nedostatak bilo ANP ili negovog receptora izaziva spontanu hipertenziju (John, S.W. et al. (1995) Science 267:679-681; John, S.W. et al. (1996) Am. J. Phvsiol. 271, R109-R114; Lopez et al.
(1995) Nature 378:65-68). Prepoznato je da je korak aktiviranja konvertovanja pro-ANP u ANP kritičan u regulisanju srčanog hormona.
Korin ima predviđenu strukturu tip II proteina transmembrane koji sadrži dva kovrdžavo slična cisteinom bogata motiva, osam LDL receptor ponavljanja, magrofaga sakupljača receptom slični domen, i tripsinu sličan proteaza domen u ekstracelularnom regionu (Yan et al. (1999) J. Biol. Chem. 274:14926-14935). Ukupna topologija korina je slična tom drugom tipu II transmembranaserin proteaza uključujući hepsin, enterokinaza, MT-SP1/matriptaza, humani tripsinu-slična proteaza disajnog puta, TMPRSS2, TMPRSS3/TADG-12, TMPRSS4, MSPL, iStubble- stubbloid.Slične topoligije kao i rezličite modularne strukture sugerišu da ovi proteini sadrže familiju gena koja evoluira duplikacijom i preraspoređivanjem eksona predaka.
Humani gen obuhvata > 200 kb i sadrži 22 eksona. Intron/ekson granice su dobro konzervisane između vrsta sa najvećim brojem eksona koji kodiraju strukturalne domene. Kloniranje oba, mišje i humane cRNK koja kodira korin protein je prethodno objavljeno (Yan et al., ibid). Severna analiza pokazje da je korin mRNK visoko ekspresovana u humanom srcu. Putem analize hibridizacije fluorescencijom in situ , humani korin gen je mapiran prema kratkoj ruci hromozoma 4 (4p12-13) gde su ranije lokalizovani likus kongenitalne srčane bolesti, totalni anomalijski pulmonalni venski povraćaj.
SUŠTINA PRONALASKA
Sadašnji pronalazak se odnosi na izolovanje, kloniranje i identifikaciju kontrolnih regiona ekspresije sisarskog korin gena, uključujući promoter i druge regulatorne elemente, i upotrebu ovog kontrolnog regiona srčano specifične ekspresije da se identifikuju novi agensi koji moduliraju ekspresiju korin gena i da se leče bolesti srca.
Ka ovim krajevima, predmet je sadašnjeg pronalaska da se obezbedi izolovani polinukleotid koji sadrži kontrolni region ekspresije korina, pri čemu kontrolni region modulira transkripciju bilo kog heterologog polinukleotida prema kome je operativno povezan, uključujući, ali ne limitirajući na, humani korin gen.
Kontrolni region ekspresije korina usmerava srčano specifičnu transkripciju heterologih polinukleotida za koje je operativno povezan, sadrži jedan ili više regulacionih elemenata transkripcije, odabrane od grupe koja se sastoji od GATA, Tbx-5, NKx2.5, Kruppel-slični transkripcioni faktor, ili NF-AT položaje vezivanja, i sposoban je da vezuje transkripcione proteine, n.pr. GATA-4.
Dalji je predmet pronalaska da obezbedi polinukleotide koji sadrže kontrolni region ekspresije humanog korina. Pretpostavljeni polinukleotid pronalaska je lociran na nukleotidima -4037 do-15 (SEQ ID NO: 6), poželjnije na nukleotidima -1297 do -15 (SEQ ID NO: 5), i još poželjnije na nukleotidima -405 do -15 (SEQ ID NO: 4), gde je brojanju u zavisnosti od položaja iniciranja translacije (ATG) humanog korin gena ili njegovog komplementarnog vlakna kao što je prikazano na Slici 8 (SEQ ID NO: 2).
U skladu sa ovim aspektom pronalaska takođe su obezbeđeni fragmenti i varijante ovih polinukleotida.
Sledeći je predmet pronalaska da obezbedi vektore koji sadrže kontrolni region ekspresije korina, ili njegove fragmente ili varijante. U daljim realizacijama, vektor takođe sadrži heterologi polinukleotid, n.pr. korin, operativno povezan za kontrolni region ekspresije korina. U skladu sa ovim aspektom pronalaska, takođe su obezbeđene ćelije domaćini izmenjene infekcijom sa takvim vektorima, i postupci ekspresije proizvoda koji su kodirani putem takvih heterologih polinukleotida.
Sledeći je predmet pronalaska da obezbedi farmaceutske sastave koji se sastoje od vektora koji sadrži kontrolni region ekspresije korina operativno povezan sa heterologim polinukleotidom ili ćelijom domaćina izmenjenom infekcijom sa takvim vektorom, u farmaceutski prihvatljivom nosaču.
Sledeći je predmet pronalaska da obezbedi postupak identifikovanja agensa koji može da modulira ekspresiju humanog korin gena u ćeliji, pri čemu se postupak sastoji od: (a) proizvodnje rekombinantnog vektora u kojem je izolovan polinukleotid koji se sastoji od kontrolnog regiona eskpresije sisarskog korina operativno povezan za reporter genom; (b) izmene infekcijom ćelije sa rekombinantnim vektorom; (c) tretiranja ćelije sa agensom; (d) merenja nivoa transkripcije reporter sekvence u tretiranoj ćeliji; i (e) upoređivanja nivoa ekspresije reporter sekvence u prisustvu agensa prema nivou ekspresije u kontrolnoj ćeliji izmenjenoj infekcijom koja nije tretirana sa agensom.
U pretpostavljenoj realizaciji, upotrebljavaju se srčanje miocit ćelije.
Sledeći je predmet pronalaska da obezbedi postupak moduliranja srčano specifične ekspresije gena u humanom subjektu, postupak koji se sastoji od:: (a) proizvodnje rekombinantnog vektora u kome je izolovani polinukleotid koji sadrži kontrolni region ekspresije sisarskog korina operativno povezan za heterologi polinukleotid; i (b) davanja vektora subjektu u terapeutski efektivnoj količini.
Pretpostavljena realizacija ovog aspekta pronalaska je vektor u kome heterologi polinukleotid kodira korin. Takođe su pretpostavljene realizacije u kojima je kontrolni region ekspresije korina odabran od polinukleotida koji imaju sekvence SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 ili SEQ ID NO: 6.
Sledeći predmet pronalaska je da obezbedi postupak lečenja kongestivnog slabljenja srca, hipertenzije i infarkta miokarda kod humanog subjekta, postupak koji se sastoji od davanja subjektu terapeutski efektivne količine izolovanog polinukleotida koji sadrži kontrolni region ekspresije korina, operativno povezan za gen odabran od grupe koja se sastoji od korina, atrijalnog natiuretičkog peptida (ANP), B-tip natriuretičkog peptida, fofonolambana, antiotenzina koji konvertuje enzim (ACE), ili dominantnih negativnih formi ovih gena. Alternativno, kontrolni region ekspresije korina može biti operativno povezan za polinukleotid koji kodira antisens RNK molekul.
U pretpostavljenoj realizaciji ovog aspekta pronalaska gen koji je odabran je korin.
Sledeći je aspekt pronalaska da obezbedi postupak lečenja humanog subjekta sa srcem koje slabi, postupak koji se sastoji od: (a) proizvodnje rekombinantnog vektora u kome je izolovanmi polinukleotid koji sadrži kontrolni region ekspresije sisarskog korina operativno povezan za polinukleotid koji kodira polipeptid odabran od grupe koja se sastoji od ANP, B-tip natriuretičkog peptida, fofonolambana, ACE, ili dominantnih negativnih formi ovih gena; i (b) davanja rekombinantnog vektora subjektu, u farmaceutski prihvatljivom nosaču.
OPIS SLIKA
Slika 1. Organizovanje sisarskih korin gena. Prikazana je organizacija (A) humanih i (B) mišjih korin gena. Dva BAC klona se sekvenciraju putem otvorene strategije i naznačene su veličine njihovih sakupljenih umetnutih sekvenci. Vertikalni vertikalne crte naznačavaju eksone. Plazmid klon koji se upotrebljava za podkloniranje iz BAC 26540 u humani gen je naznačeno položajima restrikcije enzima (H, Hind III; E, EcoRI). Umetak podklona se sakvencira putem postupka ekstenzije prajmera upotrebom automatizovanog sekvenciranja. Na dnu su opisane pozicije BAC klonova, dodirnih i plazmid klona koji savija korin gen.
Slika 2. Intron-ekson granične pozicije prema protein domenu korina. Eksoni 1 do 22 (gornji panel) korin gena su poravnjani sa njihovim odgovarajućim protein domenima. TM, transmembrana domen; Ukovrčani, kovrdžama slični cisteinom bogati domen; LDLR, LDL receptor ponavljanja; SRCR receptor za sakupljanje cisteinom bogatog domena; H, D, i S, His, Asp, i Ser ostatci katalitičke triade proteaza domena.
Slika 3. Poravnanje 5'-bočnih regiona humanih (SEQ ID NO: 1) i mišjih (SEQ ID NO: 3) korin gena. 5'-bočni region, ekson 1 i deo introna 1 su poravnati između humanih i mišjih gena. Označavanje brojevima je u zavisnosti od inicijatora translacije ATG (zadebljani tip slova i ukošena slova). Naznačeni brojevi su različiti između humanog i mišjeg, usled divergencije u prvim eksonima. Strelica ukazuje ukrštanje između prvog eksona i introna humanog korin gena, i a spletena sekvenca davaoca humanog introna 1 je podvučena. Pretpostavljene regulatorne sekvence su naznačene i zadebljane (Tbx5 položaj vezivanja za Tbx5, T-kućica koja sadrži faktor transkripcije; NF-AT, položaj vezivanja za nuklearni faktor aktiviranih T-ćelija; GATA, vezujući element za GATA proteine; GT kućica za vezivanje Kruppel-slčinih faktora; TATA kućica za vezivanje bazalne transkripcije faktora TFIID; i NKE, vezujući motiv za Nxk2.5). NKE sekvenca, koja se preklapa sa najbližom GATA sekvencom, je podvučena.
Slika 4. Funkcionalna analiza aktivnosti promotera korin gena u kultivisanim kardiomiocitima. Reporter konstrukti koji sadrže serijski prekinute segmente 5'-bočnog regiona humanih i mišjih korin gena povezani za luciferaza gen su na dijagramu (Panel A). Lokacije pretpostavljenih regulatornih elemenata su naznačene. Ovi konstruktu su ko-izmenjeni infekcijom u mišjim HL-5 ćelijama sa pRL-SV40,Rellinalucifaraza-ekspresujućim plazmidom vođenim sa SV40 viralnim promoterom. Aktivnost luciferaze ekspresovane od strane svakog konstrukta se normalizuje prem aktivnostiRellinaluciferaze koja se ekspresuje od strana pRL-SV40 za svaki izmenjenu infekciju. Svaki eksperiment izmene infekciojom se obavlja u triplikatu za svaki konstrukt. Podaci predstavljaju srednje vrednosti ± S.D. tri nezavisna eksperimenta (Panel B).
Slika 5. Srčano-specifična ekspresija 5'-bočnih sekvenci iz humanih i mišjih korin gena. Kardiomiociti HL5 ćelija i epiteloid HeLa ćelije se izmene infekcijom sa naznačenim konstruktima, svaki duž kontrolnog konstrukta pRL-SV40. Aktivnosti luciferaze iRellinasu ekspresovane kao kao lake jedinice po 20 uL-alikvotima ćelijskih ekstrakta iz ćelija izmenjenih infekcijom. Svaki eksperiment izmene infekcijom se obavlja u triplikatu. Podaci predstavljaju srednje vrednosti + S.D. tri nezavisna eksperimenta.
Slika 6. Vezivanje nuklearnih proteina na regulatorne sekvence okruživanjem najbližeg GATA elementa.
A: Sekvence gornjeg vlakna oligonukleotida se upotrebljavaju kao probe i takmičari. GATA motivi u svakoj sekvenci (SEQ ID NOS: 11 i 13, za humane i mišje, svaka posebno) su podebljani, i mitirani nukleotidi (SEQ ID NOS: 12 i 14, za hume i mišje, svaka posebno) su sa zakrivljenim slovima. Humani i mišji najbliži GATA elementi su iz naznačenih regiona korin 5'-bočnih sekvenci. Saglasna GATA proba (SEQ ID NO: 15) koja sadrži dva GATA motiva je izvedena iz humog T-ćelija receptor specifičnog regiona za pojačavanje.
B: Označena saglasna GATA proba (SEQ ID NO: 15) ili njena mutant proba (SEQ ID NO: 16) se inkubira sa nuklearnim ekstraktima iz HL-5 ćelija u prisustvu ili odsustvu 100-puta viška naznačenih neoznačenih oligonukleotida. Strelica pokazuje zavisni DNK-protein kompleks zavisan od GATA-sekvence.
C: Označena saglasna GATA proba se inkubira sa nuklearnim ekstraktima iz HL-5 ćelija u prisustvu antitela spram GATA proteina. Strelica označava DNK-protein kompleks čije se formiranje blokira antitelom spram GATA-4, ali ne antitelima spram GATA-1, -3, i -6.
D: Označeni humani korin GATA element se inkubira sa nuklearnim ekstraktima iz HL-5 u prisustvu ili odsustvu antitela spram GATA-4. Strelica označava DNK-protein kompleks čije je formiranje u potpunosti blokirano u prisustvu anti-GATA-4 antitela.
Slika7. Mutaciona analiza najbližih konzervisanih GATA elemenata. Iste mutacije (GATA prema CTTA) koje ukidaju vezivanje GATA-4 proteina u EMSA se uvode u konstrukte luciferaza receptora vođene sa 5'-bočnim regionima od -642 do -77 kod miša ili od -405 do -15 kod čoveka. Mutant i divlji tip konstrukti se izmene infekcijom u HL-5 ćelijama, svaki zajedno sa kontrolnim konstruktom pRL-SV40. Aktivnost luciferaze ekspresovana od strane svakog konstrukta se normalizuje u aktivnostiRenillaluciferaze ekspresovanoj sa pRL-SV40 za svaku izmenu infekcijom. Aktivnost promotera svakog mutant konstrukta se ekspresuje kao procenat odgovarajućeg konstrukta divljeg tipa. Svaki eksperiment izmene infekcijom se obavlja u triplikatu. Podaci predstavljaju srednje vrednosti ± S.D. tri nezavisna eksperimenta
Slika8. Nukleotidna sekvenca (SEQ ID NO: 2) 5'-bočnog regiona humanog korin gena. 4165-baza sparena sekvenca sadrži 5'-bočni region, prvi ekson, i početak introna 1 (u nižem slučaju). Sva određivanja brojevima su u zavisnosti od početnog translacionog položaja (ATG, zadebljano i podvučeno). Pretpostavljeni regulatorni elementi su naznačeni zadebljano. Skraćenice za pretpostavljene relgulatorne elemente su opisane u legendi Slike 3.
DETALJAN OPIS PRONALASKA
Sadašnji pronalazak se odnosi na izolovanje, kloniranje i identifikaciju ekspresionog kontrolnog regiona srčano specifičnog korin gena, uključujući promoter i druge regulatorne elemente. Izolovani kontrolni region ekspresije korina, i njihovi fragmenti i varijante, imaju korisnost u konstruisanjuin vitroiin vivoeksperimentalnih modela za proučavanje modulacije ekspresije korin gena i za identifi kova nje novih modulatora ekspresije korin gena. Ekspresioni kontrolni region može takođe biti upotrebljen u genskoj terapiji ciljanoj ka srčanim bolesnim stanjima, n.pr. slabljenju srca.
Definicije:
Kako se koristi u opisu, primerima i zahtevima, osim ukoliko nije specifikovano drugačije, sledeći pojmovi imaju naznačena značenja.
"Nukleinska kiselina" ili "polinukleotid" se odnosi na deoksiribonukleotide ili ribonukleotide i njihove polimere u bilo jedinično- ili dvostruko-vlaknastom obliku. Pojam obuhvata nukleinske kiseline koje sadrže analoge nukleotida ili modifikovanu kičmu ostataka ili veznika, koji su sintetički, prirodno nastaju, i neprirodno nastaju, koji imaju slične osobine vezivanja kao referentna nukleinska kiselina, i koji se metabolišu na sličan način kao referentni nukleotidi. Primeri takvih analoga uključuju, bez limitiranja,
fosforotioate, fosforoamidate, metil fosfonate, hiralne-metil fosfonate, 2-0-metil ribonukleotide, peptid-nukleinske kiseline (PNA-ovi).
Osim ukoliko nije drugačije naznačeno, određena sekvenca nukleinske kiseline takođe implicitno obuhvata njihove konzervativno modifikovane varijante (n.pr., degenerisane kodon supstitucije) i komplementarne sekvence, kao i sekvence eksplicitno naznačene. Specifično, degenerisane kodon supstitucije mogu biti postignute generisanjem sekvenci u kojima je treća pozicija jednog ili više odabranih (ili svi) kodona supstituisana sa smešanom osnovom i/ili deokinozin ostatcima (Batzer et al. (1991) Nucl. Acids Res. 19:5081; Ohtsuka et al. (1985) J. Biol. Chem. 260:2605-08; Rossolini et al. (1994) Mol. Cell. Probes 8:91-98). Pojam nukleinska kiselina se upotrebljava inter izmenjlijvo sa genom, cDNK, mRNK, oligonukleotidom, i polinukleotidom.
Određena sekvenca nukleinske kiseline takođe implicitno obuhvata "spletene varijante". Slično, određeni protein kodiran sa nukleinskom kiselinom implicitno obuhvata bilo koji protein koji je kodiran sa spletenom varijantom te nukleinske kiseline. "Spletene varijante", kao što samo ime sugeriše, su proizvodi alternativnog spletanja gena. Posle transkripcije, inicijalni transkript nukleinske kiseline može biti spleten tako da različiti (alternativni) spleteni proizvodi nukleinske kiseline kodiraju različite polipeptide. Mehanizmi za proizvodnju spletenih varijanti variraju, ali uključuju alternativno spletanje eksona. Alternativni polipeptidi izvedeni iz iste nukleinske kiseline putem čitanja kroz transkripciju su takođe obuhvaćeni ovom definicijom. Bilo koji proizvod reakcije spletanja, uključujući rekombinanten forme spletenih proizvoda, su takođe uključeni u ovu definiciju.
"Korin gen" se odnosi na gen koji kodira dodirnu sekvencu amino kiseline koji dele oko bar 60% (pretpostavljeno 75%, 78%, 90%, i više pretpostavljeno oko 95%) identitet sa sekvencom amino kiseline humanog korin gena kao što je otkriveno kod Yan et al. (1999) J. Biol. Chem. 274: 14926-14935).
"Kontrolni region ekspresije korina" ili "ekspresioni kontrolni region" se odnosi na polinukleotid lociran u okviru uzlazne (5') genomne sekvence kodirajućeg regiona prirodno nastalih sisarskih korin gena. U humanom korin genu, kontrolni region ekspresije korina počinje na nukleotidu -4165 i završava se na nukleotidu -15 u odnosu na položaj iniciranja translacije (ATG) korin gena ili njegovog komplementarnog vlakna kao što je prikazano na Slici 8. Kontrolni region ekspresije korina je sposoban da aktivira transkripciju korin gena u srčanom tkivu (miociti). Polinukleotidi kontrolnog regiona ekspresije korina mogu biti u rasponu od 100 do 5000 nukleotida u dužini; određene realizacije funkcionalnog kontrolnog regiona eskpresije korina su 4023, 1283, ili 391 nukleotida (SEQ ID NOS: 6, 5 , i 4, svaka posebno) u dužini. Polinuklotidi kontrolnog regiona ekspresije gena su generalno bar 70% homologi sa ovim sekvencama. U nekim realizacijama, polinukleotidi kontrolnog regiona ekspresije korina su bar 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95% ili 100% homologi ovim sekvencama. Pojam "kontrolni region" ne uključuje iniciranje ili ukidanje kodona i drugih sekvenci već opisanih kod Yan et al. Ibid. Kontrolni region ekspresije gena sadrži vezujuće položaje za rzličite transkripcione regulatorne proteine,
n.pr., GATA-4, kojimogu biti povezani na način koji je suštinski isti kao u prirodi ili na veštački način. Kontrolni region ekspresije korina aktivira transkripciju korin gena ili drugih heterologih polinukleotida koji su operativno povezani na njega, posebno na srčano specifični način.
"Srčano specifična ekspresija" znači daje polunukleotid transkribovan u većoj meri u srčano-izvedenim ćelijama nego u ne-srčanim ćelijama. Tako će kontrolni region ekspresije korina generalno aktivirati transkripciju povezanog polinukleotida bar 2 puta efikasnije u srčanim miocitima neko u ne-srčanim ćelijama, gde je ekspresija u svakom slučaju normalizovana u odnosu na transkripciju drugog polinukleotida povezanog na SV40 promoter/pojačivač ili drugi konstitutivni promoter.
"Varijanta(e)" polinukleotida, kako se to ovde koristi, su polinukleotidi koji se razlikuju od polinukleotidne sekvence referentnog polinukleotida. Generalno, razlike su limitirane tako da su polinukleotidne sekvence reference i varijatne ukupno vrlo slične i, u mnogim regionima identične. Razlike su takve da funkcija polinukleotida nije izmenjena, i ukoliko polinukleotid normalno kodira polipeptid, rezultirajući polipeptid je bilo nepromenjen u sekvenci amino kiseline ili, dok poseduje razlike u sekvenci amino kiseline, je i dalje funkcionalno identičan.
"Fragment(i)", kako se to ovde koristi, se odnose na polinukleotid koji ma polinukleotidnu sekvencu koja je u potupnosti ista kao deo, ali ne cele, polinukleotidne sekvence ranije pomenutog kontrolnog regiona ekspresije korina i njegovih varijanti. Takvi fragmenti zadržavaju sposobnost kontrolnog regiona ekspresije korina da usmeri srčano specifičnu transkripciju heterologih polinukleotida na koje su operativno vezani.
"Elementi iniciranja transkripcije" se odnosi na sekvence u promoteru koje specifikuju početni položaj RNK polimeraze II. Elementi iniciranja transkripcije mogu da uključuju TATA kućice, koji usmeravaju iniciranje transkripcije 25-35 baza nizlazno, ili inicijator elemente, koji su sekvence same locirane blizu početnog položaja transkripcije. Eukariotski promoteri
generalno sadrže elemente iniciranja transkripcije i bilo promoter-dodirne elemente, udaljene elemente pojačavanja, ili obe.
"Rekombinantno" kada se upotrebljava sa referencom, n.pr., na ćeliju, ili nukleinsku kiselinu, protein, ili vektor, naznačava daje ćelija, nukleinska kiselina, protein ili vektor, modifikovan putem uvođenja heterologe nukleinske kiseline ili proteina ili izmenom matične nukleinske kiseline ili proteina, ili daje ćelija izvedena iz ćelije tako modifikovane. Tako, na primer, rekombinanten ćelije ekspresuju gene koji nisu pronađeni u okviru matičnog (ne-rekombinantnog) oblika ćelije ili ekspresuju matične gene koji se inače abnormalno ekspresuju, manje ekspresuju ili uopšte ne ekspresuju.
"Pojačivač" se odnosi na DNK regulatorni region koji pojačava transkripciju. Pojačivač je uobičajeno, ali ne uvek, liciran van dodirnog promoter regiona i može biti lociran nekoliko kilobaza ili više od početnog položaja transkripcije, čako 3' prem kodirajućoj sekvenci ili u okviru introna gena. Promoteri i pojačivači mogu dami ili u kombinaciji da prenose tkivo specifičnu ekspresiju.
"Prigušivač" se odnosi na kontrolni region DNK koji kada je prisutan u prirodnom kontekstu korin gena izaziva potiskivanje transkripcije iz tog promotera bilo zbog svoji sopstvenih dejstava kao diskretan DNK segment ili kroz dejstva trans-delujućih faktora vezivanja prema navedenim elementima i efektuiranjem negativne kontrole na ekspresiju gena. Ovaj elemenat može igrati ulogu u restrikciji matrice ekspresije ćelijskog tipa viđene za korin gen, na pirmer ekspresija može biti dopustiva u kardiomiocitima gde prigušivač može biti neaktivan, ali zabranjena u
drugim ćelijskim tipovima u kojma je prigušivač aktivan. Ovaj elemenat može ili ne mora raditi u izolaciji ili u heterologom promoter konstruktu.
"Izolovano" kada se odnosi na, n.pr., polinukleotid znači daje matirijal uklonjen iz svog originalnog okruženja (n.pr., prirodno okruženje ako je prirodno nastali), i izolovan ili odvojen od bar jedne druge komponente sa kojom je prirodno povezan. Na primer, prirodno nastali polinukleotid prisutan u prirodnom živom domaćinu nije izolovan, ali isti polinukleotid, odvojen od svih koegzistirajućih materijala u prirodnom sistemu, je izolovan. Takvi polinukleotidi mogu biti deo sastava i, i dalje biti izolovani tako da sastav nije deo njegovog prirodnog okruženja.
"Procenat identičnosti" ili identični procenat kada se odnosi na sekvencu, znači da je sekvenca upoređena sa zahtevanim elementom ili opisanom sekvencom nakon poravnanja sekvence da bude upoređena sa opisanom ili zahtevanom sekvencom. Upoređenje sekvenci i utvrđivanje procenta identičnosti i sličnosti između dve sekvence može biti postignuto upotrebom matematičkog algoritma. Pretpostavljeni ne-limitirajući primer takvog matematičkog algoritma je opisana kod Karlin et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877. Takav algoritam je inkorporisan u NBLAST i XBLAST programe (verzija 2.0) kao što je opisano kod Altschul etal. (1997) Nucleic Acid Res. 25:3389-3402.
"Visoka strogost" kako se ovde koristi znači, na primer, inkubiranje mrlje preko noći (n.pr., bar 12 sati) sa velikom polinukleotidnom probom u rastvoru za hibridizovanje koji sadrži, n.pr., 5X SSC, 0,5% SDS, 100:g/ml_ denaturisane DNK sperme lososa i 50% formamida, pri 42°C. Mrlje mogu da se operu pri uslovima visoke strogosti koji dopuštaju, n.pr., manje od
5% bp razlike (n.pr., oprati dva puta u 0,1X SSC i 0,1% SDS 30 minuta na 65°C), pri čemu se selektiraju sekvence koje imaju n.pr., 95% ili više identičnost sekvence.
Polinukleotid je "ekspresovan" kada je DNK kopija polinukleotida transkribovana u RNK.
Polinukleotid je "operativno povezan" za kontrolni region ekspresije korina kada spajanje polinukleotida i kontrolnog regiona ekspresije korina u jednom molekulu rezultira u transkripciji polinukleotida, najpoželjnije u srčano specifičnoj transkripciji, (u miocitima).
"Heterologi polinukleotid" se odnosi na polinukleotide, osim onih kontrolnog regiona ekspresije korina, koji su operativno povezani za kontrolni region ekspresije korina i poželjno ekspresovani u srčano specifičnim ćelijama. Povezani polinukleotid kodira terapeutski koristan molekul, n.pr., polipeptid, antisens RNK. Pojmovi "izolovan", "prečišćen", ili "biološki čist" se odnose na materijal koji je suštinski ili esencijalno oslobođen od komponenti koje ih normalno prate kao što je pronaženo u njihovom prirodnom stanju. Čistoća i homogeničnost se tipično utvrđuju upotrebom tehnika analitičke hernije kao što su poliakrilamid gel elektroforeza ili tečna hromatografija visokih performansi. Protein koji je predominantano prisutan po vrstama u preparatu se suštinski prečišćava. Posebno, izolovana nukleinska kiselina je odvojena od ramova za otvoreno čitanje koji napadaju s boka gen i kodiraju druge proteine. Pojam "prečišćen" označava da nukelinska kiselina ili protein daju podizanje do esencijalno jednog povezivanja u elektroforetičkom gelu. Posebno, to
znači da je nukleinska kiselina ili protein bar 85% čist, poželjnije bar 95% čist, i najpoželjnije bar 99% čist.
Pojmovi "polipeptid", "peptid", i "protein" se ovde upotrebljavaju interizmenjljivo da se odnose na polimer ostataka amino kiselina. Pojmovi odgovaraju polimerima amino kiseline u kojem je jedan ili više ostatka amino kiseline veštački hemijski mimetik odgovarajuće prirodno nastale amino kiseline, kao i na prirodno nastale polimera amino kiseline i neprirodno nastali polimer amino kiseline.
Pojam "amino kiselina" se odnosi na prirodno nastale i sintetičke amino kiseline, kao i na analoge amino kiseline i mimetike amino kiseline koji
funkcionišu na način sličan prirodno nastalim amino kiselinama. Prirodno nastale amino kiseline su one koje su kodirane od strane genetskog koda, kao i one amino kiseline koje su kasnije modifikovane, n.pr., hidroksiprolin, y-karboksiglutamat, i O-fosfoserin. Analozi amino kiseline se odnosi na jedinjenja koja imaju istu bazičnu hemijsku strukturu kao prirodno nastala amino kiselina, odnosno, ugljenik koje je vezan za vodonik, karboksil grupa, amino grupa, i R grupa, n.pr., homoserin, norleucin, metionin sulfoksid, metionin metil sulfonijum. Takvi analozi modifikuju R grupe (n.pr., norleucin) ili modifikuju kočme peptida, ali zadržavaju istu bazičnu hemijsku strukturu kao prirodno nastala amino kiselina. Mimetici amino kiseline se odnosi na hemijska jedinjenja koja imaju strukturu koja je različita od generalne hemijske strukture amino kiseline, ali koji funkcionišu na način sličan prirodno nastaloj amino kiselini.
Na amino kiseline se ovde može pozvati putem bilo njihovih uobičajeno poznatih simbola od tri slova ili putem simbola od jednog slova koji se preporučuje od strane IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission. Na nukleotide se, na isti način, može pozvati putem njihovih uobičajeno prihvaćenih kodova od jednog slova.
"Konzervativno modifikovane varijante" se primenjuju na oba amino kiselinu i sekvence nukleinske kiseline. U pogledu određenih sekvenci nukleinske kiseline, konzervativno modifikovane varijante se odnose na one nukleinske kiseline koje kodiraju identične ili esencijalno identične sekvence amino kiseline, ili gde nukleinska kiselina ne kodira sekvencu amino kiseline, u esencijalno identične sekvence. Zbog degenerisanja genetskog koda, veliki broj funkcionalno identičnih nukleinskih kiselina kodiraju bilo koji dati protein. Na primer, kodoni GCA, GCC, GCG i GCU svi kodiraju amino kiselinu alanin.' Tako, na svakoj poziciji gde je alanin specifikovan od strane kodona, kodon može biti zamenjen za bilo koje odgovarajuće kodone opisane bez izmene kodiranog polipeptida. Takve varijante nukleinske kiseline su "tihe varijacije" koje su jedna vrsta
konzervativno modifikovanih varijacija. Ovde svaka sekvenca nukleinske kiseline koja kodira polipeptid takođe opisuje svaku moguću tihu varijaciju nukleinske kiseline. Stručnjak će prepoznati da svaki kodon u nukleinskoj kiselini (osim AUG, koji je uobičajeno jedini kodon za metionin, i TGG, koji je obično jedini kodon za triptofan) može biti modifikovan da se dobije
prinos funkcionalno identičnog molekula. U skladu sa tim, svaka tiha varijacija nukleinske kiseline koja kodira polipeptid je implicitno u svakoj opisanoj sekvenci.
Što se tiče sekvenci amino kiseline, stručnjak će prepoznati da su individualne supstitucije, uklanjanja ili dodavanja nukleinskoj kiselini, peptidu, polipeptidu, ili sekvenci proteina koja menja, dodaje ili uklanja jednu amino kiselinu ili mali procenat amino kiselina u kodiranoj sekvenci
"konzervisano modifikovana varijanta" gde izmena rezultira u supstituciji amino kiseline sa hemijski sličnom amino kiselinom. Tabele konzervativne supstitucije koje obezbeđuju funkcionalno slične amino kiseline su dobro poznate u nauci. Takve konzervativno modifikovane varijante su dodatno i ne isključuju polimorfne varijante, homolege među vrstama, i alele pronalaska.
Svaka od sledećih osam grupa sadrži amino kiseline koje su konzervativne supstitucije jedna za drugu: 1) Alanin (A), Glicin (G); 2) Aspartinska kiselina (D), Glutaminska kiselina (E); 3) Asparagin (N), Glutamin (Q); 4) Arginin (R), Lizin (K); 5) Izoleucin (I), Leucin (L), Metionin (M), Valin (V); 6) Fenilalanin (F), Tirozin (Y), Triptofan (W);
7) Serin (S), Treonin (T); i
8) Cistein (C), Metionin (M)
Videti, n.pr., Creighton, Proteins (1984).
"Vektor ekspresije" se odnosi na konstrukt nukleinske kiseline, generisan rekombinantno ili sintetički, sa serijom spcifikovanih elemenata nukleinske kiseline da dopusti transkripciju određene nukleinske kiseline u ćeliji domaćinu. Vektor ekspresije može biti deo plazmida, virusa, ili fragmenta nukleinske kiseline. Tipično, vektor ekspresije uključuje nukleinsku kiselinu da bude transkribovana operativno vezana za kontrolni region ekspresije, n.pr. kontrolni region ekspresije korina.
"Farmaceutski prihvatljivi inertni punilac" se odnosi na prihvatljivi nosač, i bilo koja prihvatljiva pomoćna supstanca koja se zahteva da bude
kompatibilna sa fiziološkim stanjima, koji su ne-toksični i ne utiču škodljivo na biološku aktivnost farmaceutskog sastava suspendovanog ili uključenog u njega. Odgovarajući inertni punioci će biti jedinjenja kao što su manitol, sukcinat, glicin, ili serum albumin.
"Terapeutski efektivna količina" se odnosi na količinu jedinjenja pronalaska, koja, kada se daje subjektu kome je neophodna, je dovoljan da tretman dejstvuje, kao što je dole definisano, za pacijente koji pate od, ili je verovatno da će im se razviti, srčane bolesti. Količina jedinjenja koje konstituiše "terapeutski efektivnu količinu" će varirati u zavisnosti od jedinjenja, ali može biti rutinski utvrđena od strane stručnjaka iz ove oblasti nauke s pogledom na njegovo sopstveno znanje i na ovo otkriće.
"Tretiranje" ili "tretman" kako se to ovde koristi pokrivaju tretman srčane bolesti, i uključuje:
(a) sprečavanje nastanka bolesti srca koja se pojavljuje kod ljudi, posebno kada su takvi ljudi predisponirani da imaju takva stanja; (b) inhibiranje bolesti srca, odnosno zaustavljanje njenog razvoja; ili (c) olakšavanje bolesti srca, odnosno izazivanje regresije stanja bolesti.
Detaljan opis pronalaska
Sadašnji pronalazak se odnosi na kloniranje i identifikaciju kontrolnog regiona ekspresije sisarskog korin gena (n.pr., miš, čovek), uključujući promoter i druge regulatorne elemente i upotrebu ovog kontrolnog regiona ekspresije da identifikuje agense koji moduliraju ekspresiju korin gena i u tretmanu bolesti srca. Posebno, pronalazak se odnosi na polinukleotide koji sadrže novi kontrolni region ekspresije korina i sposobnost ovog kontrolnog regiona da usmeri srčano specifičnu ekspresiju heterologih polinukleotida opoerativno povezanih na njega.
Izolovanje i karakterizacija polinukleotida kontrolnog regiona
ekspresije korina
Ovaj pronalazak se oslanja na rutinskim tehnikama u oblesti rekombinantne genetike. Osnovni tekstovi koji otkrivaju generalne postupke za upotrebu ovog pronalaska uključuju Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratorv Manual (2nd ed. 1989); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); i Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biologv (John Wiley and Sons, New York, NY, 1994).
Organizacija sisarskog korin gena
Slika 1 opisuje organizaciju hmanih i mišjih korin gena i lokacije (bakterijskog veštačkog hromozoma) BAC klonova, dodirnih, i plazmid klona koji sadrži korin gene i njegove 5'-bočne regione. Oba i humani i mišji korin geni obuhvataju bar 200 Kb i sastojei se od 22 eksona i 21 introna.
Sekvenca korin cDNK predviđa protein sastavljen od brojnih diskretnih domena. Granice između protein domena korespondiraju skoro u potpunosti sa ekson/intron granicama genomne strukture, kao što je ilustrovano šematski na Slici 2. Citoplazmični rep na N-završetku je kodiran sa eksonom 1 i polovinom eksona 2, praćeno domenom transmembrane koji je kodiran sa drugom polovinom eksona 2. Region između transmembrane i prvog Kovrdžavog domena je kodiran sa eksonom 3. Svaki od kovrdžanih domena je kodiran sa dva eksona, svako od osam LDLR-ova sa jednim eksonom, a sakupljač receptora cistein bogatog domena sa tri eksona. Proteaza domen na C-završtetku je kodiran sa eksonima 19 do 22, sa eksonom 19 koji kodira sekvencu koja uključuje proteolitički položaj aktiviranja i katalitički histidin ostatak. Eksoni 20 i 22 kodiraju sekvence koje uključuju druga dva katalitička ostatka aspartinsku kiselinu i serin, svaki posebno.
Kloniranje kontrolnog regiona ekspresije korina
Da bi se klonirali humani i mišji korin geni i njihovi 5'-bočni regioni, sintetisani su specifični oligonukleotidi koji odgovaraju objavljenim korin c'DNK sekvencama ovih gena (Yan et al. (1999) J. Biol. Chem. 274:14926-14935). Ovi oligonukleotidni prajmeri se testiraju za pojačavanje specifičnih proizvoda u PCR-baziranim reakcijama upotrebom humane ili mišje genomne DNK. Par prajmera koji uspešno pojačavaju specifične PCR proizvode se onda upotrebljavaju u PCR-baziranom pretraživanju da se identifikuju BAC klonovi koji sadrže humani ili mišji korin gen i/ili njihove odgovarajuće 5'-bočne regione. Identifikovani pozitivni BAC klonovi se bilo direktno sekvenciraju putem otvorene strategije ili podkloniraju u pUC118 (PanVera/Takara, Madison, Wl) za sekvenciranje. Sakupljanje otvorenih sekvenci se obavlja upotrebom Staden paketa (Bonfield et al. (1995) Nucleic Acids Res. 23:4992-4999).
Četiri BAC klona, po dva koja sadrže humane i mišje korin gene, se dobijaju putem na PCR-baziranog pretraživanja. Tri BAC klona se sekvenciraju putem otvorene strategije, i ove sekvence, u kombinaciji sa dostupnom informacijom traženja predmeta
( http:// www. ncbi. nim. nih. gov:80/ Traces/ trace. cqi,
http:// trace. ensembl. org), se upotrebljavaju da se sakupe dodirne sekvence od 340 kb koje sadrže humani korin gen, i da se utvrde sekvence za 5 dodirnih sekvenci za mišji korin gen. Za mišji korin gen, poredak 5 dodirnih sekvenci se potvrđuje putem postojanja nekoliko sparenih parova za čitanje u odgovarajućim susednim dodirnim sekvencama. Njihova udaljenost dopušta nam da utvrdimo veličinu praznine koja je manja od 500 bp, pošto je veličina umetka javnih
otvorenih umetaka vrlo dobro definisana. Strukture humanih i mišjih korin gena se onda analiziraju. Pa ipak, 340-kb humana genomna sekvenca ne sadrži 5'-bočni region. Dodatnih 4165 bp Hind M-EcoR fagmenta se izoluje iz BAC 26540, štop uključuje prvih 3919 bp 5'-bočnog regiona, sve od eksona 1 i dela introna 1 (podneseno kod GenBank™/EBI data Bank sa ulaznim brojem AF521006).
Ovde opisani polinukleotidi kontrolnog regiona eskpresije korina su svi izvedeni iz 4165 bp Hind lll-EcoR I fragmenta (videti Sliku 8, SEQ ID NO: 2) izolovanog iz BAC26540. Ovi polinukleotidi kontrolnog regiona ekspresije se dobijaju putem PCR-baziranog postupka, ili varenjem restrikcionog enzima, ili kombinacijom oba. 4023 bp polinukleotida kontrolnog regiona ekspresije korina (SEQ ID NO: 6) se pojačava iz 4165 pb Hind lll-EcoR I fragmenta ili humane genomne DNK upotrebom priajmera F1 (5-AAGCTTCATGAGGGCAGGAG-3') (SEQ ID NO: 7) i R1 (5-GAGCTCGCTTATTCTTCTGTCCACTT-3') (SEQ ID NO: 8). Na sličan način, 1283 pb polinukleotid kontrolnog regiona ekspresije korina (SEQ ID NO: 5) se pojačava upotrebom prajmera F» (5-AAGCTTATAAAAATAATAGCTTCTTC-3') (SEQ ID NO: 9) i R1 i 391 bp polinukleotid kontrlonog regiona ekspresije korina (SEQ ID NO: 4) se pojačava upotrebom prajmera F3 (5-AAGCTTAGTAACTCTTTTGCTCCCAA-3') (SEQ ID NO: 10) i R1.
Bilo koje sisarsko tkivo kao što su leukociti, od kojih DNK može lako biti ekstrakovana je odgovarajući izvor genomne DNK za izolovanje polinukleotida kontrolnog regiona ekspresije sisarskog korina.
Funkcionalni polinukleotidi kontrolnog regiona ekspresije korina
Gore opisani polinukleotidi kontrolnog regiona ekspresije korina se ogledaju za srčano specifičnu transkripcionu aktivnost putem operativnog povezivanja datok plinukleotida kontrolnog regiona ekspresije za reporter gen, menjajući infekcijom konstruk u srčane miocite, i ogledanjem na sposobnost određenme sekvence polinukleotida kontrolnog regiona eskpresije da usmeri srčano specifičnu transkripciju reporter gena. Reporter geni tipično kodiraju proteine sa lako oglednom enzimskom aktivnošću koji je prirodno odsutna iz ćelije domaćina. Tipični reporter proteini za eukariotske promotere uključuju hloramfenikol acetiltranferazu (CAT), svica iliRenillaluciferazu, beta-kalaktozidazu, beta-glukoronidazu, alkalnu fosfatazu, i zeleni fluorescentni protein (GFP). Pretpostavljeni reporter gen je svitac luciferaza.
Jedan sistem za pristupanje aktivnosti kontrolnog regiona ekspresije korina je nepostojana ili stabilna izmenjena infekcija u kultivisanim ćelijskim linijama. Vektori ogleda koji nose polinukleotide kontrolnog regiona ekspresije korina operativno povezane za reporeter gene mogu biti izmenjeni infekcijom u bilo kojoj sisarskoj ćelijskoj liniji za oglede aktivnosti promotera; za postupke ćelijske kulture, izmene infekcijom, i ogled reporter gena videti Ausubel et al. (2000), supra; Transfection Guide, Promega Corporation, Madison, Wl (1998). Polinukleotidi kontrolnog regiona ekspresije korina mogu biti ogledani za srčano specifičnu transkripcionu aktivnost putem paralelne izmene infekcijom vektora ogleda u srčano izvedene ćelijske linije i ne-srčano izvedene ćelijske linije. Tipično, kontrolni vektor koji sadrži drugi reporter gen vođen putem poznatog promotera, n.pr.,Renillaluciferaza vođena sa SV40 ranim promoter/pojačivačem (pRL-SV40, Promega, Madison, Wl) je ko-izmenjen infekcijom zajedno sa vektorom ogleda da kontroliše varijacije u efikasnosti izmene infekcijom ili prevođenju reporter gena između različitih ćelijskih linija.
Alternativno, polinukleotidi kontrolnog regiona ekspresije korina vođeni transkripcijom mogu takođe biti detektovani direktnim merenjem količine RNK transkribovane iz reporter gena. U ovim realizcijama, reporter gen može biti bilo koja nukleinska kiselina koja se može transkribovati poznate sekvence koja nije drugačije ekspresovana od strane ćelije domaćina. RNK ekspresovana iz konstrukta polinukleotida kontrolnog regiona ekspresije korina može biti analizirana putem tehnika koje su poznate u nauci, n.pr., reverska transkripcija i pojačavanje mRNK, izolovanje ukupne RNK ili poli A<+>RNK,northernmrljanje, mrljanje tačke,in situhibridizacija, Rnaza zaštita, ekstenzija prajmera, tehnologija raspoređivanja polinukleotida velike gustine i slično.
Sposobnost sekvence polinukleotida kontrolnog regiona ekspresije korina da aktivira transkripciju se tipično procenjuje u odnosu na kontrlni konstrukt. U jednoj realizaciji, sposobnost polinukleotida kontrolnog regiona ekspresije korina da aktivira transkripciju se procenjuje upoređivanjem eskpresije reporter gena povezanog na polinukleotid kontrolnog regiona ekspresije korina sa ekspresijom identičnog reporter gena ne povezanog na takvu sekvencu. Tako, u pretpostavljenoj realizaciji, upoređuje se ekspresija luciferaze upoređena između pRL-SV40 i pRL-SV40 u kojoj su umetnute sekvence polinukleotida kontrolnog regiona ekspresije korina 5' luciferaza gena (videti Primer 2, Slika 4). U drugim realizacijama, aktivnost polinukleotida kontrolnog regiona ekspresije korina može biti upoređena sa poznatim promoterom. Tako, aktivnost reporter gena vođenog polinukleotidom kontrolnog regiona ekspresije korina se upoređuje sa aktivnošću reporter gena vođenog sa karakteizovanim promoterom (n.pr., SV40 promoter/pojačivač u pGL3-Kontrola, Promega, Madison, Wl).
Srčana specifičnost transkripcije usmerene putem kontrolnog regiona ekspresije korina se ocenjuje upoređivanjem transkripcije reporter gena u srčanim izvedenim i ne-srčanim izvedenim ćelijama. Odgovarajuće srčane izvedene ćelijske linije za ocenjivanje srčano specifične transkripcije su AT-1 (Clavcomb etal. (1998) Proc. Natl, Acad, Sci. 95:2979-2984), HL-1 (Lanson et al. (1992) Circulation 85:1835-1841), i HL-5 (Wu et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:16900-16905). Pretpostavljena ćelijska linija je HL-5 ćelijska linija. Bilo koja spremna sisarska ćelijska linija koja se može izmeniti infekcijom može biti upotrebljena da se ogleda aktivnost kontrolnog regiona ekspresije korina u ne-srčanim ćelijama (n.pr., HeLa ćelije, ATCC No. CCL2). U Primeru 3 (SI. 5), srčano specifična aktivnost oba humanih (hCp405LUC) i mišjih (mCp642LUC) polinukleotida kontrolnog regiona ekspresije korina se demonstrira upoređivanjem ekspresije svitac luciferaze iz vektora sa ili bez ovih fragmenata kontrolnog regiona ekspresije u HL-5 i HeLa ćelijskim linijama. Za svaki ogled, aktivnost kontrolnog regiona ekspresije korina je normalizovana prema aktivnosti promotera ko-izmenjenog infekcijom SV40 (odnosno, pGL3-Kontrola) prema kontroli za varijabilnost između ćelijskih linija.
Jednom kada se demonstrira srčano specifična transkripciona aktivnost u polinukleotidu kontrolnog regiona ekspresije korina, uklanjanjima, mutacijama, preraspoređivanjima, i drugim modifikacijama sekvence može se konstruisati i ogledati prema srčano specifičnoj aktivnosti u ogledima pronalaska. Takvi derivati polinukleotida kontrolnog regiona ekspresije korina su korisni da generišu kompaktnije promotere, da semanji pozadinska ekspresija u ne-srčanim ćelijama, da se eliminišu represivne sekvence, ili da se identifikuju novi srčano specifični transkripcioni regulatorni proteini. Humane i glodarske sekvence kontrolnog regiona ekspresije korina mogu biti upoređene da se identifikuju regulatorni elementi konzervisane transkripcije, uključujući one koji prenose srčano specifičnu ekspresiju.
Pod-fragmenti kontrolnog regiona ekspresije korina i derivati mogu biti konstruisani putem konvencionalnih rekombinantnih DNK postupaka
poznatih u nauci. Jedan takav postupak je da se generiše serija uklnojenih derivata u okviru sekvence kontrolnog regiona ekspresije korina (Primer 2). Upoređivanjem transkripcione aktivnosti serije za uklanjanje, elementi koji doprinose ili oduzimaju srčano specifičnoj aktivnosti mogu biti lokalizovani. Na osnovu ovakvih analiza, mogu se dizajnirati poboljšani derivati polinukleotida kontrolnog regiona ekspresije korina. Na primer, elementi kontrolnog regiona ekspresije korina mogu se kombinovati sa srčano specifičnim ili svuda prisutnim elementima iz heterologih promotera da se poveća srčana specifičnost ili aktivnost polinukleotida kontrolnog regiona ekspresije korina.
Vektori i ćelije domaćina
Sadašnji pronalazak se takođe odnosi na vektore koji uključuju polinukleotide sadašnjeg pronalaska, ćelije domaćina koje su genetički izgrađene sa vektorima pronalaska i proizvodnju polipeptida pronalaska rekombinantnim tehnikama. Takve tehnike su opisane kod Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainvievv, N.Y., 1989 i Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biologv, John Wiley & Sons, New York, N.Y., 1989.
Ćelije domaćina mogu biti genetski izgrađene da inkorporišu polinukleotide koji sadrže kontrolni region ekspresije korina sadašnjeg pronalaska kao i polinukleotide koji sadrže kontrolni region ekspresije korina operativno povezan za gene koji kodiraju korin i druge polipeptide, kao i da dopuste ekspresiju proizvoda kodiranog putem povezanog polinukleotida, n.pr., korina. Polinukleotidi mogu biti uvedeni u ćelije domaćina upotebom dobro poznatih tehnika infekcije, transdukcije, izmene infekcijom, transvektije i transformacije. Polinukleotidi mogu biti uvedeni sami ili sa drugim polinukleotidima. Takvi drugi polinukleotidi mogu biti uvedeni nezavisno, ko-uvedeni ili uvedeni pridruženi polinukleotidima pronalaska.
Tako, na primer, polinukleotidi pronalaska mogu biti izmenjeni infekcijom u ćelijama domaćina sa drugim, odvojenim, polinukleotidom koji kodira odabirljivi marker, upotrebom standardnih tehnika za ko-izmenu infekcijom i odabiranje u, na primer, sisarskim ćelijama. U ovom slučaju, polinukleotidi će generalno biti stabilno inkorporisani u genom ćelije domaćina.
Alternativno, polinukleotidi mogu biti pridruženi vektoru koji sadrži odabirljivi marker za propagiranje u domaćinu. Vektor konstrukt može biti uveden u ćelije domaćina putem ranije pomenutih tehnika. Generalno, plazmid vektor se uvodi kao DNK u talog, kao što je talog kalcijum fosfata, ili u kompleks sa napunjenim lipidom. Elektroporacija takođe može biti upotrebljena da se uvedu polinukleotidi u domaćina. Ukoliko je vektor virus, može biti spakovan in vitro ili uveden u ćeliju za pakovanje i spakovan virus može biti transdukovan u ćelije. Vrlo različite tehnike pogodne za pravljene polinukleotida i za uvođenje polinukleotida u ćelije u skladu sa ovim aspektom pronalaska su dobro poznate i rutinske za stručnjaka iz ove oblasti nauke. Takve tehnike su date kod Sambrook et al., koji citiran u gornjem tekstu, što je ilustrativno iz mnogih uputstava iz laboratorija koji daju do detalja ove tehnike. U skladu sa ovim aspektom pronalaska, vektor može biti, na primer, plazmid vektor, jedno ili dvostruko-vlaknasti faga vektor, jedno ili dvostruko-vlaknasti RNK ili DNK viralni vektor. Takvi vektori mogu biti uvedeni u ćelije kao polinukleotidi, pretpostavleno DNK, putem dobro poznatih tehnika za uvođenje DNK i RNK u ćelije. Vektori, u slučaju fage i viralnih vektora, takođe mogu biti pretpostavljeno uvedeni u ćelije kao spakovani ili kapsulirani virus putem dobro poznatih tehnika za infekciju i transdukciju. Viralni vektori mogu biti kompetentni za replikaciju ili defektivni za replikaciju. U potonjem slučaju viralno propagiranje će se generalno pojaviti samo u komplementnim ćelijama domaćina.
Pretpostavljeni među vektorima, u određenim pogledima, su oni za ekspresiju polinukleotida i polipeptida sadašnjeg pronalaska. Generalno, takvi vektori sa sastojo do cis-dejstvujućih kontrolnih regiona efektivnih za ekspresiju u domaćinu operativno povezani za polinukleotid koji se ima ekspresovati. Odgovarajući trans-dejstvujući faktori ili su snabdeveni od strane domaćina, snabedeveni komplementnim vektorom ili snabdeveni samim vektorom po uvođenju u domaćina.
Polinukleotidi kontrolnog regiona ekspresije korina pronalaska mogu biti umetnuti u vektor putem bilo koje od različitih dobro poznatih i rutinskih tehnika. Generalno, DNK sekvenca za ekspresiju se pridružuje vektoru ekspresije cepanjem DNK sekvence i vektora ekspresije sa jednom ili više endonukleaza restrikcije i potom zajedno pridružuje restrikcionim fragmentima upotrebom T4 DNK ligaze. Postupci za restrikciju i ligaciju koji se mogu upotrebiti na ovom kraju su dobro poznati i rutinski stručnjacima iz ove oblasti nauke. Odgovarajući postupci u ovom pogledu, i za konstruisanje vektora ekspresije upotrebom alternativnih tehnika, koji se takođe dobro poznate i rutinske stručnjacima iz ove oblasti nauke, su opisane detaljno kod Sambrook et al. Koje se ovde na drugom mestu citiran.
Upotrebe kontrolnog regiona ekspresije korina
Polinukleotidi kontrolnog regiona ekspresije korina sadašnjeg pronalaska su korisni za spefično ekspresovanje terapeutskih molekula u srčane izvedene ćelije. Srčano specifična ekspresija terapeutskih molekula se može upotrebiti, na primer, da se tretira kongestivna slabljenje srca, hipertenzija, i srčana hipertrofija. U skladu sa tim, vektori koji sadre terapeutske polinukleotide operativno povezane za polinukleotide kontrolnog regiona ekspresije korina sadašnjeg pronalaska mogu biti konstruisani i dati pacijentima da se tretiraju bolesti srca i da se razviju novi i unapređeni terapeutici.
Bilo koji terapeutski polinukleotid može biti operativno povezan sa polinukleotidom kontrolnog regiona ekspresije korina, uključujući ali ne limitirajući na, polinukleotid koji kodira korin. Tipično, polinukleotid kontrolnog regiona ekspresije korina je uključen u ekspresionu kasetu i umetnut 5' od terapeutskog polinukleotida koji se ima ekspresovati. Polinukleotidi kontrolnog regiona ekspresije korina mogu biti pozicionirani neposredno dodrino za terapeutski polinukleotid, iako pojačivački elementi polinukleotida kontrolnog regiona ekspresije korina mogu biti pozicionirani bilo gde u okviru nekoliko kilobaza od terapeutskog polinukleotida, uključujući i na 3' kraju terapeutskog polinukleotida i ukoviru introna. Sposobnost polinukleotida kontrolnog regiona ekspresije korina da prenosi srčano specifičnu transkripciju iz date pozicije može biti potvrđena po'zicioniranjem polinukleotida kontrolnog regiona ekspresije korina u odgovarajućoj konfiguraciji prema reporter genu, i ogledanjem aktivnosti srčano specifičnog reporter gena kao što je ovde opisano.
Polinukleotid kontrolnog regiona ekspresije korina može biti operativno povezan direktno za polinukleotid koji kodira terapeutski molekul bed dodatnih sekvenci. U realizacijama gde polinukleotid kontrolnog regiona ekspresije korina ne uključuje elemente iniciranja transkripcije korina, dodatni elementi kao što je TATA kućica i položaji iniciranja transkripcije treba da budu obezbeđeni. Ovo mogu biti bilo matični elementi iniciranja transkripcije terapeutskog gena, ili izvedni iz heterologog eukariotskog ili viralnog promotera. Dodatno, nivo terapeutske ekspresije gena može biti povećana uključivanjem pojačivača i sekvenci poliadenilacije iz terapeutskog gena ili iz heterologih gena, sve dok se održava srčana specifičnost ekspresije (mereno u ogledima pronalaska).
Vektori za izmenjene infekcijom srčane-izvedene ćelijein vitroiin vivo,postupci osiguravanja stalne ekspresije u srčanim-izvedenim ćelijamain vivo,postupci operativnog povezivanja terapeutskih polinukleotida za srčano specifične promotere, i postupci ciljanja vektorima na srčane ćelijein vitroiin vivo,putevi davanje, i doze za tretman bolesti srca sa terapeutskim vektorima mogu biti pronađeni kod Tank et al. (2002) Mthods 28:259-266; Phillips et al. (2002) Hvpertension 39:651-655; Prentice et al.
(1997) Cardiovas. Res. 35:567-574; Beggah AT et al. (2002) PNAS 99:7160-7165; Monte et al. (2003) J. Phvsiol. 546:49-61.
U skladu sa tim, polinukleotidi kontrolnog regiona ekspresije korina sadašnjeg pronalaska mogu biti upotrebljeni za srčano specifičnu ekspresiju različitih terapeutskih polinukleotida. Terapeutski polinukleotidi ekspresovani putem polinukleotida kontrolnog regiona ekspresije korina su bilo sami aktivni (n.pr., antisens i katalitički polinukleotidi) ili kodiraju protein koji će imati terapeutsku korisnost.
Ekspresija antisens i katalitičkih ribonukleotida. Jedan tip terapeutskog polinukleotida koji može biti ekspresovan putem polinukleotida kontrolnog regiona ekspresije korina je antisens RNK ili iRNK (Fire, A. (1999) Trends. Genet. 15:358-363; Sharp, P. (2001) Genes Dev. 15:485-490). U takvim realizacijama, polinukleotid kontrolnog regiona ekspresije korina je operativno vezan za polinukleotid koji je, kada se transkribuje putem ćelijskih RNK polimeraza, sposoban da se vezuje za ciljanu mRNK. Izvođenje antisens sekvence, zasnovano na cDNK sekvenci koja kodira ciljani protein je opisana, na primer, kod Stein & Cohen (1988) Cancer Res. 48:2659-68 i van der Krol et al. (1988) Bio Techniques 6:958-76. Ciljani protein će generalno biti protein čije se prisustvo smatra da doprinosi, ili povećava šanse za, srčanu bolest, n.pr., angiotenzin konvertujući enzim, angiotenzin II receptor ili NF-ATC (Stein et al. (1998) Amer. Heart J. 135:914-923; Levin etal. (1998) New Eng. J. Med. 339:321-328; Keating i Goa (2003) Drugs 63:47-70). Tako, srčano specifična ekspresija antisens molekula može pretpostavljeno smanjiti ekspresiju ovih proteina kod individua kod kojih postoji rizik. Uspešno korišćenje srčano specifične antisens ekspresije je opisana (Beggah AT et al. (2002) PNAS 99:7160-7165). Takav pristup se pokazao uspešnim u lečenju srčane fibroze i slabosti srca upotrebom srčano specifične ekspresije (Lee etal. (1966) Anticancer Res. 16:1805-11).
Dodatno antisens polinukleotidima, ribozomi mogu biti dizajnirani da inhibiraju ekspresiju ciljanih molekula. Ribozom je RNK molekul koji katalitički čepa druge RNK molekule. U skladu sa tim, polinukleotidi kontrolnog regiona ekspresije korina sadašnjeg pronalaska mogu biti upotrebljeni da ekspresuju ribozome specifično u srčano-izvedenim ćelijama putem vezivanja polinukleotida koji kodira ribozom za polinukleotid kontrolnog regiona ekspresije korina. Opisane su različite vrste ribozoma, uključujući ribozome grupe I, ribozome oblika glave čekića, ribozome oblika ukosnice, RNaza P, i ribozome oblika glave sekire (videti, n.pr., Castanotto et al. (1994) Adv. in Pharmacologv 25:289-317 za generalni pregled osobina različitih ribozoma). Opšte karakteristike ribozoma oblika ukosnice su opisane, n.pr., kod Hampel et al. (1990) Nucl. Acid Res. 18:299-304; Hampel et al., European Patent Publication No. 0 360 257 (1990); U.S. Patent No. 5,254,678. Postupci pripremanja ribozoma su dobro poznati stručnjacima iz ove oblasti nauke (videti, n.pr., VVong-Staal et al., WO 94/26877; Ojvvang et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6340-44; Yamada et al. (1994) Hum. Gene Ther. 1:39-45; Laevitt et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:699-703; Laevitt et al.
(1994) Hum. Gene Ther. 5:1115-20; i Yamada et al. (1994) Virology 205:121-26).
Ekspresija terapeutskih proteina: Vrlo različiti terapeutski proteini se mogu upotrebljavati da tretiraju bolesti srca. U skladu sa tim, polinukleotid kontrolnog regiona ekspresije korina sadašnjeg pronalaska mogu se upotrebiti da ekspresuju polinukleotide koji kodiraju terapeutske proteine specifično u srčanim ćelijama. Terapeutski proteini mogu biti prokariotskog, eukariotskog, viralnog, ili sintetičkog porekla. Gde terapeutski protein nije sisarskog porekla, kodirajuća sekvenca proteina može biti modifikovana za maksimalnu sisarsku ekspresiju prema postupcima poznatim u nauci (n.pr., upotreba sisarskog kodona i saglasni položaji iniciranja translacije).
Terapeutski proteini mogu biti operativno vezani za polinukleotide kontrolnog regiona ekspresije korina da se dopusti srčano specifična ekspresija i bude uspešno uposlena da se tretira bolest srca bilo koje etiologije, uključujući (ali ne limitirajući na) ishemičnu bolest srca, hipertenzivnu bolest srca, valvularnu bolest srca, miokarditis, Chagas kardiomiopatiju i idiopatsku kardiomiopatiju. Takvi terapeutski proteini uključuju, ali nisu limitirani na, proteine kao što je korin, koji konvertuje pro-atrijalni natiuretički peptid (pro-ANP) u ANP, ANP, koji smanjuje zapreminu krvi i pritisak promovisanjem sekrecije natrijuma i vazodilacijom, i B-tip natriuretički peptid, (Stein etal. (1998) Amer. Heart J. 135:914-923; Levin et al. (1998) New Eng. J. Med. 339:321-328; Keating i Goa (2003) Drugs 63:47-70), kao i negativne dominantne forme takvih gena, odnosno korin (Wu et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:16900-16905).
Identifikacija modulatora ekspresije korina
Polinukleotidi kontrolnog regiona ekspresije korina sadašnjeg pronalaska mogu biti upotrebljeni da identifikuju nove modulatore koji su korisni u kontroli srčano-povezanih bolesti kod sisara, posebno ljudi, čiji su primeri kardiovaskularna hipertenzija, kongestivna slabost srca, ili kardiomiopatija. Takvi modulatori su korisni u lečenju domaćina sa abnormalnim nivoima ekspresije korin gena. Korin gen modulatori mogu takođe biti upotrebljeni da tretiraju bolesti i stanja na koje utiče nivo ekspresije korin gena, kao što su, ali nisu limitirani na, mehanički naprezanje, zapremina krvi, izlučivanje soli, urinarni prinos, i vazomotorni ton. Modulatori su takođe korisni kod mimikiranih humanih bolesti ili stanja kod životinja koje se odnose na nivo ekspresije odabranih polipeptida.
Specifično, agensi koji se vezuju za modulat takve ekspresije mogu biti identifikovani putem njihove sposobnosti da izazovu promenu u transkripcionom nivou reporter gena, n.pr. luciferaze, koji je operativno vezan za polinukleotid kontrolnog regiona ekspresije korina, kao što je ranije opisano (Videti Primer 2).
Agensi koji se ogledaju u gornjem postupku mogu biti nasumice odabrani ili racionalno odabrani ili dizajnirani. Kako se to ovde koristi, za agens se kaže da je nasumice odabran kada je agens odabran nasumice bez razmatranja bilo koje specifične sekvence. Primer nasumice odabranih agenasa je upotreba hemijske biblioteke ili čorbe rasta ekstrakta organizma ili biljke (Bunin, et al. (1992) J. Am. Chem. Soc. 114:10997-10998 i tamo kombinovane reference).
Kako se to ovde koristi, za agens se kaže da je racionalno odabran ili dizajniran kada je agens odabran na nenasumičnoj osnovi koja uzima u obzir sekvencu ciljanog položaja i/ili njegovu saglasnost u vezi sa dejstvom agensa.
Genska terapija
Sadašnji pronalazak obezbeđuje polinukleotide kontrolnog regiona ekspresije korina koji mogu biti izmenjeni infekcijom u ćelijama u terapeutske svrhein vitroiin vivo.Ove nukleinske kiseline mogu biti umetnute u bilo koji od brojnih dobro poznatih vektora za izmenjenu infekciju ciljanih ćelija i organizama kao što je dole opisano. Nukleinske kiseline se transferišu u ćelije,ex vivoiliin vivo,kroz interakciju vekora i ciljane ćelije. Tipično, operativna veza polinukleotida kontrolnog regiona ekspresije korina i drugog, terapeutski korisnog, polinukleotida izaziva srčano specifičnu ekspresiju drugog polinukleotida. Sastavi se daju pacijentu u količini dovoljnoj da izazove terapeutski odgovor pacijenta. Adekvatna količina da se postigne ovo je definisana kao "terapeutski efektivna doza ili količina".
Takvi postupci genske terapije se upotrebljavaju da isprave stečene i nasleđene genetske defekte, kancere, i viralne infekcije u brojnim kontekstima. Sposobnost da se ekspresuju terapeutski korisni veštački geni kod ljudi potpomaže prevenciju i/ili lečenje mnogih vašnih humanih bolesti, uključujući mnoge bolesti koje nisu odgovorne za lečenje putem drugih terapija (za pregled postupaka genske terapije, videti Anderson
(1992) Science 256:808-13; Nabel & Felgner, TIBTECH (1993), Vol. 11, pp. 211-17; Mitani & Caskev, TIBTECH (1993), Vol. 11, pp. 162-66; Milligan, Science (1993), Vol. 260, pp. 926-32; Dillon, TIBTECH (1993), Vol. 11, pp. 167-75; Miller, Nature (1992), Vol. 357, pp. 455-60; Van Brunt, Biotechnologv (1998), Vol. 6, pp. 1149-54; Vigne, Restorative Neurol. Neurosci. (1995), Vol. 8, pp. 35-36; Kremer & Perricaudet, British Medical Bulletin (1995), Vol. 51, pp, 31-44; Haddada et al., in Current Topisc in Microbiologv and Immunologv (Doerfler & Bohm eds., 1995); i Yu et al., Gene Therapy (1994), Vol. 1, pp. 13-26).
Isporuka gena ili genetičkog materijala u ćeliju je prvi korak u na genskoj terapiji zasnovanom tretmanu bolesti. Veliki broj postupaka isporuke je dobro poznat stručnjacima iz ove oblasti nauke. Pretpostavljeno, nukleinske kiseline se daju zain vivoi exvivoupotrebe genske terapije. Sistemi isporuke ne-viralnog vektora uključuju DNK plazmide, gole nukleinske kiseline, i nukleinske kiseline kompleksovane sa nosačem isporuke kao što je lipozom. Sistemi isporuke viralnog vektora uključuju DNK i RNK viruse, koji su bilo epizomalni il integrisani genom posle isporuke u ćeliju.
Postupci ne-viralne isporuke nukleinskih kiselina uključuju lipofekciju, mikro-ubrizgavanje, biolistiku, virozom, lipozome, imunolipozome, polikatjon ili lipid: kojugate nukleinske kiseline, golu DNK, veštačke virione, i agensom pojačanu resorbciju DNK. Lipofekcija je opisana kod, n.pr., U.S. Patent Nos. 5,049,386, 4,946,787; i 4,897,355, i reagenski lipofekcije se komercijalno prodaju (n.pr., Transfectam™ i Lipofectin™). Katjonski i neutralni lipidi koji su pogodni za efikasno receptor-prepoznavanje lipofekcije polinukleotida uključuju one od Felgner-a, WO 91/17424 i WO 91/16024. Isporuka može ići ka ćelijama(ex vivodavanje) ili ciljanim tkivima( in vivodavanje).
Pripremanje lipida: kompleksi nukleinske kiseline, uključujući ciljane lipozome kao što su imunolipid kompleksi, su dobro poznati stručnjaku iz
ove oblasti nauke (videti, n.pr., Crvstal, Science (1995), Vol. 270, pp. 404-10; Blaese etal., Cancer Gene Ther. (1995) Vol. 2, pp. 291-97; Behretal., Bioconjugate Chem. (1994), Vol. 5, pp. 382-89; Remy et al., Bioconjugate Chem. (1994), Vol. 5, pp. 647-54; Gao et al., Gene Therapy (1995), Vol. 2, pp. 710-22; Ahmad etal., Cancer Res. (1992), Vol. 52, pp. 4817-20; U.S.
Patent Nos. 4,186,183, 4,217,344, 4,235,871, 4,261,975, 4,485,054, 4,501,728, 4,774,085, 4,837,028, i 4,946,787).
Upotreba RNK i DNK viralno baziranih sistema za isporuku nukleinskih kiselina imaju prednost krajnje razvijenih postupaka za ciljanje virusa do specifičnih ćelija u telu i saobraćaju viralnog punjenja na nukleus. Viralni vektori mogu biti dati direktno pacijentima( in vivo)ili mogu biti upotrebljeni da se tretiraju ćelijein vitroi modifikovane ćelije se daju pacijentima(ex vivo).Konvencionalni viralno bazirani sistemi isporuke nukleinskih kiselina mogu da uključe retroviralne, lentivirus, adenoviralne, adano-povezane i herpes simplex virus vektore za genski transfer. Viralni vektori su trenutno najefikasniji i raznovrsniji postupak genskog transfera u ciljane ćelije i tkiva. Integracija u genomu domaćina je moguća sa retrovirus, lentivirus, i adeno-povezanim virus postupcima genskog transfera, često rezultirajući u dugotrajnoj ekspresiji umetnutog transgena. Dodatno, visoke efikasnosti transdukcije su primećene u mnogim različitim ćelijskim tipovima i ciljanim tkivima. Posebno, bar šest prilaza viralnog vektora su trenutno dostupni za genski transfer u kliničkim probama, sa retroviralnim vektorom ubedljivo najčešće upotrebljavanim sistemom. Svi ovi viralni vektori iskorištavaju prilaze koji uključuje komplementaciju defektivnih vektora putem gena umetnutih u pomoćnu ćelijsku liniju da se generiše agens za transdukovanje.
Tropizam retrovirusa može biti izmenjen inkorporisanjem stranih uvijenih proteina, širenjem potencijalne ciljane populacije ciljanih ćelija. Lentiviralni vektori su retroviralni vektori koji su sposobni da transdukuju ili inficiraju ne-deljive ćelije i tipično proizvode visoke viralne titere. Odabiranje retroviralnog sistema genskog transfera će zbog toga zavisiti od ciljanog tkiva. Retroviralni vektori se sastoje od cis-delujućeih dugih krajnjih ponavljanja sa kapacitetom pakovanja do oko 6-10 kbp strane sekvence. Minimum cis-delućih LTR-ova je dovoljan za replikaciju i pakovanje vektora, koji se onda upotrebljavaju da integrišu terapeutski gen u ciljanu ćeliju da se obezbedi permanentna trangena ekspresija. Široko upotrebljavani retroviralni vektori uključuju one bazirane na mišjem virusu leukemije (MuLV), virusu leukemije gibon majmuna (GaLV), simian virusu imunonedostatka (SIV), humanom virusu imunonedostatka (HIV), i njihovim kombinacijama (videti, n.pr., Buchscher et al., J. Virol. (1992), Vol. 66, pp. 2731-39; Johann et al., J. Virol. (1992), Vol. 66, pp. 1635-40; Sommerfeltetal., Virology (1990), Vol. 176, pp. 58-59; VVilson etal., J. Virol. (1989), Vol. 63, pp. 2374-78; Miller et al. J. Virol. (1991), Vol. 65, pp. 2220-24; PCT/US94/05700).
pLASN i MFG-S su primeri retroviralnih vektora koji se koriste u kliničkim probama (Dunbar et al., Blood (1995), Vol., 85, pp. 3048-57; Kohn et al., Nat. Med. (1995), Vol. 1, pp. 1017-23; Malech et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1997), Vol. 94, pp.12133-38). PA317/pl_ASN je prvi terapeutski vektor koji se upotrebljavao u probama genske terapije (Blaese et al., Science (1995), Vol. 270, pp. 475-80). Efikasnosti transdukcije od 50% ili više su primećene za MFG-S pakovane vektore (Ellem et al., Immunol. Immunother. (1997), Vol. 44, pp.10-20; Dranoff et al., Hum. Gene Ther.
(1997), Vol. 1, pp. 111-23).
U primenama gde je pretpostavljena prolazna ekspresija nukleinske kiseline, adenoviralno bazirani sistemi se tipično upotrebljavaju. Adenoviralno bazirani vektori su sposobni za vrlo veliku efikasnost transdukcije u mnogim ćelijskim tipovima i ne zahtevaju deobu ćelije. Sa takvim vektorima, dobijaju se visoki titer i nivoi ekspresije. Ovaj vektor može biti proizveden u velikim količinama u relativno prostom sistemu. Adeno-povezani virus ("AAV") vektori se takođe upotrebljavaju da transdukuju ćelije sa ciljanim nukleinskim kiselinama, n.pr., uin vitroproizvodnji nukleinskih kiselina i peptida, i zain vivoiex vivopostupke genske terapije (videti, n.pr., West et al., Virologv (1987), Vol. 160, pp. 38-47; U.S. Patent No. 4,797,368; WO 93/24641; Kotin, Hum. Gene Ther.
(1994), Vol. 5, pp. 793-801; Muzvczka, J. Clin. Invešt. (1994), Vol. 94, pp. 1351). Konstrukcija rekombinantnih AAV vektora je opisana u brojnim publikacijama, uključujući U.S. Patent No. 5,173,414; Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. (1985), Vol. 5, pp. 3251-60; Tratschin et al., Mol. Cell. Biol.
(1984), Vol 4, pp. 2072-81; Hermonat & Mazvczka, Proc. Natl. Adac. Sci. USA (1984), Vol. 81, pp. 6466-70; i Samulski et al., J. Virol. (1989), Vol. 63, pp. 3822-28.
Rekombinantni adeno-povezani virus vektori (rAAV) su obećavajuća alternativa sistemu isporuke gena na defektivnim i ne-patogenim parvovirusima adeno-povezanog tipa 2 virusa. Svi vektori su izvedeni iz plazmida koji zadržava samo AAV 145 bp invertovana krajnja ponavaljanja napadajući s boka transgenu kasetu ekspresije. Efikasni genski transfer i stabilna transgena isporuka usled integracije u genome transdukovane ćelije su ključne karakteristike za ovoj vektorski sistem (VVagner et al., Lancet (1998), Vol. 351. pp. 1702-03; Kearns etal., Gene Ther. (1996), Vol. 9, pp. 748-55).
Replikacijom-deficitarni rekombinantni adenoviralni vektori (Ad) se predominantno upotrebljavaju u prolaznoj ekspresiji genske terapije, pošto oni mogu biti proizvedeni pri visokom titru i spremno inficiraju brojne različite ćelijske tipove. Najveći broj adenovirus vektora su napravljeni tako da transgen zamenjuje Ad E1a, E1b, i E3 gene; posle se replikacijom defektni vektor propagira u humanim 293 ćelijama koje snabedevaju funkciju uklonjenog gena u trans. Ad vektori mogu da transdukuju višestruke tipove tkivain vivo,uključujući nedeljive, diferencirane ćelije kao što su one koje se pronalaze u jetri, bubregu i mišićnom sistemu tkiva. Konvencionalni Ad vektori imaju veliki kapacitet nošenja. Primer upotrebe Ad vektora u kliničkoj probi uključuje polinukleotid terapiju za antitumornu imunizaciju sa intramuskularnim ubrizgavanjem (Sterman et al., Hum. Gene Ther. (1998), Vol. 9, pp. 1083-92). Dodatni primeri upotrebe adenovirus vektora za genski transfer u kliničkim probama uključuju Roseneckeretal., Infection (1996), Vol. 241, pp. 5-10; VVelsh etal., Hum. Gene Ther. (1995), Vol. 2, pp. 205-18; Alvarez et al., Hum. Gene Ther.
(1997). Vol. 5, pp. 597-613; Topf etal., Gene Ther. (1998), Vol. 5, pp. 507-13; Sterman etal., Hum. Gene Ther. (1998), Vol. 9, pp. 1083-89.
U mnogim primenama genske terapije, poželjno je da vektor genske terapije bude isporučen sa visokim stepenom specifičnosti određenom tipu tkiva. Viralni vektor je tipično modifikovan da ima specifičnost za dati ćelijski tip putem ekspresije liganda kao fuzinog proteina sa viralnim proteinom kao oblogom na spoljnoj površini virusa. Ligand je izabran da ima fainitet za receptor poznat da je prisutan u ćelijskom tipu od interesa. Na primer, Han et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995), Vol. 92, pp. 9747-51, izveštava da Molonev mišji leukemija virus može biti modifikovan da ekspresuje humani heregulin spojen za gp70, i rekombinantni virus inficira određene humane ćelije kancera dojke eksprsujući humani epidermalni receptor faktora rasta. Ovaj princip se može proširiti na druge parove virusa koji ekspresuju ligand fuzionog proteina i ciljanu ćeliju koja ekspresuje receptor. Na primer, filamentna faga može biti izgrađena da pokaže fragmente antitela (n.pr., Fab ili Fv) koji imaju specifični afinitet vezivanja za bukvalno bilo koji izabrani ćelijski receptor. lako se gornji opis primenjuje primarno na viralne vektore, isti principi mogu biti primenjeni na neviralne vektore. Takvi vektori mogu biti izgrađeni da sadrže specifične sekvence unosa da pogoduju unosu putem specifičnih ciljanih ćelija.
Farmaceutski sastavi i davanje
Sadašnji pronalazak se takođe odnosi na farmaceutske sastave koji mogu da se sastoje od kontrolnog regiona ekspresije korina, ili vektora koji sadrži kontrolni region ekspresije, u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljvim nosačem. U jednoj realizaciji sadašnjeg pronalaska, farmaceutski prihvatljivi nosač je farmaceutski inertan.
Vektori genske terapije mogu biti isporučeniin vivoputem davanja individualnom pacijentu, tipično putem sistemskog davanja (n.pr., intravenozno, intraperitonelno, intramuskularno, subdermalno, ili intrakranijalnom infuzijom) ili mesnim davanjem, kao što je dole opisano. Alternativno, vektori mogu biti isporučeni ćelijamaex vivo,kao što su ćelije eksplantirane iz individualnog pacijenta (n.pr., limfociti, usisane koštane srži, biopsija tkiva) ili univerzalnim davaocem hematopoetičkih stem ćelija, praćeno reimplantacijom ćelija u pacijenta, uobičajeno posle odabiranja ćelija koje su inkorporisale vektor.
Izmena infekcijom exvivoćelije za dijagnosticiranje, istraživanje ili za gensku terapiju (n.pr. putem re-infuzije ćelija izmenjenih infekcijom u organizam domaćina) je dobro poznata stručnjacima iz ove oblasti nauke. U pretpostavljenoj realizaciji, ćelije se izoluju iz organizma subjekta, izmene infekciojom sa nukleinskom kiselinom (gen ili cDNK), i re-infuzuju nazad u organizam subjekta (n.pr., pacijent). Različiti ćelijski tipovi koji odgovaraju za exvivoizmenu infekcijom su dobro poznati stručnjacima iz ove oblasti nauke (videti, n.pr., Freshnev et al., Sulture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique (3rd ed., 1994)) i reference koje su ovde citirane za razmatranje kako da se izoluju i kultivišu ćelije iz pacijenata).
Vektori (n.pr., retrovirusi, adenovirusi, lipozomi, itd.) koji sadrže nukleinske kiseline mogu takođe biti date direktno organizmu za transdukciju ćelijain vivo.Alternativno, može se dati gola DNK. Davanje se putem bilo kog od puteva normalno upotrebljavaju za uvođenje molekula u krajnji kontakt sa krvlju ili tkivom ćelija. Odgovarajući postupci davanja takvih nukleinskih kiselina su dostupni i dobro poznati stručnjacima iz ove oblasti nauke, i, iako se može upotrebiti više nego jedan put da se da određeni sastav, određeni put može često da obezbedi trenutniju i efektivniju reakciju nego neki drugi put.
Farmaceutski prihvatljivi nosači su utvrđeni delom određenim sastavom koji se daje (n.pr., nukleinska kiselina, protein, modulatorna jedinjenja ili transdukovana ćelija), kao i putem određenog postupka koji se upotrebljava da se sastava da. U skladu sa tim, postoje vrlo različite odgovarajuće formulacije farmaceutskih sastava sadašnjeg pronalaska (videti, n.pr., Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., 1989). Davanje može biti na bilo koji konvencionalni način, n.pr., putem ubrizgavanja, oralnog davanja, inhalacije, ili transdermalne primene.
Formulacije koje su pogodne za oralno davanje mogu da se sastoje od: (a) tečnih rastvora, kao što je efektivna količina pakovane nukleinske kiseline suspendovana u razblaživaču, kao što je voda, slani rastvor ili PEG 400; (b) kapsule, kesice ili tablete, od kojih svaka sadrži prethodno utvrđenu količinu aktivnog sastojka, kao tečnosti, čvrste materije, granule ili želatin; (c) suspenzije u odgovarajućoj tečnosti; i (d) odgovarajuće emulzije. Forme tablete mogu da uključe jedno ili više od sledećeg: laktoza, saharoza, manitol, sorbit, kalcijum fosfati, kukuruzni škrob, krompirom škrob, mikrokristalnu celulozu, želatin, koloidni silicijum dioksid, talk, magnezijum stearat. stearinska kiselina, i drugi inertni punioci, sredstva za bojenje, punioci, vezivna sredstva, razređivači, agensi puferovanja, agensi vlaženja, prezervativi, agensi za davanje ukusa, boje, agensi za dezintegraciju, farmaceutski kompatibilni nosači. Oblici pastile mogu da sadrže aktini sastojak u ukusu, n.pr., saharozi, kao i pstile koje sadrže aktivni sastojak koji u inertnoj bazi, kao što je želatin i glicerin ili sagaroza i emulzije akacije, gelovi i slično koji sadrže dodatno aktivnom sastojku, nosače poznate u nauci.
Jedinjenje od izbora, samo ili u kombinaciji sa drugim odgovarajućim komponentama, može biti sačinjeno u aerosol formulaicije (odnosno, mogu biti "raspršeni") kako bi se dali putem inhalacije. Formulacije aerosola mogu biti postavljene u odgovarajuće reaktivno gorivo pod pritiskom, kao što je dihlorodifluorometan, propan, azot, i slično.
Formulacije koje odgovaraju za parenteralno davanje, kao što su, na primer, intraartikularnim (u džointima), intravenoznim, intramuskularnim, intradermalnim, intraperitonelnim, potkožnim putevima davanja, uključuju vodene i ne-vodene, izotonične sterilne rastvore za ubrizgavanje, koji mogu da sadrže antioksidante,pufere, bakteriostate, i rastvorljiva sredstva koji čine formulaciju izotoničnom sa krvlju primaoca kome se namerava dati, vodene i ne-vodene sterilne suspenzije koje uključuju supsenzivna sredstva, rastvarače, sredstva za oblaganje, stabilizatore, i prezervative.
U praksi ovog pronalaska, sastavi mogu biti dati, na primer, intravenoznom infuzijom, oralno, mesno, intraperitonelno, intravezikalno ili intratrahealno. Parenteralno davanje i intravenozno davanje su pretpostavljeni postupci davanja. Formulacije sastava mogu biti prezentovane u jediničnoj dozi ili multi dozi zapečaćene u kontejnere, kao što su ampule ili sudovi.
Rastvori za ubrizgavanje i suspenzije mogu biti pripremljene iz sterilnih pudera, granula, i tableta prethodno opisanih vrsta. Transdukovane ćelije putem nukleinskih kiselina exvivoterapijom mogu takođe biti date intravenozno ili parenteralno kao stoje gore opisano.
Data doza pacijentu, u kontekstu sadašnjeg pronalaska treba da bude dovoljna da izazove korisni terapeutski odgovor u pacijentu tokom vremena. Doza će se utvrditi putem efikasnosti određenog vektora koji se upošljava i stanja u kome je pacijent, kao i prema telesnoj težini ili površinskoj oblasti pacijenta koja se ima tretirati. Veličina doze će takođe biti utvrđena postojanjem, prirodom, i razmerom bilo kog od sporednih efekata koji su pridruženi davanju određenog vektora, ili transdukovanog ćelijskog tipa u određenom pacijentu.
U utvrđivanju efektivne količine vektora koji se ima dati, lekar procenjuje nivoe cirkulišuće plazme vektora, toksičnosti vektora, progresiju bolesti, i proizvodnju anti-vektor antitela. Uopšteno, ekvivalent doze gole nukleinske kiseline iz vektora je od oko 1 ?ig do 100^g za tipičnog pacijenta težine 70 kg, i doze vektora koje uključuju retroviralnu česticu se izračunavaju da daju prinos ekvivalentan količini terapeutske nukleinske kiseline.
Za davanje, jedinjenja i transdukovane ćelije sadašnjeg pronalaska mogu biti date u odnosu utvrđenom sa LD-50 inhibitora, vektora ili transdukovanog ćelijskog tipa, i sporednim dejstvima inhibitora, vektora ili ćelijskog tipa pri različitim koncentracijama, kako se primenjuje težinu i ukupno zdravljen pacijenta. Davanje može biti postignuto putem jedinične ili podeljenih doza.
Pribori
Sadašnji pronalazak se dalje odnosi na framaceutska pakovanja i pribore kojise sastoje od jednog ili više kontejnera napunjenih sa jednim ili više sastojaka ranije pomenutih sastava pronalaska. Povezano sa takvim kontejnerom(ima) može biti upozorenje u obliku propisanom od strane vladine agencije koja reguliše proizvodnju, upotrebu i prodaju famraceutskih sredstava ili bioloških proizvoda, koje se odnosi na dozvolu od strane agencije za proizvodnju, upotrebu i prodaju proizvoda za humano davanje.
Transgeni miševi
Polinukleotidi kontrolnog regiona ekspresije korina sadašnjeg pronalaska mogu takođe biti upotrebljeni da proizvedu trangene sisare pretpostavljeno miša. Takav trangeni organizam je koristan, na primer, za identifikovanje i/ili karakterizaciju agenasa koji moduliraju ekspresiju i/ili aktivnost takog polinukleotida. Trangene životinje su takođe korisne kao modeli stanja bolesti srca. Pronalazak otkriven ovde takođe se odnosi na ne-humanu transgenu životinju koja sadrži u okviru svog genoma jednu ili više kopija polinukleotida pronalaska. Transgene životinje pronalaska mogu sadržati u okviru svog genoma višestruke kopije polinukleotida.
U pretpostavljenoj realizaciji, trangena životinja sadrži u okviru svog genoma kontrolni region ekspresije humanog korin gena. Različiti ne-humani transgeni organizmi su obuhvaćeni ovim pronalaskom, uključujući, n.pr., drozofilu, C.elegans, zebraribu i kvasac. Transgene životinja pronalaska je pretpostavljeno sisar, n.pr., krava, koza, ovca, zec, ne-humani primat, ili pacov, najpoželjnije miš.
Postupci za proizvodnju transgenih životinja su u okviru znanja stručnjaka iz ove oblasti nauke, i uključuju, homologu rekombinaciju, mutagenezu (n.rp., Rathkolb et al. (2000) Exp. Phvsiol., 85:635-644), i tetraciklinom regulisanog sistema ekspresije gena (n.pr., U.S. Pat. No. 6,242,667), i ovde neće biti detalno opisan. (Videti n.pr., Wu et al, Methods in Gene Biotechnologv, CRC 1997, pp.339-366; Jacenko, 0., Strategies in Generatin Transgenic Animals, in Recombinant Gene Expression Protocols, Vol. 62 of Methods in Molecular Biologv, Human Press, 1997, pp 399-424). Sadašnji pronalazak se takođe odnosi na ne-humanu onesvešćenu životinju čiji genom sadrži kontrolni region ekspresije humanog korin gena koji je operativno vezan za reporter sekvencu i pri čemu je navedeni kontrolni region efektivan da inicira, zaustavi, ili reguliše transkripciju reporter sekvence.
Funkcionalni prekid reporter sekvence operativno vezane sa kontrolnom sekvencom može biti postignut na bilo koji efektivni način, uključujući, n.pr., uvođenje stop kodona u bilo koji deo kodirajuće sekvence tako da je rezultirajući polipeptid biološki neaktivan (n.pr., usled toga što mu nedostaje katalitički domen, domen za vezivanje liganda, itd.), uvođenje mutacije u promoter ili drugu regulatornu sekvencu koja je efektivna daje isključi, ili smanji transkripciju reporter sekvence egzogene sekvence u reporter sekvencu koja ga inaktivira. Primeri transgenih životinja koji imaju funkcionalno prekinute gene su dobro poznati, n.pr., kao što je opisano u U.S. Patent Nos. 6,239,326, 6,225,525, 6,207,878.
Bez daljeg elaboriranja, veruje se da stručnjak iz ove oblasti nauke može, upotrebom prethodnih opisa, iskoristiti sadašnji pronalazak do njegovih krajnih granica. Svi primeri se obavljaju upotrebom standardnih tehnika, koje su dobro poznate u nauci, osim gde drugačije nije opisano detaljno. Rutinske tehnike molekularne biologije sledećih primera mogu biti obavljene kao što je opisano u standardnim laboratorijskim priručnicima, kao što je Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratorv Manual, 2nd Ed.; Cold Spring Harbor, N.Y., 1989.
Sledeće pretpostavljene specifične realizacije, prema tome, treba da se razumeju samo kao ilustrativne, a ne limitirajuće na bilo koji način. Ukupno otkriće svih primena, patenata, i publikacije koje su gore citirana su ovde inkorporisan putem reference.
Primer 1: Izolovanje i karakterizacija humanih i mišjih korin gena uključujući 5'-bočne regione
Sintetišu se klon humanih i mišjih korin gena i njihovih 5'-bočnih regiona, specifični oligonukleotidi koji odgovaraju 5'- i 3'- završetcima korin cDNK sekvenci. Ovi oligonukleotidni prajmeri se testiraju na pojačavanje specifičnih proizvoda u PCR-baziranim reakcijama upotrebom humane i mišje genomne DNK. PCR reakcije se obavljaju upotrebom PCR Reagens sistema (Life Technologies Inc.) sa 30 ciklusa pojačavanja (1-rmin denaturisanje na 94°C, 1-min prekaljivanja na 50°C, i 1-min produženje na 72°C) i konačno 7-min produženje na 72°C. Parovi prajmera koji uspešno pojačavaju specifične PCR proizvode se onda koriste u na PCR-zasnovanom pretraživanju da se identifikuju BAC klonovi koji sadrže humani mišji korin gen i/ili njihova kontrolni regioni ekspresije. DNK izolovanje iz BAC klonova se obavlja prema proizvođačkim uputstvima (lncyte Genomics, Palo Alto, CA). Identifikovahi klonovi pozitivnih bakterijskih veštačkih hromozoma (BAC) se dalje potvrđuju upotrebomSouthernanalize upotrebom<32>P-označenih humanih i mišjih korin DNK proba. BAC klonovi se bilo direktno sekvenciraju putem otvorene strategije ili podkloniraju u pUC118 (PanVera/Takara, Madison, Wl) za sekvenciranje. Sakupljanje otvorenih sekvenci se obavlja upotrebom Staden softver paketa (MRC Laboratorv of Molecular Biologv; Bonfield et al. (1995) Nucleic Acid Res. 23:4992-4999).
Četiri BAC klona, od kojih svaka dva sadrže humane i mišje korin gene, se dobijaju putem na PCR-baziranog pretraživanja. Tri BAC klona se sekvenciraju putem otvorene strategije upotrebom hernije ukidanja boje. Kombinacija otvorenih podataka sa javno dostupnim informacijom preko fajla za traženje ( http:// www. ncbi. nim. nih. qov:80/ Traces/ trace. cgi, http:// trace. ensembl. org), dodirne sekvence od 340 kb koje sadrže humani korin gen, i 5 dodirnih sekvenci za mišji korin gen se sakupljaju.
Poredak 5 dodirnih sekvenci se potvrđuje postojanjem nekoliko udruženih parova za čitanje u pogledu susednih dodirnih sekvenci. Njihove distance dopuštaju nam da utvrdimo veličinu praznine da bude manje od 500 bp, pošto je veličina umetka javnih otvorenih biblioteka dobro definisana. Strukture humanih i mišjih korin gena se onda analiziraju. 340-kb humana genomna sekvenca, a ipak, ne sadrži 5'-bočni region. Dodatni 4165 bp Hind lll-EcoR I fragment se izoluje iz BAC 26540, koji uključuje privi 3919 pb 5'-bočnog regiona, sve od eksona 1 i deo introna 1 (podneseno kod GenBank™/EBI data Bank sa ulaznim brojem AF521006).
Polinukleotidi kontrolnog regiona eskpresije korina (SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 i SEQ ID NO: 6) su svi izvedeni iz 4165 bp Hind lll-EcoR I fragmenta (Slika 8, SEQ ID NO: 2) izolovanog iz BAC26540, upotrebom PCR-baziranog postupka, ili varenjem restrikcionog enzima, ili kombinacijom oba. Na primer, ovde opisani 4023 bp polinukleotid kontrolnog regiona ekspresije korina (SEQ ID NO: 6) se pojačava iz 4165 pb Hind lll-EcoR I fragmenta ili humane genomne DNK upotrebom priajmera F1 (5-AAGCTTCATGAGGGCAGGAG-3') (SEQ ID NO: 7) i R1 (5'-GAGCTCGCTTATTCTTCTGTCCACTT-3') (SEQ ID NO: 8). Ovde opisani 1283 pb polinukleotid kontrolnog regiona ekspresije korina (SEQ ID NO: 5) se pojačava iz 4165 pb Hind lll-EcoR I fragmenta ili humane genomne DNK upotrebom prajmera F2 (5-AAGCTTATAAAAATAATAGCTTCTTC-3') (SEQ ID NO: 9) i R1. Ovde opisani 391 bp polinukleotid kontrlonog regiona ekspresije korina (SEQ ID NO: 4) se pojačava iz 4165 pb Hind lll-EcoR I fragmenta ili humane genimne DNK upotrebom prajmera
F3 (5'-AAGCTTAGTAACTCTTTTGCTCCCAA-3') (SEQ ID NO: 10) i R1. Bilo koje sisarsko tkivo kao što su leukociti iz kojih DNK može biti lako ekstrakovana je pogodan izvor genomne DNK za izolovanje sisarskih korin polinukleotida.
Primer 2: Aktivnost promotera 5'-bočnih regiona
Aktivnost promotera 5'-bočnih regiona korin gena se ispituje pripremanjem reporter konstrukata u kojima su serijski skraćeni fragmenti 5'-bočnih sekvenci humanih ili mišjih korin gena vezani za luciferaza gen koji je bez promotera (videti Sliku 4A). Reporter konstrukti humanog gen promotera, hCp1297LUC (1283 bp kontrolni regiofi ekspresije korina (SEQ ID NO:5 ) vezan za svitac luciferaza gen) i hCp405LUC (391 bp kontrolni region ekspresije korina (SEQ ID NO: 4) vezan za svitac luciferaza gen), se generišu u dva koraka: prvo, na PCR-bazirano kloniranje 5'-bočnog regiona humanog korin gena od -1297 ili -405 do -15 ( u zavisnosti od kodona ATG za iniciranje translacije) upotrebom prajmera da drže restrikcione položaje Sac I i Hind III, svaki posebno; i drugo, umetanje posebnog PCR produkta u Sac I i Hind III položaje pGL3-baznog vektora (Promega, Madison, Wl).
Slično, konstrukti mišjeg korin promotera, mCp1183LUC, mCp809LUC i mCp646LUC, su takođe sačinjeni na osnovu PCR-baziranog pristupa kloniranja koji je gore opisan. Plazmidi za ove konstrukte se pripremaju upotrebom EndoFree Plasmid Maxi kit (Qiagen, Valencia, CA). Izmena infekcijom HL-5 ćelija (Clavcomb etal. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci., USA 95:2979-2984) se obavlja upotrebom lipofektin-baziranog postupka prema proizvođačkom uputstvu (Life Technologies). Ukratko, 10 ug DNK svakog konstrukta korin reportera plus 0,1 ug pRL-SV40 (Promega, Madison, Wl) se smeša sa 20 ug lipofektina u 1 mL OPTI-MEM I redukovanom-serum medijumu. Smeša se inkubira 30 minuta na sobnoj temperaturi, onda se dodaje~70% sastavljenog HL-5 kultivisane u jednom bazenčiću od ploča sa 6 bazenčića. Posle inkubacije od 6 sati, medijum se menja sa svežim Ex-Cell 320 medijumom kulture; i 30 h kasnije, ćelije izmenjene infekcijom se požanju i ogledaju za svitac iRenillaaktivnosti luciferaze. Ogled dvostruke aktivnosti luciferaze se obavlja prema proizvođačkom uputstvu (Promega). Ukratko, ćelijski ekstrakti se pripremaju lizovanjem ćelija izmenjenih infekcijom sa 250 uL sveže razblaženog pasivnog pufera lizovanja (Promega). Lizati se zamrznu i odmrzavaju jednom pre centrifugiranja na 13.000 obr.p.m. tokom 5 minuta da se peletuju ćelijski otpatci. Površinski slojevi se transferišu na svežu cev, i 20-uL alikvot površinskih slojeva se ogleda putem sistema Dvostrukog-luciferaza reporter ogleda. Luminescencija uzoraka se prati sa Luminometrom mikroploče LB96V (EG&G Berthold), koji meri proizvodnju svetlosti (relativne jedinice svetlosti) u toku 10 sekundi. Svaki od ćelijskih ekstrakata se ogleda u triplikatu. Svaki eksperiment izmene infekcijom za svaki konstrukt se obavlja u triplikatu. Svitac luciferaza aktivnost se normalizuje do aktivnostiRenillaliciferaze.
Kao što je prikazano na slici 4B, konstrukti humanog korin reportera hCP1297LUC i hCP405LUC promovišu aktivnosti luciferaze koje su značajno više nego pozadina u pGL3-baznim ćelijama izmenjenim infekcijom. Slično, konstrukti mišjeg receptora mCp1183LUC, mCp809LUC i mCp646LUC promovišu značajne luciferaza aktivnosti uporedivo sa onima od humanih konstrukata. Ovi podaci sugerišu da je cis sekvenca odgovorna za najveći broj aktivnosti promotera locirana između nukleotida -405 do -15 ili nukleotida -646 do -77 u humanim i mišjim korin genima, svakom posbno.
Primer 3: Demonstracija srčano specifične ekspresije
Da se utvrdi da li konstrukti posreduju u srčano specifičnoj ekspresiji, HeLa ćelije (ATCC No. CCL2), koje ne ekspresuju korin mRNK i protein se izmene infekcijom sa konstruktima koji su gore opisani. Za razliku od njihovih visokih aktivnosti u HL-5 ćelijama, konstrukti hCp405LUC i mCp646LUC imaju samo minimalnu aktivnost promotera u HeLa ćelijama (SI. 5). Kao kontrola, simultano izmenjeni infekcijom pRL-SV40 promoviše više nivoeRanillaliciferaza aktivnosti u HeLa nego u HL-5 ćelijama, ukazujući da su HeLa ćelije spremno izmenjene infekcijom sa HL-5 ćelijama u ovim eksperimentima. Ovi rezultati ukazuju da 5'-bočne sekvence od -405 do -15 humanih ili -646- do -77 mišjih korin gena sadrže elemente koji su dovoljni za specifičnu ekspresiju u kultivisanim kardiomiocitima.
Primer 4: Najbliži GATA elementi koji se vezuju sa GATA-4 su neophodni za optimalnu funkciju korin promotera.
5'-bočni regioni od nukleotida —405 do -15 kod čoveka ili od nukleotida - 646 do -77 kod miša su dovoljni da promovišu visoke nivoe genske ekspresije u kultivisanim kardiomiocitima ali ne u HeLa ćelijama. Ovo sugeriše da ovi regioni sadrže regulatorne elemente odgovorne za kardiomiocit-specifičnu ekspresiju. Inspekcija ovih regiona otkriva konzervisane GATA saglasne sekvence (usmereni ka najbližim GATA sekvencama).
Da se utvrdi da li se najbliže GATA sekvence svakako vezuju za GATA proteine, pripremili smo nuklearne ekstrakte iz eksponencijalno rastućih HL-5 ćelija kao što je opisano (Schreiber E. et al., (1989) Nucleic Acids Res. 17:6419) i obavili takmičenje u ogledu podizanja elektroforetičke mobilnosti (EMSA) upotrebom dobro karakterisane saglasne GATA oligonukleotidne probe (Redondo, J.M. et al. (1990) Science 247(4947), 1225-9) i probe koje obuhvataju svaki od najbližih GATA sekvenci (Slika 6A). Duplo-vlaknaste oligonukleotidne probe koje sadrže dve saglasne GATA sekvence ili mitirane GATA sekvence (GATA do CTTA) se kupuju od Santa Cruz Biotechnologv. Probe (videti Slika 6A) obuhvataju humani i mišji korin GATA (GATA do CTTA) (SEQ ID NOS: 11 i 13, svaka posebno), ili mutirane humane i mišje korin GATA (GATA do CTTA) (SEQ ID NOS: 12 i 14, svaka posebno), sekvence se sintetišu i HPLC-prečiste. Oligonukleotidne probe se na 5'-kraju-označvaju sa T4 polinukleotid kinazom (Life Technologies) upotrebom [gama-<32>P] ATP (3000 Ci/mmol, Amersham Pharmacia Biotech). Ogledi podizanja gel mobilnosti se obavljaju kao što je ranije opisano (Pan, J. & McEver R.P. (1983) J. Biol. Chem. 268:22600-22608). Kao što se očekuje, označena saglasna GATA proba (SEQ ID NO: 15) formira kompleks sekvenca-specifičnog DNK-proteina kada se inkubira sa nuklearnim ekstraktima HL-5 ćelija (SI. 6B). Formiranje ovog kompleksa se sprečava dodavanjem 100-puta viška neoznačene probe ali ne i GAS elementa koji nije povezan. Formiranje kompleksa je zavisno od netaknute GATA sekvence, pošto mutacije u GATA sekvenci ukidaju formiranje kompleksa. Dalje, kompleks se ne otkriva u prisustvu 100 - puta viška neoznačene probe koja sadrži bilo humane ili mišje najblliže GATA sekvence. Nasuprot tome, 100 - puta višak neoznačenih proba obuhvata mutant najbliže GATA sekvence (SEQ ID NOS:12 i 14) koje imaju minimalno dejstvo na formiranje kompleksa. Ovi podaci ukazuju da se korin najbliže GATA sekvence i saglasna GATA proba vezuju za uobičajene GATA protein(e).
Da se utvrdi koji su GATA protein(i) uključeni u kompleks, obavili smo EMSA sa označenom saglasnom GATA probom u prisustvu anititela spram članova GATA familije. Antitela spram GATA - 1 miša (SC-1234x), GATA-3 (SC-268x), GATA-4 (SC-1237x), i GATA-6 (SC-7244x) su od Santa Cruz Biotechnologv (Santa Cruz, CA). Kao što je prikazano na sl.6C, antitelo spram GATA-4 značajno inhibira formiranje kompleksa, dok antitela spram GATA-1, -3 i -6, imaju malo dejstva. Da se direktno demonstrira vezivanje GATA-4 za najbližu GATA sekvencu, koristimo označenu humanu najbližu GATA probu u odsustvu ili prisustvu istog antitela spram GATA-4. Kao što je prikazano na sl.6D, antitelo spram GATA-4 u potpunosti inhibira formiranje DNK-protein kompleksa sa sličnom mobilnošću sa onom od kompleksa formiranog sa saglasnom GATA probom. Ovi podaci ukazuju da se GATA-4 vezuje za najbliže GATA sekvence, sugeriišući da vezivanje GATA-4 za najbliže GATA sekvence može da doprinese genskoj ekspresiji korina u srčanim miocitima.
Da se elaborira da li su najbliži GATA elementi u stvari neophodni za aktivnost promotera, mutiramo sekvencu divljeg tipa AGATAA u ACTTAA kod humanih i mišjih konstrukta koji promovišu najvišu aktivnost promotera (Slika 7). Mutant konstrukti hCp405mutGATA i mCp646mutGATA, su konstruisani zaokruživanjem PCR protokola (Ho S.N. et al.,(1989)gene(Amst)77:51-59). Ukratko, dva odvojena PCR proizvoda, jedan za svaku polovinu hibrid proizvoda, se generišu bilo sa antisens ili sens mutiranim GATA oligonukleotidom i jednim spoljašnjim prajmerom. Dva proizvoda se prečišćavaju i mešaju. Drugi PCR se onda obavlja upotrebom dva spoljašnja prajmera. PCR proizvod se svari sa Sac I i Hind III, i ligatuje u Sac I- i Hind III- svarenim pGL3-bazičnim vektorom. Svi konstrukti su potvrdjeni mapiranjem restrikcije i DNK sekvenciranjem. Mutacije u GATA elementu su iste kao one učinjene u mutant GATA probama upotrebljenim u EMSA-ima. Kada se izmene infekcijom u HL-5, humani i mišji mutant konstrukti imaju 10% ili 42% od aktivnosti promotera uporedjeno sa njihovim odgovarajućim sekvencama divljeg tipa. Ovi rezultati pokazuju da se najbliži GATA elementi zahtevaju za konstitutivnu ekspresiju humanih ili mišjih korin gena u kultivisanim kardiomiocitima.

Claims (28)

1. Izolovani polinukleotid koji sadrži kontrolni region ekspresije sisarskog korina,naznačen time,što kontrolni region modulira transkripciju heterologog polinukleotida za koji je operativn vezan.
2. Polinukleotid prema zahtevu 1,naznačen time,što kontrolni region modulira transkripciju sisarskog korin gena.
3. Polinukleotid prema zahtevu 1,naznačen time,što događa u srčanom tkivu.
4. Polinukleotid prema zahtevu 1,naznačen time,što kontrolni region sadrži regulacioni element transkripcije, odabran od grupe koja se sastoji od GATA, Tbx-5, NKx2.5, ili NF-AT položaja vezivanja.
5. Polinukleotid prema zahtevu 1,naznačen time,što se kontrolni region vezuje za regulatorne proteine transkripcije, pri čemu su proteini odabrani od grupe koja se sastoji od GATA-4, Tbx-5, Nkx2.5, Krppel-sličnog faktora, ili NF-AT transkripcionog faktora.
6. Polinukleotid prema zahtevu 1,naznačen time,što je sisar čovek.
7. Polinukleotid prema zahtevu 6,naznačen time,što polinukleotid ima sekvencu određenu u SEQ ID NO:4.
8. Polinukleotid prema zahtevu 6,naznačen time,što polinukleotid ima sekvencu određenu u SEQ ID NO:5.
9. Polinukleotid prema zahtevu 6,naznačen time,što polinukleotid ima sekvencu određenu u SEQ ID NO:6.
10. Fragment ili varijanta polinukleotida,naznačeni time,što je fragmen ili varijanta sposobna da kopira heterologi polinukleotid za koji je operativno vezana..
11. Fragment ili varijanta prema zahtevu 10,naznačeni time,što fragment ili varijanta ima sekvencu koja je bar 70% identična sa SEQ ID NO: 4.
12. Fragment ili varijanta prema zahtevu 10,naznačeni time,što fragment ili varijanta ima sekvencu koja je bar 70% identična sa SEQ ID NO: 5.
13. Fragment ili varijanta prema zahtevu 10,naznačeni time,što fragment ili varijanta ima sekvencu koja je bar 70% identična sa SEQ ID NO: 6.
14. Vektor,naznačen time,što sadrži kontrolni region ekspresije korina prema zahtevu 1.
15. Ćelija domaćina,naznačena time,što sadrži vektor prema zahtevu 14.
16. Postupak proizvodnje polipeptida,naznačen time,što se sastoji od ekspresovanja iz ćelije domaćina prema zahtevu 15 polipeptida koji se kodira od strane heterologog polinukleotida operativno vezanog za kontrolni region ekspresije korina.
17. Postupak proizvodnje polipeptida,naznačen time,što se sastoji od ekspresovanja iz ćelije domaćina prema zahtevu 15 antisens molekula koji se kodira od strane heterologog polinukleotida operativno vezanog za kontrolni region ekspresije korina.
18. Farmaceutski sastav,naznačen time,što sadrži vektor prema zahtevu 14 u farmaceutski prihvatljivom nosaču.
19. Farmaceutski sastav,naznačen time,što sadrži ćeliju prema zahtevu 15 u farmaceutski prihvatljivom nosaču.
20. Postupak identifikovanja agensa koji modulira ekspresiju humanog korin gena u ćeliji,naznačen time,što se postupak sastoji od: (a) proizvodnje rekombinantnog vektora u kome je izolovani polinukleotid sadrži kontrolni region ekspresije sisarskog korina operativno vezan za reporter gen; (b) izmene infekcijom ćelije sa rekombinantnim vekorom; (c) tretiranja ćelije agensom; (d) meranja nivoa ekspresije reporter sekvence u tretiranoj ćeliji; i (e) upoređenja nivoa ekspresije reporter sekvence u prisustvu agensa prema nivou ekspresije kontrolne ćelije izmenjene infekcijom koja nije tretirana.
21. Postupak prema zahtevu 20,naznačen time,što je ćelija srčana miocit ćelija.
22. Postupak moduliranja ekspresije gena u humanom subjektu,naznačen time,što se postupak sastoji od: (a) proizvodnje rekombinantnog vektora u kome je izolovani polinukleotid sadrži kontrolni region ekspresije sisarskog korina operativno vezan za heterologi polinukleotid; (b) davanja subjektu vektora u terapeutski efektivnoj količini.
23. Postupak prema zahtevu 22,naznačen time,što heterologi polinukleotid kodira terapeutski protein kao što su korin, ANP, B-tip natriuretički peptid, fosfolamban, ACE, ili negativni dominantni oblici ovih gena.
24. Postupak prema zahtevu 23,naznačen time,što heterologi polinukleotid kodira korin.
25. Postupak prema zahtevu 22,naznačen time,što heterologi polinukleotid kodira terapeutski polinukleotid kao što su antisens RNK molekul ili katalitički RNK molekul.đ
26. Postupak prema zahtevu 22,naznačen time,što je kontrolni region odabran od grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, ili SEQ ID NO: 6.
27. Postupak za lečenje kongestivne slabosti srca, hipertenzije ili infarkta miokarda kod humanog subjekta,naznačen time,što se postupak sastoji od davanja subjektu terapeutski efektivne količine izolovanog polinukleotida koji sadrži kontrolni region ekspresije sisarskog korina, operativno vezan za gen odabran od grupe koja se sastoji od korina, ANP, B-tip natriuretičkog peptida, fosfolambana, ACE, ili negatinih dominantnih formi ovih gena.
28. Postupak prema zahtevu 27,naznačen time,što je gen korin.
YU104404A 2002-05-31 2003-05-28 Kontrolne sekvence humanog korin gena RS104404A (sr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US38410802P 2002-05-31 2002-05-31
PCT/US2003/016741 WO2003102135A2 (en) 2002-05-31 2003-05-28 Control sequences of the human corin gene

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS104404A true RS104404A (sr) 2006-12-15

Family

ID=29711979

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
YU104404A RS104404A (sr) 2002-05-31 2003-05-28 Kontrolne sekvence humanog korin gena

Country Status (18)

Country Link
US (1) US20030223976A1 (sr)
EP (1) EP1546172A4 (sr)
JP (1) JP2005531302A (sr)
KR (1) KR20050009724A (sr)
CN (1) CN1671729A (sr)
AU (1) AU2003245342A1 (sr)
BR (1) BR0311603A (sr)
CA (1) CA2487024A1 (sr)
CR (1) CR7622A (sr)
EC (1) ECSP045518A (sr)
IL (1) IL165244A0 (sr)
MX (1) MXPA04011944A (sr)
NO (1) NO20045722L (sr)
PL (1) PL374125A1 (sr)
RS (1) RS104404A (sr)
RU (1) RU2004139055A (sr)
WO (1) WO2003102135A2 (sr)
ZA (1) ZA200410400B (sr)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050026255A1 (en) * 2002-06-25 2005-02-03 Morser John Michael Corin, a serine protease
JP2007530016A (ja) * 2004-02-27 2007-11-01 ザ ジェネラル ホスピタル コーポレーション 発毛のための方法および組成物
KR101402636B1 (ko) 2005-12-01 2014-06-03 시바 홀딩 인크 옥심 에스테르 광개시제
WO2010096658A1 (en) 2009-02-19 2010-08-26 The Cleveland Clinic Foundation Corin as a marker for heart failure
CN105734070A (zh) * 2016-04-11 2016-07-06 苏州大学 Corin基因变异体及其用途

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5917123A (en) * 1997-03-14 1999-06-29 University Of Pittsburgh Transgenic mice containing a nucleic acid encoding tumor necrosis factor-α under the control of a cardiac specific regulatory region
JP4488140B2 (ja) * 1998-06-05 2010-06-23 バイエル・シエーリング・ファーマ アクチエンゲゼルシャフト セリンプロテアーゼであるコリン
CA2296792A1 (en) * 1999-02-26 2000-08-26 Genset S.A. Expressed sequence tags and encoded human proteins
AU2001243142A1 (en) * 2000-02-03 2001-08-14 Hyseq, Inc. Novel nucleic acids and polypeptides
EP1252300B1 (en) * 2000-02-03 2011-01-19 Dendreon Corporation Nucleic acid molecules encoding transmembrane serine proteases, the encoded proteins and methods based thereon
JP2001245671A (ja) * 2000-03-07 2001-09-11 Chiba Prefecture ヒト神経芽細胞腫においてクローニングされた新規遺伝子及び新規遺伝子の断片

Also Published As

Publication number Publication date
ZA200410400B (en) 2006-06-28
EP1546172A4 (en) 2005-11-30
IL165244A0 (en) 2005-12-18
JP2005531302A (ja) 2005-10-20
CR7622A (es) 2006-05-29
WO2003102135A3 (en) 2004-11-04
EP1546172A2 (en) 2005-06-29
AU2003245342A1 (en) 2003-12-19
US20030223976A1 (en) 2003-12-04
MXPA04011944A (es) 2005-03-31
WO2003102135A2 (en) 2003-12-11
RU2004139055A (ru) 2005-08-20
CN1671729A (zh) 2005-09-21
CA2487024A1 (en) 2003-12-11
ECSP045518A (es) 2005-03-10
KR20050009724A (ko) 2005-01-25
NO20045722L (no) 2004-12-30
PL374125A1 (en) 2005-10-03
BR0311603A (pt) 2005-06-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7721589B2 (ja) 細胞の遺伝子修飾のための非組込みｄｎａベクター
KR20220030205A (ko) 면역 세포의 트랜스포존 기반 변형
KR20220038362A (ko) 재조합 ad35 벡터 및 관련 유전자 요법 개선
JPH10507927A (ja) 改良されたアデノウイルスおよびその使用法
JP2022513376A (ja) レトロウイルスインテグラーゼ－Ｃａｓ９融合タンパク質を使用した指向性非相同ＤＮＡ挿入によるゲノム編集
TW201720926A (zh) 轉位子系統、套組及其用途
CN112639108A (zh) 治疗非综合征性感觉神经性听力损失的方法
KR20200095462A (ko) Hbb 유전자 기능 회복을 위한 아데노-연관 바이러스 조성물 및 이의 사용 방법
KR20200127170A (ko) Pah 유전자 기능 복원을 위한 아데노-연관 바이러스 조성물 및 이의 사용 방법
US20170355956A1 (en) Compositions for increasing survival of motor neuron protein (smn) levels in target cells and methods of use thereof for the treatment of spinal muscular atrophy
HK1046081A1 (zh) 可用於基因治疗和治疗性筛选的enos突变
CN117157109A (zh) 腺病毒基因疗法载体
JP2002543792A (ja) ベクターによるトランスポゾン配列の供給及び組込み
RS104404A (sr) Kontrolne sekvence humanog korin gena
CA2253433A1 (en) Mammalian regulator of nonsense-mediated rna decay
JPH11514881A (ja) Ｇａｘタンパク質の癌治療への応用
JP5091669B2 (ja) チミジンキナーゼ
Cook et al. The amino terminus of polyomavirus middle T antigen is required for transformation
CN114729021B (zh) 能破坏细胞的氨基酸序列及相关核苷酸序列和相关的应用
KR102933002B1 (ko) 강력한 암 치료제로서의 융합체 종양용해성 단순 헤르페스 돌연변이체
KR20240000580A (ko) 레트로바이러스 인테그라제-Cas 융합 단백질을 이용한 직접 비상동 DNA 삽입에 의한 게놈 편집 및 치료 방법
WO2003089596A2 (en) Novel prostate tumor-specific promoter
US20100190160A1 (en) Indicator cell lines and methods for making same
HK40040055A (en) Adeno-associated virus compositions for restoring pah gene function and methods of use thereof
HUP0105230A2 (hu) Specifikus hibrid promóterek alkalmazása szöveti kifejeződés szabályozására