RS20050031A - Postupak za tretman okluzija prepariranog katetera upotrebom fibrinolitičkih metaloproteinaza - Google Patents

Abstract

Daje se postupak za lokalizovano intravaskularno ordiniranje fibrinolitičke metaloproteinaze humanom subjektu, u količini koja je i bezbedna i efikasna za lizu okludovanog krvnog ugruška koji sadrži fibrin, ali takodje izbegavajući efekte neutralizacije α2makroglobulina u krvotoku. Postupak takodje daje tretman krvnog ugruška u, oko, ili pripojenog uz preparirani uredjaj za vaskularni pristup. Daje se takodje i postupak za obnavljanje prohodnosti i funkcije prepariranog uredjaja za vaskularni pristup.

Description

POSTUPAK ZA TRETMAN OKLUZIJA

PREPARIRANOG KATETERA UPOTREBOM

FIBRINOLITIČKIH METALOPROTEINAZA

Ova prijava je delimični nastavak U.S. Application No. 09/466,276, podnete 17. decembra 1999, koja je ovde priključena kroz citat.

Ovaj pronalazak se odnosi na terapeutsko ordiniranje fubrinolitičkih metaloproteinaza, određenije na postupak za ordiniranje tih agenasain vivo,preko lokalnog oslobađanja u vaskulame trombove, kako bi se ostvarila liza ugruška. Ovaj pronalazak odnosi se takođe na postupak za rastvaranje krvnih ugrušaka u prepariranom kateteru, šantu ili drugim uređajima za vaskulami pritup, kako bi se obnovila funkcija tog uređaja za vaskularni pristup.

Vaskularne okluzije, izazvane krvnim ugrušcima, kao što su trombovi i embolije, predstavljaju ozbiljne medicinske probleme, koji, ako se ne tretiraju blagovremeno, mogu ugroziti udove ili život. Razvijeni su uređaji i postupci za tretman i uklanjanje vaskularnih krvnih ugrušaka. Ilustracije radi, videti U.S.

Patent No. 4,447,236 (Quinn), priznat 8. maja 1984; U.S. Patent No. 4,692,139

(Stiles), priznat 8. septembra 1987; U.S. Patent No. 4,755,167 (Thistle et al.), priznat 5. jula 1988; U.S. Patent No. 5,167,628 (Boyles), priznat 1. decembra 1992; U.S. Patent No. 5,222,941 (Don Michael), priznat 29. juna 1993; U.S.

Patent No. 5,250,034 (Appling et al ), priznat 5. oktobra 1993; U.S. Patent No. 5,370,653 (Cragg), priznat 6. decembra 1994; U.S. Patent No. 5,380,273 (Dubrul et al.), priznat 10. januara 1995; U.S. Patent No. 5,498,236 (Dubrul et al.), priznat 12. marta 1996; U.S. Patent No. 5,626,564 (Zhan et al.), priznat 6. maja 1997; U.S. Patent No. 5,709,676 (Alt), priznat 20. januara 1998; U.S. Patent No. 5,865,178 (Yock), priznat 2. februara 1999; i WO 90/07352 (objavljen 12. jula 1990). Te metode i uređaji obuhvataju infuzione katetere za oslobađanje trombolitičkih i fibrinolitičkih agenasa u krvni ugrušak i njegovo rastvaranje. Infuzioni kateteri se tipično koriste zajedno sa enzimatski aktivnim agensima, koji su u stanju da razgrade fibrin u ugrušku i na taj način efikasno rastvore ugrušak. Ovi enzimi se tipično navode kao trombolitički ili fibrinolitički agensi.

Fibrolaza je poznata fibrinolitička cink-metaloproteinaza, koja je prvo izolovana iz otrova južnjačke bakarnoglave zmije( Agkistrodon contorthx contortrix).Videti Guan et al.,Archives of Biochemistry and Biophysics,1991, 289(2). 197-207; Randolph et al., "Protein Science", Cambridge Universitv Press, 1992, strane 590-600; European Patent Application No. 0 323 722 (Valenzuela et al ), objavljena 12. jula 1989; i U.S. Patent No. 4,610,879 (Markland et al.), priznat 6. septembra 1986. Pokazano je da je fibrolaza fibrinolitička, a dokumentovano je da ova metaloproteinaza ima proteolitičku aktivnost protiv Aa-lanca fibrinogena, sa umanjenom proteolitičkom aktivnošću za Bp-lanac i bez aktivnosti za y-lanac fibrinogena; Ahmed et al.,Hemostasis,1990, 20, 147-154. Pošto fibrin predstavlja glavnu komponentu krvnih ugrušaka, fibrinolitička svojstva fibrolaze ukazuju na njen potencijal kao agensa za rastvaranje ugruška u trombolitičkoj upotrebiin vivo;videti Markland et al.,Circulation,1994, 9(5), 2448-2456, i Ahmed et al., videti gore.

Novel Acting Thrombolvtic (NAT) je modifikovani oblik fibrolaze koji se razlikuje od fibrolaze po tome što NAT sadrži 201 aminokiselinu sa sekvencijom na N-kraju SFPOR, dok sekvencija N-kraja prirodne fibrolaze počinje sa EQRFPQR i ima dužinu od 203 aminokiseline. Modifikacija amino-kraja je dizajnirana da se spreče hemijske reakcije ostataka aminokiselina, koje su u stanju da formiraju varijabilnu količinu ciklizovanog glutamina (proglutaminska kiselina), koji ima potencijal za stvaranje varijeteta mesto-do-mesta u kvalitetu i uniformnosti proizvoda. Dakle, NAT se može posmatrati kao stabilniji molekul.

Uprkos ovih strukturnih razlika, NAT i fibrolaza su slični u pogledu enzimatske (fibrinolitičke) aktivnosti. Ova sličnost u biološkoj aktivnosti saglasna je sa podacima koji ukazuju da se aktivno mesto u molekulu fibrolaze proteže između aminokiselina 139-159, kao što je opisao Manning uToxicon,1995, 33, 1189-1200, a njena predviđena lokacija u trodimenzionalnom prostoru je udaljena od amino-kraja. Aktivno mesto za molekule fibrolaze i NAT sadrži atom cinka, koji je kompleksiran sa tri histidinska ostatka.

Objavljena literatura o fibrolazi izvedenoj iz otrova, pokazala je njenu proteolitičku aktivnost protiv fibrogena na mestu Lys413-Leu<4>14, protiv oksidisanog p-lanca insulina na mestu Ala<14->Leu<15>; Retzios i Markland,Thrombosis Research,1994, 74, 355-367; Pretzer et al.,Pharmaceutical Research,1991, 8, 1103-1112; i Pretzer et al.,Pharmaceutical Research,1992, 9, 870-877. Određeno je takođe, da NAT ima proteolitičku aktivnost na ovim supstratima, na istim mestima cepanja.

Nasuprot fibrinolitičkim metaloproteinazama, kao što su fibrolaza i NAT, agensi za lizu ugrušaka, kao što je streptokinaza, urokinaza i aktivator plazminogena tipa tkiva (tPA), su aktivatori plazminogena koji promovišu trombolizu aktiviranjem endogenog fibrinolitičkog sistema. Određenije, aktivatori plazminogena katalizuju konverziju plazminogena u plazmin, serinsku proteazu. Plazmin je u stanju da čepa fibrinogen i fibrin na vezama arginil-lizil, a to je preko generisanja plazmina, tako da aktivatori plazminogena konačno utiču na razgradnju fibrina i lizu ugruška. Današnji komercijalno dostupni agensi su aktivatori plazminogena, kao što je urokinaza, streptokinaza ili tPA.

Za razliku od klase trombolitičkih lekova, aktivatora plazminogena, fibrinolitičke metaloproteinaze, kao što su fibrolaza i NAT, ne oslanjaju se na endogeni fibrinolitički sistem (konvenrzija plazminogena u plazmin). Dakle, ova klasa

agenasa za lizu ugrušaka se može razlikovati od aktivatora plazminogena po njihovom jedinstvenom načinu delovanja, pa se defmišu kao "direktni" fibrinolitički agensi.

Alfa2-makroglobulin, kao dominantan inhibitor proteinaze prisustan u serumu sisara, je jedan od najvećih serumskih proteina (ima masu molekula od 725 kilodaltona). Specifičnost ci2-makroglobulina prema proteinazama je široka, obuhvatajući serin, cistein, asparaginsku kiselinu i klase metaloproteinaza. Molekul a2-makroglobulina je tetramer od identičnih subjedinki, vezanih u parovima preko disulfida i nekovalentnim povezivanjem polovina molekula. Dakle, pod redukcionim uslovima, priordni a2-makroglobulin može da disosuje u njegove četri monomerne subjedinke.

Svaka subjedinka a2-makroglobulina poseduje region koji je vrlo osetljiv na proteolitičko cepanje (region "ugriza"). Proteoliza regiona ugriza izaziva konformacionu pramenu u a2-makroglobulinu, koja zahvata proteinazu unutar a2-makroglobulinske molekulske strukture. Ovaj proces je opisan u literaturi kao interakcija "venus fly-trap" (biljka muholovka,Dionaea muscipula).Kada je proteinaza napadnuta, ona je stemo ometena, pa stoga ne može prići njenom makromolekulskom substratu.

Pored toga, može se formirati kovalentna veza između a2-makroglobulina i mnogih proteinaza koje on napada. Kao što je pomenuto, napadanje proteinaze izaziva konformacionu pramenu u molekulu a2-makroglobulina. Predpostavlja se da posle ove konformacione promene postaje reaktivna tioestarska veza u unutrašnjosti molekula a2-makroglobulina, pa može formirati kovalentnu vezu sa nukleofilnim ostacima (kao što je lizin) napadnute proteinaze. Dakle, unutar krvotoka, a2-makroglobulin može efikasno da neutrališe razne proteinaze.

Pored toga, konformaciona pramena u a.2-makroglobulinu do koje dolazi napadanjem proteinaze, dovodi do oblika koji prepoznaje retikulendotelijumski sistem. Iščezavanje kombinacije a2-makroglobulin-napadnuta proteinaza obično se opisuje vrednostima poluvremena u minutima, i veruje se da se dešava preko receptora lipoproteina niske gustine (LDL), povezanih sa proteinom koji se izlučuje na makrofagama, hepatocitima i fibroplastima. Za više podataka o a2-makroglobulinu, videti "Methods in Enzymology", urednik A.J. Barrett, Academic Press, Inc., Philadelphia, 1981, str. 737-754.

Alfarmakroglobulin je u stanju da formira makromolekulski kompleks sa fibrolazom, NAT ili drugim proteinazama. Za razliku od nekih proteinaza koje mogu da stvaraju kompleks sa a2-makroglobulinom koji može da disocira, fibrolaza i NAT su dva primera fibrinolitičkih metaloproteinaza koji formiraju kompleks koji ne može da disocira iz a2-makroglobulina pod fiziološkim uslovima. Kada se prečiste, na primer humani a2-makroglobulin i NAT, se inkubiraju zajedno, formiranje kompleksa počinje za nekoliko sekundi, a potpuno je završeno za nekoliko minuta. Ovaj fenomen pokazuje da stvaranje kompleksain vitro,može biti brzo i ukazuje na potencijalnu brzinu stvaranja kompleksa između a2-makroglobulina i NAT, ili drugih fibrinolitičkih metaloproteinazain vivo.

Mada je a2-makroglobulin jedan od glavnih proteina plazme, postoji ipak konačna količina a2-makroglobulina u krvotoku, koja bi mogla biti na raspolaganju za vezivanje i neutralizaciju fibrinolitičke metaloproteinaze. Stoga, kapacitet vezivanja a2-makroglobulina dostiže zasićenje. Kada se prevaziđe kapacitet vezivanja a2-makroglobulina, proporcionalno raste koncentracija nevezane fibrinolitičke metaloproteinaze, ako se uzorku doda još fibrinolitičke metaloproteinaze.

Prisustvo a2-makroglobulina u opštem krvotoku pacijenta predstavlja izazov za sistemsko (na primer, intravenozno) ordiniranje fibrolaze, NAT ili druge fibrinolitičke metaloproteinaze, koje se vezuju za a2-makroglobulin u opštem krvotoku. Ukoliko se prevaziđe nivo zasićenja urođenog a2-makroglobulina sistemskim ordiniranjem doze takve fibrinolitičke metaloproteinaze, ova poslednja će efikasno biti neutralisana i učinjena neefikasnom u terapeutske svrhe.

U jednom ispitivanjuin vivo,obavljenom na zečevima, biološka efikasnost fibrolaze izvedene iz otrova, isptivanja je posle sistemskog intravenoznog ordiniranja. Ahmed et al.,Haemostasis,videti gore. Doza upotrebljene fibrolaze je bila 3,7 mg/kg, procenjujući da to daje konačnu koncentraciju u krvi od približno 60 ug/mL, kod zečeva od 3,0 kg. Ova količina je odabrana na bazi ispitivanja inaktivacije enzima u prisustvu krvi ili plazme, predpostavlja se zbog a2-makroglobulina (videti strane 336 i 339).

U sledećem ispitivanjuin vivo,biološki efekat rekombinantne fibrolaze na lizu ugruška ispitivan je na psima. Markland et al.,Circulation,videti gore. Preko katetera daje se infuzija od 4 mg ovog materijala po kg (mase životinje), tokom 5 min, ispred prethodno izazvanog tromba u levoj karotidnoj arteriji (videti stranu 2450). I ovde je ponovo opaženo da se inaktiviranje fibrolaze odigarva u opštem krvotoku, predpostavlja se usled prisustva a2-makroglobulina (videti stranu 2454, druga kolona, poslednji pasus).

Kao što ova dva ispitivanja pokazuju, efekti deaktivacije ot2-makroglobulina se mogu preovladati ili ordiniranjem ili sistemskim doziranjem fibrinolitičke metaloproteinaze, prevazilazeći nivo zasićenja urđenog a2-makroglobulina (u ispitivanju na zečevima), ili lokalnim oslobađanjem enzima na mestu ugruška

(ispitivanje na psima), a izbegavajući sistemsko ordiniranje. S druge strane, doze fibrinolitičke proteinaze iznad nivoa zasićenja a2-makroglobulina, bez obzira da li se oslobađaju sistemski ili lokalno, mogu prevazići nivoe koji su bezbedni i dobro podnošenje za osobu koja se tretira. Treba napomenuti da su fibrinolitičke metaloproteinaze u stanju da unište ne samo fibrin, već mogu da razgrade i druge strukturne proteine, pa su stoga potencijalno toksičnein vivo,kada su prisutne u velikim količinama, koje prevazilaze nivo zasićenja a2-makroglobulina.

Stvaranje krvnog ugruška ili druge okluzije na bazi fibrina, bitno je takođe kada se koristi preparirani kateter ili drugi uređaj za vaskularni pristup. Ima mnogo situacija u kojima se zahteva ponavljana ili produžena upotreba uređaja za vaskulami pristup, kao što je kateter, pristupni graft, manžetna, igla, arteriovenska fistula ili šant. Na primer, razne procedure povezane sa hemodijalizom, hemoterapijom, infuzijom ili zamenom krvi, ili druge procedure koje predpostavljaju ponovljeno intravenzono ili intraarterijsko oslobađanje leka (ili vađenje fluida), mogu biti obuhvaćene upotrebom prepariranog katetera ili drugog permanentnog ili polu-permanentnog implantiranog medicinskog uređaja. Krvni ugrušci se mogu formirati u, ili oko, ili pripojeni uz bilo koji uređaj koji je ubačen u vaskularni prostor, naročito ukoliko ovaj uređaj ostaje u vaskularnom prostoru tokom dužeg perioda vremena, ili ukoliko taj uređaj ima jedan ili više malih otvora. Pored toga, druge okluzije na bazi fibrina mogu se vezati sa bilo kojim delom prepariranog uređaja za vaskulami pristup, i mogu sprečiti ili otežati ispravno funkcionisanje tog uređaja.

Bilo bi korisno imati brz i efikasan postupak za tretiranje, tj. uništavanje, rastvaranje ili lizovanje ugrušaka ili drugih okluzija formiranih oko, ili pripojenih uz preparirani uređaj za vaskularni pristup. U odsustvu efikasnog postupka za tretiranje ugrušaka formiranih u ili oko uređaja za vaskularni pristup, ovaj preparirani uređaj mora da bude zamenjen od strane lekara, što izaziva dodatni trošak i rizik za pacijenta.

Prema tome, predmet ovog pronalaska je davanje bezbednog i efikasnog postupka za tretman krvnog ugruška ili okluzije u okolini prepariranog uređaja za vaskulami pristup.

Predmet ovog pronalaska je takođe i davanje postupka za obnavljanje prohodnosti ili potpuno ili delimično okludiranog prepariranog uređaja za vaskulami pristup.

Predmet ovog pronalaska je još i davanje postupka za obnavljanje funkcije prepariranog uređaja za vaskularni pristup, čija je funkcija izmenjenja okluzijom na bazi fibrina.

Predmet ovog pronalaska je takođe i davanje bezbednog i biološki efikasnog načina za upotrebu lokalno ordinirane fibrinolitičke metaloproteinaze za lizu krvnog ugruškain vivo.

U nekim realizacijama, ovaj pronalazak je postupak terapeutskog tretmana krvnog ugruška u prepariranom uređaju za vaskularni pristup, ordiniranjem kroz pomenuti uređaj za vaskularni pristup količine fibrinolitičke metaloproteinaze u farmaceutski prihvatljivom rastvoru, gde ta količina ne prevazilazi 1,7 mg fibrinolitičke metaloproteinaze po kilogramu telesne mase tretiranog humanog subjekta. U nekim realizacijama, uređaj za vaskularni pristup je prepariran u arteriji ili veni humanog subjekta. U nekim realizacijama preparirani uređaj za vaskulami pristup je kateter, šant, pristupni graft, igla ili manžetna. U nekim realizacijama uređaj za vaskulami pristup se koristi za uvođenje ili uklanjanje fluida iz vaskulamog domena. U nekim realizacijama uređaj za vaskulami pristup iz ovog pronalaska se koristi u vezi sa hemodijalizom, transfurzijom krvi, uklanjanjem ili zamenom, hemoterapijom ili bilo kojom drugom procedurom koja zahteva uvođenje ili uzimanje fluida iz vene ili arterije.

U nekim realizacijama, ovaj pronalazak predstavlja postupak za lizu krvnog ugruška u prepariranom uređaju za vaskularni pristup, preko lokalnog ordiniranja farmaceutski prihvatljivog rastvora u pomenuti ugrušak, sa količinom fibrinolitičke metaloproteinaze koja se kompleksira sa a2-makroglobulinom, količinom dovoljnom da se olakša liza tog ugruška, ali da sadržajem znatno ne prevaziđe nivo zasićenja a2-makroglobulina u pomenutom humanom subjektu.

U nekim realizacijama, ovaj pronalazak predstavlja postupak za obnavljanje prohodnosti potpuno ili delimično okludovanog prepariranog uređaja za vaskulami pristup. U nekim realizacijama, ovaj pronalazak predstavlja postupak za obnavljanje funkcije prepariranog uređaja za vaskularni pristup.

Kratak opis slika

Slike 1A-1C. Slika 1A je osnovni, polazni angiogram karotidne arterije odrasle svinje, pre uvođenja balon-katetera u povredu i stvaranja okluzivnog tromba; Slika 1B je angiogram uzet istoj životinji posle 4 dana, pre ordiniranja NAT u skladu sa ovim pronalaskom. Slika 1C je angiogram 2 h posle ordiniranja 30 mg NAT kroz kateter "PRO" (videti Sliku 3 radi ilustracije ovog uređaja).

Slika 2 ilustruje tip kateterskog uređaja koji je dizajniran za lokalizovano oslobađanje trombolitičkog agensa u krvni sud.

Slika 3 je poprečni presek alternativnog tipa kateterskog uređaja za lokalizovano oslobađanje trombolitičkog agensa u krvnom sudu.

Slika 4 je histogram procenjene maksimalne doze NAT kod pacijenta sa perifernom vaskulamom okluzijom.

Slika 5 ilustruje upotrebu NAT na modelu okluzije kateterain vitno.

Slika 6 ilustruje zbirne rezultate brojnih eksperimenata, a dobijeni usrednjeni podaci pokazuju da NAT rastvara okluzijein vitroi do 40% brže nego Abbokinase<®>, Open Cath<®>, komercijalni proizvod urokinaze za čišćenje katetera.

Detaljan opis pronalaska

Unekim realizacijama, ovaj postupak predstavlja postupak za tretman krvnog ugruškain vivo,kod humanih subjekata, pomoću fibrinolitičke metaloproteinaze, koji se sastoji od lokalnog ordiniranja bezbedne, biološki efikasne količine fibrinolitičke metaloproteinaze u krvni ugrušak, kao što je korišćenjem katetera ili drugog uređaja za vaskulami pristup. Tipično, stacionarni fibrinski ugrušci su locirani u krvnom sudu humanog subjekta (arterijskom ili venskom, vlastitom ili veštačkom (npr. graft)).U nekim realizacijiama ovaj pronalazak predstavlja postupak za tretiranje krvnog ugruška lociranog u, ili oko, ili pripojenom uz preparairani kateter, šant, iglu ili drugi uređaj za vaskulami pristup. U nekim realizacijama ovaj pronalazak predstavlja postupak za obnavljanje prohodnosti potpuno ili delimično okludovanog prepariranog uređaja za vaskulami pristup. U nekim realizacijama ovaj pronalazak predstavlja postupak za obnavljanje funkcije uređaja za vaskulami pristup, gde je ta funkcija izmenjena ili u određenoj meri zahvaćena okluzijom na bazi fibrina.

"Bezbedna, biološki efikasna" količina, označava količinu dodovljnu da razgradi fibrin i olakša lizu ugruška (tj. tromba), ali da znatno ne prevazilazi sadržaj nivoa zasićenja a2-makroglobulina u sistemu krvotoka tretiranog pacijenta (tj. sadržaji koji mogu oštetiti zidove krvnih sudova). Tipično, ova količina je unutar opsega između 0,025 i 1,7 mg po kg telesne mase humanog subjekta koji se tretira, što je određeno ispitivanjem obavljenim na uzorcima krvi humanih subjekata, isptivanih na sadržaj a2-makroglobulinain vitroi na kapacitet vezivanja. Iz ovinin vitrorezultata u ovom ispitivanju, bilo je moguće definisati nivo zasićenja <x2-makroglobulinain vivo,praktično za sve svrhe, čime je omogućeno dobijanje slike biološki efikasne količine, koja daje ne samo minimalni nivo fibrinolitičke metaloproteinaze neophodan za biološku efikasnost, već takođe i maksimalni

nivo za tolerantno ordiniranje. Ovo ispitivanje je detaljno opisano niže i u Primerima.

Nazivi "lokalno" ili "lokalizovano" primenjuju se na način oslobađanja fibrinolitičke metaloproteinaze, a odnose se na intra-aretrijsko ili intra-venozno ordiniranje, ili u sam krvni ugrušak (tj. intra-tromb) ili u neposrednu blizinu ugruška (bilo spreda ili pozadi, relativno prema proticanju krvi), ili dovoljno blizu da glavninu fibrinolitičke metaloproteinaze absorbuje ugrušak. Za tretman ugrušaka u, oko, ili pripojenih uz uređaj za vaskulami pristup, ili za obnavljanje funkcije ili blokiranog uređaja za vaskulami pristup, oslobađanje fibrinolitičke metaloproteinaze se obično ostvaruje u samom uređaju za vaskulami pristup, pa je stoga nedvojbeno lokalno. U nekim realizacijama, može da se upotrebi sekundarni uređaj za vaskulami pristup, kao što je kateter, za oslobađanje fibrinolitičke metaloproteinaze u implantirani medicinski uređaj, kao što je stent.

Naziv "kateter kao sredstvo za oslobađanje" ili "uređaj za vaskulami pristup" ovde se koristi u konvencionalnom smislu, i odnosi se na cevasti medicinski uređaj za ubacivanje u kanale, krvne sudove, prolaze ili telesne šupljine, u svrhu injektiranja ili uzimanja fluida, ili za održavanje tih prolaza otvorenim. Obično, ta sredstva tipično se sastoje od produženog, fleksibilnog tela katetera, koji sadrži jedan ili više unutrašnjih prolaza (ili "lumena"); prednjeg dela, koji dozvoljava da se materijal (tj. agens za lizu ugruška) uvede u telo katetera i da protiče kroz lumen; zadnjeg dela koji opciono ima zasečen vrti; i jednog ili više otvora blizu kraja zadnjeg dela, koji dozvoljavaju materijalu da izađe iz katetera, kao odgovor na primenjeni pritisak.

Nazivi "proteolitička degradacija", "rastvaranje", "liza" i "terapeutski tretman", ovde se svi koriste odnoseći se na degradaciju, dezintegraciju, razlaganje, razbijanje ili drugo uklanjanje krvnog ugruška ili druge okluzije na bazi fibrina. Krvni ugrušak može delimično ili totalno da okluduje lumen krvnog suda ili medicinskog uređaja. Slično, "obnavljanje prohodnosti" odnosi se na bilo koji merljiv porast proticanja krvi (na primer, zapreminski ili po brzinski) kroz lumen krvnog suda, ili medicinskog uređaja, ili izlazni otvor, usled rastvaranja krvnog ugruška u njima.

Naziv "krvni ugrušak" ili "okluzija" ovde se koristi odnoseći se na bilo koju masu na bazi fibrina, klaster, opstrukciju ili izraslinu. Tipično, do krvnih ugrušaka dolazi kada se krv koaguliše u arteriji ili veni i usporava, preprečuje, smanjuje ili blokira, potpuno ii delimično, protok krvi kroz njih. Krvni ugrušci se mogu takođe formirati u ili oko stranih objekata unetih u vaskulami prostor. Krvni ugrušci mogu biti stacionarni, kao što je tromb (krvni ugrušak koji se formira u krvnom sudu i tu ostaje) ili može biti prenosiv, kao što je embolija (krvni ugrušci koji putuju sa mesta gde su formirani na drugu lokaciju u telu). Krvni ugrušci mogu takođe biti veoma različiti po veličini, obliku i sastavu, a mogu biti sfeme mase, kao i krilca ili druge planame strukture. Ponekad, komadić aterosklerotičnog plaka, mali komad tumora, globule masti, vazduh, amniotički fluid ili drugi materijali koji se nalaze u krvi, mogu delovati na isti način kao krvni ugrušak. U izvesnom smislu te mase sadrže fibrin ili druge supstance osetljive na degradaciju fibrinolitičkom metaloproteinazom, jednim od postupaka iz ovog pronalaska koji bi bio koristan za njihov tretman.

Sledeći postupak iz ovog pronalaska je ilustrovan u nastavku, i odnosi se na periferijsku arterijsku okluziju (PAO). PAO potiče od periferne vaskulame bolesti usled ateroskleroze. Simptomi se sporo razvijaju, tokom mnogih godina napredovanja ateroskleroze, s tim da se kritični nivo ishemije dostiže kod oko 15 do 20% pacijenata sa oboljenjem donjih ekstremiteta. Medicinska terapija je ograničena i prvenstveno usmerena na prevenciju ili umanjenje rizika, korišćenjem medikacija kao što su agensi za smanjivanje lipida ili anti-trombocitni agensi, programi odvikavanja od pušenja i fizičko vežbanje. Jackson i Clagett,Chest,1998, 114, 666S-682S.

Kliničke manifestacije periferne vaskulame bolesti mogu da obuhvate akutna dešavanja ishemije koja ugrožavaju udove, ili prisustvo hroničnih dokaza vaskulame bolesti (tj. povremena hramanja). Pored gore pomenutih preventivnih

mera, hronična PAO se tipično ne tretira do pojave ozbiljnih životnih ograničenja ili ishemija koje ugrožavaju udove. Zavisno od'napadnutog segmenta krvnih sudova i iznosa okluzije, dostupne medicinske intervencije obuhvataju perkutanu transluminalnu angioplastiku, hiruršku revaskularizaciju i trombolizu. Ispitivanja su pokazala da intra-arterijskom infuzijom agensa za lizu ugrušaka, a naročito u ranoj fazi okluzije, može da se izbegne potreba za hirurškom intervencijom. Kao što je pokazano u Rochetser-ovom ispitivanju, koje poredi trombolizu aktivatorskom urokinazom plazminogena sa hirurgijom, prilikom tretmana akutnog PAO (Ouriel et al.,Journal of Vascular Surgery,1994, 19, 1021-1030), 33% pacijenata u grupi ove studije trombolize su uspešno tretirani intervencijom samo medikamentima, izbegavajući tako invazivniju proceduru. Nasuprot, 98% pacijenata u radnoj grupi su podvrgnuti endovaskulamoj ili hirurškoj proceduri.

Drugi medicinski poremećaji koji obuhvataju okluzivne krvne ugruške mogu se na sličan način efikasno tretirati ovim postupkom, uključujući, ali bez ograničavanja, akutni infarkt miokarda, ishemički moždani udar, trombozu dubinskih vena i pulmonamu emboliju. U nekim realizacijama, postupak iz ovog pronalaska se može takođe primeniti na rastvaranje ugrušaka koji se dešavaju hronično u implantiranim medicinskim uređajima, kao što su preparirani kateteri i graftovi za pristup hemodijalizi. Drugi primeri implantiranih medicinskih uređaja su šantovi, pristupni delovi, igle, manžetne i drugi uređaji za vaskulami pristup.

U nekim realizacijama ovaj pronalazak je primenljiv za terapeutsko oslobađanje bilo koje fibrinolitičke metaloproteinaze koja je u stanju da se kompleksira sa a2-makroglobulinom. Ove fibrinolitičke metaloproteinaze, ukoliko se nalaze u prirodi, mogu se prečistiti iz njihovih prirodnih resursa, npr. fibrolazom iz zmijskog otrova. Alternativno, agensi polipeptidne fibrinolitičke metaloproteinaze, čiji su segmenti nukleinskih kiselina i aminokiselina poznati, mogu se proizvesti korišćenjem konvencionalnih metoda rekombinantnog izlučivanja i prečišćavanja.

Obično, rekombinantne metode koriste molekul DNK, koji kodira posmatranu fibrinolitičku metaloproteinazu, a koji se ubacuje u odgovarajući vektor za izlučivanje u pogodnoj ćeliji domaćina. Ovaj vektor se bira tako da da bude funkcionalan u upotrebljenoj ćeliji domaćina, tj. da je kompatibilan sa sistemom ćelije domaćina, tako da može da dođe do izlučivanja DNK. Ovi vektori mogu takođe da sadrže bočnu sekvenciju 5'- (koja se takođe naziva "promoter") i druge elemente regulacije izlučivanja, kao i druge elemente, kao što je početak elementa replikacije, tranksripcioni konačni element, potpuna intronska sekvencija koja sadrži donorsko i akceptorsko mesto spajanja, sekvencija signalnog peptida, mesto vezivanja elementa ribozoma, sekvencija za poliadenilovanje, polilinkerska regija za ubacivanje kodirane nukleinske kiseline i element markera koji se može birati. Ovaj vektor može opciono da sadrži takođe i sekvenciju "etikete", tj. sekvenciju oligonukleotida lociranu na kraju 5' ili 3' sekvencije koja kodira polipeptid, koji kodira poliHis, ili drugu malu imunogenu sekvenciju. Ova etiketa će se izlučivati zajedno sa željenim proteinom i može poslužiti kao etiketa afiniteta za prečišćavanje ovog polipeptida od ćelije domaćina. Ukoliko se želi, ova etiketa može se naknadno raznim metodama ukloniti iz pečišćenog polipeptida, na primer upotrebom selektivne peptidaze.

U onim slučajevima kada je poželjno da se polipeptid izlučuje iz ćelije domaćina, može se koristiti signalna sekvencija za usmeravanje polipetida izvan ćelije domaćina, u kojoj je sintetizovan. Tipično, signalna sekvencija je smeštena u regionu kodiranja sekvencije nukleinskih kiselina, ili direktno na kraju 5' regiona za kodiranje. Identifikovane su mnoge signalne sekvencije, a može se koristiti bilo koja, ako je funkcionalna u odabranoj ćeliji domaćina.

Posle konstruisanja vektora i ubacivanja nukleinske kiseline na odvogarajuće mesto vektora, ovako kompletiran vektor se može ubaciti u pogodnu ćeliju domaćina, za pojačavanje i/ili izlučivanje polipeptida. Ćelije domaćina mogu biti prokariotske (kao što jeE. coli)ili eukariotske (kao što su ćelije kvasca, ćelije insekta, ili ćelije kičmenjaka).

Pogodne ćelije ili sojevi ćelija domaćina mogu biti ćelije sisara, kao što su ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO) ili 3T3 ćelije. Izbor pogodnih ćelija domaćina i postupaka i metoda transformacije, kultivisanjam amplifikacije, testiranja i proizvodnje i prečišćavanja produkta , poznati su u stanju tehnike. Drugi pogodni sojevi ćelija sisara su sojevi ćelija majmuna COS-1 i COS-7 i.soj ćelija CV-1. Drugi sojevi ćelija domaćina sisara za primer, su sojevi ćelija primata i sojevi ćelija glodara, uključujući transformisane sojeve ćelija. Pogodne su takođe, normalne diploidne ćelije, sojevi ćelija izvedeni iz kulture primarnog tkivain vitro,kao i primami eksplantati. Ćelije kandidati mogu biti deficitarne genotipično pri selekciji gena, ili mogu sadržati selekcioni gen koji dominantno dejstvuje. Drugi pogodni sojevi ćelija sisara su, ali bez ograničavanja, HeLa, mišje ćelije L-929, sojevi 3T3, izvedeni iz Swiss, Balb-C ili NIH miševa, sojevi ćelija BHK ili HaK zamoraca.

Korisne ćelije domaćina su takođe ćelije bakterija, na primer, razni sojeviE. colii razni sojevi ćelija kvasca.

Ubacivanje (takođe poznato kao insertovanje, "transformacija" ili "transficiranje") vektora u odabranu ćeliju domaćina može se obaviti korišćenjem metoda kao što su kalcijum-fosfat, elektroporacija, mikroinjektiranje, lipofekcija ili metoda DEAE-dekstrana. Odabrana metoda biće delom u funkciji vrste ćelija domaćina koje se koriste. Ovi postupci i druge pogodne metode su dobro poznati verziranima u stanje tehnike.

Ćelije domaćina, kada se kultivišu pod odgovarajućim uslovima, mogu da sintetizuju željenu fibrinolitičku metaloproteinazu. Ćelije domaćina se mogu kultivisati upotrebom standardnih medijuma, dobro poznatih verziranom

stručnjaku. Ovi medijumi obično sadrže sve nutrijente koji su potrebni za rast i preživljavanje ćelija. Pogodan medijum za kultivisanje ćelijaE. coli jena primer, čorba Luria Broth (LB) i/ili čorba Terrific Broth (TB). Pogodni medijumi za kultivisanje eukaritoskih ćelija su RPMI 1640, MEM, DMEM, svi sa dodatkom seruma i/ili faktora rasta, u skladu sa zahtevom za svaki posebni soj ćelija koji se kultiviše.

Tipično, antibiotsko ili drugo jedinjenje, korisno za selektivni rast transformiranih ćelija, dodaje se kao jedini dodatak u medijum. Jedinjenje koje treba da se koristi diktira odabrani element markera prisutan u plazmidu, sa kojim su ćelije domaćina transformisane. Na primer, ukoliko je element markera koji se može izabirati rezistentan prema kanamycin-u, jedinjenje koje se dodaje u medijum kulture će biti kanamvcin.

Količina stvorenog proteina u ćelijama domaćina se ocenjuje korišćenjem standardnih metoda, poznatih u stanju tehnike, uključujući analizu VVestem blot, elektroforezu gela SDS-poliakrilamid, elektroforezu gela bez denaturisanja i/ili testove aktivnosti, kao što su testovi pomeranja vezivanja gela DNK.

Ukoliko se protein izlučuje iz ćelija domaćina koje se razlikuju od gram-negativnih bakterija, verovatno je da će se glavnina nalaziti u medijumu kulture. Ukoliko se ne izlučuje, biće prisutan u citoplazmi. Za unutarćelijski protein, tipično se ćelije domaćina prvo mehanički razore. Za protein koji ima periplazmičku lokaciju, mogu se koristiti ili mehaničko razaranje ili osmotski tretman, kako bi se oslobodio periplazmički sadržaj u puferovani rastvor, pa se zatim polipeptid izoluje iz tog rastvora. Posle toga, može se obaviti prečišćavanje iz rastvora, korišćenjem raznih tehnika.

Ukoliko se protein sintetizuje tako da sadrži etiketu, kao što je heksahistidin ili drugi mali peptid, bilo sa karboksilnog ili amino kraja, u suštini on se može prečistiti procesom u jednom koraku, propuštanjem tog rastvora kroz kolonu sa afinitetom, gde matrica te kolone ima visok afinitet prema toj etiketi, ili direktno, prema polipeptidu (tj. monoklonalnom antitelu). Ukoliko taj polipetid nema etiketu i antitela nisu dostupna, mogu se koristiti druge procedure prečišćavanja, na primer, jonoizmenjivačka hromatografija, hromatrografija na molekulskim sitima, hromatografija na reversnoj fazi, HPLC, elektroforeza nativnog gela (nukleotidi 1-783), pored "zrelog" polipetida (nukleotidi 784-1392). Izlučivanje NAT u ovakvom sistemu tipično obuhvata molekul DNK sa sekvencijom SEQ ID NO: 6, koja kodira sekvenciju "prepro" (nukeotidi 1-783), pored "zrelog" polipeptida (nukeotidi 784-1386).

Fibronilitička metaloproteinaza, koja se koristi u skladu sa ovim pronalaskom, bez obzira da li je to NAT, fibrolaza ili neka druga fibrinolitička metaloproteinaza, ordinira se u obliku farmaceutski prihvatljivog rastvora, sama ili sadržeći dodatne farmaceutski prihvatljive sastojke. Ukoliko se želi, ovi rastvori mogu da sadrže, pored fibrinolitičke metaloproteinaze i rastvarač (tj. destilovanu vodu ili fiziološki slani rastvor), standardne sastojke, kao što su stabilizatori (da se spreči agregacija proteina ili fizička ili hemijska razgradnja u vodenom medijumu), agense za povećavanje mase (koji treba da obezbede masu), diluente, antobakterijske agense, agense za podešavanje viskoznosti, antioksidante itd., u konvencionalnim količinama. Poznati dodaci, koji se mogu uključiti u ovu formulaciju su polioli (uključujući manitol, sorbitol i glicerin); šećeri (uključujući glukozu i saharozu); i aminokiseline (uključujući alanin, glicin i glutaminsku kiselinu). Videti na primer, "Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Companv, Easton, Pennsvlvania. Videti takođe, WO 01/24817 A2 (koji je u celini priključen ovde kroz citat), gde se opisuju razni preparati fibrinolitičkih agenasa, koji su korisni u ovom pronalasku.

Poželjno je da se farmaceutski preparat puferuje (sa biokompatibilnim agensom za puferovanje, na primer, sa limunskom kiselinom ili solju limunske kiseline) do pH koje je ili je blizu neutralnog (pH 7,0), pre ordiniranja, a pH je obično između 6,5 i oko 8.0 (±0,5).

Ukoliko cink predstavlja jon metala fibrinolitičke metaloproteinaze, kao što je fibriolaza ili NAT, može biti poželjno da se kao stabilizator priključi i cinkova so rastvoma u vodi (na primer, cink-sulfat ili cink-acetat). Da bi se pojačala dugotrajna stabilnost i vreme skladištenja ovog preparata, može biti pogodno takođe da se rastvor zamrzne ili konvertuje u liofilizovani proizvod (sušenje smrzavanjem), koji se otkravi ili rekonstituiše pred upotrebu, zavisno od slučaja.

Ilustracije radi, tečan medicinski preparat koji se može zamrznuti, a može koristiti u postupku iz ovog pronalaska, sadrži fibrolazu ili NAT, cinkovu so rastvomu u vodi, limunsku kiselinu kao pufer, opciono uz dodatni stabilizator, koji se bira iz grupe koju čine kalcijumove soli rastvome u vodi i opciono agens za povećavanje mase (npr. manitol). Može se takođe dodati neki surfaktant, kao što je Tween<®>80 (BASF, Gumeee, lllinoius), kako bi se povećala stabilnost pri smrzavanju/ otkravljivaju. Da bi se stabilizovalo pH na ili oko 7,4 može se dodati Tris pufer (Sigma, St. Louis, Missouri) ili neki drugi pufer. Većina ovih sastojaka će biti prisutna u malim koncentracijama, koje se kreću od 0,001 do 2,0 mM, ili u sadržaju manjem od 10 %{ m/ V).Agens za puferovanje se dodaje u količini dovoljnoj za postizanje željenog pH, a ta količina može da varira zavisno od specifičnosti formulacije.

Ilustracije radi, farmaceutski preparat koji se može liofilizovati, ili koji je liofilizovan, a koji se može korisiti u postupku iz ovog pronalaska, sadrži fibrolazu ili NAT, stabilizator cinka (npr. cinkova so rastvoma u vodi, kao i gore) i limunsku kiselinu kao pufer, sa ili bez dodataka (npr. agens za povećanje mase, kao što su manitol, glicin i slično). Liofilizovani preparat može takođe da sadrži disahardini šećer, kao što su saharoza ili trehaloza, kao i lioprotektor. Može se dodati neki surfaktant, kao što je Tween<®>80, za zaštitu fibrinolitičke metaloproteinaze (npr, fibrolaza, ili NAT) od naprezanja pri liofilizaciji. Idealno je da se pH održava na 8,0 ± 0,5, korišćenjem pogodnog pufera, čije je pKau ovoj oblasti (na primer, Tris). Količine sastojaka su saglasne sa onima datim gore.

Kao što je pomenuto, u nekim realizacijama postupak iz ovog pronalaska se koristi za lokalno ordiniranje biološki efikasne količine fibrinolitičke metaloproteinaze, koja se nalazi unutar opsega doze između 0,025 i 1,7 mg/kg. Poželjno je da ova količina bude u opsegu od oko 0,1 do oko 0,5 mg/kg. Jačina rastvora se formuliše u skladu sa tim, a razblaživanje se ostvaruje, ako je potrebno, prilikom ordiniranja.

Nasuprot tretiranju tromboze u nativnoj arteriji ili veni, kao što je PAO, tretman krvnog igruška koji se desio u implantiranom ili prepariranom uređaju za vaskulami pristup, predstavlja dodatni izazov. Na primer, u slučaju okludiranog centralnog venskog suda, "mrtva zapremina" katetera (tj. unutrašnji prečnik katetra pomnožen njegovom dužinom) defmiše maksimalnu zapreminu koja može biti sadržana u tom kateteru. Na primer, kateter unutrašnjeg prečnika 1,0 mm i dužine 40,0 cm ima mrtvu zapreminu od -0,3 mL. Zato što je ova zapremina tako ograničena, važno je definisati odgovarajuću jačinu rastvora. U skladu sa tim, povećanje jačine rastvora, ili koncentracije, je efikasan način za povećanje količine leka koji je na raspolaganju za rastvaranje ciljanog krvnog ugruška.

U nekim realizacijama, postupak iz ovog pronalaska se odnosi na upotrebu fibrinolitičke metaloproteinaze u tretmanu okluzija povezanih sa uređajem za vaskulami pristup. Ti ugrušci se mogu dogoditi u, oko, ili biti pripojeni uz uređaje za vaskulami pristup. Tipično, ugrušci se formiraju u lumenu ili u izlaznom otvoru uređaja, kao što je kateter, i mogu da interferiraju sa funkcijom katetera. Ugrušci mogu takođe da nastanu na spoljašnjosti uređaja za vaskulami pristup, kao što je krilce koje može da pokriva izlazni otvor, čime se sprečava unošenje leka ili vađenje krvi. Ugrušci mogu takođe biti pripojeni uz uređaj za vaskulami pristup, interferirajući sa korektnim funkcionisanjem tog uređaja. Ova interferencija može da bude rezultat delimične okluzije ili blokade, tj. kada nešto fluida može da prolazi, ili potpune okluzije, kada fluid ne prolazi.

Da bi se prikazao jedan postupak iz ovog pronalaska, upotrebljen je model okluzije kateterain vitro,da se stimuliše ugrušak u uređaju tipa prepariranog katetera. U ovom modelu, koriste se Pasteur-ove pipete obložene kolagenom, da se simulira preparirani deo katetera. Humana krv se uvuče kapilarnim dejstvom u dužini 3,0 mm, pa se ostavi da se zgruša. Vrh pipete se unese u fiolu koja sadrži slani rastvor, a druga u rastvor sa 4 mg NAT (100 uL rastvora jačine 40 mg/mL). Slika 5 ilustruje rezultate ovog modela okluzije kateterain vitro,koji pokazuju da je ugrušak u slanom rastvoru netaknut, dok je ugrušak u rastvoru sa 40 mg/mL aktivan po pitanju rastvaranja ugruška.

U sledećem eksperimentu, odvojena grupa pipeta (svaka sadrži ugrušak krvi na njenom vrhu) se unese i inkubira u fioli koja sadrži: 100 uL slanog rastvora, 100 uL rastvora urokinaze (5000 internacionalnih jedinica/mL) i 100 uL rastvora NAT, gde količina leka varira od 0,5 do 4 mg, sa povećanjem jačine rastvora od 5 mg/mL do 40 mg/mL. Slika 6 ilustruje zbirne rezultate brojnih eksperimenata, što vodi usrednjenim podacima koji pokazuju da NAT rastvara okluzijein vitroi do 40% brže nego Abbokinase<®>OpenCath<®>, komercijalni proizvod urokinaze za čišćenje katetera (druga kolona, UK 500 Int. jed.). Slika 6 pokazuje takođe da NAT zavisi od doze u pogledu brzine kojom NAT deluje na proteolitičku razgradnju krvnog ugruška.

Za tretman relativno malih okluzija u prepariranom kateteru, kao što su one simulirane na modelu okluzije kateterain vitro,poželjan opseg za tretman bi bio od približno 5 do 40 mg/mL fibrolaze, NAT ili druge fibrinolitičke metaloproteinaze. Međutim, zavisno od vrste i veličine uređaja za vaskulami pristup ili drugog medicinskog uređaja, i položaja, veličine i domašaja okludovanog ugruška, mogu biti potrebne ili mnogo manje ili veće doze. Na primer, ugrušak u relativno velikom šantu verovatno je da će zahtevati veće koncentracije fibrinolitičke metaloproteinaze, nego ugrušak koji blokira izlazni otvor katetera prečnika 1,0 mL. U skladu sa tim, koncentracije za ovu indikaciju mogu se kretati od približno 0,1 mg/mL ili manje, do preko 80 mg/mL.

Za krvne ugruške locirane u, oko, ili pripojene uz preparirani uređaj za vaskulami pristup, efikasna doza se može osloboditi na brojne načine, uključujući povremenu infuziju, kontinualnu infuziju, bolus ordiniranje, ili kombinaciju sva tri. Uzimajući u obzir teškoće, označene ograničenjima "mrtve zapremine", obično je poželjno bolus ordiniranje.

U tipičnom slučaju, postupak iz ovog pronalaska se obavlja zajednički sa procedurom trombolize usmerene kateterom. Ta procedura obuhvata upotebu prethodno sterilisanog uređaja za oslobađanje leka tipa katetera, čiji su bočni zidovi napravljeni od tankog polu-krutog ili fleksibilnog biokompatibilnog materijala (na primer, poliolefina, fluoropolimera, ili drugog inertnog polimera). Obično, pogodan katater sadrži najmanje jednu unutrašnju šupljinu (ili lumen) koja se proteže čitavom dužinom uređaja. Materijal od koga se konstruiše kateter je dovoljno fleksibilan da se može pomerati kroz unutrašnjost vaskulature, bez izazivanja povreda na zidovima krvnog suda, a ipak dovoljno krut da se može protegnuti duž čitavog rastojanja do mesta tretmana, dok unutrašnja šupljina tog uređaja ostaje potpuno otvorena. Tipično, ovakav kateterski uređaj se kreće od 2 do 20 cm, na francuskoj skali za prečnike katetera (1/3 mm je jednaka 1 francuski podeljak), a u dužini od oko 60 cm do oko 2 m.

Katetrski uređaji za primer, za intravaskulamo oslobađanje trombolitičke medikacije u skladu sa ovim pronalaskom, ilustrovani su na slikama 2 i 3, a njihova praktična primena je detaljno opisana u primerima koji slede. Međutim, može se upotrebiti bilo koji konvencionalni kateter ili uređaj za vaskularni pristup, koji je podesan za ovaj postupak, uključujući, ali bez ograničavanja, specifične uređaje na koje se ovde poziva.

Na primer, Slika 2 ilustruje tip kateterskog uređaja dizajniranog za lokalno oslobađanje trombolitičkog agensa u krvni sud. Uređaj, koji je prikazan na porečnom preseku, sadrži "bočne rupice" na kraju za oslobađanje, kroz koje se ispušta infuzat (trombolitički agens), pod pritiskom primenjenog fluida. Prečnici kataterskih cevčica na ovoj slici i sledećoj slici, relativno prema ukupnoj njihovoj veličini, su prenaglašeni, da se bolje prikažu detalji. Videti takođe Sliku 3, koja ilustruje poprečni presek alternativnog tipa kateterskog uređaja za lokalizovano oslobađanje trombolitičkog agensa u krvni sud. Ovaj uređaj sadrži tanke proreze, koji se nazivaju "oduške za pritisak" (PRO), usečene u "zidu katetera u pravilnim razmacima, tako da se infuzat ispušta kada pritisak fluida unutar katetera dostigne kritičnu tačku, izazivajući otvaranje ovih proreza. Ovaj uređaj se može koristiti zajednički sa automatizovanim, klipnim uređajem za pulsirajuću infuziju (koji nije-prikazan, ali je uzet za primer u nastavku), koji je u stanju da daje pulseve infuzije leka.

Za krvne ugruške koji se stvaraju u veni ili arteriji i nisu povezani sa uvođenjem vaskulamog ili drugog medicisnkog uređaja, efikasna doza fibrinolitičke metaloproteinaze se može osloboditi kroz kateter na lokalno mesto tretiranja pulsirajućom infuzijom, kontinualnom infuzijom, bolus ordiniranjem ili kombinacijom sva tri. Jačina rastvora (tj. koncentracija) fibrinolitičke metaloproteinaze u rastvoru za tretiranje takođe je zanačajn parametar za ove tipove ugrušaka. Određenije, treba odabratii opseg između minimalnog razblaženja fibrinolitičke metaloproteinaze za postizanje efikasnosti, sa donjeg kraja (što je naročito značajno kod bolus ordiniranja) i maksimalne rastvorljivosti fibrinolitičke metaloproteinaze, sa gornjeg kraja. Obično se koriste jačine rastvora u opsegu od oko 0,1 do oko 80 mg/mL. Zapremina bolusa (ili ukupna zapremina višestrukih bolusa, u slučaju "pulsnog" oslobađanja) bira se zatim u skladu sa oslobađanjem efikasne količine fibrinolitičke metaloproteinaze unutar opsega propisanog gore.

Ovaj pronalazak ilustrovan je još primerima koji slede, za koje se podrazumeva da su samo ilustrativni, a ne da ograničavaju ovaj pronalazak samo na opisane realizacije. U ovim primerima i kroz ceo opis ovog pronalaska, "kg" označava masu tela ispitivanog subjekta u kliogramima, "mg" označava miligrame, "mL" označava mililitre, a "min" označava minute. Ilustrovana fibrinolitička metaloproteinaza, naime Novel Acting Thrombolvtic (NAT), izvedena je rekombinantno i napravljena u skladu sa metodama na koje se gore poziva.

Primer 1

Tromboliza subakutne tromboze zajedničkog dela karotidne arterije

odrasle svinje

NAT je ispitivan na modelu subakutne tromboze karotidne arterije odraslih svinja, prosečne mase 75 kg, u uslužnoj laboratoriji (Charles River Laboratories, Southbridge, Massachusetts). Namera ovog ispitivanja je da se utvrdi fibrinolitička aktivnost NAT na modelu tromboze, relevantnom za okluziju periferne arterije kod humanih bića.

Na ovom animalnom modelu, tromboza karotidne arterije je nastala ćelom njenom dužinom (približno 20 cm od početka aorte do grananja karotide) kombinacijom povrede pomoću balona, trombina i staze. Veličina tromba se približava veličini tromba koji se klinički opaža kod humanih bića sa okluzijom periferne arterije. Posle uspešne tromboze, životinja se ostavi da se oporavlja tokom perioda od nekoliko dana. Odabran je četvorodnevni period, da se dozvoli ekstenzivno umrežavanje fibrina, remodelovanje tromba i infiltracija ćelija. Uzgred, i veličina i starost tromba u ovom modelu rezonski predstavljaju veličinu i trajanje ishemičkih simptoma, koji su objavljeni u nedavno objavljenom ispitivanju trombolize TOPAS, sa aktivatorima plazminogena u okluziji periferne arterije kod humanih bića. Za literaturu videti, Ouriel et al.,New England Jounral of Medicine,1998, 338, 1105-1111.

Ukratko, u zajedničkom delu karotidne arterije tromboza se može dobiti čitavom njenom dužinom pomoću fluoroskopski usmeravane povrede sa balonom. Baloni koji se koriste su predimenzionisane veličine i neodgovarajući. Baloni se naduvaju pritiskom i do 12 bar, što izaziva povredu raskidanja intimnog sloja krvnog suda. Dok se balon naduvava, pomera se napred-nazad, kako bi se sastrugao endotelijum krvnog suda.

Ova procedura uvođenja balona stvara velike povrede i površinu krvnog suda koja je veoma podložna stvaranju tromba, a ponavlja se čitavom dužinom zajedničkog dela karotidne arterije. Posle potpunog povređivanja čitave ove arterije izvuče se balon u prednji položaj, blizu aorte i naduva, da se okludira protok krvi kroz ovaj krvni sud. Dok je okludiran, kroz distallni otvor katetera balona injektira se 50 jedinica goveđeg trombina, kako bi se stimulisala koagulacija. Balon se drži naduvan 30 min, što dovodi do trombotičke okluzije krvnog suda. Posle 30 min balon se izduva i uzme angiogram da se potvrdi da je krvi sud okludiran. Sa ovom procedurom postiže se okluzija krvnog suda u više od 90% slučajeva.

Slika 1A predstavlja osnovni, polazni angiogram karotidne arterije odrasle svinje, pre nego što je izazvana povreda kateterom sa balonom i stvorio se okluzivni tromb. Strelica pokazuje položaj i prisustvo kontrastnog medijuma u zajedničkom delu leve karotidne arterije, pokazujući da krv protiče kroz arteriju bez opstrukcije (tj. krvni sud je "prohodan" ili ima ""). Slika 1B je angiogram koji je uzet četvrtog dana istoj životinji, pre ordiniranja NAT, u skladu sa postupkom iz ovog pronalaska. Strelica pokazuje položaj zajedničkog dela leve karotidne arterije, ali kontrasni medijum ne protiče kroz arteriju usled prisustva okluzivnog tromba. Slika 1C je angiogram uzet 2 h posle ordiniranja 30 mg NAT, kroz kateter "PRO"

(videti Sliku 3 za ilustraciju ovog uređaja). Strelica pokazuje prisustvo kontrasnog medijuma u krvnom sudu, što pokazuje da je prohodnost u levoj karotidnoj arteriji obnovljena. U lumenu arterije je vidljiv minimalni zaostali tromb.

Kada nastane tromb, kateter sa balonom, vodeći kateter i pristupna manžetna se uklone, i životinja se ostavi da se oporavi tokom perioda od 4 dana. Četvrtog dana životinje se ponovo anesteziraju, ponovo potvrdi okluzija, pa se uvede kateter za oslobađanje leka sa više bočnih rupica (videti Slike 2 i 3), uz fluoroskopsko navođenje, i postavi se tako da su bične rupice locirane unutar tromba. Tromboliza uz pomoć NAT se posmatra angiografski, korišćenjem fiksiranog doziranja NAT, koje se kretalo od 10 do 30 mg (ili približno od 0,1 do 0,4 mg/kg, na bazi podešene mase), kao što pokazuju Slike 1A-1C.

Kao što ilustruje slika 1B, NAT je efikasan u obnavljanju prethodnog protoka, što se ocenjujeangiografijom. Da bi se to iskazalo kvantitativno, protok kroz ciljani krvni sud se kvantitativno ocenjuje u skladu sa 4-članom skalom (koja se kreće od 0 do 3), gde su:

0 = nema protoka

1 = procenjuje se da je protok manji od 30% nego u kontralateralnoj karotidi (bez tromba) 2 = procenjuje se da je protok manji od 30-80% nego u kontralateralnoj karotidi 3 = protok se ne može razlikovati od istog u kontralateralnoj karotidi.

Ono što je pokazano na Slici 1B ocenjeno je na gornjoj skali kao 3, što je čest rezultat u krvnim sudovima sa trombom koji su tretirani dozom od 30 mg NAT (približno 0,4 mg/kg kod svinje od 75 kg). Tabele 1-3 u primerima koji slede ilustruju režime tretmana i vrednosti srednjeg protoka, dobijene iz serijskih angiograma. U svim ovim ispitivanjima, respiracija, telesna temperatura, otkucaji srca i arterijski krvni pritisak su kontinualno praćeni, a ostali su unutar fizioloških granica, bez opaženih promena nakon ordiniraja NAT.

Primer 2

Izbor katetera i oslobađanja raspršivanjem u pulsevima

U kliničkom tretmanu okluzije periferne arterije trombolitički agensi se oslobađaju kroz katetere koji su postavljeni blizu ili uronjeni u tromb. Kao što je pokazano na Slikama 2 i 3, obično postoje dva tipa katetera koji se koriste.

Jedna varijanta, kateter sa "bočnim rupicama" (Slika 2) ima bočno male, okrugle rupice (2) urezane u kateter (4) u blizini zatvorenog distalnog kraja 6, i ulazni otvor 8 (za rastvor fibrinolitičke metaloproteinaze), u pripojenom prstenu 10, fiksiranom sa prednjeg kraja 12. Kateter se konstruiše kao cev od fleksibilnog, dugačkog, biokompatibilnog polimemog materijala, koja je šuplja, tankih zidova i ima uniforman prečnik od 2 do 20 francuskih podeljaka, poželjno od 3 do 5 francuskih podeljaka. Ovaj kateter, na spoljašnjoj površini, blizu distalnog kraja 6, sadrži dva radiološki neprozirna markera 14; koji ograničavaju onaj deo katetera koji sadrži bočne rupice 2. U praksi, ovaj kateter se ubacuje kroz hirurški načinjen otvor u okludovanoj arteriji ili veni, dok se posmatra preko fluoroskopije, u skladu sa standardno prihvaćenom procedurom, pa se pažljivo pomera kroz - krvni sud, tako da se distalni kraj 6 može smestiti u ili u blizinu tromba. Markeri 14, koji se jasno vide na fluoroskoskom vidnom polju, mogu da služe za navođenje i postavljanje tog dela katetera, tako da infuzat koji izlazi iz bočnih rupica 2, dolazi direktno u kontakt sa trombom. Zatim se farmaceutski rastvor fibrinolitičke metaloproteinaze injektira, pod blagim pritiskom iz rezervoara nalik špricu 16, kroz ulazni deo 8, pa potoskuje prema distalnom delu 6, izlazeći kroz rupice 2 u tromb, što izaziva razgradnju fibrinoznog materijala.

Kada se daju infuzije fibrinolitičke metaloproteinaze, korišćenjem ovog tipa katetera, većina rastvora, koji sadrži fibrinolitički agens, teži da izađe kroz najbliže bočne rupice (tj. one koje su najbliže ulaznom otvoru 8), što ima negativan uticaj na uniformnost oslobađanja leka na mestu tretmana. Postoji takođe mogućnost povratnog toka krvi u kateter kroz bočne otvore 2, usled negativnog pritiska.

Druga varijanta katetera, takođe načinjenog od okruglog, biokompatibilnog polimemog materijala tankih zidova, prikazana na Slici 3, ima ekstremno tanke proreze 2, isečene laserom u fleksibilnom kateteru 4, u pravilnim intervalima blizu distalnog kraja 6. Ovi prorezi, koji će se nazivati izlaznim otvorima koji su oduška pritisku ("PRO"), su dovoljno tesni da infuzat ne izlazi ukoliko pritisak fluida unutar katetera ne dostigne kritičnu vrednost koja izaziva da se prorezi istovremeno naduju i na taj način privremeno otvore. Ovaj kateter može takođe da sadrži spoljašnje radiološki neproizirne markere 8, koji pomažu u postavljanju tog uređaja na mesto gde je tromb.

Idealno, ovi "PRO" infuzioni kateteri se koriste zajednički sa automatizovanim, klipnim uređajem za pulsiranu infuziju (nije prikazan), koji je u stanju da oslobađa regulisane pulseve male zapremine infuzionog leka u ulazni otvor 10, preko pripojenog prstena 12 pričvršećnog za prednji kraj 14 katetera 4. Kada se ovakav puls oslobodi, pritisak unutar katetera se trenutno povisi. Odgovor na to je da se izlazni odušci za pritisak (prorezi 2) trenutno otvore i dozvole infuzatu (npr. farmaceutski rastvor fibrinolitičke metaloproteinaze) da izađe. Teorijska prednost pulsiranog oslobađanja infuzata i katetera tipa PRO, je u tome što se infuzat oslobađa uniformno kroz proreze, ćelom dužinom katetera, dok infuzat oslobođen kroz "bočne rupice" katetera (Slika 2) sledi šemu najmanjeg otpora i protiče kroz rupice bliže prednjoj strani, neuniformno, kao što je več pomenuto.

Model četri dana stare tromboze karotide kod svinja se koristi za testiranje performansi gore pomenuta dva tipa katetera, korišćenjem fiksiranih doza od 30 mg NAT (približno 0,4 mg/kg kod svinje od 75 kg). Rezultati su sabrani u Tabeli 1.

Kao što pokazuje Tabela 1, rezultati angiografskog protoka u grupi tretiranoj sa varijantom rasprišavanja pulsevima je pokazao rezultate malo većeg početnog protoka na angiogramu od 30 min, koji se nisu izmenili do vremena od 4 h. Mada nisu dobijene statističke razlike, angiografski rezultati su procenjeni kao bolji. Stoga, kateter tipa PRO, zajednički sa oslobađanjem raspršivanjem pomoću pulseva, je poželjniji način oslobađanja fibrinolitičke metaloproteinaze, u skladu sa ovim pronalaskom.

Primer 3

Testiranje vremena oslobađanja leka

Akutna periferna arterijska okluzija se tipično tretira sa aktivatorima plazminogena, kao što je urokinaza, oslobođenog infuzijom, što često traje 24 h, a povremeno i 48 h. Dužina trajanja infuzije predpostavlja se da održava nizak nivo generisanja plazmina tokom produženog perioda vremena, sa ciljem efikasnog rastvaranja okluzivnog tromba. Poto su i NAT i fibrolaza fibrinolitičke metaloproteinaze, ovako produžene infuzije ne moraju biti neophodne. Da bi se ocenilo da li brzina oslobađanja utiče na lizu ugruška angigrafski, fiksirana doza NAT od 30 mg (grubo 0,4 mg/kg svinje od 75 kg) se oslobađa korišćenjem katetera PRO i uređaja za raspršivanje pulsiranjem. Koristeći zapremine pulsa od 0,1 mL, oslobađa se rastvor NAT od 5 mg/mL tokom 6 min (deset pulseva na minut), ili tokom 60 min (1 puls na minut). Rezultati su pokazani u Tabeli 2.

Kao što je pokazano u Tabeli 2, oslobađanje 30 mg NAT tokom 6 min daje srednji rezultat od 2,7 kod 3 životinje, na angiogramu od 30 min, koji ostaje neizmenjen sve do vremena od 4 h. Nasuprot, oslobađanje 30 mg NAT pulsirajućom infuzijom tokom 60 min je daleko manje impresivno. Mada ovi podaci nisu statistički poređeni, ovi rezultati govore u prilog oslobađanja NAT bržim režimom pulsiranja.

Primer 4

Optimizacija zapremine pulsa

Uređaj za infuziju raspršivanjem pomoću pulsiranja može da se programira u pogledu oslobođene zapremine u pulsu, od 0,1 do 0,5 mL po pulsu. Da bi se odredilo da li zapremina pulsa ima bilo kakav efekat na angiografski rezultat na modelu svinje, poređene su zapremine pulsa od 0,2 mL sa zapreminama pulsa od 0,4 mL. NAT je oslobađan sa fiksnom dozom od 10 mg (ekvivalentno 0,15 mg/kg svinje). Rezultati su prikazani u Tabeli 3.

Kao što je pokazano u Tabeli 3, u 30. min srednji agiografski rezultat je nešto viši u grupi sa zapreminom pulsa od 0,4 mL. Međutim, u vremenu od 4 h, srednja vrednost grupe je nešto viša za zapreminu pulsa od 0,2 mL. Prema tome, iz ovih ispitivanja ne može se izvući zaključak u pogledu toga da je jedna zapremina pulsa bolja od druge.

Rezultati u prethodnom tekstu i tabelama pokazuju sa su praktično svi ovi režimi tretiranja sa NAT efikasni u tretiranju okluzija periferne arterije, postupkom olsobađanja iz ovog pronalaska, i da su ti rezultati bar uporedivi sa tretmanom pomoću aktivatora plazminogena, kao što je urokinaza, koji predstavlja današnji odabrani tretman sa trombolitičkim agensima.

Ovi rezultati pokazuju da kateter PRO sa raspršivanjem pomoću pulsiranja daje bolje angiografske rezultate. Za datu masu životinja (70-100 kg), fiksirana doza od 30 mg je grubo ekvivalentna 0,3-0,4 mg/kg podešeno prema masi.

Smanjivanje fiksirane doze NAT na 10 mg dalo je smanjenje srednje vrednosti angiografskih rezultata grupe, a kod nekih životinja prohodnost nije postignuta. Ovo ukazuje da se doza od 10 mg smatra dozom praga biološke aktivnosti na ovom modelu. Za datu masu životinja u ovim ispitivanjima (70-100 kg), fiksna doza od 10 mg je grubo ekvivalentna 0,1-0,15 mg/kg na bazi podešene mase. Variranje zapremine pulsa od 0,2 mL na 0,4 mL nije se pokazalo da dublje utiče na angiografske rezultate prohodnosti.

Primer 5

Utvrđivanje bezbednog.dobro podnošljivog, biološki efikasnog

opsega doze kod humanih bića

Ne postoji zadovoljavajuća literatura u pogledu koncentracije u serumu ili biohemijske aktivnosti a2-makroglobulina kod starijih pacijenata sa perifernom vaskulamom bolešću (PVD). Pošto su koncentracije <x2-makroglobulina ključna odrednica za bezbednost, a verovatno je da su povezane sa tolerantnošću fibrinolitičkih metaloproteinazain vivo,obavljeno je ukršteno epidemiološko ispitivanje na pacijentima sa PVD, da bi se ocenila koncentracija a2-makroglobulina i kapacitet vezivanja fibrinolitičke metaloproteinaze (korišćenjem NAT kao testiranog agensa).

U dva centra, uključeno je 216 pacijenata (Cleveland Clinic Foundation, Cleveland, OH, i Rochester General Hospital, Rochester, NY). Prikupljene su demografske informacije i druge karakteristike pacijenata, a serum je dobijen merenjem a2-makroglobulina, kapaciteta vezivanja NAT (titrisanjem uzoraka seruma kod pojedinih pacijenata, korišćenjem testa HPLC koji detektuje nevezani NAT) i drugih parametara hernije seruma. Primami zadatak je određivanje veze između koncentracije a.2-makroglobulina u serumu i količine NAT (u ug/mL seruma) koja se može neutralisatiin vitro(kapacitet vezivanja

NAT).

Poređenje karakteristika pacijenata u ovom ispitivanju sa onima iz dve najveće objavljene studije trombolize PAO (tj. studije STILE i TOPAS) pokazuje da je populacija pacijenata u ovom ispitivanju reprezentativna i za prethodne studije trombolize PAO; za ostale detalje u prethodnim studijama videtiAnnals ofSurgery,1994, 220, 251-266 i Ouriel et a!.,New England Journal of Medicine,1998, 338,1105-1111, respektivno.

Za svakog pacijenta je izračunata procenjena maksimalna doza (EMD) NAT, koristeći kapacitet vezivanja NAT, i procena zapremine plazme za svakog pacijenta. Rezultati ispitivanja predviđaju da prosečan pacijent može da primi dozu od 1,7 mg/kg (oslobođenu ili lokalno lili sistemski), a da se ne prevaziđe kapacitet vezivanja a2-makroglobulina za vezivanje i neutralizaciju NAT. Rezultati ovog ispitivanja su sabrani na Slici 4.

Na Slici 4, ocenjena maksimalna doza NAT je izračunata za svakog od 216 pacijenata u ovom ispitivanju. Rezultati ovog ispitivanja su prikazani kao histogram, u kome se vizuelnim opažanjem može videti zvonasta raspodela. Predviđa se daje prosečan pacijent u ovom ispitivanju u stanju da podnese 1,7 mg/kg NAT (pik raspodele zvonastog oblika). Doze ordinirane u ispitivanjima na životinjama prikazane su kao referentne (sa desne strane) i može se videti da su veće od ocenjenih maksimalnih doza NAT kod 99% populacije iz ovog ispitivanja.

Prema tome, propisani opseg od 0,025 do 1,7 mg/kg u ovom pronalasku, predstavlja racionalnu procenu doze pacijenata koji na primer, mogu da je prime bezbedno, (na osnovu zapremine plazme i kapaciteta vezivanja NAT za <x2-makroglobulin), bez pojave slobodnog NAT u krvotoku.

U zaključku, rezultati farmakoloških ispitivanja uzetih za primer, Primeri 1-4 gore, pokazuju biološku efikasnost fibrinolitičke metaloproteinaze kao agensa za lizu ugruška, na animalnom modelu tromboze, gde je tromb uporediv po veličini i starosti sa istima koji se često sreću u perifernim arterijskim okluzijama kod humanih bića. Doze, identifikovane na animalnim modelima, dobijene su bez uzimanja u obzir ili testiranja potencijalnih toksičnosti kod animalnog bića. Efikasnost doze kod zečeva i pasa (3,7 i 4,0 mg/kg, respektivno), kao što su opisali Ahmed et al. i Markland et al. (gore), mogu da omoguće upotrebu fibrinolitičkih metaloproteinaza u veterini. Međutim, kada se posmatraju u prisustvi podataka na humanim bićima, ordinranje doze od 3,7 i 4,0 mg/kg moglo bi biti predozirano kod 99% pacijenata, prema isptivanju na populaciji. Prema tome, objavljena isptivanja na animalnim bićima ne omogućavaju terapeutsku upotrebu fubrinolitičkih metaloproteinaza kod humanih bića, na način koji bi bio bezbedan, i biološki efikasan. S druge strane, podaci dati u Primeru 5, omogućavaju takvu upotrebu kod humanih bića.

Claims (54)

1. Postupak za lizu krvnog ugruška u, oko, ili pripojenog uz preparirani uređaj za vaskularni pristup humanom biću, naznačen time, što se sastoji od ordiniranja kroz pomenuti uređaj za vaskulami pristup količine fibrinolitičke metaloproteinaze koja ne prevazilazi 1,7 mg fibrinolitičke metaloproteinaze po kg telesne mase humanog bića.

2. Postupak za lizu krvnog ugruška u, oko, ili pripojenog uz preparirani uređaj za vaskulami pristup humanom biću, naznačen time, što se sastoji od ordiniranja kroz pomenuti uređaj za vaskulami pristup količine fibrinolitičke metaloproteinaze koja kompleksira sa a2-makroglobulinom, u količini dovoljnoj da olakša lizu tog ugruška, ali ne prevazilazeći značajno sadržajem nivo zasićenosti a2-makroglobulina kod pomenutog humanog bića.

3. Postupak prema Zahtevu 1 ili 2, naznačen time, što sadrži 0,1 do 80 mg/mL fibrinolitičke metaloproteinaze.

4. Postupak prema Zahtevu 1 ili 2, naznačen time, što sadrži 0,1 do 50 mg/mL fibrinolitičke metaloproteinaze.

5. Postupak prema Zahtevu 1 ili 2, naznačen time, što pomenuti uređaj za vaskulami pristup predstavlja kateter.

6. Postupak prema Zahtevu 1 ili 2, naznačen time, što pomenuti uređaj za vaskulami pristup predstavlja šant.

7. Postupak prema Zahtevu 1 ili 2, naznačen time, što pomenuti uređaj za vaskulami pristup predstavlja pristupni graft.

8. Postupak prema Zahtevu 1 ili 2, naznačen time, što pomenuti uređaj za vaskulami pristup predstavlja igla.

9. Postupak prema Zahtevu 1 ili 2, naznačen time, što se uređaj za vaskulami pristup koristi za uvođenje tečnog preparata u humanu arteriju ili venu.

10. Postupak prema Zahtevu 1 ili 2, naznačen time, što se uređaj za vaskulami pristup koristi za uzimanje krvi iz humane arterije ili vene.

11. Postupak prema Zahtevu 1 ili 2, naznačen time, što se uređaj za vaskulami pristup koristi u vezi sa procedurom hemodijalize.

12. Postupak prema Zahtevu 1 ili 2, naznačen time, što se uređaj za vaskulami pristup koristi u vezi sa procedurom transfuzije krvi.

13. Postupak prema Zahtevu 1 ili 2, naznačen time, što se uređaj za vaskulami pristup koristi u vezi sa hemoterapijom.

14. Postupak prema Zahtevu 1 ili 2, naznačen time, što se koristi za tretiranje perifernih arterijskih okluzija.

15. Postupak prema Zahtevu 1 ili 2, naznačen time, što se uređaj za vaskulami pristup koristi u vezi sa vađenjem krvi.

16. Postupak prema Zahtevu 1 ili 2, naznačen time, što je pomenuti krvni ugrušak smešten na unutrašnjoj površini prepariranog uređaja za vaskulami pristup.

17. Postupak prema Zahtevu 1 ili 2, naznačen time, što je pomenuti krvni" ugrušak smešten na spoljašnjoj površini prepariranog uređaja za vaskulami pristup.

18. Postupak prema Zahtevu -1 ili 2, naznačen time, što je pomenuti krvni ugrušak pripojen uz preparirani uređaj za vaskularni pristup.

19. Postupak prema Zahtevu 1 ili 2, naznačen time, što je pomenuti uređaj za vaskulami pristup smešten u arteriji.

20. Postupak prema Zahtevu 1 ili 2, naznačen time, što je pomenuti uređaj za vaskulami pristup smešten u veni.

21. Postupak prema Zahtevu 1 ili 2, naznačen time, što se pomenuti uređaj za vaskulami pristup sastoji od kateterskog uređaja sa "bočnim rupicama".

22. Postupak prema Zahtevu 1 ili 2, naznačen time, što se pomenuti uređaj za vaskulami pristup sastoji od uređaja za katetersko oslobađanje sa "oduškom za pritisak" (PRO).

23. Postupak prema Zahtevu 1 ili 2, naznačen time, što se rastvor fibrinolitičke metaloproteinaze ordinira kao bolus.

24. Postupak prema Zahtevu 1 ili 2, naznačen time, što fibrinolitičku metaloproteinazu predstavlja Novel Acting Thrombolvtic (NAT).

25. Postupak prema Zahtevu 1 ili 2, naznačen time, što fibrinolitičku metaloproteinazu predstavlja fibrolaza.

26. Postupak za obnavljanje prohodnosti prepariranog uređaja za vaskulami pristup, koji se upotrebljava kod humanih bića sa okluzijom na bazi fibrina, naznačen time, što se kroz pomenuti uređaj za vaskulami pristup ordinira količina fibrinolitičke metaloproteinaze koja se kompleksira sa a2-makroglobulinom, u količini dovoljnoj da olakša lizu ugruška, ali da sadržajem značajno ne prevaziđe nivo zasićenosti a2-makroglobulina kod pomenutog humanog bića, gde pomenuta količina ne prevazilazi 1,7 mg fibrinolitičke metaloproteinaze po kg telesne mase humanog bića.

27. Postupak za obnavljanje funkcije prepariranog uređaja za vaskulami pristup, koji se upotrebljava kod humanih bića sa okluzijom na bazi fibrina, naznačen time, što se kroz pomenuti uređaj za vaskulami pristup ordinira količina fibrinolitičke metaloproteinaze koja se kompleksira sa a2-makroglobulinom, u količini dovoljnoj da olakša lizu ugruška, ali da sadržajem značajno ne prevaziđe nivo zasićenosti a2-makroglobulina kod pomenutog humanog bića, gde pomenuta količina ne prevazilazi 1,7 mg fibrinolitičke metaloproteinaze po kg telesne mase humanog bića.

28. Upotreba fibrinolitičke metaloproteinaze u količini koja ne prevazilazi 1,7 mg fibrinolitičke metaloproteinaze po kg telesne mase humanog subjekta, u farmaceutski prihvatljivom rastvoru, za proizvodnju medikaneta za terapeutski tretman krvnog ugruška u, oko, ili pripojeng uz preparirani uređaj za vaskulami pristup.

29. Upotreba fibrinolitičke metaloproteinaze koja se kompleksira sa a2-makroglobulinom, u količini dovoljnoj da olakša lizovanje ugruška, ali ne prevazilazeći značajno nivo zasićenosti ct2-makroglobulina u, oko, ili pripojenog uz preparirani uređaj za vaskulami pristup, u farmaceutski prihvatljivom rastvoru, za proizvodnju medikamenta za proteolitičko razlaganje krvnog ugruška u, oko, ili pripojenog uz pomenuti preparirani uređaj za vaskulami pristup.

30. Upotreba prema Zahtevu 28 ili 29, gde fibrinolitička metaloproteinaza ima koncentraciju od 0,1 do 80 mg/mL.

31. Upotreba prema Zahtevu 28 ili 29, gde fibrinolitička metaloproteinaza ima koncentraciju od 0,1 do 50 mg/mL.

32. Upotreba prema Zahtevu 28 ili 29, gde pomenuti uređaj za vaskulami pristup predstavlja kateter.

33. Upotreba prema Zahtevu 28 ili 29, gde pomenuti uređaj za vaskulami pristup predstavlja šant.

34. Upotreba prema Zahtevu 28 ili 29, gde pomenuti uređaj za vaskulami pristup predstavlja pristupni graft.

35. Upotreba prema Zahtevu 28 ili 29, gde pomenuti uređaj za vaskulami pristup predstavlja igla.

36. Upotreba prema Zahtevu 28 ili 29, gde se uređaj za vaskulami pristup koristi za uvođenje tečnog preparata u humanu arteriju ili venu.

37. Upotreba prema Zahtevu 28 ili 29, gde se uređaj za vaskulami pristup koristi za uzimanje krvi iz humane arterije ili vene.

38. Upotreba prema Zahtevu 28 ili 29, gde se uređaj za vaskulami pristup koristi u vezi sa procedurom hemodijalize..

39. Upotreba prema Zahtevu 28 ili 29, gde se uređaj za vaskulami pristup koristi u vezi sa procedurom transfuzije krvi.

40. Upotreba prema Zahtevu 28 ili 29, gde se uređaj za vaskulami pristup koristi u vezi sa hemoterapijom.

41. Upotreba prema Zahtevu 28 ili 29, gde se uređaj za vaskulami pristup koristi za tretiranje perifernih arterijskih okluzija.

42. Upotreba prema Zahtevu 28 ili 29, gde se uređaj za vaskulami pristup koristi u vezi sa davanjem krvi.

43. Upotreba prema Zahtevu 28 ili 29, gde je pomenuti krvni ugrušak lociran na unutrašnjoj površini prepariranog uređaja za vaskulami pristup.

44. Upotreba prema Zahtevu 28 ili 29, gde je pomenuti krvni ugrušak lociran na spoljašnjoj površini prepariranog uređaja za vaskulami pristup.

45. Upotreba prema Zahtevu 28 ili 29, gde je pomenuti krvni ugrušak pripojen uz preparirani uređaj za vaskulami pristup.

46. Upotreba prema Zahtevu 28 ili 29, gde je pomenuti uređaj za vaskulami pristup lociran u arteriji.

47. Upotreba prema Zahtevu 28 ili 29, gde je pomenuti uređaj za vaskulami pristup lociran u veni.

48. Upotreba prema Zahtevu 28 ili 29, gde pomenuti uređaj za vaskulami pristup sadrži kateterski uređaj sa "bočnim rupicama".

49. Upotreba prema Zahtevu 28 ili 29, gde pomenuti uređaj za vaskulami pristup sadrži katetrski uređaj za oslobađanje koji ima "odušku za pritisak" (PRO).

50. Upotreba prema Zahtevu 28 ili 29, gde je pomenuti' medikament pripremljen za ordiniranje bolusom.

51. Upotreba prema Zahtevu 28 ili 29, gde fibrinolitičku metaloproteinazu predstavlja Novel Acting Thrombolvtic (NAT).

52. Upotreba prema Zahtevu 28 ili 29, gde fibrinolitičku metaloproteinazu predstavlja fibrolaza.

53. Upotreba fibrinolitičke metaloproteinaze u količini koja se kompleksira sa a2-makroglobulinom, a u količini koja je dovoljna da olakša lizovanje ugruška, ali ne prevazilazeći značajno nivo sadržaja zasićenosti a2-makroglobulina u humanom subjektu, u farmaceutski prihvatljivom rastvoru, gde pomenuta količina ne prevazilazi 1,7 mg fibrinolitičke metaloproteinaze po kg telesne mase humanog subjekta, za proizvodnju medikamenta za obnavljanje prohodnosti prepariranog uređaja za vaskulami pristup koji ima okluziju na bazi fibrina.

54. Upotreba fibrinolitičke metaloproteinaze u količini koja se kompleksira sa a2-makroglobulinom, a u količini koja je dovoljna da olakša lizovanje ugruška, ali ne prevazilazeći značajno nivo sadržaja zasićenosti a2-makroglobulina u humanom subjektu, u farmaceutski prihvatljivom rastvoru, gde pomenuta količina ne prevazilazi 1,7 mg fibrinolitičke metaloproteinaze po kg telesne mase humanog subjekta, za proizvodnju medikamenta za obnavljanje funkcije prepariranog uređaja za vaskulami pristup koji ima okluziju na bazi fibrina.