RS18304A - Biljke i delovi biljaka sa sposobnošću samoprerađivanja - Google Patents

Biljke i delovi biljaka sa sposobnošću samoprerađivanja

Info

Publication number
RS18304A
RS18304A YU18304A YUP18304A RS18304A RS 18304 A RS18304 A RS 18304A YU 18304 A YU18304 A YU 18304A YU P18304 A YUP18304 A YU P18304A RS 18304 A RS18304 A RS 18304A
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
plant
starch
enzyme
amylase
polynucleotide
Prior art date
Application number
YU18304A
Other languages
English (en)
Inventor
Michael Lanahan
Shib Sankar Basu
Christopher Batie
Wen Chen
Joyce Craig
Mark Kinkema
Original Assignee
Syngenta Participations Ag.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=23223692&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS18304(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Syngenta Participations Ag. filed Critical Syngenta Participations Ag.
Publication of RS18304A publication Critical patent/RS18304A/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2411—Amylases
    • C12N9/2428—Glucan 1,4-alpha-glucosidase (3.2.1.3), i.e. glucoamylase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8245—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified carbohydrate or sugar alcohol metabolism, e.g. starch biosynthesis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2411—Amylases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2411—Amylases
    • C12N9/2414—Alpha-amylase (3.2.1.1.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2411—Amylases
    • C12N9/2414—Alpha-amylase (3.2.1.1.)
    • C12N9/2422—Alpha-amylase (3.2.1.1.) from plant source
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2451—Glucanases acting on alpha-1,6-glucosidic bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2451—Glucanases acting on alpha-1,6-glucosidic bonds
    • C12N9/2457—Pullulanase (3.2.1.41)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2451—Glucanases acting on alpha-1,6-glucosidic bonds
    • C12N9/246—Isoamylase (3.2.1.68)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/14—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a carbohydrase (EC 3.2.x), e.g. by alpha-amylase, e.g. by cellulase, hemicellulase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/06—Ethanol, i.e. non-beverage
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01001—Alpha-amylase (3.2.1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01003—Glucan 1,4-alpha-glucosidase (3.2.1.3), i.e. glucoamylase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/0102—Alpha-glucosidase (3.2.1.20)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01041—Pullulanase (3.2.1.41)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01068—Isoamylase (3.2.1.68)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
  • Cereal-Derived Products (AREA)
  • Seasonings (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Preparation Of Fruits And Vegetables (AREA)

Abstract

Predmetni pronalazak obezbeđuje polinukleotide, poželjno sintetičke polinukleotide, koji kodiraju enzime za prerađivanje koji su optimizovani za ekspresiju u biljkama. Polinukleotidi kodiraju mozofilne, termofilne ili hipertermofilne enzime za prerađivanje koji se aktiviraju pod odgovarajućim aktivacionim uslovima, kako bi delovali na željenom supstratu. Takođe su obezbeđene "samoprerađivajuće" transgene biljke i delovi biljaka, npr. zrno, koje eksprimiraju jedan ili više ovakvih enzima i koje imaju izmenjeni sastav koji obezbeđuje prerađivanje biljke i zrna. Takođe su obezbeđeni postupci za dobijanje i upotrebu ovih biljaka, npr. za proizvodnju namirnica koje imaju poboljšani ukus, kao i za dobijanej fermentabilnih supstrata za dobijanej etanola i fermentisanih napitaka.

Description

BILJKE I DELOVI BILJAKA SA SPOSOBNOŠĆU
SAMOPRERAĐIVANJA
Referenca odnosne prijave
Ova prijava ima prioritet od US prijave ser. br. 60/3 1 5,281, podnete 27. avgusta 2001. godine, koja je ovde uključena prema referenci.
Oblast pronalaska
Predmetni pronalazak se generalno odnosi na područje molekularne biologije biljaka, specifičnije rečeno, na stvaranje biljaka koje eksprimiraju enzime za prerađivanje koji obezbeđuju ispoljavanje željenje karakteristike kod određene biljke ili njenih proizvoda.
Stanje tehnike
Enzimi se koriste za prerađivanje brojnih agrikulturnih proizvoda, kao što su drvo, voće i povrće, razne vrste škroba, sokova i slično. Tipično, na nivou industrijske proizvodnje, enzimi za prerađivanje se proizvode i prikupljaju iz različitih izvora, na primer mikrobnom fermentacijom (a-amilaza iz bakterija rodaBacillus),ili se izoluju iz biljaka (p-galaktozidaza iz kafe ili papain iz delova biljaka). Preparati enzima se koriste u različitim primenama, pri šemu se enzim meša sa supstratom pod odgovarajućim uslovima vlažnosti, temperature, u toku određenog vremena i uz hemijsko mešanje, tako da se postiže odvijanje enzimske reakcije na način koji je tržišno isplatljiv. Pomenuti postupci obuhvataju korake proizvodnje enzima, pripreme enzimskog preparata, mešanja enzima i supstrata i izlaganja smeše odgovarajućim uslovima pod kojima se pospešuje enzimska reakcija. Od koristi bi bio postupak kojim se smanjuju ili eliminišu vreme, energija, mešanje. kapitalni troškovi i/ili troškovi proizvodnje enzima, ili postupak kojim se dobijaju poboljšani ili novi proizvodi. Jedan od primera gde su takva poboljšanja potrebna predstavlja oblast prerade kukuruza mlevenjem.
Danas se kukuruz melje u cilju dobijanja kukuruznog škroba i drugih koproizvoda koji se dobijaju pri ovom postupku, kao što su kukuruzna glutenska stočna hrana, kukuruzno glutensko krupno brašno i kukuruzno ulje. Škrob koji se dobija tokom ovog procesa se obično dalje prerađuje u druge proizvode, kao što su derivirane vrste škroba i šećera, ili se fermentira kako bi se dobilo mnoštvo proizvoda u koje spadaju alkoholi ili mlečna kiselina. Prerada kukuruznog škroba često obuhvata korišćenje enzima, posebno enzima koji hidrolizuju i prevode škrob u fermentabilne šećere ili u fruktozu (cc-mailaza i glukoamilaza, a-glukozidaza, izomeraza glukoze i slični). Postupak koji se danas komercijalno koristi je skup, jer je potrebna konstrukcija veoma velikih mlinova da bi se prerađivalo dovoljno kukuruza kako bi se postigao razumni odnos troškova i efikasnosti. Dodatno, proces zahteva odvojenu proizvodnju enzima za hidrolizu ili modifikaciju škroba, a zatim i mašineriju za mešanje enzima sa supstratom, kako bi se dobili proizvodi hidrolize škroba.
Postupak dobijanja škroba iz kukuruza je dobro poznat i obuhvata postupak vlažnog mlevenja. Postupak vlažnog mlevenja kukuruza obuhvata korake natapanja kukuruznog zrna, mlevenja kukuruznog zrna i razdvajanja komponenti zrna. Zrna se natapaju u rezervoaru za natapanje sa protivstrujnim tokom vode čija je temperatura oko 120 °F, pri čemu zrna ostaju u rezervoaru za natapanje tokom 24 do 48 časova. Voda za natapanje tipično sadrži sumpor dioksid u koncentraciji od oko 0.2% (w/w). Sumpor dioksid se u ovom postupku primenjuje u cilju pospešivanja smanjenja rasta mikroorganizama, a takođe i radi smanjenja broja disulfidnih veza u proteinima endosperma, čime se pospešuje efikasnije razdvajanje škroba od proteina. Uobičajeno, po bušelu kukuruza se koristi oko 0,59 galona vode za natapanje. Voda za natapanje se smatra otpadom i često sadrži neželjene nivoe rezidualnog sumpor dioksida.
Natopljena zrna se zatim razdvajaju od vode i podvrgavaju dejstvu serije frikcionih mlinova. Prva serija frikcionih mlinova raskida zrna i oslobađa klicu od ostatka zrna. Komercijalno dostupni frikcioni mlin, koji je pogodan za vlažno mlevenje se prodaje pod zaštićenim imenom Bauer. Za razdvajanje klica od ostatka zrna se koristi centrifugiranje. Tipično se koristi Merco centrifuga za separaciju. Frikcioni mlinovi i centrifuge za separaciju su veoma skupi proizvodi, kojima je potrebna energija za funkcionisanje.
U sledećem koraku postupka, preostale komponente zrna koje sadrže škrob, ljusku, vlakna i gluten, podvrgavaju se dejstvu druge serije frikcionih mlinova i propuštaju se kroz seriju sita za ispiranje, kako bi se razdvojile vlaknaste komponente od škroba i glutena (proteina endosperma). Škrob i gluten prolaze kroz sita. dok se vlakna zadržavaju. 7a razdvajanje škroba od proteina endosprema koristi se centrifugiranje ili treće mlevenje posle koga sledi centrifugiranje. Centrifugiranjem se dobija suspenzija škroba koja ne sadrži vodu i koja se potom ispira svežom vodom i suši dok se ne postigne vlažnost od 12%. Tipično, praktično čisti škrob se dalje prerađuje korišćenjem enzima.
Razdvajanje škroba od drugih komponenti žitarice se sprovodi se uklanjanjem omotača semena, proteina embriona i endosperma, čime se omogućava efikasni kontakt škroba sa enzimima za prerađivanje, a dobijeni proizvodi hidrolize su relativno oslobođeni od kontaminirajućih materija poreklom iz drugih komponenti zrna. Razdvajanjem se takođe osigurava da se druge komponente žitarice efikasno učine dostupnim, nakon čega se mogu prodati kao koproizvodi, kako bi se povećali prihodi od mlina.
Pošto se škrob izdvoji postupkom vlažnog mlevenja, dalje se tipično prerađuje koracima gelatinizacije, likvefakcije i dekstrinizacije u cilju proizvodnje maltodekstrina, a zatim i koracima saharifikacije, izomerizacije i prečišćavanja u cilju dobijanja glukoze, maltoze i fruktoze.
Pri hidrolizi škroba se koristi gelatinizacija, jer enzimi koji su trenutno dostupni na tržisštu nemogu brzo da hidrolizuju kristalni škrob. Kako bi se škrob učinio dostupnim dejstvu hidrolitičkih enzima, on se tipično prevodi u suspenziju dodavanjem vode (20 - 40% u odnosu na suvu materiju) i zagrevanjem na temperaturi koja pogoduje gelatinizaciji. Ova temperatura se kreće između 105 - 110 °C, kada je u pitanju škrob kukuruza. Gelatinizovani škrob je tipično veoma viskozan, zbog čega se u narednom koraku, koji se naziva likvefakcija, čini manje viskoznim. Likvefakcijom se raskidaju neke od veza između molekula glukoze škroba i ona se postiže primenom enzima ili korišćenjem kiseline. U ovom, kao i u narednom koraku dekstrinizacije, koristi se termostabilna endo-a-amilaza. U koraku dektrinizacije kontroliše se stepen hidrolize, kako bi se dobili proizvodi hidrolize sa željenim procentom dekstroze.
Dalja hidroliza proizvoda dekstrina dobijenih u koraku likvefakcije se izvodi primenom brojnih različitih egzo-amilaza i enzima kojima se raskidaju veze grananja, što zavisi od vrste željenog proizvoda. Konačno, ukoliko je poželjna fruktoza, tipično se koristi imobilsana izomeraza glukoze radi prevođenja glukoze u fruktozu.
Postupci suvog mlevenja za dobijanje fermentabilnih šećera (a potom, na primer. i etanola) iz škroba kukuruza pospešuju efikasni kontakt egzogenih enzima sa škrobom. Ovi postupci su jeftiniji od vlažnog mlevenja, ali je i dalje poželjno značajno smanjenje troškova, jer često koproizvodi koji se dobijaju pri ovim postupcima nemaju onu vrednost koju imaju koproizvodi koji se dobijaju pri vlažnom mlevenju. Na primer. u postupku suvog mlevenja kukuruza, zrno se melje u prah, kako bi se pospešio kontakt škroba sa enzimima za razgradnju. Nakon enzimske hidrolize kukuruznog brašna, preostale čvrste supstance imaju određenu vrednost kao stočna hrana, jer sadrže proteine i neke druge sastojke. Eckhoff je u skorije vreme opisao mogućnost za poboljšanja i dotakao se određenih važnih tema u vezi suvog mlevenja u radu pod nazivom "Fermentation and costs of fuel ethanol from corn vvith quick-germ process" (Appl. Biochem. Biotechnol., 94 : 41 (2001)). Postupak ''brze klice"' omogućava razdvajanje uljem bogatih klica od škroba uz skraćeno vreme natapanja.
Slatki kukuruz predstavlja primer gde regulacija i/ili određeni nivo endogenih enzima za prerađivanje u biljci može da rezultuje dobijanjem željenog proizvoda. Tipično, varijante slatkog kukuruza se razlikuju od običnog kukuruza po tome što slatki kukuruz nije sposoban za biosintezu škroba u normalnom nivou. Tipično, u varijantama slatkog kukuruza se koriste mutacije gena koji kodiraju enzime koji su uključeni u biosintezu škroba, kako bi se ograničila njegova biosinteza. Pomenute mutacije se nalaze u genima koji kodiraju sintaze škroba i ADP-glukoza pirofosforilaze (kao što su šećerne i superslatke mutacije). U endospermu koji se razvija, kod takvih mutanata nakupljaju se fruktoza, glukoza i sukroza. koje pedstavljaju proste šećere neophodne za izazivanje osećaja slatkog koji je poželjan konzumentima jestivog svežeg kukuruza. Međutim, ukoliko je nivo akumuliranog škroba previsok, kao u slučaju kada se kukuruz ostavi da prezri (kasna žetva) ili kada se kukuruz pre upotrebe uskladišti tokom suviše dugog perioda, proizvod gubi slatkoću i dobija ukus škroba. Period prozora za žetvu za slatki kukuruz je stoga veoma uzak, a dozvoljeno vreme njegovog skladištenja je ograničeno.
Druga značajna nezgoda za farmera koji uzgaja varijante slatkog kukuruza je ta stoje mogućnost korišćenja ovih varijanti ograničena isključivo na jestivu hranu. Ukoliko farmer želi da preduzme žetvu svog slatkog kukuruza da bi ga koristio kao jestivu hranu tokom perioda razvoja semena, usev bi praktično predstavljao čist gubitak. Prinos žitarice i kvalitet slatkog kukuruza je slab iz dva osnovna razloga. Prvi razlog je taj da mutacije u procesu biosinteze škroba bitno oštećuju biosintetičku mašineriju za škrob, zbog čega se žitarice ne ispunjavaju škrobom u potpunosti, što vodi kompromitovanom prinosu i kvalitetu. Drugo, usied visokih nivoa šećera koji su prisutni u žitarici i nemogućnosti za odlaganje ovih šećera u vidu škroba, ukupna snaga penetracije semena je umanjena, što potencira smanjenje odlaganja hranljivih materija u žitarici. Količina endosperma semena kod varijanti slatkog kukuruza je smanjena i oni su kolabirani, ne podležu odgovarajućoj desikaciji i podložni su oboljevanju. Slab kvalitet slatkog kukuruza ima dalje agronomske implikacije; slaba vijabilnost semena. slaba germinacija. podložnost semena oboljevanju i slaba rana snaga semena nastaju kao kombinacija činioca izazvanih neodgovarajućom akumulacijom škroba. Stoga, slab kvalitet slatkog kukuruza pogađa potrošača, farmera/uzgajaoca. distributera i proizvođača semena.
Tako, pri procesu suvog mlevenja postoji potreba za postupkom kojim bi se poboljšala efikasnost procesa i/ili kojim bi se povećala vrednost koproizvoda. Pri procesu vlažnog mlevenja postoji potreba za postupkom prerade škroba koji ne zahteva opremu neophodnu za produženo natapanje, usitnjavanje, mlavenje i/ili razdvajanje sastojaka zrna. Na primer, postoji potreba za modifikacijom ili eliminacijom koraka natapanja u procesu vlažnog mlevenja, jer bi se tako smanjila količina otpadne vode koja zahteva odlaganje, a time bi se uštedeli energija i vreme i povećao bi se kapacitet mlina (zrna bi provodila manje vremena u rezervoarima za natapanje). Takođe, postoji potreba za eliminacijom ili poboljšavanjem procesa razdvajanja endosperma koji sadrži škrob od embriona.
Suština pronalaska
Predmetni pronalazak se odnosi na biljke i delove biljaka sa sposobnošću samoprerađivanja i na postupke njihovog korišćenja. Biljke i delovi biljaka sa sposobnošću samoprerađivanja prema predmetnom pronalasku mogu da eksprimiraju i aktiviraju enzim (enzime) (mezofilne, termofilne i/ili hipertermofilne). Nakon aktivacije enzima (mezofilnih, termofilnih i/ili hipertermofilnih), biljka ili njen deo je sposoban da samoprerađuje supstrat na koji vrši dejstvo u cilju dobijanja željenog proizvoda.
Predmetni pronalazak se odnosi na izolovani polinukleotid koji: a) sadrži sekvence čiji su ID brojevi 2, 4, 6, 9, 19, 21, 25, 37, 39, 41, 43, 46, 48, 50, 52 ili 59, ili njima komplementarne sekvence, ili polinukleotid koji hibridizuje sa komplementom bilo koje od sekvenci čiji su ID brojevi 2, 4, 6, 9, 19, 21, 25, 37, 39, 41, 43, 46, 48, 50, 52 ili 59, u uslovima slabo precizne hibridizacije, i koji kodira polipeptid koji poseduje aktivnost o amilaze, pululanaze, ct-glikozidaze, izomeraze glukoze ili glukoamilaze, ili b) koji kodira polipeptid koji sadrži sekvence čiji su ID brojevi 10, 13. 14, 15, 16. 18. 20. 24. 26, 27, 28. 29, 30. 33. 34, 35. 36, 38. 40, 42, 44, 45. 47. 49 ili 51. ili koji sadrži njihov enzimski aktivni fragment. Poželjno, izolovani polinukleotid kodira fuzioni polipeptid koji sadrži prvi polipeptid i drugi polipeptid, pri čemu prvi polipeptid poseduje aktivnost a-amilaze. pululanaze, a-glikozidaze, izomeraze glukoze ili glukoamilaze. Najpoželjnije, drugi polipeptid sadrži signalnu sekvencu peptida, koja može da usmeri prvi polipeptid ka vakuoli. endoplazmatskom retikulumu. hloroplastu, granuli škroba, semenu ili ka ćelijskom zidti biljke. Na primer, signalna sekvenca može biti N-terminalna signalna sekvenca izvedena izwaxy\N-terminalna signalna sekvenca iz y-zeina. vezujući domen škroba, ili C-terminalni vezujući domen škroba. Dalje, obimom zaštite prema predmetnom pronalasku su obuhvaćeni polinukleotidi koji hibridizuju sa komplementom bilo koje od sekvenci čiji su ID brojevi 2. 9 ili 52, u uslovima slabo precizne hibridizacije i koji kodiraju polipeptid koji poseduje aktivnost a-amilaze; polinukleotidi koji hibridizuju sa komplementom sekvenci čiji su ID brojevi 4 ili 25, u uslovima slabo precizne hibridizacije i koji kodiraju polipeptid koji poseduje aktivnost pululanaze; polinukleotidi koji hibridizuju sa komplementom sekvence čiji je ID broj 6 i koji kodira polipeptid koji poseduje aktivnost a-glukozidaze; polinukleotidi koji hibridizuju sa komplementom bilo koje od sekvenci čiji su ID brojevi 19, 21. 37, 39. 41 ili 43, u uslovima slabo precizne hibridizacije i koji kodiraju polipeptid koji poseduje aktivnost izomeraze glukoze; polinukleotidi koji hibridizuju sa komplementom bilo koje od sekvenci čiji su ID brojevi 46, 48, 50 ili 59, u uslovima slabo precizne hibridizacije i koji kodiraju polipeptid koji poseduje aktivnost glukoamilaze.
Dalje, ekspresiona kaseta sadrži a) polinikleotid koji poseduje sekvence čiji su ID brojevi 2. 4, 6, 9, 19, 21, 25, 37, 39, 41, 43, 46, 48, 50, 52 ili 59, ili njima komplementarne sekvence, ili polinukleotid koji hibridizuje sa komplementom bilo koje od sekvenci čiji su ID brojevi 2, 4, 6, 9, 19, 21, 25, 37, 39, 41, 43, 46, 48, 50, 52 ili 59, u uslovima slabo precizne hibridizacije i koji kodira polipeptid koji poseduje aktivnost a-amilaze, pululanaze,a-glikozidaze, izomeraze glukoze ili glukoamilaze, ili b) koji kodira polipeptid koji sadrži sekvence čiji su ID brojevi 10, 13, 14, 15, 16, 18, 20, 24, 26, 27, 28, 29, 30, 33, 34, 35, 36, 38, 40, 42, 44, 45, 47, 49 ili 51, ili koji sadrži njihov enzimski aktivni fragment. Poželjno, ekspresiona kaseta dalje sadrži promoter koji je operativno povezan sa polinukleotidom, kao što je inducibilni promoter, tkivno specifični promoter ili, poželjno, za endosperm specifični promoter. Poželjno, promoter specifičan za enosperm je promoter y-zeina kukuruza ili ADP-gpp promoter kukuruza. U jednom poželjnom rešenju, promoter sadrži sekvencu čiji je ID broj 1 1 ili sekvencu čiji je ID broj 12. Štaviše, u drugom poželjnom rešenju. polinukleotid je orijentisan u smeru očitavanja u odnosu na promoter. Ekspresiona kaseta prema predmetnom pronalasku može dalje da kodira signalnu sekvencu koja je operativno povezana sa polipeptidom kodiranim od strane polinukleotida. Signalna sekvenca poželjno usmerava operativno povezani polipeptid ka vakuoli, endoplazmatskom retikulumu. hloroplastu, granuli škroba, semenu ili ka ćelijskom zidu biljke. Poželjno, signalna sekvenca sadrži N-terminalnu signalnu sekvencu izvedenu izwaxy.N-terminalnu signalnu sekvencu iz y-zeina, ili vezujući domen škroba.
Predmetni pronalazak se dalje odnosi na vektor ili na ćeliju koja sadrži ekspresione kasete prema predmetnom pronalasku. Ćelija može biti izabrana iz grupe koju čineAgrobacterium,ćelija monokotiledone biljke, ćelija dikotiledone biljke, ćelija Liliopsida, ćelija Panicoideae, ćelija kukuruza i ćelija žitarice. Poželjno, ćelija prema predmetnom pronalasku je ćelija kukuruza.
Dalje, predmetni pronalazak obimom zaštite obuhvata biljku koja je stabilno transformisana vektorima prema predmetnom pronalasku. Predmetnim pronalaskom je obezbeđena biljka koja je stabilno transformisana vektorom koji sadrži a-amilazu sa aminokiselinskom sekvencom čiji je ID broj 1, 10, 13, 14, 15, 16, 33 ili 35, ili koja je kodirana polinukleotidom čiji je ID broj 2 ili 9. Poželjno, ct-amilaza je hipertermofilna.
U drugom rešenju, obezbeđena je biljka koja je stabilno transformisana vektorom koji sadrži gen za pululanazu, čija aminokiselinska sekvenca ima ID broj 24 ili 34, ili koja je kodirana polinukleotidom čiji je ID broj 4 ili 25. Dalje, obezbeđena je biljka koja je stabilno transformisana vektorom koji sadrži gen za a-glukozidazu. čija aminokiselinska sekvenca ima ID broj 26 ili 27, ili čija je aminokiselinska sekvenca kodirana polinukleotidom čija sekvenca ima ID broj 6. Poželjno, a-glukozidaza je hipertermofilna. Dalje, opisana je biljka koja je stabilno transformisana vektorom koji sadrži gen za izomerazu glukoze, čija aminokiselinska sekvenca ima ID broj 18, 20, 28, 29, 30, 38, 40, 42, pr 44, ili čija je aminokiselinska sekvenca kodirana polinukleotidom čiji je ID broj 19, 21, 37, 39, 41 ili 43. Poželjno, izomeraza glukoze je hipertermofilna. U drugom rešenju, opisana je biljka koja je stabilno transformisana vektorom koji sadrži gen za gluko-amilazu, čija aminokiselinska sekvenca ima ID broj 45, 47 ili 49, ili čija je aminokiselinska sekvenca kodirana polinukleotidom čiji je ID broj 46, 48, 50 i!i 59. Poželjno, gluko-amilaza je hipertermofilna.
Dalje su obezbeđeni biljni proizvodi, kao što su seme, plod ili zrno biljaka koje su stabilno transformisane prema predmetnom pronalasku.
U drugom rešenju. predmetni pronalazak se odnosi na transformisanu biljku, čiji je genom pojačan rekombinantnim polinukleotidom koji kodira barem jedan enzim za prerađivanje operativno povezan sa promoterskom sekvencom. pri čemu je sekvenca polinukleotida optimizovana za ekspresiju u biljci. Biljka može biti monokotileđona. kao što je to kukuruz, ili dikotiledona. Poželjno, biljka je žitarica ili biljka koja se komercijalno uzgaja. Enzim za prerađivanje je izabran iz grupe koju čine a-amilaza. glukoamilaza. izomeraza glukoze, glukanaza. p-amilaza. a-glukozidaza, izoamilaza, pululanaza, neo-pululanaza, izo-pululanaza, amilopululanaza, celulaza, agzo-1,4-p-celobiohidrolaza, egzo-1,3-P-D-glukanaza, p-glukozidaza, endoglukanaza, L-arabinaza. a-arabinozidaza. galaktanaza, mananaza, ksilanaza, ksilozidaza, proteaza. glukanaza, ksilanaza. esteraza, fitaza i lipaza. Poželjno, enzim za prerađivanje je enzim za prerađivanje škroba izabran iz grupe koju čine a-amilaza. glukoamilaza. izomeraza glukoze, p-amilaza. a-glukozidaza, izoamilaza. pululanaza, neo-pululanaza. izo-pululanaza i amilopululanaza. Poželjnije, enzim je izabran iz grupe koju čine a-amilaza, glukoamilaza, izomeraza glukoze, a-glukozidaza i pululanaza. Dalje, poželjno je daje enzim za prerađivanje hipertermofilan. Shodno ovom aspektu predmetnog pronalaska, enzim može biti enzim za razgradnju koji ne razgrađuje škrob i koji je izabran iz grupe koju čine proteaza, glukanaza, ksilanaza, esteraza, fitaza i lipaza. Poželjno, pomenuti enzimi su hipertermofilni, U poželjnom rešenju, enzim se nakuplja u vakuoli. endoplazmatskom retikulumu, hloroplastu, granuli škroba, semenu ili ćelijskom zidu biljke. Štaviše, u drugom rešenju, genom biljke može biti dalje pojačan drugim rekombinantnim polinukleotidom koji kodira enzim koji nije hipertermofilan.
U drugom rešenju prema predmetnom pronalasku, obezbeđena je transformisana biljka, čiji je genom pojačan rekombinantnim polinukleotidom koji kodira barem jedan enzim za prerađivanje izabran iz grupe koju čine a-amilaza, glukoamilaza, izomeraza glukoze, a-glukozidaza i pululanaza, koji je operativno povezan sa promoterskom sekvencom, pri čemu je polinukleotid ove sekvence optimizovan za ekspresiju u biljci. Poželjno, enzim za prerađivanje je hipertermofilan i poreklom je iz kukuruza.
Drugo rešenje prema predmetnom pronalasku se odnosi na transformisanu biljku kukuruza, Čiji je genom pojačan rekombinantnim polinukleotidom koji kodira barem jedan enzim za prerađivanje izabran iz grupe koju čine a-amilaza, glukoamilaza, izomeraza glukoze, a-glukozidaza i pululanaza, čija je sekvenca operativno povezana sa promoterskom sekvencom, pri čemu je polinukleotid ove sekvence optimizovan za ekspresiju u biljci kukuruza. Poželjno, enzim za prerađivanje je hipertermofilan.
Obezbeđena je transformisana biljka, čiji je genom pojačan rekombinantnim polinukleotidom čija sekvenca ima ID broj 2, 9 ili 52, koji je operativno povezan sa promoterskom i signalnom sekvencom. Dodatno, opisana je i transformisana biljka, čiji je genom pojačan rekombinantnim polinukleotidom čija sekvenca ima ID broj 4 ili 25, koji je operativno povezan sa promoterskom i signalnom sekvencom. U drugom rešenju, obezbeđena je transformisana biljka, čiji je genom pojačan rekombinantnim polinukleotidom čija sekvenca ima ID broj 6, koji je operativno povezan sa promoterskom i signalnom sekvencom. Dodatno, opisana je transformisana biljka, čiji je genom pojačan rekombinantnim polinukleotidom čija sekvenca ima ID broj 19, 21, 37, 39, 41 ili 43. Takođe, obezbeđenaje transformisana biljka, čiji je genom pojačan rekombinantnim polinukleotidom čija sekvenca ima ID broj 46, 48. 50 ili 59.
Predmetni pronalazak se odnosi i na proizvode transformisanih biljaka. Proizvodi, na primer, obuhvataju seme, plod ili zrno. Alternativno, proizvod može biti enzim za prerađivanje, škrob ili šećer.
Dalje je opisana biljka koja se dobija od stabilno transformisanih biljaka prema predmetnom pronalasku. U ovom rešenju, pomenuta biljka može biti hibridna biljka ili biljka potomak.
Dalje rešenje predmetnog pronalaska obezeđuje škrob određenog sastava, pri čemu je obuhvaćen barem jedan enzim za proizvodnju i to proteaza, glukanaza ili esteraza. Poželjno, pomenuti enzim je hipertermofilan.
Rešenje prema predmetnom pronalasku obezbeđuje i zrno koje sadrži barem jedan enzim za proizvodnju i to a-amilazu, pululanazu, oglikozidazu, glukoamilazu ili izomerazu glukoze. Poželjno, enzim je hipertermofilan.
U drugom rešenju, obezbeđen je postupak za dobijanje granula škroba, koji se sastoji od: tretiranja zrna barem jednim enzimom koji ne prerađuje škrob u uslovima u kojima je aktivan barem jedan od tih enzima; dobijanja smeše koja sadrži granule škroba i proizvode razgradnje koji se razlikuju od škroba, pri čemu se zrno dobija od transformisane biljke, čiji je genom pojačan eksprsionom kasetom koja kodira barem jedan enzim; kao i od izdvajanja granula škroba iz smeše. Pri tome, poželjno je da je enzim proteaza, glukanaza, ksilanaza, fitaza ili esteraza. Štaviše, enzim je poželjno hipertermofilan. Zrno može biti usitnjeno i/ili može biti tretirano u uslovima male ili velike vlažnosti. Alternativno, zrno može da se tretira sumpor dioksidom. Predmetni pronalazak dalje poželjno obuhvata izdvajanje iz smeše proizvoda koji se razlikuju od škroba. Dalje su opisani škrobni i neskrobni proizvodi dobijeni pomoću ovog postupka.
U još jednom rešenju, obezbeđen je postupak za proizvodnju hiperslatkog kukuruza, koji se sastoji iz tretiranja transformisanog kukuruza ili njegovog dela, čiji je genom pojačan ekspresionom kasetom koja se eksprimira u endospermu i koja kodira barem jedan enzim koji razgrađuje ili vrši izomerizaciju škroba, u uslovima u kojima je aktivan barem jedan enzim, tako da se polisaharidi u kukuruzu prevode u šećere, pri čemu se dobija hiperslatki kukuruz. Dalje, ekspresiona kaseta poželjno sadrži promoter koji je operativno povezan sa polinukleotidom koji kodira enzim. Promoter može biti, na primer, konstitutivni promoter, za seme specifični promoter, ili za endosperm specifični promoter. Poželjno, enzim je hipertermofilan. Poželjnije, enzim je a-amilaza. Ekspresiona kaseta koja se ovde koristi može dalje da sadrži polinukleotid koji kodira signalnu sekvencu operativno povezanu sa barem jednim enzimom. Signalna sekvenca može, na primer. da usmeri hipertermofilni enzim ka aloplastu ili endoplazmatskom retikulumu. Poželjno, enzimi poseduju bilo koju od sekveni čiji su ID brojevi 13, 14, 15, 16, 33 ili 35.
U najpoželjnijem rešenju, opisan je postupak za proizvodnju hiperslatkog kukuruza, koji se sastoji iz tretiranja transformisanog kukuruza ili njegovog dela. čiji je genom pojačan ekspresionom kasetom koja se eksprimira u endospermu i koja kodira a-amilazu. u uslovima u kojima je aktivan barem jedan enzim, tako da se polisaharidi u kukuruzu prevode u šećere, pri čemu se dobija hiperslatki kukuruz. Poželjno, enzim je hipertermofilan, a hipertermofilna amilaza poseduje aminokiselinsku sekvencu čiji je ID broj 10. 13. 14, 15, 16, 33 ili 35. ili enzimski aktivni segment ovih sekvenci koji poseduje a-amilaznu aktivnost.
Ovde je opisan i postupak za dobijanje rastvora proizvoda hidrolize škroba, koji obuhvata tretiranje dela biljke sa granulama škroba barem jednim enzimom za prerađivanje u uslovima u kojima je aktivan barem jedan enzim, pri čemu se granule škroba prerađuju i čime se stvara vodeni rastvor koji sadrži proizvod hidrolize škroba, pri čemu se deo biljke dobija od transformisane biljke, čiji je genom pojačan ekspresionom kasetom koja kodira barem jedan enzim za prerađivanje škroba; postupak obuhvata i prikupljanje vodenog rastvor koji sadrži proizvod hidrolize škroba. Proizvod hidrolize škroba može da sadrži dekstrin, maltooligosaharid, glukozu i/ili njihovu smešu. Poželjno, enzim je a-.amilaza, a-glukozidaza, glukoamilaza, pululanaza, amilopululanaza, izomeraza glukoze, ili bilo koja njihova kombinacija. Štaviše, poželjno je daje enzim hipertermofilan. U drugom rešenju, genom dela biljke može dalje biti pojačan ekspresionom kasetom koja kodira ne-hipertermofilni enzim za prerađivanje škroba. Ne-hipertermofilni enzim za prerađivanje škroba može biti izabran iz grupe koju čine amilaza, glukoamilaza, a-glukozidaza, pululanaza. izomeraza glukoze, ili njihova kombinacija. U još jednom rešenju, poželjno je da je enzim za prerađivanje eksprimiran u endospermu. Poželjno, pomenuti deo biljke je zrno, i to zrno kukuruza, pšenice, ječma. raži. ovsa, šećerne trske ili pirinča. Poželjno, barem jedan enzim je operativno povezan sa promoterskom i signalnom sekvencom koja usmerava enzim ka granuli škroba, endoplazmatskom retikulumu. ili ćelijskom zidu. Dalje, postupak obuhvata izolaciju proizvoda hidrolize škroba i/ili fermentaciju proizvoda hidrolize škroba.
U drugom rešenju prema predmetnom pronalasku, opisan je postupak dobijanja proizvoda hidrolize škroba koji obuhvata tretiranje dela biljke sa granulama škroba barem jednim enzimom za prerađivanje škroba u uslovima u kojima je aktivan barem jedan enzim, pri čemu se granule škroba prerađuju i čime se stvara vodeni rastvor koji sadrži proizvod hidrolize škroba, pri čemu se deo biljke dobija od transformisane biljke, čiji je genom pojačan ekspresionom kasetom koja kodira barem jednu a-amilazu; postupak obuhvata i prikupljanje vodenog rastvora koji sadrži proizvod hidrolize škroba. Poželjno je da je a-amilaza hipertermofilana, a poželjnije je da hipertermofilna a-amilaza ima aminokiselinsku sekvencu čiji je ID broj 1, 10, 13, 14, 15, 16. 33 ili 35, ili aktivni fragment ovih sekvenci koji poseduje a-amilaznu aktivnost. Poželjno, ekspresiona kaseta sadrži polinukleotid koji je izabran iz grupe koju čine sekvence čiji je ID broj 2, 9, 46 ili 52, njima komplementarne sekvence ili polinukleotid koji hibridizuje sa bilo kojom od sekvenci čiji su ID brojevi 2, 9. 46 ili 52 u uslovima slabo precizne hibridizacije i koje kodiraju polipeptid koji ima aktivnost a-amilaze. Štaviše. predmetni pronalazak dalje obezbeđuje genom transformisane biljke koji sadrži polinukleotid koji kodira ne-termofilni enzim za prerađivanje škroba. Alternativno, biljni deo može biti tretiran ne-hipertermofilnim enzimom za prerađivanje škroba.
Predmetni pronalazak se dalje odnosi na deo transformisane biljke koji sadrži barem jedan enzim za prerađivanje škroba koji je prisutan u ćelijama biljke, pri čemu se biljni deo dobija od transformisane biljke, čiji je genom pojačan ekspresionom kasetom koja kodira barem jedan enzim za prerađivanje škroba. Poželjno, enzim predstavlja enzim za prerađivanje škroba, koji je izabran iz grupe koju čine a-amilaza, glukoamilaza, izomeraza glukoze, P-amilaza. a-glukozidaza, izoamilaza, pululanaza, neo-pululanaza, izo-pululanaza i amilopululanaza. Dalje, enzim je poželjno hipertermofilan. Biljka može biti bilo koja biljka, ali je poželjno da je to kukuruz.
Drugo rešenje prema predmetnom pronalasku obuhvata deo transformisane biljke koji sadrži barem jedan enzim za prerađivanje koji ne prerađuje škrob i koji je prisutan u ćelijama biljke, pri čemu se biljni deo dobija od transformisane biljke, čiji je genom pojačan ekspresionom kasetom koja kodira barem jedan enzim za prerađivanje koji ne prerađuje škrob ili barem jedan enzim za prerađivanje polisaharida koji ne prerađuje škrob. Poželjno, enzim je hipertermofilan. Dalje, poželjno je da enzim za prerađivanje koji ne prerađuje škrob bude izabran iz grupe koju čine proteaza, glukanaza, ksilanaza. esteraza, fitaza i lipaza. Biljni deo može biti bilo koji deo biljke, ali je poželjno daje to list, seme, plod, zrno, mahuna, pleva ili pleva šećerne trske.
Predmetni pronalazak se takođe odnosi na delove transformisanih biljaka. Na primer. opisan je deo transformisane biljke koji sadrži a-amilazu čija aminokiselinska sekvenca ima ID broj 1. 10. 13, 14, 15, 16, 33 ili 35, ili čija je aminokiselinska sekvenca kodirana polinukleotidom čija sekvenca ima ID broj 2, 9, 46 ili 52; deo transformisane biljke koji sadrži a-glukozidazu čija aminokiselinska sekvenca ima ID broj 5, 26 ili 27, ili čija je aminokiselinska sekvenca kodirana polinukleotidom čija sekvenca ima ID broj 6; deo transformisane biljke koji sadrži izomerazu glukoze čija aminokiselinska sekvenca ima ID broj 28. 29, 30, 38, 40, 42 ili 44, ili čija je aminokiselinska sekvenca kodirana polinukleotidom čija sekvenca ima ID broj 19, 21, 37, 39, 41 ili 43: deo transformisane biljke koji sadrži glukoamilazu čija aminokiselinska sekvenca ima !D broj 45, 47 ili 49, ili čija je aminokiselinska sekvenca kodirana polinukleotidom čija sekvenca ima ID broj 46, 48, 50 ili 59; deo transformisane biljke koji sadrži pululanazu čija je aminokiselinska sekvenca kodirana polinukleotidom čija sekvenca ima ID broj 4 ili 25.
Drugo rešenje se odnosi na postupak prevođenja škroba u delu transformisane biljke, koji obuhvata aktivaciju enzima za prerađivanje škroba sadržanog u tom delu. Dalje su opisani škrob, dekstrin, maltooligosaharid ili šećer koji su dobijem' putem ovog postupka.
Predmetni pronalazak dalje opisuje postupak korišćenja dela transformisane biljke koji sadrži barem jedan enzim za prerađivanje koji ne prerađuje škrob u ćelijskom zidu ili u ćeliji biljnog dela, pri čemu postupak obuhvata tretiranje dela transformisane biljke korišćenjem barem jednog enzima za prerađivanje polisaharida koji ne prerađuje škrob u uslovima koji omogućavaju da barem jedan enzim bude aktivan, pri čemu se razgrađuje polisaharid koji se razlikuje od škroba, čime se dobija vodeni rastvor koji sadrži oligosaharid i/ili šećere, pri čemu se biljni deo dobija od transformisane biljke, čiji je genom pojačan ekspresionom kasetom koja kodira barem jedan enzim za prerađivanje polisaharida koji ne prerađuje škrob: navedeni postupak obuhvata i prikupljanje vodenog rastvora koji sadrži oligosaharide i/ili šećere. Poželjno, enzim za prerađivanje polisaharida koji ne prerađuje škrob je hipertermofilan.
Opisan je i postupak korišćenja semena transformisane biljke koje sadrži barem jedan enzim za prerađivanje, pri čemu postupak obuhvata tretiranje semena transformisane biljke korišćenjem barem jedne proteaze ili lipaze u uslovima koji omogućavaju da barem jedan enzim bude aktivan, pri čemu se dobija vodena smeša koja sadrži aminokiseline i masne kiseline, pri čemu se seme dobija od transformisane biljke, čiji je genom pojačan ekspresionom kasetom koja kodira barem jedan od enzima; navedeni postupak obuhvata i prikupljanje vodene smeše. Poželjno je da se aminokiseline, masne kiseline ili obe klase supstanci izdvoje iz smeše. Poželjno, hipertermofilna je ili proteaza ili lipaza.
Opisan je i postupak za dobijanje etanoia, koji obuhvata tretiranje biljnog dela barem sa jednim enzimom za prerađivanje polisaharida, čime se dobija oligosaharid ili fermentabilni šećer, pri čemu se biljni deo dobija od transformisane biljke, čiji je genom pojačan ekspresionom kasetom koja kodira barem jedan od enzima za prerađivanje polisaharida; postupak obuhvata i inkubaciju fermentabilnog šećera u uslovima koji podstiču prevođenje fermentabilnog šećera ili oligosaharida u etanol. Poželjno, pomenuti deo biljke je zrno, plod. seme. stabljika, drvo, povrće ili koren. Poželjno, biljni deo se dobija od biljke koja je izabrana iz grupe koju čine ovas, ječam, pšenica, bobica, grožđe, raž. kukuruz, pirinač. krompir. šećerna repa, šećerna trska, ananas, trave i drveće. U drugom poželjnom rešenju, enzim za prerađivanje polisaharida je a-amilaza, glukoamilaza, a-glukozidaza, izomeraza glukoze, pululanaza, ili njihova kombinacija.
Postupak za dobijanje etanoia obuhvata tretiranje biljnog dela koji sadrži barem jedan od enzima koji je izabran iz grupe koju čine a-amilaza, glukoamilaza. a-glukozidaza, izomeraza glukoze, pululanaza, ili njihova kombinacija, uz zagrevanje tokom određenog vremenskog perioda u uslovima u kojima je aktivan barem jedan od enzima, čime se polisaharid razgrađuje i čime se dobija fermentabilni šećer, pri čemu se biljni deo dobija od transformisane biljke, čiji je genom pojačan ekspresionom kasetom koja kodira barem jedan od enzima; postupak obuhvata i inkubaciju fermentabilnog Šećera u uslovima koji pospešuju prevođenje fermentabilnog šećera u etanol. Poželjno, barem jedan enzim je hipertermofilan ili mezofilan.
U drugom rešenju, obezbeđen je postupak za dobijanje etanoia koji obuhvata tretiranje biljnog dela koji sadrži barem jedan od enzima za prerađivanje koji ne prerađuje škrob u uslovima li kojima je aktivan barem jedan enzim, pri čemu se polisaharid koji se razlikuje od škroba razgrađuje do oligosaharida i fermentabilnog šećera, pri čemu se biljni deo dobija od transformisane biljke, čiji je genom pojačan ekspresionom kasetom koja kodira barem jedan enzim; postupak obuhvata i inkubaciju fermentabilnog šećera u uslovima koji pospešuju prevođenje fermentabilnog šećera u etanol. Poželjno, enzim za prerađivanje koji ne prerađuje ski'ob je glukanaza. ksilanaza ili celulaza.
Dalje jc obezbeđen postupak za dobijanje etanoia koji obuhvata tretiranje biljnog dela koji sadrži barem jedan od enzima koji je izabran iz grupe koju čine a-amilaza. glukoamilaza. a-glukozidaza, izomeraza glukoze, pululanaza, ili njihova kombinacija, u uslovima u kojima je aktivan barem jedan od enzima, čime se polisaharid razgrađuje do fermentabilnog šećera, pri čemu se biljni deo dobija od transformisane biljke, čiji je genom pojačan ekspresionom kasetom koja kodira barem jedan od enzima; postupak obuhvata i inkubaciju fermentabilnog šećera u uslovima koji pospešuju prevođenje fermentabilnog šećera u etanol. Poželjno, enzim je hipertermofilan.
Dalje, opisan je postupak za proizvodnju zaslađene brašnaste namirnice bez dodavanja dodatnog zaslađivača, koji obuhvata tretiranje biljnog dela koji sadrži barem jedan enzim za prerađivanje škroba, u uslovima u kojima je aktivan barem jedan enzim, pri čemu se granule škroba u biljnom delu prerađuju u šećere, čime se dobija zaslađeni proizvod, pri čemu se biljni deo dobija od transformisane biljke, čiji je genom pojačan ekspresionom kasetom koja kodira barem jedan od enzima; postupak obuhvata i prerađivanje zaslađenog proizvoda u brašnastu namirnicu. Brašnasta namirnica može biti u obliku zaslađenog proizvoda i vode. Dalje, brašnasti proizvod može da sadrži slad, veštačku aromu, vitamine, minerale, veštačke boje ili bilo koju njihovu kombinaciju. Poželjno, barem jedan enzim je hipertermofilan. Enzim može biti izabran iz grupe koju čine a-amilaza, a-glukozidaza, glukoamilaza. pululanaza, izomeraza glukoze, ili bilo koja njihova kombinacija. Biljka dalje može biti izabrana iz grupe koju čine soja, raž, ovas, ječam, pšenica, kukuruz, pirinač i šećerna trska. Poželjno, brašnasti proizvod je namirnica od žitarica, namirnica za doručak, namirnica koja može odmah da se konzumira ili pečena namirnica. Obrada namirnice može da obuhvata pečenje, kuvanje, izlaganje toploti, pripremanje na pari, izlaganje električnom pražnjenju ili primenu bilo koje kombinacije prethodno navedenih postupaka.
Predmetni pronalazak se dalje odnosi na postupak za zaslađivanje proizvoda koji sadrži škrob, bez dodavanja zaslađivača, koji obuhvata tretiranje škroba barem jednim od enzima za prerađivanje škroba u uslovima u kojima je aktivan barem jedan enzim, čime se škrob razgrađuje do šećera i slatkog škroba, pri čemu se škrob dobija iz transformisane biljke, čiji je genom pojačan ekspresionom kasetom koja kodira barem jedan od enzima; postupak obuhvata i dodavanje slatkog škroba u proizvod, kako bi se dobio proizvod koji sadrži zaslađeni škrob. Poželjno, transformisana biljka je izabrana iz grupe koju čine kukuruz, soja. raž. ovas, ječam, pšenica, pirinač i šećerna trska. Poželjno, barem jedan enzim je hipertermofilan. Poželjnije, barem jedan enzim je a-amilaza. a-glukozidaza. glukoamilaza. pululanaza, izomeraza glukoze, ili bilo koja njihova kombinacija.
Obezbeđenaje i brašnasta namirnica i proizvod koji sadrži zaslađeni škrob.
Predmetni pronalazak se takođe odnosi na postupak za zaslađivanje voća ili povrća koji sadrže polisaharide i koji obuhvata tretiranje voća ili povrća barem jednim enzimom za prerađivanje polisaharida u uslovima u kojima je aktivan barem jedan enzim, čime se polisaharid iz voća ili povrća razgrađuje do šećera, pri čemu se dobija zaslađeno voće ili povrće, pri čemu se voće ili povrće dobija iz transformisane biljke, čiji je genom pojačan ekspresionom kasetom koja kodira barem jedan od enzima za prerađivanje polisaharida. Voće ili povrće je izabrano iz grupe koju čine krompir, paradajz, banana, bundeva, grašak i pasulj. Poželjno, barem jedan enzim je hipertermofilan.
Predmetni pronalazak se dalje odnosi na postupak za dobijanje vodenog rastvora koji sadrži šećer, koji obuhvata tretiranje granula škroba dobijenih iz biljke u uslovima u kojima je aktivan barem jedan enzim, čime se dobija vodeni rastvor koji sadrži šećer.
Drugo rešenje se odnosi na postupak za dobijanje proizvoda izvedenih iz škroba poreklom iz žitarica, pri čemu postupak ne obuhvata vlažno ili suvo mlevenje pre izdvajanja proizvoda izvedenih iz škroba, već koji obuhvata tretiranje biljnog dela koji sadrži granule škroba i barem jedan enzim za prerađivanje škroba u uslovima u kojima je barem jedan enzim aktivan, čime se prerađuju granule škroba do vodenog rastvora koji sadrži dekstrine ili šećere, pri čemu se biljni deo dobija od transformisane biljke, čiji je genom pojačan ekspresionom kasetom koja kodira barem jedan od enzima koji prerađuju škrob; postupak obuhvata i prikupljanje vođenog rastvora koji sadrži proizvod izveden iz škroba. Poželjno, barem jedan enzim za prerađivanje škroba je hipertermofilan.
Dalje, obezbeđen je postupak izolacije a-amilaze, glukoamilaze, izomeraze glukoze, a-glukozidaze i pululanaze, koji podrazumeva kultivaciju transformisane biljke i izolaciju a-amilaze, glukoamilaze, izomeraze glukoze, a-glukozidaze, pululanaze iz tih biljaka. Poželjno, izolovani enzim je hipertermofilan.
Dalje je obezbeđen postupak dobijanja maltodekstrina. koji obuhvata mešanje trans<g>ene žitarice sa vodom, zagrevanje pomenute smeše. razdvajanje čvrstog ostatka od nastalog dekstrinskog sirupa i prikupljanje maltodekstrina. Poželjno, transgene žitarice sadrže barem jedan enzim za prerađivanje škroba. Poželjno, enzim za prerađivanje škroba je a-amilaza.<g>lukoamilaza. a-glukozidaza i izomeraza glukoze. Dalje, obezbeđen je maltodekstrin i preparati koji se dobijaju primenom postupka prema predmetnom pronalasku.
Obezbeđen je postupak za dobijanje dekstrina ili šećera iz žitarice, koji ne obuhvata mehaničko razaranje zrna pre izdvajanja derivata škroba, pri čemu ovaj postupak obuhvata tretiranje biljnog dela koji sadrži granule škroba barem jednim enzimom za prerađivanje škroba u uslovima u kojima je barem jedan od enzima aktivan, pri čemu se granule škroba prerađuju do vodenog rastvora koji sadrži dekstrine ili šećere, pri čemu se biljni deo dobija ođ transformisane biljke, čiji je genom pojačan ekspresionom kasetom koja kodira barem jedan od enzima; postupak obuhvata i prikupljanje vodenog rastvora koji sadrži šećer i/ili dekstrine.
Predmetni pronalazak se dalje odnosi na postupak za dobijanje fermentabilnog šećera, koji obuhvata tretiranje biljnog dela koji sadrži granule škroba barem jednim enzimom za prerađivanje škroba u uslovima u kojima je barem jedan od enzima aktivan, pri čemu se granule škroba prerađuju do vodenog rastvora koji sadrži dekstrine ili šećere, pri čemu se biljni deo dobija od transformisane biljke, čiji je genom pojačan ekspresionom kasetom koja kodira barem jedan od enzima; postupak obuhvata i prikupljanje vodenog rastvora koji sadrži fermentabilni šećer.
Dalje, predmetnim pronalaskom je obezbeđena biljka kukuruza koja je stabilno transformisana vektorom koji kodira hipertermofilnu a-amilazu. Na primer. poželjno je da je biljka kukuruza stabilno transformisana vektorom koji sadrži polinukleotidnu sekvencu koja kodira a-amilazu koja poseduje stepen identičnosti veći od 60% sa sekvencom čiji je ID broj I ili 5.
Kratak opis crteža
Slike 1A i 1B ilustruju aktivnost a-amilaze eksprimirane u zrnima kukuruza i u endospermu izdvojenom iz TI zrna poreklom iz pNOV6201 biljaka i iz šest pNOV6200 linija.
Slika 2 i I list ruje aktivnost a-amilaze izdvojene iz TI zrna poreklom iz pNOV620l linija.
Slika 3 opisuje količinu etanoia dobijenog nakon fermentacije kaše od transgenog kukuruza koja sadrži termostabilnu 797GL3 a-amilazu i koja je podvrgnuta likvefakciji u trajanju od 60 minuta na temperaturi od 85 °C i 95 °C. Ova slika pokazuje daje prinos etanoia nakon 72 časa fermentacije skoro nepromenjen, ako likvefakcija traje od 15 do 60 minuta. Dalje, slika pokazuje da kaša dobijena likvefakcijom na 95 °C proizvodi više etanoia u bilo kom vremenskom trenutku u odnosu na kašu dobijenu likvefakcijom na 85 °C.
Slika 4 prikazuje količinu rezidualnog škroba (%) nakon fermentacije kaše od transgenog kukuruza koja sadrži termostabilnu a-amilazu i koja je podvrgnuta likvefakciji u trajanju do 60 minuta na temperaturi od 85 °C i 95 °C. Ova slika pokazuje daje prinos etanoia nakon 72 časa fermentacije skoro nepromenjen, ako likvefakcija traje od 15 do 60 minuta. Dalje, slika pokazuje pokazuje da kaša dobijena likvefakcijom na 95 °C proizvodi više etanoia u bilo kom vremenskom trenutku u odnosu na kašu dobijenu likvefakcijom na 85 °C.
Slika 5 prikazuje prinos etanoia dobijenog iz kaše od transgenog kukuruza, kontrolnog kukuruza i njihovih različitih smeša, dobijenih na 85 °C i na 95 °C. Ova slika pokazuje da korišćenje transgenog kukuruza koji sadrži a-amilazu vodi značajnom poboljšanju pri dobijanju škroba koji je dostupan fermentaciji, jer postoji smanjenje količine škroba koji preostaje nakon fermentacije.
Slika 6 prikazuje količinu rezidualnog škroba koja je izmerena na osnovu suvog ostatka nakon fermentacije kaše od transgenog kukuruza, kontrolnog kukuruza i njihovih različitih smeša, na 85 °C i na 95 °C.
Slika 7 predstavlja prinos etanoia u funkciji vremena fermentacije uzorka koji sadrži 3% transgenog kukuruza, tokom 20 - 80 časova, pri različitim pH vrednostima u opsegu od 5,3 - 6,4. Slika prikazuje da fermentacija koja se izvodi pri nižoj pH vrednosti napreduje brže od fermentacije pri pH vrednosti od 6 ili višoj.
Slika 8 prikazuje prinos etanoia tokom fermentacije kaše koja sadrži različite masene procente transgenog kukuruza, čija se količina kreće od 0 - 12% (masenih) pri različitim pH vrednostima u opsegu od 5,2 - 6,4. Ova slika pokazuje da je prinos etanoia nezavisan od količine transgenog kukuruza koji se nalazi u uzorku.
Slika 9 prikazuje analizu T2 semena dobijenog različitim transformacijama sa pNOV 7005. U poređenju sa netransgenom kontrolom, može se primetiti velika ekspresija aktivnosti pululanaze.
Slike 10A i 10B prikazuju rezultate HPLC analize hidrolitićkih proizvoda dobijenih korišćenjem eksprimirane pululanaze iz škroba u brašnu transgenog kukuruza. Inkubacija brašna od kukuruza u kome je eksprimirana pululanaza u reakcionom puteni na temperaturi od 75 °C tokom 30 minuta dovodi do nastanka oligosaharida srednje dužine lanca (stepen polimerizacije (DP - Dcgree of Poiymerization) je približno 10 - 30) i kratkih lanaca amiloze (DP približno 100 - 200) iz škroba kukuruza. Slike 10A i 10B takođe prikazuju dejstvo dodatih kalcijumovih jona na aktivnost pululanaze.
Slike l 1A i 1IB opisuju podatke prikupljene HPLC analizom proizvoda hidrolize škroba iz dve reakcione smeše. Prva reakciona smeša označena kao »Amilaza« sadrži smešu [1:1 (wAv)J uzoraka kukuruznog brašna transgenog kukuruza koji eksprimira a-amilazu i netransgenog kukuruza A188; druga reakciona smeša označena kao «Amilaza + Pululanaza« sadrži transgeni kukuruz koji eksprimira a-amilazu i transgeni kukuruz koji eksprimira pululanazu.
Slika 12 prikazuje količinu šećera izraženu u ug po 25 u I reakcione smeše za dve reakcione smeše. Prva reakciona smeša označena kao «Amilaza» sadrži smešu [1:1 (vv/\v)] uzoraka kukuruznog brašna transgenog kukuruza koji eksprimira a-amilazu i netransgenog kukuruza A188; druga reakciona smeša označena kao «Amilaza -i- Pululanaza» sadrži transgeni kukuruz koji eksprimira a-amilazu i transgeni kukuruz koji eksprimira pululanazu.
Slike 13A i 13B prikazuju proizvode hidrolize škroba iz dve serije reakcionih smeša na kraju inkubacije od 30 minuta na 85 °C i 95 °C. Za svaku seriju postoje dve reakcione smeše; prva reakciona smeša označena kao «Amilaza x Pululanaza« sadrži brašno transgenog kukuruza (dobijenog ukrštenim oprašivanjem) koji eksprimira i a-amilazu i pululanazu. a druga reakcionamseša označena kao «Amilaza» sadrži smešu uzoraka brašna transgenog kukuruza koji eksprimira a-amilazu i brašna netransgenog kukuruza A188, u odnosu koji omogućava da se dobije ista vrednost aktivnosti a-amilaze koja je izmerena u hibridu (Amilaza x Pululanaza).
Slika 14 prikazuje razgradnju škroba do glukoze korišćenjem semena netransgenog kukuruza (kontrola), semena transgenog kukuruza koje eksprimira 797GL3 a-amilazu i korišćenjem mešavine semena 797GL3 transgenog kukuruza i MalA a-glukozidaze.
Slika 15 prikazuje prerađivanje sirovog škroba na sobnoj temperaturi ili na 30 °C. Na ovoj slici reakcione smeše 1 i 2 predstavljaju kombinaciju vode i škroba na sobnoj temperaturi ili na 30 °C, respektivno. Reakcione smeše 3 i 4 predstavljaju kombinaciju a-amilaze ječma i škroba na sobnoj temperaturi ili na 30 °C, respektivno. Reakcione smeše 5 i 6 predstavljaju kombinaciju glukoamilaze poreklom izThermoanaerobacieriimi- ni škroba na sobnoj temperaturi ili na 30 °C. respektivno. Reakcione smeše 7 i 8 predstavljaju kombinaciju a-amilaze ječma (Sigma) i glukoamilaze poreklom izThennoanaerobacieriiun- ai škroba na sobnoj temperaturi ili na 30 °C, respektivno. Reakcione smeše 9 i 10 su kombinacije a-amilaze ječma (Sigma) kontrole i škroba na sobnoj temperaturi ili na 30 °C. respektivno. Naznačen je stepen polimerizacije (DP) proizvoda dobijenih dejstvom glukoamilaze poreklom izThernioanaerobacteriuni- a.
Slika 16 prikazuje proizvodnju fruktoze iz brašna transgenog kukuruza koji eksprimira amilazu korišćenjem kombinacije a-amilaze. a-glukozidaze i izomeraze glukoze, kao što je opisano u Primeru 19. Brašno transgenog kukuruza koji eksprimira amilazu se meša sa rastvorima enzima uz dodatak vode ili pufera. Sve reakcione smeše sadrže po 60 mg brašna transgenog kukuruza koji eksprimira amilazu i ukupno 600 p.1 tečnosti i inkubirane su tokom 2 časa na 90 °C.
Slika 17 prikazuje oblasti maksimalnih koncentracija proizvoda dobijenih iz reakcione smeše sa 100% brašnom transgenog kukuruza koji eksprimira amilazu iz zrna koje poseduje sposobnost samoprerađivanja, u funkciji vremena inkubacije u opsegu od 0 - 1200 minuta na 90 °C.
Slika 18 prikazuje oblasti maksimalnih koncentracija proizvoda dobijenih iz reakcione smeše sa 10% brašnom transgenog kukuruza koji eksprimira amilazu iz zrna koje poseduje sposobnost samoprerađivanja i 90%> brašna kontrolnog kukuruza, u funkciji vremena inkubacije u opsegu od 0 - 1200 minuta na 90 °C.
Slika 19 prikazuje rezultate HPLC analize bršna transgenog kukuruza koji eksprimira amilazu i koje je inkubirano na 70 °C, 80 °C, 90 °C ili 100 °C, u vremenu do 90 minuta, u cilju procene dejstva temperature na hidrolizu škroba.
Slika 20 prikazuje oblasti maksimalnih koncentracija detektovanih pomoću ELSD iz uzorka koji sadrži 60 mg brašna transgenog kukuruza koji eksprimira amilazu pomešanog sa rastvorima enzima uz dodatak vode ili pufera u različitim reakcionim uslovima. Jedna serija reakcionih smeša je puferovana sa 50 mM MOPS, pH 7,0 na sobnoj temperaturi, uz dodatak 10 mM MgS04i 1 mM CoCb; u drugoj seriji reakcionih smeša, rastvor pufera koji sadrži jone metala je zamenjen vodom. Sve reakcione smeše su inkubirane tokom 2 časa na temperaturi od 90 °C.
Detaljan opis predmetnog pronalaska
Shodno predmetnom pronalasku, biljka sa »sposobnošću samoprerađivanja«. ili njen deo. poseduje inkorporirani izolovani polinukleotid koji kodira enzim za prerađivanje koji je sposoban da u biljkama prerađuje, npr. modifikuje, različite vrste škroba, polisaharidc. lipide. proteine i slično, pri čemu pomenuti enzim može biti mezofilan. termofilan ili hipertermofilan i može biti aktiviran mlevenjem. dodavanjem vode. zagrevanjem. ili na neki drugi način, koji omogućava povoljne uslove za funkcionisanje enzima. Izolovani polinukleotid koji kodira enzim za prerađivanje je integrisan u biljku ili u deo biljke, gde se i eksprimira. Nakon ekspresije i aktivacije enzima za prerađivanje, biljka ili deo biljke prema predmetnom pronalasku prerađuje supstrat na koji enzim za prerađivanje inače deluje. Stoga, biljka ili deo biljke prema predmetnom pronalsku je sposobna da samoprerađuje supstrat za koji je enzim specifičan, nakon aktivacije enzima za prerađivanje koji je u biljci ili biljnom delu sadržan, u odsustvu ili uz smanjenu količinu spoljašnjih izvora enzima potrebnih za prerađivanje supstrata. Usled toga, transformisane biljke, transformisane biljne ćelije i transformisani delovi biljaka poseduju »ugrađene« sposobnosti za prerađivanje željenih supstrata pomoću enzima koji su u njima inkorporirani prema predmetnom pronalasku. Poželjno, polinukleotid koji kodira enzim za prerađivanje je »genetski stabilan«, tj. polinukleotid se stabilno održava u transformisanoj biljci ili u biljnim defovima prema predmetnom pronalasku i stabilno se prenosi kroz sukcesivne generacije potomstva.
Shodno predmetnom pronalasku, postupci koji koriste navedene biljke i biljne delove mogu da eliminišu potrebu za mlevenjem ili primenom nekog drugog fizičkog postupka razaranja integriteta biljnih delova pre prikupljanja proizvoda izvedenih iz škroba. Na primer, predmetni pronalazak obezbeđuje poboljšane postupke za preradu kukuruza i žitarica čime se dobijaju proizvodi izvedeni iz škroba. Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje postupak koji omogućava prikupljanje granula škroba koje sadrže određene nivoe enzima za razgrađivanje škroba, u samim granulama ili na njima, koji su dovoljni za hidrolizu specifičnih veza u škrobu, bez potrebe za dodavanjem egzogeno proizvedenih enzima za hidrolizu škroba. Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje poboljšane proizvode dobijene od biljke ili biljnog dela sa sposobnošću za samoprerađivanje, dobijenih primenom postupka prema predmetnom pronalasku.
Dodatno, korišćenjem "samoprerađujućeg" transformisanog dela biljke, npr. zrna, i transformisane biljke izbegavaju se veći problemi koji se javljaju prilikom primene postojeće tehnologije, tj. enzimi za prerađivanje se tipično proizvode fermentacijom mikroorganizama, što zahteva izolaciju enzima iz supernatanta kulture, što predstavlja trošak; izolovani enzim treba da bude formulisan za određenu primenu. a moraju da budu razvijeni i procesi i mašinerija za dodavanje, mešanje i reagovanje enzima sa supstratom. Transformisana biljka ili njen deo prema predmetnom pronalasku takođe predstavlja i izvor samog enzima za prerađivanje i izvor supstrata i proizvoda koji nastaju dejstvom tog enzima, kao što su šećeri, aminokiseline, masne kiseline, škrob i polisaharidi koji se razlikuju od škroba. Biljka prema predmetnom pronalasku takođe može da se koristi za dobijanje potomstva biljaka, bilo hibrida ili biljaka sa urođenim željenim karakteristikama.
Enzimi za prerađivanje i i polinukleotidi koji ih kodiraju
Polinukleotid koji kodira enzim za prerađivanje (mezofilni, termofilni ili hipertermofilni) biva uveden u biljku ili njen deo. Enzim za prerađivanje se bira prema željenom supstratu koji se nalazi u biljkama ili u transgenim biljkama i/ili se bira na osnovu željenog krajnjeg proizvoda. Na primer, enzim za prerađivanje može biti enzim za prerađivanje škroba, kao što su enzimi za razgrađivanje ili enzimi za izomerizaciju škroba, ili to može biti enzim za prerađivanje koji ne deluje na škrob. Odgovarajući enzimi za prerađivanje obuhvataju, bez ograničenja, enzime za razgradnju ili izomerizaciju škroba, u koje spadaju, na primer, a-amilaza, endo- ili egzo-1.4, ili 1,6-a-D, glukoamilaza. izomeraza glukoze. P-amilaze. a-glukozidaze. i druge egzo-amilaze; kao i enzimi koji deluju na mesta grananja škroba, kao što su izoamilaza, pululanaza, neo-pululanaza, izo-pululanaza. amilopululanaza, i slični; glikozil transferaze, kao što su ciklodekstrin glikoziltransferaza i slični; celulaze, kao što su egzo-l,4-P-celobiohidrolaza, egzo-l,3-P-D-glukanaza. hemicelulaza, P-glukozidaza, i slični; endoglukanaze, kao što su endo-l,3-P-glukanaza i endo-1,4-P-glukanaza i slični; L-arabinaze, kao što su endo-l,5-a-L-arabinaza, a-arabinozidaza, i slični; galaktanaze, kao što su endo-l,4-p-D-galaktanaza, endo-l,3-p-D-galaktanaza, p-galaktozidaza, a-galaktozidaza i slični; mananaze, kao što su endo-l,4-p-D-mananaza, P-manozidaza, a-manozidaza i slični; ksilanaze, kao što su endo-l,4-p-ksilanaza, p-D-ksilozidaza, 1,3-p-D-ksilanaza i slični; i pektinaze; kao i enzimi za prerađivanje koji ne deluju na škrob, kao što su proteaza, glukanaza, ksilanaza, tioredoksin/tioredoksin reduktaza, esteraza, fitaza i lipaza.
U jednom rešenju. enzim za prerađivanje je enzim za razgradnju škroba, koji je izabran iz grupe koju čine a-amilaza. pululanaza. a-glukozidaza. glukoamilaza. amilopululanaza. izomeraza glukoze ili njihove kombinacije. Shodno ovom rešenju predmetnog pronalaska, enzim za razgradnju škroba omogućava biljci ili delu biljke sa sposobnošću samorazgrađivanja da razgrađuje škrob nakon aktivacije enzima koji se nalazi li biljci ili u delu biljke, kao što će kasnije biti opisano. Enzim za razgradnju škroba se bira prema željenim krajnjim proizvodima. Na primer, može biti izabrana izomeraza glukoze u cilju prevođenja glukoze (heksoze) u fruktozu. Alternativno, enzim može biti izabran na osnovu željenog krajnjeg proizvoda izvedenog iz škroba sa različitom dužinom lanca, a prema, na primer. funkciji stepena prerađivanja ili prema različitim željenim obrascima granania. Na primer, a-amilaza, glukoamilaza ili amilopululanaza se mogu koristiti ili uz kratke periode inkubacije kako bi se dobili dekstrinski proizvodi, ili uz duže vreme inkubacije kako bi se dobili proizvodi kraćih lanaca ili šećeri. Pululanaza se može koristiti za specifičnu hidrolizu tački grananja u molekulu škroba, pri čemu se dobija škrob sa visokim sadržajem amiloze. a neopululanaza se može koristiti kako bi se dobio škrob sa trakama a-1,4 veza sa rasutim a-1,6 vezama. Za dobijanje graničnih dekstrina se može koristiti glukozidaza, ili se može koristiti kombinacija različitih enzima u cilju dobijanja drugih derivata škroba.
U drugom rešenju, enzim za prerađivanje je enzim koji ne prerađLije škrob i izabran je iz grupe koju čine proteaza, glukanaza, ksilanaza i esteraza. Ovi enzimi su inkorporirani u ciljna područja biljke ili biljnog dela sa sposobnošću samoprerađivanja prema predmetnom pronalasku i omogućavaju da se nakon aktivacije prekine integritet biljke, pri čemu granule škroba ostaju netaknute. Na primer. u željenom rešenju, enzimi za prerađivanje koji ne deluju na škrob deluju na matriks endosperma biljne ćelije i nakon aktivacije vrše razaranje matriksa endosperma, pri čemu ostavljaju intaktnim granule škroba u endospermu. što olakšava njihovo prikupljanje iz nastalog materijala.
Predmetni pronalazak obuhvata i kombinacije enzima za prerađivanje. Na primer, enzimi za prerađivanje škroba i enzimi za prerađivanje koji ne deluju na škrob se mogu koristiti u kombinaciji. Kombinacije enzima za prerađivanje se mogu dobiti korišćenjem višestrukih genskih konstrukata koji kodiraju svaki od enzima. Alternativno, pojedinačne transgene biljke koje su stabilno transformisane sa određenim enzimima mogu da.se ukrste poznatim postupcima, čime se dobija biljka koja sadrži oba enzima. Drugi postupak obuhvata korišćenje egzogenih enzima zajedno sa transgenom biljkom.
Enzimi za prerađivanje mogu da se izoluju ili izvedu iz bilo kog izvora, a stručnjaci mogu dešifrovati sekvence polinukleotida koji im odgovaraju. Na primer. enzim za prerađivanje. poželjno a-amilaza. je poreklom iz mikroorganizama iz roda Pvrococcus (npr.Pvrococcus furiosus).Thermus. Thermococcus (npr.Thennocncciis hvclrotennalis).Sulfolobus (npr.Safolobiis solfataricus),Thermotoga( T/ iermotoga marilimciiThcniiotoga ncapolitana),Thermoanaerobacterium (npr.Thermoanaerobacter tengcongcn. sis).Aspergillus( A. spergillus shirousainiiAspergillu. sniger),Rhizopus( Rfiizopi/ s orvzae).Thermoproteales. Desili furococcus (npr.Desulfurococcus amvlolvticus),iz mikroorganizama
Methanobacleriuin ihermoautulrophicitm, Methanococcu. s jannuschii, Mclhunopvnis
kandleri, Thermo. svnechococcus elongams, Thermoplasma aciclophilitui, Thennophisiiia
volcanicum, Aeropvntmpernix,kao i iz biljaka kao što su kukuruz, ječam i pirinač.
Enzimi za prerađivanje prema predmetnom pronalasku mogu biti aktivirani nakon uvođenja i eksprimiranja u genomu biljke. Uslovi za aktivaciju enzima su određeni za svaki dati enzim i obuhvataju različite uslove, kao što su određene vrednosti temperature, pH. vlažnosti, prisustvo metala, aktivirajućih jedinjenja, inaktivirajućih jedinjenja. itd. Na primer, enzimi zavisni od vrednosti temperature obuhvataju mezofilne, termofilne i hipettermofilne enzime. Mezofiini enzimi tipično pokazuju maksimalnu aktivnost na temperaturama od 20 - 65 °C i bivaju inaktivirani na temperaturama većim od 70 °C. Mezofiini enzimi poseduju značajnu aktivnost na temperaturama od 30 - 37 °C, dok im je aktivnost na 30 °C poželjno manja od 10% maksimalne aktivnosti, a poželjnije manja od 20% maksimalne aktivnosti.
Termofilni enzimi poseduju maksimalnu aktivnost na temperaturama između 50 i 80 °C i bivaju inaktivirani na temperaturama većim od 80 °C. Termofilni enzim poželjno poseduje aktivnost manju od 20% maksimalne aktivnosti na 30 °C, poželjnije manju od 10% maksimalne aktivnosti.
"Hipertennofilni" enzim poseduje aktivnost na još većim temperaturama. Hipertermofilni enzimi pokazuju maksimalnu aktivnost na temperaturama koje su veće od 80 °C i održavaju aktivnost na temperaturama od najmanje 80 °C, poželjnije na temperaturama od najmanje 90 °C, a najpoželjnije na temperaturama od najmanje 95 °C. Hipertermofilni enzimi takođe pokazuju smanjenu aktivnost na nižim temperaturama. Hipertermofilni enzim može posedovati aktivnost na 30 °C koja je manja od 1'% maksimalne aktivnosti, a poželjno koja je manja od 5% od maksimalne aktivnosti.
Polinukleotid koji kodira enzim za prerađivanje je poželjno modifikovan tako da obuhvata kodone koji su optimizovani za ekspresiju u izabranom organizmu, kao što je biljka
(videti. na primer. Wada et al., Nucl. Acids. Res.. 18 : 2367 (1990). iVkirrazet al.. Nucl. Acids Res.. 17 : 477 (1989). U.S. patenti br. 5.096.825. 5.625.136. 5.670.356 i 5.874.304). Sekvence sa optimizovanim kodonima su sintetičke sekvence. tj. one se ne javljaju u prirodi, a poželjno kodiraju identični polipeptid (ili enzimski aktivni fragment polipeptida pune dužine lanca, koji praktično poseduje istu aktivnost kao i polipeptid pune dužine lanca) koji je kodiran od strane roditeljskog polinukleotida koji ne poseduje sekvencu sa optimizovanim kodonima i koji kodira enzim za prerađivanje. Poželjno je da je polipeptid biohcmijski različit ili poboljšan, npr. primenom rekurzivne mutageneze molekula DNK koji kodira određeni enzim za prerađivanje, poreklom od polipeptida iz roditeljskog izvora, tako da su njegove karakteristike u toku primene u procesu poboljšane. Poželjni polinukleotidi su optimizovani za ekspresiju u ciljnoj biljci - domaćinu i kodiraju enzim za prerađivanje. Postupci za dobijanje ovih enzima obuhvataju mutagenezu, npr. rekurzivnu mutagenezu i selekciju. Postupci mutageneze i alteracije sekvence nukleotida su dobro poznati u struci. Videti, na primer, Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82 : 488, (1985); Kunkel et al., Methods in Enzvmol.. 154 : 367 (1987); U.S. patent, br. 4,873,192; V/alker & Gaastra, urednici (1983) Techniques in Molecular Biologv (MacMillan Publishing companv, Ne\v York), kao i tamo citirane reference, kao i Arnold et al., Chem. Eng. Sci.. 51 : 5091 (1996). Postupci za optimizaciju ekspresije segmenta nukleinske kiseline u ciljnoj biljci ili organizmu su dobro poznati u struci. Ukratko, dobija se tabela korišćenja kodona, koja ukazuje na optimalne kodone koji se koriste u ciljnom organizmu, pa se biraju optimalni kodoni kojima se zamenjuju oni u ciljnom polinukleotidu, a optimizovana sekvenca se onda hemijski sintetiše. Poželjni kodoni za kukuruz su opisani u U.S. patentu br. 5.625,136.
Dalje, opisane su nukleinske kiseline koje su komplementarne polinukleotidima prema predmetnom pronalasku. Primer uslova za slabo preciznu hibridizaciju komplementarnih nukleinskih kiselina, pri kojoj postoji više od 100 komplementarnih ostataka na filteru pri Southern ili Norther blot tehnici su: 50% formamid, npr. hibridizacija u 50% formamidu, 1 VI NaCI, 1 % SDS na 37 °C i ispiranje u 0,1 * SSC na 60 - 65 °C. Primer uslova za slabo preciznu hibridizaciju obuhvata odvijanje procesa u rastvoru pufera sa 30 - 35% formamida, 1 VI NaCI, 1% SDS (natrijum dodecil sulfat) na 37 °C i ispiranje u lx do 2x SSC (20X SSC = 3,0 M NaCI / 0,3 M trinatrijum citrat) na 50 do 55 °C. Primer uslova za srednje preciznu hibridizaciju: hibridizacija u 40 do 45% formamidu, 1,0 M NaCI, 1% NaCI, 1% SDS na 37 °C i ispiranje u 0,5X do IX SSC na 55 do 60 °C.
Dalje, opisani su polinukleotidi koji kodriaju "enzimski aktivni" fragment enzima za prerađivanje. Kao što se ovde koristi, pojam "enzimski aktivan" podrazumeva polipeptidni fragment enzima za prerađivanje koji poseduje praktično istli biološku aktivnost kao i enzim za prerađivanje i koji mođifikuje supstrat na koji enzim za prerađivanje normalno deluje pod odgovarajućim uslovima.
U poželjnom rešenju, polinukleotid prema predmetnom pronalasku je polinukleotid koji je optimizovan za kukuruz, koji kodria a-amilazu i koji poseduje sekvencu čiji je ID broj 2. 9, 46 i 52. U drugom željenom rešenju, polinukleotid je za kukuruz optimizovana pululanaza, koja poseduje sekvencu čiji je ID broj 4 i 25. U još jednom željenom rešenju. polinukleotid je za kukuruz optimizovani polinukleotid koji kodira a-glukozidazu. koja poseduje sekvencu čiji je ID broj 6. Drugi poželjni polinukleotid je za kukuruz optimizovani polinukleotid koji kodira izomerazu glukoze, koja poseduje sekvencu čiji je ID broj 19. 21. 37, 39, 41 ili 43. U drugom rešenju, poželjan je za kukuruz optimizovani polinukleotid koji kodira glukoamilazu, koja poseduje sekvencu čiji je ID broj 46, 48 ili 50. Dalje, obezbeđen je za kukuruz optimizovani polinukleotid koji kodira fuzioni peptid za glukanazu/mananazu, koji poseduje sekvencu čiji je ID broj 57. Predmetni pronalazak dalje obezbeđuje sekvence komplementarne navedenim polinukleotidima, koje hibridizuju u uslovima srednje, poželjno niske preciznosti i koji kodiraju polipeptid sa aktivnošću a-amilaze. pululanaze. a-glukozidaze, izomeraze glukoze, glukoamilaze, glukanaze ili mananaze, što zavisi od đatog slučaja.
Pojam "polinukleotid" može da se koristi naizmenično sa pojmovima "nukleinska kiselina" ili "polinukleinska kiselina" i odnosi se na deoksiribonukleotide ili na ribonukleotide i njihove polimere, bilo da su u jednolančanom ili dvolančanom obliku, koji su sastavljeni od monomera (nukleotida) koji sadrže šećer, fosfat i bazu, koja je ili purinska ili pirimidinska. Osim ukoliko nije drugačije naznačeno, pojam obuhvata nukleinske kiseline koje sadrže poznate analoge prirodnih nukleotida, koji poseduju slične osobine vezivanja kao i referentna nukleinska kiselina i koji se metabolišu na način koji je sličan prirodnim nukleotidima. Osim ukoliko nije drugačije naznačeno, određena sekvenca nukleinske kiseline takođe implicitno obuhvata njene konzervativno modifikovane varijante (supstitucije kod degenerisanih kodona) i komplementarne sekvence, kao i sekvence koje su eksplicitno naznačene. Specifično, supstitucije kod degenerisanih kodona se mogu dobiti stvaranjem sekvenci u kojima je nukleotid na trećoj poziciji jednog ili više izabranih (ili svih) kodona supstituisan sa mešanom bazom i/ili deoksinozinskim ostacima.
Dalje su obuhvaćene i "varijante" ili praktično iste sekvence. U slučaju sekvence nukleotida. varijante obuhvataju one sekvence koje, usled degeneracije genetskog koda. kodiraju aminokiselinsku sekvencu identičnu sekvenci nativnog proteina. Prirodno postojeće alelne varijante slične pomenutim mogu da se identifikuju korišćenjem dobro poznatih tehnika molekularne biologije, kao što su. na primer, lančana reakcija polimei izacije. tehnike hibridizacije i tehnike ponovnog spajanja ligacijom. Varijante nukleotidnih sekvenci takođe obuhvataju sintetski izvedene nukleotidne sekvence. kao što su one koje su dobijene. na primer. korišćenjem mutageneze usmerene na određeno mesto, koje kodiraju nativni protein, kao i one koje kodiraju polipeptid sa supstituisanim aminokiselinama. Generalno, varijante nukleotidnih sekvenci prema predmetnom pronalasku poseduju identičnost od najmanje 40%. 50%. 60%o, poželjno od 70%, poželjnije od 80%>, još poželjnije ođ 90%. najpoželjnije od 99%. kao i stopostotnu identičnost u odnosu na nativnu nukleotidnu sekvencu koja se zasniva na ovim kategorijama. Na primer. zasnovanu na kategorijama od 71%. 72%>. 73% i slično, do kategorije od najmanje 90%>. Varijante takođe obuhvataju gen pune dužine koji odgovara identifikovanom genskom fragmentu.
Regulatorne sekvence: promoteri / signalne sekvence / izabrani markeri
Polinukleotidne sekvence koje kodiraju enzime za prerađivanje prema predmetnom pronalasku mogu biti operativno povezane sa polinukleotidnim sekvencama koje kodiraju signale za lokalizaciju ili sa signalnim sekvencama (na N- ili na C-terminalu polipeptida), npr. koje usmeravaju hipertermofilni enzim ka određenom odeljku u biljci. Primeri takvih odeljaka obuhvataju, bez ograničenja, vakuolu, endoplazmatski retikulum, hloroplast. amiloplast. granulu škroba ili ćelijski zid, ili određeno tkivo, npr. seme. Ekspresija polinukleotida koji kodira enzim za prerađivanje i poseduje signalnu sekvencu u biljci, posebno ako se koristi tkivno specifični ili inducibilni promoter, može da dovede do pojave visokih nivoa enzima za prerađivanje specifično lokalizovanog u biljci. Poznate su brojne signalne sekvence koje utiču na ekspresiju ili na usmeravanje polinukleotida ka ili od određenog odeljka. Odgovarajuće signalne sekvence i usmeravajući promoteri su poznati u struci i obuhvataju, bez ograničenja, one koji su ovde opisani.
Na primer, kada je poželjna ekspresija u specifičnim tkivima ili organima, koriste se tkivno specifični promoteri. Nasuprot tome, kada je poželjna ekspresija gena koja nastaje kao od<g>ovor na stimulus. reguiatorni elementi izbora su inducibilni promoteri. Kada je potrebna kontinuirana ekspresija u svim ćelijama biljke, koriste se konstitutivni promoteri. U ekspresione konstrukte vektora transformacije mogu biti uključene dodatne regulatorne sekvence proksimalno i/ili distalno od osnovnog promotera. kako bi se dobili promenljivi nivoi ekspresije heterologih nukleotidnih sekvenci u transgenoj biljci.
Opisani su brojni promoteri biljaka, koji poseduju različite karakteristike ekspresije. Primeri nekih konstitutivnih promotera koji su opisani obuhvataju promoter aktina I pirinča (VVang et al.. Mol. Cell. Biol.. 12 : 3399 (1992); U.S. patent br. 5,641,876), CaMV 35S (Odell et al., Nature, 313 : 810 (1985)), CaMV 19S (Lavvton et al., 1987), nos (Ebert et al.. 1987), Adh (Walkcr et al., 1987), promoter sintaze sukroze (Yang & Russell, 1990) i promoteri ubikvitina.
Vektori koji se koriste za tkivno specifično usmeravanje gena u transgenim biljkama tipično obuhvataju tkivno specifične promotere i takođe mogu da obuhvataju druge tkivno specifične kontrolne elemente, kao što su pojačavačke sekvence. Promoteri koji su odgovorni za specifičnu ili pojačanu ekspresiju u određenim biljnim tkivima, a koji se odnose na predmetni pronalazak, poznati su stručnjacima. Ovde spadaju, na primer, rbcS promoter. specifičan za zeleno tkivo; ocs, nos i mas promoteri, koji poseduju visoku aktivnost u korenu ili u oštećenom tkivu lista; fragmentirani (od -90 do + 8) 35 S promoter, koji je odgovoran za pojačanu ekspresiju u korenu. gen a-tubulina koji je odgovoran za ekspresiju u korenu i promoteri koji su izvedeni iz gena proteina za skladištenje zeina koji su odgovorni za ekspresiju u endospermu.
Tkivno specifična ekspresija može funkcionalno da se ostvari uvođenjem konstitutivno eksprimiranog gena (eksprimiranog u svim tkivima) u kombinaciji sa genom sa antisens transkriptom koji je eksprimiran samo u onim tkivima u kojima genski proizvod nije poželjan. Na primer, gen koji kodira lipazu može biti uveden tako da je eksprimiran u svim tkivima korišćenjem 35S promotera poreklom iz mozaičnog virusa karfiola. Ekspresija antisens transkripta gena za lipazu u zrnu kukuruza, korišćenjem, na primer promotera za zein, sprečava nakupljanje proteina lipaze u semenu. Stoga, protein koji je kodiran ovim uvedenim genom će biti prisutan u svim tkivima, izuzev u zrnu.
Štaviše, otkriveno je nekoliko tkivno specifičnih regulisanih gena i/ili promotera u biljkama. Neki tkivno specifični geni obuhvataju gene koji kodiraju proteine (kao što su napin, kruciferin, P-konglicinin i fazeolin) koji skladište zein u semenu ili ulje u stablu (kao što je oleozin) ili gene koji su uključeni u biosintezi masnih kiselina (uključujući protein
nosač acil grupe, stearoil-ACP desaturazu i desaturazu masnih kiselina (tad 2-1)). kao i druge gene eksprimirane tokom razvoja embriona (kao što je Bce; videti. na primer. EP 255378 i Kridl et al.. Seed Science Research. 1 : 209 (1991)). Primeri opisanih tkivno specifičnih promotera obuhvataju promoter lektina (Vodkin. Prog. Clin. Biol. Res.. 138 : 87 (1983): Lindstrom et al.. Der. Genet.. II : 160 (1990)), alkohol dehidrogenaze I kukuruza (Vogel et al.. 19S9; Dennis et at, Nucleic Acids Res., 12 : 3983 (1984)). promoter kompleksa za laku žetvu kukuruza (Simpson. 1986; Bansal et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89 : 3654 (1992)). promoter proteina toplotnog šoka kukuruza (Odell et al., 1985; Rochester et al., 1986), promoter male podjedinice RuBP karboksilaze graška (Poulsen et al., 1986; Cashmore et al., 1983), promoter sintaze Ti plazmida manopina (Langridge et al., 1989), promoter sintaze Ti plazmida nopalina (Langridge et al., 1989), promoter isomeraze halkona petunije (vanTunen et at. EMBO J.. 7 : 1257 (1988)), promoter proteina 1 bogatog glicinom pasulja (Keller et al., Genes Dev.. 3 : 1639 (1989)), promoter fragmentiranog CaMV 35S (Odell et al.. Nature. 313 : 810 (1985)), promoter patatina krompira (VVenzler et at, Plant Mol. Biol.. 13 : 347 (1989)), promoter ćelije korena (Yamamoto et al., Nucleic Acids Res., 18 : 7449 (1990)). promoter zeina kukuruza (Reina et al., Nucleic Acids Res., 18 : 6425 (1990); Kriz et al., Mol. Gen. Genet.. 207 : 90 (1987); Wandelt et al., Nucleic Acids Res., 17 : 2354 (1989); Langridge et al., Cell. 34 : 1015 (1983); Reina et al., Nucleic Acids Res., 18 : 7449 (1990)), promoter globulina-1 (Belanger et al., Genetics. 129 : 863 (1991)), promoter a-tubulina, promoter cab (Sullivan et al. Mol. Gen. Genet, 215 : 431 (1989)), promoter PEPCaze (Hudspeth & Grula. 1989), promotere udružene sa R genskim kompleksom (Chandler et at. Plant Cell, 1 : 1175
(1989)). i promotere sintaze halkona (Franken et al, EMBO J.. 10 : 2605 (1991)). Za specifičnu ekspresiju u semenu od posebne je koristi promoter vicilina graška (Czako et al.. Mol. Gen. Genet, 235 : 33 (1992). (Videti takođe U.S. patent br. 5,625,136, koji je ovde inkorporiran po referenci). Drugi korisni promoteri za ekspresiju u zrelom lišću su oni koji se uključuju sa početkom starenja, kao što je SAG promoter iz Arabidopsisa (Gan et al, Science, 270 : 1986 (1995).
Klasa promotera koji su specifično eksprimirani u plodu u periodu od ili tokom cvetanja do razvoja ploda, barem do početka sazrevanja, diskutovana je u U.S. patentu 4,943,674, čiji je opis ovde inkorporiran po referenci. Izolovani su cDNK klonovi koji su preferencijalno eksprimirani u vlaknu pamuka (John et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89 : 5769 (1992)). Izolovani su i opisani cDNK klonovi iz paradajza koji pokazuju diferencijalnu ekspresiju tokom razvoja ploda (Mansson et al. Gen. Genet, 200 : 356 (1985); Slater et al. Plant. Mol. Biol, 5 : 137 (1985)). Promoter za gen poligalakturonaze je aktivan u plodu koji sazerva. Gen za poligalakturonazu je opisan u U.S. patentu br. 4,535.060. U.S. patentu br. 4.769.061. U.S. patentu br. 4.801.590 i U.S. patentu br. 5.107.065. čiji opisi su ovde inkorporirani po referenci.
Drugi primeri tkivno specifičnih promotera obuhvataju one koji su odgovorni za ekspresiju u ćelijama listova nakon oštećenja lista (na primer. oštećenja od strane insekata koji jedu lišće), za ekspresiju u gomolju (na primer. promoter gena za patatin). kao i za ekspresiju u ćelijama vlakana (primer proteina ćelije vlakna čija je ekspresija regulisana stadijumom razvoja je protein E6 (John et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89 : 5769 (1992)). Gen za protein E6 je najaktivniji u vlaknu, iako se niski nivoi njegovog transkripta nalaze i u listu, neoplođenom semenu i cvetu.
Tkivna specifičnost nekih "tkivno specifičnih" promotera ne mora biti apsolutna i može biti testirana od strane stručnjaka korišćenjem sekvence toksina difetrije. Takođe, može se postići tkivno specifična ekspresija upotrebom "prodorne" ekspresije kombinacijom različitih tkivno specifičnih promotera (Beals et al, Plant Cell, 9 : 1527 (1997)). Stručnjaci mogu izolovati i druge tkivno specifične promotere (videti U.S. patent br. 5.589,379).
U jednom rešenju, proizvod gena za hidrolizu polisaharida, kao što je a-amilaza, može da bude usmeren do određene organele, kao što je aloplast. umesto ka citoplazmi. Primer za ovo je korišćenje N-terminalne signalne sekvence y-zeina kukuruza (sekvenca čiji je ID broj 17), koja je odgovorna za usmeravanja proteina specifično ka aloplastu. Usmeravanja proteina ili enzima u specifični odeljak omogućava enzimu da bude lokalizovan na način pri kome neće doći u kontakt sa supstratom. Ovim se postiže da se enzimska aktivnost određenog enzima ne javi sve dok enzim ne dođe u kontakt sa supstratom. Enzim može da stupi u kontakt sa supstratom u toku mlevenja (nakon fizičkog razaranja ćelijskog integriteta) ili pri zagrevanju ćelija ili biljnih tkiva, čime se vrši razaranje fizičkog integriteta biljnih ćelija ili organa koji sadrže enzim. Na primer, mezofiini enzim za hidrolizu škroba se može usmeriti u aloplast ili u endoplazmatski retikulum, tako da ne dolazi u kontakt sa granulama škroba u amiloplastu. Mlevenje zrna narušava njegov integritet, usled čega dolazi do uspostavljanja kontakta između enzima koji vrši hidrolizu škroba i granula škroba. Na ovaj način mogu da se izbegnu potencijalno negativna dejstva ko-lokalizacije enzima i njegovog supstrata.
U drugom rešenju, tkivno specifični promoter obuhvata promotere specifične za endosperm, kao što su promoter za y-zein kukuruza (sekvenca čiji je ID broj 12) ili promoter za ADP-gpp kukuruza (sekvenca čiji je ID broj 11, koja obuhvata 5' sekvencu koja se ne transiira i intronsku sekvencu). Stoga, predmetni pronalazak obuhvata izolovani polinukleotid koji sadrži promoter čija sekvence ima ID broj 11 ili 12, polinukleotid koji hibridizuje sa komplementom sekvence navedenog promotera u uslovima slabo precizne hibridizacije. ili fragment sekvence koji poseduje aktivnost promotera. tj. koji poseduje najmanje 10%. a poželjno najmanje 50% aktivnosti promotera čija sekvenca ima ID broj I 1 ili 12.
U drugom rešenju prema predmetnom pronalasku, opisan je polinukleotid koji kodira hipertermofilni enzim za prerađivanje koji je operativno povezan sa hloroplastnim (amiloplastnim) tranzitnim peptidom (CTP) i vezujućim domenom za škrob. npr. poreklom izwaxygena. Primer polinukleotida u ovom rešenju predstavlja sekvenca čiji je ID broj 10 (a-amilaza povezana sa vezujućim domenom za škrob iz waxy gena). Drugi primeri polinukleotida obuhvataju polinuklotid koji kodira hipertermofilni enzim za prerađivanje koji je povezan sa signalnom sekvencom koja usmerava enzim ka endoplazmatskom retikulumu. a potom i dalje ka apoplastu (primeri su sekvence čiji su ID brojevi 13, 27 ili 30. koje sadrže N-terminalnu sekvencu y-zeina kukuruza operativno povezanu sa a-amilazom, ct-glukozidazom i izomerazom glukoze, respektivno); polinukleotid koji kodira hipertermofilni enzim za prerađivanje koji je. povezan sa signalnom sekvencom koja zadržava enzim u endoplazmatskom retikulumu (primeri su polinukleotidi čije sekvence imaju ID brojeve 14.
26. 28. 29. 33, 34. 35 ili 36. koje sadrže N-terminalnu sekvencu y-zeina kukuruza operativno povezanu sa hipertermofilnim enzimom, koja je operativno povezana sa SEKDEL sekvencom, pri čemu je enzim a-amilaza, malA a-glukozidaza. izomeraza glukoze izT. maritima,izomeraza glukoze izT. neapolitana) ;polinukleotid koji kodira hipertermoflni enzim za prerađivanje povezan sa N-terminalnom sekvencom koja usmerava enzim ka amiloplastu (primer je polinukleotid čija sekvenca ima ID broj 15, koji sadrži N-terminalnu sekvencu koja usmerava ka amiloplastu, koja je poreklom iz vva.\y gena i koja je operativno povezana sa a-amiloazom); polinukleotid koji kodira hipertermofilni fuzioni polipeptid koji usmerava enzim ka granuli škroba (primer je polinukleotid čija sekvenca poseduje ID broj 16, koji sadrži N-terminalnu sekvencu koja usmerava ka amiloplastu, koja je poreklom iz waxy gena i koja je operativno povezana sa fuzionim polipeptidom a-amilaze i waxy, koji sadrži vezujući domen za škrob poreklom iz waxy gena); polinukleotid koji kodira hipertermofilni enzim za prerađivanje povezan sa signalnom sekvencom za zadržavanje u ER (primer je polinukleotid čija sekvenca poseduje ID broj 38 i 39). Dalje, hipertermofilni enzim za prerađivanje može biti povezan sa vezujućim mestom na sirovom škrobu, čija aminokiselinska sekvenca ima ID broj 53, pri čemu je polinukleotid koji kodira enzim za prerađivanje povezan sa sekvencom nukleinske kiseline koja je optimizovana za kukuruz (sekvenca čiji je ID broj 54) koja kodira vezujuće mesto.
Otkriveno je nekoliko inducibilnih promotera. Mnogi su opisani u revijskom prikazu koji je dao Gatz, Current Opinion in Biotechnologv, 7 : 168 (1996) i u Gtaz. C. Annu. Rev. Plant Phvsiol. Plant Mol. Biol.. 48 : 49 (1997). Primeri obuhvataju sistem represije tetraciklina. Lac rcprcsorski sistem, sisteme koji su indukovani bakrom, sisteme koji su indukovani salicilatom (ako što je PRI a sistem), sisteme koji su indukovani glukokortikoidima (Aoyama T. et al, N-H Plant Journal, 1 I : 605 (1997)) i sisteme koji su indukovani egdizonom. Drugi inducibilni promoteri obuhvataju ABA- i turgor inducibilne promotere, promotere gena proteina koji vezuje auksin (Schvvob et al, Plant J.. 4 : 423
(1993)), promoter gena za UDP glukoza flavonoid glikozil-transferazu (Ralston et al.. Genetics. 119: 185 (1988)), promoter inhibitora MPI proteinaze (Cordero et al, Plant J., 6 : 141 (1994)) i promoter gena za gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenazu (Kohler et al.. Plant Mol. Biol, 29 : 1293 (1293 (1995); Ouiglev et al., J. Mol. evol, 29 : 412 (1989); Martinez et al, J. Mol. Biol, 208 : 551 (1989)). Takođe su obuhvaćeni promoteri sistema indukovanog benzen sulfonamidom (U.S. 5364,780) i sistema indukovanog alkoholom (WO 97/06269 i VVO 97/06268) i promoteri glutation S-transferaze.
Druge studije su se fokusirale na inducibilne gene koji su regulisani stresnim stimulusom poreklom iz spoljašnje sredine ili stimulusima kao što su povećani salinitet, suša. dejstvo patogena i ozleđivanje (Graham et al.. J. Biol. Chem.. 260 : 6555 (1985): Graham et al, J. Biol. Chem, 260 : 6561 (1985), Smith et al., Planta, 168 : 94 (1986)). Nakupljanje proteina inhibitora metalokarboksipeptidaze je otkriveno u lišću ili ozleđenim biljkama krompira (Graham et al, Biochem. Biophys. Res. Comm, 101 : 1 164 (1981)). Za druge biljne gene je saopšteno da su indukovani metil jasmonatom, signalnim molekulima, toplotnim šokom, anaerobnim stresom ili ubiaživačima dejstva herbicida.
Regulisana ekspresija himeričnog trans-delujućeg viralnog proteina replikacije može biti dalje regulisana primenom drugih genetskih strategija, kao što su, na primer, Cre-posredovana genska aktivacija (Odell et al. Mol. Gen. genet, 113: 369 (1990)). Stoga, DNK fragment koji sadrži 3' regulatornu sekvencu vezanu sa lox mestima između promotera i kođirajuću sekvencu replikacionog proteina koji blokira ekspresiju himeričnog gena za replikaciju iz promotera može biti uklonjen pomoću Cre-posredovane ekscizije, čime se dobija ekspresija trans-delujućeg gena za replikaciju. U ovom slučaju, himerični Cre-gen, himerični trans-delujući gen za replikaiju, ili oba mogu biti pod kontrolom tkivno i razvojno specifičnih ili inducibilnih promotera. Alternativna genetska strategija predstavlja korišćenje tRNK supresorskog gena. Na primer. regulisana ekspresija tRNK stipresorskog gena može uslovno da kontroliše ekspresiju kodirajuće sekvence trans-delujućeg proteina replikacije koja sadrži odgovarajući stop kodon (Ulmasov et al., Plant. Mol. Biol.. 35 : 417 (1997)). Ponovo, himerični tRNK supresorski gen ili gen himeričnog trans-delujućeg proteina replikacije. ili oba ova gena. mogu biti pod kontrolom tkivno i razvojno specifičnog ili inducibilnog promotera.
Poželjno, u slučaju višećelijskih organizama, promoter takođe može biti specifičan za određeno tkivo, organ ili fazu razvoja. Primeri takvih promotera obuhvataju, bez ograničenja, promoter ADP-gpp izZea mavsi y-zeina izZea mavs,kao i promoter globulina izZea mays.
Ekspresija gena u transgenoj biljci može biti poželjna samo tokom određenog perioda u toku razvoja biljke. Razvojno uvremenjavanje je često povezano sa tkivno specifičnom ekspresijom gena. Na primer, ekspresija proteina za skladištenje zeina se inicira u endospermu oko 15 dana nakon oprašivanja.
Dodatno, mogu biti konstruisani i upotrebljeni vektori koji vrše intracelularno usmeravanje specifičnih genskih proizvoda unutar ćelije transgene biljke ili koji usmeravaju protein ka ekstracelularnoj sredini. Ovo se generalno postiže udruživanjem DNK sekvence koja kodira tranzitnu ili signalnu peptidnu sekvencu sa kodirajućom sekvencom određenog gena. Dobijeni tranzitni ili signalni peptid transportuje protein do određene intracelularne ili ekstracelularne destinacije, respektivno, i nakon toga biva post-translaciono uklonjen. Tranzitni ili signalni peptidi deluju tako što pospešuju transport proteina kroz intracelularne membrane, npr. vakuole. vezikule, plastida i kroz mitohondrijalne membrane, a drugi signalni peptidi usmeravaju proteine kroz ekstracelularne membrane.
Signalna sekvenca kao što je N-terminalna signalna sekvenca y-zeina za usmeravanje ka endoplazmatskom retikulumu i sekreciju u apoplast može biti operativno povezana sa polinukleotidom koji kodira hipertermofilni enzim za prerađivanje prema predmetnom pronalasku (Torrent et al, 1997). Na primer, sekvence čiji su ID brojevi 13, 27 i 30 obezbeđuju polinukleotide koji kodiraju hipertermofilni enzim koji je operativno povezan sa N-terminalnom sekvencom y-zeina kukuruza. Druga signalna sekvenca je aminokiselinska sekvenca SEKDEL za održavanje polipeptida u endoplazmatskom retikulumu (Munro & Pelham, 1987). Na primer, polinukleotid koji kodira sekvencu čiji je ID broj 14, 26, 28, 29, 33, 34, 35 ili 36, koji sadrži N-terminalnu sekvencu iz y-zeina kukuruza operativno povezanu sa enzimom za prerađivanje je operativno povezan sa sekvencom SEKDEL. Polipeptid može takođe biti usmeren ka amiloplastu fuzijom vva.vv peptida koji usmerava ka amiloplastu (Klosgen et al, 1986) ili ka granuli škroba. Na primer. polinukleotid koji kodira hipertermofilni enzim za prerađivanje može biti operativno povezan sa tranzitnim peptidom za hloroplast (amiloplast) (CTP - Chloroplast Transit peptidc) i sa vezujućim domenom za škrob. npr. poreklom izwcixygena. Sekvenca čiji je ID broj 10 predstavlja primer a-amilaze povezane sa vezujućim domenom za škrob poreklom iz\ vaxygena. Sekvenca čiji je ID broj I 5 predstavlja primer N-terminalne sekvence koja usmerava ka amiloplastu poreklom iz\va.\y gena koja je operativno povezana sa a-amilazom. Dalje, polinukleotid koji kodira enzim za prerađivanje može biti fuzionisan sa vezujućim domenom za škrob poreklom iz\vaxy gena tako daje usmeren ka granulama škroba. Na primer, sekvenca čiji je ID broj 16 predstavlja primer fuzionog polipeptida koji sadrži N-terminalnu sekvencu koja usmerava ka amiloplastu poreklom iz wax<y>gena koja je operativno povezana sa a-amilaza/\vaxy fuzionim polipeptidom koji sadrži vezujući domen za škrob poreklom iz\vaxy.
Polinukleotidi prema predmetnom pronalasku, pored signala za usmeravanje, mogu dalje da sadrže druge regulatorne sekvence, kao stoje to poznato u struci. Pojam "regulatorne sekvence" i "odgovarajuće regulatorne sekvence" odnose se na nukleotidne sekvence koje su locirane proksimalno (5' nekodirajuće sekvence), unutar ili distalno (3' nekodirajuće sekvence) u odnosu na kodirajuću sekvencu i koje utiču na transkripciju, obradu ili stabilnost RNK ili na translaciju pridružene kodirajuće sekvence. Regulatorne sekvence obuhvataju pojačavače, promotere, vodeće sekvence za translaciju, introne i poliadenilatne signalne sekvence. One obuhvataju prirodne i sintetske sekvence. kao i sekvence koje mogu biti kombinacija sintetskih i prirodnih sekvenci.
Markeri za selekciju takođe mogu biti upotrebljeni prema predmetnom pronalasku, u cilju selekcije transformisanih biljaka i biljnih tkiva, kao stoje dobro poznato u struci. Može biti poželjno korišćenje gena koji su markeri za selekciju ili marker gena koji se prepoznaje ispitivanjem kao dodatak ekspresionom genu koji je od interesa. Pojam "marker geni" označava gene koji omogućavaju ekspresiju određenog fenotipa ćelija koje eksprimiraju marker gen i tako omogućavaju da se transformisane ćelije razlikuju od ćelija koje ne poseduju takav marker. Takvi geni mogu kodirati ili marker za selekciju ili marker koji se prepoznaje ispitivanjem, u zavisnosti od toga da li marker kodira osobinu koja se može odrediti hemijskim sredstvima, tj. korišćenjem agensa za selekciju (npr. herbicida, antibiotika ili sličnog) ili jednostavno kodira osobinu koja se može identifikovati posmatranjem ili testiranjem, tj. pomoću ispitivanja (npr. gen koji kodira R-lokus karakteristiku). Naravno, u struci su poznati mnogi primeri marker gena, koji se mogu upotrebiti u praksi prema predmetnom pronalasku.
Pod pojmom markera za selekciju ili markera koji se prepoznaje ispitivanjem takođe se pođrazumevaju geni koji kodiraju "marker za selekciju", čija se sekrecija može iskoristiti kao sredstvo za identifikaciju ili selekciju transformisanih ćelija. Primeri obuhvataju markere koji kodiraju antigen koji se sekretuje i koji može da se identifikuje interakcijom sa antitelom, ili čak enzime koji se sekretuju i koji mogu da se otkriju pomoću njihove katalitičke aktivnosti. Proteini koji se sekretuju pripadaju brojnim klasama i obuhvataju male. difuzibilne proteine koji se mogu detektovati npr. pomoću ELISA tehnike: male aktivne enzime koji se mogu detektovati u ekstracelularnom rastvoru (npr. a-amilaza, fj-laktamaza. fosfinotricin acetiltransferaza); i proteine koji se ugrađuju ili bivaju zarobljeni u ćelijskom zidu (npr. proteine koji sadrže vodeće sekvence, kao što su oni koji se nalaze u ekspresionoj jedinici ekstenzina ili PR-S duvana).
Uporedo sa markerima za selekciju, posebno poželjnim se smatra korišćenje gena koji kodira protein koji biva odložen u ćelijski zid i koji poseduje jedinstveni epitop. Takav antigeni marker koji biva sekretovan u idealnom slučaju koristi sekvencu epitopa koja obezbeđuje slabo izraženu pozadinu u tkivu biljke, promoter - vodeću sekvencu koja omogućava efikasnu ekspresiju i usmeravanje ka plazma membrani i koja vodi proizvodnji proteina koji je vezan za ćelijski zid i koji je pristupačan antitelima. Uobičajeno je sekretovani protein ćelijskog zida modifikovan kako bi obuhvatio jedinstveni epitop. kako bi se zadovoljili pomenuti zahtevi.
Primer proteina koji odgovara za modifikaciju na pomenuti način jeste ekstenzin, ili hidroksiprolinom bogati glikoprotein (HPRG). Na primer. ekspresija i proteinska struktura molekula HPRG kukuruza (Steifel et al, The Plant Cell, 2 : 785 (1990)) je dobro ispitana sa stanovišta molekularne biologije. Međutim, bilo koja od varijanti ekstenzina i/ili glicinom bogatih proteina ćelijskog zida (Kelier et al, EMBO Journal, 8 : 1309 (1989)) može biti modifikovana dodavanjem antigenog mesta, kako bi nastao marker koji može da se ispituje.
A. Markeri za selekciju
Potencijalni markeri za selekciju koji se koriste u skladu sa predmetnim pronalaskom obuhvataju, bez ograničenja, neo ili nptll gen (Potrykus et al. Mol. Gen. Genet, 199 : 183
(1985)), koji su odgovorni za rezistenciju prema kanamicinu i koji mogu biti izdvojeni korišćenjem kanamicina. ili gen G418 i slični; bar gen. koji je odgovoran za rezistenciju prema herbicidu fosfinotricinu: gen koji kodira izmenjenu EPSP sintazu (Hinchee et al.. Biotech. 6 : 915 (1988)), i koji je stoga odgovoran za rezistenciju prema glifosatu; gen za nitrilazu. kao što je b\n poreklom izKlebsiella ozaene,koji je odgovoran za rezistenciju prema bromoksinilu (Stalker et al.. Science, 242 : 419 (1988)); gen za mutantnu acetolaktat sintazu (ALS), koji je odgovoran za rezistenciju prema imidazolinonu. sullbnilureji ili drugim inhibitorima ALS (Evropska patentna prijava 154,204. 1985); DL1FR gen za rezistenciju prema metotreksatu (Thillet et al, .1. Biol. Chem.. 263 : 12500 (1988)); gen za dalapon dchalogenazu koji je odgovoran za rezistenciju prema herbicidu dalaponu: gen za fosfomanoza izomerazu (PM1); gen za imitiranu antranilat sintazu, koji je odgovoran za rezistenciju prema 5-metil triptofanu; hph gen, koji je odgovoran za rezistenciju prema antibiotiku higromicinu; ili gen za manoza-6-fosfat (takođe ovde označen i kao gen za izomerazu fosfomanoze), koji obezbeđuje sposobnost metabolisanja manoze (U.S. pateni br. 5,767,378 i 5,994.629). Stručnjak može izabrati odgovarajući marker gen za selekciju prilikom primene postupka prema predmetnom pronalasku. Kada se koristi gen mutantne EPSP sintaze, može se ostvariti dodatna prednost inkorporacijom odgovarajućeg peptida za tranzit kroz hloroplast (CTP - Chloroplast Transit Peptide) (evropska patentna prijava 0.218,571. 1987).
Ilustrativno rešenje marker gena za selekciju koji može da se koristi u sistemima pri selekcijiji transformanata predstavljaju geni koji kodiraju enzim fosfinotricin acetiltransferazu, kao što je bar gen poreklom izSlreptomvces hvgroscopicus,ili pat gen poreklom izStreptomyces viridochromogenes.Enzim fosfinotricin acetiltransferaza (PAT) inaktivira aktivni sastojak u herbicidu bialafosu, supstancu fosfinotricin (PPT). PPT inhibira glutamin sintetazu (Murakami et al. Mol. Gen. genet, 205 : 42 (1986); Tvvell et al, Plant Phvsiol, 91 : 1270 (1989)), što vodi brzom nakupljanju amonijaka i ćelijskoj smrti. Posebno iznenađuje uspeh u korišćenju sistema selekcije povezanog sa monokotiledonim biljkama zbog velikih teškoća koje su saopštene pri transformaciji žitarica (Potrvkus, Trends Biotech, 7 : 269 (1989)).
Kada je poželjno da se koristi gen za rezistenciju prema bialafosu u praksi prema predmetnom pronalasku, gen koji je od posebne koristi je bar ili pat gen, koji se mogu dobiti iz gljivica rodaStreptomvces(npr. ATCC br. 21,705). Opisano je kloniranje bar gena (Murakami et al. Mol. Gen. Genet, 205 : 42 (1986); Thompson et al.. EMBO Journal, 6 : 2519 (1987)), kao i korišćenje bar gena u kontekstu biljaka koje ne pripadaju klasi monokotila
(De Block et al.. EMBO Journal. 6 : 2513 (1987); De Block et al.. Plant PhvsioL 91 : 694
(1989)).
A . Markeri koji se prepoznaju ispitivanjem
Markeri koji se prepoznaju ispitivanjem i koji mogu da se upotrebe u praksi prema predmetnom pronalsku obuhvataju. bez ograničenja, gen [3-glukuronidaze ili uidA gen (GUS). koji kodira enzim za koji su poznati različiti hromogeni supstrati; gen R-lokusa, koji kodira proizvod koji u biljnim tkivima reguliše proizvodnju pigmenta antocijanina (crvena boja)
(Dellaporta et al, u knjizi "Chromosome Structure and Function", str. 263 - 282 (1988)); gen za (3-laktamazu (Sutcliffe, PNAS USA, 75 : 3737 (1978)). koji kodira enzim za koji su poznati različiti hromogeni supstrati (npr. PADAC. hromogeni cefalosporin); xylE gen (Zuko\vsky et al.. PNAS USA, 80 : 1101 (1983)), koji kodira katehol dehidrogenazu koja može da konvertuje hromogene katehole; gen a-amilaze (Ikuta et al, Biotech.. 8 : 241 (1990)); gen tirozinaze (Katz et al, J. Gen. Microbiol, 129 : 2703 (1983)). koji kodira enzim koji je sposoban da oksiduje tirozin do DOPA i dopakinon, koji se zauzvrat kondenzuje. čime se dobija lako detektibilno jedinjenje melanin; gen za [3-galaktoidazu, koji kodira enzim za koji postoje hromogeni supstrati; gen iuciferaze (lux) (Ow et al, Science. 234 : 856 (1986)), koji omogućava ispoljavanje bioluminescencije; ili aequorin gen (Prasher et al, Biochem. Biphvs. Res. Comm, 126 : 1259 (1985)), koji može da se upotrebi za detekciju kalcijum - senzitivne bioluminescencije, ili gen zelenog fluorescentnog proteina (Niedz et al, Plant Cell Reports. 14 : 403 (1995)).
Geni iz R genskog kompleksa kukuruza se smatraju posebno korisnim kao marker geni koji se prepoznaju ispitivanjem. R genski kompleks u kukuruzu kodira protein koji deluje kao regulator proizvodnje antrocijaninskih pigmenata u semenu i najvećem broju biljnih tkiva. Gen poreklom iz R genskog kompleksa je pogodan za transformaciju kukuruza, jer ekspresija ovog gena u transformisanoj ćeliji ne oštećuje ćeliju. Stoga, R gen koji je uveden u takvu ćeliju dovodi do ekspresije crvenog pigmenta i, ukoliko je stabilno inkorporiran, može biti vizuelno prepoznat u vidu crvenog područja. Ukoliko linija kukuruza nosi dominantne alele za gene koji kodiraju enzimske intermedijere u antocijaninskom biosintetskom putu (C2, Al, A2, Bzl i Bz2), i ukoliko nosi recesivni alel za R lokus, transformacija bilo koje ćelije iz te linije sa R genom će dovesti do stvaranja crvenog pigementa. Primer takve linije obuhvata liniju Wisconsin 22, koja sadrži rg-Stadler alel i TRI 12. K55 derivat koji je r-g, b. Pl. Alternativno, može da se koristi bilo koji genotip kukuruza, ukoliko se CI i R aleli uvedu zajedno. Dalje, markeri koji se prepoznaju ispitivanjem prema predmetnom pronalasku obuhvataju luciferazu svica. kodiranu lu\genom. Prisustvo lux gena u transformiranoj ćeliji se može detektovati, na primer. korišćenjem filma za X-zrakc. scintilacionog brojača, fluorescentne spektrofotometrije. video kamera za slabo svetio, kamera za brojanje fotona ili luminometrijom na pločicama sa više polja. Predmetnim pronalaskom je takođe predviđeno da ovaj sistem može da se razvije za populaciono ispitivanje bioluminescencije, kao stoje ispitivanje ploča sa kulturom tkiva ili čak ispitivanje cele biljke.
Polinukleotidi koji se koriste za transformaciju biljke mogu da obuhvate, bez ograničenja, DNK iz biljnih gena i gene koji nisu biljni, kao što su geni iz bakterija, gljivica, životinja ili virusa. Uvedena DNK može da sadrži modifikovane gene, delove gena ili himerične gene, uključujući gene kukuruza istog ili različitog genotipa. Pojam "himerični gen" ili "himerična DNK" je definisan kao gen ili DNK sekvenca ili segment koji sadrži najmanje dve DNK sekvence ili segment poreklom iz vrsta koje ne kombinuju svoju DNK pod normalnim uslovima, ili kao DNK sekvence ili segmenti koji su pozicionirani ili povezani na način koji se normalno ne javlja u nativnom genomu netransformisane biljke.
Dalje su obezbeđene ekspresione kasete koje sadrže polinukleotide koji kodiraju hipertermofilne enzime za prerađivanje, a poželjno polinukleotide sa optimizovanim kodonima. Poželjno je da polinukleotid u ekspresionoj kaseti (prvi polinukleotid) bude operativno povezan sa regulatornim sekvencama. kao što su promoterska, pojačivačka. intronska. terminaciona sekvenca ili bilo koja njihova kombinacija, a da opciono drugi polinukleotid kodira signalnu sekvencu (N- ili C-terminalnu), koja usmerava enzim koji je kodiran prvim polinukleotidom do određene ćelijske ili subćelijske lokacije. Stoga, promoter i jedna ili više signalnih sekvenci mogu da obezbede visoke nivoe ekspresije enzima u posebnim odeljcima biljke, biljnog tkiva ili biljne ćelije. Promoteri mogu biti konstitutivni promoteri, inducibilni (uslovni) promoteri ili tkivno specifični promoteri, npr. endosperm specifični promoteri, kao što su promoter y-zeina kukuruza (sekvenca čiji je ID broj 12) ili ADP-gpp promoter kukuruza (sekvenca čiji je ID broj 11, koja obuhvata 5' sekvencu koja se ne translira i intronsku sekvencu). Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje izolovani polinukleotid koji sadrži promoter sekvence čiji je ID broj 11 ili 12, polinukleotid koji hibridizuje sa komplementom te sekvence u uslovima slabo prcizne hibridizacije, ili fragment sekvence koji poseduje aktivnost promotera, npr. od najmanje 10%, a poželjno od najmanje 50% aktivnosti promotera sekvence čiji je ID broj 1 1 ili 12. Takođe su obezbeđeni vektori koji sadrže ekspresionu kasetu ili polinukleotid prema predmetnom pronalasku i transformisane ćelije koje sadrže polinukleotide. ekspresionu kasetu ili vektor prema predmetnom pronalasku. Vektor prema predmetnom pronalasku može da sadrži polinukleotidnu sekvencu koja kodira više od jednog hipertermofilnog enzima za prerađivanje prema predmetnom pronalasku, čija sekvenca može biti orijentisana u smeru ili suprotno smeru očitavanja, pri čemu transformisana ćelija može da sadrži jedan ili više vektora prema predmetnom pronalasku. Poželjni vektori su oni koji su korisni za uvođenje nukleinske kiseline u biljne ćelije.
Transformacija
U ćeliju može biti ubačena ekspresiona kaseta ili vektorski konstrukt koji sadrži ekspresionu kasetu. Ekspresiona kaseta ili vektorski konstrukt može biti unešen kao epizom ili može biti integrisan u genom ćelije. Transformisana ćelija zatim može da se uzgaja u transgenoj biljci. Shodno tome, predmetni pronalazak obezbeđuje proizvode transgenih biljaka. Pomenuti proizvodi mogu da obuhvate, bez ograničenja, seme, plod. potomstvo i proizvode potomstva transgenih biljaka.
Stručnjacima su dostupne i poznate razne tehnike za uvođenje konstrukata u ćeliju - domaćina. Transformacija bakterijskih i mnogih eukariotskih ćelija se može postići korišćenjem polietilen glikola, kalcijum hlorida. infekcije virusom, infekcije fagom. elektroporacijom i drugim postupcima koji su poznati u struci. Tehnike transformacije biljne ćelije ili tkiva obuhvataju transformaciju sa DNK korišćenjemA. tumefaciensiliA. rhizogeneskao transformišućih sredstava, elektroporacije, DNK injekcije, bombardovanja mikroprojektilima, ubrzavanjem čestica itd. (videti, na primer, EP 295959 i EP 138341).
U jednom rešenju, vektori binarnog tipa Ti i Ri plazmida poreklomiz A grobac te rinm spp.se koriste za transformaciju širokog opsega viših biljaka, uključujući monokotiledone i dikotiledone biljke, kao što su soja, pamuk, repica, duvan i pirinač (Pacciotti et al, Bio/Tecnology, 3 : 241 (1985); Byrne et al, Plant Cell Tissue and Organ Culture, 8 : 3
(1987); Sukhapinda et al, Plant Mol. Biol, 8 : 209 (1987); Lorz et al. Mol. Gen. Genet, 199 : 178 (1985); Potrykus, Mol. Gen. Genet, 199 : 183 (1985); Parketal, J. Plant Biol, 38 : 365
(1985); Hiei et al, Plant J, 6 : 271 (1994)). Korišćenje T-DNK za transformaciju ćelija biljaka je ekstenzivno prikazano i opširno opisano u studiji (EO 120516: Hoekema. u knjizi The Binarv Plant Vector Svstem. Offset - drukkerij Kanters B. V.: Alblasserdam (1985). poglavlje V; Knauf et al., Genetic Analvsis of Host Range Expression byAgrubacteriumu knjizi Molecular Genetics of the Bacteria - Plant lnteraction. Puhler. A. urednik. Springer - Verlage, New York. 1983. str. 245; i An et al.. EMBO J., 4 : 277 (1 985)).
Drugi postupci transformacije su dostupni i poznati stručnjacima i to su direktno preuzimanje stranih DNK konstrukata (videti EP 295959), tehnike elektroporacije (Fromm et al.. Nature (London), 319 : 791 (1986)), ili balističko bombardovanje velikom brzinom sa metalnim česticama obloženim sa konstruktima nukleinskih kiselina (Kline et al.. Nature (London) 327 : 70 (1987) i U.S. patent br. 4,945.050). Kada su jednom transformisane. stručnjaci mogu da regenerišu ćelije. Od posebne su važnosti u skorije vreme opisani postupci za transformaciju stranih gena u komercijalno važne useve, kao što su seme repice (De Block et al, Plant Phvsiol. 91 : 694 - 701 (1989)), suncokret (Everett et al, Bio/Technology, 5 : 1201 (1987)), soja (McCabe et al, Bio/Technology, 6 : 923 (1988); Hinchee et al, Bio/Technology, 6:915 (1988); Chee et al, Plant Phvsiol, 91 : 1212 (1989); Christou et al.. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86 : 7500 (1989) EP 301749), pirinač (Hiei et al, Plant J, 6 : 271
(1994)) i kukuruz (Gordon Kamm et al, Plant Cell, 2 : 603 (1990); Fromm et al, Biotechnologv, 8 : 833. (1990)).
Ekspresioni vektori koji sadrže genomske ili sintetske fragmente mogu biti uvedeni u protoplaste ili u intaktna tkiva ili u izolovane ćelije. Poželjno, ekspresioni vektori se uvode u intaktno tkivo. Opšti postupci kultivacije biljnih tkiva su obezbeđeni, na primer, u Maki et al.. "Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants" u knjizi "Methods in Plant Molecular Biology & Biotechnology", Glich et al. (urednici), str. 67 - 88. CRC Press (1993); i u Phillips et al. "Cell-Tissue Culture and In-Vitro Manipulation" u knjizi "Corn & Corn Improvement", 3. izdanje 10, Sprague et al. (urednici) str. 345 - 387, American Societv of Agronomv Inc.
(1988).
U jednom rešenju, ekspresioni vektori mogu da se uvedu u kukuruz ili u druga biljna tkiva korišćenjem postupka direktnog transfera gena, kao što je isporuka posredovana mikroprojektilima, DNK injektiranje, elektroporacija i slični. Ekspresioni vekotri se uvode u biljna tkiva korišćenjem podloge sa mikroprojektilima sa biolističkim uređajem. Videti, na primer. Tomes et al. "Direct DNA transfer into intact plant cells via microprojectile bombardment" u knjizi Gamborg & Phillips (urednici) "Plant Cell, Tissue and Organ Culture: Fundamenta! Methods", Springer Verlag, Berlin (1995). U svakom slučaju, predmetni pronalazak obuhvata transformaciju biljaka hipertermotllnim enzimima za prerađivanje shodno poznatim postupcima transformacije. Videti. takođe. VVeissinger et al., Annual Rev. Genet.. 22 : 421 (1988): Sanford et al.. Particulate Science and Technologv. 5 : 27 (1987)
(luk): Christou et al.. Plant Phvsiol.. 87 : 671 (1988 ) (soja) ; McCabe et al.. Bio/Technology.
6 : 923 (1988) (soja); Datta et al.. Bio/Technology, 8 : 736 (1990) (pirinač); Klein et al.. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85 : 4305 (1988) (kukuruz); Klein et al.. Bio/Teclmologv. 6 : 559
(1988) (kukuruz); Klein et al., Plant Phvsiol., 91 : 440 (1988) (kukuruz); Fromm et al., Bio/TechnoIogy, 8 : 833 (1990) (kukuruz); i Gordon-Kamm et al.. Plant Cell, 2 : 603 (1990)
(kukuruz); Svab et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87 : 8526 (1990) (hloroplast cluvana); Koziel et al, Biotechnology, 1 1 : 194 (1993) (kukuruz); Shimamoto et al.. Nature, 338 : 274
(1989) (pirinač); Christou et al., Biotechnologv, 9 : 957 (1991) (pirinač); Evropska patentna prijava EP 0 332 581( Dactvlis glomerata L.i druge Pooideae); Vasil et al, Biotechnologv, 11 : 1553 (1993) (pšenica); Weeks et al, Plant Physiol, 102: 1077 (1993) (pšenica). Methods in Molecular Biology, 82. Arabidopsis Protocols, urednik Martinez-Zapater & Salinas 1998, Humana Press (Arabidopsis).
Transformacija biljaka može da se sprovede sa jednim ili sa više molekula DNK (kotrasnformacija), a obe ove tehnike su pogodne za korišćenje ekspresionih kaseta i konstrukata prema predmetnom pronalasku. Za transformaciju biljaka su dostupni brojni vektori za transformaciju, a ekspresione kasete prema predmetnom pronalasku mogu da se koriste sa bilo kojim od ovih vektora. Selekcija vektora zavisi od poželjne tehnike transformacije i ciljne vrste koja treba da se transformiše.
Konačno, najpoželjniji DNK segmenti za uvođenje u genom monokotiledone biljke mogu biti homologi geni ili familije gena koji kodiraju željenu karakteristiku (npr. hidrolizu proteina, lipida ili polisaharida) i koji se uvode pod kontrolom novih promotera ili pojačivača itd, ili čak homologih ili tkivno specifičnih (npr. za koren, koru/omotač, lisni pupoljak, stablo, osnovu lista, zrno ili list) promotera ili kontrolnih elemenata. Zaista, predviđeno je da posebna primena predmetnog pronalska bude usmeravanje gena na konstitutivni ili inducibilni način.
Primeri odgovarajućih vektora zatransformaciju
Stručnjacima koji se bave transformacijom biljaka je poznat i dostupan veliki broj vektora za transformaciju biljaka, a geni koji su značajni za predmetni pronalazak mogu da se upotrebe sa bilo kojim od tih vektora. Izbor vektora zavisi od poželjne tehnike transformacije i ciljne vrste koja se transformiše.
A. Vektori koji su pogodni za transformacijusa Agrohacteriitm - om
Mnogi vektori su dostupni za transformaciju korišćenjemAgrobacterium lumefaciens.Oni tipično nose najmanje jednu T-DNK graničnu sekvencu i obuhvataju vektore kao što su pBIN 19 (Bevan. Nucl. Acids Res. (1984)). Ispod je dat opis konstrukcije dva tipična vektora koja su pogodna za transformaciju korišćenjemA<g>robacterium- a.
PC1B200 iPC1B200I
Binarni vektori pCIB200 i pCIB2001 se koriste za konstrukciju rekombinantnih vektora koji se koristesa Agrobacterium- omi koji se konstruišu na sledeći način. pTJS75kan se dobija NarI digestijom pTJS75 (Schmidhauser & Helinski, J. BacterioL 164 : 446 (1985)) čime je omogućena ekscizija gena za rezistenciju prema tetraciklinu, nakon čega sledi insercija Accl fragmenta iz pUC4K koji nosi NPTI1 (Messing & Vierra. Gene, 19 : 259
(1982); Bevan et al. Nature, 304 : 184 (1983); McBride et al., Plant Molecular Biologv, 14 : 266 (1990)). XhoI veznici su povezani sa EcoRV fragmentom PCIB7 koji sadrži levu i desnu T-DNK granicu, himerični gen za selekciju biljkenos/ nptlli pUC poliveznik (Rothstein et al. Gene, 53 : 153 (1987)), pa je Xhol-razgrađeni fragment kloniran u Sall-razgrađeni pTJS75kan kako bi se dobio pCIB200 (videti takođe EP 0 332 104, Primer 19). pCIB200 sadrži sledeća jedinstvena poliveznička restrikciona mesta: EcoRI, Sstl, KpnI. Bglll, Xbal i Sali. pCIB2001 je derivat pCIB200 koji se dobija insercijom dodatnih restrikcionih mesta u poliveznik. Jedinstvena restrikciona mesta u polivezniku pCIB2001 su EcoRI, Sstl, KpnI, Bglll, Xbal, Sali, Mlul, Bell, A vrli, Apal, Hpal i Stul. pCIB2001, pored toga što sadrži ova jedinstvena restrikciona mesta, takođe poseduje i sposobnost bakterijske selekcije kanamicinom, levu i desnu T-DNK granicuza Agrobacterium- omposredovanu transformaciju, RK2-izvedenitr/ Ačija je funkcija mobilizacija izmeđuE. colii drugih domaćina, kao iO/Ti OriVfunkcije koje su takođe iz RK2. Poliveznik pCIB2001 je pogodan za kloniranje biljne ekspresione kasete koja sadrži svoje sopstvene regulatorne signale.
pCIBlO i njegovi derivati za selekciju higromicinom
Binarni vektor pCIBlO sadrži gene koji kodiraju kanamicinsku rezistenciju koja služi za selekciju u biljkama i T-DNK desnu i levu graničnu sekvencu i može da inkorporira sekvence poreklom iz plazmida pRK252 koji ima široki opseg domaćina, što mu omogućava da se replicira i uE. coliiu Agrobacterium- u.Njegova konstrukcija je opisana u Rothestein et al.. Gene. 25 : 179 (1983). Pomenuti derivati omogućavaju selekciju transgenih biljnih ćelija samo higromicinom (pClB743) ili hifžgromicinom i kanamicinom (pC 1B71 5. pCIB71 7).
B. Vektori koji su pogodni za transformaciju pri kojoj se ne koristiAgrobacterium
Transformacijom bez upotrebeAgrobacterium ( umefaciensse izbegava potreba za T-DNK sekvencama u izabranom vektoru za transformaciju, tako da vektori koji ne poseduju ove sekvence mogu da se koriste kao dodatak vektorima koji su prethodno opisani i koji sadrže T-DNK sekvence. Tehnike transformacije koje ne zavise odupotrebe Agrobacterium- 3.obuhvataju transformaciju bombardovanjem česticama, preuzimanjem od strane protoplasta (npr. PEG ili elektroporacija) i mikroinjektiranjem. Izbor vektora u mnogome zavisi od izbora poželjne vrste koja treba da bude transformisana. Dalje, bez ograničenja, opisani su primeri konstrukcije tipičnih vektora koji su pogodni za transformaciju pri kojoj se ne koristi
Agrobacterium.
PCIB3064
pC!B3064 predstavlja pUC-izvedeni vektor koji je pogodan za direktni transfer gena u kombinaciji sa selekcijom herbicidom basta (ili fosfinotricinom). Plazmid pCIB246 sadrži CaMV 35S promoter koji je operativno fuzionisan sa GUS genomE. colii transkripcioni terminator CaMV 35S i opisan je u objavljenoj PCT prijavi WO 93/07278. 35S promoter ovog vektora sadrži dve ATG 5' sekvence startnog mesta. Ova mesta su mutirana korišćenjem stendardnih PCR tehnika tako što su uklonjeni ATG-ovi i tako što su stvorena restrikciona mesta Sspl i PvuII. Nova restrikciona mesta su udaljena 96 i 37 bp od jedinstvenog Sali mesta i 101 i 42 bp od stvarnog startnog mesta. Nastali derivat pCIB246 je označen kao pGB3025. GUS gen je zatim ekscidiran iz pCIB3025 digestijom sa Sali i Sacl, krajevi su učinjeni nelepljivim i religiran je kako bi se dobio plazmid pCIB3060. Plazmid pJ[T82 može da se
naruči u John Innes Centre. Norvvich, a fragment Smal od 400 bp koji sadrži bar gen izSirepionivces viridochromogenes jeekscidiran i ubačen na Hpal mesto pCIB3060 (Thompson et al.. EMBO J. 6 : 2519 (1987)). Tako dobijeni pCIB3064. sadržibargen pod kontrolom CaMV 35S promotera i terminator sekvencu za selekciju herbicidom, gen za ampicilinsku rezistenciju (za selekcijuu E. coli)i poliveznik sa jedinstvenim mestima Sphl. Pstl. Hindlll i BamHI. Ovaj vektor je pogodan za kloniranje biljnih ekspresionih kaseta koje sadrže svoje sopstvene regulatorne signale.
PSOG19 i pSOG35
Plazmid pSOG35 je transformacioni vektor koji koristi gen dehidrofolat reduktaze (DHFR)E. colikao selektivni marker koji je odgovoran za rezistenciju prema metotreksatu. Korišćena je PCR za amplifikaciju promotera 35S (-800 bp), introna 6 iz gena Adhl kukuruza (-550 bp) i 18 bp GUS vodeće sekvence koja se ne translira poreklom iz pSOGlO. Fragment od 250 bp koji kodira gen za dehidrofolat reduktazu tipa U izE. coli jetakođe amplifikovan pomoću PCR. pa su ova dva PCR fragmenta udružena sa SacI - Pstl fragmentom iz pB 1221 (Clontech), koji sadrži skelet pUC19 vektora i terminator sekvencu nopalin sintaze. Udruživanjem ovih fragmenata se dobija pSOG19, koji sadrži 35S promoter fuzionisan sa sekvencom introna 6, GUS vodećom sekvencom, DHFR genom i terminator sekvencom nopalin sintaze. Zamenom GUS vodeće sekvence u pSOG19 sa vodećom sekvencom iz hlorotičnog šarajućeg virusa kukuruza (MCMV - Maize Chlorotic Mottle Virus) dobija se vektor pSOG35. pSOG19 i pSOG35 nose pUC gen za ampicilinsku rezistenciju i poseduju Hindlll, Sphl, Pstl i EcoRI mesta koja su dostupna za kloniranje stranih supstanci.
C. Vektor koji je pogodan za transformaciju hloroplasta
Za ekspresiju nukleotidne sekvence prema predmetnom pronalasku u biljnom plastidu, koristi se vektor za transformaciju pPH143 (VVO 97/32011, Primer 36). Sekvenca nukleotida se ubacuje u pPH143 čime se zamenjuje PROTOX kodirajuća sekvenca. Ovaj vektor se potom koristi za transformaciju plastida i za selekciju transformanata putem rezistencije prema spektinomicinu. Alternativno, nukleotidna sekvenca se ubacuje u pPH 143 tako da zameni aadH gen. U ovom slučaju, transformanti se biraju korišćenjem rezistencije prema PROTOX inhibitorima.
Biljke - domaćini koje se podvrgavaju postupcima transformacije
Bilo koje biljno tkivo koje je sposobno za klonalnu propagaciju. bilo putem organogneze ili embriogeneze, može biti transformisano konstruktima prema predmetnom pronalasku. Pojam "organogeneza" označava proces putem koga se mladice i koreni sekvencijalno razvijaju iz meristemskih centara, a pojam "embriogeneza" označava proces putem koga se mladice i korenovi razvijaju zajedno na koordinisani način (a ne sekvencijalno), bilo iz somatskih ćelija ili iz gameta. Vrsta izabranog tkiva varira u zavisnosti od dostupnog sistema za klonalnu propagaciju i od toga da li najbolje odgovara određenoj vrsti koja biva transformisana. Primeri tkivnih meta obuhvataju diferencirana i nediferencirana tkiva ili biljke, pri čemu su obuhvaćeni, bez ograničenja, lisne ploče, korenovi, stabla, izdanci, lišće, polen, semenje, embrioni, kotiledoni. hipokotili. megagametofiti, tkivo kalusa, postojeće meristemsko tkivo (npr. apikalni meristem, aksilarni pupoljci i meristemi korena) i indukovano meristemsko tkivo (npr. meristem kotiledona i meristem hipokotiia), tumorsko tkivo i različiti oblici i kulture, kao što su pojedinačne ćelije, protoplasti, embrioni i tkivo kalusa. Tkivo biljke može biti poreklom iz biljke ili iz kulture organa, tkiva ili ćelija.
Biljke prema predmetnom pronalasku mogu biti u brojnim oblicima. Biljke mogu biti himere transformisanih ćelija i netransformisanih ćelija; biljke mogu biti klonalni transformanti (npr. sve ćelije su transformisane tako da sadrže ekspresionu kasetu); biljke mogu sadržati presatke transformisanih i netransformisanih tkiva (npr. transformisano deblo korena koje je presađeno na netransformisani izdanak limuna). Transformisane biljke mogu da se umnožavaju na različite načine, kao što je klonalna propagacija ili klasične tehnike ukrštanja. Na primer, prva generacija (ili TI generacija) transformisanih biljaka može biti ukrštena sama sa sobom, kako bi se dobila homzigotna druga generacija (ili T2 generacija) transformisanih biljaka, a T2 biljke mogu dalje da se propagiraju primenom klasičnih tehnika ukrštanja. Dominantni marker za selekciju (kao što je npt U) može biti udružen sa ekspresinom kasetom, kako bi se potpomoglo ukrštanje.
Predmetni pronalazak može da se koristi za transformaciju bilo koje biljne vrste, uključujući monokotile i dikotile, uključujući, bez ograničenja, kukuruz (Zea mays), Brassica sp. (npr. B. napus, B. rapa, B. juncea), posebno one Brassica vrste koje su korisne kao izvori semenog ulja, lucerku (Medicago sativa), pirinač (Oryza sativa), raž (Secale cereale), kinesku šećernu trsku (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), proso (npr. perlasti proso (Pennisetum glaticum), hlebni proso (Paniculum miliaceum), lisičji rep - proso (Setaria italica), prstasti proso (Eleusine coracana)), suncokret (Helianthus annuus). šafraniku (Carthamus tinctorius). pšenicu (Triticum aestivum), soju (Glvcine max), duvan (Nicotiana tabacum), krompir (Solanum tuberosum). kikiriki (Arachis hvpogaea). pamuk (Gossvpium barbadense. Gossvpium hirsutum). slatki krompir (lpomoca batatus), manioku (Manihot esculenta). kafu (Cofea spp.), kokosov orah (Cocos nucifera), ananas (Ananas comosus). limunova drva (Citrus spp.), kakao (Theobroma cacao), čaj (Camellia sinensis), bananu (Musa spp.), avokado (Persea americana), smokvu (Ficus casica), guavu (Psidium guajava), mango (lVlangifera indica), maslinu (Olea europaea), papaju (Carica papava), kesu (Anacardium occidentale). makadamiju (Macadamia integrifolia), badem (Prunus amygdalus). šećernu repu (Beta vulgaris), šećernu trsku (Saccharum spp.), ovas. ječam, povrće, ukrasne biljke, drvenaste biljke, kao što su četinari, listopadno drveće, tikvu, bundevu, konoplju, tikvice, jabuku, krušku, dunju, dinju, šljivu, višnju, breskvu, nektarinu, kajsiju, jagodu, grožđe, malinu, kupinu, soju, kinesku šećernu trsku, šećernu trsku, semenu repicu, detelinu, šargarepu iArabidopsis thaliana.
Povrće obuhvata paradajz (Lvcopersicon esculentum), zelenu salatu (Lactuca sativa), boraniju (Phaseolus vulgaris), lima pasulj (Phaseolus limensis). grašak (Lathvrus spp.), karfiol, brokole, repu, rotkvice, spanać, asparagus. luk, beli luk, biber. celer i članove roda Cucumis, kao što su krastavac (C. sativus), dinju cerovaču (C. cantalupensis) i mirišljavu dinju (C. melo). Ukrasne biljke obuhvataju azaleju (Rhododendron spp.), hortenziju (Macrophvlla hydrangea), hibiskus (Mibiscus rosasanensis), ruže (Rosa spp.), lale (Tulipa spp.). žuti narcis (Narcissus spp.), petunije (Petunia hvbrida). karanfil (Dianthus caryophyllus), mlečiku (Euphorbia pulcherrima) i hrizanteme. Četinari koji mogu da se koriste u praksi predmetnog pronalaska obuhvataju, na primer, borove, kao što su lobloli bor (Pinus taeda), presečeni bor (Pinus elliotii), crveni bor (Pinus ponderosa), izuvijani bor (Pinus contorta) i montrealski bor (Pinus radiata), Daglasovu jelu (Pseudotsuga menziesii), zapadnu kukutu (Tsuga camadensis), Sitka omoriku (Picea glauka), sekvoju (Sequoia sempervirens), prave jele, kao što su srebrna jela (Abies amabilis) i balsam jela (Abies balsamea) i kedrove, kao što su zapadni crveni kedar (Thuja plicata) i aljaski žuti kedar (Chamaecyparis nootkatensis). Mahunaste biljke obuhvataju pasulj i grašak. Pasulj obuhvata guar, skakavčev pasulj, peskavicu, soju, baštenski pasulj, kravlji grašak, mung pasulj, lima pasulj, fava pasulj, sočiva, kokošiji grašak, itd. Mahunaste biljke obuhvataju, bez ograničenja, biljke iz roda Arachis, npr. kikiriki; biljke iz roda Vicia, npr. krunsku grahoricu, vlasastu grahoricu, adzuki pasulj, mung pasulj i kokošiji grašak; biljke iz roda Lupinus. npr. obrniku, trifolium; biljke iz roda Phaseolus, npr. obični pasulj i lima pasulj; biljke iz roda Pisum. npr. poljski pasulj; biljke iz roda Melilotus. npr. detelinu; biljke iz roda Medicago, npr. lucerku: biljke iz roda Lotus, npr. trolist; sočiva. npr. obično sočivo i lažni indigo. Poželjna stočna hrana i busenska trava za korišćenje u postupcima prema predmetnom pronalasku obuhvata lucerku. voćnačku travu, visoku travu, višegodišnju ražnu travu, puzeću savijenu travu i crvenvrh.
Poželjno, biljke prema predmetnom pronalasku obuhvataju useve. na primer, kukuruz, lucerku. suncokret, biljke iz roda Brassica, soju, pamuk, šafraniku. kikiriki, kinesku šećernu trsku, pšenicu, proso, duvan, ječam, pirinač, paradajz, krompir, tikvu, dinje, mahunaste useve i si. Druge poželjne biljke obuhvataju biljke iz roda Liliopsida i Panicoideae.
Onda kada je željena DNK sekvenca transformacijom ubačena u određenu biljnu vrstu, ona se može propagirati u toj vrsti ili prevesti u druge varijante iste vrste, posebno u komercijalne varijante, korišćenjem tradicionalnih tehnika ukrštanja.
U tekstu koji sledi su dati opisi reprezentativnih tehnika za transformaciju dikotiledonih i monokotiledonih biljaka, kao i reprezentativne tehnike transformacije plasatida.
A. Transformacija dikotiledonih biljaka
Tehnike transformacije za dikotiledone biljke su dobro poznate u struci i obuhvataju tehnike koje se zasnivaju na upotrebiAgrobacterium- ai tehnike koje ne koristeAgrobacterium.Tehnike koje ne koristeagrobacteriumobuhvataju direktno preuzimanje egzogenog genetskog materijala od strane protoplasta ili ćelija. Ovo se može postići pomoću preuzimanja posredovanog sa PEG, elektroporacijom, isporukom putem bombardovanja česticama ili mikroinjektiranjem. Primeri ovih tehnika su opisani u Paszkowsky et al., EMBOJ, 3: 2717 (1984), Potrvkus et al., Mol. Gen. Genet., 199 : 169 (1985), Reich et al., Biotechnology, 4 : 1001 (1986) i u Klein et al., Nature, 327 : 70 (1987). U svakom slučaju, transformisane biljke se regenerišu do celih billjaka korišćenjem standardnih tehnika koje su poznate u struci.
Transformacija posredovanaAgrobacterium- omje poželjna tehnika transformacije dikotiledonih biljaka, zbog visoke efikasnosti transformacije i mogućnosti korišćenja kod mnogih različitih vrsta.Transformacija Agrobacteriumomtipično uključuje transfer binarnog vektora koji nosi stranu DNK od interesa (npr. pCIB200 ili pCIB2001) u odgovarajući sojAgrobacterium- a,što može da zavisi od komplementarnihvirgena koje sadrži domaćin - ćelijasoja Agrobacterium- abilo na ko-rezidentnom Ti plazmid u ili u svom hromozomu (npr. soj CIB542 u slučaju pC!B200 i pCIB200! (Uknes et al.. Plant Cell. 5 : 159 (1993)). Transfer rekombinantnog binarnog vektora uAgrobacteriumse postiže triparentalnim postupkom ukrštanja korišćenjemE. coli kojanosi rekombinantni binarni vektor, pomoćnički sojE. coli.koji nosi plazmid. kao što je pRK2013 koji je sposoban da mobiliše rekombinantni binarni vektor do ciljnog sojaAgrobacterium- a.Alternativno, rekombinantni binarni vektor može da se prebaciu Agrobacteriumpomoću transformacije DNK (Hoefgen & VVillmitzer, Nucl. acids Res.. 16 : 9877 (1988)).
Transformacija ciljne biljne vrste pomoćurekombinantnog Agrobacterium- aobuhvata ko-kultivacijuAgrobacterium- asa eksplantatima biljke uz poštovanje protokola koji su dobro poznati u struci. Transformisano tkivo se regeneriše na selektivnoj podlozi koja sadrži antibiotik ili herbicid, čime se vrši selekcija onih ćelija koje nose marker za rezistenciju kodiran sekvencom koja se nalazi između T-DNK granica binarnog plazmida.
Vektori mogu biti uneti u biljne ćelije korišćenjem poznatih postupaka. Poželjne ćelije za transformaciju obuhvatajuAgrobacterium,ćelije monokotiledonih i ćelije dikotiledonih biljaka, uključujući Liliopsida ćelije i Panicoideae ćelije. Poželjne monolotiledone ćelije su ćelije žitarica, npr. kukuruza, ječma i pšenice, kao i ćelije dikotiledonih biljaka koje nakupljaju škrob, npr. ćelije krompira.
Drugi pristup transformaciji biljne ćelije određenim genom obuhvata ubrzavanje i usmeravanje inertnih ili biološki aktivnih čestica ka biljnim tkivima i ćelijama. Ova tehnika je opisana u U.S. patentima br. 4,945,050, 5,036,006 i 5,100.792. Generalno, ova tehnika podrazumeva pokretanje inertnih ili biološki aktivnih čestica ka ćelijama u uslovima koji omogućavaju efikasno prodiranje kroz spoljašnju površinu ćelije, čime se dozvoljava inkorporacija u njihovu unutrašnjost. Kada se koriste inertne čestice, vektor se u ćeliju može uvesti oblaganjem čestica vektorom koji sadrži željeni gen. Alternativno, ciljna ćelija može biti okružena vektorom, tako da se vektor unosi u ćeliju potenciranjem čestica. Biološki aktivne čestice (npr. isušene ćelije gljivica, isušene bakterije ili bakteriofag, od kojih svaka sadrži DNK koja treba da bude unešena) takođe mogu biti progurane u biljno tkivo.
B. Transformacija monokotiledonih biljaka
Danas je takođe postala rutina i transformacija većine monokotiledonih biljaka. Poželjne tehnike obuhvataju direktni transfer gena u protoplaste korišćenjem tehnike sa polietilen glikolom (PEG) ili tehnike elektorporacije, kao i bombardovanje tkiva kalusa česticama. Transformacija može biti izvršena jednom vrstom DNK i sa više vrsta DNK (tj. može biti primenjena ko-transformacija), a obe ove tehnike su pogodne za korišćenje prema predmetnom pronalasku. Kotransformacija može posedovati prednost koja se ogleda u tome da se izbegne konstrukcija čitavog vektora i u tome što se dobijaju transgene biljke sa nepovezanim lokusima za gen od interesa i za marker za selekciju, što omogućava uklanjanje markera za selekciju u narednim generacijama, ukoliko se to oceni kao poželjno. Međutim, mana pri korišćenju kotransformacije je u tome što je frekvencija sa kojom se razdvojene DNK vrste integrišu u genom manja od 100% (Schocher et al.. Biotechnologv. 4 : 1093
(1986)).
Patentne prijave EP 0 292 435, EP 0 392 225 i WO 93/07278 opisuju tehnike za dobijanje kalusa i protoplasta iz elitne uzgojne linije kukuruza, transformaciju protoplasta korišćenjem PEG ili elektroporacije i regeneraciju biljaka kukuruza iz transformisanih protoplasta. Gordon - Kamin et al, (Plant Cell, 2 : 603 (1990)) i Fromm et al. (Biotechnologv. 8 : 833 (1990)) su objavili opise tehnika za transformaciju linije kukuruza izvedene iz linije A188 korišćenjem bombardovanja česticama. Dalje, VVO 93/07278 i Koziel et al.
(Biotechnologv, 11 : 194 (1993)) opisuju tehnike za transformaciju elitnih uzgojnih linija kukuruza bombardovanjem česticama. Ova tehnika koristi nezrele embrione kukuruza dužine 1.5 - 2,5 mm ekscidirane iz struka kukuruza 14-15 dana nakon oprašivanja i PDS - lOOOHe Biolistics uređaj za bombardovanje.
Transformacija pirinča takođe može da se izvede korišćenjem tehnika direktnog transfera gena upotrebom protoplasta ili bombardovanjem česticama. Transformacija posredovana protoplastima je opisana zaJaponicasorte iIndicusorte pirinča (Zhang et al, Plant Cell Rep, 7 : 379 (1988); Shimamoto et al. Nature, 388 : 274 (1989); Datta et al, Biotechnologv, 8 : 736 (1990)). Oba tipa biljke je takođe moguće rutinski transformisati korišćenjem bombardovanja česticama (Christou et al, Biotechnologv, 9 : 957 (1991)). Dalje, VVO 93/21335 opisuje tehnike za transformaciju pirinča pomoću elektroporacije. Patentna prijava EP 0 332 581 opisuje tehnike za dobijanje, transformaciju i regeneraciju protoplasta Pooideae. Ove tehnike omogućavaju transformacijuDactylis- ai pšenice. Dalje, transformacija pšenice je opisana od strane Vasil et al. (Biotechnologv, 10 : 667 (1992)) korišćenjem bombardovanja česticama ćelija tipa C dugotrajno regenerabilnog kalusa. a takođe je opisana i od strane Vasil et al. (Biotechnologv, 11 : 1553 (1993)) i od VVeeks et al.
(Plant Phvsiol.. 102 : 1077 (1993)) korišćenjem bombardovanja česticama nezrelih embriona i kalusa izvedenog iz nezrelog embriona. Poželjna tehnika za transformaciju pšenice, međutim, obuhvata transformaciju pšenice pomoću bombardovanja česticama nezrelih embriona i obuhvata ili korak sa velikom koncentracijom sukroze ili korak sa visokom koncentracijom maltoze pre transfera gena. Pre bombardovanja, bilo koji broj embriona (dužine od 0.75 - 1 mm) se kultiviše na rVIS podlozi sa 3% sukroze (Murashiga & Skoog, Phvsiologia Plantarum. 15 : 473 (1962)) i 3 mg/l 2,4-D za indukciju somatskih embriona, što omogućava nastavak procesa u odsustvu svetlosti. Tokom dana određenog za bombardovanje, embrioni se uklanjaju iz podloge za indukciju i postavljaju na osmotikum (tj. na indukcioni medij um sa sukrozom ili maltozom, koje su dodate do željene koncentracije, tipično od 15%). Embrioni se ostave da liziraju tokom 2-3 časa, a zatim se bombarduju. Tipično je korišćenje 20 embriona po ploči koja je meta, iako to nije od kritične važnosti. Odgovarajući plazmid koji nosi gene (kao što je pC!B3064 ili pSG35) se istaloži na česticama zlata veličine mikrometra korišćenjem standardnih postupaka. Svaka ploča sa embrionima se gađa DuPont Biolistics® helijumskim uređajem korišćenjem potisnog pritiska od oko 1000 psi uz upotrebu standardnog 80 mrežastog zaklona. Nakon bombardovanja, embrioni se ponovo ostavljaju u uslovima odsustva svetlosti tokom oko 24 časa (još uvek na osmotikumu). Nakon 24 časa, embrioni se uklanjaju sa osmotikuma i ponovo postavljaju na podlogu za indukciju, gde se ostavljaju tokom oko mesec dana pre regeneracije. Nakon otprilike mcsec dana, cksplanti embriona zajedno sa embriogenim kalusom u razvoju se prebacuju na podlogu za regeneraciju (MS + 1 mg/l NAA, 5 mg/l GA), koja dalje sadrži odgovarajuće sredstvo za selekciju (10 mg/l basta u slučaju pCIB3064 i 2 mg/l metotreksata u slučaju pSOG35). Nakon otprilike mesec dana, razvijeni izdanci se prebacuju u veće sterilne kontejnere poznate kao "GA7", koji sadrže MS sa polovimo jačine, 2% sukroze i istu koncentraciju sredstva za selekciju.
Takođe je opisana i transformacija monokotiledonih biljaka korišćenjemAgrobacterium- d'.Videti, VVO 94/00977 i U.S. patent br. 5,591,616, koji su ovde inkorporirani po referenci.
C. Transformacija plastida
SemenjeNicoticma tabacitmc.v. 'Xanti ne' je uzgajano po 7 komada po ploči u kružnoj posudi pečnika 1" na T - agar podlozi i bombardovano je 12-14 dana nakon zasejavanja sa 1 um tungstenskim česticama (MIO. Biorad. Hercules. CA) obloženim sa DNK iz plazmida pPH 143 i pPH145, na način koji je generalno opisan (Svab & Maliga. PNAS. 90 : 913 (1993)). Bombardovano semenje je inkubirano na T podlozi tokom 2 dana. nakon čega je ekscidirano lišće, pa je postavljeno uz osovinu bele svetlosti na gore (350 - 500 urno I fotona/m<2>/s) na pločama sa RMOP podlogom (Svab, Hajdukievvicz & Maliga, PNAS, 87 : 8526 (1990)), koja sadrži 500 (.ig/ml spektinomicin dihidrohlorida (Sigma, St. Louis. MO). Rezistentne mladice su se pojavile ispod izbeljenih listova 3 do 8 nedelja nakon bombardovanja i subklonirane su na istoj podlozi za selekciju, što je omogućilo da se razvije kalus, pa su izolovane i subklonirane sekundarne mladice. Kompletno izdvajanje genomskih kopija transformisanih plastida (homoplastidnost) u nezavisnim subklonovima je ispitano standardnim Southern blotting tehnikama (Sambrook et al.. Molecular Cloning: A Laboratorv Manual, Cold Spring Harbor Laboratorv, Cold Spring Harbor (1989)). Ukupna ćelijska DNK razgrađena sa BamHI/EcoRl (Metter, U. Plant Mol. Biol. Reporter, 5 : 346 (1987)) je razdvojena na 1% Tris-borat (TBE) agaroza gelovima, prebačena je na najlonske membrane (Amersham) i ispitana sa DNK sekvencama obeleženim sa<j>2P koje su prethodno nasumično pripremljene i koje odgovaraju fragmentu DNK koji je dobijen dejstvom BamHl/Hindlll iz pC8 i koji sadrži deorps7/ 12plastidne usmeravajuće sekvence. Homoplastidne mladice su aseptično zasejane na MS/IBA podlozi koja sadrži spektinomicin (McBride et al.. PNAS. 91 : 7301 (1994)) i prebačene su u staklenu baštu.
Proizvodnja i karakterizacija stabilno transformisanih biljaka
Transformisane biljne ćelije se postavljaju na odgovarajuću podlogu za selekciju kako bi se izvršila selekcija transgenih ćelija, koje se potom uzgajaju do kalusa. Iz kalusa se uzgajaju mladice, a biljke se dobijaju iz mladica uzgajanjem u podlozi koja pospešuje rast korena. Različiti konstrukti normalno su spojeni sa markerom za selekciju u ćeliji biljke. Poželjno, marker može biti gen za rezistenciju prema biocidu (posebno prema antibiotiku, kao što je kanamicin, G418, bleomicin, higromicin, hloramfenikol, neki herbicid i slični). Određeni marker omogućava selekciju transformisanih ćelija, ali ne i ćelija kojima nedostaje DNK koja je uvedena. Komponente DNK konstrukta, koje obuhvataju transkripcione / ekspresione kasete prema predmetnom pronalasku mogu da se pripreme od sekvenci koje su urođene (endogene) ili strane (egzogene) datom domaćinu. Pod pojmom "strani" podrazumeva se da se sekvenca ne nalazi u domaćinu divljeg tipa u koga se konstrukt uvodi. Heterologi konstrukti sadrže najmanje jedan region koji nije urođen u odnosu na gen iz koga je region za transkripciju-inicijaciju izveden.
Da bi se potvrdilo prisustvo transgena u transgenim ćelijama i biljkama, može se upotrebiti Southern blot analiza korišćenjem postupaka koji su poznati stručnjacima. Integracija segmenta polinukleinske kiseline u genom može da se detektuje i kvantifikuje Southern blot analizom, jer se ovi segmenti mogu lako razlikovati od konstrukata koji sadrže segmente genoma, nakon upotrebe odgovarajućih restrikcionih enzima. Ekspresioni proizvodi transgena se mogu detektovati na jedan od brojnih načina, čiji izbor zavisi od prirode proizvoda, što obuhvata primenu VVestern blot analize i enzimskih ispitivanja. Jedan posebno koristan način za kvantifikaciju ekspresije proteina i za detekciju replikacije u različitim biljnim tkivima jeste upotreba reporter gena, kao što je GUS. Kada se jednom dobiju transgene biljke, one mogu da se uzgajaju da bi proizvodile biljna tkiva ili delove koji ispoljavaju željeni fenotip. Mogu se prikupiti biljno tkivo ili biljni delovi. kao i semenje biljke. Semenje može da posluži kao izvor za uzgajanje dodatnih biljaka sa tkivima ili delovima koji poseduju željene karakteristike.
Stoga, predmetni pronalazak obezbeđuje transformisanu biljku ili biljni deo, kao što su struk, seme, plod, zrno, mahuna, pleva ili pleva od šećerne trske, koji sadrži barem jedan polinukleotid, ekspresionu kasetu ili vektor prema predmetnom pronalasku, obezbeđuje postupke za dobijanje takve biljke i postupke za korišćenje takve biljke ili njenog dela. Transformisana biljka ili biljni deo eksprimira enzim za prerađivanje, koji je opciono lokalizovan u određenom ćelijskom ili subćelijskom odeljku određenog tkiva ili u usevu koji se razvija. Na primer, predmetni pronalazak obezbeđuje transformisani deo biljke koji sadrži najmanje jedan enzim za prerađivanje škroba koji je prisutan u ćelijama biljke, pri čemu se deo biljke dobija iz transformisane biljke, čiji je genom pojačan ekspresinom kasetom koja kodira najmanje jedan enzim za prerađivanje škroba. Enzim za prerađivanje škroba ne deluje na ciljni supstrat, osim ako nije aktiviran postupcima kao što su zagrevanje, mlevenje, ili neki drugi postupci, koji omogućavaju enzimu da stupi u kontakt sa supstratom u uslovima kada je taj enzim aktivan.
Poželjni postupci prema predmetnom pronalasku
Biljke i biljni delovi sa sposobnošću samoprerađivanja prema predmetnom pronalasku mogu da se koriste u različitim postupcima koji koriste enzime za prerađivanje (mezolllne, termolilne ili hipertermofilne) koji su u njima eksprimirani i aktivirani. Shodno predmetnom pronalasku, deo transgene biljke koji je dobijen iz transgene biljke čiji je genom pojačan najmanje jednim genoom koji kodira enzim za prerađivanje ostavlja se u uslovima u kojima se enzim eksprimira i aktivira. Nakon aktivacije, enzim za prerađivanje se aktivira i deluje na supstrat na koji inače normalno deluje, u cilju dobijanja željenog rezultata. Na primer, enzim koji prerađuje škrob deluje na škrob da bi ga razgradio, hidrolizovao. izomerizovao ili na drugi način izmenio, kako bi se dobio željeni rezultat posle njegove aktivacije. Enzimi koji ne prerađuju škrob mogu da se koriste u cilju rezaranja membrane biljne ćelije kako bi se pospešila ekstrakcija škroba, lipida, aminokisetina ili drugih proizvoda iz biljaka. Štaviše, ne-hipertermofilni i hipertermofilni enzimi mogu da se koriste u kombinaciji u biljci ili biljnom delu sa sposobnošću samoprerađivanja prema predmetnom pronalasku. Na primer, mezofiini enzim za prerađivanje koji ne razgrađuje škrob može biti aktiviran u cilju razaranja membrane biljne ćelije radi ekstrakcije škroba, a nakon toga u biljci sa sposobnošću samoprerađivanja može biti aktiviran hipertermofilni enzim koji razgrađuje škrob.
Enzimi koji su eksprimirani u zrnu mogu da se aktiviraju izlaganjem biljke ili biljnog dela koji ih sadrži uslovima u kojima su aktivni. Na primer, mogu se koristiti jedna ili više sledećih tehnika: biljni deo može da se izloži dejstvu vode. što obezbeđuje supstrat za dejstvo hidrolitičkog enzima, koji na taj način biva aktiviran. Biljni deo može biti izložen kontaktu sa vodom što omogućava enzimu da migrira iz odeljka u kome je odložen tokom razvoja biljnog dela i da tako stupi u kontakt sa supstratom. Pokretanje enzima je moguće, jer se odlaganje u određeni odeljak narušava u procesu sazrevanja, tj. tokom sušenja zrana i njegove rehidracije. Intaktno ili prelomljeno zrno može da stupi u kontakt sa vodom, što omogućava enzimu da migrira iz odeljka u koji je odloženo tokom razvoja biljke i da se tako udruži sa svojim supstratom. Enzimi takođe mogu biti aktivirani dodavanjem aktivirajućeg jedinjenja. Na primer, kalcijum - zavisni enzim može biti aktiviran dodavanjem kalcijuma. Druga aktivirajuća jedinjenja su poznata stručnjacima. Enzimi mogu biti aktivirani uklanjanjem inaktivatora. Na primer, poznati su peptidni inhibitori enzima amilaze; amilaza može biti koeksprimirana sa inhibitorom amilaze. a zatim aktivirana dodavanjem proteaze. Enzimi mogu biti aktivirani alteracijom pH vrednosti do one vrednosti pri kojoj je enzim najaktivniji. Enzimi takođe mogu biti aktivirani povećanjem temperature. Aktivost enzima se generalno povećava do vrednosti temperature pri kojoj je enzim maksimalno aktivan. Mezofiini enzim povećava svoju aktivnost od nivoa aktivnosti koju ima pri ambijentalnoj temperaturi do vrednosti temperature pri kojoj gubi svoju aktivnost, a to je tipično manje ili jednako 70 °C. Slično tome. termofilni i hipertermofilni enzimi takođe mogu biti aktivirani povećavanjem temperature. Termofilni enzimi mogu biti aktivirani zagrevanjem do temperature do vrednosti pri kojoj je njihova aktivnost maksimalna ili pri kojoj je njihova stabilnost maksimalna. Za termofilni enzim temperatura maksimalne aktivnosti i stabilnosti je generalno između 70 i 85 °C. Hipertermofilni enzimi poseduju čak veću relativnu sposobnost aktivacije od mezofilnih ili termofilnih enzima, jer poseduju sposobnost aktivacije u širem opsegu temperatura, koji se kreće od 25 °C do 85 °C, 95 °C ili čak do 100 °C. Povećanje temperature se može ostvariti primenom bilo kog postupka, na primer pečenjem, kuvanjem, zagrevanjem, izlaganjem pari. električnom pražnjenju ili bilo kojoj njihovoj kombinaciji. Dalje, kod biljaka koje eksprimiraju mezofiini ili termofilni enzim (enzime), aktivacija enzima se može postići mlevenjem, čime se i omogućava kontakt enzima sa supstratom.
Optimalni uslovi, npr. temperatura, vlažnost, pH vrednost itd. mogu biti određeni od strane stručnjaka i mogu zavisiti od enzima koji se koristi i od željene primene enzima.
Predmetni pronalazak dalje obezbeđuje korišćenje egzogenih enzima koji mogu biti od pomoći u određenom postupku. Na primer, korišćenje biljke ili biljnog dela sa sposobnošću samoprerađivanja prema predmetnom pronalasku može biti u kombinaciji sa egzogenim enzimom kako bi se pospešila reakcija. Na primer, transgeni kukuruz koji eksprimira a-amilazu može da se koristi u kombinaciji sa drugim enzimima koji prerađuju škrob, kao što su pululanaza, a-glukozidaza, izomeraza glukoze, mananaze, hemicelulaze itd. kako bi se hidrolizovao škrob ili proizveo etanol. Li stvari, pronađeno je da kombinacija kukuruza koji eksprimira a-amilazu i pomenutih enzima pokazuje neočekivano veći stepen konverzije škroba u poređenju sa korišćenjem samog kukuruza koji eksprimira a-amilazu.
Primeri odgovarajućih postupaka prema predmetnom pronalasku obezbeđeni su u ovom opisu.
A. Ekstrakcija škroba iz biljaka
Predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za olakšavanje ekstrakcije škroba iz biljaka. Konkretno, u biljku se uvodi najmanje jedan polinukleotid koji kodira enzim za prerađivanje koji razara matriks endosperma (ćelijske zidove, neskrobne polisaharide i proteinski matriks). poželjno tako da je enzim fizički n neposrednoj blizini granula škroba biljke. Poželjno, u ovom rešenju prema predmetnom pronalasku, transformisane biljke eksprimiraju jednu ili više proteaza. glukanazu, ksilanazu, tioredoksin/tioredoskin reduktazu. eslerazu i slične, ali ne i enzime koji poseduju bilo kakvu aktivnost ti smislu razgradnje škroba, tako da se održava integritet granula škroba. Ekspresija ovih enzima u delu biljke, kao što je zrno. na pomenuti način poboljšava karakteristike prerađivanja zrna. Enzim za prerađivanje može biti mezofilan. termofilan ili hipertermofilan. U jednom primeru. zrno transformisane biljke prema predmetnom pronalasku se isušuje zagrevanjem. čime se inaktiviraju ne-hipertermofilni enzimi za prerađivanje i čime se poboljšava integritet semena. Zrno (ili raspuknuto zrno) se natapa pri niskim temperaturama ili pri visokim temperaturama (onda kada je važno vreme) u uslovima sa visokim ili niskim sadržajem vlage (videti "Primarv Cereal Processing", Gordon & Willm, urednici, str. 319 - 337 (1997), čiji je opis ovde inkroporiran po referenci), uz opciono korišćenje sumpor dioksida. Nakon postizanja povišene temperature, opciono uz određene uslove vlažnosti, integritet matriksa endosperma se razara aktivacijom enzima, npr. dejstvom proteaza, ksilanaza, fitaza ili glukanaza. koje razgrađuju proteine i neskrobne polisaharide koji su prisutni u endospermu. čime se granule škroba ostavljaju netaknutim i čime se omogućava njihovo lakše izdvajanje iz rezultujućeg materijala. Dalje, proteini i ne-skrobni polisaharidi u efluentu su najmanje delimično razgrađeni i visoko koncentrovani, pa se mogu koristiti za poboljšavanje stočne hrane, namirnica ili kao komponente podloga za fermentaciju mikroorganizmima. Pod pojmom "efluent" se podrazumeva tečnost dobijena natapanjem kukuruza poboljšanog sastava.
Stoga, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za dobijanje granula škroba. Postupak obuhvata tretiranje zrna, na primer raspuknutog zrna, što obuhvata dejstvo najmanje jednog enzima za prerađivanje koji ne deluje na škrob u uslovima u kojima je najmanje jedan enzim aktivan, pri čemu se dobija smeša koja sadrži granule škroba i ne-skrobne proizvode razgradnje, npr. proizvode dobijene razgradnjom matriksa endosperma. Enzimi za prerađivanje koji ne deluju na škrob mogu biti mezofiini, termofilni ili hipertermofilni. Nakon aktivacije enzima, granule škroba se izdvajaju iz smeše. Zrno se dobija od transformisane biljke, čiji genom sadrži (čiji je genom pojačan) ekspresionom kasetom koja kodira najmanje jedan enzim za prerađivanje. Na primer, enzim za prerađivanje može biti proteaza, glukanaza, ksilanaza, fitaza, tioredoksin/tioredoksin reduktaza, ili esteraza. Poželjno, enzim za prerađivanje je hipertermofilan. Zrno može biti tretirano u uslovima male ili velike vlažnosti, u prisustvu ili u odsustvu sumpor dioksida. U zavisnosti od aktivnosti i nivoa ekspresije enzima za prerađivanje u zrnu transgene biljke, transgeno zrno može da se pomeša sa robnim zrnom pre ili tokom obrade. Takođe. pomenutim postupkom je obezbeđeno dobijanje proizvoda kao što su škrob, ne-skrobni proizvodi i poboljšani proizvod natapanja vodom, koji sadrži makar jednu dodatnu komponentu.
B. Postupci za prerađivanje škroba
Transformisane biljke ili delovi biljaka prema predmetnom pronalasku mogu da sadrže enzime koji razgrađuju škrob koji su ovde opisani i koji razgrađuju granule škroba da dekstrina, drugih modifikovanih vrsta škroba, ili do heksoza (to su npr. a-amilaza, pululanaza, a-glikozidaza, glukoamilaza, amilopululanaza) ili koji prevode glukozu u fruktozu (npr. izomeraza glukoze). Poželjno, enzim za razgradnju škroba se bira iz grupe koju čine a-amilaza, a-glukozidaza, glukoamilaza, pululanaza, neopululanaza. amilopululanaza, izomeraza glukoze i njihove kombinacije, koji se koristi za transformaciju zrna. Dalje, poželjno je da je enzim opserativno povezan sa promoterom i signalnom sekvencom koja usmerava enzim ka granuli škroba, amiloplastu, apoplastu ili endoplazmatskom retikulumu. Najpoželjnije, enzim je eksprimiran u endospermu. a posebno endospermu kukuruza i lokalizovan je u jednom ili u više ćelijskih odeljaka. ili u samoj granuli škroba. Poželjni deo biljke je zrno. Poželjni su delovi biljke kukuruza, pšenice, ječma, raži, ovsa, šećerne trske ili pirinča.
Prema jednom rešenju predmetnog pronalaska koji se odnosi na razgradnju škroba, transformisano zrno akumulira enzim za razgradnju škroba u granuli škroba, zatim se podvrgava natapanju pri uobičajenim temperaturama od 50 - 60 °C i melje vlažnim postupkom, kao što je poznato u struci. Poželjno, enzim koji razgrađuje škrob je hipertermofilan. Zbog subcelularnog usmeravanja enzima ka granuli škroba, ili zbog udruživanja enzima sa granulom škroba tokom procesa vlažnog mlevenja pri konvencionalnim temperaturama, enzim za prerađivanje se prečišćava zajedno sa granulama škroba, čime se dobija smeša granula škroba i enzima. Nakon izdvajanja smeše granula škroba i enzima, enzim se aktivira obezbeđivanjem pogodnih uslova za njegovo dejstvo. Na primer, prerađivanje može da se izvede u različitim uslovima vlažnosti i/ili temperature, čime se pospešuje delimična (u slučaju kada se dobijaju derivirane vrste škroba ili dekstrini) ili kompletna hidroliza škroba do heksoza. Na ovaj način se dobijaju sirupi koji sadrže velike ekvivalente dekstroze ili fruktoze. Ovaj postupak efikasno skraćuje vreme, smanjuje energiju i troškove koji se odnose na enzime, a povećava efikasnost kojom se škrob prevodi u odgovarajuću heksozu, efikasnost dobijanja proizvoda, kao što su voda dobijena natapanjem sa visokim nivoom šećera i sirupi sa visokim nivoima ekvivalenata dekstroze.
U drugom rešenju, biljka ili proizvod biljke, kao što je plod ili zrno, ili brašno koje se dobija iz zrna i koje eksprimira enzim, biva tretirano kako bi se aktivirao enzim i kako bi se preveli polisaharidi eksprimirani i sadržani u biljci u šećere. Poželjno, enzim je fuzionisan sa signalnom sekvencom koja usmerava enzim ka granuli škroba, amiloplastu. apoplastu ili endoplazmatskom retikulumu, kao što je ovde i opisano. Dobijeni šećer zatim može biti izolovan ili izdvojen iz biljke ili proizvoda biljke. U drugom rešenju, ekspresija enzima za prerađivanje koji poseduje sposobnost da prevede polisaharide u šećere postavlja se pod kontrolu inducibilnog promotera korišćenjem postupaka koji su ovde opisani i koji su poznati u struci. Enzim za prerađivanje može biti mezofilan, termofilan ili hipertermofilan. Biljka se uzgaja do željenog stadijuma razvoja, nakon čega se indukuje promoter koji izaziva ekspresiju enzima i konverziju polisaharida do šećera, u samoj biljci ili biljnom proizvodu. Poželjno, enzim je operativno povezan sa signalnomsekvencom koja usmerava enzim do granule škroba, amiloplasta, apoplasta ili endoplazmatskog retikuluma. U drugom rešenju, proizvodi se transformisana biljka koja eksprimira enzim za prerađivanje koji je sposoban da prevede granulu škroba u šećer. Enzim se fuzioniše sa signalnom sekvencom koja usmerava enzim do granule škroba u biljci. Škrob se zatim izoluje iz transformisane biljke koja sadrži enzim koji je eksprimiran u transformisanoj biljci. Enzim koji se nalazi u izolovanom škrobu zatim može biti aktiviran kako bi preveo škrob u šećer. Enzim može biti mezofilan, termofilan ili hipertermofilan. Obezbeđeni su primeri hipertermofilnih enzima koji su spososbni da prevedu škrob u šećer. Postupak može da se koristi u slučaju bilo koje biljke koja proizvodi polisaharid i koja može da eksprimira enzim koji može da prevede polisaharid u šećere ili da hidrolizuje škrob do proizvoda kao što su dekstrin, malto-oligosaharid, glukoza i/ili njihove smeše.
Predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za dobijanje dekstrina i izmenjenih vrsta škroba iz biljke ili proizvoda biljke, koja je transformisana enzimom za prerađivanje koji hidrolizuje određene kovalentne veze polisaharida, čime se dobija derivat polisaharida. U jednom rešenju, biljka ili deo biljke, kao što je plod ili zrno ili brašno koje se dobija od zrna i koje eksprimira enzim, postavlja se u uslove koji su dovoljni da aktiviraju enzim i da prevedu polisaharide koji se nalaze u biljci u polisaharide manje molekulske mase. Poželjno, enzim je fuzionisan sa signalnom sekvencom koja usmerava enzim do granule škroba, amiloplasta. apoplasta ili endoplazmatskog retikuluma, kao stoje ovde opisano. Dobijem' dekstrin ili drugi derivati škroba zatim mogu da se izoluju ili prikupe iz biljke ili biljnog proizvoda. U drugom rešenju, enzim za prerađivanje, koji je sposoban da prevede polisaharide u dekstrine ili izmenjene vrste škroba, postavlja se pod kontrolu inducibilnog promotera korišćenjem postupaka koji su poznati u struci i koji su ovde opisani. Biljka se uzgaja do željenog stadijuma razvoja, pa se indukuje promoter što vodi ekspresiji enzima i konverziji polisaharida do dekstrina ili izmenjenih vrsta škroba, u samoj biljci ili njenom delu. Poželjno, enzim je a-amilaza. pululanaza, izo- ili neo-pululanaza i operativno je povezan sa signalnom sekvencom koja usmerava enzim do granule škroba, amiloplasta, apoplasta ili endoplazmatskog retikuluma. U jednom rešenju, enzim je usmeren ka apoplastu ili ka endoplazmatkskom retikulumu. U još jednom rešenju, dobija se transformisana biljka koja eksprimira enzim koji je sposoban da prevede škrob do dekstrina ili do izmenjenih vrsta škroba. Enzim je fuzionisan sa signalnom sekvencom koja usmerava enzim do granule škroba u samoj biljci. Škrob se potom izoluje iz transformisane biljke koja sadrži enzim koji ta biljka eksprimira. Enzim koji se nalazi u izolovanom škrobu zatim može biti aktiviran u određenim uslovima, čime se škrob prevodi u dekstrine ili u izmenjeni škrob. Primeri hipertermofilnih enzima, koji su, na primer, sposobni da prevedu škrob do proizvoda hidrolize škroba su obezbeđeni predmetnim pronalaskom. Postupci prema predmetnom pronalasku mogu da se upotrebe na bilo kojoj biljci koja stvara polisaharide i koja može da eksprimira enzim koji je sposoban da prevede polisaharid u šećer.
U drugom rešenju, zrno iz transformisanih biljaka prema predmetnom pronalasku koje akumulira enzime za razgradnju škroba koji raskidaju veze u granulama škroba pri čemu nastaju dekstrini, modifikovane vrste škroba ili heksoze (npr. a-amilaza, pululanaza, a-glukozidaza, amilopululanaza), natapa se u uslovima u kojima se pospešuje aktivnost enzima za razgradnju škroba tokom različitih perioda vremena. Nastala smeša može da sadrži visoke nivoe proizvoda izvedenih iz škroba. Korišćenje takvog zrna: 1) eliminiše potrebu za mlevenjem zrna, ili za nekim drugim vidom prerade zrna pre dobijanja granula škroba, 2) čini škrob lakše dostupnim enzimima tako što se enzimi postavljaju direktno u tkivo endosperma zrna i 3) eliminiše potrebu za korišćenjem mikrobnih enzima za hidrolizu škroba. Stoga, čitav postupak vlažnog mlevenja pre prikupljanja heksoza biva eliminisan jednostavnim zagrevanjem zrna, poželjno zrna kukuruza, u prisustvu vode, čime se omogućava dejstvo enzima na škrob.
Ovaj proces takođe može da se koristi za proizvodnju etanoia. sirupa sa visokim sadržajem fruktoze. fermentacionih podloga sa visokim sadržajem heksoze (glukoze), ili za bilo koju drugu upotrebu škroba koja ne zahteva preradu komponenti zrna.
Predmetni pronalazak dalje obezbeđuje postupak za dobijanje dekstrina. malto-oligosaharida i/ili šećera koji obuhvata tretiranje dela biljke koji sadrži granule škroba i najmanje jedan enzim za preradu škroba u uslovima u kojima je aktivan najmanje jedan enzim, pri čemu se granule škroba prerađuju do vodenog rastvora koji sadrži šećere. Deo biljke se dobija iz transformisane biljke, čiji je genom pojačan ekspresionom kasetom koja kodira najamnje jedan enzim za prerađivanje. Zatim se vodeni rastvor koji sadrži dekstrine. malto-oligosaharide i/ili šećer prikuplja. U jednom rešenju, enzim za prerađivanje je a-amilaza, a-glukozidaza, pululanaza, glukoamilaza, amilopululanaza. izomeraza glukoze, ili bilo koja njihova kombinacija. Poželjno, enzim je hipertermofilan. U drugom rešenju. postupak dalje obuhvata izolaciju dekstrina, malto-oligosaharida i/ili šećera.
C. Poboljšane varijante kukuruza
Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje proizvodnju poboljšanih varijanti kukuruza (kao i varijanti drugih useva) koje poseduju normalne nivoe akumuliranog škroba i koje akumuliraju dovoljne nivoe amilolitičkih enzima u svom endospermu, ili u organu u kome se nakuplja škrob, tako da nakon aktivacije enzima koji se u njima nalazi, npr. kuvanjem ili zagrevanjem biljke ili dela biljke u slučaju hipertermofilnog enzima, biva pospešeno brzo prevođenje škroba u proste šećere. Ovi prosti šećeri (pre svega glukoza) obezbeđuju sladak ukus tretiranom kukuruzu. Nastala biljka kukuruza je poboljšana varijanta koja ima dvostruku upotrebu i kao zrno za dobijanje hibrida i kao slatki kukuruz. Stoga, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za dobijanje hiperslatkog kukuruza, koji se sastoji u tretiranju transformisanog kukuruza ili njenog dela, čiji je genom pojačan ekspresionom kasetom koja sadrži promoter operativno povezan sa prvim polinukleotidom koji kodira najmanje jedan amilolitički enzim u endospermu, a obezbeđuje i sulove u kojima je aktivan barem jedan enzim, tako da se polisaharidi u kukuruzu prevode u šećer, pri čemu se dobija hiperslatki kukuruz. Promoter može biti konstitutivni promoter, za seme specifični promoter ili.promoter koji je specifičan za endosperm i koji je povezan sa polinukleotidnom sekvencom koja kodira enzim za prerađivanje kao stoje a-amilaza, npr. koji je povezan sa sekvencom čiji je ID broj 13, 14 ili 16. Poželjno, enzim je hipertermofilan. U jednom rešenju, ekspresiona kaseta dalje sadrži drugi polinukleotid koji kodira signalnu sekvencu operativno povezanu sa enzimom koji je kodiran prvim polinukleotidom. Primer signalne sekvence u ovom rešenju predmetnog pronalaska usmerava enzim ka apoplastu, endoplazmatskom retikulumu. granuli škroba ili ka amiloplastu. Biljka kukuruza se uzgaja tako da se formiraju strukovi sa zrnima, a zatim se indukuje promoter koji dovodi do ekspresije enzima, čime se polisaharidi koji se nalaze u biljci prevode u šećer.
D. Biljke sa sposobnošću samofermentacije
U drugom rešenju prema predmetnom pronalasku, biljke, kao što su kukuruz, pirinač. pšenica ili šećerna repa se projektuju tako da akumuliraju velike količine enzima za prerađivanje u svojim ćelijama, npr. velike količine ksilanaza, celulaza, hemicelulaza, glukanaza, pektinaza i sličnih (enzima za razgradnju koji ne deluju na škrob). Nakon prikupljanja komponenti zrna (ili šećera u slučaju šećerne trske), stočna hrana, pleva ili pleva od šećerne trske se koriste kao izvor enzima, koji su usmereni da se eksprimiraju i akumuliraju u ćelijskom zidu, a koriste se i kao izvor biomase. Stočna hrana (ili drugi materijali koji se razmatraju) se koristi kao zaliha materijala u procesu prikupljanja fermentabilnih šećera. Postupak dobijanja fermentabilnih šećera se sastoji od aktivacije enzima koji razgrađuje ne-skrobne polisaharide. Na primer. aktivacija može da obuhvati biljno tkivo u prisustvu vode tokom perioda vremena koji su odgovarajuće dugački za hidrolizu ne-skrobnih polisaharida u odgovarajuće šećere. Stoga, navedena stočna hrana sa sposobnošću samoprerađivanja proizvodi enzime koji su potrebni za prevođenje polisaharida u monosaharide, praktično bez porasta troškova, jer su oni sastavni delovi stočne hrane. Dalje, enzimi koji su zavisni od temperature nemaju štetna dejstva na rast i razvoj biljke, a njihovo usmeravanje ka ćelijskom zidu, čak usmeravanje u mikrofibrile polisaharida posredstvom vezujućih domena za celulozu/ksilozu koji su fuzionisani sa proteinom, poboljšava dostupnost supstrata enzimu.
Stoga, predmetni pronalazak takođe obezbeđuje postupak za korišćenje dela transformisane biljke koji sadrži najmanje jedan enzim za prerađivanje ne-skrobnih polisaharida u ćelijskom zidu ćelija biljnog dela. Postupak takođe obuhvata tretiranje transformisanog biljnog dela koji sadrži najmanje jedan enzim za prerađivanje ne-skrobnih polisaharida u uslovima u kojima je najmanje jedan enzim aktivan, pri čemu se granule škroba prerađuju, čime se dobija vodeni rastvor koji sadrži šećere, pri čemu se biljni deo dobija od transformisane biljke, čiji je genom pojačan ekspresionom kasetom koja kodira namanje jedan enzim za prerađivanje ne-skrobnog polisaharida: kao i prikupljanje vodenog rastvora koji sadrži šećere. Predmetni pronalazak obimom zaštite takođe obuhvata transformisanu biljku ili biljni deo koji sadrži najmanje jedan enzim za prerađivanje ne-skrobnog polisaharida koji se nalazi u ćeliji ili u ćelijskom zidu ćelije biljke ili biljnog dela. Biljni deo se dobija od transformisane biljke, čiji je genom pojačan ekspresionom kasetom koja kodira najmanje jedan enzim za prerađivanje koji ne deluje na škrob. npr. ksilanazu. celulazu, glukanaza. pektinazu ili bilo koju njihovu kombinaciju.
E. Vodena faza sa visokim sadržajem proteina i šećera
U još jednom rešenju, projektovane su proteaze i lipaze koje se akumuliraju u semenu, npr. semenu soje. Nakon aktivacije proteaze ili lipaze, npr. zagrevanjem, ovi enzimi u semenu hidrolizuju lipide i proteine za skladištenje koji se nalaze u soji. Tako se mogu dobiti rastvorljivi proizvodi kao što su aminokiseline, koje mogu da se koriste kao stočna hrana, kao namirnice ili fermentacione podloge, a dobijaju se i masne kiseline. U nerastvornoj frakciji prerađenog zrna se tipično nalaze polisaharidi. Međutim, kombinovanjem ekspresije i akumulacije enzima koji razgrađuju polisaharide u semenu, proteini i polisaharidi mogu da se hidrolizuju i nalaze se u vodenoj fazi. Na primer, na ovaj način mogu biti učinjeni rastvornim zeini iz kukuruza i proteini za skladištenje i ne-skrobni polisaharidi iz soje. Sastojci iz vodene i hidrofobne faze mogu lako da se razdvoje ekstrakcijom organskim rastvaračima ili nadkritičnim koncentracijama ugljen dioksida. Stoga, obezbeđen je postupak za dobijanje vodenog ekstrakta zrna koji sadrži visoke nivoe proteina, aminokiselina, šećera ili saharida.
F. Samofermentacija
Predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za proizvodnju etanoia, fermentiranog pića, ili drugih proizvoda koji se dobijaju fermentacijom. Postupak obuhvata dobijanje biljke ili proizvoda ili dela biljke ili derivata biljke, kao što je brašno od zrna, u kome je eksprimiran enzim za prerađivanje koji prevodi polisaharide u šećer. Biljka ili njen deo se tretira tako da se iz polisaharida prevođenjem dobije šećer, kao što je gore opisano. Šećeri i drugi sastojci biljke se zatim fermentiraju kako bi se dobio etanol ili fermentirano piće ili neki drugi fermentacioni proizvodi, shodno postupcima koji su poznati u struci. Videti, na primer, U.S: patent br.
4,929.452. Ukratko, šećer koji se dobija prevođenjem iz polisaharida biva inkubiran sa gljivicama u uslovima koji pospešuju prevođenje šećera u etanol. Odgovarajuće gljivice obuhvataju sojeve gljivica koje su tolerantne na visoke sadržaje alkohola i šećera, kao što je. na primer. gljivicaS. cerevisiaeATCC br. 20867. Ovaj soj je deponovan u Američkoj kolekciji tipskih kultura, Rockville, MD, 17.09.1987. i označen je kao ATCC br. 20867. Fermentirani proizvod ili fermentirano piće zatim mogu biti destilovani kako bi se izolovao etanol ili kako bi se dobilo destilovano piće. ili se fermentacioni proizvod može prikupiti na neki drugi način. Biljka koja se koristi u ovom postupku može biti bilo koja biljka koja sadrži polisaharid i koja je sposobna da eksprimira enzim prema predmetnom pronalasku. Mnoge takve biljke su ovde opisane. Poželjna je ona biljka koja se komercijalno uzgaja. Poželjnija je ona biljka koja se normalno koristi za dobijanje etanoia ili fermentiranih pića ili drugih fermentacionih proizvoda, kao što su, na primer, pšenica, ječam, kukuruz, raž, krompir. grožđe ili pirinač. Najpoželjnija biljka je kukuruz.
Postupak prema predmetnom pronalasku obuhvata tretiranje biljnog dela koji sadrži najmanje jedan enzim za prerađivanje polisaharida u uslovima u kojima je najmanje jedan enzim aktivan, čime se u biljnom delu polisaharid razgrađuje do fermentabilnog šećera. Enzim za porerađivanje polisaharida može biti mezofilan, termofilan ili hipertermofilan. Poželjno, enzim je hipertermofilan. Biljni deo se dobija iz transformisane biljke, čiji je genom pojačan ekspresionom kasetom koja kodira najmanje jedan enzim za prerađivanje polisaharida. Biljni delovi prema ovom rešenju predmetnog pronalaska obuhvataju. bez ograničenja, zrno, plod. seme, stablo, drvo, povrće ili koren. Poželjne biljke obuhvataju, bez ograničenja, ovas, ječam, pšenicu, bobice, grožđe, raž, kukuruz, krompir, šećernu repu. šećernu trsku, ananas, travu i drvo. Biljni deo može biti kombinovan sa robnim zrnom ili drugim komercijalno dostupnim supstratima; izvor supstrata za prerađivanje može biti i neki drugi izvor pored biljke sa sposobnošću samoprerađivanja. Fermentabilni šećer se zatim inkubira u uslovima koji pospešuju prevođenje fermentabilnog šećera u etanol, npr. u prisustvu gljivice i/ili drugih mikroba. U poželjnom rešenju, deo biljke se dobija od kukuruza koji je transformisan a-amilazom, za koji je otkriveno da skraćuje vreme i smanjuje troškove fermentacije.
Otkriveno je da se količina rezidualnog škroba smanjuje kada se, na primer, pri fermentaciji koristi transgeni kukuruz koji se proizvodi shodno predmetnom pronalasku tako da eksprimira termostabilnu a-amilazu. Ovo ukazuje da je veća količina škroba rastvorena tokom fermentacije. Manja količina rezidualnog škroba rezultuje dobijanjem zrna za destilaciju koje sadrži veću količinu (masu) proteina, a time i veću vrednost. Dalje, fermentacija transgenog kukuruza prema predmetnom pronalasku dozvoljava da se proces likvefakcije izvodi pri nižoj pH vrednosti (što vodi uštedi u troškovima za Kemikalije koje se koriste za podešavanje pH vrednosti), pri većoj temperaturi, npr, većoj od 85 °C, poželjno većoj od 90 °C, još poželjnije većoj od 95 °C i višoj, što vodi kraćem vremenu likvefakcije i kompletnijem rastvaranju škroba, kao i skraćenju vremena likvefakcije, što sve vodi efikasnoj reakciji fermentacije uz veći prinos etanoia.
Dalje, otkriveno je da kontakt delova konvencionalnih biljaka čak i sa malim delom transgene biljke dobijenim shodno predmetnom pronalasku, može da skrati vreme fermentacije i sa tim povezane troškove. Tako. predmetni pronalazak se odnosi na skraćenje vremena ferementacije, koja obuhvata izlaganje transgenog dela biljke dobijenog od biljke koja sadrži enzim za prerađivanje polisaharida koji prevodi polisaharide u šećer, u odnosu vreme fermentacije pri korišćenju biljnog dela koji ne sadrži enzim za prerađivanje polisaharida.
G. Sirovi enzimi koji prerađuju škrob i polinukleotidi koji ih kodiraju
Polinukleotid koji kodira mezofiini enzim za prerađivanje uveden je u biljku ili biljni deo. U poželjnom rešenju, polinukleotid prema predmetnom pronalasku je polinukleotid koji je optimizovan za kukuruz i čija sekvenca ima ID broj 48, 50 i 59, koja kodira glukoamilazu. kao što je ona čija sekvenca ima ID broj 47 i 49. U drugom poželjnom rešenju, polinukleotid prema predmetnom pronalasku jeste polinukeotid koji je optimizovan za kukuruz, kao što je polinukleotid čija sekvenca ima ID broj 52, koja kodira a-amilazu, kao što je ona koja je kodirana sekvencom čiji je ID broj 51. Dalje su obezbeđeni fuzioni proizvodi enzima za prerađivanje. U jednom poželjnom rešenju, polinukleotid prema predmetnom pronalasku je polinukleotid koji je optimizovan za kukuruz i koji ima sekvencu čiji je ID broj 46, koji kodira fuzioni protein a-amilaze i glukoamilaze, kao stoje onaj čija sekvenca ima ID broj 45. Dalje, predmetnim pronalaskom su obuhvaćene kombinacije enzima za prerađivanje. Na primer, obuhvaćena je kombinacija enzima za prerađivanje škroba i enzima za prerađivanje koji ne deluju na škrob. Ovakve kombinacije enzima za prerađivanje može da se dobije upotrebom multiplih genskih konstrukata koji kodiraju takve enzime. Alternativno, pojedinačne transgene biljke koje su stabilno transformisane enzimima mogu da se ukrste poznatim postupcima sa biljkom koja sadrži oba enzima. Drugi postupak obuhvata korišćenje egzogenog enzima (egzogenih enzima) zajedno sa transgenom biljkom.
Enzimi za prerađivanje škroba ili enzima za prerađivanje koji ne deluju na škrob mogu biti izolovani ili izvedeni iz bilo kog izvora, a stručnjaci mogu da dešifruju njima odgovarajuće polinukleotide. Poželjno, a-amilaza se izvodiiz Aspcrgi/! us- a (npr. Aspergilhis shirouscuniiAspergilhis niger). Rhizopus- a(npr.Rhizopu. s orvzae)i biljaka kao što su kukuruz, ječam i pirinač. Poželjno, glukoamilaza se izvodiiz Aspergillus- a (npr. Aspergilhis shirouscuniiAspergilhis niger), Rhizopus- a(npr.Rhizopu. s oryzae)i izTherniocincierobcicter- a
{ Thermocmaerobcicter thermosaccharolvticum).
U drugom rešenju prema predmetnom pronalasku, polinukleotid kodira mezofiini enzim za prerađivanje škroba koji je operativno povezan sa polinukleotidom optimizovanim za kukuruz, kao što je onaj čija sekvenca ima ID broj 54, koji kodira vezujući domen za sirovi škrob, kao što je onaj čija sekvenca ima ID broj 53.
U drugom rešenju, tkivno specifični promoter obuhvata endosperm - specifične promotere, kao što je promoter y-zeina kukuruza (sekvenca čiji je ID broj 12) ili promoter ADP-gpp kukuruza (sekvenca čiji je ID broj 1 1. koja sadrži 5' sekvencu koja se ne translira i intronsku sekvencu). Stoga, predmetni pronalazak obuhvata izolovani polinukleotid koji sadrži promoter čija sekvenca ima ID broj 11 ili 12, polinukleotid koji hibridizuje sa komplementom ovih sekvenci u uslovima slabo precizne hibridizacije, ili deo tog polinukleotida koji poseduje aktivnost promotera čija sekvenca ima ID broj 11 ili 12 od najmanje 10%. a poželjno od najmanje 50%.
U jednom rešenju, proizvod gena koji kodira enzim za hidrolizu škroba, kao što je a-amilaza, glukoamilaza ili fuzioni protein a-amilaza/glukoamilaza. može biti usmeren ka određenoj organeli ili ka određenom mestu, kao što je endoplazmatski retikulum ili apoplast, pre nego ka citoplazmi. Primer za ovo je korišćenje N-terminalne signalne sekvence y-zeina kukuruza (sekvenca čiji je ID broj 17), koja omogućava usmeravanje proteina specifično ka apoplastu, kao i korišćenje N-terminalne signalne sekvence y-zeina (sekvenca čiji je ID broj 17) koja je operativno povezana sa enzimom za prerađivanje, koji je operativno povezan sa SEKDEL sekvencom koja omogućava zadržavanje u endoplazmatskom retikulumu. Usmeravanje proteina ili enzima ka specifičnom odeljku omogućava enzimu da bude lokalizovan na način pri kome neće doći u kontakt sa supstratom. Na ovaj način dejstvo enzima se neće ispoljiti sve dok enzim ne dođe u kontakt sa supstratom. Enzim može doći u kontakt sa svojim supstratom u toku procesa mlevenja (fizičkog razaranja ćelijskog integriteta) i hidracije. Na primer. mezofiini enzim za prerađivanje škroba može biti usmeren ka apoplastu ili ka endoplazmatskom retikulumu i tako neće doći u kontakt sa granulama škroba u amiloplastu. Mlevenje zrna razara integritet zrna i omogućava da enzim za hidrolizu škroba dospe u kontakt sa granulama škroba. Na ovaj način mogu da se izbegnu potencijalni negativni efekti ko-lokalizacije enzima i njegovog supstrata.
H. Namirnice bez dodatka zaslađivača
Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje postupak proizvodnje zaslađenih brašnastih namirnica bez dodavanja zaslađivača. Primeri brašnastih proizvoda obuhvataju. bez ograničenja, hranu za doručak, hranu koja se odmah konzumira, testeninu i proizvode od žitarica, kao što su pahuljice od žitarica koje se koriste za doručak. Postupak takođe obuhvata tretiranje biljnog dela koji sadrži najmanje jedan enzim za prerađivanje škroba u uslovima u kojima je aktivan barem jedan enzim za prerađivanje škroba, pri čemu se granule škroba prerađuju u biljnom delu do šećera, tako da se dobija zaslađeni proizvod, npr. proizvod koji je slađi u poređenju sa proizvodom dobijenim prerađivanjem granula škroba iz biljnog dela koji ne sadrži hipertermofilni enzim. Poželjno, enzim za prerađivanje škroba je hipertermofilan i aktivira se zagrevanjem, npr. pečenjem, kuvanjem, izlaganjem toploti. izlaganjem pari, izlaganjem električnom pražnjenju ili bilo kojoj kombinaciji ovih postupaka. Biljni deo se dobija od transformisane biljke, na primer od transformisane soje, raži. ovsa. ječma, pšenice, kukuruza, pirinča ili šećerne repe, čiji je genom pojačan ekspresionom kasetom koja kodira najmanje jedan hipertermofilan enzim za prerađivanje škroba, npr. a-amilazu. a-glukozidazu. glukoamilazu, pululanazu, izomerazu glukoze, ili bilo koju njihovu kombinaciju. Zaslađeni proizvod se zatim prerađuje u brašnastu namirnicu. Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje brašnastu namirnicu, npr. pahuljice od žitarica, hranu za doručak, namirnicu koja odmah može da se konzumira ili pečenu namirnicu, koja je dobijena shodno postupku prema predmetnom pronalasku. Brašnasta namirnica može da se dobije iz zaslađenog proizvoda i vode i može da sadrži slad, veštačke arome, vitamine, minerale, veštačke boje ili bilo koju njihovu kombinaciju.
Enzim može biti aktiviran tako da prevodi polisaharide koji se nalaze u biljnom materijalu u šećer pre ubacivanja biljnog materijala u definitivni proizvod od žitarica ili tokom prerađivanja proizvoda od žitarice. Shodno tome, polisaharidi koji se nalaze u biljnom materijalu mogu da se prevedu u šećer aktivacijom materijala, npr. zagrevanjem u slučaju hipertermofilnog enzima, pre dobijanja samog brašnastog proizvoda. Biljni materijal koji sadrži šećer koji je dobijen prevođenjem polisaharida se nakon toga dodaje proizvodu kako bi se dobio zaslađeni proizvod. Alternativno, polisaharidi mogu da se prevedu u šećere pomoću enzima tokom prerađivanja brašnastog proizvoda. Primeri procesa koji se koriste za dobijanje proizvoda od žitarica su dobro poznati u struci i obuhvataju zagrevanje. pečenje, kuvanje i slično, kao što je opisano u U.S. patentima br. 6.183.7S8; 6.159.530; 6.149.965; 4,988.521 i 5,368.870.
Ukratko, testo može da se pripremi mešanjem raznih suvih sastojaka sa vodom i kuvanjem do gelatinizacije škrobnih sastojaka i do razvoja ukusa skuvane namirnice. Skuvani materijal može biti mehanički obrađen kako bi se dobilo kuvano testo. kao što je testo za pahuljice od žitarica. Suvi sastojci mogu da obuhvate različite aditive, kao što su šećeri, škrob, so, vitamini, minerali, veštačke boje, veštačke arome, so i slično. Pored vode, mogu da se dodaju razni tečni sastojci, kao što su sirup kukuruza ili sirup slada. Brašnasti materijal može da sadrži zrna žitarica, isečena zrna, griz ili veštačke arome pšenice, pirinča, kukuruza, ovsa, ječma, raži ili ili druga žitarična zrna i njihove smeše od date transformisane biljke prema predmetnom pronalasku. Testo zatim može biti prerađeno u željeni oblik procesom kao što je provlačenje ili udaranje i može biti dalje kuvano korišćenjem sredstava kao što je Džejmsov aparat za kuvanje, rerna ili uređaj sa električnim pražnjenjem.
Dalje je obezbeđen postupak za zasladivanje proizvoda koji sadrži škrob bez dodavanja zaslađivača. Postupak obuhvata tretiranje škroba najmanje jednim enzimom za prerađivanje škroba u uslovima u kojima je aktivan najmanje jedan enzim, čime se škrob razgrađuje da šećera, pri čemu se dobija tretirani (zaslađeni škrob), tj. škrob koji je slađi od proizvoda dobijenog tretiranjem škroba koji ne sadrži hipertermofilni enzim. Škrob prema predmetnom pronalasku se dobija iz transformisane biljke, čiji je genom pojačan ekspresionom kasetom koja kodira najmanje jedan enzim za prerađivanje. Poželjni enzimi obuhvataju a-amilazu, a-glukozidazu, glukoamilazu, pululanazu, izomerazu glukoze ili bilo koju njihovu kombinaciju. Poželjno, enzim je hipertermofilan i aktivira se toplotom. Poželjne transformisane biljke obuhvataju kukuruz, soju, raž, ovas, ječam, pšenicu, pirinač i šećernu trsku. Tretirani škrob se zatim dodaje proizvodu kako bi se dobio zaslađeni proizvod koji sadrži škrob, npr. brašnasti proizvod. Takođe je obezbeđen i zaslađeni proizvod koji sadrži škrob dobijen korišćenjem ovog postupka.
Predmetni pronalazak dalje obezbeđuje postupak za zaslađivanje voća ili povrća koje sadrži polisaharid i obuhvata: tretiranje voća ili povrća koje sadrži makar jedan enzim za prerađivanje polisaharida u uslovima u kojima je aktivan barem jedan enzim, čime se polisaharid iz voća ili povrća prerađuje do šećera, čime se dobija zaslađeno voće ili povrće, npr. Voće ili povrće koje je slađe u odnosu na voće ili povrće biljke koja ne sadrži enzim za prerađivanje polisaharida. Voće ili povrće prema predmetnom pronalasku se dobija od transformisane biljke, čiji je genom pojačan ekspresionom kasetom koja kodira najmanje jedan enzim za prerađivanje polisaharida.
Poželjno voće i povrće obuhvata krompir, paradajz, bananu, bundevu, grašak i pasulj. Poželjni enzimi obuhvataju a-amilazu. a-glukozidazu, glukoamilazu, pululanazu, izomerazu glukoze ili bilo koju njihovu kombinaciju. Poželjno, enzim je hipertermofilan.
1. Zaslađivanje biljke ili biljnog proizvoda koji sadrži polisaharid
Postupak prema predmetnom pronalasku obuhvata dobijanje biljke koja eksprimira enzim za prerađivanje koji prevodi polisaharid u šećer, kao što je ranije opisano. Shodno tome, enzim je eksprimiran u biljci i biljnom proizvodu, kao što je voće ili povrće. U jednom rešenju, enzim je stavljen pod kontrolu inducibilnog promotera, tako da se ekspresija enzima može indukovati primenom spoljašnjeg stimulusa. Takvi inducibilni promoteri i konstrukti su dobro poznati u struci i ovde su opisani. Ekspresija enzima u biljci ili njenom proizvodu dovodi do prevođenja polisaharida koji se nalazi u biljci ili biljnom proizvodu do šećera, čime se biljka ili njen proizvod zaslađuju. U drugom rešenju, enzim za prerađivanje polisaharida je konstitutivno eksprimiran. Stoga, biljka ili biljni proizvod mogu da se aktiviraju u uslovima koji su dovoljni za aktivaciju enzima tako se započne prevođenje polisaharida u šećer, čime se zaslađuju biljka ili njen proizvod. Ovaj postupak samoprerađivanja polisaharida u voću ili povrću, pri čemu nastaje šećer, rezultuje dobijanjem zaslađenog voća ili povrća, npr. slađeg u odnosu na voće ili povrće iz biljke koja ne sadrži enzim za prerađivanje polisaharida. Voće ili povrće prema predmetnom pronalasku se dobija od transformisane biljke, čiji je genom pojačan ekspresionom kasetom koja kodira najmanje jedan • enzim za prerađivanje polisaharida. Poželjno voće i povrće obuhvata krompir, paradajz, bananu, bundevu, grašak i pasulj. Poželjni enzimi obuhvataju a-amilazu, a-glukozidazu, glukoamilazu, pululanazu, izomerazu glukoze ili bilo koju njihovu kombinaciju. Poželjno, enzim za prerađivanje polisaharida je hipertermofilan.
. 1. Izolacija škroba iz transformisanog zrna koje sadrži enzim koji razara matriks endosperma
Predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za izolaciju škroba iz transformisanog zrna u kome je eksprimiran enzim koji razara matriks endosperma. Postupak obuhvata dobijanje biljke koja eksprimira enzim koji razara matriks endosperma modifikacijom, na primer, ćelijskih zidova, ne-skrobnih polisaharida i/ili proteina. Primeri takvih enzima obuhvataju. bez ograničenja, na primer, proteaze, glukanaze, tioredoksin. tioredoksm reduktazu i esterazu. Ovi enzimi ne obuhvataju nijedan enzim koji pokazuje aktivnost prema škrobu, tako da integritet granula škroba biva održan. Poželjno, enzim je fuzionisan sa signalnom sekvencom koja usmerava enzim ka granuli škroba. U jednom rešenju. zrno se isušuje toplotom, kako bi se aktivirao enzim i kako bi se inaktivirali endogeni enzimi koji se nalaze u zrnu. Tretiranje toplotom izaziva aktivaciju enzima, koji deluje tako da razara matriks endosperma, čime se ovaj zatim lako odvaja od granula škroba. U drugom rešenju, zrno se natapa pri niskoj ili pri visokoj temperaturi, u uslovima male ili velike vlažnosti, sa ili bez sumpor dioksida. Zatim se zrno tretira toplotom kako bi se razorio matriks endosperma i kako bi se omogućilo lako odvajanje od granula škroba. U drugom rešenju, stvaraju se odgovarajući uslovi temperature i vlažnosti kako bi se proteazama omogućilo da prodru u granule škroba i razgrade proteine koji se nalaze u granulama. Ovim tretmanom se dobija visok prinos granula škroba i mala količina proteina.
K. Sirup koji poseduje visok nivo šećera i njegovo korišćenje pri dobijanju etanoia ili
fermentiranog pića
Postupak prema predmetnom pronalasku obuhvata biljku koja eksprimira enzim za prerađivanje polisaharida koji prevodi polisaharid u šećer, kao što je prethodno opisano. Biljka ili njen deo se natapa u vodenoj struji u uslovima u kojima eksprimirani enzim prevodi polisaharid koji se nalazi u biljci ili u njenom delu u dekstrin, malto-oligosaharid i/ili šećer. Vodena struja koja sadrži dekstrin, malto-oligosaharid i/ili šećer dobijen prevođenjem polisaharida se zatim izdvaja, kako bi se dobio sirup koji poseduje visok nivo šećera. Postupak može, a ne mora, da obuhvati dodatni korak mlevenja biljke ili njenog proizvoda vlažnim postupkom, kako bi se dobile granule škroba. Primeri enzima koji mogu da se koriste u ovom postupku obuhvataju, bez ograničenja, a-amilazu, glukoamilazu, pululanazu i a-glukozidazu. Poželjno, enzim je hipertermofilan. Šećeri koji su dobijeni shodno ovom postupku obuhvataju, bez ograničenja, heksozu. glukozu i fruktozu. Primeri biljaka koji se mogu koristiti pri ovom postupku obuhvataju, bez ograničenja, kukuruz, pšenicu ili ječam. Primeri proizvoda biljke koji se mogu koristiti oobuhvataju, bez ograničenja, plod voćke, zrno i povrće. U jednom rešenju, enzim koji prerađuje polisaharid se stavlja pod kontrolu inducibilnog promotera. Shodno tome, pre ili tokom natapanja, promoter se indukuje. čime se izaziva ekspresija enzima, koja zatim obezbeđuje prevođenje polisaharida u šećer. Primeri inducibilnih promotera i konstrukata koji ih sadrže su dobro poznati u struci i ovde su opisani. Stoga, kada je prerađivanje polisaharida hipertermofilno. natapanje se izvodi pri visokoj temperaturi, kako bi se aktivirao hipertermofilni enzim i kako bi se inaktivirali endogeni enzimi koji se nalaze u biljci ili njenom proizvodu. U drugom rešenju, hipertermofilni enzim koji može da prevodi polisaharid u šećer može biti konstitutivno eksprimiran. Ovaj enzim može. ali ne mora biti usmeren ka odeljku biljke korišćenjem signalne sekvence. Biljka ili njen proizvod se natapa u uslovima visoke temperature, kako bi se izazvalo prevođenje polisaharida koji se nalaze u biljci u šećer.
Takođe, obezbeđen je postupak za dobijanje etanoia ili fermentiranog pića iz sirupa koji poseduje visok sadržaj šećera. Postupak obuhvata inkubaciju sirupa sa gljivicom u uslovima koji omogućavaju prevođenje šećera koji se nalazi u sirupu u etanol ili fermentirano piće. Primeri takvih fermentiranih pića obuhvataju, bez ograničenja, pivo i vino. Fermentacioni uslovi su dobro poznati u struci i opisani su u U.S. patentu br. 4.929.452. kao i ovde. Poželjna gljivica je soj 5.cerevisiaeATCC br. 20867, koja je tolerantna na visoke sadržaje alkohola i šećera. Fermentacioni proizvod ili fermentirano piće može biti destilovano, kako bi se izolovao etanol ili kako bi se dobilo destilovano piće.
L. Nakupljanje hipertermofilnog enzima u ćelijskom zidu biljne ćelije
Predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za nakupljanje hipertermofilnog enzima u ćelijskom zidu biljne ćelije. Postupak obuhvata dobijanje biljke koja eksprimira hipertermofilni enzim koji je fuzionisan sa signalnom sekvencom koja ga usmerava ka ćelijskom zidu, tako da se usmereni enzim nakuplja u ćelijskom zidu. Poželjno, enzim je sposoban da prevede polisaharide u monosaharide. Primeri usmeravajućih sekvenci obuhvataju, bez ograničenja, vezujući domen za celulozu ili ksilozu. Primeri hipertermofilnih enzima obuhvataju one čije sekvence imaju ID brojeve 1, 3, 5, 10, 13, 14, 15 ili 16. Biljni materijal koji sadrži ćelijske zidove može da se koristi kao izvor željenih enzima u procesu izdvajanja šećera iz zaliha hrane ili kao izvor enzima za prevođenje polisaharida koji su poreklom iz drugih izvora do monosaharida. Dodatno, ćelijski zidovi mogu da posluže i kao izvor iz kog enzimi mogu da se prečišćavaju. Postupci za prečišćavanje enzima su dobro poznati u struci i obuhvataju. bez ograničenja, gel filtraciju. jonoizmenjivačku hromatografiju. hromatofbkusiranje. izoelektrično fokusiranje. afinitetnu hromatografiju. FPLC. HPLC. precipitaciju solima, dijalizu i slično. Shodno tome, predmetni pronalazak takođe obezbeđuje prečišćene enzime koji su izolovani iz ćclijskih zidova biljaka.
M. Postupak za dobijanje i izolaciju enzima za prerađivanje
Shodno predmetnom pronalasku, dobijanje rekombinantnih enzima za prerađivanje prema predmetnom pronalasku obuhvata transformaciju biljnog tkiva ili biljne ćelije tako da eksprimira enzim za prerađivanje prema predmetnom pronalasku koji može da se aktivira u biljci; obuhvata selekciju transformisanog biljnog tkiva ili ćelije, uzgajanje transformisanog biljnog tkiva ili ćelije u transformisanu biljku, kao i izolaciju enzima za prerađivanje iz transformisane biljke ili njenog dela. Poželjno, rekombinantni enzim je a-amilaza, glukoamilaza. izomeraza glukoze, a-glukozidaza i pululanaza. Najpoželjnije, enzim je kodiran polinukleotidom koji je izabran iz grupe koju čine sekvence čiji su ID brojevi 2, 4. 6. 9. 19. 21, 25, 37, 39. 41, 43, 46, 48, 50, 52 ili 59.
Predmetni pronalazak će dalje biti opisan u primerima koji slede, a koji ni na koji način ne ograničavaju obim zaštite predmetnog pronalaska.
Primeri
Primer1: Konstrukcija gena hipertermofilnih enzima za prerađivanje skroba/izomerizaciju škroba koji su optimizovani za kukuruz
Enzimi, a-amilaza, pululanaza, a-glukozidaza i izomeraza glukoze, koji su uključeni u razgradnju škroba ili izomerizaciju glukoze, izabrani su na osnovu profila njihove aktivnosti. U taj profil spadaju, bez ograničenja, minimalna aktivnost pri ambijentalnoj temperaturi, aktivnost/stabilnost na visokoj temperaturi i aktivnost pri niskom vrednostima pH. Zatim su dizajnirani odgovarajući geni korišćenjem poželjnih kodona za kukuruz, kao što je opisano u U.S. patentu br. 5.625,136 i sintetisani su od strane kompanije Integrateđ DNA Technologies, Inc. (Coralville. 1A).
Zbog svoje hipertermofilne aktivnosti, izabrana je 797GL3 a-amilaza. čija sekvenca ima ID broj I. Sekvenca nukleinske kiseline ovog enzima je dešifrovana i optimizovana za kukuruz i predstavljena je sekvencom čiji je ID broj 2. Slično tome. izabrana je i 6gp3 pululanaza, koja poseduje aminokiselinsku sekvencu čiji je ID broj 3. Sekvenca nukleinske kiseline za 6gp3 pululanazu je dešifrovana i optimizovana za kukuruz i predstavljena je sekvencom čiji je ID broj 4.
Aminokiselinska sekvenca za malA a-glukozidazu izSitlfolobus solfataricuspribavljena je iz literature. J. Bact. 177 : 482 - 485 (1995); J. Bact. 180 : 1287 - 1295 (1998). Na osnovu objavljene aminokiselinske sekvence proteina (sekvenca čiji je ID broj 5). dizajniran je sintetski gen optimizovan za kukuruz (sekvenca čiji je ID broj 6) koji kodira malA a-glukozidazu.
Izabrano je nekoliko izomeraza glukoze. Aminokiselinska sekvenca izomeraze glukoze izvedene izThermotoga maritima(sekvenca čiji je ID broj 18) je sastavljena na osnovu objavljene DNK sekvence čiji je pristupni broj NC-000853, pa je dizajniran sintetski gen koji je optimizovan za kukuruz (sekvenca čiji je ID broj 19). Slično tome, aminokiselinska sekvenca izomeraze glukoze izvedene izThermotoga neapolitana(sekvenca čiji je ID broj 20) je sastavljena na osnovu DNK sekvence objavljene u Appl. Envir. Microbiol. 61 (5) : 1867 - 1875 (1995), pristupni br. L38994. Dizajniranje sintetski gen koji je optimizovan za kukuruz i koji kodira izomerazu glukoze poreklomThermotoga neaoplitana(sekvenca čiji je ID broj 21).
Primer 2 : Ekspresija fuzionog proteina 797GL3 a-amilaze i regiona za enkapsulaciju škroba uE. coli
Konstrukt koji kodira hipertermofilnu 797GL3 a-amilazu fuzionisanu sa regionom za enkapsulaciju škroba (Starch Encapsulating Region - SER) iz kukuruzne sintaze škroba vezane za granulu (waxy) uveden je i eksprimiranu E. Coli.cDNK kukuruzne sintaze škroba vezane za granulu (sekvenca čiji je ID broj 7) koja kodira aminokiselinsku sekvencu (sekvenca čiji je ID broj 8) (Klosgen RB, et al. 1986) klonirana je kao izvor domena za vezivanje škroba, ili kao izvor regiona za enkapsulaciju škroba (SER). cDNK pune dužine je amplifikovana pomoću RT-PCR iz RNK dobijene iz semena kukuruza korišćenjem početnih sekvenci SV 57 5' AGCGAATTCATGGCGGCTCTGGCCACGT 3') (sekvenca čiji je ID broj 22) i SV58 (5' AGCTAAGCTTCAGGGCGCGGCCACGTTCT 3') (sekvenca čiji je ID broj 23) dizajniranih na osnovu sekvence čiji je pristupni broj X03935. Kompletna cDNK je klonirana u pBluescript kao EcoRI/Hindlll fragment i plazmid koji je označen kao pNOV4022. C-terminalni deo (kodiran od strane bp 919 - 1818) waxy cDNK. koji obuhvata domen za vezivanje škroba, amplifikovan je iz pNOV4022 i fuzionisan u okvir očitavanja sa 3' karajem gena 797GL3 pune dužine koji je optimizovan za kukuruz (sekvenca čiji je ID broj 2). Fuzionisani genski proizvod, 797GL3/Waxy, koji poseduje nukleinsku kiselinu čija sekvenca ima ID br. 9 i koja kodira aminokiselinsku sekvencu čiji je ID broj 10, klonirana je kao NcoI/XbaI fragment u pET28b (NOVAGEN, Madison, VV1) i isečen je kao Ncol/XbaI fragment.
Vektori pET28/797GL3 i pET28/797GL3/Waxy su transformisani u BL2I/DE3 ćelijeE. Coli(MOVAGEN) i uzgajane su i indukovane prema uputstvu proizvođača. Analiza pomoću PAGE/Coomassie bojenja je otkrila indukovani protein u oba ekstrakta koji odgovara predviđenim veličinama fuzinisane i nefuzionisane amilaze. respektivno.
Ukupni ćelijski ekstrakti su analizirani na aktivnost hipertermofilne amilaze na sledeći način: 5 mg škroba je suspendovano u 20 u.1 vode, a zatim razblaženo sa 25 ul etanoia. Standardna pozitivna kontrola za amilazu ili uzorak koji treba da se testira na aktivnost amilaze je dodata u smešu, pa je dodata voda do konačne zapremine reakcione smeše od 500 ul. Reakciona smeša je izložena temperaturi od 80 °C tokom 15-45 minuta. Zatim je reakciona smeša ohlađena do sobne temperature, pa je dodato 500 p.1 smeše o-dianizidina i glukoza oksidaze/peroksidaze (Sigma). Smeša je inkubirana na 37 °C tokom 30 minuta. Da bi se reakcija zaustavila, dodato je 500 p.1 12 N sumporne kiseline. Izmerena je apsorbancija na 540 nm kako bi se odredila količina glukoze koja je dobijena dejstvom amilaze po uzorku. Ispitivanjem fuzionisanih i nefuzionisanih ekstrakta amilaze su dobijeni slični nivoi aktivnosti hipertermofilne amilaze, dok su kontrolni ekstrakti bili negativni. Ovo znači daje 797GL3 amilaza još uvek aktivna (pri visokoj temperaturi) kada je fuzionisana sa C-terminalnim delom \vaxy proteina.
Primer 3: Izolacija fragmenata promotera za endosperm - specifičnu ekspresiju u kukuruzu
Promoter 5' nekodirajućeg regiona I (uključujući prvi intron) iz velike podjedinice ADP-gpp (ADP - glukoza pirofosforilaza) izZea mays jeamplifikovan kao fragment od 1515 baznih parova (sekvenca čiji je ID broj I I) iz genomske DNK kukuruza korišćenjem početnih sekvenci dizajniranih na osnovu sekvence čiji je Genbank pristupni br. M81603. Pokazano je da je promoter ADP-gp specifičan za endosperm (Shavv & Hannah, 1992).
Promoter iz gena za y-zein izZea mavsje amplifikovan kao fragment od 673 bp (sekvenca čiji je ID broj 12) iz plazmida pGZ27.3 (dobijenog od dr Brian Larkins). Pokazano je daje promoter za y-zein specifičan za endosperm (Torrent et al. 1997).
Primer 4: Konstrukcija vektora transformacije za 797GL3 hipertermofilnu a-amilazu
Ekspresione kasete su konstruisane u cilju ekspresije 797GL3 hipertermofilne a-amilaze u endospermu kukuruza sa različitim usmeravajućim signalnim sekvencama kao što sledi: pNOV 6200 (sekvenca čiji je ID broj 13) sadrži N-terminalnu signalnu sekvencu y-zeina kukuruza (MRVLLVALALLALAASATS) (sekvenca čiji je ID broj 17) fuzionisanu sa sintetskom 797GL3 amilazom, kao što je gore opisano u Primeru 1. radi usmeravanja ka endoplazmatskom retikulumu i radi sekrecije u apoplast (Torrent et al. 1997). Fuzioni protein je kloniran iza ADP-gpp promotera kukuruza za specifičnu ekspresiju u endospermu.
pNOV 6201 (sekvenca čiji je ID broj 14) sadrži N-terminalnu signalnu sekvencu y-zeina fuzionisanu sa sintetskom 797GL3 amilazom sa C-terminalnim dodatkom sekvence SEKDEL radi usmeravanja i zadržavanja u endoplazmatskom retikulumu (ER) (Munro & Pelham, 1987). Fuzioni protein je kloniran iza ADP-gpp promotera kukuruza za specifičnu ekspresiju u endospermu.
pNOV 7013 sadrži N-terminalnu signalnu sekvencu y-zeina fuzionisanu sa sintetskom 797GL3 amilazom sa C-terminalnim dodatkom sekvence SEKDEL radi usmeravanja i zadržavanja u endoplazmatskom retikulumu (ER). pNOV7013 je identična sa pNOV620l, s tim izuzetkom daje korišćen promoter y-zeina kukuruza (sekvenca čiji je ID broj 12) umesto promotera ADP-gpp kukuruza, radi ekspresije fuzionog proteina u endospermu.
pNOV4029 (sekvenca čiji je ID broj 15) sadrži\vaxy peptid koji usmerava ka amiloplastu (Kloseng et al, 1986), koji je fuzionisan sa sintetskom 797GL3 amilazom radi usmeravanja ka amiloplastu. Fuzioni protein je kloniran iza ADP-gpp promotera kukuruza za specifičnu ekspresiju u endospermu.
pNOV4031 (sekvenca čiji je ID broj 16) sadrži \vaxy peptid koji usmerava ka amiloplastu, koji je fuzionisan sa sintetskim fuzionim proteinom 797GL3Avaxy radi usmeravanja ka granulama škroba. Fuzioni protein je kloniran iza ADP-gpp promotera kukuruza za specifičnu ekspresiju u endospermu.
Dobijeni su dodatni konstrukti sa navedenim fuzionim proteinima koji su klonirani iza promotera y-zeina kukuruza, kako bi se dobili veći nivoi ekspresije enzima. Sve ekspresione kasete su prenete u binarni vektor za transformaciju kukuruza pomoću infekcijeAgrobacterium- om.Binarni vektor sadrži gen za izomerazu fosfomanoze (PM I - Phosphomannose Isomerase), koji omogućava selekciju transgenih ćelija manozom. Transformisane biljke kukuruza su ili samo-oprašene ili su ukrštene, a seme je prikupljeno zbog analize.
Dobijeni su dodatni konstrukti sa usmeravajućim signalima opisanim gore koji su fuzionisani ili sa 6gp3 pululanazom ili sa 340gl2 a-glukozidazom na isti način kao što je opisano za a-amilazu. Ovi fuzioni proteini su klonirani iza ADP-gpp promotera kukuruza i/ili iza promotera y-zeina i transformisani su u kukuruz kao štoje gore opisano. Transformisane biljke kukuruza su ili samo-oprašene ili su ukrštene, a seme je prikupljeno zbog analize.
Kombinacija enzima se može dobiti ili ukrštanjem biljaka koje eksprimiraju pojedinačne enzime ili kloniranjem nekoliko ekspresionih kaseta u isti binarni vektor, čime se omogućava ko-transformacija.
Primer 5: Konstrukcija vektora transformacije za 6Gp3 termofilnu pululanazu
Konstruisana je ekspresiona kaseta za eksprimiranje 6GP3 termofilne pululanaze u endoplazmatskom retikulumu endosperma kukuruza kao što sledi: pNOV7005 (sekvenca čiji je ID broj 24 i 25) sadrži N-terminalnu signalnu sekvencu y-zeina kukuruza fuzionisanu sa sintetskom 6GP3 pululanazom sa C-terminalnim dodatkom sekvence SEKDEL radi usmeravanja i zadržavanja u endoplazmatskom retikulumu. Peptid SEKDEL je fuzionisan sa C-terminalom enzima korišćenjem PCR sa početnicama dizajniranim da amplifikuju sintetski gen i da istovremeno dodaju 6 aminokiselina na C-terminal proteina. Fuzioni protein je kloniran iza promotera y-zeina kukuruza za specifičnu ekspresiju u endospermu.
Primer 6: Konstrukcija vektora za transformaciju biljke sa malA hipertermofilnom a-glukozidazom
Konstruisane su ekspresione kasete za eksprimiranje malA hipertermofilne a-glukozidaze poreklom izSulfolubus solfactariusu endospermu kukuruza sa različitim signalnim sekvencama za usmeravanje: pNOV4831 (sekvenca čiji je ID broj 26) sadrži N-terminalnu signalnu sekvencu y-zeina kukuruza (MRVLLVALALLALAASATS) (sekvenca čiji je ID broj 17) fuzionisanu sa sintetskom malA hipertermofilnom a-glukozidazom sa C-terminalnim dodatkom SEKDEL sekvence radi usmeravanja i zadržavanja u endoplazmatskom retikulumu (Munro & Pelham, 1987). Fuzioni protein je kloniran iza promotera y-zeina kukuruza za specifičnu ekspresiju u endospermu.
pNOV4839 (sekvenca čiji je ID broj 27) sadrži N-terminalnu signalnu sekvencu y-zeina kukuruza (MRVLLVALALLALAASATS) (sekvenca čiji je ID broj 17) fuzionisanu sa sintetskom malA a-glukozidazom radi usmeravanja ka endoplazmatskom retikulumu i radi sekrecije u apoplast (Torrent et al. 1997). Fuzioni protein je kloniran iza promotera y-zeina kukuruza za specifičnu ekspresiju u endospermu.
pNOV4837 sadrži N-terminalnu signalnu sekvencu y-zeina kukuruza (MRVLLVALALLALAASATS) (sekvenca čiji je ID broj 17) fuzionisanu sa sintetskom malA a-glukozidazom sa C-terminalnim dodatkom SEKDEL sekvence radi usmeravanja i zadržavanja u endoplazmatskom retikulumu. Fuzioni protein je kloniran iza promotera ADP-gpp kukuruza za specifičnu ekspresiju u endospermu. Aminokiselinska sekvenca ovog klona je identična sekvenci pNOV4831 (sekvenca čiji je ID broj 26).
Primer 7: Konstrukcija vektora za transformaciju biljke za hipertermofilnu izomerazu glukoze poreklom izThermotoga marilimaiThermotoga neapolitana
Konstruisane su ekspresione kasete za eksprimiranje hipertermofilne izomeraze glukoze poreklom izThermotoga marilimaiThermotoga neapolitanau endospermu kukuruza sa različitim signalnim sekvencama za usmeravanje: pNOV4832 (sekvenca čiji je ID broj 28) sadrži N-terminalnu signalnu sekvencu y-zeina kukuruza (MRVLLVALALLALAASATS) (sekvenca čiji je ID broj 17) fuzionisanu sa sintetskom izomerazom glukoze poreklom izThermotoga marilimasa C-terminalnim dodatkom SEKDEL sekvence radi usmeravanja i zadržavanja u endoplazmatskom retikulumu. Fuzioni protein je kloniran iza promotera y-zeina kukuruza za specifičnu ekspresiju u endospermu.
pNOV4833 (sekvenca čiji je ID broj 29) sadrži N-terminalnu signalnu sekvencu y-zeina kukuruza (MRVLLVALALLALAASATS) (sekvenca čiji je ID broj 17) fuzionisanu sa sintetskom izomerazom glukoze poreklom izThermotoga neapolitanasa C-terminalnim dodatkom SEKDEL sekvence radi usmeravanja i zadržavanja u endoplazmatskom retikulumu. Fuzioni protein je kloniran iza promotera y-zeina kukuruza za specifičnu ekspresiju u endospermu.
pNOV4840 (sekvenca čiji je ID broj 30) sadrži N-terminalnu signalnu sekvencu y-zeina kukuruza (MRVLLVALALLALAASATS) (sekvenca čiji je ID broj 17) fuzionisanu sa sintetskom izomerazom glukoze poreklom izThermotoga neapolitanaradi usmeravanja ka endoplazmatskom retikulumu i radi sekrecije u apoplast (Torrent ct al, 1997). Fuzioni protein je kloniran iza promotera y-zeina kukuruza za specifičnu ekspresiju u endospermu.
pNOV4838 sadrži N-terminalnu signalnu sekvencu y-zeina kukuruza (MRVLLVALALLALAASATS) (sekvenca čiji je ID broj 17) fuzionisanu sa sintetskom izomerazom glukoze poreklom izThermotoga neapolitanasa C-terminalnim dodatkom SEKDEL sekvence radi usmeravanja i zadržavanja u endoplazmatskom retikulumu. Fuzioni protein je kloniran iza promotera ADP-gpp za specifičnu ekspresiju u endospermu. Aminokiselinska sekvenca ovog klona je identična sa sekvencom pNOV4833 (sekvenca čiji je ID broj 29).
Primer 8: Konstrukcija vektora za transformaciju biljke koja eksprimira hipertermofilnu Egl A glukanazu
pNOV4800 (sekvenca čiji je ID broj 58) sadrži signalnu sekvencu AMY32b a-amilaze ječma (MGKNGNLCCFSLLLLLLAGLASGHO/) (sekvenca čiji je ID broj 31) koja je fuzionisana sa zrelom Egl A proteinskom sekvencom radi lokalizacije u apoplastu. Fuzioni protein je kloniran iza promotera y-zeina kukuruza za specifičnu ekspresiju u endospermu.
Primer 9: Konstrukcija vektora za transformaciju biljke koja eksprimira veći broj hipertermofilnih enzima
pNOV4841 sadrži dvostruki genski konstrukt fuzionog proteina 797GL3 a-amilaze i fuzionog proteina 6GP3 pululanaze. Fuzioni protein 797GL3 a-amilaze (sekvenca čiji je ID broj 33) i fuzioni protein 6GP3 pululanaze (sekvenca čiji je ID broj 34) poseduju N-terminalnu signalnu sekvencu y-zeina kukuruza i SEKDEL sekvencu za usmeravanje ka i zadržavanje u endoplazmatskom retikulumu. Svaki od ovih fuzionih proteina je kloniran iza odvojenog promotera y-zeina kukuruza za specifičnu ekspresiju u endospermu.
pNOV4842 sadrži dvostruki genski konstrukt fuzionog proteina 797GL3 a-amilaze i fuzionog proteina malA a-glukozidaze. Fuzioni polipeptid 797GL3 (sekvenca čiji je ID broj 35) i fuzioni polipeptid malA a-glukozidaze (sekvenca čiji je ID broj 36) poseduju N-terminalnu signalnu sekvencu y-zeina kukuruza i SEKDEL sekvencu za usmeravanje ka i zadržavanje u endoplazmatskom retikulumu. Svaki od ovih fuzionih proteina je kloniran iza odvojenog promotera y-zeina kukuruza za specifičnu ekspresiju u endospermu.
pNOV4843 sadrži dvostruki genski konstrukt fuzionog proteina 797GL3 a-amilaze i fuzionog proteina malA a-glukozidaze. Fuzioni protein 797GL3 i fuzioni protein malA a-glukozidaze poseduju N-terminalnu sekvencu y-zeina kukuruza i SEKDEL sekvencu za usmeravanje ka i zadržavanje u endoplazmatskom retikulumu. Fuzioni protein 797GL3 je kloniran iza promotera y-zeina kukuruza, a fuzioni protein malA je kloniran iza ADPgpp promotera za specifičnu ekspresiju u endospermu. Aminokiselinske sekvence. fuzionog proteina 797GL3 i fuzionog proteina malA su identične odgovarajućim sekvencama u pNOV4842 (sekvenca čiji je ID broj 35 i 36, respektivno).
pNOV4844 sadrži trostruki genski konstrukt fuzionog proteina 797GL3 a-amilaze. fuzionog proteina 6GP3 pululanaze i fuzinog proteina malA a-glukozidaze. Fuzioni proteini 797GL3, malA i 6GP3 poseduju N-terminalnu sekvencu y-zeina kukuruza i SEKDEL sekvencu za usmeravanje ka i zadržavanje u endoplazmatskom retikulumu. 797GL3 i malA fuzioni proteini su klonirani iza dva odvojena promotera y-zeina kukuruza, a fuzioni protein 6GP3 je kloniran iza ADPgpp promotera kukuruza za specifičnu ekspresiju u endospermu. Aminokiselinske sekvence fuzionog proteina 797GL3 i fuzionog proteina malA su identične sekvencama pNOV4842 (sekvenca čiji je ID broj 35 i 36, respektivno). Aminokiselinska sekvenca fuzionog proteina 6GP3 je identična sekvenci 6GP3 fuzionog proteina u pNOV4841 (sekvenca čiji je ID broj 34).
Sve ekspresione kasete su prenete u binarni vektor pNOV21 17 zbog transformacije u kukuruz pomoću infekcijeAgrobacterium- om.pNOV2117 sadrži gen za izomerazu fosfomanoze (PMI) koji omogućava selekciju transgenih ćelija upotrebom manoze. Navedeni vektor sadrži konstitutivni VirG gen iz pAD1289 (Hansen, G, et al., PNAS USA 91 : 7603 - 7607 (1994)) i gen za rezistenciju prema spektinomicinu iz Tn7. Između desne i leve granične sekvence u poliveznik su klonirani promoter za ubikvitin kukuruza, PMI kodirajući region i terminator sintaze nopalina iz pNOVl 17 (Negrotto, D.. et al, Plant Cell Reports 19 : 798 - 803 (2000)). Transformisane biljke kukuruza su ili samo-oprašene ili su ukrštene, a seme je prikupljeno radi analize. Kombinacije različitih enzima mogu da se dobiju ili ukrštanjem biljaka koje eksprimiraju pojedinačne enzime ili transfromacijom biljke jednom multigenskom ekspresionom kasetom.
Primer 10: Konstrukcija bakterijskog iPichiaekspresionog vektora
Konstruisane su ekspresione kasete za eksprimiranje hipertermofilne a-glukozidaze i izomeraze glukoze ili uPichiaili u bakterijama: pNOV4829 (sekvenca čiji je ID broj 37 i 38) sadrži sintetski fuzioni protein izomeraze glukoze poreklom izThermotoga maritimasa signalom za zadržavanje u endomplazmatskom retikulumu, koji se nalazi u bakterijskom ekspresionom vektoru pET29a. Gen za fuzioni protein izomeraze glukoze je kloniran u Ncol i SacI mesta pET29a, čime je izvršeno dodavanje N-terminalne S-oznake za prečišćavanje proteina.
pNOV4830 (sekvenca čiji je ID broj 39 i 40) sadrži sintetski fuzioni protein izomeraze glukoze poreklom izThermotoga neapolitanasa signalom za zadržavanje u endomplazmatskom retikulumu. koji se nalazi u bakterijskom ekspresionom vektoru pET29a. Gen za fuzioni protein izomeraze glukoze je kloniran u Ncol i SacI mesta pET29a. čime je izvršeno dodavanje N-terminalne S-oznake za prečišćavanje proteina.
pNOV4835 (sekvenca čiji je ID broj 41 i 42) sadrži sintetski gen za izomerazu glukozu poreklom izThermotoga marilimakoji je kloniran u BamHl i EcoRI mesta bakterijskog ekspresionog vektora pET28C. Ovim je izvršena fuzija His-oznake na N-terminal izomeraze glukoze.
pNOV4836 (sekvenca čiji je ID broj 43 i 44) sadrži sintetski gen za izomerazu glukozu poreklom izThermotoga neapolitanakoji je kloniran u BamHI i EcoRI mesta bakterijskog ekspresionog vektora pET28C. Ovim je izvršena fuzija His-oznake (za prečišćavanje proteina) na N-terminal izomeraze glukoze.
Primer 11
Izvedena je transformacija nezrelih embriona kukuruza u osnovi na isti način koji je opisan u Negrotto et al, Plant Cell Reports, 19 : 798 - 803. Svi sastojci podloga koje se koriste u ovom primeru su opisani u referenci Negrotto et al, navedenoj gore. Međutim, kao zamena se mogu koristiti različiti sastojci podloga, kao što je opisano u literaturi.
A. Transformacija plazmida i markeri za selekciju
Geni koji su korišćeni za transformaciju su klonirani u vektor koji je pogodan za transformaciju kukuruza. Vektori koji su korišćeni u ovom primeru sadrže gen za izomerazu fosfomanoze (PMI) koji se koristi za selekciju transgenih linija (Negrotto et al. (2000) Plant Cell Reports 19 : 798 - 803).
B. PripremaAgrobacterium tumefacines-' A
SojAgrobacterium- aLBA4404 (pSBl) koji sadrži plazmid za transformaciju biljaka je uzgajan na čvrstoj podlozi koja sadrži YEP (ekstrakt gljivica (5 g/l), pepton (10 g/l), NaCI
(5 g/l), agar (15 g/l), pH 6,8) tokom 2-4 dana na 28 °C. Oko 0.8*IO<9>Agrobacterium- a jesuspendovano u LS-inf podlozi sa dodatkom 100 uM As (Negrotto et al, (2000) Plant Cell Rep, 19 : 798 - 803). Bakterije su prethodno indukovane na ovoj podlozi tokom 30 - 60 minuta.
C. Inokulncija
Nezreli embrioni iz A 188 linije ili druge linije odgovarajućeg genotipa su ekscidirani iz 8 - 12 dana starih strukova i ostavljeni u tečnoj podlozi LS-inf sa dodatakom 100 uM As. Embrioni su jednom isprani svežom podlogom za infekciju. Zatim je dodat rastvorAgrobacterium- a,pa su embrioni mešani na vorteksu tokom 30 sekundi i ostavljeni su izloženi bakterijama tokom 5 minuta. Zatim su embrioni prebačeni sa štitom usmerenim ka gore u LSAs podlogu i kultivisani su u mraku tokom dva do tri dana. Nakon toga, između 20 i 25 embriona po petri šolji je prebačeno u LSDc podlogu sa dodatkom cefotaksima (250 mg/l) i srebro nitrata (1,6 mg/l) i kultivisano je u mraku na 28 °C tokom 10 dana.
D. Selekcija transformisanih ćelija i regeneracija transformisanih biljaka
Nezreli embrioni koji proizvode embriogeni kalus su prebačeni na LSD1M 0.5S podlogu. Kulture su selekcionisane na ovoj podlozi tokom 6 nedelja uz korak stvaranja potkulture tokom 3. nedelje. Preživeli kalusi su prebačeni na Regl podlogu sa dodatkom manoze. Nakon kultivacije na svetlosti (režim 16 časova svetlosti - 8 časova tame), zelena tkiva su prebačena na Reg2 podlogu bez regulatora rasta i inkubirana su tokom 1 - 2 nedelje. Biljke su prebačene u Magenta GA-7 kutije (Magenta Corp, Chicago, 1L) koje sadrže Reg3 podlogu i uzgajane su na svetlosti. Nakon 2-3 nedelje, biljke su ispitivane na prisustvo PMI gena i drugih gena od interesa pomoću PCR. Biljke koje su bile pozitivne tokom PCR testa su prebačene u staklenik.
Primer 12: Ispitivanje TI semena biljki kukuruza koje eksprimiraju a-amilazu koja je usmerena ka apoplastu ili ER
Dobijeno je TI seme iz samo-oprašenih biljaka kukuruza koje su transformisane ili sa pNOV6200 ili sa pNOV6201. kao stoje opisano u Primeru 4. Akumulacija škroba u ovim zrnima je bila normalna, što je utvrđeno na osnovu vizuelne inspekcije i na osnovu uobičajenog bojenja škroba rastvorom joda pre izlaganja visokoj temperaturi. Nezrela zrna su isečena. a prečišćeni endosperm je individualno postavljen u kivete za mikrocentrifugiranje i potopljen u 200 p.1 50 mM NaPOa pufera. Kivete su ostavljene u vodenom kupatilu na 85 °C tokom 20 minuta, a zatim su ohlađene na ledu. U svaku kivetu je dodato 20 ul 1% rastvora joda. nakon čega su kivete mešane. Oko 25% segregiranih zrna je bilo normalno obojeno na škrob. Ostalih 75% zrna se nije obojilo, što ukazuje daje škrob razgrađen do šećera male molekulske mase, koji se ne boje jodom. Otkriveno je da su TI zrna pNOV6200 i pNOV6201 samohidrolizovala škrob. Nije primećeno merljivo smanjenje sadržaja škroba nakon inkubacije na temperaturi od 37 °C.
Ekspresija amilaze je dalje ispitivana izolacijom hipertermofilne proteinske frakcije iz endosperma nakon PAGE/Coomassie bojenja. Primećena je traka segregiranih proteina odgovarajuće molekulske mase (50 kD). Ovi uzorci su podvrgnuti ispitivanju na a-amilazu korišćenjem komercijalno dostupne obojene amiloze (AMYLAZYME, Megazvme. Irska). Izraženi nivoi aktivnosti hipertermofilne amilaze koreliraju sa prisustvom proteina od 50 kD.
Dalje je otkriveno daje uvedeni enzim u zrnu većine transgenih biljaka kukuruza, koje eksprimiraju hipertermofilnu a-amilazu, usmerenu ka mailoplastu. dovoljno aktivan na ambijentalnoj temperaturi da hidrolizuje veći deo škroba, ukoliko se dozvoli da enzim bude u direktnom kontaktu sa granulom škroba. Od 80 linija koje eksprimiraju hipertermofilnu a-amilazu usmerenu ka amiloplastu, identifikovane su 4 linije koje akumuliraju škrob u zrnu. Tri od ovih linija su ispitivane na aktivnost termostabilne a-amilaze korišćenjem kolorimetrijskog Amylazyme testa (Megazyme). Test na amilazu je pokazao da ove tri linije poseduju niske nivoe aktivnosti termostabilne amilaze. Kada je prečišćeni škrob iz ove tri linije tretiran u odgovarajućim uslovima vlažnosti i toplote, škrob je hidrolizovan, što ukazuje na prisustvo oodgovarajućih nivoa aktivnosti a-amilaze koja pospešuje autohidrolizu škroba dobijenog iz ovih linija.
Dobijeno je TI seme iz višestrukih nezavisnih linija transformisanih sa pNOV6200 i pNOV6201. Pojedinačna zrna iz svake od linija je isečeno i prečišćeni endosperm je pojedinačno homogenizovan u 300 p.1 50 mM NaP04pufera. Jednake količine suspenzija endosperma su ispitivane na aktivnost a-amilaze na 85 °C. Otprilike 80% linija je bilo pozitivno na aktivnost hipertermofilnog enzima (videti Slike 1A, 1B i 2).
Zrna biljaka divljeg tipa ili biljaka koje su transformisane sa pNOV620I su zagrevane na 100 °C tokom 1, 2, 3 ili 6 časova, a zatim su obojena na škrob rastvorom joda. Detektovano je malo ili nimalo škroba u zrelim zrnima nakon 3 ili 6 časova, respektivno. Stoga, škrob u zrelim zrnima iz transgenog kukuruza koja eksprimiraju hipertermofilnu amilazu usmerenu ka endoplazmatskom retikulumu je hidrolizovan pri inkubaciji na visokoj temperaturi.
U drugom eksperimentu, delimično prečišćeni škrob iz zrelih TI zrna iz pNOV6201 biljaka, natapanje na 50 °C tokom 16 časova, a podlegao je hidrolizi nakon zagrevanja na 85 °C tokom 5 minuta. Ovo ilustruje da se a-amilaza usmerena ka ER vezuje za škrob nakon mlevenja zrna i da je sposobna da hidrolizuje škrob nakon zagrevanja. Jodno bojenje je pokazalo da škrob ostaje netaknut u zrelim zrnima nakon 16 časova natapanja na 50 °C.
U drugom eskperimentu, segregirana, zrela zrna iz biljka transformisanih sa pNOV6201 su zagrevana na 95 °C tokom 16 časova, a zatim su isušena. Kod semena koja eksprimiraju hipertermofilnu a-amilazu, hidroliza škroba do šećera je dovela do pojave naboranog izgleda zrna nakon sušenja.
Primer 13: Ispitivanje TI semena iz biljaka kukuruza koja eksprimiraju a-amilazu usmerenu ka amiloplastu
Dobijena su TI zrna iz samo-oprašenih biljaka kukuruza transformisanih sa pNOV4029 ili pNOV4031, kao što je opisano u Primeru 4. Nakupljanje škroba u zrnima ovih linija jasno nije bilo normalno. Sve segregirane linije, uz malo varijacije u intenzitetu, pokazale su fenotip sa malo ili nimalo škroba. Endosperm koji je prečišćen iz nezrelih zrna se samo slabo bojio jodom pre nego je izložen visokoj temperaturi. Nakon 20 minuta na 85 °C, bojenje je bilo potpuno negativno. Kada su stabljike osušene, zrna su se smežurala. Ova posebna amilaza je jasno imala dovoljnu aktivnost na temperaturi u stakleniku da hidrolizuje škrob, ukoliko joj je bio omogućen direktan kontakt sa granulom škroba.
Primer 14:Fermentacija zrna iz biljki kukuruza koje eksprimiraju a-amilazu
Vreme likvefakcije kod 100% transgenog zrna je različito pri 85 °C 1 pri 95 °C
Transgeni kukuruz (pNOV6201) koji sadrži termostabilnu a-amilazu se ponaša dobro pri fermentaciji bez dodavanja egzogene a-amilaze, zahteva mnogo kraće vreme za likvefakciju i rezultuje kompletnijom rastvorljivošću škroba. Fermentacije u laboratorijskom obimu su izvođene prema protokolu sa sledećim koracima (detaljno opisanim dole): I) mlevenje. 2) analiza vlažnosti, 3) pripremanje kaše koja sadrži kukuruz, vodu, suspenziju i u-amilazu. 4) likvefakcija i 5) simultana saharifikacija i fermentacija (SSF). U ovom primeru temperatura i vreme likvefakcije su menjani, kao što je dole opisano. Dodatno, transgeni kukuruz je natapan sa i bez egzogene a-amilaze, pa su poređene karakteristike proizvodnje etanoia sa kontrolnim kukuruzom tretiranim komercijalno dostupnom a-amilazom.
Transgeni kukuruz koji je korišćen u ovom primeru je dobijen prema postupcima opisanim u Primeru 4 korišćenjem vektora koji sadrži gen za a-amilazu i PMI marker za selekciju, konkretno, pNOV6201. Transgeni kukuruz je dobijen oprašivanjem komercijalnog hibrida (N3030BT) polenom transgene linije koja eksprimira visok nivo termostabilne a-amilaze. Kukuruz je isušen do sadržaja vlage od 1 1% i uskladišten je na sobnoj temperaturi. Sadržaj a-amilaze brašna transgenog kukuruza je bio 95 jedinica/g, pri čemu 1 jedinica enzima stvara 1 (.imol redukujućih krajeva po minuti iz kukuruznog brašna na 85 °C pri pFI vrednosti od 6,0 u MES puferu. Kontrolni kukuruz koji je korišćenje bio žutozubi kukuruz za koji se zna da poseduje dobre karakteristike pri proizvodnji etanoia. 1) Mlevenje: Transgeni kukuruz (1180 g) je mleven u Perten 3100 kompresionom mlinu koji je opremljen sa 2,0 mm ekranom, pri čemu je dobijeno brašno transgenog kukuruza. Kontrolni kukuruz je mleven u istom mlinu nakon detaljnog čišćenja, kako bi se sprečilo zagađenje transgenim kukuruzom. 2) Ispitivanje vlažnosti: Uzorci (20 g) transgenog i kontrolnog kukuruza su odmereni na aluminijumskim tasovima i zagrevani su na 100 °C tokom 4 časa. Uzorci su ponovo odmereni, pa je sadržaj valge izračunat na osnovu gubitka u masi. Sadržaj vlage transgenog brašna je 9,26%, a kontrolnog brašna je 12,54%. 3) Dobijanje suspenzija: Sastav suspenzija je tako dizajniran da se dobije kaša sa 36% čvrste supstance na početku SSF. Kontrolni uzorci su pripremljeni u plastičnim bocama od 100 ml i sadržali su 21,5 g brašna kontrolnog kukuruza, 23 ml dejonizovane vode, 6,0 ml suspenzije (8% (masenih) čvrstih supstanci) i 0,30 ml komercijalno dostupne a-amilaze razblažene sa vodom'u odnosu 1 : 50. Doza a-amilaze je izabrana kao reprezentativna doza pri industrijskoj upotrebi. Kada se ispitivanje vrši u uslovima opisanim gore, koji služe za ispitivanje transgene a-amilaze, doza kontrolne a-amilaze je 2 jedinice/g kukuruznog brašna.
Vrednost pH je podešena do 6,0 dodavanjem amonijum hidroksida. Transgeni uzorci su dobijeni na isti način, ali su sadržali 20 g kukuruznog brašna zbog manjeg sadržaja vlage u transgenom brašnu. Suspenzije transgenog brašna su pripremljene ili sa a-amilazom u istoj dozi kao kontrolni uzorci ili bez dodavanja egzogene a-amilaze. 4) Likvefakcija: Boce sa suspenzijama brašna transgenog kukuruza su potopljene u vodena kupatila na 85 °C ili na 95 °C tokom 5, 15, 30, 45 ili 60 minuta. Kontrolne suspenzije su inkubirane tokom 60 minuta na 85 °C. Tokom inkubacije pri visokoj temperaturi, suspenzije su energično mešane rukom svakih 5 minuta. Po okončanju koraka izlaganja visokoj temperaturi, suspenzije su ohlađene na ledu. 5) Simultana saharifikacija i fermentacija: Kaša dobijena likvefakcijom je pomešana sa glukoamilazom (0.65 ml u razblaženju 1:50 komercijalno dostupne L-400 glukoamilaze), sa proteinazom (0,60 ml 1000x razblaženja komercijalno dostupne proteaze) i sa 0.2 mg laktocida i uree (0,85 ml 10 x razblaženja 50% uree u tečnom stanju). Probušena je rupa na zatvaraču boce od 100 ml koja sadrži smešu u cilju otpuštanja CO2. Zatim je smeša inokulirana gljivicom (1,44 ml) i inkubirana u vodenom kupatilu podešenom na 90° F. Nakon 24 časa, temperatura fermentacije je smanjena na 86° F; nakon 48 časova, podešena je na 82°
F.
Gljivica koja je inokulirana je propagirana pripremanjem smeše koja sadrži gljivicu (0,12 g) sa 70 g maltodekstrina, 230 ml vode, 100 ml suspenzije, glukoamilazu (0.88 ml 10 * razblaženja komercijalno dostupne glukoamilaze), proteazu (176 ml 100 x razblaženja komercijalno dostupnog enzima), ureu (1,07 g), penicilin (0,67 mg) i cink sulfat (0,13 g). Propagacija kulture je inicirana dan pre nego je inkubirana uz mešanje na 90 °F.
Nakon 24, 48 i 72 časa uzorci su uzeti iz svakog suda za fermentaciju, filtrirani su kroz filtere od 0,2 um i ispitivani su pomoću HPLC na prisustvo etanoia i šećera. Uzorci uzeti nakon 72 časa su ispitivani na ukupnu količinu čvrstih supstanci i rezidualnog škroba.
HPLC analiza je izvođena korišćenjem sistema binarnog gradijenta opremljenog detektorom za refraktivni indeks, grejačem kolone i kolonom Bio-Rad Aminex HPX-87H. Sistem je kalibrisan sa 0,005 M H2SO4u vodi pri 1 ml/min. Temperatura kolone je 50 °C. Zapremina injekcionog uzorka je 5 p.1; eluiranje je izvedeno u istom rastvaraču. RI odgovor je kalibrisan injekcijom poznatih standarda. U svakoj injekciji su određivani i etanol i glukoza.
Rezidualni škrob je određivan na sledeći način. Uzorci i standardi su isušeni na 50 °C u pećnici, a zatim su samleveni u prah u mlinu. Prah (0,2 g) je izmeren u graduisanoj kiveti za r.entrifnairani<p>od 15 ml Prah ie isnran 3 nuta sa 10 ml vndenoo rastvora etannla("80% ( v/ v\\uz mešanje na vorteksu, a nakon toga je centrifugiran, a supernatant je odbačen. U sačmu je dodat DMSO (2.0 ml), a zatim je dodato 3.0 ml termostabilne a-amilaze (300 jedinica) u MOPS puferu. Nakon energičnog mešanja, kivete su inkubirane u vodenom kupatilu na 85 °C tokom 60 minuta. Tokom inkubacije, kivete su mešane 4 puta. Uzorci su ohlađeni, pa je dodato 4,0 ml natrijum acetatnog pufera (200 mM, pH 4,5), a zatim još 0.1 ml glukoamilaze (20 jedinica). Uzorci su inkubirani na 50 °C tokom 2 časa, mešani su. a zatim centrifugirani tokom 5 minuta na 3500 obrtaja/minuti. Supernatant je filtriran kroz filter od 0.2 um i ispitivan je na glukozu HPLC postupkom opisanim gore. Za uzorke sa malim nivoom rezidualnog škroba (<20% čvrste supstance) korišćene su injekcije zapremine 50 ul.
Rezultati: Transgeni kukuruz je pokazao dobre karakteristike pri fermentaciji bez dodatka a-amilaze. Prinos etanoia nakon 72 časa je bio praktično isti sa ili bez dodavanja egzogene a-amilaze, kao što je prikazano u Tabeli I. Pomenuti podaci pokazuju da se veći prinos etanoia postiže onda kada je temperatura likvefakcije viša; enzim prema predmetnom pronalasku koji je eksprimiran u transgenom kukuruzu poseduje aktivnost pri višim temperaturama u odnosu na druge enzime koji se komercijalno koriste, kao što je a-amilaza
Bacillus liquefaciens-&.
Kada se menja vreme likvefakcije, otkriveno je da je vreme likvefakcije koje je neophodno za efikasno dobijanje etanoia mnogo manje od jednog časa pri izvođenju konvencionalnog postupka. Slika 3 prikazuje daje prinos etanoia nakon 72 časa fermentacije skoro nepromenjen pri trajanju likvefakcije od 15 do 60 minuta. Dodatno, likvefakcija na 95 °C daje više etanoia u svakom vremenskom trenutku u odnosu na likvefakciju pri 85 °C. Ovo zapažanje pokazuje da se postupak poboljšava korišćenjem hipertermofilnog enzima.
Kontrolni kukuruz daje veći konačni prinos etanoia u odnosu na transgeni kukuruz, ali je kontrolni kukuruz izabran zato što poseduje vrlo dobre karakteristike pri fermentaciji. Nasuprot tome, transgeni kukuruz poseduje genetsku pozadinu izabranu kako bi pospešila transformacija. Trebalo bi da se ova razlika eliminiše uvođenjem a-amilaze u elitni soj kukuruza korišćenjemdobro poznatih tehnika.
Ispitivanje nivoa rezidualnog škroba u pivu proizvedenom nakon 72 časa (Slika 4) pokazuje da korišćenje transgene a-amilaze dovodi do značajnog poboljšanja pri dobijanju škroba koji je dostupan fermentaciji; nakon fermentacije je ostalo mnogo manje škroba. 1 za nivo etanoia i za nivo rezidualnog škroba optimalno vreme likvefakcije je 15 minuta na 95 °C i 30 minuta na 85 °C. Prema eksperimentima predmetnog pronalaska, ova vremena predstavljaju ukupno vreme tokom koga su sudovi za fermentaciju bili u vodenom kupatilu, tako da obuhvataju i period tokom koga se temperatura uzorka povećavala od sobne temperature do 85 °C ili 95 °C. Kraća vremena likvefakcije mogu biti optimalna pri industrijskoj proizvodnji na veliko, pri kojoj se kaša brzo zagreva korišćenjem opreme , kao što su mlazna kuvala. Konvencionalni industrijski procesi likvefakcije zahtevaju korišćenje rezervoara kako bi se omogućilo da kaša bude inkubirana na visokoj temperaturi tokom jednog ili više sati. Predmetni pronalazak eliminiše potrebu za takvim rezervoarima za držanje i povećava produktivnost opreme za likvefakciju.
Jedna važna funkcija a-amilaze u procesu fermentacije jeste ta što smanjuje viskoznost kaše. U svim vremenskim trenucima, uzorci koji sadrže brašno transgenog kukuruza su značajno manje viskozni od kontrolnog uzorka. Dodatno, transgeni uzorci izgleda ne prolaze kroz gelatinoznu fazu koja se primećuje u svim kontrolnim uzorcima: gelatinizacija se normalno javlja kada se suspenzije kukuruza kuvaju. Stoga, posedovanje a-amilaze koja je raspoređena svuda u fragmentima endosperma omogućava ispoljavanje prestižnih fizičkih karakteristika kaše tokom kuvanja, tako što sprečava stvaranje velikih gelova koji usporavaju difuziju i povećavaju energetske troškove pri mešanju i pumpanju kaše.
Visoka doza a-amilaze u transgenom kukuruzu takođe doprinosi ispoljavanju poželjnih svojstava transgene kaše. Na 85 °C aktivnost a-amilaze transgenog kukuruza je mnogostruko veća od aktivnosti doze egzogene a-amilaze korišcene u kontrolama. Egzogena a-amilaza je uzeta kao predstavnik brzina pri komercijalnoj upotrebi.
Primer 15: Efikasna funkcija transgenog kukuruza u uslovima kada se meša sa kontrolnim kukuruzom
Brašno transgenog kukuruza je mešano sa brašnom kontrolnog kukuruza u različitim odnosima koji se kreću od 5% do 100% brašna transgenog kukuruza. Dobijeni uzorci su tretirani kao što je opisano u Primeru 14. Smeša koja sadrži transgeno eksprimiranu a-amilazu je podvrgnuta likvefakciji na 85 °C tokom 30 minuta ili na 95 °C tokom 15 minuta; kontrolne kaše su dobijene kao što je opisano u Primeru 14 i podvrgnute su likvefakciji na 85 °C tokom 60 minuta (svaka posebno) ili na 95 °C tokom 15 ili 60 minuta (svaka posebno).
Podaci za nivo etanoia nakon 48 časova i nakon 72 časa i za nivoe rezidualnog škroba su dati u Tabeli 2. Nivoi etanoia nakon 48 časova su grafički prikazani na Slici 5; podaci dobijeni određivanjem rezidualnog škroba su prikazani na Slici 6. Pomenuti podaci pokazuju da transgeno eksprimirana termostabilna a-amilaza pokazuje vrlo dobre karakteristike pri dobijanju etanoia, čak i onda kada transgeno zrno predstavlja samo mali deo (čak samo oko 5%) ukupnog zrna u kaši. Podaci takođe pokazuju da je nivo rezidualnog škroba izraženo manji nego u kontrolnoj kaši, kada transgeno zrno predstavlja najmanje 40% ukupnog zrna.
Primer 16: Proizvodnja etanoia kao funkcija pH vrednosti tokom likvefakcije pri korišćenju transgenog kukuruza pri njegovom sadržaju od 1,5% do 12% u odnosu na ukupni kukuruz
Usled toga što transgeni kukuruz pokazuje dobre karakteristike kada se koristi u količini od 5 - 10% od ukupnog kukuruza pri fermentaciji, izvedena je dodatna serija ispitivanja fermentacije u kojoj je transgeni kukuruz sačinjavao od 1,5% do 12% ukupnog kukuruza. Vrednost pH je varirala od 6,4 do 5,2, a a-amilaza eksprimirana u transgenom kukuruzu je optimizovana za aktivnost pri pH nižoj od one koja se konvencionalno koristi u industrijskoj proizvodnji.
Eksperimenti su izvedeni kao što je opisano u Primeru 15 uz sledeće izuzetke:
1) Transgeno brašno je mešano sa kontrolnim brašnom u odnosu od 1,5% do 12.0% ukupne suve mase. 2) Kontrolni kukuruz je N3030BT, koji je sličniji sa transgenim kukuruzom nego sa kontrolom korišćenoj u Primerima 14 i 15.
3) U uzorke koji sadrže transgeno brašno nije dodavana egzogena a-amilaza.
4) Pre likvefakcije, uzorci su prilagođeni na vrednosti pH od 5,2, 5,6, 6,0 ili 6,4. Najmanje 5 uzoraka sa sadržajem transgenog kukuruza od 0%o do 12% je pripremljeno za svaku pH vrednost.
5) Likvefakcije za sve uzorke su izvođene na 85 °C tokom 60 minuta.
Promena u sadržaju etanoia kao funkcija vremena fermentacije je prikazana na Slici 7. Slika pokazuje podatke dobijene iz uzoraka koji sadrže 3% transgenog kukuruza. Pri nižoj pH vrednosti, fermentacija napreduje brže od fermentacije pri pH 6,0 ili višoj: slično ponašanje je primećeno u uzorcima sa drugim dozama transgenog zrna. Profd pH vrednosti aktivnosti transgenog enzima u kobinaciji sa visokim nivoima ekspresije omogućava likvefakciju pri nižoj pH vrednosti, što vodi bržoj fermentaciji, a tako i većem obrtu, nego što je moguće tokom konvencionalnog procesa pri pH 6.
Prinosi etanoia nakon 72 časa su prikazani na Slici 8. Kao što može da se vidi na osnovu prinosa etanoia, rezultati pokazuju malu zavisnost od količine transgenog zrna u uzorku. Stoga, zrno sadrži veliki nivo amilaze u cilju pospešivanja proizvodnje etanoia fermentacijom. Takođe je pokazano da likvefakcija pri nižoj pH vrednosti dovodi do većeg prinosa etanoia.
Posmatrana je viskoznost uzorka nakon likvefakcije i primećeno je da je pri pH vrednosti od 6,0 dovoljno 6% transgenog zrna za adekvatno smanjenje viskoznosti. Pri pH vrednosti od 5,2 i 5,6, viskoznost je ista kao kod kontrole pri 12% transgenog zrna, ali ne i pri manjim procentima transgenog zrna.
Primer 17: Proizvodnja fruktozc iz brašna kukuruza korišćenjem termotllnih enzima
Kukuruz koji eksprimira hipertermofilnu a-amilazu 797GL3 dokazano pospešuje proizvodnju fruktoze kada se pomeša sa a-glukozidazom (MalA) i izomerazom ksiloze (XylA).
Seme iz pNOV6201 transgenih biljaka koje eksprimiraju 797GL3 je samleveno do brašna u Kleco mlinu, čime je dobijeno amilazno brašno. Zrna netransgenog kukuruza su na isti način samlevena, čime je dobijeno kontrolno brašno.
a-Glukozidaza MalA (izS. solfataricus)je eksprimirana uE. coli.Prikupljene bakterije su suspendovane u 50 mM kalijum fosfatnom puferu pH 7.0, koji sadrži 1 mM 4-(2-aminoetiljbenzensulfonil fluorid, a zatim su lizirane u Francuskoj ćeliji pod pritiskom. Lizat je centrifugiran pri 23000 x g tokom 15 minuta na 4 °C. Uklonjen je rastvor supernatanta. zagrevan je na 70 °C tokom 10 minuta, ohlađen na ledu tokom 10 minuta, a zatim centrifugiran pri 34000 x g tokom 30 minuta na 4 °C. Rastvor supernatanta je uklonjen, a MalA je dvostruko koncentrovan u Centricon 10 uređaju. Dobijeni filtrat je iskorišćen kao negativna kontrola za MalA.
Izomeraza ksiloze (glukoze) je dobijena ekspresijom xylA gena izT. neapolitanauE. coli.Bakterije su suspendovane u 100 mM natrij um fosfatnom puferu pH 7.0 i lizirane propuštanjem pod pritiskom kroz Francusku ćeliju. Nakon taloženja ćelijskih ostataka, ekstrakt je zagrevan na 80 °C tokom 10 minuta, a zatim je centrifugiran. Rastvor supernatanta pokazuje enzimsku aktivnost XylA. Ekstrakt kontrole sa praznim vektorom je pripremljen uporedo sa esktraktom XylA.
Kukuruzno brašno (60 mg po uzorku) je pomešano sa puferom i ekstraktimaE. coli.Kao što je naznačeno u Tabeli 3, uzorci sadrže amilazno kukuruzno brašno (amilazu) ili kontrolno kukuruzno brašno (kontrolu), 50 uj MalA ekstrakta (+) ili filtrata (-) i 20 ttl XylA ekstrakta (+) ili kontrole sa praznim vektorom (-). Svi uzorci takođe sadrže 230 ul 50 mM MOPS, 10 mM MgSC»4 i 1 mM CoCb; pH vrednost pufera je 7,0 na sobnoj temp.
Uzorci su inkubirani na 85 °C tokom 18 časova. Na kraju inkubacionog perioda, uzorci su razblaženi sa 0,9 ml vode na 85 °C i centrifugirani su kako bi se uklonio nerastvorni materijal. Supernatant je zatim filtriran kroz Centricon 3 uređaj za uitrafiltraciju i ispitan je pomoću HPLC ili ELSD.
Sistem sa gradijentom za HPLC je opremljen sa Atec Polvmer Amino kolonom, veličine čestica 5 (.im. 250 x 4,6 mm i Alltech ELSD 2000 detektorom. Sistem je prethodno kalibrisan smešom vode i acetonitrila u odnosu 15 : 85. Brzina protoka je I ml/min. Početni uslovi su održavani tokom 5 minuta nakon injektiranja, a zatim je održavan gradijent voda : acetonitril 50 : 50 tokom 20 minuta, posle čega je korišćen isti rastvarač tokom 10 minuta. Sistem je ispiran tokom 20 minuta smešom voda : acetonitril 80 : 20, a zatim je ponovo ekvilibrisan početnim rastvaračem. Fruktoza je eluirana na 5,8 minuta, a glukoza na 8,7 minuta.
Rezultati HPLC takođe pokazuju prisustvo većih malto-oligosaharida u svim uzorcima koji sadrže a-amilazu. Ovi rezultati pokazuju da tri termofilna enzima mogu zajedno da funkcionišu kako bi se dobila fruktoza iz kukuruznog brašna pri viškoj temperaturi.
Primer 18: Amilazno brašno sa izomerazom
U drugom primeru, amilazno brašno je mešano sa prečišćenim MalA i sa dve bakterijske izomeraze ksiloze: XylA poreklom izT. maritimai sa enzimom koji je označena kao BD8037 poreklom izDiversa.Amilazno brašno je dobijeno kao što je opisano u Primeru 18.
MalA izS. solfataricussa 611 i s oznakom za prečišćavanje je eksprimiran uE. coli.Ćelijski lizat je dobijen kao što je opisano u Pirmeru 18, a zatim je prečišćen do očigledne homogenosti korišćenjem smole sa afinitetom za nikl (Probond Invitrogen) prema uputstvu proizvođača za prečišćavanje nativnog proteina.
XylA izT. maritimasa dodatkom S oznake i sa signalom za zadržavanje u ER je eksprimiranu E. colii dobijen na isti način kao i XylA poreklom izT. neapolitana.kao što je opisano u Primeru 1 8.
Izomeraza ksiloze BD8037 je dobijena kao liofilizovani prah i resuspendovana u zapremini od 0,4 x od originalne zapremine vode.
Amilazno kukuruzno brašno je mešano sa rastvorima enzima uz dodatak vode ili pufera. Sve reakcone smeše sadrže po 60 mg amilaznog brašna i ukupno 600 ?) tečnosti. Jedna serija reakcionih smeša je puferovana sa 50 mM MOPS, pEI 7,0, na sobnoj temperaturi, uz dodatak 10 mM MgSOai 1 mM CoCL; u drugoj seriji reakcionih smeša rastvor pufera koji sadrži metal je zamenjen vodom. Količine izomeraza variraju kao što je navedeno u Tabeli 4. Sve reakcione smeše su inkubirane tokom 2 časa na 90 °C. Centrifugiranjem su dobijeni suprenatanti reakcionih smeša. Sačma je isprana sa dodatnih 600 ul vode i ponovo je centrifugirana. Supernatanti iz svih reakcionih smeša su pomešani, filtrirani kroz Centricon 10 filter i analizirani su korišćenjem HPLC sa ELSD detektovanjem, kao što je opisano u Primeru 17. Količine glukoze i fruktoze koje su zabeležene grafički su predstavljene na Slici 15.
Korišćenjem svake od navedenih izomeraza, dobijana je fruktoza na dozno zavisan način onda kada su u reakcionoj smeši prisutni a-amilaza i a-glukozidaza. Navedeni rezultati pokazuju da zrno koje eksprimira amilazu 797GL3 može da funkcioniše sa MalA i sa mnoštvom različitih termofilnih izomeraza. sa ili bez dodatka metalnih jona. kako bi se dobila fruktoza iz kukuruznog brašna pri povišenoj temperaturi. U prisustvu dodatih dvovalentnih metalnih jona. izomeraza može da obezbedi predviđenu fruktozu: pri ekvilibrijumu sa glukozom se na 90 °C se dobija otprilike 55% fruktoze. Ovo predstavlja poboljšanje u odnosu na postojeći postupak dobijanja korišćenjem mezofilnih izomeraza, koji zahteva hromatografsko razdvajanje kako bi se povećala koncentracija fruktoze.
Primer 19: Ekspresija pululanaze u kukuruzu
Transgene biljke koje su homozigoti ili za pNOV7013 ili za pNOV7005 su ukrštene kako bi se dobilo seme transgenog kukuruza koje eksprimira i 797GL3 a-amilazu i 6GP3 pululanazu.
Dobijena su TI ili T2 semena iz samo-oprašenih biljaka kukuruza transfomisanih ili sa pNOV7005 ili sa pNOV4093. pNOV4093 je fuzioni protein kodiran sintetskim genom za 6GP3 optimizovanim za kukuruz (sekvenca čiji je ID broj 3 i 4), koji sadrži sekvencu za usmeravanje ka amiloplastu (sekvenca čiji je ID broj 7 i 8), čime je obezbeđena lokalizacija fuzionog proteina u amiloplastu. Fuzioni protein se nalazi pod kontrolom promotera ADPgpp (sekvenca čiji je ID broj 1 1) za specifičnu eksprsiju u endospermu. pNOV7005 konstrukt je odgovoran za ekspresiju pululanaze u ER endosperma. Lokalizacija ovog enzima u ER dozvoljava normalno nakupljanje škroba u zrnima. Takođe, neposredno pre izlaganja visokoj temperaturi je primećeno normalno bojenje na škrob sa rastvorom joda.
Kao što je opisano u slučaju a.- amilaze, ekspresija pululanaze koja je usmerena ka amiloplastu (pNOV4093) je rezultovala abnormalnim nakupljanjem škroba u zrnima. Kada su stabljike kukuruza osušene, zrna su se smežurala. Očigledno, ova termofilna pululanaza poseduje dovoljnu aktivnost pri niskim temperaturama i hidrolizuje škrob, ako joj se dopusti da bude u direktnom kontaktu sa granulama škroba u endospermu semena.
Pobijanje enzima ili ekstrakcija enzima iz kukuruznog brašna
Pululanaza je ekstrahovana iz transgenog semena prvo mlevenjem u Kleco mlinu, nakon čega je brašno inkubirano u 50 mM NaAOc puferu, pH 5,5 tokom 1 časa na sobnoj temperaturi, uz konstantno mešanje. Inkubaciona smeša je zatim centrifugirana rokom 15 minuta na 14000 obrtaja/min. Dobijeni supernatant je korišćen kao izvor enzima.
Ispitivanje pululanaze
Reakcija ispitivanja je izvedena na ploči od 96 polja. Enzim koji je ekstrahovan iz kukuruznog brašna (100 ul) je razblažen 10 x sa 900 u. I 50 mM NaOAc puferom, pH 5,5. koji sadrži 40 mM CaCL. Smeša je mešana na vorteksu, u svaku reakcionu smešu je dodata po 1 tableta Limit-Dextrizyme (azurin-ukršteno povezani-pululan, proizvođač Megazyme), pa je sve inkubirano na 75 °C tokom 30 minuta (ili kao što je pomenuto ranije). Na kraju inkubacionog perioda, reakcione smeše su centrifugirane na 3500 obrtaja/minuti tokom 15 minuta. Supernatanti su razblaženi 5 x i prebačeni na ploču od 96 polja sa ravnim dnom radi merenja apsorbancije na 590 nm. Hidroliza azurin-ukršteno povezanog-pululana kao supstrata korišćenjem pululanaze stvara u vodi rastvorljive obojene fragmente, a brzina njihovog otpuštanja (određeno na osnovu povećanja apsorbancije na 590 nm) je direktno zavisna od aktivnosti enzima.
Slika 9 prikazuje analizu T2 semena transformisanog sa pNOV7005 u različitim situacijama. Primetno je da je ekspresija aktivnosti pululanaze visoka u poređenju sa netransgenom kontrolom u brojnim situacijama.
U odmerenu količinu (približno 100 ttg) suvog kukuruznog brašna od transgenog kukuruza (koji eksprimira pululanazu, ili amilazu, ili oba enzima) i od kontrolnog (netransgenog) brašna je dodato 1000 u I 50 mM NaOAc pufera, pH 5,5, koji sadrži 40 mM CaCE. Reakcione smeše su mešane na vorteksu i inkubirane na šejkeru tokom 1 časa. Enzimska reakcija je počela prebacivanjem inkubacionih smeša na visoku temperaturu (75 °C, optimalna reakciona temperatura za pululanazu ili kao što je navedeno u slikama) tokom vremena koje je naznačeno na slikama. Reakcije su zasutavljene hlađenjem . na ledu. Reakcione smeše su zatim centrifugirane tokom 10 minuta na 14000 obrtaja/minuti. Jednake količine (100 u.1) supernatanta su razblažene 3*, filtrirane kroz 0,2 Mm filter radi HPLC analize.
Uzorci su analizirani korišćenjem HPLC u sledećim uslovima:
Kolona: Alltech Prevail Carbohvdrate ES 5 (.im 250 x 4.6
Detektor: Alltech ELSD 2000
Pumpa: Gilson 322
Injektor: Gilson 215 injektor/razblaživač
Rastvarači: Acetonitril za HPLC (Fisher Scientific) i voda (prečišćena VVaters Millipore sistemom).
Gradijent koji se koristi za oligosaharide malog stepena polimerizacije (DP 1-15).
Gradijent koji se koristi za saharide visokog stepena polimerizacije (DP 20 - 100 i iznad).
Sistem koji se koristi za analizu podataka: Gilson Unipoint Softvvare Svstem verzija 3.2.
Slike 10A i 10B prikazuju HPLC analizu hidrolitičkih proizvoda dobijenih korišćenjem eksprimirane pululanaze iz škroba u brašnu transgenog kukuruza. Inkubacija brašna sa eksprimiranom pululanazom u reakcionom puferu na 75 °C tokom 30 minuta rezultuje proizvodnjom oligosaharida srednje dužine lanca (DP približno 10 - 30) i amiloze kratkog lanca (DP približno 100 - 200) iz kukuruznog brašna. Ova slika takođe prikazuje zavisnost aktivnosti pululanaze od prisustva jona kalcijuma.
Transgeni kukuruz koji eksprimira pululanazu može da se koristi za dobijanje modifikovanog skroba/dekstrina koji nije razgranat (raskinute a 1-6 veze) i koji zato poseduje visok nivo amiloze / pravolančanog dekstrina. Takođe. u zavisnosti od vrste škroba koji se koristi (npr. waxy, škrob sa visokim sadržajem amiloze itd.) varira distribucija dužine lanca amiloze/dekstrina dobijenog dejstvom pululanaze. a takođe variraju i svojstva modifikovanog skroba/dekstrina.
Hidroliza al-6 veze je takođe dokazana korišćenjem pululana kao supstrata. Pululanaza koja je izolovana iz kukuruznog brašna efikasno hidrolizuje pululan. HPLC analiza (kao što je opisana) proizvoda dobijenih na kraju inkubacije pokazuje proizvodnju maltotrioze, kao što je očekivano, usled hidrolize al-6 veza u molekulu pululana dejstvom enzima iz kukuruza.
Primer 20: Ekspresija pululanaze u kukuruzu
Ekspresija 6GP3 pululanaze je dalje analizirana postupkom koji se sastoji iz ekstrakcije iz kukuruznog brašna, a zatim bojenja sa PAGE i COOmassie. Kukuruzno brašno je dobijeno mlevenjem semena tokom 30 sekundi u Kleco mlinu. Enzim je ekstrahovan iz oko 150 mg brašna sa 1 ml 50 mM NaOAc puferom, pH 5,5. Smeša je mešana na vorteksu i inkubirana na šejkeru na sobnoj temperaturi tokom 1 časa, a zatim još tokom 1 5 minuta na 70 °C. Smeša je zatim centrifugirana (14000 obrtaja/min na sobnoj temp.), a supernatant je korišćen u SDS-PAGE analizi. Primećena je proteinska traka odgovarajuće molekulske mase (95 kDa). Ovi uzorci su podvrgnuti ispitivanju na pululanazu korišćenjem komercijalno dostupnih graničnih dekstrina konjugovanih sa bojom (LIMIT-DEXTRIZYME, Megazyme, Irska). Visoki nivoi aktivnosti termofilne pululanaze koreliraju sa prisustvom proteina od 95 kDa.
VVestern blot i ELISA analize transgenog semena kukuruza su takođe pokazale ekspresiju proteina od približno 95 kDa, koji reaguje sa antitelom specifičnim za pululanazu (eksprimiranu uE. coli).
Primer 21: Povećanje brzine hidrolize škroba i poboljšanje prinosa (fermentabilnih) oligosaharida kratkog lanca dodavanjem pululanaze eksprimirane u kukuruzu
Podaci prikazani na Slikama 11A i 11B su dobijeni korišćenjem HPLC analize proizvoda hidrolize škroba iz dve reakcione smeše, kao što je opisano gore. Prva reakciona smeša označena kao "Amilaza" sadrži smešu [1 : I (\v/\v)] uzoraka kukuruznog brašna transgenog kukuruza koji eksprimira a-amilazu dobijenog prema postupku opisanom u Primeru 14, na primer, i brašna netransgenog kukuruza A188; a druga reakciona smeša označena kao "Amilaza + pululanaza" sadrži smešu [1 : 1 (vvAv)] uzoraka kukuruznog brašna transgenog kukuruza koji eksprimira a-amilazu i brašna transgenog kukuruza koji eksprimira pululanazu, koje je dobijeno prema postupku opisanom u Primeru 19. Dobijeni rezultati potvrđuju korist od korišćenja pululanaze u kombinaciji sa a-amilazom tokom hidrolize škroba. Korist se odnosi na povećanu brzinu hidrolize škroba (Slika 11 A) i povećan prinos fermentabilnih oligosaharida sa malim stepenom polimerizacije (Slika 1 1B).
Otkriveno je da sama a-amilaza ili a-amilaza i pululanaza (ili bilo koja kombinacija enzima za hidrolizu škroba) koje su eksprimirane u kukuruzu može da se koristi za dobijanje maltodekstrina (pravolančanih ili razgranatih oligosaharida) (Slika 11A, 11B, 12 i 13A). U zavisnosti od uslova reakcije, tipa hidrolitičkih enzima i njihovih kombinacija, kao i od tipa škroba koji se koristi, varira sastav dobijenih maltodekstrina. a stoga i njihova svojstva.
Slika 12 opisuje rezultate eksperimenta izvedenog na sličan nalin kao što je opisano na Slici 1 1. Različita temperatura i vremenske šeme koje se slede nakon inkubacije reakcionih smeša su naznačene na Slici 12. Optimalna reakciona temp. za pululanazu je 75 °C. a za a-amilazu je veća od 95 °C. Stoga, slede se naznačene šeme kako bi se omogućilo katalitičko dejstvo pululanaze i/ili a-amilaze na njihovim optimalnim reakcionim temperaturama. Na osnovu prikazanih rezultata se jasno može zaključiti da kombinacija pululanaze a-amilaze i pululanaze poseduje bolja svojstva pri hidrolizi kukuruznog škroba na kraju inkubacionog perioda od 60 minuta.
Na Slikama 13A i 13B su prikazani rezultati HPLC analize (opisane gore, sa izuzetkom što je u ovim reakcijama korišćeno približno 150 mg kukuruznog brašna) proizvoda hidrolize škroba iz dve serije reakcionih smeša na kraju inkubacije od 30 minuta. Prva serija reakcionih smeša je inkubirana na 85 °C, a druga na 95 °C. U svakoj seriji postoje dve reakcione smeše; prva reakciona smeša označena kao "Amilaza x pululanaza" sadrži brašno transgenog kukuruza (dobijeno ukrštenim oprašivanjem) koji eksprimira i a-amilazu i pululanazu, a druga reakciona smeša označena kao "Amilaza" sadrži smešu uzoraka kukuruznog brašna koje eksprimira a-amilazu i brašna netransgenog kukuruza A188 u odnosu tako podešenom da se dobije ista količina aktivnosti a-amilaze koja je primećena kod hibrida dobijenog ukrštanjem ("Amilaza * pululanaza"). Ukupan prinos oligosaharida male DPje bio veći u slučaju hibrida sa a-amilazom i pululanazom u poređenju sa kukuruzom koji eksprimira samo a-amilazu, pri inkubaciji uzoraka kukuruznog brašna na 85 °C. Inkubaciona temp. od 95 °C inaktivira (barem delimično) pululanazu, pa se zato primećuje mala razlika između smeša "Amilaza x pululanaza" i "Amilaza". Međutim, podaci dobijeni inkubacijom na obe navedene temp. pokazuju značajno poboljšanje u količini dobijene glukoze (Slika 13B) na kraju inkubacionog perioda, kada se koristi kukuruzno brašno hibrida koji eksprimira i a-amilazu i pululanazu u poređenju sa kukurznim brašnom koje eksprimira samo a-amilazu. Stoga, korišćenje kukuruza koji eksprimira i a-amilazu i pululanazu može biti od posebne koristi u postupku kada je važna kompletna hidroliza škroba do glukoze.
Gore navedeni primeri predstavljaju obimnu potvrdu tvrdnji da ekspresija pululanaze u semenu kukuruza, onda kada se koristi u kombinaciji sa a-amilazom. poboljšava hidrolizu. Aktivnost pululanaze, koja je specifična za a 1-6 veze. raskida veze grananja škroba mnogo efikasnije od a-amilaze (enzim specifičan za al-4 veze), čime se smanjuje količina razgranatih oligosaharida (npr. graničnog dekstrina, panoze, koji obično nisu fermentabilni) i čime se povećava količina pravolančanih oligosaharida kratkog lanca (koji se lako fermentiraju do etanoia itd.). Drugo, fragmentacija molekula škroba dejstvom pululanaze povećava dostupnost supstrata za a-amilazu, pa je tako povećana efikasnost katalize a-amilazom.
Primer 22
Da bi se odredilo da li 797GL3 a-amilaza i malA a-glukozidaza mogu da funkcionišu pod sličnim vrednostima pH i temperature kako bi se dobila povećana količina glukoze u odnosu na količinu koja se dobija korišćenjem bilo kog od ovih enzima ponaosob, u rastvor koji sadrži 1% škrob i prečišćeni škrob ili iz semena netransgenog kukuruza (kontrola) ili iz semena transgenog kukuruza (u semenu 797GL3 kukuruza a-amilaza se prečišćava zajedno sa škrobom) dodaje se oko 0,35 ug malA a-glukozidaze (proizvedenog od strane bakterija). Dodatno, prečišćeni škrob iz semena netransgenog i transgenog 797GL3 kukuruza je dodat 1% škrobu kukuruza u odsustvu bilo koje malA glukozidaze. Smeše su inkubirane na 90 °C. pH 6,0, tokom 1 časa. centrifugirane su kako bi se uklonio nerastvorni materijal, a rastvorna frakcija je analizirana na prisustvo glukoze korišćenjem HPLC. Kao što je prikazano na Slici 14, 797GL3 a-amilaza i malA a-glukozidaza funkcionišu pri sličnoj pH vrednosti i teperaturi pri razlaganju škroba do glukoze. Dobijena količina glukoze je značajno veća od količine koja se dobija dejstvom bilo kog od ovih enzima ponaosob.
Primer 23
Određivana je korisnost glukoamilazeThermoanaerobacterium- apri hidrolizi sirovog škroba. Kao što je navedeno u Primeru 15, hidrolitičko prevođenje škroba je ispitivano sa vodom, a-amilazom ječma (komercijalni preparat koji proizvodi Sigma), glukoamilazomThermoanaerobacterium- ai sa njihovim kombinacijama pri sobnoj temperaturi i na 30 °C. Kao što je prikazano, kombinacija a-amilaze ječma i glukoamilazeThermoanaerobacterium- aje sposobna da hidrolizuje sirovi škrob do glukoze. Štaviše, količina dobijene glukoze korišćenjem amilaze ječma i glukoamilazeThermoanaerobacterium- aje značajno veća od količine koja se dobija dejstvom bilo kog od ovih enzima ponaosob.
Primer 24: Geni i sekvence optimizovane za kukuruz za hidrolizu sirovog škroba i vektori za transformaciju biljke
Enzimi su izabrani na osnovu njihove sposobnosti da hidrolizuju sirovi škrob na temperaturama koje se kreću od oko 20 °C do oko 50 °C. Zatim su dizajnirani odgovarajući geni ili genski fragmenti korišćenjem kodona specifičnih za kukuruz, čime su dobijeni sintetski geni, kao što je opisano u Primeru 1.
Izabran je fuzioni peptid a-amilazeAspergilhis shirousamii glukoamilaze (bez signalne sekvence) i njegova sekvenca ima ID broj 45, kao što je navedeno u Bioci. Biotech. Biochem, 56 : 884 - 889 (1992); Agric. Biol. Chem. 545 : 1905 - 14 (1990); Biosci. Biotechnol. Biochem, 56 : 174 - 79 (1992). Za kukuruz optimizovana nukleinska kiselina je dizajnirana i predstavljena kao sekvenca čiji je ID broj 46.
Slično tome, izabrana je glukoamilazaThermoanaerobacteriuin thermo. saccharolyticum- a,koja poseduje sekvencu čiji je ID broj 47, kao stoje objavljeno u Biosci. Biotech. Biochem., 62 : 302 - 308 (1998). Dizajnirana je za kukuruz optimizovana nukleinska kiselina (sekvenca čiji je ID broj 48).
Izabrana je glukoamilazaRhizopu. s orvzae,koja poseduje aminokiselinsku sekvencu čiji je ID broj 50 (bez signalne sekvence), kao što je objavljeno u literaturi (Agric. Biol. Chem. (1986) 50, str. 957 - 964). Dizajnirana je za kukuruz optimizovana nukleinska kiselina, čija sekvenca poseduje ID broj 5 1.
Dalje, izabrana je a-amilaza kukuruza, čija aminokiselinska sekvenca ima ID broj 51. a sekvenca nukleinske kiseline ima ID broj 52, što je navedeno u literaturi. Videti. na primer. Plant Phvsiol.. 105 : 759 - 760 (1994).
Ekspresione kasete su konstruisane tako da eksprimiraju: fuzioni polipeptid a-amilazeAspergilhis . shirousamii glukoamilaze koji je kodiran nukleinskom kiselinom optimizovanom za kukuruz, koja je označena kao sekvenca čiji je ID broj 46; glukoamilazuThermoanaerobacterium thermosaccharolyticum- a,kodiranu nukleinskom kiselinom čija sekvenca ima ID broj 48; glukoamilazuRhizopus orvzae,čija aminokiselinska sekvenca (bez signalne sekvence) ima ID broj 49 i koja je kodirana nukleinskom kiselinom optimizovanom za kukuruz, čija sekvenca ima ID broj 50; i a-amilazu kukuruza.
Plazmid koji sadrži N-terminalnu signalnu sekvencu y-zeina kukuruza (MRVLLVALALLALAASATS) (sekvenca čiji je broj 17) je fuzionisan sa sintetskim genom koji kodira enzim. Opciono, sekvenca SEKDEL je fuzionisana sa C-terminalom sintetskog gena radi usmeravanja i zadržavanja polipeptida u ER. Fuzioni protein je kloniran iza promotera y-zeina kukuruza u plazmidu koji se koristi za transformaciju biljke radi specifične ekspresije u endospermu. Fuzioni polipeptid je transficiran u tkivo kukuruza korišćenjem
Agrobacterium- a.
Primer 25
Konstruisane su ekspresione kasete koje sadrže izabrane enzime. Plazmid koji sadrži sekvencu za vezujuće mesto za sirovi škrob je fuzionisan sa sintetskim genom koji kodira enzim. Vezujuće mesto za sirovi škrob omogućava fuzionom enzimu da se veže za negelatinizovani škrob. Aminokiselinska sekvenca vezujućeg mesta za sirovi škrob (sekvenca čiji je ID broj 53) je određena na osnovu podataka iz literature, a nukleinska sekvenca optimizovana za kukuruz je predstavljena kao sekvenca čiji je ID broj 54. Sekvenca nukleinske kiseline optimizovane za kukuruz je fuzionisana sa sintetskim genom koji kodira enzim u plazmidu koji se koristi za ekspresiju u biljci.
Primer 26: Konstrukcija gena optimizovanih za kukuruz i vektora za transformaciju biljke
Dizajnirani su geni ili genski fragmenti korišćenjem kodona specifičnih za kukuruz radi konstrukcije sintetskih gena, kao što je opisano u Primeru 1.
Izabrana je EGLA. hipertermofilna endoglukanaza poreklomiz Pyrococcus furiosus- a,čija aminokiselinska sekvenca ima ID broj 55, kao što je navedeno u literaturi (Journal of Bacteriologv (1999) 181, str. 284 - 290). Dizajnirana je nukleinska kiselina koja je optimizovana za kukuruz i čija sekvenca ima ID broj 56.
Izabrana je izomeraza ksiloze poreklom izThermits flavus- a.koja ima aminokiselinsku sekvencu čiji je ID broj 57, kao što je opisano u literaturi (Applied Biochemistrv and Biotechnologv 62 : 15 - 27 (1997)).
Konstruisane su ekspresione kasete koja sadrži: gen za EGLA (endoglukanaza) poreklom izPvrococcus furiosus- asa nukleinskom kiselinom optimizovanom za kukuruz, čija sekvenca ima ID broj 56; kao i gen za izomerazu ksiloze poreklom izThermus flavus- asa nukleinskom kiselinom koja je optimizovana za kukuruz i koja kodira aminokiselinsku sekvencu čiji je ID broj 57. Plazmid koji sadrži N-terminalnu signalnu sekvencu7-zeina (MRVLLVALALLALAASATS) (sekvenca čiji je broj 17) je fuzionisan sa sintetskim genom optimizovanim za kukuruz, koji kodira enzim. Opciono, SEKDEL sekvenca je fuzionisana sa C-terminalom sintetskog gena radi usmeravanja i zadržavanja u ER. Fuzioni protein je kloniran iza promotera y-zeina kukuruza u plazmidu koji se koristi za transformaciju biljke radi specifične ekspresije u endospermu. Fuzioni polipeptid je transficiran u tkivo kukuruza korišćenjemAgrobacterium- a.
Primer 27: Dobijanje glukoze iz kukuruznog brašna korišćenjem termofilnih enzima eksprimiranih u kukuruzu
Pokazano je da ekspresija hipertermofilne a-amilaze 797GL3 i a-glukozidaze MalA vodi proizvodnji glukoze kada su ovi enzimi pomešani sa vodenim rastvorom škroba i kada je reakciona smeša inkubirana na 90 °C.
Određivanjem aktivnosti a-glukozidaze, na osnovu hidrolize p-nitrofenil-a-glukozida je identifikovana linija transgenog kukuruza (linija i 68A10B, pNOV4S31) koja eksprimira MalA enzim.
Kukuruzna zrna poreklom od transgenih biljaka koja eksprimiraju 797GL3 su samlevena do brašna u Kleco mlinu, čime je dobijeno amilazno brašno. Kukuruzna zrna poreklom od transgenih biljaka koja eksprimiraju MalA su samlevena do brašna u Kleco mlinu, čime je dobijeno MalA brašno. Na isti način su samlevena zrna netransgenih biljaka, čime je dobijeno kontrolno brašno.
Korišćenje MES pufer, pH 6,0.
Reakcije hidrolize kukuruznog brašna
Uzorci su pripremljeni kao što je navedeno u Tabeli 5, ispod. Kukuruzno brašno (oko 60 mg po uzorku) je pomešano sa 40 ml 50 mM MES pufera, pH 6,0. Uzorci su inkubirani u vodenom kupatilu podešenom na 90 °C tokom 2,5 i tokom 14 časova. Na kraju naznačenih perioda inkubacije, uzorci su uklonjeni i analizirana je količina glukoze u njima.
Uzorci su ispitivani na glukozu korišćenjem testa koji se zasniva na dejstvu oksidaze glukoze / peroksidaze rena. GOPOD reagens sadrži: 0,2 mg/ml o-dianizidina, 100 mM Tris pH 7,5, 100 jedinica/mi oksidaze glukoze i 10 jedinica/ml peroksidaze rena. Uzorak od 20 ul ili razblaženi uzorak je raspoređen na ploči od 96 polja zajedno sa standardima glukoze (koji su varirali od 0 do 0,22 mg/ml). U svako polje je uz mešanje dodato po 100 u.1 GOPOD reagensa, pa je ploča inkubirana na 37 °C tokom 30 minuta. Dodato je 100 ul sumporne kiseline (9 M), pa je očitavana apsorbancija na 540 nm. Koncentracija glukoze u uzorcima je određivana u odnosu na standardnu krivu. Količina glukoze u svakom od uzoraka je naznačena u Tabeli 5.
Navedeni podaci pokazuju da u glukoza nastaje u slučaju kada su u kukuruzu eksprimirane hipertermofilna a-amilaza i a-glukozidaza i kada se kukuruz hidrira i zagreva u odgovarajućim uslovima.
Primer 28: Proizvodnja maltodekstrina
Za dobijanje maltodekstrina je korišćeno zrno koje eksprimira hipertermofilnu a-amilazu. Navedeni proces ne zahteva prethodnu izolaciju škroba, niti dodavanje egzogenih enzima.
Kukuruzna zrna od transgenih biljaka koje eksprimiraju 797GL3 su samlevene do brašna u Kleco mlinu, čime je nastalo "amilazno brašno". Smeša 10% transgenih i 90% netransgenih zrna je samlevena na isti način kako bi se dobilo "10% amilazno brašno".
Amilazno brašno i 10% amilazno brašno (oko 60 mg/uzorku) je pomešano sa vodom u odnosu od 5 u.1 vode po mg brašna. Nastale suspenzije su inkubirane na 90<C>C tokom vremena do 30 časova, kao što je naznačeno u Tabeli 6. Reakcije su obustavljene dodavanjem 0,9 ml 50 mM EDTA na 85 °C i smeše su mešane pipetom. Uzorci od 0,2 ml suspenzije su prikupljeni, centrifugirani kako bi se uklonio nerastvorni materijal i razblaženi 3 * u vodi.
Uzorci su analizirani korišćenjem HPLC sa ELSD detekcijom šećera i maltodekstrina. Sistem gradijenta HPLC je opremljen sa Atec Polvmer Amino kolonom, veličina čestica je 5 um, 250 * 4,6 mm i sa Alltech ELSD 2000 detektorom. Sistem je prethodno ekvilibrisan smešom 15 : 85 vode i acetonitrila. Brzina protoka je 1 ml/min. Inicijalni uslovi su održavani tnknm 5 minuta nakon iniektirania a zatim tnknm 20 minuta ie održavan aradiient 50 • 50 voda :'acetonitril, nakon čega tokom 10 minuta korišćen samo rastvarač. Sistem je ispiran tokom 20 minuta smešom 80 : 20 voda : acetonitril, a zatim je ponovo ekvilibrisan sa početnim rastvaračem.
Dobijene vrednosti maksimalnih koncentracija sli normalizovane prema zapremini i masi brašna. Faktor odgovora ELSD po pg ugljenog hidrata se smanjuje sa povećanjem DP. pa zato maltodekstrini sa većim DP predstavljaju veći procenat od ukupne količine nego što je to indikovano vrednošću maksimalne koncentracije.
Realtivne vrednosti maksimalnih koncentracija proizvoda reakcija sa 100% amilaznim brašnom su prikazane na Slici 17. Realtivne vrednosti maksimalnih koncentracija proizvoda reakcija sa 10% amilaznim brašnom su prikazane na Slici 18.
Navedeni podaci pokazuju da se može dobiti mnoštvo maltodekstrinskih smeša promenom vremena zagrevanja. Nivo aktivnosti a-amilaze može da se menja pomoću mešanja transgenog kukuruza koji eksprimira a-amilazu sa kukuruzom divljeg tipa, čime se menja profil maltodekstrina.
Proizvodi reakcija hidrolize koji su opisani u ovom primeru mogu biti koncentrovani i prečišćeni za upotrebu u namirnicama ili za druge primene korišćenjem raznih dobro definisanih postupaka u koje spadaju: centrifugiranje. filtracija, izmena jona, gel-permeacija, ultrafiltracija, nanofiltracija, reverzna osmoza, obezbojavanje česticama ugljenika, sprej sušenjem i drugim standardnim tehnikama koje su poznate u struci.
Primer 29: Efekat vremena i temperature na proizvodnju maltodekstrina
Sastav maltodekstrinskih proizvoda dobijenih autohidrolizom zrna koje sadrži termofilnu a-amilazu može da se izmeni promenom trajanja i temperature reakcije.
U drugom eksperimentu, amilazno brašno se dobija kao što je opisano u Primeru 28 gore i mešanjem sa vodom u odnosu 300 uJ vode po 60 mg brašna. Uzorci su inkubirani na 60 °C, 80 °C, 90 °C ili 100 °C u trajanju do 90 minuta. Reakcije su obustavljene dodavanjem 900 ml 50 mM EDTA na 90 °C, centrifugiranjem kako bi se uklonio nerastvorni materijal i filtriranjem kroz 0,45 (.im najlonske filtere. Filtrati su analizirani korišćenjem HPLC, kao što je opisano u Primeru 28.
Rezultat ove analize je predstavljen na Slici 19. Cifre u DP nomenklaturi se odnose na stepen polimerizacije. DP2 je maltoza; DP3 je maltotrioza itd. Maltodekstrini većeg DP koji su eluirani u jednoj oblasti maksimalne koncentracije pri kraju eluiranja su obeleženi kao ">DP 12". Ovaj agregat obuhvata dekstrine koji prolaze kroz filtere od 0.45 pm i kroz zaštitnu kolonu, a ne obuhvataju ni jedan vrlo veliki fragment škroba koji biva zarobljen na filteru ili na zaštitnoj koloni.
Ovaj eksperiment pokazuje da sastav maltodekstrinskog proizvoda može da bude izmenjen promenom temperature i vremena inkubacije, kako bi se dobili željeni malto-oligosaharidi ili maltodekstrinski proizvod.
Primer 30: Proizvodnja maltodekstrina
Sastav maltodekstrinskih proizvoda dobijenih od transgenog kukuruza koji sadrži termofilnu a-amilazu takođe može da bude izmenjen dodavanjem drugih enzima kao što su a-glukozidaza i izomeraza ksiloze. kao i uključivanjem soli u smešu vode i brašna pre tretiranja toplotom.
U drugom slučaju, amilazno brašno koje je dobijano na gore opisani način biva pomešano sa prečišćenim MalA i/ili sa bakterijskom izomerazom ksiloze, koja je označena kao BD8037. MalA poreklom izS. sulftaricussa 6His oznakom za prečišćavanje je eksprimirana uE. coli.Ćelijski lizat je dobijen kao što je opisano u Primeru 28. a zatim je prečišćen do jasne homogenizovanosti korišćenjem smole sa afinitetom prema niklu (Probond, Invitrogen), prema uputstvu proizvođača za prečišćavanja nativnog proteina. Izomeraza ksiloze BD8037 je dobijena kao liofilizovani prašak koji proizvodi Diversa i koji je resuspendovan u 0,4 * od originalne zapremine vode.
Amilazno kukuruzno brašno je pomešano sa rastvorima enzima uz dodatak vode ili pufera. Sve reakcione smeše sadrže po 60 mg amilaznog brašna i ukupno 600 ul tečnosti. Jedna serija reakcionih smeša sadrži 50 mM MOPS pufer, pH 7,0 na sobnoj temperaturi, uz dodatak 10 mM MgS04i 1 mM C0CI2; u drugoj seriji reakcionih smeša rastvor pufera koji sadrži metalne jone je zamenjen vodom. Sve reakcione smeše su inkubirane tokom 2 časa na 90 °C. Frakcije supernatanta su dobijene centrifugiranjem. Sačma je isprana sa dodatnih 600 ul vode i ponovo je centrifugirana. Supernatanti iz svake reakcione smeše su pomešani, filtrirani kroz Centricon 10 filter i analizirani pomoću HPLC sa ELSD detektorom, kao što je gore opisano.
Rezultati su grafički prikazani na Slici 20. Oni pokazuju da amilaza 797GL3 koja je eksprimirana u zrnu može da funkcioniše sa drugim termofilnim enzimima, sa ili bez dodavanja metalnih jona. kako bi se dobile različite maltodekstrinske smeše iz kukuruznog brašna na visokoj temperaturi. Posebno, korišćenjem glukoamilaze ili a-glukozidaze može da se dobije prozvod koji sadrži više glukoze i drugih proizvoda malog DP. Korišćenjem enzima sa aktivnošću izomeraze glukoze može da se dobije proizvod koji sadrži fruktozu. pa je stoga slađi od proizvoda dobijenog samo dejstvom amilaze ili amilaze i a-glukozidaze. Dodatno, podaci pokazuju da udeo DP5, DP6 i DP7 malto-oligosaharida može da se poveća uključivanjem dvovalentnih katjonskih soli, kao što su C0CI2i MgSOa.
Drugi načini promene sastava maltodekstrina dobijenih reakcijom kao što je ona koja je ovde opisana obuhvataju: promenu pH vrednosti, promenu tipa škroba u transgenom ili netransgenom zrnu, promenu odnosa čvrstih supstanci ili dodavanje organskih rastvarača.
Primer 31: Dobijanje dekstrina ili šećera iz zrna bez mehaničkog razaranja zrna pre prikupljanja proizvoda izvedenih iz škroba
Šećeri i maltodekstrini su dobijeni uspostavljanjem kontakta transgenog zrna koje eksprimira a-amilazu 797GL3 sa vodom i zagrevanjem na 90 °C tokom noći (>14 časova). Zatim je tečnost odvojena od zrna filtracijom. Tečni proizvod je analiziran pomoću HPLC. na način koji je opisan u Primeru 15. Tabela 6 predstavlja profil detektovanih proizvoda.
<*>Kvantifikacija DP3 obuhvata maltotriozu i može da obuhvati izomere maltotrioze koji poseduju a (1 —> 6) vezu umestoa(l —> 4) veze. Slično tome. kvantitlkacija DP 4 do DP 7 obuhvata linearne malto-oligosaharide date dužine lanca, kao i izomere koji poseduju jednu ili više a (1 —► 6) veza umesto a (1 —► 4) veza.
Navedeni podaci pokazuju da šećeri i maltodekstrini mogu biti dobijeni kontaktom intaktnog zrana koje eksprimira a-amilazu sa vodom i uz grejanje. Proizvodi potom mogu biti izdvojeni iz intaktnog zrna filtracijom ili centrifugiranjem ili dejtvom gravitacije.
Primer 32: Fermentacija sirovog škroba u kukuruzu koji eksprimira glukoamilazu poreklom izRhizopu. s orvzae
Zrna transgenog kukuruza su prikupljena od transgenih biljaka dobijenih na način koji je opisan u Primeru 29. Zrna su samlevena do brašna. Zrna kukuruza eksprimiraju protein koji sadrži aktivni fragment glukoamilaze izRhizopus oryzae(sekvenca čiji je ID broj 49), koji je usmeren ka ER.
Zrna kukuruza su samlevena do brašna kao što je opisano u Primeru 15. Zatim je pripremljena kaša koja sadrži 20 g kukuruznog brašna, 23 ml dejonizovane vode i 6.0 ml suspenzije (8% (masenih) čvrstih supstanci). Vrednost pH je podešena na 6.0 dodavanjem amonijum hidroksida. Sledeće komponente su dodate u kašu: proteaza (0,60 ml 1000 x razblažene komercijalno dostupne proteaze) i 0.2 mg laktocida i uree (0,85 ml 10 x razblažene 50% tečne uree). Napravljena je rupa na zatvaraču boce od 100 ml u kojoj se nalazi kaša, kako bi se omogućilo isparavanje CCb. Kaša je zatim inokulirana sa gljivicom (1,44 ml) i inkubirana u vodenom kupatilu podešenom na 90° F. Nakon 24 časa fermentacije, temperatura je smanjena na 86° F; a nakon 48 časova na 82° F.
Gljivice korišćene za inokulaciju su propagirane kao što je opisano u Primeru 14.
Uzorci su uklonjeni kao stoje opisano u Primeru 14, a zatim su analizirani postupcima opisanim u Primeru 14.
Primer 33: Primer fermentacije siros'Og škroba u kukuruzu koji eksprimira glukoamilazu
Rhizopus orvzae
Zrna transgenog kukuruza su prikupljena od transgenih biljaka dobijenih na način koji je opisan u Primeru 28. Zrna su samlevena do brašna. Zrna kukuruza eksprimiraju protein koji sadrži aktivni fragment glukoamilaze izRhizopu. s orvzae(sekvenca čiji je ID broj 49). koji je usmeren ka ER.
Zrna kukuruza su samlevena kao što je opisano u Primeru 15. Zatim je pripremljena kaša koja sadrži 20 g kukuruznog brašna, 23 ml dejonizovane vode i 6,0 ml suspenzije (S%
(masenih) čvrstih supstanci). Vrednost pH je podešena na 6,0 dodavanjem amonijum hidroksida. Siedeće komponente su dodate u kašu: proteaza (0,60 ml 1000 x razblažene komercijalno dostupne proteaze) i 0,2 mg laktocida i uree (0,85 ml 10*razblažene 50% tečne uree). Napravljena je rupa na zatvaraču boce od 100 ml u kojoj se nalazi kaša, kako bi se omogućilo isparavanje CCb. Kaša je zatim inokulirana sa gljivicom (1,44 ml) i inkubirana u vodenom kupatilu podešenom na 90° F. Nakon 24 časa fermentacije, temperatura je smanjena na 86° F; a nakon 48 časova na 82° F.
Gljivice korišćene za inokulaciju su propagirane kao što je opisano u Primeru 14.
Uzorci su uklonjeni kao što je opisano u Primeru 14, a zatim su analizirani postupcima opisanim u Primeru 14.
Primer 34: Primer fermentacije sirovog škroba u celim zrnima kukuruza koji eksprimira glukoamilazuRhizopus oryzaeuz dodatak egzogene a-amilaze
Zrna transgenog kukuruza su prikupljena od transgenih biljaka dobijenih na način koji je opisan u Primeru 28. Zrna kukuruza eksprimiraju protein koji sadrži aktivni fragment glukoamilaze izRhizopus oryzae(sekvenca čiji je ID broj 49), koji je usmeren ka ER.
Zrna kukuruza su izložena kontaktu sa 20 g kukuruznog brašna, 23 ml dejonizovane vode i 6,0 ml suspenzije (8% (masenih) čvrstih supstanci). Vrednost pH je podešena na 6,0 dodavanjem amonijum hidroksida. Dodate su siedeće komponente: a.-amilaza ječma, prizvođač Sigma (2 mg), proteaza (0,60 ml 1000 x razblažene komercijalno dostupne proteaze) i 0,2 mg laktocida i uree (0,85 ml 10 * razblažene 50%> tečne uree). Napravljena je rupa na zatvaraču boce od 100 ml u kojoj se nalazi kaša, kako bi se omogućilo isparavanje CO;. Kaša je zatim inokulirana sa gljivicom (1,44 ml) i inkubirana u vodenom kupatilu podešenom na 90° F. Nakon 24 časa fermentacije, temperatura je smanjena na 86° F: a nakon 48 časova na 82° F.
Gljivice korišćene za inokulaciju su propagirane kao što je opisano u Primeru 14.
Uzorci su uklonjeni kao što je opisano u Primeru 14, a zatim su analizirani postupcima opisanim u Primeru 14.
Primer 35: Fermentacija sirovog škroba u kukuruzu koji eksprimira glukoamilazuRhizopus orvzaei amilazu izZea mavs
Zrna transgenog kukuruza su prikupljena od transgenih biljaka dobijenih na način koji je opisan u Primeru 28. Zrna kukuruza eksprimiraju protein koji sadrži aktivni fragment glukoamilaze izRhizopus oryzae(sekvenca čiji je ID broj 49), koji je usmeren ka ER.
Zrna kukuruza su samlevena do brašna kao što je opisano u Primeru 14. Zatim je pripremljena kaša koja sadrži 20 g kukuruznog brašna, 23 ml dejonizovane vode i 6.0 ml suspenzije (8% (masenih) čvrstih supstanci). Vrednost pH je podešena na 6,0 dodavanjem amonijum hidroksida. Dodate su siedeće komponente: proteaza (0,60 ml 1000 x razblažene komercijalno dostupne proteaze) i 0.2 mg laktocida i uree (0,85 ml 10 x razblažene 50% tečne uree). Napravljena je rupa na zatvaraču boce od 100 ml u kojoj se nalazi kaša, kako bi se omogućilo isparavanje CCb. Kaša je zatim inokulirana sa gljivicom (1.44 ml) i inkubirana u vodenom kupatilu podešenom na 90° F. Nakon 24 časa fermentacije, temperatura je smanjena na 86° F; a nakon 48 časova na 82° F.
Gljivice korišćene za inokulaciju su propagirane kao što je opisano u Primeru 14.
Uzorci su uklonjeni kao što je opisano u Primeru 14, a zatim su analizirani postupcima opisanim u Primeru 14.
Primer 36:Primer fermentacije sirovog škroba u kukuruzu koji eksprimira glukoamilazu iz
Thermoanaerobacter thermosaccharolyticum
Zrna transgenog kukuruza su prikupljena od transgenih biljaka dobijenih na način koji je opisan u Primeru 28. Zrna kukuruza eksprimiraju protein koji sadrži aktivni fragment glukoamilaze izThermoanaerobacter therniosaccharolvticum(sekvenca čiji je ID broj 47). koji je usmeren ka ER.
Zrna kukuruza su samlevena do brašna kao što je opisano u Primeru 15. Zatim je pripremljena kaša koja sadrži 20 g kukuruznog brašna. 23 ml dejonizovane vode i 6.0 ml suspenzije (8% (masenih) čvrstih supstanci). Vrednost pH je podešena na 6.0 dodavanjem amonijum hidroksida. Dodate su siedeće komponente: proteaza (0.60 ml 1000 x razblažene komercijalno dostupne proteaze) i 0.2 mg laktocida i uree (0.85 ml 10 * razblažene 50% tečne uree). Napravljena je rupa na zatvaraču boce od 100 ml u kojoj se nalazi kaša. kako bi se omogućilo isparavanje CCK Kaša je zatim inokulirana sa gljivicom (1.44 ml) i inkubirana u vodenom kupatilu podešenom na 90° F. Nakon 24 časa fermentacije, temperatura je smanjena na 86° F; a nakon 48 časova na 82° F.
Gljivice korišćene za inokulaciju su propagirane kao što je opisano u Primeru 14.
Uzorci su uklonjeni kao što je opisano u Primeru 14, a zatim su analizirani postupcima opisanim u Primeru 14.
Primer 37: Primer fermentacije sirovog škroba u kukuruzu koji eksprimira glukoamilazu iz
Aspergilhis niger
Zrna transgenog kukuruza su prikupljena od transgenih biljaka dobijenih na način koji je opisan u Primeru 28. Zrna kukuruza eksprimiraju protein koji sadrži aktivni fragment glukoamilaze izAspergilhis niger(Fiil, N.P. "Glucoamvlases Gl and G2 from Aspergilhis niger are svnthesized from tvvo different but closelv related mRNAs" EMBO J. 3 (5), 1097 - 1102 (1984), pristupni br. P04064). Nukleinska kiselina koja je optimizovana za kukuruz i koja kodira glukoamilazu poseduje sekvencu čiji je ID broj 59, a njen proteinski proizvod je usmeren ka ER.
Zrna kukuruza su samlevena do brašna kao što je opisano u Primeru 14. Zatim je pripremljena kaša koja sadrži 20 g kukuruznog brašna, 23 ml dejonizovane vode i 6,0 ml suspenzije (8% (masenih) čvrstih supstanci). Vrednost pH je podešena na 6,0 dodavanjem amonijum hidroksida. Dodate su siedeće komponente: proteaza (0,60 ml 1000 * razblažene komercijalno dostupne proteaze) i 0,2 mg laktocida i uree (0,85 ml 10 x razblažene 50% tečne uree). Napravljena je rupa na zatvaraču boce od 100 ml u kojoj se nalazi kaša, kako bi se omogućilo isparavanje CO2. Kaša je zatim inokulirana sa gljivicom (1,44 ml) i inkubirana u vodenom kupatilu podešenom na 90° F. Nakon 24 časa fermentacije, temperatura je smanjena na 86° F; a nakon 48 časova na 82° F.
Gljivice korišćene za inokulaciju su propagirane kao što je opisano u Primeru 14.
Uzorci su uklonjeni kao što je opisano u Primeru 14. a zatim su analizirani postupcima opisanim u Primeru 14.
Primer 38: Primer fermentacije sirovog škroba u kukuruzu koji eksprimira glukoamilazu izAspergilhis nigeri amilazu izZea mays
Zrna transgenog kukuruza su prikupljena od transgenih biljaka dobijenih na način koji je opisan u Primeru 28. Zrna kukuruza eksprimiraju protein koji sadrži aktivni fragment glukoamilaze izAspergilhis niger(Fiil, N.P. "Glucoamvlases Gl and G2 from Aspergilhis niger are svnthesized from tvvo different but closelv related mRNAs" EMBO J. 3 (5), 1097 - 1102 (1984), pristupni br. P04064) (sekvenca čiji je ID broj 59, za kukuruz optimizovana nukleinska kiselina) koja je usmerena ka ER. zrna takođe eksprimiraju kukuruznu amilazu sa vezujućim domenom za sirovi škrob, kao što je opisano u Primeru 28.
Zrna kukuruza su samlevena do brašna kao što je opisano u Primeru 14. Zatim je pripremljena kaša koja sadrži 20 g kukuruznog brašna, 23 ml dejonizovane vode i 6,0 ml suspenzije (8% (masenih) čvrstih supstanci). Vrednost pH je podešena na 6,0 dodavanjem amonijum hidroksida. Dodate su siedeće komponente: proteaza (0,60 ml 1000 x razblažene komercijalno dostupne proteaze) i 0,2 mg laktocida i uree (0,85 ml 10 * razblažene 50% tečne uree). Napravljena je rupa na zatvaraču boce od 100 ml u kojoj se nalazi kaša, kako bi se omogućilo isparavanje CO2. Kaša je zatim inokulirana sa gljivicom (1,44 ml) i inkubirana u vodenom kupatilu podešenom na 90° F. Nakon 24 časa fermentacije, temperatura je smanjena na 86° F; a nakon 48 časova na 82° F.
Gljivice korišćene za inokulaciju su propagirane kao štoje opisano u Primeru 14.
Uzorci su uklonjeni kao štoje opisano u Primeru 14, a zatim su analizirani postupcima opisanim u Primeru 14.
Primer 39: Primer fermentacije sirovog škroba u kukuruzu koji eksprimira glukoamilazu izThermoanaerobacter thermosaccharolvticumi amilazu ječma
Zrna transgenog kukuruza su prikupljena od transgenih biljaka dobijenih na način koji je opisan u Primeru 28. Zrna kukuruza eksprimiraju protein koji sadrži aktivni fragment glukoamilaze izThermoanaerobacter thermosaccharolvticum(sekvenca čiji je ID broj 47). koji je usmeren ka ER. Zrna takođe eksprimiraju amyl gen za amilazu ječma niskog pl (Rogers. J.C. & Milliman. C. "Isolation and sequence analvsis of barlev a-amylase cDNA clone" J. Biol. Chem. 258 (13), 8169 - 8174 (1983)), koji je modifikovan tako da usmerava ekspresiju proteina ka ER.
Zrna kukuruza su samlevena do brašna kao što je opisano u Primeru 14. Zatim je pripremljena kaša koja sadrži 20 g kukuruznog brašna, 23 ml dejonizovane vode i 6,0 ml suspenzije (8% (masenih) čvrstih supstanci). Vrednost pH je podešena na 6,0 dodavanjem amonijum hidroksida. Dodate su siedeće komponente: proteaza (0,60 ml 1000 :< razblažene komercijalno dostupne proteaze) i 0,2 mg laktocida i uree (0,85 ml 10 x razblažene 50% tečne uree). Napravljena je rupa na zatvaraču boce od 100 ml u kojoj se nalazi kaša, kako bi se omogućilo isparavanje CCK Kaša je zatim inokulirana sa gljivicom (1,44 ml) i inkubirana u vodenom kupatilu podešenom na 90° F. Nakon 24 časa fermentacije, temperatura je smanjena na 86° F; a nakon 48 časova na 82° F.
Gljivice korišćene za inokulaciju su propagirane kao štoje opisano u Primeru 14.
Uzorci su uklonjeni kao štoje opisano u Primeru 14, a zatim su analizirani postupcima opisanim u Primeru 14.
Primer 40: Primer fermentacije sirovog škroba u celim zrnima kukuruza koji eksprimira glukoamilazu izThermoanaerobacter thermosaccharolyticumi amilazu ječma
Zrna transgenog kukuruza su prikupljena od transgenih biljaka dobijenih na način koji je opisan u Primeru 28. Zrna kukuruza eksprimiraju protein koji sadrži aktivni fragment glukoamilaze izThermoanaerobacter thermosaccharolyticum(sekvenca čiji je ID broj 47), koji je usmeren ka ER. Zrna takođe eksprimiraju amyl gen za amilazu ječma niskog pl (Rogers, J.C. & Milliman, C. "Isolation and sequence analysis of barley a-amylase cDNA done" J. Biol. Chem. 258 (13), 8169 - 8174 (1983)), koji je modifikovan tako da usmerava ekspresiju proteina ka ER.
Zrna kukuruza izložena kontaktu sa smešom koja sadrži 20 g kukuruznog brašna. 23 ml dejonizovane vode i 6.0 ml suspenzije (8% (masenih) čvrstih supstanci). Vrednost pH je podešena na 6,0 dodavanjem amonijum hidroksida. Dodate su siedeće komponente: proteaza (0.60 ml 1000xrazblažene komercijalno dostupne proteaze) i 0,2 mg laktocida i uree (0.85 ml 10 x razblažene 50% tečne uree). Napravljena je rupa na zatvaraču boce od 100 ml u kojoj se nalazi kaša, kako bi se omogućilo isparavanje CCK Kaša je zatim inokulirana sa gljivicom (1,44 ml) i inkubirana u vodenom kupatilu podešenom na 90° F. Nakon 24 časa fermentacije, temperatura je smanjena na 86° F; a nakon 48 časova na 82° F.
Gljivice korišćene za inokulaciju su propagirane kao štoje opisano u Primeru 14.
Uzorci su uklonjeni kao štoje opisano u Primeru 14, a zatim su analizirani postupcima opisanim u Primeru 14.
Primer 41: Primer fermentacije sirovog škroba u kukuruzu koji eksprimira fuzioni protein a-amilaze i glukoamilaze
Zrna transgenog kukuruza su prikupljena od transgenih biljaka dobijenih na način koji je opisan u Primeru 28. Zrna kukuruza eksprimiraju za kukuruz optimizovani polinukleotid. kao što je onaj čija sekvenca ima ID broj 46, koji kodira fuzioni protein a-amilaze i glukoamilaze, kao štoje onaj čija sekvenca ima ID broj 45, koji je usmeren ka ER.
Zrna kukuruza su samlevena do brašna kao što je opisano u Primeru 14. Zatim je pripremljena kaša koja sadrži 20 g kukuruznog brašna, 23 ml dejonizovane vode i 6,0 ml suspenzije (8% (masenih) čvrstih supstanci). Vrednost pH je podešena na 6,0 dodavanjem amonijum hidroksida. Dodate su siedeće komponente: proteaza (0,60 ml 1000 * razblažene komercijalno dostupne proteaze) i 0,2 mg laktocida i uree (0,85 ml 10 * razblažene 50% tečne uree). Napravljena je rupa na zatvaraču boce od 100 ml u kojoj se nalazi kaša, kako bi se omogućilo isparavanje CCb. Kaša je zatim inokulirana sa gljivicom (1,44 ml) i inkubirana u vodenom kupatilu podešenom na 90° F. Nakon 24 časa fermentacije, temperatura je smanjena na 86° F: a nakon 48 časova na 82° F.
Gljivice korišćene za inokulaciju su propagirane kao štoje opisano u Primeru 14.
Uzorci su uklonjeni kao što je opisano u Primeru 14. a zatim su analizirani postupcima opisanim u Primeru 14.
Sve publikacije, patenti i patentne prijave su ovde inkorporirane po referenci, lako je prethodno navedena specifikacija predmetnog pronalaska opisana u odnosu na njegova određena poželjna rešenja. i iako su opisani mnogi detalji u cilju ilustracije, stručnjaku je jasno da su moguća dodatna rešenja predmetnog pronalaska i da određeni detalji koji su ovde opisani mogu značajno da variraju bez odstupanja od osnovnih načela predmetnog pronalaska.
Aminokiselinska sekvenca 797GL3 a- amilaze ( sekvenca sa ID brojem 1)
Sekvenca nukleinskih kiselina 797GL3 a- amilaze optimizovana za kukuruz ( sekvenca sa ID
brojem 2)
Aminokiselinska sekvenca 6gp3 pululanaze ( sekvenca sa ID brojem 3) Sekvenca nukleinskih kiselina 6<g>p3 pululanaze optimizovana za kukuruz ( sekvenca sa ID brojem 4) Aminokiselinska sekvenca malA a- glukozidaze izSulfolobus solfaiaricus( sekvenca sa ID brojem 5) Sekvenca nukleinskih kiselina malA a- glukozidaze izSulfolobus solfataricus .optimizovana za kukuruz ( sekvenca sa ID brojem 6) IVcavaminokiselinska sekvenca ( sekvenca sa ID brojem 8)
Sekvenca nukleinskih kiselina konstrukta797GL3Ai' axv ( sekvencasa ID brojem 9)
Aminokiselinska sekvenca konstrukta 797GL3Ai' o. yv ( sekvenca sa ID brojem 10)
Sekvenca nukleinskih kiselina ADP- gpp promotera izZea mavs( sekvenca sa ID brojem 1 1)
Sekvenca nukleinskih kiselina promotera y- zeina izZea mavs( sekvenca sa ID brojem 12)
Aminokiselinska sekvenca fuzionog polipeptida pNOV6200 amilaze ( sekvenca sa ID brojem 13)
Aminokiselinska sekvenca fuzionog polipeptida pNOV6201 amilaze ( sekvenca sa ID brojem
iil
Aminokiselinska sekvenca fuzionog polipeptida pNOV4029 amilaze ( sekvenca sa ID brojem 11) Aminokiselinska sekvenca fuzionog polipeptida pNOV4031 amilaze ( sekvenca sa ID brojem 16)
N- terminalna signalna sekvenca y- zeina kukuruza ( sekvenca sa ID brojem 17)
Aminokiselinska sekvenca izomeraze glukoze izThermotoga maritima(sekven ca sa ID
brojem 1 8)
Sekvenca nukleinskih kiselina izomeraze glukoze izThermotoga maritima .optimizovana za
kukuruz ( sekvenca sa ID brojem 19)
Aminokiselinska sekvenca izomeraze glukoze izThermotoga neapolitana( sekvenca sa ID
brojem 20)
Sekvenca nukleinskih kiselina izomeraze glukoze izThermotoga neapolitana .optimizovana
za kukuruz ( sekvenca sa ID brojem 21)
SV57 ( sekvenca sa ID brojem 22) (5'AGCGAATTCATGGCGGCTCTGGCCACGT 3') SV58 ( sekvenca sa ID brojem 22) (5'AGCTAAGCTTCAGGGCGCGGCCACGTTCT 3') Aminokiselinska sekvenca fuzionog polipeptida pNOV7005 6GP3 ( sekvenca sa ID brojem 24)
Sekvenca nukleinskih kiselina fuzionog polipeptida pNOV7005 6GP3. optimizovana za
kukuruz ( sekvenca sa ID brojem 25)
Aminokiselinska sekvenca fuzionog polipeptida pNOV4831 malA ( sekvenca sa ID brojem 261 Aminokiselinska sekvenca Fuzionog polipeptida pNOV4839 malA ( sekvenca sa ID brojem27)
Aminokiselinska sekvenca fuzionog polipeptida pNQV4832 izomeraze glukoze ( sekvenca sa
ID brojem 28)
Aminokiselinska sekvenca fuzionog polipeptida pNOV4S33 izomeraze glukoze ( sekvenca sa
ID brojem 29)
Aminokiselinska sekvenca fuzionog polipeptida pNQV484Q izomeraze glukoze ( sekvenca sa
ID brojem 30)
Signalna sekvenca alfa amilaze AMY32b iz ječma ( sekvenca sa ID brojem 31)
Si<g>nalna sekvenca PRI a ( sekvenca sa ID brojem 32) Sekvenca fuzionog polipeptida 797GL3 ( sekvenca sa ID brojem 33)
Sekvenca fuzionog polipeptida 6GP3 ( sekvenca sa ID brojem 34) Sekvenca fuzionog polipeptida 797GL3 ( sekvenca sa ID brojem 35)
Sekvenca fuzionog polipeptida malA ( sekvenca sa ID brojem 36)
Sekvenca nukleotida fuzionog polipeptida pNOV4829 izomeraze glukoze ( sekvenca sa ID
brojem 37)
Aminokiselinska sekvenca fuzionog polipeptida pNOV4829 izomeraze glukoze ( sekvenca sa
ID brojem 38)
Sekvenca nukleotida fuzionog polipeptida pNOV4830 izomeraze<g>lukoze ( sekvenca sa ID
brojem 39)
Aminokiselinska sekvenca fuzionog polipeptida pNOV4830 izomeraze<g>lukoze ( sekvenca sa
ID brojem 40)
Sekvenca nukleotida fuziono<g>polipeptida pNOV4835 izomeraze<g>lukoze izThermotoga
maritima( sekvenca sa ID brojem 41)
Aminokiselinska sekvenca fuzionog polipeptida pNOV4835 izomeraze<g>lukoze iz
Thermotoga maritima( sekvenca sa ID brojem 42)
Sekvenca nukleotida Fuzionog polipeptida pNOV4836 izomeraze glukoze izThermologa
neapolitana( sekvenca sa ID brojem 43)
Aminokiselinska sekvenca fuzionog polipeptida pNOV4836 izomeraze glukoze iz
Thermotoga neapolitana( sekvenca sa ID brojem 44)
Aminokiselinska sekvenca fuzionog polipeptida a- amilaze/ glukoamilaze izAspergilhis
shirousami( bez signalne sekvence) ( sekvenca sa ID brojem 45)
Sekvenca nukleinskih kiselina Fuzionog polipeptida a- amilaze/ glukoamilaze izAspergilhis shirouscuni .optimizovana za kukuruz ( bez signalne sekvence') ( sekvenca sa ID brojem 46)
Aminokiselinska sekvenca glukoamilaze izThermoanaerohacterium thermosaccharolvticum
( bez signalne sekvence) ( sekvenca sa ID brojem 47)
Sekvenca nukleinskih kiselina glukoamilaze izThermoanaerobacterium thermosaccharolvticum .optimizovana za kukuruz ( bez signalne sekvence) ( sekvenca sa ID brojem 48)
Aminokiselinska sekvenca glukoamilaze izRhizopus orvzae( bez signalne sekvence)
( sekvenca sa ID brojem 49)
Sekvenca nukleinskih kiselina glukoamilaze izRhizopu . s orvzae .optimizovana za kukuruz
( bez signalne sekvence) ( sekvenca sa ID brojem 50)
Aminokiselinska sekvenca a- amilaze iz kukuruza ( sekvenca sa ID brojem 51)
Sekvenca nukleinskih kiselina a- amilaze iz kukuruza ( sekvenca sa ID brojem 52)
Aminokiselinska sekvenca vezujućeg mesta sirovog škroba ( sekvenca sa ID brojem 53)
Sekvenca nukleinske kiseline veztijtićeg mesta sirovog škroba, optimizovana za kukuruz
( sekvenca sa ID brojem 54)
Aminokiselinska sekvenca EGLA izPvrococcus furiosus( bez signalne sekvence) ( sekvenca
sa ID brojem 55)
Sekvenca nukleinske kiseline EGLA izPvrococcus furiosus .oprimizovana za kukuruz ( bez
si<g>nalne sekvence) ( sekvenca sa ID brojem 56)
Aminokiselinska sekvenca izomeraze ksiloze izThermu . s flavus( sekvenca sa ID brojem 57)
Sekvenca nukleotida pNOV4800 ( signalna sekvenca Amv32B sa EGLA) ( sekvenca sa ID
brojem 58)
Nukleinska kiselinaAspergilhis niger .optimizovana za kukuruz ( sekvenca sa I D brojem 59)

Claims (1)

1. Izolovani polinukleotid, naznačen time što a) sadrži sekvence čiji su ID brojevi 2, 4, 6. 9.
19, 21, 25, 37, 39, 41, 43, 46, 48, 50, 52 ili 59 ili njima komplementarne sekvence. ili polinukleotid naznačen time što hibridizuje sa komplementom bilo koje od sekvenci čiji su ID brojevi 2, 4, 6. 9, 19, 21, 25, 37, 39, 41, 43, 46, 48, 50, 52 ili 59, u uslovima slabo precizne hibridizacije i naznačen time što kodira polipeptid koji poseduje aktivnost a-amilaze, pululanaze. a-glikozidaze, izomeraze glukoze ili glukoamilaze ili naznačen time što b) kodira polipeptid koji sadrži sekvence čiji su ID brojevi 10, 13, 14, 15, 16, 18. 20, 24, 26. 27. 28. 29, 30, 33, 34, 35, 36, 38, 40, 42, 44, 45, 47, 49 ili 51 ili koji sadrži njihov enzimski aktivni fragment.
2. Izolovani polinukleotid prema zahtevu 1. naznačen time što pomenuti polinukleotid kodira fuzioni polipeptid koji sadrži prvi polipeptid i drugi peptid, pri čemu pomenuti prvi polipeptid poseduje aktivnost a-amilaze, pululanaze, a-glikozidaze, izomeraze glukoze ili glukoamilaze.
3. Izolovani polinukleotid prema zahtevu 2, naznačen time što drugi peptid sadrži signalnu sekvencu peptida.
4. Izolovani polinukleotid prema zahtevu 3, naznačen time što signalna sekvenca peptida usmerava prvi polipeptid ka vakuoli, endoplazmatskom retikulumu, hloroplastu. granuli škroba, semenu ili ka ćelijskom zidu biljke.
5. Izolovani polinukleotid prema zahtevu 3, naznačen time što pomenuta signalna sekvenca predstavlja N-terminalnu signalnu sekvencu izvedenu iz\ vaxy,N-terminalnu signalnu sekvencu iz y-zeina, vezujući domen škroba, ili C-terminalni vezujući domen škroba.
6. Izolovani polinukleotid prema zahtevu 1, naznačen time što pomenuti polinukleotid hibridizuje sa komplementom bilo koje od sekvenci čiji su ID brojevi 2, 9 ili 52, u uslovima slabo precizne hibridizacije i naznačen time što kodira polipeptid koji poseduje aktivnost a-amilaze.
7. Izolovani polinukleotid prema zahtevu I, naznačen time što pomenuti polinukleotid hibridizuje sa komplementom sekvenci čiji su ID brojevi 4 ili 25. u uslovima slabo precizne hibridizacije i naznačen time što kodira polipeptid koji poseduje aktivnost pululanaze.
8. Izolovani polinukleotid prema zahtevu 1, naznačen time što pomenuti polinukleotid hibridizuje sa komplementom sekvence čiji je ID broj 6 i naznačen time što kodira polipeptid koji poseduje aktivnost a-glukozidaze.
9. izolovani polinukleotid prema zahtevu 1, naznačen time što pomenuti polinukleotid hibridizuje sa komplementom bilo koje od sekvenci čiji su ID brojevi 19. 21. 37. 39. 41 ili 43, u uslovima slabo precizne hibridizacije i koji kodiraju polipeptid koji poseduje aktivnost izomeraze glukoze.
10. Izolovani polinukleotid prema zahtevu 1, naznačen time što pomenuti polinukleotid hibridizuje sa komplementom bilo koje od sekvenci čiji su ID brojevi 46. 48, 50 ili 59. u uslovima slabo precizne hibridizacije i naznačen time što kodira polipeptid koji poseduje aktivnost glukoamilaze.
11. Izolovani polinukleotid, naznačen time što sadrži bilo koju od sekvenci sa ID brojem 2 ili 9, ili njima komplementarne sekvence.
12. Izolovani polinukleotid, naznačen time što sadrži bilo koju od sekvenci sa ID brojem 4 ili 25, ili njima komplementarne sekvence.
13. Izolovani polinukleotid, naznačen time što sadrži sekvencu sa ID brojem 6 ili njoj komplementarnu sekvencu.
14. Izolovani polinukleotid, naznačen time što sadrži bilo koju od sekvenci sa ID brojem 19, 21, 37,39, 41 ili 43, ili njima komplementarne sekvence.
15. Izolovani polinukleotid, naznačen time što sadrži bilo koju od sekvenci sa ID brojem 46, 48, 50 ili 59, ili njima komplementarne sekvence.
16. Ekspresiona kaseta, naznačena time što sadrži polinukleotid koji a) poseduje sekvence čiji su ID brojevi 2. 4. 6. 9, 19. 21. 25. 37. 39, 41. 43. 46, 48. 50, 52 ili 59 ili njima komplementarne sekvence, ili polinukleotid koji hibridizuje sa komplementom bilo koje od sekvenci čiji su ID brojevi 2, 4, 6, 9, 19, 21, 25, 37. 39. 41, 43, 46, 48. 50, 52 ili 59, u uslovima slabo precizne hibridizacije i koji kodira polipeptid koji poseduje aktivnost o amilaze, pululanaze. a-glikozidaze. izomeraze glukoze ili glukoamilaze ili koji b) kodira polipeptid koji sadrži sekvence čiji su ID brojevi 10, 13. 14, 15, 16, 18. 20, 24, 26. 27, 28. 29.
30. 33, 34, 35. 36, 38, 40, 42, 44, 45, 47, 49 ili 51 ili koji sadrži njihov enzimski aktivni fragment.
17. Ekspresiona kaseta prema zahtevu 16, naznačena time što je operativno povezana sa promoterom.
18. Ekspresiona kaseta prema zahtevu 17, naznačena time što promoter je inducibilni promoter.
19. Ekspresiona kaseta prema zahtevu 17, naznačena time što promoter je tkivno specifični promoter.
20. Ekspresiona kaseta prema zahtevu 19, naznačena time što promoter je promoter specifičan za endosperm.
21. Ekspresiona kaseta prema zahtevu 20, naznačena time što promoter specifičan za enosperm je promoter y-zeina kukuruza ili ADP-gpp promoter kukuruza.
22. Ekspresiona kaseta prema zahtevu 21, naznačena time što promoter sadrži sekvencu čiji je ID broj 11 ili sekvencu čiji je ID broj 12.
23. Ekspresiona kaseta prema zahtevu 16, naznačena time štoje polinukleotid orijentisan u smeru očitavanja u odnosu na promoter.
24. Ekspresiona kaseta prema zahtevu 16, naznačena time što polinukleotid naveden pod a), dodatno kodira signalnu sekvencu koja je operativno povezana sa polipeptidom kodiranim od strane polinukleotida.
25. Ekspresiona kaseta prema zahtevu 24, naznačena time što signalna sekvenca usmerava operativno povezani polipeptid ka vakuoli. endoplazmatskom retikulumu. hloroplastu. granuli škroba, semenu ili ka ćelijskom zidu biljke.
26. Ekspresiona kaseta prema zahtevu 25, naznačena time što signalna sekvenca predstavlja N-terminalnu signalnu sekvencu izvedenu iz\ vaxyili N-terminalnu signalnu sekvencu iz y-zeina.
27. Ekspresiona kaseta prema zahtevu 25, naznačena time što signalna sekvenca predstavlja vezujući domen škroba.
28. Ekspresiona kaseta prema zahtevu 16, naznačena time što polinukleotid naveden pod b) je operativno povezan sa tkivno specifičnim promoterom.
29. Ekspresiona kaseta prema zahtevu 28, naznačena time što tkivno specifični promoter predstavlja promoterZea mays y-zeinaiiiZea maysADP-gpp promoter.
30. Ekspresiona kaseta, naznačena time što sadrži polinukleotid koji poseduje bilo koju od sekvenci sa ID brojem 2 ili 9, ili njima komplementarne sekvence.
31. Ekspresiona kaseta, naznačena time što sadrži polinukleotid koji poseduje sekvencu sa ID brojem 6 ili njoj komplementarnu sekvencu.
32. Ekspresiona kaseta, naznačena time što sadrži polinukleotid koji poseduje bilo koju od sekvenci sa ID brojem 19, 21, 37, 39, 41 ili 43, ili njima komplementarne sekvence.
33. Ekspresiona kaseta, naznačena time što sadrži polinukleotid koji poseduje bilo koju od sekvenci sa ID brojem 46, 48, 50 ili 59, ili njima komplementarne sekvence.
34. Ekspresiona kaseta, naznačena time što sadrži polinukleotid koji poseduje bilo koju od sekvenci sa ID brojem 4 ili 25, ili njima komplementarne sekvence.
35. Ekspresiona kaseta, naznačena time što sadrži polinukleotid koji kodira polipeptid koji sadrži bilo koju od aminokiselinskih sekvenci čiji su ID brojevi 10, 13, 14, 15, 16, 24, 26, 27.
28, 29, 30, 33. 34, 35, 36, 38, 40. 42, 44, 45, 47, 49 ili 51, ili koji sadrži njihov enzimski aktivni fragment.
36. Ekspresiona kaseta, naznačena time što sadrži polinukleotid koji kodira polipeptid koji sadrži bilo koju od aminokiselinskih sekvenci čiji su ID broj evi 10, 13, 14, 15, 16, 33, 35 ili 51, ili koji sadrži njihov aktivni fragment koji poseduje aktivnost a-amilaze.
37. Ekspresiona kaseta, naznačena time što sadrži polinukleotid koji kodira polipeptid koji sadrži bilo koju od aminokiselinskih sekvenci čiji su ID brojevi 3, 24 ili 34, ili koji sadrži njihov aktivni fragment koji poseduje aktivnost pululanaze.
38. Ekspresiona kaseta, naznačena time što sadrži polinukleotid koji kodira polipeptid koji sadrži bilo koju od aminokiselinskih sekvenci čiji su ID brojevi 5, 26 ili 27, ili koji sadrži njihov aktivni fragment koji poseduje aktivnost a-glikozidaze.
39. Ekspresiona kaseta, naznačena time što sadrži polinukleotid koji kodira polipeptid koji sadrži bilo koju od aminokiselinskih sekvenci čiji su ID brojevi 18, 20, 28. 29, 30. 38. 40. 42 ili 44, ili koji sadrži njihov aktivni fragment koji poseduje aktivnost izomeraze glukoze.
40. Ekspresiona kaseta, naznačena time što sadrži polinukleotid koji kodira polipeptid koji sadrži bilo koju od aminokiselinskih sekvenci čiji su ID brojevi 45, 47 ili 49, ili koji sadrži njihov aktivni fragment koji poseduje aktivnost glukoamilaze.
41. Vektor, naznačen time što sadrži ekspresionu kasetu prema zahtevu 16.
42. Vektor, naznačen time što sadrži ekspresionu kasetu prema bilo kome od zahteva 30 do 40.
43. Ćelija, naznačena time što sadrži ekspresionu kasetu prema zahtevu 16.
44. Ćelija, naznačena time što sadrži ekspresionu kasetu prema bilo kome od zahteva 30 do 40.
45. Ćelija prema zahtevu 44, naznačena time što je izabrana iz grupe koju čineAgrobacterium,ćelija monokotiledone biljke, ćelija dikotiledone biljke, ćelija Liliopsida, ćelija Panicoideae, ćelija kukuruza i ćelija žitarice.
46. Ćelija prema zahtevu 45, naznačena time što pomenuta ćelija je ćelija kukuruza.
47. Ćelija prema zahtevu 45, naznačena time što je izabrana iz grupe koju čineAgrobacterium,ćelija monokotiledone biljke, ćelija dikotiledone biljke, ćelija Liliopsida, ćelija Panicoideae, ćelija kukuruza i ćelija žitarice.
48. Ćelija prema zahtevu 47, naznačena time što pomenuta ćelija je ćelija kukuruza.
49. Biljka, naznačena time štoje stabilno transformisana vektorom prema zahtevu 41.
50. Biljka, naznačena time štoje stabilno transformisana vektorom prema zahtevu 42.
51. Biljka, naznačena time štoje stabilno transformisana vektorom koji sadrži a-amilazu sa aminokiselinskom sekvencom identičnom sa bilo kojom od sekvenci čiji su ID brojevi 1, 10, 13, 14, 15, 16, 33 ili 35, ili koja je kodirana polinukleotidom koji sadrži bilo koju od sekvenci čiji su ID brojevi 2 ili 9.
52. Biljka prema zahtevu 51, naznačena time što pomenuta a-amilaza je hipertermofilna.
53. Biljka, naznačena time što je stabilno transformisana vektorom koji sadrži gen za pululanazu i koji poseduje aminokiselinsku sekvencu identičnu bilo kojoj od sekvenci čiji su ID brojevi 24 ili 34, ili koja je kodirana polinukleotidom koji sadrži bilo koju od sekvenci čiji su ID brojevi 4 ili 25.
54. Biljka, naznačena time što je stabilno transformisana vektorom koji sadrži gen za ct-glukozidazu i koji poseduje aminokiselinsku sekvencu identičnu bilo kojoj od sekvenci čiji su ID brojevi 26 ili 27, ili koja je kodirana polinukleotidom koji sadrži sekvencu čiji je ID broj 6.
55. Biljka prema zahtevu 54. naznačena time što pomenuta a-glukozidaza je hipertermofilna.
56. Biljka, naznačena time što je stabilno transformisana vektorom koji sadrži gen za izomerazu glukoze, koji poseduje aminokiselinsku sekvencu identičnu bilo kojoj od sekvenci čiji su ID brojevi 18, 20, 28, 29, 30, 38, 40, 42, pr 44, ili aminokiselinsku sekvencu koja je kodirana polinukleotidom koji sadrži bilo koju od sekvenci čiji su ID brojevi 19, 21, 37. 39.
41 ili 43.
57. Biljka prema zahtevu 56, naznačena time što pomenuta izomeraza glukoza je hipertermofilna.
58. Biljka, naznačena time što je stabilno transformisana vektorom koji sadrži gen za glukoamilazu, koja poseduje aminokiselinsku sekvencu identičnu bilo kojoj od sekvenci čiji su ID brojevi 45, 47 ili 49. ili aminokiselinsku sekvencu koja je kodirana polinukleotidom koji sadrži bilo koju od sekvenci čiji su ID brojevi 46. 48, 50 ili 59.
59. Biljka prema zahtevu 58, naznačena time što pomenuta glukoamilaza je hipertermofilna.
60. Seme, plod ili zrno biljke prema zahtevu 49.
61. Seme, plod ili zrno biljke prema zahtevu 50.
62. Seme, plod ili zrno biljke prema zahtevu 51.
63. Seme, plod ili zrno biljke prema zahtevu 53.
64. Seme, plod ili zrno biljke prema zahtevu 54.
65. Seme.plod ili zrno biljke prema zahtevu 56.
66. Seme. plod ili zrno biljke prema zahtevu 58.
67. Transformisana biljka, naznačena time što je njen genom pojačan rekombinantnim polinukleotidom koji kodira barem jedan enzim za prerađivanje koji je operativno povezan sa promoterskom sekvencom, pri čemu je sekvenca polinukleotida optimizovana za ekspresiju u biljci.
68. Biljka prema zahtevu 67, naznačena time štoje monokotiledona biljka.
69. Biljka prema zahtevu 68, naznačena time što monokotiledona biljka je kukuruz.
70. Biljka prema zahtevu 67, naznačena time što je dikotiledona biljka.
71. Biljka prema zahtevu 67, naznačena time što pomenuta biljka je žitarica ili biljka koja se komercijalno uzgaja.
72. Biljka prema zahtevu 67, naznačena time što je enzim za prerađivanje izabran iz grupe koju čine a-amilaza, glukoamilaza, izomeraza glukoze, glukanaza, p-amilaza, a-glukozidaza, izoamilaza, pululanaza. neo-pululanaza, izo-pululanaza. amilopululanaza. celulaza. egzo-1.4-(3-celobiohidrolaza, egzo-l,3-(3-D-glukanaza, (3-glukozidaza, endoglukanaza, L-arabinaza. a-arabinozidaza, galaktanaza, mananaza, ksilanaza, ksilozidaza, proteaza, glukanaza, ksilanaza, esteraza, fitaza i lipaza.
73. Biljka prema zahtevu 72, naznačena time što enzim za prerađivanje predstavlja enzim za prerađivanje škroba izabran iz grupe koju čine a-amilaza, glukoamilaza, izomeraza glukoze, P-amilaza, a-glukozidaza, izoamilaza, pululanaza, neo-pululanaza, izo-pululanaza i amilopululanaza.
74. Biljka prema zahtevu 73, naznačena time što je enzim izabran iz grupe koju čine a-amilaza, glukoamilaza, izomeraza glukoze, a-glukozidaza i pululanaza.
75. Biljka prema zahtevu 74, naznačena time štoje enzim hipertermofilan.
76. Biljka prema zahtevu 72, naznačena time što enzim za prerađivanje predstavlja enzim koji ne razgrađuje škrob i koji je izabran iz grupe koju čine proteaza. glukanaza. ksilanaza. esteraza, fitaza i lipaza.
77. Biljka prema zahtevu 76, naznačena time štoje enzim hipertermofilan.
78. Biljka prema zahtevu 67. naznačena time što se enzim akumulira u vakuoli. endoplazmatskom retikulumu, hloroplastu, granuli škroba, semenu ili ćelijskom zidu biljke.
79. Biljka prema zahtevu 78, naznačena time što se enzim akumulira u endoplazmatskom retikulumu.
80. Biljka prema zahtevu 78, naznačena time što se enzim akumulira u granuli škroba.
81. Biljka prema zahtevu 67, naznačena time štoje njen genom dodatno pojačan drugim rekombinantnim polinukleotidom koji sadrži gen za enzim koji nije hipertermofilan.
82. Transformisana biljka, naznačena time što je njen genom pojačan rekombinantnim polinukleotidom koji kodira barem jedan enzim za prerađivanje izabran iz grupe koju čine a-amilaza, glukoamilaza, izomeraza glukoze, a-glukozidaza i pululanaza. a koji je operativno povezan sa promoterskom sekvencom, pri čemu je polinukleotid ove sekvence optimizovan za ekspresiju u biljci.
83. Transformisana biljka prema zahtevu 82, naznačena time što je enzim za prerađivanje hipertermofilan.
84. Transformisana biljka prema zahtevu 82, naznačena time što pomenuta biljka je kukuruz.
85. Transformisana biljka kukuruza, naznačena time što je njen genom pojačan rekombinantnim polinukleotidom koji kodira barem jedan enzim za prerađivanje izabran iz grupe koju čine a-amilaza, glukoamilaza, izomeraza glukoze, a-glukozidaza i pululanaza, a koji je operativno povezan sa promoterskom sekvencom, pri čemu je polinukleotid ove sekvence optimizovan za ekspresiju u biljci kukuruza.
86. Transformisana biljka kukuruza prema zahtevu 85. naznačena time što je enzim za prerađivanje hipertermofilan.
87. Transformisana biljka, naznačena time što je njen genom pojačan rekombinantnim polinukleotidom koji poseduje sekvencu čiji je ID broj 2. 9 ili 52 i koji je operativno povezan sa promoterskom i signalnom sekvencom.
88. Transformisana biljka, naznačena time što je njen genom pojačan rekombinantnim polinukleotidom koji poseduje sekvencu čiji je ID broj 4 ili 25 i koji je operativno povezan sa promoterskom i signalnom sekvencom.
89. Transformisana biljka, naznačena time što je njen genom pojačan rekombinantnim polinukleotidom koji poseduje sekvencu čiji je ID broj 6 i koji je operativno povezan sa promoterskom i signalnom sekvencom.
90. Transformisana biljka, naznačena time što je njen genom pojačan rekombinantnim polinukleotidom koji poseduje sekvencu čiji je ID broj 19, 21, 37. 39, 41 ili 43.
91. Transformisana biljka, naznačena time što je njen genom pojačan rekombinantnim polinukleotidom koji poseduje sekvencu čiji je ID broj 46, 48, 50 ili 59.
92. Proizvod transformisane biljke prema zahtevu 82.
93. Proizvod transformisane biljke prema zahtevu 85.
94. Proizvod transformisane biljke prema bilo kome od zahteva 87 do 91.
95. Proizvod prema zahtevu 92, naznačen time što pomenuti proizvod je seme, plod ili zrno.
96. Proizvod prema zahtevu 92, naznačen time što pomenuti proizvod je enzim za prerađivanje, škrob ili šećer.
97. Biljka, naznačena time štoje dobijena od biljke prema zahtevu 82.
98. Biljka, naznačena time štoje dobijena od biljke prema zahtevu 85.
99. Biljka, naznačena time štoje dobijena od biljke prema bilo kome od zahteva 87 do 91.
100. Biljka prema zahtevu 97, naznačena time što pomenuta biljka je hibridna biljka.
101. Biljka prema zahtevu 98, naznačena time što pomenuta biljka je hibridna biljka.
102. Biljka prema zahtevu 99, naznačena time što pomenuta biljka je hibridna biljka.
103. Biljka prema zahtevu 97, naznačena time što pomenuta biljka je biljka potomak.
104. Biljka prema zahtevu 98, naznačena time što pomenuta biljka je biljka potomak.
105. Biljka prema zahtevu 99, naznačena time što pomenuta biljka je biljka potomak.
106. Preparat škroba, naznačen time što sadrži bar jedan enzim za prerađivanje izabran iz grupe koju čine proteaza, glukanaza ili esteraza.
107. Škrobni preparat prema zahtevu 106, naznačen time što je pomenuti enzim hipertermofilan.
108. Zrno, naznačeno time što sadrži barem jedan enzim za prerađivanje i to a-amilazu, pululanazu, a-glikozidazu, glukoamilazu ili izomerazu glukoze.
109. Zrno prema zahtevu 108, naznačen time štoje pomenuti enzim hipertermofilan.
110. Postupak za dobijanje granula škroba, naznačen time što obuhvata: a) tretiranje zrna koje sadrži bar jedan enzim koji ne prerađuje škrob u uslovima u kojima se aktivira barem jedan enzim, dobijanje smeše koja sadrži granule škroba i proizvode razgradnje koji se razlikuju od škroba, pri čemu se zrno dobija od transformisane biljke čiji je genom pojačan eksprsionom kasetom koja kodira barem jedan enzim; i b) razdvajanje granula škroba iz smeše.
111. Postupak prema zahtevu 1 10, naznačen time što pomenuti enzim je proteaza, glukanaza. ksilanaza. fitaza ili esteraza.
1 12. Postupak prema zahtevu 111, naznačen time štoje pomenuti enzim hipertermofilan.
1 13. Postupak prema zahtevu I 10. naznačen time što pomenuto zrno je usitnjeno zrno.
114. Postupak prema zahtevu 110, naznačen time štoje zrno tretirano u uslovima niske vlažnosti.
115. Postupak prema zahtevu 110, naznačen time što je zrno tretirano u uslovima visoke vlažnosti.
116. Postupak prema zahtevu 1 10, naznačen time štoje zrno tretirano sumpor dioksidom.
117. Postupak prema zahtevu 110, naznačen time što dodatno obuhvata izdvajanje iz smeše onih proizvoda koji ne predstavljaju škrob.
118. Škrob, naznačen time štoje dobijen postupkom prema zahtevu 110.
119. Škrob, naznačen time štoje dobijen postupkom prema zahtevu 112.
120. Neskrobni proizvodi, naznačeni time što su dobijeni postupkom prema zahtevu 110.
121. Neskrobni proizvodi, naznačeni time što su dobijeni postupkom prema zahtevu 1 12.
122. Postupak za dobijanje hiperslatkog kukuruza, naznačen time što obuhvata tretiranje transformisanog kukuruza ili njegovog dela, čiji je genom pojačan ekspresionom kasetom koja se eksprimira u endospermu i koja kodira barem jedan enzim koji razgrađuje ili vrši izomerizaciju škroba, u uslovima koji aktiviraju barem jedan enzim, tako da se polisaharidi u kukuruzu prevode u šećere, pri čemu se dobija hiperslatki kukuruz.
123. Postupak prema zahtevu 122, naznačen time što ekspresiona kaseta dodatno sadrži promoter koji je operativno povezan sa polinukleotidom koji kodira enzim.
124. Postupak prema zahtevu 123, naznačen time što pomenuti promoter je konstitutivni promoter.
125. Postupak prema zahtevu 123, naznačen time što pomenuti promoter je promoter specifičan za seme.
126. Postupak prema zahtevu 123, naznačen time što pomenuti promoter je promoter specifičan za endosperm.
127. Postupak prema zahtevu 123, naznačen time štoje enzim hipertermofilan.
128. Postupak prema zahtevu 127, naznačen time što pomenuti enzim je a-amilaza.
129. Postupak prema zahtevu 122, naznačen time što ekspresiona kaseta dodatno sadrži polinukleotid koji kodira signalnu sekvencu operativno povezanu sa barem jednim enzimom.
130. Postupak prema zahtevu 129, naznačen time što signalna sekvenca usmerava hipertermofilni enzim ka apoplastu.
131. Postupak prema zahtevu 129, naznačen time što signalna sekvenca usmerava hipertermofilni enzim ka endoplazmatskom retikulumu.
132. Postupak prema zahtevu 122, naznačen time što enzim sadrži bilo koju od sekvenci čiji su ID brojevi 13, 14, 15, 16, 33 ili 35.
133. Postupak za dobijanje hiperslatkog kukuruza, naznačen time što obuhvata tretiranje transformisanog kukuruza ili njegovog dela, čiji je genom pojačan ekspresionom kasetom koja se eksprimira u endospermu i koja kodira a-amilazu, u uslovima koji aktiviraju barem jedan enzim, tako da se polisaharidi u kukuruzu prevode u šećere, pri čemu se dobija hiperslatki kukuruz.
134. Postupak prema zahtevu 133, naznačen time štoje enzim hipertermofilan.
135. Postupak prema zahtevu 134. naznačen time što hipertermofilna a-amilaza poseduje aminokiselinsku sekvencu koja je identična bilo kojoj od sekvenci čiji su ID brojevi 10, 13, 14. 15. 16, 33 ili 35, ili njihovom enzimski aktivnom segmentu koji poseduje aktivnost a-amilaze.
136. Postupak prema zahtevu 134, naznačen time što ekspresiona kaseta sadrži polinukleotid koji je izabran iz grupe koju čine sekvence čiji je ID broj 2, 9 ili 52, njima komplementarne sekvence ili polinukleotid koji hibridizuje sa bilo kojom od sekvenci čiji su ID brojevi 2, 9 ili 52 u uslovima slabo precizne hibridizacije i koji kodiraju polipeptid koji ima aktivnost a-amilaze.
137. Postupak za dobijanje rastvora proizvoda hidrolize škroba, naznačen time što obuhvata: a) tretiranje dela biljke koji sadrži granule škroba barem jednim enzimom za prerađivanje u uslovima u kojima se aktivira barem jedan enzim, pri čemu se granule škroba prerađuju i čime se stvara vodeni rastvor koji sadrži proizvod hidrolize škroba, pri čemu se deo biljke dobija od transformisane biljke čiji je genom pojačan ekspresionom kasetom koja kodira barem jedan enzim za prerađivanje škroba; i b) prikupljanje vodenog rastvora koji sadrži proizvod hidrolize škroba.
138. Postupak prema zahtevu 137, naznačen time što proizvod hidrolize škroba može da sadrži dekstrin, maltooligosaharid, šećer i/ili njihovu smešu.
139. Postupak prema zahtevu 137, naznačen time što enzim je a-amilaza, a-glukozidaza, glukoamilaza, pululanaza, amilopululanaza, izomeraza glukoze, P-amilaza, izoamilaza, neopululanaza, izo-pululanaza ili bilo koja njihova smeša.
140. Postupak prema zahtevu 137, naznačen time štoje bar jedan od enzima za prerađivanje hipertermofilan.
141. Postupak prema zahtevu 139, naznačen time štoje bar jedan od enzima za prerađivanje hipertermofilan.
142. Postupak prema zahtevu 137. naznačen time što genom dela biljke je dodatno pojačan ekspresionom kasetom koja kodira ne-hipertermofilni enzim za prerađivanje škroba.
143. Postupak prema zahtevu 142, naznačen time što je ne-hipertermofilni enzim za prerađivanje škroba izabran iz grupe koju čine amilaza. glukoamilaza, a-glukozidaza. pululanaza. izomeraza glukoze, ili njihova kombinacija.
144. Postupak prema zahtevu 137, naznačen time štoje bar jedan enzim za prerađivanje eksprimiran u endospermu.
145. Postupak prema zahtevu 137, naznačen time što pomenuti deo biljke je zrno.
146. Postupak prema zahtevu 137, naznačen time što pomenuti deo biljke potiče od kukuruza, pšenice, ječma, raži, ovsa, šećerne trske ili pirinča.
147. Postupak prema zahtevu 137, naznačen time štoje bar jedan od enzima za prerađivanje operativno povezan sa promoterskom i signalnom sekvencom koja usmerava enzim ka granuli škroba, endoplazmatskom retikulumu, ili ćelijskom zidu.
148. Postupak prema zahtevu 137, naznačen time što dodatno obuhvata izolovanje proizvoda hidrolize škroba.
149. Postupak prema zahtevu 137, naznačen time što dodatno obuhvata fermentaciju proizvoda hidrolize škroba.
150. Postupak za dobijanje proizvoda hidrolize škroba, naznačen time što obuhvata: a) tretiranje dela biljke koji sadrži granule škroba barem jednim enzimom za prerađivanje škroba u uslovima u kojima se aktivira barem jedan enzim, pri čemu se granule škroba prerađuju i čime se stvara vodeni rastvor koji sadrži proizvod hidrolize škroba, pri čemu se deo biljke dobija od transformisane biljke čiji je genom pojačan ekspresionom kasetom koja kodira barem jednu a-amilazu; i b) prikupljanje vodenog rastvora koji sadrži proizvod hidrolize škroba.
151. Postupak prema zahtevu 150, naznačen time štoje a-amilaza hipertermofilna.
152. Postupak prema zahtevu 151. naznačen time što hipertermofilna a-amilaza ima aminokiselinsku sekvencu koja je identična bilo kojoj od sekvenci čiji je ID broj 1. 10, 13. 14.
15. 16. 33 ili 35. ili aktivnom fragmentu ovih sekvenci koji poseduje aktivnost a-amilaze.
153. Postupak prema zahtevu 151. naznačen time što ekspresiona kaseta sadrži polinukleotid koji je izabran iz grupe koju čine sekvence čiji je ID broj 2. 9, 46 ili 52, njima komplementarne sekvence ili polinukleotid koji hibridizuje sa bilo kojom od sekvenci čiji su ID brojevi 2, 9, 46 ili 52 u uslovima slabo precizne hibridizacije i koji kodiraju polipeptid koji ima aktivnost a-amilaze.
154. Postupak prema zahtevu 150, naznačen time što genom transformisane biljke dodatno sadrži polinukleotid koji kodira netermofilni enzim za prerađivanje škroba.
155. Postupak prema zahtevu 150, naznačen time što dodatno obuhvata tretiranje biljke ne-hipertermofilnim enzimom za prerađivanje škroba.
156. Deo transformisane biljke koji sadrži barem jedan enzim za prerađivanje škroba koji je prisutan u ćelijama biljke, naznačen time što se pomenuti biljni deo dobija od transformisane biljke čiji je genom pojačan ekspresionom kasetom koja kodira barem jedan enzim za prerađivanje škroba.
157. Deo biljke prema zahtevu 156, naznačen time što pomenuti enzim predstavlja enzim za prerađivanje škroba koji je izabran iz grupe koju čine a-amilaza, glukoamilaza, izomeraza glukoze, p-amilaza, a-glukozidaza, izoamilaza, pululanaza, neo-pululanaza, izo-pululanaza i amilopululanaza.
158. Deo biljke prema zahtevu 156, naznačen time što je enzim hipertermofilan.
159. Deo biljke prema zahtevu 156, naznačen time što pomenuta biljka je kukuruz.
160. Deo transformisane biljke, naznačen time što sadrži barem jedan enzim za prerađivanje koji ne prerađuje škrob, a koji je prisutan u ćelijskom zidu ili ćelijama biljke, pri čemu se taj biljni deo dobija od transformisane biljke čiji je genom pojačan ekspresionom kasetom koja kodira barem jedan enzim za prerađivanje koji ne prerađuje škrob ili barem jedan enzim za prerađivanje polisaharida koji ne prerađuje škrob.
161. Deo biljke prema zahtevu 160. naznačen time što je enzim hipertermofilan.
162. Deo biljke prema zahtevu 160, naznačen time što je enzim za prerađivanje koji ne prerađuje škrob izabran iz grupe koju čine proteaza, glukanaza. ksilanaza, esteraza. fitaza i lipaza.
163. Deo biljke prema zahtevu 156 ili 160, naznačen time što pomenuti deo biljke je izdanak, seme, plod, zrno, mahuna, pleva ili pleva od šećerne trske.
164. Deo transformisane biljke, naznačen time što sadrži a-amilazu čija je aminokiselinska sekvenca identična bilo kojoj od sekvenci čiji je ID broj 1, 10, 13, 14, 15, 16, 33 ili 35, ili čija je aminokiselinska sekvenca kodirana polinukleotidom koji sadrži bilo koju od sekvenci sa ID brojem 2, 9, 46 ili 52.
165. Deo transformisane biljke, naznačen time što sadrži a-glukozidazu čija je aminokiselinska sekvenca identična bilo kojoj sekvenci čiji je ID broj 5. 26 ili 27. ili čija je aminokiselinska sekvenca kodirana polinukleotidom koji sadrži sekvencu sa ID brojem 6.
166. Deo transformisane biljke, naznačen time što sadrži izomerazu glukoze koja ima aminokiselinsku sekvencu identičnu bilo kojoj od sekvenci čiji je ID broj 28, 29, 30, 38, 40, 42 ili 44, ili čija je aminokiselinska sekvenca kodirana polinukleotidom koji sadrži bilo koju od sekvenci sa ID brojem 19, 21, 37, 39, 41 ili 43.
167. Deo transformisane biljke, naznačen time što sadrži glukoamilazu koja ima aminokiselinsku sekvencu čiji je ID broj 45, 47 ili 49, ili čija je aminokiselinska sekvenca kodirana polinukleotidom koji sadrži bilo koju od sekvenci sa ID brojem 46, 48, 50 ili 59.
168. Deo transformisane biljke, naznačen time što sadrži pululanazu koja je kodirana polinukleotidom koji sadrži bilo koju od sekvencai sa ID brojem 4 ili 25.
169. Postupak za prevođenje škroba u delu transformisane biljke prema zahtevu 156. naznačen time što obuhvata aktivaciju enzima za prerađivanje škroba sadržanog u tom delu.
170. Postupak za prevođenje škroba u proizvod izveden iz škroba u delu transformisane biljke prema bilo kome od zahteva 164-168, naznačen time što obuhvata aktivaciju enzima sadržanog u tom delu.
171. Škrob, dekstrin. maltooligosaharid ili šećer, naznačeni time što su dobijeni postupkom prema zahtevu 169.
172. Škrob, dekstrin, maltooligosaharid ili šećer, naznačeni time što su dobijeni postupkom prema zahtevu 170.
173. Postupak za korišćenje dela transformisane biljke koji u ćelijskom zidu ili u ćeliji tog biljnog dela sadrži barem jedan enzim za prerađivanje koji ne prerađuje škrob, naznačen time što obuhvata: a) tretiranje dela transformisane biljke koji sadrži barem jedan enzim za prerađivanje polisaharida koji ne prerađuje škrob u uslovima koji omogućavaju da barem jedan enzim bude aktiviran, pri čemu se razgrađuje polisaharid koji se razlikuje od škroba, čime se dobija vodeni rastvor koji sadrži oligosaharid i/ili šećere, pri čemu se biljni deo dobija od transformisane biljke čiji je genom pojačan ekspresionom kasetom koja kodira barem jedan enzim za prerađivanje polisaharida koji ne prerađuje škrob; i b) prikupljanje vodenog rastvora koji sadrži oligosaharide i/ili šećere.
174. Postupak prema zahtevu 173, naznačen time što enzim za prerađivanje polisaharida koji ne prerađuje škrob je hipertermofilan.
175. Postupak za korišćenje semena transformisane biljke koja sadrže barem jedan enzim za prerađivanje, naznačen time što obuhvata: a) tretiranje semena transformisane biljke koja sadrže barem jednu proteazu ili lipazu u uslovima koji omogućavaju da barem jedan enzim bude aktiviran, pri čemu se dobija vodena smeša koja sadrži aminokiseline i masne kiseline, pri čemu se seme dobija od transformisane biljke čiji je genom pojačan ekspresionom kasetom koja kodira barem jedan od enzima; i b) prikupljanje vodene smeše.
176. Postupak prema zahtevu 175, naznačen time što izdvajaju aminokiseline, masne kiseline ili obe vrste supstanci.
177. Postupak prema zahtevu 175, naznačen time što bilo proteaza ili lipaza je hipertermofilan enzim.
178. Postupak za dobijanje etanoia, naznačen time što obuhvata: a) tretiranje dela biljke koji sadrži bar jedan enzim za prerađivanje polisaharida pod uslovima pri kojima se aktivira bar jedan enzim, čime se razgrađuje polisaharid i obrazuje oligosaharid ili fermentabilni šećer, pri čemu se deo biljke dobija od transformisane biljke čiji je genom pojačan ekspresionom kasetom koja kodira barem jedan od enzima za prerađivanje polisaharida; i b) inkubaciju fermentabilnog šećera u uslovima koji podstiču prevođenje fermentabilnog šećera ili oligosaharida u etanol.
179. Postupak prema zahtevu 178, naznačen time što pomenuti deo biljke je zrno, plod, seme, stabljika, drvo, povrće ili koren.
180. Postupak prema zahtevu 178, naznačen time štoje pomenuti deo biljke dobijen iz biljke izabrane iz grupe koju čine ovas, ječam, pšenica, bobica, grožđe, raž, kukuruz, pirinač, krompir, šećerna repa, šećerna trska, ananas, trave i drveće.
181. Postupak prema zahtevu 178, naznačen time što enzim za prerađivanje polisaharida je a-amilaza, glukoamilaza, a-glukozidaza, izomeraza glukoze, pululanaza, ili njihova kombinacija.
182. Postupak prema zahtevu 178. naznačen time što enzim za prerađivanje polisaharida je hipertermofilan.
183. Postupak prema zahtevu 178. naznačen time što enzim za prerađivanje polisaharida je mezofilan.
184. Postupak prema zahtevu 181. naznačen time što enzim za prerađivanje polisaharida je hipertermofilan.
185. Postupak za dobijanje etanoia, naznačen time što obuhvata: a) tretiranje dela biljke koji sadrži barem jedan enzim izabran iz grupe koju čine a-amilaza. glukoamilaza, a-glukozidaza, izomeraza glukoze, pululanaza, ili njihova kombinacija, uz zagrevanje tokom određenog vremenskog perioda u uslovima u kojima se aktivira barem jedan od enzima, čime se polisaharid razgrađuje i čime se dobija fermentabilni šećer, pri čemu se biljni deo dobija od transformisane biljke čiji je genom pojačan ekspresionom kasetom koja kodira barem jedan od enzima; i b) inkubaciju fermentabilnog šećera u uslovima koji pospešuju prevođenje fermentabilnog šećera u etanol.
186. Postupak prema zahtevu 185, naznačen time štoje bar jedan od enzima hipertermofilan.
187. Postupak prema zahtevu 185, naznačen time štoje bar jedan od enzima mezofilan.
188. Postupak prema zahtevu 185, naznačen time što a-amilaza poseduje aminokiselinsku sekvencu identičnu bilo kojoj od sekvenci sa ID brojem 1, 10, 13, 14, 15, 16, 33 ili 35, ili pak sekvencu koju kodira polinukleotid koji sadrži sekvencu sa ID brojem 2 ili 9.
189. Postupak prema zahtevu 185, naznačen time što a-glukozidaza poseduje aminokiselinsku sekvencu identičnu bilo kojoj od sekvenci sa ID brojem 5, 26 ili 27, ili pak sekvencu koju kodira polinukleotid koji sadrži sekvencu sa ID brojem 6.
190. Postupak prema zahtevu 185, naznačen time što izomeraza glukoze poseduje aminokiselinsku sekvencu identičnu bilo kojoj od sekvenci sa ID brojem 28, 29, 30, 38, 40, 42 ili 44, ili pak sekvencu koju kodira polinukleotid koji sadrži bilo koju od sekvenci sa ID brojem 19, 21, 37, 39, 41 ili 43.
191. Postupak prema zahtevu 185. naznačen time što glukoamilaza poseduje aminokiselinsku sekvencu identičnu sekvenci sa ID brojem 45. ili pak sekvencu koju kodira polinukleotid koji sadrži bilo koju od sekvenci sa ID brojem 46, 48 ili 50.
192. Postupak prema zahtevu 185, naznačen time što pululanaza poseduje aminokiselinsku sekvencu identičnu bilo kojoj od sekvenci sa ID brojem 24 ili 34, ili pak sekvencu koju kodira polinukleotid koji sadrži bilo koju od sekvenci sa ID brojem 4 ili 25.
193. Postupak za dobijanje etanoia, naznačen time što obuhvata: a) tretiranje dela biljke koji sadrži barem jedan od enzima za prerađivanje koji ne prerađuju škrob u uslovima u kojima je aktiviran bar jedan enzim, pri čemu se razgrađuje polisaharid koji se razlikuje od škroba do oligosaharida i fermentabilnog šećera, pri čemu se deo biljke dobija od transformisane biljke čiji je genom pojačan ekspresionom kasetom koja kodira bar jedan enzim: i b) inkubaciju fermentabilnog šećera u uslovima koji pospešuju prevođenje fermentabilnog šećera u etanol.
194. Postupak prema zahtevu 193, naznačen time što enzim za prerađivanje koji ne prerađuje škrob je glukanaza, ksilanaza ili celulaza.
195. Postupak za dobijanje etanoia, naznačen time što obuhvata: a) tretiranje dela biljke koji sadrži bar jedan od enzima koji je izabran iz grupe koju čine a-amilaza, glukoamilaza, a-glukozidaza, izomeraza glukoze, pululanaza, ili njihova kombinacija, u uslovima u kojima se aktivira barem jedan od enzima, čime se polisaharid razgrađuje do fermentabilnog šećera, pri čemu se deo biljke dobija od transformisane biljke čiji je genom pojačan ekspresionom kasetom koja kodira bar jedan od enzima; i b) inkubaciju fermentabilnog šećera u uslovima koji pospešuju prevođenje fermentabilnog šećera u etanol.
196. Postupak prema zahtevu 195, naznačen time štoje bar jedan od enzima hipertermofilan.
197. Postupak za proizvodnju zaslađene brašnaste namirnice bez dodavanja dodatnog zaslađivača. naznačen time što obuhvata: a) tretiranje dela biljke koji sadrži bar jedan enzim za prerađivanje škroba, u uslovima u kojima se aktivira bar jedan enzim, pri čemu se granule škroba u delu biljke prerađuju u šećere, čime se dobija zaslađeni proizvod, pri čemu se deo biljke dobija od transformisane biljke čiji je genom pojačan ekspresionom kasetom koja kodira barem jedan od enzima; i b) prerađivanje zaslađenog proizvoda u brašnastu namirnicu.
198. Postupak prema zahtevu 197, naznačen time štoje brašnasta namirnica dobijena iz zaslađenog proizvoda i vode.
199. Postupak prema zahtevu 197, naznačen time što brašnasti proizvod može da sadrži slad. veštačku aromu, vitamine, minerale, veštačke boje ili bilo koju njihovu kombinaciju.
200. Postupak prema zahtevu 197, naznačen time štoje bar jedan enzim hipertermofilan.
201. Postupak prema zahtevu 197, naznačen time štoje enzim izabran iz grupe koju čine a-amilaza, a-glukozidaza, glukoamilaza, pululanaza, izomeraza glukoze, ili bilo koja njihova kombinacija.
202. Postupak prema zahtevu 197, naznačen time štoje biljka izabrana iz grupe koju čine soja, raž, ovas, ječam, pšenica, kukuruz, pirinač i šećerna trska.
203. Postupak prema zahtevu 197, naznačen time što brašnasti proizvod je namirnica od žitarica.
204. Postupak prema zahtevu 197, naznačen time što brašnasti proizvod je namirnica za doručak.
205. Postupak prema zahtevu 197, naznačen time što brašnasti proizvod je namirnica koja može odmah da se konzumira.
206. Postupak prema zahtevu 197, naznačen time što brašnasti proizvod je pečena namirnica.
207. Postupak prema zahtevu 197, naznačen time što obrada namirnice predstavlja pečenje, kuvanje. zagrevanje. pripremanje na pari, izlaganje električnom pražnjenju ili primena bilo koje kombinacije ovih postupaka.
208. Postupak za zaslađivanje proizvoda koji sadrži škrob, bez dodavanja zaslađivača, naznačen time što obuhvata: a) tretiranje škroba koji sadrži bar jedan od enzima za prerađivanje škroba u uslovima u kojima je aktiviran bar jedan enzim, čime se škrob razgrađuje do šećera i slatkog škroba, pri čemu se škrob dobija iz transformisane biljke čiji je genom pojačan ekspresionom kasetom koja kodira barem jedan od enzima; i b) dodavanje slatkog škroba u proizvod, kako bi se dobio proizvod koji sadrži zaslađeni škrob.
209. Postupak prema zahtevu 208, naznačen time što je transformisana biljka izabrana iz grupe koju čine kukuruz, soja, raž, ovas, ječam, pšenica, pirinač i šećerna trska.
210. Postupak prema zahtevu 208, naznačen time štoje bar jedan enzim hipertermofilan.
211. Postupak prema zahtevu 208, naznačen time što bar jedan enzim je a-amilaza, a-glukozidaza, glukoamilaza, pululanaza, izomeraza glukoze, ili bilo koja njihova kombinacija.
212. Brašnasta namirnica, naznačena time štoje dobijena postupkom prema zahtevu 197.
213. Proizvod koji sadrži zaslađeni škrob, naznačen time štoje dobijen postupkom prema zahtevu 208.
214. Postupak za zaslađivanje voća ili povrća koje sadrži polisaharide, naznačen time što obuhvata tretiranje voća ili povrća koje sadrži bar jedan enzim za prerađivanje polisaharida u uslovima u kojima se aktivira bar jedan enzim, čime se polisaharid iz voća ili povrća razgrađuje do šećera, pri čemu se dobija zaslađeno voće ili povrće, pri čemu se voće ili povrće dobija iz transformisane biljke čiji je genom pojačan ekspresionom kasetom koja kodira bar jedan od enzima za prerađivanje polisaharida.
215. Postupak prema zahtevu 214. naznačen time štoje voće ili povrće je izabrano iz grupe koju čine krompir. paradajz, banana, bundeva, grašak i pasulj.
216. Postupak prema zahtevu 214, naznačen time štoje bar jedan od enzima hipertermofilan.
217. Postupak prema zahtevu 214. naznačen time štoje enzim izabran iz grupe koju čine a-amilaza. a-glukozidaza, glukoamilaza, pululanaza, izomeraza glukoze, ili bilo koja njihova kombinacija.
218. Postupak za dobijanje vodenog rastvora koji sadrži šećer, naznačen time što obuhvata tretiranje granula škroba dobijenih iz dela biljke prema zahtevu 156. u uslovima u kojima se aktivira bar jedan enzim, čime se dobija vodeni rastvor koji sadrži šećer.
219. Postupak za dobijanje proizvoda izvedenih iz škroba dobijenog iz zrna. pri čemu postupak ne obuhvata vlažno ili suvo mlevenje pre izdvajanja proizvoda izvedenih iz škroba, naznačen time što obuhvata: a) tretiranje dela biljke koji sadrži granule škroba i bar jedan enzim za prerađivanje škroba u uslovima u kojima je bar jedan enzim aktiviran, čime se granule škroba prerađuju do vodenog rastvora koji sadrži dekstrine ili šećere, pri čemu se deo biljke dobija od transformisane biljke čiji je genom pojačan ekspresionom kasetom koja kodira bar jedan od enzima koji prerađuju škrob; i b) prikupljanje vodenog rastvora koji sadrži proizvod izveden iz škroba.
220. Postupak prema zahtevu 219, naznačen time štoje bar jedan enzim za prerađivanje škroba hipertermofilan.
221. Postupak izolovanja a-amilaze, glukoamilaze, izomeraze glukoze, a-glukozidaze i pululanaze, naznačen time što obuhvata kultivaciju transformisane biljke prema zahtevu 82 i izolovanje a-amilaze, glukoamilaze. izomeraze glukoze, a-glukozidaze. pululanaze iz te biljke.
222. Postupak prema zahtevu 221. naznačen time što su a-amilaza, glukoamilaza. izomeraza glukoze, a-glukozidaza i pululanaza hipertermofilne.
223. Postupak za dobijanje maltodekstrina, naznačen time što obuhvata: a) mešanje transgene žitarice sa vodom; b) zagrevanje pomenute smeše; c) razdvajanje čvrstog ostatka od nastalog dekstrinskog sirupa dobijenog pod b) i d) prikupljanje maltodekstrina.
224. Postupak prema zahtevu 223, naznačen time što transgena žitarica sadrži bar jedan enzim za prerađivanje škroba.
225. Postupak prema zahtevu 224, naznačen time što enzim za prerađivanje škroba je a-amilaza, glukoamilaza, a-glukozidaza i izomeraza glukoze.
226. Postupak prema zahtevu 225, naznačen time štoje bar jedan od enzima za prerađivanje škroba hipertermofilan.
227. Maltodekstrin, naznačen time štoje dobijen postupkom prema bilo kome od zahteva 223 do 226.
228. Preparat maltodekstrina, naznačen time štoje dobijen postupkom prema bilo kome od zahteva 223 do 226.
229. Postupak za dobijanje dekstrina ili šećera iz žitarice, koji ne podrazumeva mehaničku disrupciju zrna pre izdvajanja derivata škroba, naznačen time što obuhvata: a) tretiranje biljnog dela koji sadrži granule škroba i bar jedan enzim za prerađivanje škroba u uslovima u kojima je bar jedan od enzima aktivan, pri čemu se granule škroba prerađuju do vodenog rastvora koji sadrži dekstrine ili šećere, pri čemu se biljni deo dobija od transformisane biljke čiji je genom pojačan ekspresionom kasetom koja kodira bar jedan od enzima: i b) prikupljanje vodenog rastvora koji sadrži šećer i/ili dekstrine.
230. Postupak prema zahtevu 229, naznačen time što enzim za prerađivanje škroba je a-amilaza. glukoamilaza, a-glukozidaza i izomeraza glukoze.
23 1. Postupak za dobijanje fermentabilnog šećera, naznačen time što obuhvata: a) tretiranje biljnog dela koji sadrži granule škroba i bar jedan enzim za prerađivanje škroba u uslovima u kojima je bar jedan od enzima aktivan, pri čemu se granule škroba prerađuju do vodenog rastvora koji sadrži dekstrine ili šećere, pri čemu se biljni deo dobija od transformisane biljke čiji je genom pojačan ekspresionom kasetom koja kodira barem jedan od enzima; i b) prikupljanje vodenog rastvora koji sadrži fermentabilni šećer.
232. Postupak prema zahtevu 249, naznačen time što enzim za prerađivanje škroba je a-amilaza, glukoamilaza, a-glukozidaza i izomeraza glukoze.
233. Biljka kukuruza, naznačena time štoje stabilno transformisana vektorom koji kodira hipertermofilnu a-amilazu.
234. Biljka kukuruza, naznačena time što je stabilno transformisana vektorom koji sadrži polinukleotidnu sekvencu koja kodira a-amilazu koja poseduje stepen identičnosti veći od 60% sa sekvencom čiji je ID broj 1 ili 51.
YU18304A 2001-08-27 2002-08-27 Biljke i delovi biljaka sa sposobnošću samoprerađivanja RS18304A (sr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US31528101P 2001-08-27 2001-08-27
PCT/US2002/027129 WO2003018766A2 (en) 2001-08-27 2002-08-27 Self-processing plants and plant parts

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS18304A true RS18304A (sr) 2006-10-27

Family

ID=23223692

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
YU18304A RS18304A (sr) 2001-08-27 2002-08-27 Biljke i delovi biljaka sa sposobnošću samoprerađivanja

Country Status (17)

Country Link
US (4) US7102057B2 (sr)
EP (1) EP1432798B1 (sr)
JP (1) JP2005503153A (sr)
KR (1) KR20040029122A (sr)
CN (2) CN1821412A (sr)
AR (2) AR036370A1 (sr)
AT (1) ATE488585T1 (sr)
AU (1) AU2002332666B2 (sr)
BR (1) BR0212170A (sr)
CA (1) CA2457477C (sr)
DE (1) DE60238339D1 (sr)
HU (1) HU228266B1 (sr)
MX (1) MXPA04001802A (sr)
RS (1) RS18304A (sr)
RU (1) RU2312144C2 (sr)
WO (1) WO2003018766A2 (sr)
ZA (1) ZA200401480B (sr)

Families Citing this family (99)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE299941T1 (de) * 1996-09-12 2005-08-15 Syngenta Participations Ag Cellulolytische enzyme-exprimierende transgene pflanzen
US7612251B2 (en) 2000-09-26 2009-11-03 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Nucleotide sequences mediating male fertility and method of using same
US7659102B2 (en) 2001-02-21 2010-02-09 Verenium Corporation Amylases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
ATE510023T1 (de) 2001-02-21 2011-06-15 Verenium Corp Enzyme mit alpha-amylase-aktivität und verfahren zu deren verwendung
AR036370A1 (es) 2001-08-27 2004-09-01 Syngenta Participations Ag Plantas con auto-procesamiento y partes de las mismas
US8558058B2 (en) * 2001-12-06 2013-10-15 Applied Biotechnology Institute Monocotyledonous seed expressing exo-1,4B-glucanase
WO2003056904A2 (en) 2002-01-08 2003-07-17 Raab Michael R Transgenic plants expressing civps or intein modified proteins and related method
AU2003205556A1 (en) * 2002-02-14 2003-09-04 Novozymes A/S Process for producing starch hydrolysate
US7741092B2 (en) * 2002-10-31 2010-06-22 Verenium Corporation Amylases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
SE0400565D0 (sv) * 2004-03-07 2004-03-07 Doris Staahle Reglering av teleskopiskt rörliga element
AU2004229313B2 (en) * 2003-03-06 2010-08-19 Basf Enzymes Llc Amylases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
AU2004219649A1 (en) * 2003-03-10 2004-09-23 Broin And Associates, Inc. Method for producing ethanol using raw starch
US7667096B2 (en) 2003-06-03 2010-02-23 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Conditional sterility in plants
ES2517245T3 (es) 2003-06-25 2014-11-03 Novozymes A/S Enzimas para el tratamiento de almidón
BRPI0411994B1 (pt) * 2003-06-27 2020-01-28 Monsanto Technology Llc molécula de ácido nucléico codificando proteínas úteis para aumentar os níveis de óleo em plantas, cassete de expressão e método de produzir uma planta tendo níveis aumentados de produção de óleo
US7491811B2 (en) * 2004-01-15 2009-02-17 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Repressor-mediated tissue-specific gene expression in plants
US7855323B2 (en) * 2004-02-10 2010-12-21 Monsanto Technology Llc Recombinant DNA for gene suppression
CN1950510B (zh) * 2004-03-08 2011-10-05 先正达合作有限公司 富含谷氨酰胺的玉米种子蛋白质和启动子
JP2007527726A (ja) * 2004-03-08 2007-10-04 シンジェンタ パーティシペーションズ アクチェンゲゼルシャフト 自己プロセシング植物および植物部分
WO2005099440A2 (en) * 2004-04-13 2005-10-27 John Burr, Iii Methods for recovering products from plants
CN101023175B (zh) * 2004-04-20 2012-02-29 辛根塔参与股份公司 用于在植物繁殖组织中表达基因产物的调控序列
CA2567272A1 (en) * 2004-05-19 2005-12-01 Agrivida, Inc. Transgenic plants expressing intein modified proteins and associated processes for bio-pharmaceutical production
US7662918B2 (en) * 2005-03-03 2010-02-16 Simpson Biotech Co., Ltd. Recombinant protein comprising starch binding domain and use thereof
MX2007010036A (es) * 2005-03-16 2007-10-04 Syngenta Participations Ag Maiz evento 3272 y metodos para la deteccion del mismo.
US7919289B2 (en) 2005-10-10 2011-04-05 Poet Research, Inc. Methods and systems for producing ethanol using raw starch and selecting plant material
US20070269820A1 (en) * 2005-12-16 2007-11-22 Syngenta Participations Ag Methods for the detection of nucleic acid encoding ALPHA-amylase
CA2643809A1 (en) 2006-02-27 2007-09-07 Edenspace Systems Corporation Energy crops for improved biofuel feedstocks
US7968318B2 (en) 2006-06-06 2011-06-28 Genencor International, Inc. Process for conversion of granular starch to ethanol
EP2038408A1 (en) * 2006-06-22 2009-03-25 Novozymes A/S Preparation of dough and baked products
CN103397043A (zh) 2006-08-04 2013-11-20 维莱尼姆公司 葡聚糖酶、编码它们的核酸及制备和使用它们的方法
EP2617822A3 (en) 2006-09-21 2013-10-16 Verenium Corporation Phytases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
CN101605809A (zh) * 2006-10-31 2009-12-16 善笙生物科技股份有限公司 淀粉吸附区域及其用途
US8062872B2 (en) * 2006-11-01 2011-11-22 Inland Environmental Resources, Inc. Methods and compositions for optimizing fermentation
MX2009006782A (es) * 2006-12-21 2009-09-21 Verenium Corp Amilasas y glucoamilasas, acidos nucleicos que las codifican y metodos para formarlas y usarlas.
JP2010516296A (ja) 2007-01-30 2010-05-20 ヴェレニウム コーポレイション リグノセルロース性物質を処理する酵素、前記をコードする核酸並びに前記を製造及び使用する方法
CN101742901A (zh) * 2007-06-01 2010-06-16 先正达参股股份有限公司 商业生产转基因植物的方法
WO2008150880A1 (en) * 2007-06-01 2008-12-11 Syngenta Participations Ag Process for starch liquefaction and fermentation
US7915020B2 (en) * 2007-06-01 2011-03-29 Syngenta Participations Ag Process for starch liquefaction and fermentation
US7727726B2 (en) * 2007-06-01 2010-06-01 Syngenta Participations Ag Process for starch liquefaction and fermentation
US20090047385A1 (en) * 2007-08-15 2009-02-19 The Quaker Oats Company Natural oat-derived sweetener
EP2201127B1 (en) * 2007-10-12 2015-03-18 Archer-Daniels-Midland Company Increased fiber hydrolysis by protease addition
CA2706805A1 (en) * 2007-11-27 2009-06-04 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Plants with modified starch metabolism
US20090205075A1 (en) * 2008-01-30 2009-08-13 Stacy Miles Use of plastid transit peptides derived from glaucocystophytes
CA2713451A1 (en) * 2008-02-04 2009-08-13 Danisco Us Inc. Variants of bacillus stearothermophilus alpha-amylase and uses thereof
US9816119B2 (en) * 2008-02-29 2017-11-14 Syngenta Participations Ag Methods for starch hydrolysis
WO2009143059A1 (en) * 2008-05-20 2009-11-26 Inventus Holdings, Llc Removal of fermentation inhibiting compounds from citrus waste using solvent extraction and production of ethanol
US8252566B2 (en) * 2008-05-20 2012-08-28 Jj Florida Properties Llc Ethanol production from citrus waste through limonene reduction
US8153006B1 (en) 2008-06-05 2012-04-10 Procorp Enterprises, Llc Anaerobic treatment process for ethanol production
US9127287B2 (en) 2008-06-11 2015-09-08 Syngenta Participations Ag Compositions and methods for producing fermentable carbohydrates
WO2010006152A2 (en) * 2008-07-09 2010-01-14 The Board Of Regents For Oklahoma State University Thermocellulases for lignocellulosic degradation
CN102124121A (zh) * 2008-08-19 2011-07-13 加州大学评议会 利用瞬时农杆菌渗入法在植物主体中制备纤维素酶
US8563931B2 (en) * 2008-11-25 2013-10-22 Syngenta Participations Ag System for providing a calibration for a testing device used to evaluate ethanol production yield, and associated method
EP2401385A4 (en) * 2009-02-25 2012-10-10 Syngenta Participations Ag METHOD FOR INCREASING THE STRENGTH CONTENT IN PLANT PISTONS
GB0903346D0 (en) 2009-02-27 2009-04-08 Cambridge Advanced Tech Transgenic Plants
US9068206B1 (en) 2009-03-03 2015-06-30 Poet Research, Inc. System for treatment of biomass to facilitate the production of ethanol
US8450094B1 (en) 2009-03-03 2013-05-28 Poet Research, Inc. System for management of yeast to facilitate the production of ethanol
US20100240082A1 (en) * 2009-03-18 2010-09-23 Syngenta Participations Ag Methods for detecting and measuring polysaccharide-hydrolyzing enzymes
ES2608690T3 (es) 2009-05-21 2017-04-12 Basf Enzymes Llc Fitasas, ácidos nucleicos que las codifican y métodos para su producción y uso
CN102482652B (zh) 2009-06-02 2014-12-17 诺维信股份有限公司 具有纤维二糖水解酶活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸
JP5641179B2 (ja) * 2009-07-22 2014-12-17 公立大学法人大阪府立大学 浸透物質保持穀類
CN101629132B (zh) * 2009-07-25 2012-05-30 郭德军 一种用于啤酒发酵的玉米淀粉糖浆的制备方法
CN107299123A (zh) 2009-08-19 2017-10-27 杜邦营养生物科学有限公司 葡糖淀粉酶的变体
US10407742B2 (en) 2009-11-06 2019-09-10 Agrivida, Inc. Intein-modified enzymes, their production and industrial applications
US9464333B2 (en) 2009-11-06 2016-10-11 Agrivida, Inc. Intein-modified enzymes, their production and industrial applications
US8420387B2 (en) * 2009-11-06 2013-04-16 Agrivida, Inc. Intein-modified enzymes, their production and industrial applications
US10443068B2 (en) 2010-06-25 2019-10-15 Agrivida, Inc. Plants with engineered endogenous genes
US9598700B2 (en) 2010-06-25 2017-03-21 Agrivida, Inc. Methods and compositions for processing biomass with elevated levels of starch
AR083354A1 (es) 2010-10-06 2013-02-21 Bp Corp North America Inc Polipeptidos variantes cbh i (celobiohidrolasas i) con reducida inhibicion de producto
AU2012225487B2 (en) 2011-03-07 2017-04-06 Agrivida, Inc. Consolidated pretreatment and hydrolysis of plant biomass expressing cell wall degrading enzymes
WO2012137201A1 (en) 2011-04-07 2012-10-11 Hcl Cleantech Ltd. Lignocellulose conversion processes and products
US10308948B2 (en) 2011-07-27 2019-06-04 Applied Biotechnology Institute, Inc. Method of increasing expression of nucleic acid molecules in plants using multiple transcription units
EP2878349B1 (en) 2012-05-03 2022-07-06 Virdia, LLC Fractionation of a mixture by sequential simulated moving bed chromatography
WO2013169645A1 (en) 2012-05-11 2013-11-14 Danisco Us Inc. Use of alpha-amylase from aspergillus clavatus for saccharification
EP2895610B1 (en) 2012-09-13 2019-11-06 Indiana University Research and Technology Corporation Compositions and systems for conferring disease resistance in plants and methods of use thereof
ES2774426T3 (es) * 2012-11-14 2020-07-21 Agrivida Inc Métodos y composiciones para procesar biomasa con niveles elevados de almidón
US9528097B2 (en) 2013-02-15 2016-12-27 Syngenta Participations Ag Method of extraction of an enzyme from plant or animal tissue
UA124050C2 (uk) 2014-12-12 2021-07-14 Сінгента Партісіпейшнс Аг Химерний ген, який кодує білок, токсичний для кукурудзяного метелика, та спосіб його застосування
US11078548B2 (en) 2015-01-07 2021-08-03 Virdia, Llc Method for producing xylitol by fermentation
US11154594B2 (en) 2015-04-10 2021-10-26 Syngenta Participations Ag Animal feed compositions and methods of use
CA2981500C (en) * 2015-05-14 2024-10-15 Agrivida, Inc. GLUCANASE PRODUCTION AND ITS METHODS OF USE
BR112017025322A8 (pt) * 2015-05-27 2022-08-23 Virdia Inc Processos integrados para recuperação de hidrolisato celulósico após hidrólise de polpa de celulose
RU2590485C1 (ru) * 2015-08-12 2016-07-10 Олег Иванович Квасенков Способ производства хлебного кваса
CN105325285B (zh) * 2015-11-04 2017-08-01 文山壮族苗族自治州农业科学院 选育具有隐性双色颖壳标记水稻的方法
EP3618643A4 (en) 2017-05-01 2021-01-27 Syngenta Participations AG ANIMAL FEED COMPOSITIONS AND METHOD OF USE
EP3638763A4 (en) 2017-06-16 2021-04-28 BASF Enzymes LLC PROCESS FOR INCREASING THE OIL YIELD IN THE PRODUCTION OF ETHANOL
EP3668902A1 (en) * 2017-08-15 2020-06-24 Corn Products Development, Inc. Process for obtaining maltodextrin and maltodextrin
CN111148432B (zh) 2017-10-02 2021-11-23 先正达参股股份有限公司 工程化的杀有害生物蛋白和控制植物有害生物的方法
US11793216B2 (en) 2017-10-12 2023-10-24 Syngenta Participations Ag Animal feed compositions and methods of use
BR112020016306A2 (pt) 2018-02-12 2020-12-15 Curators Of The University Of Missouri Gene (saur) suprarregulado pequeno de auxina para o melhoramento da arquitetura do sistema radicular da planta, tolerância ao encharcamento, resistência à seca, e rendimento
US20210024909A1 (en) * 2018-03-26 2021-01-28 Lallemand Hungary Liquidity Management Llc Chimeric amylases comprising an heterologous starch binding domain
US12258374B2 (en) 2019-02-20 2025-03-25 Syngenta Crop Protection Ag Engineered pesticidal proteins and methods of controlling plant pests
EP4194561A4 (en) * 2020-08-05 2024-08-28 Denka Company Limited METHOD FOR OBTAINING AND PRODUCING A TARGET PROTEIN
CN112522238A (zh) * 2020-12-30 2021-03-19 浙江大学 一种利用转基因玉米生产淀粉酶的方法
CN113584075B (zh) * 2021-08-31 2024-01-02 浙江大学 一种利用转基因大豆生产α-淀粉酶的方法及表达载体
WO2023130002A2 (en) * 2022-01-03 2023-07-06 Inari Agriculture Technology, Inc. Pollen-mediated industrial trait delivery in hybrid f2 progeny seed
CA3257053A1 (en) 2022-05-14 2023-11-23 Novozymes A/S COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE PREVENTION, TREATMENT, SUPPRESSION AND/OR ELIMINATION OF PHYTOPATHOGENIC INFESTATIONS AND INFECTIONS
CN116178490A (zh) * 2022-07-08 2023-05-30 北京工商大学 一种高活性淀粉酶抑制活性肽及其制备方法和应用
CN115715932B (zh) * 2022-11-21 2025-06-24 南昌大学 具有调节α-葡萄糖苷酶活性的芦笋提取物及其制备方法和应用
CN119662621A (zh) * 2024-12-18 2025-03-21 青岛普柏生物科技有限公司 一种葡萄糖异构酶突变体及其应用

Family Cites Families (48)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5096825A (en) 1983-01-12 1992-03-17 Chiron Corporation Gene for human epidermal growth factor and synthesis and expression thereof
US5380831A (en) * 1986-04-04 1995-01-10 Mycogen Plant Science, Inc. Synthetic insecticidal crystal protein gene
FI841500A0 (fi) 1984-04-13 1984-04-13 Valtion Teknillinen Foerfarande foer uppbygnande av cellulolytiska jaeststammar.
JP2530181B2 (ja) 1986-10-31 1996-09-04 花王株式会社 アルカリセルラ―ゼ遺伝子を含むｄｎａ断片並びに該ｄｎａ断片を組み込んだ組換えプラスミド及び組換え微生物
US5614395A (en) 1988-03-08 1997-03-25 Ciba-Geigy Corporation Chemically regulatable and anti-pathogenic DNA sequences and uses thereof
DD282028A5 (de) 1989-02-16 1990-08-29 Akad Wissenschaften Ddr Verfahren zur herstellung einer thermostabilen, hybriden bacillus-beta-1,3-1,4-glukanase
ES2092504T3 (es) 1989-02-16 1996-12-01 Carlsberg As (1,3-1,4)-beta-glucanasa termoestable.
DK198089D0 (da) * 1989-04-24 1989-04-24 Danske Spritfabrikker Dna-materialer og anvendelse deraf
US5536655A (en) 1989-09-26 1996-07-16 Midwest Research Institute Gene coding for the E1 endoglucanase
NZ237549A (en) 1990-03-23 1993-06-25 Gist Brocades Nv Production of enhanced levels of enzymes in the seeds of transgenic plants and the use of these seeds
US5543576A (en) 1990-03-23 1996-08-06 Mogen International Production of enzymes in seeds and their use
DE4009932A1 (de) * 1990-03-28 1991-10-02 Basf Lacke & Farben Verfahren zur herstellung eines mehrschichtigen ueberzuges, waessrige beschichtungszusammensetzungen, wasserverduennbare polyacrylatharze und verfahren zur herstellung von wasserverduennbaren polyacrylatharzen
US5168064A (en) 1990-04-20 1992-12-01 The Regents Of The University Of California Endo-1,4-β-glucanase gene and its use in plants
DK115890D0 (da) 1990-05-09 1990-05-09 Novo Nordisk As Enzym
DK162790D0 (da) 1990-07-06 1990-07-06 Novo Nordisk As Plantecelle
US5705375A (en) 1990-09-13 1998-01-06 Mogen International, N.V. Transgenic plants having a modified carbohydrate content
IE913215A1 (en) 1990-09-13 1992-02-25 Gist Brocades Nv Transgenic plants having a modified carbohydrate content
US5475101A (en) 1990-10-05 1995-12-12 Genencor International, Inc. DNA sequence encoding endoglucanase III cellulase
UA48104C2 (uk) * 1991-10-04 2002-08-15 Новартіс Аг Фрагмент днк, який містить послідовність,що кодує інсектицидний протеїн, оптимізовану для кукурудзи,фрагмент днк, який забезпечує направлену бажану для серцевини стебла експресію зв'язаного з нею структурного гена в рослині, фрагмент днк, який забезпечує специфічну для пилку експресію зв`язаного з нею структурного гена в рослині, рекомбінантна молекула днк, спосіб одержання оптимізованої для кукурудзи кодуючої послідовності інсектицидного протеїну, спосіб захисту рослин кукурудзи щонайменше від однієї комахи-шкідника
US5578479A (en) * 1992-06-09 1996-11-26 The Johns Hopkins University Alpha-amylase from hyperthermophilic archaebacterium
US5366883A (en) * 1992-06-09 1994-11-22 Takara Shuzo Co., Ltd. α-amylase gene
US5670356A (en) 1994-12-12 1997-09-23 Promega Corporation Modified luciferase
FR2736930B1 (fr) * 1995-07-17 1997-09-19 Biocem Procede de production, par des cellules vegetales, de proteines heminiques, proteines ainsi obtenues et produits contenant ces proteines
AU6504796A (en) * 1995-07-20 1997-02-18 Washington State University Research Foundation Production of secreted foreign polypeptides in plant cell culture
US5874304A (en) 1996-01-18 1999-02-23 University Of Florida Research Foundation, Inc. Humanized green fluorescent protein genes and methods
HUP9902151A3 (en) 1996-03-05 2001-11-28 Weissheimer Friedr Malzfab Process for the production of degradation and/or conversion products of storage substances present in transgenic plant material with the help of a malting process
US6366883B1 (en) * 1996-05-15 2002-04-02 Atr Interpreting Telecommunications Concatenation of speech segments by use of a speech synthesizer
ATE299941T1 (de) 1996-09-12 2005-08-15 Syngenta Participations Ag Cellulolytische enzyme-exprimierende transgene pflanzen
US5981835A (en) * 1996-10-17 1999-11-09 Wisconsin Alumni Research Foundation Transgenic plants as an alternative source of lignocellulosic-degrading enzymes
WO1998039461A1 (en) 1997-03-20 1998-09-11 Prodigene Inc. Methods of commercial production and extraction of protein from seed
NZ330940A (en) 1997-07-24 2000-02-28 F Production of consensus phytases from fungal origin using computer programmes
FR2778412B1 (fr) 1998-05-05 2002-08-09 Univ Reims Champagne Ardennes Procede pour preparer une enzyme alpha-amylase thermophile et enzyme ainsi obtenue
US6013860A (en) 1998-07-24 2000-01-11 Calgene Llc Expression of enzymes involved in cellulose modification
US6506592B1 (en) 1998-08-18 2003-01-14 Board Of Regents Of The University Of Nebraska Hyperthermophilic alpha-glucosidase gene and its use
HU228696B1 (en) * 1998-08-19 2013-05-28 Cambridge Advanced Tech Plastid-targeting nucleic acid sequence, beta-amylase sequence, a stimulus-responsive promoter and uses thereof
BR0009516B1 (pt) 1999-03-31 2013-09-10 vetor recombinante e célula hospedeira microbiana.
US6639126B1 (en) * 1999-12-06 2003-10-28 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Production of modified polysaccharides
US20020006647A1 (en) * 2000-02-23 2002-01-17 Novozymes A/S Fermentation with a phytase
US6475101B2 (en) * 2000-07-17 2002-11-05 Bruce D. Burrows Metal wood golf club head with faceplate insert
AU2002211798A1 (en) 2000-10-20 2002-05-06 Michigan State University Transgenic plants containing ligninase and cellulase which degrade lignin and cellulose to fermentable sugars
JP2002138931A (ja) * 2000-11-06 2002-05-17 Denso Corp エンジン始動装置
ATE510023T1 (de) 2001-02-21 2011-06-15 Verenium Corp Enzyme mit alpha-amylase-aktivität und verfahren zu deren verwendung
US7560126B2 (en) 2001-02-21 2009-07-14 Verenium Corporation Amylases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
AR036370A1 (es) 2001-08-27 2004-09-01 Syngenta Participations Ag Plantas con auto-procesamiento y partes de las mismas
US8558058B2 (en) 2001-12-06 2013-10-15 Applied Biotechnology Institute Monocotyledonous seed expressing exo-1,4B-glucanase
US6737563B2 (en) 2002-01-16 2004-05-18 Academia Sinica Transgenic seeds expressing amylopullulanase and uses therefor
NL1020273C2 (nl) * 2002-03-28 2003-09-30 Ideepak Holding B V Sealinrichting.
AU2004229313B2 (en) 2003-03-06 2010-08-19 Basf Enzymes Llc Amylases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them

Also Published As

Publication number Publication date
AU2002332666B2 (en) 2006-10-26
EP1432798B1 (en) 2010-11-17
US7557262B2 (en) 2009-07-07
WO2003018766A9 (en) 2004-03-04
EP1432798A2 (en) 2004-06-30
KR20040029122A (ko) 2004-04-03
CN1564866B (zh) 2010-09-08
JP2005503153A (ja) 2005-02-03
AR036370A1 (es) 2004-09-01
RU2004109143A (ru) 2005-04-20
CN1821412A (zh) 2006-08-23
US20080045702A1 (en) 2008-02-21
CA2457477C (en) 2014-07-08
HUP0600305A2 (en) 2006-07-28
WO2003018766A2 (en) 2003-03-06
AR073856A2 (es) 2010-12-09
ATE488585T1 (de) 2010-12-15
ZA200401480B (en) 2005-07-27
MXPA04001802A (es) 2004-07-08
US20090288232A1 (en) 2009-11-19
BR0212170A (pt) 2005-05-10
US7102057B2 (en) 2006-09-05
CA2457477A1 (en) 2003-03-06
US20060200877A1 (en) 2006-09-07
CN1564866A (zh) 2005-01-12
EP1432798A4 (en) 2005-10-12
HU228266B1 (en) 2013-02-28
DE60238339D1 (de) 2010-12-30
US7919681B2 (en) 2011-04-05
WO2003018766A3 (en) 2004-01-29
US20030135885A1 (en) 2003-07-17
RU2312144C2 (ru) 2007-12-10
US7855322B2 (en) 2010-12-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RS18304A (sr) Biljke i delovi biljaka sa sposobnošću samoprerađivanja
AU2004318207B2 (en) Self-processing plants and plant parts
AU2002332666A1 (en) Self-processing plants and plant parts
KR20000036077A (ko) 셀룰로스 분해 효소를 발현하는 트랜스젠 식물
US20120058523A1 (en) Tempering of cellulosic biomass
CN101910404A (zh) 提高植物淀粉含量的方法
CN102405291A (zh) 用于增加植物穗轴中的淀粉含量的方法
AU2006225290B2 (en) Self-processing plants and plant parts
MXPA06010197A (en) Self-processing plants and plant parts
BR122014007966B1 (pt) Expression cassette comprising an alpha-amylase and a method of obtaining a plant comprising the same
KR20070007817A (ko) 자가-가공 식물 및 식물 부분
NZ549679A (en) Self-processing plants and plant parts
HK1072618A (en) Self processing plants and plant parts
HK1094710A (en) Self-processing plants and plant parts