RS20050035A

RS20050035A - Terapije bubrežne insuficijencije sa upotrebom interferona -beta

Info

Publication number: RS20050035A
Application number: YUP-2005/0035A
Authority: RS
Inventors: Roy Lobb
Original assignee: Biogen Idec Ma Inc.,
Priority date: 2002-07-17
Filing date: 2003-07-17
Publication date: 2007-06-04
Also published as: EA009938B1; KR20050021502A; IL200892A; AU2003256603B2; MXPA05000658A; EP1553971A4; KR20110053390A; PL374914A1; CA2492649A1; IL200892A0; BR0312947A; JP2011144204A; AU2003256603A1; IL166256A0; UA88440C2; CN101664545A; WO2004006756A2; IL166256A; JP4883665B2; IS7650A

Abstract

Predmeetni pronalazak obezbedjuje postupke za lečenje, kao i medikamente koji se koriste u lečenju sisara koji imaju ili su izloženi riziku od nastanka glomerulonefritisa ili hronične bubrežne insuficijencije. Postupci uključuju primenu lekova na bazi IFN-?.

Description

TERAPIJE BUBREŽNE INSUFICIJENCIJE SA UPOTREBOM

INTERFERONA-P

Stanje tehnike

Hronična bubrežna insuficijencija (HBI) može da se definiše kao progresivno, trajno i značajno smanjenje jačine glomerularne filtracije (JGF), usled značajnog i kontinuiranog gubitka nefrona. Hronična bubrežna insuficijencija tipično počinje od tačke u kojoj hronično smanjenje funkcije bubrega (tj. trajno smanjenje bubrežne funkcije za najmanje 50 - 60%) nastaje zbog nekog oštećenja bubrežnih tkiva koje je izazvalo značajan gubitak nefrona. Inicijalno oštećenje može, mada ne mora biti udruženo sa epizodom akutne bubrežne insuficijencije ili može biti udruženo sa bilo kojim od brojnih bubrežnih poremećaja uključujući, bez ograničenja, bubrežnu bolest u terminalnom stadijumu, hroničnu dijabetičnu nefropatiju, dijabetičnu glomerulopatiju, dijabetičnu bubrežnu hipertrofiju, hipertenzivnu nefrosklerozu, hipertenzivnu glomerulosklerozu, hronični glomerulonefritis, nasledni nefritis, bubrežnu displaziju i hronično odbacivanje nakon transplantacije bubrežnog alografta. Nezavisno od prirode početnog oštećenja, kako nefroni progresivno nestaju i kako se JGF smanjuje, hronična bubrežna insuficijencija se manifestuje "krajnjim zajedničkim putem" znakova i simptoma. Ovo progersivno pogoršanje bubrežne funkcije je sporo, tipično traje godinama ili decenijama kod ljudi, ali je izgleda neizbežno.

Kod ljudi, kako hronična insuficijencija napreduje i kako JGF nastavlja da se smanjuje

do manje od 10% normalne vrednosti (npr. 5-10 ml/min), pacijent ulazi u terminalni stadijum bubrežne bolesti (TSBB). Tokom ove faze, nesposobnost preostalih nefrona da adekvatno ukloni štetne proizvode iz krvi, uz očuvanje korisnih proizvoda i održavanje ravnoteže tečnostt i elektrolita, vodi do stanja u kome mnogi organski sistemi, a posebno kardiovaskularni sistem, mogu brzo da počnu da otkazuju. U ovoj tački, bubrežna insuficijencija brzo progredira do smrtnog ishoda, osim ukoliko pacijent ne bude podvrgnut

terapijskom postupku zamene bubrežne funkcije (tj. hroničnoj hemodijalizi, kontinuiranoj peritonealnoj dijalizi ili transplantaciji bubrega).

Jedna od bolesti bubrega koja može da dovede do HBI je glomerulonefritis. Glomerulonefritis se karakteriše inflamacijom i posledičnim uvećanjem glomerula, koje tipično nastaje usled stvaranja imunih kompleksa. Nakupljanje imunih kompleksa u glomerulima izaziva inflamatorne odgovore, među koje spadaju hipercelularnost, koja može da izazove potpunu ili delimičnu blokadu glomerula, usled, između ostalog, sužavanja lumena kapilara. Jedna od posledica ovog procesa jeste inhibicija normalne filtracione funkcije glomerula. Blokada može da se javi u velikom broju glomerula, što direktno kompromituje bubrežnu funkciju, a često dovodi, do abnormalnog odlaganja proteina u zidovima kapilara koji sačinjavaju glomerul. Ovi depoziti mogu, sa druge strane, da izazovu oštećenje bazalne membrane glomerula. U onim glomerulima koji nisu zahvaćeni javlja se povišena propustljivost, što omogućava velikim količinama proteina da prođu u urin, čime nastaje stanje koje se označava kao proteinurija.

U mnogim slučajevima izraženog glomerulonefritisa, u Boumanovom prostoru nastaju patološke strukture koje se označavaju kao polumeseci, što dalje otežava glomerularnu filtraciju. Ove strukture jedino mogu da budu viđene mikroskopskim ispitivanjem uzoraka tkiva dobijenih biopsijom ili autopsijom, tako da se ne mogu uvek pronaći kod svih aficiranih pacijenata. Polumeseci su manifestacija hipercelularnosti i smatra se da nastaju usled prekomerne, abnormalne proliferacije parijetalnih epitelnih ćelija koje grade unutrašnju membranu Boumanove kapsule. Kliničko ispitivanje je pokazalo da postoji gruba korelacija između procenta glomerula sa polumesecima i kliničke težine oboljenja, a time i prognoze. Kada su prisutni u velikom broju, polumeseci predstavljaju loš prognostički znak.

Otprilike 600 na milion ljudi koristi hroničnu dijalizu svake godine u S.A.D., pri čemu se prosečna cena tretmana približava sumi od oko 60000 - 80000 USD po pacijentu za godinu dana. Od ukupnog broja novih slučajeva terminalnog stadijuma bubrežne bolesti na godišnjem nivou, oko 28 - 33% uzrokovano je dijabetičnom nefropatijom (ili dijabetičnom glomerulopatijom ili dijabetičnom bubrežnom hipertrofijom), 24 - 29% je uzrokovano hipertenzivnom nefrosklerozom (ili hipertenzivnom glomerulosklerozom), a 15 - 22% je uzrokovano glomerulonefritisom. Stopa petogodišnjeg preživljavanja za sve pacijente na hroničnoj dijalizi je oko 40%, ali kod pacijenata starijih od 65 godina, ova vrednost pada na oko 20%. Stoga, postoji potreba za terapijama za sprečavanje nastanka progresivnog gubitka bubrežne funkcije koja oko 200000 pacijenata samo u S.A.D. čini zavisnim od hronične dijalize i koja dovodi do prevremene smrti desetina hiljada pacijenata svake godine.

Suština pronalaska

U jednom rešenju, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za lečenje glomerulonefritisa ili hronične insuficijencije bubrega kod sisara koji boluje od, ili koji će verovatno razviti glomerulonefritis, a koji se sastoji od primene terapijski efikasne količine preparata IFN-(3. Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje upotrebu preparata IFN-B u toku proizvodnje medikamenta za lečenje ili sprečavanje nastanka glomerulonefritisa. Glomerulonefritis može biti izabran iz grupe koju čine fokalna glomeruloskleroza, kolabirajuće glomerulopatije, oboljenje sa minimalnim promenama, glomerulonefritis sa polumesecima, nefritski sindrom, nefrotski sindrom, primarni glomerulonefritis, sekundarni glomerulonefritis, proliferativni glomerulonefritis, membranozni glomerulonefritis, membranoproliferativni glomerulonefritis, glomerulonefritis sa imunim kompleksima, glomerulonefritis sa antitelima protiv glomerularne bazalne membrane, slaboimuni glomerulonefritis, dijabetična glomerulopatija, hronični glomerulonefritis i nasledni nefritis. IFN-(3 može biti u zrelom ili nezrelom obliku i može biti bez početnog metionina. IFN-P može biti humanog porekla, npr. IFN-(3-l i IFN-p-lb. IFN-P može biti protein koji je najmanje 95% identičan sa zrelim oblikom humanog IFN-P pune dužine, čija sekvenca ima ID broj 4. IFN-P može biti zreli oblik humanog IFN-P pune dužine koji sadrži ili koji se sastoji od sekvence čiji je ID broj 4. IFN-P može biti glikoziliran ili neglikoziliran. IFN-P preparat takođe može biti zreli oblik humanog IFN-P pune dužine koji se sastoji od sekvence čiji je ID broj 4, koja je fuzionisana sa konstantnim domenom molekula humanog imunoglobulina, npr. sa teškim lancem IgGl. Na primer, IFN-P preparat može da biti sekvenca čiji je ID broj 14. Takođe, IFN-p preparat može biti pegilirani IFN-p.

IFN-P preparat može da sadrži sredstvo za stabilizaciju, koje može biti aminokiselina kisele reakcije. Takođe, to može biti arginin. IFN-P preparat može imati pH vednost između 4,0 i 7,2. U poželjnom rešenju, IFN-P preparat je AVONEX<®.>

IFN-P preparat može da se primeni parenteralno, npr. intravenski (i.v.), subkutano i intramuskularno (Lm.). Postupak prema predmetnom pronalasku može da obuhvati primenu kod sisara nekoliko doza IFN-P preparata. IFN-P preparat može biti primenjivan tokom nekoliko dana. Na primer, može biti primenjen jednom nedeljno u dozi od 6 MIU. Takođe, može biti primenjivan tri puta nedeljno u dozi od 3, 6 ili 12 MIU. Primena IFN-P preparata može dovesti do smanjenja, npr. proteinurije, proliferacije glomerularnih ćelija ili glomerularne inflamacije kod sisara.

U poželjnom rešenju, sisar je čovek. Čovek može biti pacijent. Sisar može biti onaj sisar koji će verovatno razviti glomerulonefritis kao što je naznačeno, npr. ispoljavanjem znakova nastajuće inflamacije barem jednog glomerula. Sisar može biti sisar koji će verovatno razviti hroničnu bubrežnu insuficijenciju ili sisar koji poseduje hroničnu bubrežnu insuficijenciju kao što je naznačeno, npr. koji poseduje smanjenu bubrežnu funkciju. Sisar koji poseduje glomerulonefritis jeste onaj sisar kod koga je prisutna inflamacija makar jednog glomerula; hipertrofija glomerula; hipertrofija tubula; glomeruloskleroza; ili tubulointersticijalna skleroza. U određenim rešenjima, sisar nije onaj sisar koji je nosilac virusa, npr. virusa hepatitisa, kao što je virus hepatitisa B ili C, koji dovodi do glomerulonefritisa ili koji direktno izaziva glomerulonefritis. U drugim rešenjima, sisar se ne nalazi u terminalnom stadijumu bubrežne bolesti ili ne poseduje karcinom bubrežnih ćelija.

Kratak opis crteža

Slika 1 prikazuje sekvencu nukleotida (sekvenca čiji je ID broj 11) i aminokiselina (sekvenca čiji je ID broj 12) fuzionog proteina koji se sastoji od VCAM signalne sekvence fuzionisane sa zrelim oblikom humanog IFN-p pune dužine (sekvence čiji su ID brojevi 3 i 4), u kojima je glicin na položaju 162 aminokiselinske sekvence čiji je ID broj 4 zamenjen cisteinom, fuzionisan sa regionom šarke, CH2 i CH3 domenima humanog IgGIFc (ZL5107).

Slika 2 prikazuje sekvencu nukleotida (sekvenca čiji je ID broj 13) i aminokiselina (sekvenca čiji je ID broj 14) fuzionog proteina koji se sastoji od VCAM signalne sekvence fuzionisane sa zrelim oblikom humanog IFN-P pune dužine (sekvence čiji su ID brojevi 3 i 4), u kojima je glicin na položaju 162 amnokiselinske sekvence čiji je ID broj 4 zamenjen cisteinom; i koji je fuzionisan sa G4S veznikom fuzionisanom sa regionom šarke, CH2 i CH3 domenima humanog IgGIFc (ZL5107).

Slika 3 prikazuje intenzitet proteinurije tokom dana 7, 14, 21 i 28, kod pacova koji imaju nefrotoksični nefritis (NTN), a koji su tretirani sa 3 * IO<5>jedinica pacovskog IFN-p dnevno, sa 6 * IO<5>jedinica pacovskog IFN-P dnevno ili samo sa vektorom ("kontrola"), tokom 6 dana nedeljno, počevši od dana 0.

Slika 4 prikazuje intenzitet proteinurije tokom dana 7, 14, 21 i 28, kod pacova koji imaju nefrotoksični nefritis (NTN), a koji su tretirani sa 6 * 10<5>jedinica pacovskog IFN-p dnevno ili samo sa vektorom ("kontrola"), tokom 6 dana nedeljno, počevši od dana 0.

Slika 5 prikazuje broj proliferišućih ćelija po glomerulu kod pacova koji imaju nefrotoksični nefritis (NTN), a koji su tretirani sa 6 x 103 jedinica pacovskog IFN-P dnevno ili samo sa vektorom ("RSA"), tokom 6 dana nedeljno, počevši od dana 0 do dana 7.

Slika 6 prikazuje intenzitet proteinurije tokom dana 7 i 10 kod pacova koji imaju Thy 1 glomerulonefritis, a koji su tretirani sa 6 x 103 jedinica pacovskog IFN-P dnevno ili samo sa vektorom ("RSA"), tokom 6 dana nedeljno, počevši od dana 0 do dana 10.

Slika 7 prikazuje klirens kreatinina tokom dana 7 i 10 kod pacova koji imaju Thy 1 glomerulonefritis, a koji su tretirani sa 6 x 10<3>jedinica pacovskog IFN-P dnevno ili samo sa vektorom ("RSA"), tokom 6 dana nedeljno, počevši od dana 0 do dana 10.

Slika 8 prikazuje ocenu proliferacije u glomerulu tokom 10 dana kod pacova koji imaju Thy 1 glomerulonefritis, a koji su tretirani sa 6 x 10<3>jedinica pacovskog IFN-P dnevno, ili samo vektorom ("RSA"), tokom 6 dana nedeljno, počevši od dana 0 do dana 10.

Slika 9 prikazuje intenzitet proteinurije tokom dana 7 i 14, kod pacova koji imaju nefropatiju izazvanu puromicin aminonukleozidom (PAN), a koji su tretirani sa 6 x IO<2>, 6 x 10<3>, 6 x IO<4>ili sa 6 x lfj3 jedinica pacovskog IFN-p dnevno ili samo sa vektorom ("kontrola").

Detaljan opis pronalaska

Predmetni pronalazak se zasniva na otkriću da barem određeni simptomi glomerulonefritisa kod sisara mogu da se poboljšaju primenom INF-p. Posebno, primećeno je da se proteinurija, proliferacija glomerularnih ćelija i inflamacija značajno smanjuju nakon primene INF-p. Shodno tome, predmetni pronalazak obezbeđuje postupke i preparate za lečenje glomerulonefritisa kod sisara.

Definicije

Da bi se jasnije i konciznije istakli detalji specifikacije predmetnog pronalaska, obezbeđene su sledeće definicije specifičnih pojmova koji se koriste u opisu i pridodatim patentnim zahtevima.

Kao što, se koristi u specifikaciji i pridodatim patentnim zahtevima, oblici jednine L množine obuhvataju pojmove u množini, osim ako kontekst jasno ne ukazuje drugačije.

"Jačina glomerularne filtracije" ili "JGF" je proporcionalna klirensu u urin supstance iz plazme koja nije vezana za proteine seruma, koja se slobodno filtrira u glomerulima i koja se niti sekretuje, niti reapsorbuje u bubrežnim tubulima. Stoga, kao što se ovde koristi, JGF se poželjno definiše sledećom jednačinom:

pri čemu Uconc je koncentracija markera u urinu, Pconc je koncentracija markera u plazmi, a V je brzina protoka urina u ml/min. Opciono, JGF se koriguje u odnosu na površinu tela. Tako, vrednosti JGF koje se ovde koriste su izražene u jedinicama ml/min/l,73m<2>. Poželjna mera JGF je klirens inulina, ali zbog teškoća merenja koncentracije ove supstance, u kliničkoj praksi se tipično koristi klirens kreatinina. Na primer, u slučaju prosečnog zdravog muškarca (70 kg, 20 - 40 godina), očekuje se da tipična vrednost JGF, merena u odnosu na klirens kreatinina, bude oko 125 ml/min, pri koncentraciji kreatinina u plazmi u opsegu od 0,7 - 1,5 mg/dl. Poređenja radi, u slučaju prosečne žene, očekuje se da tipična vrednost JGF, merena u odnosu na klirens kreatinina, bude oko 115 ml/min, pri koncentraciji kreatinina u plazmi u opsegu od 0,5 - 1,3 mg/dl. Kada je čovek zdrav, vrednosti JGF su relativno stabilne do starosne dobi od oko 40 godina, kada JGF tipično počinje da se smanjuje sa godinama. Kod osoba koje su stare 85 ili 90 godina, JGF može biti smanjena na 50% vrednosti koje su tipične za starosnu dob od 40 godina. Procena "očekivane JGF" ili "JGFexp" može da se odredi uzimajući u obzir starosnu dob osobe, telesnu masu, pol, površinu tela i mišićnu masu, kao i koncentraciju u plazmi nekog jedinjenja koje služi kao marker (npr. kreatinin), a koja se, određuje ispitivanjem krvi. Stoga, kao primer, očekivana JGF ili JGFexp može da se proceni formulom:

Ova procena ne uzima u obzir činioce kao što su površina tela, mišićna masu ili procenat masnog tkiva. U svakom slučaju, ova formula koja koristi koncentraciju kreatinina u plazmi kao marker predstavlja jeftin način za procenu JGF kod muškaraca. Zbog toga što kreatinin proizvode poprečnoprogasti mišići, očekivana JGF ili JGFexp kod žena se procenjuje na osnovu iste formule, s tim što se množi sa 0,85, kako bi se u obzir uzele očekivane razlike u mišićnoj masi (videti Lemann, et al. (1990) Am. J. Kidnev Dis. 16 (3): 236 - 243).

U patentnoj specifikaciji se naizmenično koriste pojmovi "glomerulonefritis", "nefritis", "akutni nefritis" i "glomerularni nefritis".

Pojam "IFN-(3-la" se odnosi na molekul IFN-p koji poseduje aminokiselinsku sekvencu divljeg tipa humanog IFN-P koji je glikoziliran.

Pojam "IFN-P-lb" se odnosi na molekul IFN-P koji poseduje aminokiselinsku sekvencu divljeg tipa humanog IFN-p, pri čemu je cistein na položaju 17 zamenjen serinom; metionin na položaju 1 ("inicijatorski metionin") nedostaje, a molekul nije glikoziliran.

Pojam "varijanta IFN-P" se odnosi na IFN-P divljeg tipa sa jednom ili sa više modifikacija, npr. sa delecijama, adicijama, supstitucijama, postranslacionim modifikacijama aminokiselina, ili na IFN-P koji obuhvata jednu ili više aminokiseUnskih ostataka ili veza između njih koje se ne javljaju prirodno. U opseg pojma "varijanta IFN-P" su uključeni delovi molekula IFN-p. Pojam "biološki aktivna IFN-P varijanta" predstavlja varijantu IFN-P koja poseduje barem malu aktivnost u lečenju bubrežnih poremećaja, npr. glomerulonefritisa. Varijanta IFN-P može biti IFN-p molekul koji se prirodno javlja sa, npr. insercijom, delečijom ili supstitucijom jedne ili više aminokiselina u poređenju sa divljim tipom IFN-p, tj. to je mutantna ili polimorfna varijanta koja se prirodno javlja ili je to varijanta IFN-P koja se ne javlja prirodno.

Pojam "izolovan" (koji se naizmenično koristi sa pojmom "praktično čist"), kada se odnosi na polipeptide, označava polipeptid koji usled svog porekla ili zbog manipulacije: (i) prisutan je u ćeliji - domaćinu kao ekspresioni proizvod dela vektora ekspresije; (ii) povezan je sa proteinom ili sa drugom hemijskom podjedinicom koja se razlikuje od one sa kojom je povezan u prirodi; ili (iii) ne javlja se u prirodi, na primer, to je protein koji je tako hemijski izmanipulisan da mu je prikačena ili pridodata barem jedna hidrofobna podjedinica, tako da se protein nalazi u obliku koji se nemože naći u prirodi. Pod pojmom "izolovan" se dalje podrazumeva protein koji je: (i) hemijski sintetisan; ili (ii) koji je eksprimiran u ćeliji - domaćinu i prečišćen od udruženih i kontaminirajućih proteina. Pojam generalno označava polipeptid koji je izdvojen od drugih proteina i nukleinskih kiselina sa kojima se prirodno javlja. Poželjno, polipeptid se takođe razdvaja od supstanci, kao što su antitela ili gel matriksi (poliakrilamid), koji se koriste za njegovo prečišćavanje. Pojam "izolovan" (koji se naizmenično koristi sa pojmom "praktično čist"), kada se odnosi na nukleinske kiseline, odnosi se na RNK ili DNK polinukleotide, delove genomskih polinukleotida, cDNK ili sintetski polinukleotid, koji zbog svog porekla ili manipulacije: (i) nije udružen sa svim poiinukleotidima sa kojima je inače udružen u prirodi (npr. prisutan je u ćeliji - domaćinu kao ekspresioni vektor ili njegov deo); ili (ii) povezan je sa nukleinskom kiselinom ili drugom hemijskom podjedinicom koja se razlikuje od one sa kojom je povezan u prirodi; ili (iii) ne javlja se u prirodi. Pod pojmom "izolovan" se dalje podrazumeva polinukleotidna sekvenca koja je: (i)in vitroamplifikovana, korišćenjem, npr. lančane reakcije polimeraze (PCR); (ii) sintetisan hemijski; (iii) rekombinantnom proizveden kloniranjem; ili (iv) prečišćen, kao npr. cepanjem i razdvajanjem.

Nukleinska kiselina je "operativno povezana" sa drugom nukleinskom kiselinom onda kada je dovedena u funkcionalnu vezu sa drugom sekvencom nukleinske kiseline. Na primer, DNK za presekvencu ili sekretornu lider sekvencu (npr. signalna sekvenca ili signalni peptid) je operativno povezana sa DNK koja kodira polipeptid samo ako je DNK eksprimirana kao protein koji učestvuje u sekreciji tog polipeptida; promoter ili pojačivač je operativno povezan sa kodirajućom sekvencom, ako utiče na transkripciju te sekvence; a mesto vezivanja ribozoma je operativno povezano sa kodirajućom sekvencom, ako je tako postavljeno da olakšava translaciju. Generalno, pojam "operativno povezan" označava da su DNK sekvence povezane i kontinuirane i da su u slučaju npr. sekretorne lider sekvence, kontinuirane i u istom okviru očitavanja. Povezivanje se postiže ligacijom na odgovarajućim restrikcionim mestima. Ukoliko takva mesta ne postoje, mogu se koristiti sintetski oligonukleotidni adapteri ili veznici, shodno uobičajenoj praksi.

Pojam "procenat identičnosti" ili "procenat sličnosti" se odnosi na sličnost sekvenci dva polipeptida, molekula ili dve nukleinske kiseline. Kada je određeni položaj u obe sekvence koje se porede zauzet istom bazom ili aminokiselinskom monomernom podjedinicom, tada su odgovarajući molekuli identični na datom položaju. Procenat identičnosti između dve sekvence je funkcija broja poklapanja ili identičnih položaja koje dele dve sekvence, podeljeno sa brojem položaja koji se upoređuju, pa pomnoženo sa 100. Na primer, ukoliko se poklapa ili je identično 6 od 10 položaja kod dve sekvence, tada su sekvence 60% homologe. Primera radi, DNK sekvence CTGACT i CAGGTT poseduju homologiju od 50% (3 od ukupno 6 položaja se poklapaj u). Generalno, poređenje se pravi kada su dve sekvence poravnate tako da se dobija maksimalna identičnost. Takvo poravnavanje može da se postigne korišćenjem, na primer, postupkom Karlin i Altschlus, koji je detaljnije opisan ispod. Kada se odnosi na nukleinske kiseline, pojmovi "procenat homologije" i "procenat identičnosti" se koriste naizmenično, a kada se odnose na polipeptide, pojam "procenat homologije" se odnosi na stepen sličnosti, pri čemu aminokiseline koje predstavljaju konzervativne supstitucije drugih aminokiselina smatraju se identičnim sa tim aminokiselinama. Pojam "konzervativna supstitucija" nekog ostatka u referentnoj sekvenci predstavlja zamenu određene referentne aminokisline sa aminokiselinom koja je njoj fizički ili funkcionalno slična, npr., poseduje sličnu veličinu, oblik, naelektrisanje, poseduje slična hemijska svojstva, uključujući sposobnost formiranja kovalentnih ili vodoničnih veza i slično. Posebno poželjne konzervativne supstitucije su one koje ispunjavaju kriterijume definisane za "prihvatljivu tačkastu mutaciju" kao što je opisano u Davhoff et al., 5 : Atlas of Protein Sequence and Structure, 5 : Suppl. 3, poglavlje 22 : 354 - 352, Nat. Biomed. Res. Foundation, NVashington, D.C. (1978). Procenat homologije ili identičnosti dve aminokiselinske sekvence ili dve sekvence nukleinskih kiselina može da se odredi korišćenjem algoritma za poravnavanje opisan od Karlin & Altschul (Proc. Nat. Acad. Sci. USA 87 : 2264 (1990)), na način koji je modifikovan od strane Karlin & Altschul (Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90 : 5873

(1993)). Takav algoritam je inkorporiran u NBLAST ili XBLAST programe opisane od Altschul et al., J. Mol. Biol. 215 : 403 (1990). BLAST ispitivanja se izvode sa NBLAST programom, skor = 100, dužina reči = 12, kako bi se dobila sekvenca nukleotida koja je homologa nukleinskoj kisleini prema predmetnom pronalasku. BLAST proteinska ispitivanja se izvode sa XBLAST programom, skor = 50, dužina reči = 3, kako bi se dobile aminokiselinske sekvence koje su homologe referentnom polipeptidu. Kako bi se radi poređenja dobila poravnanja sa prazninama, koristi se Gapped BLAST, kao što je opisano u Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25 : 3389 (1997). Kada se koriste BLAST i Gapped BLAST, koriste se osnovni parametri odgovarajućih programa (XBLAST i NBLAST). Videti: http://www.ncbi. nlm,nih.gov.

Za IFN-P preparat se kaže da poseduje "terapijsku efikasnost", a za određenu količinu IFN-p preparata se kaže da je "terapijski efikasan", ukoliko je primena te količine IFN-p preparata dovoljna da izazove klinički značajno poboljšanje standardnog markera bubrežne funkcije, kada se preparat primeni na subjektu (npr. na životinjskom modelu ili na humanom pacijentu), koji boluje od ili koji poseduje rizik od razvoja glomerulonefritisa ili hronične insufucijencije bubrega. Takvi markeri bubrežne funkcije su dobro poznati u medicinskoj literaturi i obuhvataju, bez ograničenja, brzinu porasta nivoa uree, brzinu porasta kreatinina u serumu, statičke mere uree, statičke mere kreatinina u serumu, jačinu glomerularne filtracije (JGF), odnose urea/kreatinin, serumske koncentracije natrijuma (Na<+>), odnos koncentracije kreatinina u urinu i plazmi, odnos koncentracije uree u urinu i plazmi, osmolalnost urina, dnevnu zapreminu urina, i slično (videti, na primer, Brenner & Lazarus (1994) u knjizi Harrison's Principles of Internal Medicine, 13. izdanje, Isselbacher et al., urednici, McGraw

Hill Text, New York; Luke & Sirom (1994); u knjizi Internal Medicine, 4. izdanje, J. H.

Stein, urednik, Mosby - Year Book, Inc. St. Louis). U poželjnom rešenju, primena terapijski efikasne količine IFN-p preparata dovodi do smanjenja proteinurije, proliferacije glomerularnih ćelija ili do smanjenja prisustva inflamatornih ćelija, npr. CD8<+>T ćelija i makrofaga u glomerulima.

IFN- P preparati

IFN-p preparati koji se mogu koristiti prema predmetnom pronalasku obuhvataju divlje tipove IFN-p i njihove biološki aktivne varijante, npr., varijante koje se prirodno javljaju i one koje se ne javljaju priodno. Nukleotidi i sekvence amino kiselina divljeg tipa humanog IFN-P

koji se javlja u prirodi su predstavljeni sekvencama čiji su ID brojevi 1 i 2, respektivno, koji su identični sa sekvencama čiji su GenBank pristupni brojevi M28622 i AAA36040, respektivno. Ovi interferoni su takođe opisani, npr., kod Seghal (1985) J. Interferon Res. 5 : 521. Puna dužina humanog IFN-P proteina koji se sastoji od 187 amino kiselina i kodirajuće sekvence čiji je ID broj 1, odgovara nukleotidima 76 - 639. Signalna sekvenca odgovara aminokiselinama 1 do 21. Sekvenca amino kiseline zrelog oblika ovog IFN-P odgovara amino kiselinama 22 - 187 (nukleotidi 139 - 639 sekvence čiji je ID broj 1). Zreli humani IFN-P protein i nukleotidna sekvenca koja ga kodira su predstavljeni sekvencama čiji su ID brojevim 4 i 3, respektivno.

IFN-p koji se proizvodi u ćelijama sisara je glikoziliran. Divlji tip IFN-P, koji se pojavljuje u prirodi, glikoliziran je na ostatku 80 (Asn 80) zrelog polipeptida sekvence čiji je ID broj 4 ili na ostatku 101 (Asn 101) nezrelog polipeptida sekvence čiji je ID broj 2.

Takođe, IFN-P preparati obuhvataju ne-humane IFN-p, npr., IFN-P kičmenjaka, kao što su sisari, npr., ne-humani primati, goveda, ovce, svinje, konji, maćke, psi, pacovi i miševi; ili ptice ili vodozemci. IFN-p sekvence ovih vrsta mogu se pribaviti iz GenBank i/ili publikacija, ili mogu biti određene iz nukleinskih kiselina izolovanih hibridizacijom pod slabo strogim uslovima sa genom IFN-P druge vrste.

Varijante divljeg tipa IFN-P proteina uključuju proteine koji imaju sekvencu amino kiselina koja je najmanje 70%, 80%, 90%, 95%, 98% ili 99% identična ili homologa divljem tipu IFN-P, npr., humanom IFN-P koji ima sekvencu čiji je ID broj 2 ili 4. Varijante mogu imati jednu ili više supstitucija, delecija i adicija. Na primer, mogu se koristiti biološki aktivni fragmenti divljeg tipa IFN-P proteina. Takvi fragmenti mogu imati 1, 2, 3, 5, 10 ili do 20 amino kiselina otklonjenih, dodatih ili supstituisanih na C- ili N- terminalima proteina. Varijante mogu takođe imati 1, 2, 3, 5, 10 ili do 20 amino kiselinskih supstitucija, delecija i adicija. Neke varijante mogu imati manje od 50, 40, 30, 25, 20, 15, 10, 7 ili 5 amino kiselinskih supstitucija, delecija i adicija. Supstitucije mogu biti sa amino kiselinama koje se javljaju u prirodi ili sa njihovim analozima, npr., D - stereoizomerne amino kiseline.

Takođe, obimom predmetnog pronalaska su obuhvaćene varijante IFN-P koje su kodirane nukleinskim kiselinama koje se pod strogim uslovima hibridizuju sa nukleinskom kiselinom koja kodira IFN-P koji se pojavljuje u prirodi, npr., onim koji je predstavljen sekvencama čiji su ID brojevi 1 ili 3, ili njihovim komplementima. Pogodni strogi uslovi koji pospešuju hibridizaciju DNK su, na primer, 6,0 x natrijum hlorid / natrijum citrat (SSC), na temp. od oko 45 °C, za čime sledi ispiranje sa 2,0 x SSC na 50 °C, i ovi uslovi su poznati stručnjacima ili se mogu pronaći u: Current Protocols in Molecular Biologv, John Wiley & Sons, Nju Jork (1989), 6.3.1 - 6.3.6. Na primer, slani rastvor u koraku ispiranja mogu se izabrati manje strogi uslovi od oko 2,0 x SSC na 50°C do vrlo strogih uslova od oko 0,2 * SSC na 50°C. Dodatno, temperatura u koraku ispiranja može da se poveća od manje strogih uslova sa temp. od sobne temperature - oko 22°C, do veoma strogih uslova sa temp. od oko 65°C. Vrednosti emperature i koncentracije soli mogu da variraju, a temperatura slanog rastvora može se držati i na konstantnoj vrednosti, dok se druge varijable menjaju. U poželjnom rešenju prema predmetnom pronalasku, nukleinska kiselina koja kodira IFN-p varijantu hibridizuje sa nukleinskom kiselinom čiji je ID broj sekvence 1 ili 3, ili sa njima komplemenom sekvencom, pod u umereno strogim uslovima, na primer, na temp. od oko 40 °C uključujući i ispiranje sa 2,0 x SSC. U jednom rešenju prema predmetnom pronalasku, koje je posebno poželjno, nukleinska kiselina koja kodira IFN-p varijantu hibridizuje sa nukleinskom sekvencom čiji je ID broj sekvence 1 ili 3, ili njima komplementarnom sekvencom, u veoma strogim uslovima, npr, na temp. od oko 65 °C, uključujući ispiranje sa 0,2 x SSC.

Modifikacije iz primera su konzervativne modifikacije, koje imaju minimalni efekat na sekundarnu i tercijarnu strukturu proteina. Konzervativne supstitucije iz primera uključuju one koje su opisane u Dayhoffa, The Atlas of Protein Sequence and Structure 5 (1978), i u Argosa, EMBO J., 8, 779 - 785 (1989). Na primer, amino kiseline koje pripadaju jednoj od sledećih grupa, reprezentuju konzervativne promene: ala, pro, gly, gln, asn, ser, thr; cys, ser, tyr, thr; val, ile, leu, met, ala, phe; lys, arg, his; i phe, tyr, trp, his.

Druge modifikacije uključuju supstitucije jedne amino kiseline sa drugom amino kiselinom koja ne mora obavezno da predstavlja konzervativnu supstituciju. Na primer, mogu se napraviti supstitucije koje suštinski nemaju efekta na trodimenzionalnu strukturu IFN-p. Trodimenzionalna struktura ne-glikoliziranog humanog IFN-P je opisana, npr., u Radhakrishan et al., (1996) Structure 4: 1453; a trodimenzionalna struktura glikoliziranog IFN-P je opisana u, npr., Karpusas et al., (1997) PNAS 94: 11813. U osnovi, IFN-P se sastoji od pet heliksa: heliksa A, koji se sastoji od amino kiselina 2-22 sekvence čiji je ID broj 4; heliksa B, koji se sastoji od amino kiselina 51-71 sekvence čiji je ID broj 4; heliksa C, koji se sastoji od amino kiselina 80 - 107 sekvence čiji je ID broj 4; heliksa D, koji se sastoji od amino kiselina 118 - 136 sekvence čiji je ID broj 4; i heliksa E, koji se sastoji od amino kiselina 139 - 162 sekvence čiji je ID broj 4 (Karpusa et al., navedeno gore). Heliksi A, B, C i E formiraju levogirnu, četvorostruku heliks petlju tipa 2. Postoji velika petlja na vrhu, AB petlja, koja povezuje helikse A i B, kao i tri kraće petlju (nazvane BC, CD i DE), koje povezuju ostatak heliksa (Karpusa et al., navedeno gore). Skorašnja istraživanja su pokazala da N- terminali i C-terminali i glikozilirani C heliks regioni molekula IFN-P se ne nalaze u mestu vezivanja za receptor (videti, WO 00/23472 i USSN 09/832,659). Shodno tome, mutacije u ovim regionima neće značajno uticati na biološku aktivnost molekula interferona p. Takođe, nedavno je pokazano da mutacije u heliksu C (amino kiseline 81, 82, 85, 86 i 89 zrelog humanog IFN-P) rezultuju molekulom koji ima povećanu antivirusnu aktivnost koja je povezana sa divljim tipom IFN-p (videti, WO 00/23472 i USSN 09/832,659). Slično tome, pokazano je da mutanti u heliksu A (amino kiseline 2, 4, 5, 8 i 11 zrelog humanog IFN-P) i CD petlja (amino kiseline 110, 113, 116 i 119) imaju povećanu aktivnost vezivanja za receptor i povećanu antivirusnu i antiproliferativnu aktivnost, koja je povezana sa divljim tipom IFN-p koji se javlja u prirodi (videti, WO 00/23472 i USSN 09/832,659).

Druge željene modifikacije ili supstitucije eliminišu mesta intermolekularnog povezivanja ili formiranja pogrešnih disulfidnih veza. Na primer, IFN-p je poznat po tri cys ostatka, na položajima 17, 31 i 141 divljeg tipa sekvence čiji je broj 4. Jedna varijanta interferona je i interferon kod koga je cys (C) na poziciji 17 supstituisan sa ser (S), kao stoje opisano, npr., u U. S. patentu br. 4,588,585. Druge varijante IFN-P uključuju varijante koje imaju, npr., jednu ili više ser (S) supstituisanih sa cys (C) na poziciji 17 i val (V) na poziciji 101 koji je supstituisan sa phe (F), trp (W), tyr (Y) ili his (H), poželjno sa phe (F), kada se broji prema strukturi divljeg tipa IFN-P, koji ima sekvencu čiji je ID broj 4, kao što je opisano u U. S. patentu 6,127,332. Druge željene varijante uključuju polipeptide koji imaju sekvencu divljeg tipa IFN-p, npr., sekvencu čiji je ID broj 4, kod koga je val (V) na poziciji 101, brojano u odnosu na strukturu IFN-P divljeg tipa, supstituisan sa phe (F), tyr (Y), trp (W), his

(H) ili phe (F), stoje takođe opisano u U. S. patentu br. 6,127,332.

Druge varijante IFN-P su zreli IFN-P molekuli kojima nedostaje inicijalni metionin,

npr., metionin 1, sekvence čiji je ID broj 4. Varijantama IFN-p iz primera nedostaje inicijator metionin i imaju najmanje jednu supstituciju amino kiseline, npr., na poziciji 17 zrelog oblika, kao što je opisano u U. S. patentu br. 4,588,585.

Molekuli IFN-P, takođe, mogu biti modifikovani zamenom jedne ili više amino kiselina sa jednom ili više izvedenih amino kiselina, koje su prirodne ili veštačke amino kiseline kod kojih su normalni bočni lanci ili krajnje grupe hemijski modifikovani. Takve modifikacije uključuju, na primer, gama - karboksilaciju, beta - karboksilaciju, pegilaciju, sulfaciju, sulfonaciju, fosforizaciju, amidizaciju, esterifikaciju, N - acetilaciju, karbobenzilaciju, tozilaciju i druge modifikacije koje su poznate u struci.

Druge modifikacije podrazumevaju upotrebu analoga amino kiselina ili izvedenih amino kiselina kod kojih je bočni lanac produžen ili skraćen, pri čemu još uvek sadrži karboksil, amino ili drugu reaktivnu prekursorsku funkcionalnu grupu za kristalizaciju, kao i anolozi amino kiselina koji imaju promenljive bočne lance sa pogodnim funkcionalnim grupama. Na primer, predmetno jedinjenje može da bude analog amino kiseline, kakav je na primer, cijanoalanin, kanavanin, L-cistein tioacetal formaldehida (đenkolna kiselina), norleucin, 3 - fosfoserin, homoserin, dihidroksi - fenilalanin, 5 - hidroksitriptofan, 1 - metilhistidin, 3 - metilhistidin, diaminoheptan dikarbonska kiselina, ornitin ili diaminobuterna kiselina. Ostali metaboliti ili prekursori amino kiselina koji se javljaju u prirodi, koji imaju bočne lance pogodne u ovom kontekstu, biće prepoznati od strane veštog stručnjaka i obuhvaćeni su obimom zaštite predmetnog pronalaska.

Druge varijante IFN-P predstavljaju reverzne ili retro peptidne sekvence. Pojam "reverzna" ili "retro" peptidna sekvenca označava deo celokupne sekvence ostataka amino kiselina (ili njihovih analoga ili mimetika) povezanih kovalentnim vezama kod kojih je normalan pravac između peptidne i amino grupe, kod formiranja peptidne veze u osovinskoj strukturi amino kiseline, preokrenut tako da, gledajući na konvencionalan način, sa leva na desno, amino deo peptidne veze zaostaje za (pre nego prati) karbonilnim delom. Pogledati, generalno, Goodman, M. & Chorev, M., Accounts of Chem. Res. 1979, 12, 423. Ovde opisani peptidi preokrenute orijentacije podrazumevaju: (a) one kod kojih je jedan ili više ostataka amino - završetaka konvertovano u reverznu ("rev") orijentaciju (pa stoga nastaje drugi "karboksil terminal" na delu molekula koji je na krajnjoj levoj strani), i (b) oni kod kojih je jedan ili više ostataka karboksil - terminala konvertovano u reverznu ("rev") orijentaciju (pa stoga nastaje drugi "amino - terminal" na delu molekula koji se nalazi na krajnjoj desnoj strani). Peptidna (amidna) veza ne može da se formira na spojnoj površini ostataka normalne orijentacije i ostataka reverzne orijentacije. Zato, određeni reverzni polipeptidi predmetnog pronalaska mogu biti formirani korišćenjem pogodne mimetičke grupe amino kiseline da bi se povezala dva susedna dela sekvenci korišćenjem reverzne peptidne (reverzne amidne) veze. U slučaju (a), koji je gore naveden, centralni ostatak di-keto jedinjenja može da se pogodno iskoristi za povezivanje struktura sa dve amidne veze da bi se postigla peptidomimetska struktura. U slučaju (b), koji je gore opisan, centralni ostatak di-amino jedinjenja će na sličan način biti koristan da bi se povezale strukture sa dve amidne veze da bi se formirala peptidomimetska struktura. Generalno, reverzna struktura vezivanja kod takvih polipeptida će dodatno zahtevati inverziju enantiomerne konfiguracije reverznih ostataka amino kiselina, da bi se održala prostorna orijentacija bočnih lanaca koja je slična onoj kod nereverznih peptida. Poželjno je da konfiguracija amino kiselina u reverznom delu da bude (D), a konfiguracija nereverznog dela da bude (L). Suprotne ili mešovite konfiguracije su prihvatljive kada su pogodne za optimizaciju aktivnosti stvaranja veza. Modifikacije polipeptida su dalje opisane u, npr., U. S. patentu br. 6,399,075.

IFN-P preparati takođe uključuju IFN-P proteine i njihove varijante (npr., zreli proteini) fuzionisane u heterologe polipeptide. Heterologi polipeptdi mogu se dodati, npr., u svrhu produžavanja poluživota IFN-p proteina ili povećanja njegove proizvodnje. Heterologi polipeptdi, koji služe kao primer, uključuju molekule imunoglobulina (Ig) ili njihove delove, npr., konstantan domen lakih ili teških lanaca molekula Ig. U jednom rešenju, IFN-P protein ili njegova varijanta, je fuzionisan ili na drugi način povezan sa celim regionom šarke ili sa njegovim delom i sa konstantnim regionima lakog lanca imunoglobulina, teškog lanca ili sa oba. Stoga, predmetni pronalazak obuhvata molekul koji obuhvata: (1) IFN-P proteinsku grupu (npr., IFN-P ili njegovu varijantu), (2) drugi peptid, npr., neki peptid koji poboljšava rastvorljivost iliin vivoživotni vek IFN-P grupe, npr., član super-porodice imunoglobulina ili njegov fragment ili deo, npr., fragment ili deo IgG, npr., humani IgGl teški lanac konstantnog regiona, npr., CH2, CH3 i region šarke. Tačnije, "IFN-p/Ig fuzija" je protein koji se sastoji biološki aktivne IFN-p grupe, povezane sa N- terminalom lanca imunoglobulina. Vrsta 1FN-p/Ig fuzije je "IFN-p/Fc fuzija" kao protein koji sadrži IFN-P grupu povezanu sa makar jednim delom konstantnog domena imunoglobulina. Željena Fc fuzija sastoji se od IFN-P grupe povezane sa fragmentima antitela koje sadrži C-terminalni domen teških imunoglobulinskih lanaca.

Shodno tome, u jednom rešenju predmetnog pronalaska, fuzioni protein ima generičku formulu X-Y-Z, gde je X polipeptid koji ima amino kiselinsku sekvencu IFN-p, njegovog dela ili varijante; Y je opciona vezna grupa; a Zje polipeptid koji se sastoji bar od jednog dela polipeptida drugačijeg od IFN-P predstavljenog grupom X. U drugom rešenju, fuzioni protein ima formulu Z-Y-X, u kojoj je polipeptid različit od IFN-P fuzionisan sa N- terminalnim delom veznika koji je fuzionisan sa N- terminalnim delom polipeptida IFN-p ili njegovim delom ili varijantom. Grupa Z može biti deo polipeptida koji sadrži domene slične imunoglobulinu. Primeri ostalih takvih polipeptida uključuju CD1, CD2, CD4 i članove klase I i klase II glavnih antigena histokompatibilnosti. Videti, U. S. patent br. 5,565,335 (Capon et al.) za primere takvih polipeptida.

Grupa Z može da sadrži, na primer, mnoštvo histidinskih ostataka ili, što je još poželjnije, Fc region imunoglobulina, Pojam "Fc", kako je ovde definisan, predstavlja fragment antitela koje sadrži C-terminalni domen teških imunoglobulinskih lanaca.

Grupa Y može biti veznik koji omogućava IFN-P grupi da zadrži svoju biološku aktivnost. Grupa Y može se sastojati od jedne amino kiseline ili bar od dve amino kiseline. Y takođe, može da se sastoji od oko 2 do oko 5 amino kiselina; od oko 3 do oko 10 ili više amino kiselina. U željenom rešenju, Y se sastoji ili sadrži GlyGlyGlyGlySer (sekvenca čiji je ID broj 6), koja je kodirana, npr., nukleotidnom sekvencom GGCGGTGGTGGCAGC (sekvenca čiji je ID broj 5). Takođe, Y može da se sastoji od ili da sadrži, mesto za prepoznavanje enterokinaze, npr., AspAspAspAspLys (sekvenca čiji je ID broj 8), koje je kodirano, npr., nukleotidnom sekvencom GACGATGATGACAAG (sekvenca čiji je ID broj 7). U drugom rešenju, Y se sastoji ili sadrži SerSerGlyAspAspAspAspLys (sekvenca čiji je ID broj 10), koja je kodirana, npr., nukl. sekvencom AGCTCCGGAGACGATGATGACAAG (sekvenca čiji je ID broj 9).

Dalje, na povezivanje IFN-P grupe (X) i druge grupe koja je različita od IFN-P (Z) (npr., Fc region imunoglobulina) može uticati svaka hemijska reakcija kojom se dva molekula povezuju toliko dugo koliko je potrebno da X i Y grupe suštinski zadrže svoju aktivnost. Hemijsko vezivanje može da podrazumeva mnoge hemijske mehanizme kao što su, kovalentnovezivanje, afinitetno vezivanje, interkalacija, koordinatno vezivanje i stvaranje kompleksa. Reprezentativna sredstva za vezivanje (npr., veznici "Y" iz generičke formule), koja bi dovela do kovalentnog stvaranja veza između IFN-P grupe i Z grupe mogu da budu organska jedinjenja kao što su tioestri, karbodiimidi, sukcinimidni estri, diizocijanati, kao što su tolilen-2,6-diizocijanat, gluteraldehidi, diazobenzeni i heksametilen diamini, kao što su bis-(p-diazonijum-benzoil)-etilendiamin, bifunkcionalni derivati imidoestara, kao što su dimetil adipimidat i bis-aktivna fluorna jedinjenja, kao što su l,5-difluoro-2,4-dinitrobenzen. Ovo nabrajanje nema nameru da bude potpuno u navođenju raznih klasa sredstava za povezivanje koja su poznata u struci. Mnoga od njih se mogu komercijalno dobaviti, npr., N - sukcinimidil-3-(2-piridilditio) propionat (SPDP), l-etil-3-(3-dimetilaminopropil) karbodiimid hidrohlorid (EDC); 4-sukcinimidiloksikarbonil-alfa-metil-alfa-(2-piridil-ditio)-toluen (SMPT: Pierce Chem. Co., kat. br. 21558G).

Poželjni IFN-P / Ig fuzioni protein sastoji se od ili sadrži sekvencu čiji je ID broj 12, koja sadrži zreli oblik humanog IFN-p pune dužine, npr., sekvencu čiji je ID broj 4, fuzionisanu sa humanim IgGIFc (ZL5107) (videti, WO 00/23472 i USSN 09/832,659) (videti Sliku 1). Odgovarajuća nukleotidna sekvenca je predstavljena kao sekvenca čiji je ID broj 11. DNK koja kodira humani IFN-P završava se na nukleotidnom tripletu 568 - 570 (AAC, koji kodira arginin), konstantni region DNK koji kodira humani IgGl počinje tripletom (GAC koji kodira asparaginsku kiselinu), počevši nukleotidom čiji je broj 574 u sekvenci čiji je ID broj

U.

Drugi poželjni IFN-P / Ig fuzioni protein je određen sekvencom čiji je ID broj 14, a kodiranje sekvencom čiji je ID broj 13 (videti, VVO 00/23472 i USSN 09/832,659) (videti Sliku 2). Ovaj krajnji fuzioni protein sastoji se od humanog IFN-P koji je povezan za G4S veznikom- koji je sam povezan za humanim IgGIFc (ZL6206). G4S veznik (kodiran nukleotidima od 571 do 585 sekvence čiji je ID broj 7) sastoji se od amino kiselinske sekvence GGGGS (sekvence čiji je ID broj: 9). Postupci za proizvodnju ovih proteina su opisani u WO 00/23472 i USSN 09/832,659.

U poželjnom rešenju, IFN-p polipeptid je fuzionisan putem svog C-terminala sa najmanje jedim delom Fc regiona imunoglobulina. IFN-p formira amino terminalni deo, a Fc region formira karboksi terminalno deo. Kod ovih fuzionih proteina, poželjno je da Fc region bude ograničen na konstantni domen regiona šarke i na CH2 i CH3 domene. Fc region kod ovih fuzionih proteina može takođe biti ograničen na deo regiona šarke, deo koji je sposoban da formira disulfidne intermolekulske mostove na i CH2 i CH3 domene ili njihove strukturne ekvivalente. Ovi konstantni regioni mogu biti izvedeni iz bilo kog izvora koji pripada sisarima (poželjno čoveku) i mogu biti izvedeni iz bilo koje pogodne klase i/ili izotipa, uključujući IgA, IgD, IgM, IgE i IgGl, IgG2, IgG3 i IgG4.

Rekombinantni molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju Ig fuzioni protein mogu se dobiti bilo kojim postupkom koji je poznat u struci (Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning; A Laboratorv Manual, Cold Spring Harbor Laboratorv, Cold Spring Harbor, NY) ili se mogu dobiti iz javno dostupnih klonova. Postupke za pripremanje gena koji kodiraju konstantne regione teških ili lakih lanaca imunoglobulina je opisao, na primer, Robinson, R. et al. PCT prijava, publikacija br. WO 87/02671. Sekvenca cDNK koja kodira molekul interferona ili njegov fragment može se direktno povezati sa cDNK koja kodira konstantne regione teškog lanca Ig ili se može povezati pomoću vezne sekvence. U daljim rešenjima predmetnog pronalaska, sistem vektora za rekombinaciju se može kreirati na takav način da prihvati sekvence koje kodiraju interferon beta u korektnom okviru očitavanja i sintetski region šarke. Dodatno, može biti poželjno da se uključe, kao deo sistema vektora za ekombinaciju, nukleinske kiseline koje odgovaraju istostranom 3' regionu gena imunoglobulina, uključujući RNK mesta za cepanje/poliadenilaciju i nizvodne sekvence. Dalje, može biti poželjno da se projektuje upstream signalne sekvence kodirajućih sekvenci imunoglobulin fuzionog proteina, da bi se omogućilo lučenje fuzionisanog molekula iz ćelije koaj je transformisana rekombinantnim vektorom.

Predmetni pronalazak odnosi se i na dimerične fuzione molekule, kao i na monomerne ili multimerne molekule od kojih se sastoje fuzioni proteini. Takvi multimeri se mogu stvoriti korišćenjem Fc regiona ili njihovih delova ili Ig molekula koji su obično multivalentni, kao što su IgM pentameri ili IgA dimeri. Jasno je da J polipeptidni lanac može biti koristan da bi se formirali i stabilizovali IgM pentameri i IgA dimeri. Alternativno, multimeri IFN-P fuzionih proteina mogu se formirati korišćenjem proteina sa afinitetom za Fc region Ig molekula, kakav je protein A. Na primer, mnoštvo IFN-P / Ig fuzionih proteina mogu biti vezani za Protein A - kuglice od agaroze.

Ovi polivalentni oblici su korisni pošto poseduju višestruka mesta za vezivanje receptora za IFN-(3. Na primer, bivalentni rastvorljivi IFN-P može da se sastoji od dve tandemske ponovljene sekvence amino kiselina 1 do 166 sekvence čiji je ID broj 4 (ili od onih koje su kodirane od nukleotida od broja 1 do 498 sekvence čiji je ID broj 3) (grupa X u generičkoj formuli), razdvojene vezničkim regionom (grupa Y), pri čemu su ponovljene sekvence vezane za bar jedan deo imunoglobulin konstantnog domena (grupa Z). Alternativni polivalentni oblici mogu se takođe konstruisati, na primer, hemijskim vezivanjem IFN-P / Ig fuzionog proteina na bilo kom klinički prihvatljivom molekulu - nosiocu, polimeru koji je izabran iz grupe koja se sastoji od Ficoll-a, polietilen glikola ili dekstrana, korišćenjem konvencionalnih tehnika vezivanja. Alternativno, IFN-P može se hemijski vezati sa biotinom, a konjugat biotin - IFN-P tada omogućava vezivanje za avidin, što rezultuje tetravalentnim avidin/biotin/interferon-P molekulima. IFN-P / Ig fuzioni proteine mogu biti, takođe, kovalentno vezati sa dinitrofenolom (DNP) ili trinitrofenolom (TNP), čime nastaje konjugat koji može da precipitira sa anti - DNP i anti - TNP IgM molekulima, kako bi nastali dekamerni konjugati sa valencom 10 za vezujuća mesta interferona p.

Derivati proteina prema predmetnom pronalasku podrazumevaju i različite strukturne oblike primarnog proteina, koje zadržavaju biološku aktivnost. Na primer, zbog prisustva jonizujućih amino i karboksil grupa, IFN-p proteini i njihove varijante mogu biti u obliku kiselih ili baznih soli ili mogu biti u neutralnom obliku. Takođe, pojedinačni ostaci amino kiselina mogu biti modifikovani putem redukcije ili oksidacije. Dalje, primarna amino kiselinska struktura (uključujući i N- i/ili C-terminale) ili glikan interferona beta, mogu biti modifikovani ("izvedeni") formiranjem kovalentnih ili agregativnih konjugata sa drugim hemijskim grupama, kakve su glikozil grupe, polialkilen glikol polimeri, kao što su polietilen glikol, lipidi, fosfati, acetil grupe ili slične, ili stvaranjem mutantnih sekvenci amino kiselina.

Drugi derivati IFN-P / Ig fuzionog proteina sadrže kovalentne ili agrgativne konjugate IFN-p ili njegovih fragmenata sa drugim proteinima ili polipeptidima, koji nastaju sintezom u rekombinantnoj kulturi kao dodatni N- terminal ili C-terminal. Na primer konjugovani peptid može biti signalna (ili lider) polipeptidna sekvenca na N- terminalnom kraju proteina, koja ko-translaciono ili post-translaciono usmerava transfer proteina od mesta njegove sinteze do mesta na kome će vršiti funkciju unutar ili izvan ćelijske membrane ili zida (npr., gljivična a-faktor lider sekvenca). Na primer, signalni peptid može biti poreklom od IFN-p, npr., amino kiseline 1 -21 sekvence čiji je ID broj 2, može da odgovara nukleotidima 1 -138 sekvence čiji je ID broj 1. Signalni peptid može biti i poreklom od VCAM, npr., amino kiseline 1 - 24 sekvence čiji je ID broj 12, koje su kodirane nukleotidima 1 - 72 sekvence čiji je ID broj 11.

Takođe, heterologi polipeptid (npr., peptid) ili neki drugi molekul može biti upotrebljen kao oznaka ili može biti od pomoći pri prečišćavanju IFN-P preparata. Takvi peptidi su dobro poznati u nauci. Na primer, polinukleotid prema predmetnom pronalasku može biti fuzionisan u okviru očitavanja sa sekvencom markera, što se ovde još naziva i "sekvencaZa označavanje", koja kodira "označeni peptid", a koji omogućava označavanje i/ili prečišćavanje polipeptida prema predmetnom pronalasku. U željenom rešenju, sekvenca za označavanje je heksahistidin oznaka, npr., koja se nalazi u PQE - 9 vektoru. Brojne druge oznake za peptide se mogu komercijalno nabaviti. Druge često korišćene oznake uključuju myc-epitope (npr., videti, Ellison et al. (1991.) J. Biol. Chem. 266:21150 - 21157), koji uključuju sekvencu sa 10 ostataka iz c-myc; pFLAG sistem (International Biotechnologies, Inc.); pEZZ - protein A sistem (Pharmacia, NJ); kao i deo od 16 amino kiselina hemaglutinina poreklom izHaemophilus influenza.Dalje, bilo koji polipeptid može se iskoristiti ako ima oznaku koja je dugačku kao i reagens, npr., antitelo koje specifično reaguje sa označenim polipeptidom, a koja se može nabaviti ili se može pripremiti ili identifikovati.

U jednom rešenju, IFN-p protein ili njegova varijanta je fuzionisan na N- ili C-terminalu sa jednim od sledećih peptida: HisHisHisHisHisHis (sekvenca čiji je ID broj 16), koji je kodiran nukleotidnom sekvencom CATCATCATCATCATCAT (sekvenca čiji je ID broj 15); SerGlyGlyHisHisHisHisHis (sekvenca čiji je ID broj 18), a koji je kodiran nukleotidnom sekvencom TCCGGGGGCCATCATCATCATCATCAT (sekvenca čiji je ID broj 15) i SerGlyGlyHisHisHisHisHisSerSerAspAspAspLys (sekvenca čiji je ID broj 18), a koja je kodirana nukleotidnom sekvencom

TCCGGGGGCCATCATCATCATCATCATAGCTCCGGAGACGATGATGACAAG

(sekvenca čiji je ID broj: 19).

Takođe, aminokiselinska sekvenca interferona p može se povezati sa peptidom AspTyrLysAspAspAspAspLys (DYKDDDK) (sekvenca čiji je ID broj 21) (Hopp et al., Bio/Technology 6: 1204, 1988). Navedena sekvenca je visoko antigena i obezbeđuje da se epitop reverzibilno veže sa specifičnim monoklonalnim antitelom, koje omogućava brzo testiranje i lako prečišćavanje eksprimiranog rekombinantnog proteina. Ova sekvenca je, takođe, specifično odvojena goveđom mukoznom enterokinazom na ostatku koji sledi odmah iza Asp-Lys para.

U drugom rešenju, IFN-P preparati koji sadrže IFN-P protein ili njegovu varijantu fuzionisani su sa proteinom albumina, njegovom varijantom ili delom. Takav fuzioni protein može se dobiti na način koji je opisan, npr. u, WO 01/77137.

IFN-P preparati mogu da sadrže i molekul koji nije polipeptid. Na primer, IFN-p protein ili njegova varijanta mogu biti vezani kovalentno ili nekovalentno za polimer, npr., biorazgradljivi polimer. Na primer, IFN-P protein ili njegova varijanta mogu biti pegilizirani, npr., vezani za polietilen glikol (PEG), kao što je opisano u WO 00/231 14.

U širem obimu zaštite prema predmetnom pronalasku, jedan molekul polimera može se iskoristiti za konjugaciju sa IFN-P, iako je takođe obuhvaćeno rešenje u kome može biti vezano i više od jednog molekula polimera. Biće jasno da polimer za konjugaciju može da iskoristi bilo koju grupu, delove ili druge konjugovane vrste, kao pogodne za krajnju primenu. Na primer, u nekim primenama može biti korisno da se kovalentnom vezom za polimer veže neka funkcionalna grupa čime se narušava otpornost raspadanju pod dejstvom UV zraka, ili oksidirajućih sredstava, ili čime se narušavaju neka druga svojstva i karakteristike polimera. Dalje, na primer, u nekim primenama može imati prednosti ako se polimer poveže sa funcionalnim grupa koje će ga načiniti reaktivnim ili koje će mu omogućiti da se unakrsno povezuje, kako bi se unapredila razna svojstva ili karakteristike krajnjih konjugovanih materijala. Shodno tome, polimer može da sadrži bilo koju funkcionalnu grupu, ponovljene grupe, veze ili druge osnovne strukture koje ne ograničavaju efikasnost konjugovanog IFN-P preparata pri njegovoj nameravanoj upotrebi.

Najpoželjnije je da se IFN-p konjuguje putem terminalne reaktivne grupe na polimeru, mada konjugati takođe mogu da se granaju sa ne-terminalnih reaktivnih grupa. Polimer sa reaktivnim grupama je ovde označen kao "aktivirani polimer". Reaktivna grupa selektivno reaguje sa slobodnom amino ili drugom reaktivnom grupom na proteinu. Aktivirani polimeri reaguju tako da se veze mogu uspostaviti na bilo kojoj amino grupi IFN-P, kao što su alfa amino grupe ili epsilon amino grupe lizina. Slobodne karboksilne grupe, pogodne aktivirane karbonil grupe, hidroksil, guanidil, oksidirane ugljenohidratne grupe i merkapto grupe IFN-p (ukoliko ih ima) se takođe mogu koristiti kao mesta za vezivanje.

Iako se polimer može vezati bilo gde na molekulu IFN-P ili njegovoj varijanti ili drugoj amino kiselini povezanoj direktno ili indirektno za molekul IFN-P, najpoželjnije mesto za vezivanje polimera jeste N- terminal molekula IFN-p. Sekundarno mesto/mesta su blizu C-terminala i u šećernim podjedinicama. Stoga, predmetni pronalazak kao najpoželjnija rešenja obuhvata: (i) konjugate IFN-P ili njegove varijante povezane sa polimerom na N- terminalu; (ii) konjugate IFN-p ili njegove varijante povezane sa polimerom na C-terminalu; (iii) sa šećerima povezane konjugate polimernih konjugata, (iv) kao i konjugate IFN-p ili njegovih varijanti koji su povezani sa N- terminalom, C-terminalom i šećerima.

Generalno, koristi se oko 1 do 10 mola aktiviranog polimera po molu proteina, u zavisnosti od koncentracije proteina. Konačni ishod je ravnoteža između maksimizacije ishoda reakcije i minimizacije ne-specifičnih modifikacija proizvoda, a u isto vreme, definisanje procesa koji će održati optimalnu aktivnost, dok se istovremeno optimizuje, ako je moguće, dužina polu-života proteina. Poželjno, treba zadržati najmanje oko 50% biološke aktivnosti proteina, a najpoželjnije treba zadržati svih 100%.

Reakcije se mogu izvesti putem bilo kog pogodnog postupka koji se koristi za reakcije biološki aktivnih materija sa inertnim polimerima, poželjno pri pH vrednosti 5-7, ako se reaktivne grupe nalaze na alfa amino grupi N- terminala. Uopšteno, postupak obuhvata pripremu aktiviranog polimera (koji ima najmanje jednu terminalnu hidroksil grupu), a potom reakciju proteina i aktivnog polimera, kako bi se proizveo protein pogodan za formulisanje. Pomenuta reakcija modifikacije može se izvesti pomoću nekoliko postupaka, koji mogu imati jedan ili više koraka.

Kao što je gore pomenuto, najpoželjnije rešenje prema predmetnom pronalasku koristi N-terminalni kraj IFN-P kao vezu sa polimerom. Postoje pogodni postupci za selektivno dobijanje na N-terminalu modifikovanog IFN-p. Jedan postupak je predstavljen postupkom reduktivne alkilacije, koji koristi razlike u reaktivnosti različitih primarnih amino grupa (epsilon amino grupe na lizinu u odnosu na amino grupe na N- terminalnom metioninu), koje se mogu izvesti iz IFN-p. Pod pogodno izabranim uslovima, može se postići praktično selektivna derivatizacija IFN-P na njegovom N- terminalu sa karbonil grupom koja sadrži polimer. Reakcija se izvodi na pH vrednosti koja nam omogućava da iskoristimo razlike u pKa između epsilon amino grupa lizinskih ostataka i alfa-amino grupe N-terminalnog ostatka IFN-p. Ovaj tip postupka je dobro poznat stručnjacima.

Na primer, može se koristiti shema reakcije koja ovu selektivnost održava tako što što se reakcija izvodi na niskoj pH vrednosti (uopšteno od 5 do 6), pod uslovima u kojima polimer PEG - aldehid reaguje sa IFN-P u prisustvu natrijum cijanoborhidrida. Nakon prečišćavanja PEG - INF-P i analize sa SDS-PAGE, korišćenjem MALDI masene spektometrije i sekvenciranja/mapiranja peptida, dobijen je IFN-P čiji N-terminal specifično ciljan od strane PEG grupe.

Kristalna struktura IFN-p ukazuje sa su N- i C-terminali locirani blizu jedan drugome (videti Karpusas et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. 94 : 11813 - 11818). Stoga, modifikacije C-terminalnog kraja IFN-P treba da imaju minimalni efekac na aktivnost peptida. Pošto ne postoji prosta hemijska strategija usmeravanja polialkilen glikol polimera, kao što je PEG, ka C-terminalu, bilo bi najprostije genetski konstruisati mesto koje se može koristiti za usmeravanje polimerske grupe. Na primer, ugradnja Cys na mestu koje je na ili blizu C-terminala omogućilo bi specifičnu modifikaciju korišćenjem maleimida, vinilsulfona ili haloacetat-aktiviranog polialkilen glikola (npr., PEG). Ovi derivati se mogu koristiti specifično za modifikaciju konstruisanih cisteina zbog visoke selektivnosti ovih sredstava za Cys. Druge strategije, kao što su ugrađivanje histidinske oznake koja može biti sumerena (Fancy et al., 1996, Chem. & Biol. 3: 551) ili dodatnog mesta za glikolizaciju, predstavljaju alternative za modifikovanje C-terminala IFN-p.

Ttakođe, glikan koji se nalazi na nekim molekulima IFN-P može da omogući dalje modifikacije bez izmene aktivnosti. Postupci za usmeravanje šećera koji služe kao mesta za hemijske modifikacije, takođe su poznati u struci, pa se zato polialkilen glikol polimer može vezati direktno i specifično šećerima na IFN-p molekulima koji su aktivirani oksidacijom. Na primer, može se napraviti polietilenglikol - hidrazid koji tvori relativno stabilne hidrazonske veze sa aldehidima i ketonima. Ovo svojstvo se koristi za modifikaciju proteina putem oksidisanih oligosaharidnih veza. Videti, Andresz, H. Et al., 1978, Makromol. Chem. 179 : 301. Posebno, tretiranjem PEG - karboksimetil hidrazida sa nitritom se dobija PEG - karboksimetil azid, koji je elektrofilna aktivna grupa, reaktivna prema amino grupama. Ova reakcija se, isto tako, može koristiti za dobijanje proteina koji su modifikovani polialkilen glikolom. Videti, U. S. patente br. 4,101,380 i 4,179,337.

Hemijski procesi posredovani tiol veznicima, dalje mogu da se pospeše unakrsnim povezivanjem proteina. Ovo se može izvesti, npr., generisanjem reaktivnih aldehida na ugljenohidratnim grupama sa natrijum perjodatom, pri čemu nastaju cistaminski konjugati u aldehidu, kao i indukovanjem unakrsnog povezivanja putem tiol grupa na cistaminima (videti Pepinsky, B. Et al., (1991), J. Biol. Chem., 266 : 18244 - 18249 i Chen, L. L. Et al., (1991) J. Biol. Chem., 266 : 18237 - 18243). Shodno tome, očekuje se da ovaj tip hemijskih procesa bude pogodan za modifikovanje sa polialkilen glikol polimerima gde je veznik ugrađen u šećer i gde je polialkilen glikol polimer povezan sa veznikom. Dok veznici koji sadrže aminotiol ili hidrazin omogućavaju dodavanje jedne polimer grupe, struktura drugih veznika može da varira tako da više polimera može biti dodato i/ili da prostorna orijentacija polimera u odnosu na IFN-p može biti promenjena.

Primeri polimera obuhvataju polimere rastvorljive u vodi, kao što je polialkilen glikol polimer. Lista takvih polimera, koja nije konačna, uključuje polialkilen oksid homopolimere, kao što su polipropilen glikoli, polioksietilenirani polioli, njihove kopolimere i njihove blok kopolimere. Drugi primeri osovinskih struktura pogodnih polimera rastvorljivih u vodi i ne-peptidnih polimera uključuju poli(oksietilirani poliol), poli(olefinski alkohol), poli(vinilpirolidin), poli(hidroksipropilmetakrilamid), poli(a-hidroksi kiselina), poli(vinil alkohol), polifosfazen. polioksazolin, poli(N-akriloilmorfolin) i njihove kopolimere, terpoimere i smeše. U jednom rešenju, osovinska struktura polimera je poli(etilen glikol) ili monometoksi polietilen glikol (mPEG), koji ima prosečnu molekulsku masu od oko 200 Da do oko 400000 Da. Jasno je da se i drugi povezani polimeri mogu koristiti u kontekstu predmetnog pronalaska i da je upotreba pojma PEG ili poli(etilen glikol) u ovom smislu inkluzivna, a ne ekskluzivna. Pojam PEG obuhvata poli(etilen glikol) u bilo kom obliku, uključujući, alkoksi PEG, dvofunkcionalni PEG, jedinjenje sa više PEG grana, tj. mostova, viljuškasti PEG, razgranati PEG, viseći PEG ili PEG sa razgradljivim vezama.

U jednom rešenju, polialkilen glikol ostaci C1-C4alkil polialkilen glikola, poželjno polietilen glikola (PEG), ili poli(oksi)alkilen glikol ostaci takvih glikola, ugrađeni su u sistem polimera koji je od interesa. Stoga, polimer sa kojim je povezan protein može biti homopolimer polietilen glikola (PEG) ili polioksietilisani poliol, s tim što je u svim slučajevima polimer rastvorljiv u vodi na sobnoj temperaturi. Primeri takvih polimera, koji nisu ograničeni samo na navedene, obuhvataju polialkilen oksid homopolimere, kao što su PEG ili polipropilen glikoli, polioksietilirani glikoli, njihovi kopolimeri i njihovi blok kopolimeri, s tim da se nivo rastvorljivosti kopolimera u vodi održava. Primeri polioksietiliranih poliola uključuju, na primer, polioksietilirani glicerol, polioksietilirani sorbitol, polioksietiliranu glukozu ili slično. Glicerolska osovinska struktura polioksietiliranog glicerola je ista ona koja se pojavljuje u prirodi, na primer, kod životinja ili ljudi u mono-, di-, ili trigliceridima. Zbog toga, ovo grananje ne bi obavezno bilo shvaćeno kao strano telo u organizmu.

Kao alternativa polialkilen oksidima, mogu se koristiti dekstran, polivinil pirolidoni, poliakrilamidi, polivinil alkoholi, polimeri na bazi ugljovodonika i slični. Svakome ko ima uobičajeno znanje0nauci, biće jasno daje navedena lista isključivo ilustrativna i da se mogu uzeti u obzir svi polimeri koji imaju ovde opisane osobine.

Polimer ne mora da ima neku određenu molekulsku masu, ali je poželjno da molekulska masa bude između 300 i 100000, još poželjnije između 10000 i 40000. Posebno, polimeri maso od oko 20000 ili više su najbolji za sprečavanje gubitka proteina filtracijom u bubrezima.

U praksi prema predmetnom pronalasku, izvođenje iz polialkilen glikola ima brojne prednosti u formulisanju polimer - IFN-P konjugata, što se odnosi na sledeća svojstva derivata polialkilen glikola: na poboljšanje rastvorljivosti u vodi, pri čemu ne dolazi do sipoljavanja antigenosti ili imunih odgovora; visoki nivo biokompatibilnosti; odsustvoin vivobiorazgradnje polialkilen glikol derivata; i odsustvo slučajeva odbacivanja od strane živih organizama.

Dalje, u drugom aspektu prema predmetnom pronalasku, može se koristiti IFN-P koji je kovalentno vezan za polimernu komponentu kod koje priroda konjugacije podrazumeva kovalentnu hemijsku vezu koja se može pocepati. Ovo omogućava kontrolu u smislu potojanja vremenskog perioda tokom koga se polimer izdvaja iz konjugata sa IFN-p. Ova kovalentna veza između IFN-p preparata i polimera može biti raskinuta hemijskom ili enzimskom reakcijom. Polimer - IFN-P proizvod zadržava prihvatljiv nivo aktivnosti. Istovremeno, delovi polialkilen glikola su prisutni u polimeru za konjugaciju kako bi se polimer - IFN-P konjugatu obezbedio visok nivo rastvorljivosti u vodi i produžila sposobnost opstanka u krvi. Kao rezultat postojanja ovih unapređenih osobina, predmetni pronalazak obimom zaštite obuhvata parenteralnu, nazalnu ili oralnu primenu aktivnih polimer - IFN-P vrsta, ako i biološku raspoloživost samog IFN-P nakon hidrolitičke obrade\ n vivo.

Reakcija polimera sa IFN-p u kojoj nastaje konjugat, npr., N- terminalni konjugat, može se izvesti korišćenjem velikog broja različitih reakcionih šema. Aktivnost i stabilnost IFN-P konjugata može da se menja na nekoliko načina, korišćenjem polimera različitih molekulskih masa. Rastvorljivost konjugata može da se menja promenom odnosa i veličine polietilen glikol fragmenata koji su ugrađeni u polimerski preparat.

U jednom rešenju, konjugati prema predmetnom pronalasku se dobijaju reakcijom proteina sa aktiviranim polialkilen glikolnim jedinjenjem (PCG). Na primer, interferon može da reaguje sa PEG • aldehidom u prisustvu redukcionog sredstva (npr., natrijum cijanoborhidrida) putem reduktivne alkilacije, kako bi nastao PEG - proteinski konjugat, povezan amino vezom. Videti, npr., evropski patent br. 0154316 BI i međunarodnu patentnu prijavu br. PCT/US03/01559.

U nekim rešenjima prema predmetnom pronalasku, humani IFN-P je PEGiliran sa sledećim aktiviranim polialkilen glikolima: 20 kDa mPEG-O-2-metilpropionaldehidom, 20 kDa mPEG-O-p-metilfenil-O-2-metilpropionaldehidom, 20 kDa mPEG-O-m-metilfenil-O-2-metilpropionaldehidom, 20 kDa mPEG-O-p-fenilacetaldehidom, 20 kDa mPEG-O-p-fenilpropionaldehidom i 20 kDa mPEG-O-m-fenilacetaldehidom, kako bi nastao sa 20 kDa mPEG-O-2-metilpropionaldehidom modifikovani IFN-p, sa 20 kDa mPEG-O-p-metilfenil-O-2-metilpropionaldehidom modifikovani IFN-P, sa 20 kDa mPEG-O-m-metilfenil-O-2-metilpropionaldehidom modifikovani IFN-p, sa 20 kDa mPEG-O-p-fenilacetaldehidom modifikovani IFN-P, sa 20 kDa mPEG-O-p-fenilpropionaldehidom modifikovani IFN-P i sa 20 kDa mPEG-O-m-fenilacetaldehidom modifikovani IFN-P, respektivno. Detaljan opis pripremanja i karakterizacije humanog IFN-P modifikovanog sa 20 kDa mPEG-O-2-metilpropionaldehidom i sa 20 kDa mPEG-O-p-fenilacetaldehidom je dat napred u tekstu, kao i u međunarodnoh patentnoj prijavi br. PCT/US03/01559.

U jednom rešenju, pegilirani IFN-P je dobijen na sledeći način. IFN-P, npr., rastvor IFN-P-1 a iz veće količine intermedijera (klinička serija većih količina koja je prošla sve testove za upotrebu na ljudima) koncentracije 250 u-g/ml u 100 mM natrijum fosfata, pH 7,2, i 200 mM rastvora NaCl, razblažen je jednakom zapreminom 100 mM rastvora MES, pH 5,0, pa je pH vrednost podešena na 5,0 pomoću HC1. Uzorak je nanet na SP - Sepharose® FF kolonu (Pharmacia, Piscataway, Nju Džersi), pri koncentraciji od 6 mg IFN-p/ml smole. Kolona je eluirana sa 5 mM natrijum fosfatom, pH 6,0 i sa 600 mMNaCl. Frakcije mogu biti analizirane korišćenjem apsorbancije na 280 nm, a koncentracija interferona u uzorku se procenjuje na osnovu apsorbancije korišćenjem koeficijenta ekstinkcije od 1,51 za rastvor koncentracije od 1 mg/ml.

U rastvor IFN-P iz SP eluata koncentracije 1 mg/ml je dodat 0,5 M rastvor natrijum fosfata, pH vrednost 6,0, do koncentracije od 50 mM, pa je dodat 5 mM rastvor natrijum cijanoborhidrida (Aldrich, Milvoki, Viskonsin) i 5 mg/ml rastvor 20K PEG aldehida (Sheanvater Polimers, Huntsville, Alabama). Uzorak je inkubiran na sobnoj temperaturi tokom 20 časova. Pegilirani interferon je prečišćen od proizvoda reakcije sekvencionalnom hromatografijom na Superose<®>6 FPLC koloni (Pharmacia) sa5 mM rastvorom natrijum fosfata, pH 5,5, i sa 150 mM rastvorom NaCl kao mobilnom fazom i sa SP-Sepharose<®>FF. Hromatografijom na koloni je dobijeno osnovno razdvajanje modifikovanog i nemodifikovanog IFN-P. Eluciona frakcija dobijena gel filtracijom koja sadrži PEG - INF-P je razblažena 1 : 1 sa vodom, pa je naneta na SP-Sepharose<B>kolonu sa 2 mg IFN-p/ml smole. Kolona je isprana sa 5 mM rastvorom natrijum fosfata, pH 5,5, sa 75 mM NaCl, a nakon toga je pegilirani IFN-(3 eluiran sa kolone sa 5 mM rastvorom natrijum fosfata, pH 5,5, i sa 800 mM NaCl. Analiziran je sadržaj proteina u eluiranim frakcijama putem apsorbancije na 280 nm. Koncentracija pegiliranog IFN-P je izražena u interferonskim ekvivalentima, jer PEG podjedinica ne utiče na apsorbanciju na 280 nm. Ovaj postupak, kao i karakterizacija pegiliranog IFN-P koji je dobijen, dalje je opisan u WO 00/23114. Pokazano je da konjugačija IFN-p sa PEG ne menja njegovu antivirusnu aktivnost. Dodatno, nađeno je da specifična aktivnost pegiliranog IFN-P nije mnogo veća (oko 10x) od nepegiliranog IFN-P (WO 00/23114).

Takođe, IFN-p može biti pegiliran sa 5 K PEG-aldehidnom grupom koja može da se pribavi kod Fluka, Inc. (kat. br. 75936, Ronkonkoman, NY), prateći isti protokol kao što je gore opisano za 20 K PEG aldehid.

IFN-p koji je modifikovan sa 20 kDa mPEG-O-2-metilpropionaIdehidom može da se dobije na siedeći način. lOml rastvora IFN-<p->la bulk intermedijera (klinička serija većih količina koja je prošla sve testove za upotrebu na ljudima) koncentracije 250 ug/ml i 100 mM natrijum fosfata, pH 7,2, i 200 mM rastvora NaCl je razblaženo sa 12 ml 165 mM rastvora MES, pH 5,0, i sa 50 ul 5 N rastvora HC1. Uzorak je nanet na SP - Sepharose® FF kolonu od 300 ul (Pharmacia, Piscatavvav, Nju Džersi). Kolona je tri puta eluirana sa po 300 ul 5 mM rastvora natrijum fosfata, pH 5,5 i sa 600 mM rastvora NaCl. Frakcije mogu biti analizirane korišćenjem vrednosti apsorbancije na 280 nm, a koncentracija interferona u uzorku se procenjuje korišćenjem koeficijenta ekstinkcije od 1,51 za rastvor koncentracije od 1 mg/ml. Vršne frakcije se prikupljaju, čime se dobija rastvor IFN-p koncentracije 3,66 mg/ml, koji se nakon toga razblažuje sa vodom do koncentracije od 1,2 mg/ml.

U 0,8 ml rastvora IFN-P iz razblažene SP-Sepharose frakcije, dodaju se 0,5 M rastvor natrijum fosfata, pH 6,0, do konc. od 50 mM, onda 5 mM natrijum cijanoborhidrid (Aldrich) i 5 mg/ml 20 kDa mPEG-O-2-metilpropionaldehid. Uzorak se inkubira na sobnoj temp. tokom

16 časova u mraku. PEGilirani IFN-P se prečišćava iz reakcione smeše na SP-Sepharose FF koloni od 0,5 ml na siedeći način: 0,6 ml reakcione smeše se razblažuje sa 2,4 ml 20 mM rastvora MES, pH 5,0, pa se nanosi na SP-Sepharose kolonu. Kolona se ispira natrijum fosfatom, pH 5,5, sa 75 mM rastvorom NaCl, a potom se PEGilirani IFN-P eluira sa kolone pomoću 25 mM rastvora MES, pH 6,4, i sa 400 mM rastvorom NaCl. PEGilirani IFN-p se dalje prečišćava na Superose 6 HR 10/30 FPLC koloni sa 5 mM natrijum fosfatoom, pH 5,5, i sa 150 mM rastvorm NaCl kao mobilnom fazom. Kolona (25 ml) je radila pri protoku od 20 ml/čas, a prikupljene su frakcije od 0,5 ml. U eluiranim frakcijama je analiziran sadržaj proteina na prema apsorbanciji na 280 nm, onda su prikupljene, pa je u svakom uzorku određivana koncentracija proteina. Koncentracija PEGiliranog IFN-p je izražena u IFN ekvivalentima, jer PEG podjedinica ne utiče na apsorbanciju na 280 nm. Uzorci frakcija su uklonjeni radi analize, a ostatak je razblažen do konc. od 30 ug/ml sa puferom koji sadrži HSA za formulaciju, podeljeni su na jednake delove od 0,25 ml/bočici i uskladišteni su na temp. od -70 °C.

IFN-P koji je modifikovan sa 20 kDa mPEG-0-/?-fenilacetaldehidom može da se dobije na siedeći način. 20ml rastvora ®IFN-P-la bulk intermedijera (klinička serija većih količina koja je prošla sve testove za upotrebu na ljudima) koncentracije 250 ug/ml u 100 mM natrijum fosfata, pH 7,2, i 200 mM rastvora NaCl, razblaženo je sa 24 ml 165 mM rastvora MES, pH 5,0, i sa 100 ul 5 N rastvora HC1 i sa 24 ml vode. Uzorak je nanet na SP - Sepharose® FF kolonu od 600 ul (Pharmacia). Kolona je dva puta eluirana sa po 900 u.1 5 mM rastvora natrijum fosfata, pH 5,5 i sa 75 mM rastvora NaCl, a protein je eluiran sa 5 mM rastvorom fosfata, pH 5,5, i sa 600 mM NaCl. Frakcije su analizirane korišćenjem vrednosti apsorbancije na 280 nm, a koncentracija IFN-p u uzorcima se procenjuje korišćenjem koeficijenta ekstinkcije od 1,51 za rastvor koncentracije od 1 mg/ml. Vršne frakcije se prikupljaju, čime se dobija rastvor IFN-p koncentracije 2,3 mg/ml. U 1,2 ml rastvora IFN-p-la iz SP-Sepharose frakcija, dodaju se 0,5 M rastvor natrijum fosfata, pH 6,0, do konc. od 50 mM, onda 5 mM natrijum cijanoborhidrid (Aldrich) i 10 mg/ml 20 kDa mPEG-O-/?-fenilacetaldehid. Uzorak se inkubira na sobnoj temp. tokom 18 časova u mraku. PEGilirani IFN-P se prečišćava iz reakcione smeše na SP-Sepharose FF koloni od 0,75 ml na siedeći način: 1,5 ml reakcione smeše se razblažuje sa 7,5 ml 20 mM rastvora MES, pH 5,0, i sa 7,5 ml vode i 5 u.1 5 N HC1, pa se nanosi na SP-Sepharose kolonu. Kolona se ispira natrijum fosfatom, pH 5,5, sa 75 mM rastvorom NaCl, a potom se PEGilirani IFN-P eluira sa kolone pomoću 20 mM rastvora MES, pH 6,0, i sa 600 mM rastvorom NaCl. PEGilirani IFN-P se dalje prečišćava na Superose 6 HR 10/30 FPLC koloni sa 5 mM natrijum fosfatom, pH 5,5, i sa 150 mM rastvorm NaCl kao mobilnom fazom. Kolona (25 ml) je radila pri protoku od 20 ml/čas, a prikupljene su frakcije od 0,5 ml. U eluiranim frakcijama je analiziran sadržaj proteina prema apsorbanciji na 280 nm, onda su prikupljene, pa je u svakom uzorku određivana koncentracija proteina. Koncentracija PEGiliranog IFN-P je izražena u IFN ekvivalentima, nakon korekcije usled uticaja PEG (20 kDa mPEG-O-p-fenilacetaldehid ima koeficijent ekstinkcije na 280 nm od 0,5 za rastvor konc. 1 mg/ml) na apsorbanciju na 280 nm, korišćenjem koeficijenta ekstinkcije od 2 za rastvor PEGiliranog IFN-P koncentracije 1 mg/ml. Uzorci iz frakcija su uklonjeni radi analize, a ostatak je razblažen do konc. od 30 ug/ml sa puferom koji sadrži HSA za formulaciju, podeljeni su na jednake delove od 0,25 ml/bočici i uskladišteni su na temp. od -70 °C.

U postupcima prema predmetnom pronalasku može da se koristi glikozilirani IFN-P koji je vezan sa veštačkim polimerom. Polimer može da sadrži polialkilen glikol podjedinicu. Polialkilen podjedinica može biti vezana za IFN-p pomoću grupe koja je izabrana iz skupa koji čine aldehidna grupa, maleimidna grupa, vinilsulfonska grupa, haloacetatna grupa, mnoštvo histidinskih ostataka, hidrazinska grupa i aminotiol grupa. IFN-P može biti povezan sa polietilen glikol podjedinicom, pri čemu je IFN-P povezan sa polietilen glikol podjedinicom labilnom vezom, pri čemu se labilna veza može raskinuti biohemijskom hidrolizom i/ili proteolizom. Polimer može imati molekulsku masu od oko 5 do oko 40 kDa. Drugi IFN-p koji može da se koristi jeste fiziološki aktivni IFN-p preparat koji sadrži fiziološki aktivni glikozilirani IFN-P koji je N-terminalno povezan sa polimerom koji sadrži polialkilen glikol podjedinicu, pri čemu su fiziološki aktivni IFN-p i polialkilen glikol podjedinica u takvom odnosu da fiziološki aktivni IFN-p u sastavu preparata fiziološki aktivnog IFN-P ima praktično istu aktivnost kao i fiziološki aktivni IFN-P koji ne poseduje polimernu podjedinicu, što se određuje antivirusnim testom.

Heterologi polipeptidi ili drugi molekuli mogu biti kovalentno ili ne-kovalentno povezani sa IFN-P proteinom ili njegovom varijantom. Pojam "kovalentno povezani" označava da različite podjedinice prema predmetnom pronalasku mogu biti povezane direktno kovelanento jedna sa drugom ili indirektno nekovalentno preko umetnutih podjedinica, kao što su premošćavajuće, razdvajajuće ili povezujuće podjedinice. Umetnute podjedinice se nazivaju "vezne grupe". Pojam "konjugovan" se ovde naizmenično koristi sa pojmom "kovalentno povezani".

IFN-P koji se koriste prema predmetnom pronalasku mogu biti glikozilirani ili neglikozilirani. Neglikozilirani IFN-p mogu da se dobiju, npr., u prokariotskoj ćeliji - domaćinu. IFN-p proteini ili njihove varijante takođe mogu da se modifikuju povezivanjem sa polisaharidima koji normalno nisu prisutni na IFN-p.

Postupci za pro izvodnju IFN- j5 preparata

IFN-P preparati prema predmetnom pronalasku mogu da se dobiju bilo kojim pogodnim postupkom, npr., postupcima koji uključuju konstruisanje nukleinske kiseline koja kodira IFN-P preparat, a potom eksprimiranjem nukleinske kiseline u odgovarajuće transformisanom domaćinu. Ovim postupkom se proizvode rekombinantni IFN-P preparati. IFN-p preparati mogu se takođe proizvesti hemijskom sintezom ili kombinacijom hemijske sinteze i rekombinantne DNK tehnologije.

U jednom rešenju, nukleinska kiselina koja kodira IFN-P preparat je konstruisana izolacijom ili sintezom DNK sekvence koja kodira IFN-p ili njegovu varijantu. Na primer, IFN-p fuzioni protein može da se dobije na ovde navedeni način. Nukleinska kiselina IFN-p koja se prirodno javlja može da se dobije primenom postupaka koji su dobro poznati u struci. Na primer, nukleinska kiselina može da se izoluje reakcijom reverzna transkriptaza - polimeraza lančanom reakcijom (RT - PCR) korišćenjem RNK koja je dobijena iz ćelije za koju se zna da eksprimira IFN-P, npr., iz leukocita, kao i korišćenjem prajmera koji se zasnivaju na sekvenci gena IFN-P, npr., sekvenci čiji je ID broj 1. Nukleinske kiseline koje kodiraju IFN-P proteine mogu takođe biti izolovane na osnovu podataka dobijenih uvidom u banke sekvenci, npr., banki cDNK koje su oformljene od ćelija koje eksprimiraju IFN-P, korišćenjem probe, npr., oligonukleotida koji se sadrži deo IFN-P sekvence.

Alternativno, kompletna aminokiselinska sekvenca može da se iskoristi da bi se konstruisao odgovarajući gen. Može se sintetizovati DNK oligomer koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira IFN-p preparat. Na primer, nekoliko malih oligonukleotida koji kodiraju delove željenog polipeptida mogu se sintetizovati, a onda ligirati. Pojedinačni oligonukleotidi tipično sadrže 5' i 3' preklapajuće sekvence za komplementarno spajanje.

U nukleinske kiseline koje kodiraju IFN-P proteine mogu da se uvedu određene promene, korišćenjem postupaka koji su dobro poznati u nauci. Na primer, promene se mogu izazvati mutagenezom na tačno određenom mestu, kao što je opisano, npr., u Mark et al., "Site - specific Mutagenesis Of The Human Fibroblast Interferon Gene", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, pp. 5662 - 66 (1984) i u U. S. patentu, br. 4,588,585.

Drugi postupak konstruisanja nukleinske kiseline koja kodira IFN-P preparate podrazumeva hemijsku sintezu. Na primer, gen koji kodira željeni IFN-P preparat može da se sintetiše hemijskim putem korišćenjem oligonukleotidnog sintetizatora. Takvi oligonukleotidi su dizajnirani na osnovu sekvence amino kiseline željenog IFN-P preparata.

Kada se bira nukleinska kiselina za ekspresiju u ekspresionom sistemu, može biti poželjno da se izaberu oni kodoni koji su pogodni za ćeliju domaćina ili ekspresioni sistem u kome se proizvodi rekombinantni IFN-p preparat. Na primer, poznato je da se kod prokariotskih ćelija određeni kodoni lakše eksprimiraju od drugih kodona ("kodonska preferencija").

DNK sekvenca koja kodira IFN-P preparat može, a ne mora, da sadrži DNK sekvencu koja kodira signalnu sekvencu. Takve signalne sekvence, ukoliko su prisutne, treba da budu prepoznate od strane ćelije koja je izabrana za ekspresiju IFN-P preparata. Signalna sekvenca može biti prokariotska, eukariotska ili njihova kombinacija. Signalne sekvence su dobro poznate u struci i opisano je nekoliko različitih. Signalna sekvenca može bit sekvenca iz prirodnog IFN-p. Uključivanje signalne sekvence zavisi od poželjnosti sekrecije IFN-P preparata iz rekombinantnih ćelija u kojima se proizvodi. Ukoliko su izabrane ćelije prokariotske, generalno je poželjno da DNK sekvenca ne kodira signalnu sekvencu. Ukoliko su izabrane ćelije eukariotske, generalno je poželjno da signalna sekvenca bude kodirana, a najpoželjnije je da se koristi signalna sekvenca IFN-P divljeg tipa.

Kada je jednom sastavljena (sintezom, za mesto specifičnom mutagenezom ili na drugi način), nukleinska kiselina koja kodira IFN-P preparat se ubacuje u vektor za ekspresiju, u kome je operativno povezana sa kontrolnom sekvencom ekspresije koja je pogodna za ekspresiju IFN-p preparata u željenoj transformiranoj ćeliji - domaćinu. Pravilno sastavljanje može biti potvrđeno sekvencioniranjem nukleotida, restrikcionim mapiranjem, kao i ekspresijom biološki aktivnog polipeptida u odgovarajućem domaćinu ili ćeliji - domaćinu. Kao što je dobro poznato u struci, da bi se postigli visoki nivoi ekspresije transficiranog gena u domaćinu ili u ćeliji - domaćinu, gen mora biti operativno povezan sa kontrolnim transkripcionim i translacionim sekvencama koje su funkcionalne u domaćinu izabranom za ekspresiju.

Izbor kontrolne sekvence za ekspresiju i ekspresionog vektora zavisi od izbora ćelije - domaćina. Može se koristiti širok spektar domaćina / vektora za ekspresiju. Korisni ekspresioni vektori za eukariotske domaćine, npr., eukariotske ćelije - domaćine, obuhvataju vektore koji sadrže kontrolne sekvence ekspresije iz SV40, goveđeg papiloma virusa, adenovirusa i citomegalovirusa, a to su, npr., siedeći vektori: pcDNAI/amp, pcDNAI/neo, pRc/CMV, pSV2gpt, pSV2neo, pSV2-dhfr, pTk2, pRSVneo, pMSG, pSVT7, pko-neo i pHyg izvedeni vektori. Alternativno, za prolaznu ekspresiju proteina u eukariotskim ćelijama mogu da se koriste derivati virusa, kao što su goveđi papiloma virus (BPV-1) ili Epštajn - Barov virus (pHEBo, pREP - izvedeni i p205). U struci su dobro poznati različiti postupci koji se koriste za pripremu plazmida i transformaciju organizma domaćina. Za pregled drugih odgovarajućih ekspresionih sistema, videti Molecular Cloning - A Laboratorv Manual, 2. izdanje, urednici Sambrook, Fritsch & Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratorv Press

(1989), poglavlja 16 i 17.

Korisni ekspresioni vektori za bakterijske ćelije - domaćine obuhvataju poznate bakterijske plazmide, kao što su plazmidi iz E. coli, uključujući colEl, pCRl, pBR322, pMB9 i njihove derivate, plazmide širokog spektra domaćina, kao što su RP4, DNK faga, npr., brojne derivate lambda faga, npr., MN989, kao i druge DNK fage, kao što su Ml3 i fage sa jednolančanom filamentoznom DNK. Korisni ekspresioni vektori za ćelije gljivica obuhvataju 2.mu. plazmid i njegove derivate. Korisni vektori za ćelije insekata obuhvataju pVL941. Videti, takođe, Cate et al., "Isolation of the Bovine and Human Genes for Mullerian Inhibiting Substance and Expression ofthe Human Gene in Animal Cells", Cell, 45, str. 685 - 98 (1986).

Dodatno, bilo koja iz širokog spektra kontrolnih sekvenci ekspresije može da se upotrebi u navedenim vektorima. Takve korisne kontrolne sekvence ekspresije obuhvataju kontrolne sekvence ekspresije koje su udružene sa strukturnim genima napred naveenih ekspresionih vektora. Primeri korisnih sekvenci za kontrolu ekspresije obuhvataju, na primer, rane i kasne promtere SV40 ili adenovirusa, lac sistem, trp sistem, TAC ili TRC sistem, glavni operatorski ili promoterski egion lambda faga, na primer, PL, kontrolne regione fd pokrivnog proteina, promoter 3-fosfoglicerat kinaze ili promotere drugih glikolitičkih enzima, promotere kisele fosfataze, npr. Pho5, promotere gljivičnog a sistema za razmnožavanje i druge sekvence za koje je poznato da kontrolišu ekspresiju gena prokariotskih ili eukariotskih ćelija ili njihovih virusa, kao i njihove različite kombinacije.

Za proizvodnju IFN-P preparata može da se koristi bilo koji pogodni domaćin, uključujući bakterije, gljive (uključujući plesni), biljke, inskete, sisare ili njihove odgovarajuće ćelije ili ćelijske linije, kao i transgene životinje ili biljke. Primeri domaćina obuhvataju sojeve E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomvces, gljive, plesni, insekateske ćelije, npr. Spodoptera fruapedia (SF9), životinjske ćelije, kao što su ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO) i mišije ćelije, kao što su NS/O, ćelije afričkog zelenog majmuna, kao što su COS1, COS7, BSC40 i BMT10, kao i humane ćelije, ali i ćelije biljaka u kulturi tkiva.Takve ćelije se dobijaju iz Američke kolekcije tipskih kultura (ATCC). Poželjne ćelije - domaćini za ekspresiju u životinjskim ćelijama obuhvataju kultivisane CHO ćelije i COS7 ćelija, a posebno CHO-DDUKY-pl ćelijsku liniju.

Treba napomenuti da svi navedeni vektori i sekvence za kontrolu ekspresije ne funkcionišu podjednako dobro prilikom ekspresije ovde opisanih DNK sekvenci. Takođe, ni sve ćelije - domaćini neće podjednako dobro funkcionisati sa istim ekspresionim sistemom. Međutim, stručnjak može da napravi selekciju među ovim vektorima, sekvencama za kontrolu ekspresije i ćelijama - domaćinima, bez nepotrebnog eksperimentisanja. Tebalo bi da bude razmotren broj kopija vektora, sposobnost kontrole tog broja kopija i ekspresija bilo kojih drugih proteina koje kodira vektor, kao što su antibiotski markeri. Na primer, poželjni vektori prema predmetnom pronalasku obuhvataju one koji dozvoljavaju da broj kopija DNK koja kodira IFN-P preparat bude amplifikovan. Vektori koji se mogu amplifikovati su dobro poznati u struci. Oni obuhvataju, na primer, vektore koji mogu da budu amplifikovani DHFR amplifikacijom (videti, npr., Kaufman, U.S. patent br. 4,470,461, Kaufman & Sharp, "Construction of a Modular Dihvdrofolate Reductase cDNA Gene: Analvsis of Signals Utilized for Efficient Expression", Mol. Cell. Biol., 2, str. 1304 - 19 (1982)) ili amplifikacijom glutation sintetaze ("GS") (videti, npr., U.S. patent br. 5,122,464 i Evropsku objavljenu prijavu 338,841).

U selekciji sekvence za kontrolu ekspresije, u obzir, takođe, mogu biti uzeti različiti činioci. Ovde spadaju, na primer, relativna jačina sekvence, mogućnost njene kontrole i njena kompatibilnost sa datom DNK sekvencom koja kodira IFN-P preparat, posebno u pogledu sekundarnih struktura. Ćelije - domaćini treba da budu izabrane uzimajući u obzir njihovu kompatibilnost sa izabranim vektorom, toksičnost proizvoda koji je kodiran DNK sekvencama prema predmetnom pronalasku, karakteristike njihove sekrecije, njihovu sposobnost da oforme više polipeptidne strukture korektno, karakteristike njihove fermentacije ili kultivacije, kao i jednostavnost prečišćavanja proizvoda koji su kodirani DNK sekvencama.

U okviru ovih parametara, stručnjak može da izabere različite kombinacije vektora, sekvenci za kontrolu ekspresije i ćelija-domaćina, koje će ekspreimirati željene DNK sekvence u fermentacionoj ili širokoj životinjskoj kulturi, na primer, korišćenjem CHO ćelija ili COS 7 ćelija. Korišćenje CHO ćelijske linije CHO - KUKX - BI DHFR sup za ekspresiju INF-P varijanti je dalje opisano u U.S. patentu br. 6,127,332.

IFN-P preparat takođe može biti proizveden uin vitrosistemu, npr., uin vitrotranslacionom sistemu, npr., u ćelijskom lizatu, npr., u lizatu retikulocita. Pojam" in vitrotranslacioni sistem", koji se ovde naizmenično koristi sa pojmom "bezćelijski translacioni sistem" se odnosi na translacioni sistem koji predstavlja bezćelijski ekstrakt koji sadrži barem minimalni broj elemenata koji je potreban za translaciju RNK molekula u protein. Sistemi zain vitrotranslaciju tipično sadrže makromolekule, kao što su enzimi, faktore transalcije, inicijacije i elongacije, hemijske reagense i ribozome. Na primer,in vitrotranslacioni sistem može da sadrži makar ribozome, inicijator metionil-tRNKMet, proteine ili komplekse koji su uključeni u translaciju, npr., eIF2, eIF3, cap-vezujući (CB - cap binding) kompleks, koji sadrži cap-vezujući protein (CBP - cap-binding protein) i eukariotski faktor inicijacije 4F (eIF4p). Različitiin vitrotransalcioni sistemi su dobro poznati u struci i obuhvataju komercijalno dostupne setove. Primeriin vitrotransalcionih sistema obuhvataju eukariotske lizate, kao što su lizati zečijih retikulocita, lizate zečijih oocita, lizate humanih ćelija, lizate insekatskih ćelija i ekstrakte pšeničnih klica. Lizati su komercijalno dostupni kod proizvođača, kao što su Promega Corp., Madison, Viskonsin; Stratagene, La Jolla, Kalifornija; Amersham, Arlington Heights, Ilinois; i GIBCO/BRL, Grand Island, Njujork. RNK koja se koristi uin vitrotranslacionim sistemima može biti proizvedenain vitro,npr., korišćenjem SP6 ili T7 promotera, korišćenjem postupaka koji su poznati u struci.

U drugom rešenju, IFN-P preparat se eksprimira iz endogenog gena u ćeliji - domaćinu. Postupak može da obuhvata inseciju heterologog promotera proksimalno u odnosu na kodirajući region IFN-P gena, npr., neki inducibilni promoter, čime se eksprimira endogeni IFN-p gen, a nakon toga se prikuplja proizvedeni IFN-p. Heterologi promoter može biti uveden u ćeliju postupkom "knock-in", korišćenjem postupaka koji su poznati u struci, ili alternativno, insercijom promotera unutar gena za IFN-p.

IFN-P preparat koji se dobija prema predmetnom pronalasku može biti glikoziliran ili neglikoziliran, u zavisnosti od organizma domaćina koji se koristi za proizvodnju preparata. Ukoliko su bakterije izabrane kao domaćini, tada će proizvedeni IFN-P preparat biti neglikoziliran. Sa druge strane, eukariotske ćelije će glikozilirati IFN-P preparat.

IFN-P preparat koji je dobijen putem transformisanih domaćina može biti prečišćen korišćenjem bilo kog pogodnog postupka. Poznati su različiti postupci za prečišćavanje IFN-p. Videti, npr., U.S. patente br. 4,289,689, 4,359,389, 4,172,071, 4,551,271, 5,244,655, 4,485,017, 4,257,938, 4,541,952 i 6,127,332. U poželjnom rešenju, IFN-p preparat se prečišćava korišćenjem imunoafiniteta, kao što je opisano, npr., u: Okamura et al., "Human Fibroblastoid Interferon: Immunosorbent Column Chromatographv and N-terminal Amino Acid Sequence", Biochem., 19, str. 3831 - 35 (1980).

Na primer, IFN-P proteini i njihove varijante mogu da se izoluju i prečiste korišćenjem konvencionalnih uslova, kao što su ekstrakcija, precipitacija, hromatografija, afinitetna hromatografija, elektroforeza i slično. Na primer, proteini interferona i fagmenti mogu da se prečiste propuštanjem njihovog rastvora kroz kolonu koja poseduje interferonski receptor koji je imobilisan na koloni (videti U.S. patent br. 4,725,669). Vezani molekul interferona tada može biti eluiran tretiranjem haotropnom soli ili eluiranjem vodenim rastvorom sirćetne kiseline. Imunoglobulinski fuzioni proteini mogu biti prečišćeni propuštanjem rastvora koji sadrži fuzioni protein kroz kolonu koja sadrži imobilisani protein A ili protein G, koji selektivno vezuje Fc deo fuzionog proteina. Videti, npr., Reis, K. J., et al., J. Immunol. 132 : 3098 - 3102 (1984); PCT prijava, publikacija br. WO 87/00329. Himerično antitelo zatim može biti eluirano tretiranjem haotropnom soli ili eluiranjem vodenim rastvorom sirćetne kiseline.

Alternativno, proteini interferona i imunoglobulinski fuzioni molekuli mogu biti prečišćeni na kolonama sa anti-interferonskim antitelima, ili na kolonama sa anti-imunoglobulinskim antitelima, kako bi se dobio praktično čist protein. Pod pojmom "praktično čist" se podrazumeva da protein ne sadrži nečistoće koje se prirodno javljaju sa njim. Stanje "praktično čistog" može da se dokaže postojanjem samo jedne trake pri elektroforezi.

IFN-P koji je proizveden i prečišćen može biti opisan, npr., mapiranjem peptida. Na primer, uzorak IFN-p preparata može da se razgradi endoproteinazom Lys-C i analiziran putem HPLC reverzne faze, kao što je opisano, npr., u U.S: patentu br. 6,127,332.

U poželjnom rešenju, IFN-P preparat praktično ne sadrži drugi ćelijski materijal, npr. proteine. Pojam "prečišćeni preparati IFN-p" se odnosi na dobijanje IFN-P preparata koji poseduje manje od oko 20% (suvog ostatka) kontaminirajućeg ćelijskog materijala, npr. nukleinskih kiselina, proteina i lipida, a poželjno poseduje manje od oko 5% kontaminirajućeg ćelijskog materijala. Poželjne preparati IFN-P poseduju manje od oko 2% kontaminirajućeg ćelijskog materijala; još poželjniji preparati sadrže manje od oko 1% kontaminirajućeg ćelijskog materijala, a najpoželjniji preparati sadrže manje od oko 0,5%; 0,2%; 0,1%; 0,01%; 0,001% kontaminirajućeg ćelijskog materijala.

Poželjni IFN-p preparati takođe praktično ne sadrže druge ćelijske proteine (ovde takođe označene kao "kontaminirajući proteini"), tj. preparati sadrže manje od oko 20%

(suvog ostatka) kontaminirajućeg proteina, a poželjno manje od oko 5% kontaminirajućeg proteina. Poželjne preparati predmetnih polipeptida poseduju manje od oko 2% kontaminirajućeg proteina; još poželjniji preparati sadrže manje od oko 1% kontaminirajućeg

proteina, a najpoželjniji preparati sadrže manje od oko 0,5%; 0,2%; 0,1%; 0,01%; 0,001% kontaminirajućih proteina.

Stepen čistoće i koncentracija IFN-p preparatamogu da se odrede postupcima koji su poznati u struci, npr., izlaganjem uzoraka gel elektroforezi, kao stoje opisano, npr., u: Robert K.. Scopes, Protein Purification, Principles and Practice, 3. izdanje, Springer Verlag New York, 1993, kao i u referencama koje su tu citirane.

Biološka aktivnost IFN-P preparata može da se ispita bilo kojim postupkom koji je poznat u struci, npr., neutralizacijom antivirusne aktivnosti korišćenjem antitela, indukcijom protein kinaze, oligoadenila 2,5-A sintetaze ili fosfodiesteraze, npr., kao što je opisano u EP-Bl-41313 i WO 00/23472. Takvi testovi obuhvataju imunomodulatorne testove (videt, npr., U.S. patent br. 4,753,795), testove inhibicije rasta i merenja vezivanja za ćelije koje eksprimiraju receptore za interferon. Primeri antivirusnih testova su dalje opisani u U.S. patentu 6,127,332 i WO 00/23472.

Sposobnost IFN-p preparata da leče glomerulonefritis takođe može da se ispita na životinjskim modelima, npr., onim modelima koji su opisani u Primerima koji slede. Ispitivanje može da se izvede, npr., kao što je opisano u Primerima.

IFN-P preparati takođe mogu komercijalno da se nabave pod sldećim zaštićenim imenima: AVONEX<®>(INF-p-1 a) (Biogen, Inc., Cambridge, MA); REBIF<®>(IFN-p-la)

(Serono, S.A., Geneva, Švajcarska); BETAFERON<®>ili Bferon (IFN-p-lb) (Schering Aktiengesellschaft, Berlin, nemačka); i BETASERON<®>ili Bseron (Berlex, Montville, NJ; IFN-P-lb). AVONEX<®>i REBIF<®>su rekombinantni glikozilirani IFN-p proizvedeni od strane ćelija jajnika kinskog hrčka. BETAFERON<®>i BETASERON<®>su proizvedeni u bakterijama.

Postupci lečenja sa IFN- fi preparatima

Predmetni pronalazak obezbeđuje postupke lečenja glomerulonefritisa ili hronične bubrežne insuficijencije kod osoba koje su obolele ili koje poseduju rizik od razvoja glomerulonefritisa, uključujući primenu kod osobe terapijski efikasne količine IFN-P preparata. Osoba može biti ona osoba kod koje je dijagnostičkovan glomerulonefritis ili hronična insuficijencija bubrega.

Glomerulonefritis, koji se takođe označava kao "akutni nefritis" ili "akutni glomerulonefritis", predstavlja, ali prolazni inflamatorni proces koji pogađa glomerule, izazivajući akutno smanjenje JGF, poremećaj homeostaze tečnosti i elektrolita. Simptomi glomerulonefritis obuhvataju: proteinuriju; smanjenje jačine glomerularne filtracije (JGF); promene serumskih nivoa elektrolita, uključujući azotemiju (uremiju, povećanje nivoa uree u krvi) i retenciju soli, što vodi retenciji vode, a time i pojavi hipertenzije i edema; hematurija i nenormalnosti sedimenta urina, uključujući eritrocitne cilindre; hipoalbuminemija; hiperlipidemija; i lipidurija.

Brojne bolesti, koje su navedene ispod, uključuju i glomerulonefritis. Ukoliko je dovoljno ozbiljan, akutni glomerulonefritis može dovesti do akutne ili brzoprogresivne insuficijencije bubrega. Akutni glomerulonefritis udružen sa brzo progresivnom insuficijencijom bubrega je uobičajeni scenatio, koji može biti nazvan brzo progresivnim glomerulonefritisom zbog svog kliničkog ponašanja. S obzirom da je oštećenje zida glomerula stalan nalaz u akutnom glomerulonefritisu, eritrociti i albumin ulaze u Boumanov prostor i prolaze u urin. Kombinacija eritrocita u urinu, insuficijencije bubrega u nenormalnostima homeostaze tečnosti se naziva nefritskim sindromom. Masivni gubitak proteina plazme može dovesti do stanja koj se naziva nefrotski sindrom, kada proteini koji se gube urinom narušavaju ravnotežu proteina u serumu, što se manifestuje niskim nivoima albumina, nenormalnostima lipida i edemom. Stoga, laboratorijski nalaz proteinurije (albuminurije) i hematurije, generalno sa eritrocitnim cilindrima su neophodni za dijagnozu glomerulonefritisa, dok odsustvo ovih nalaza upućuje na druge dijagnoze. Na primer, tubulointersticijalni nefritis obuhvata prolaznu inflamaciju bubrežnih tubula i intersticijuma, bez zahvatanja kapilara glomerula. Kao i u akutnom glomerulonefritisu, javljaju se hematurija, eritrocitni cilindri i smanjenje JGF, ali je proteinurija manje naznačena i obuhvata mahom proteine male molekulske mase, a ne albumin.

Brojne bolesti mogu biti odgovorne za sindrom akutnog glomerulonefritisa. Obično je potrebna biopsija bubrega radi evaluacije pacijenata sa akutnim glomerulonefritisom, bez obzira da li je prisutna bubrežna insuficijencija u određenom stepenu. Dijagnoza, prognoza i terapija su određene preciznim histološkim i ultrastrukturnim analizama uzoraka dobijenih biopsijom bubrega. Dalje, uzorci za biopsiju mogu biti ispitivani kako bi se utvrdili tipovi imunih kompleksa, imunoglobulini i druge supstance koje su ključne u određenom tipu glomerulonefritisa, a često se izvodi imunofluorescentna analiza. Bolesti koje zahvataju bubrege mogu da se klasifikuju prema njihovoj patogenezi, na osnovu toga da li ili ne dovode do oštećenja nefrona koje je dovoljno da utiče na jačinu glomerularne filtracije i tako izazovu neki oblik bubrežne insuficijencije.

Tradicionalna nomenklatura je oformljena kako bi se opisale različite karakteristike glomerularne bolesti. Pojmovi glomerularna bolest, glomerulopatija i glomerulonefritis mogu naizmenično da se koriste u literaturi, mada pojam glomerulonefritis često označava inflamatorni proces, kao što je navedeno gore. Glomerularne bolesti se klasifikuju kao primarne onda kada patološki proces nastaje u bubregu, a onda izaziva sistemske manisfestacije; glomerularne bolesti se označavaju kao sekundarne onda kada su posledica nekog drugog, multisistemskog poremećaja. Patološke karakteristike koje se vide pod svetlosnim mikroskopom omogućavaju dalju karakterizaciju tipa glomerularne bolesti. Oštećenje koje zahvata deo glomerula se naziva segmentalno, a oštećenje koje zahvata skoro ceo glomerul se naziva globalno. Nenormalnosti koje se karakterišu povećanjem broja ćelija u glomerulu se nazivaju proliferativnim, bez obzira da li je povećanje broja ćelija posledica infiltracije leukocita ili proliferacije rezidentnih glomerularnih ćelija. Ćelijska proliferacija koja zahvata ćelije Boumanove kapsule se naziva ekstra kapilarna; proliferacija koja obuhvata endotelne ili mezangijalne čelije se naziva intrakapilarna ili endokapilarna. Nakupina ćelija koje se nalaze u Boumanovom prostoru i koje formiraju polumesečastu formaciju se naziva polumesecom i obično je sastavljena od proliferišućih epitelnih ćelija i infiltrišućih monocita. Glomerulonefritis sa polumesecima predstavlja tip akutnog glomerulonefritisa koji se karakteriše polumesečastim formacijama u glomerulima. S obzirom da je stanje često udruženo sa brzo progresivnom bubrežnom insuficijencijom, pojam glomerulopnefritis sa polumesecima može naizmenično da se koristi sa pojmom brzo progresivni glomerulonefritis. Ukoliko se glomerularna bolest karakteriše ekspanzijom glomerularne bazalne membrane usled nakupina imunokompleksa, označava se kao membranozni. Kombinacije gore navedenih pojmova se koriste da opišu glomerularne bolesti na osnovu njihovih dominantnih patoloških karakteristika. Proliferativne glomerulopatije, takođe nazivane inflamatornim glomerulopatijama, obuhvataju stanja kao što su fikalno proliferativni glomerulonefritis, difuzno proliferativni glomerulonefritis, mezangijalno proliferativni glomerulonefritis i glomerulonefritis sa polumesecima, pri čemu svaki od pojmova sugeriše lokalizaciju i/ili tip proliferišućih ćelija. Ova stanja se karakterišu prisustvom ćelija krvi i proteina u sedimentu urina, pri čemu je količina proteina mala da bi izazvala nefrotski sindrom, a nazivaju se "nefritskom" slikom. Membranozne glomerulopatije podrazumevaju promenu promenu glomerularne fiitracione barijere u odnosu na proteine, obuhvatajući glomerularnu bazalnu membranu i visceralne epitelne ćelije. Ovi poremećaji, uključujući glomerulopatiju, bolest sa minimalnim promenama i fokalnu i segmentnu glomerulosklerozu, dovode do izraženog gubitka proteina, koji može da dovede do pojave nefrotskog sindroma. Kao što samo ime sugeriše, membranoproliferativni glomerulonefritis je hibridni poremećaj sa kliničkim karakteristikama koje sugerišu i ćelijsku proliferaciju i izmenjenu glomerularnu filtracionu barijeru. Oni poremećaji koji se karakterišu izraženim ekstravaskularnim odlaganjem proteinskog ili fibrilarnog materijala se nazivaju glomerularnim depozicionim bolestima. Ova oboljenja mogu da obuhvataju komponente i nefritskog i nefrotskog sindroma, pa se tako1 poklapaju sa nalazima u proliferativnim ili membranoznim poremećajima. Poslednja kategorija oboljenja koja zahvataju bubreg su trombotske mikroangiopatije, poremećaji u kojima dolazi do zgrušavanja krvi unutar malih krvnih sudova bubrega. Svaka od navedenih kategorija poseduje specifičan tip etiologije.

Postoji spektrum proliferativnih glomerulopatija, koji sugeriše da različite histopatološke karakteristike nastaju kao posledica različitih infiamatornih procesa. Na primer, difuzni proliferativni glomerulonefritis ,ože da predstavlja akutni imunološki odgovor na iznenadno i teško opterećenje antigenom. Glomerulonefritis sa polumesecima može da obuhvati manje dramatični imunološki odgovor na manju količinu antigena kod pojedinaca koji su prethodno senzitivirani. Fokalni proliferativni ili mezangijalni proliferativni glomerulonefritis predstavlja najmanje agresivni kraj spektra, pri čemu pacijenti mogu da ispolje samo sporo progresivnu bubrežnu insuficijenciju.

Imunofluorescentna ispitivanja uzoraka dobijenih biopsijom bubrega pomažu u razlikovanju osnovnih uzroka proliferativne glomerulopatije. Postoje tri široke dijagnostičke kategorije, od kojih je svaka udružena sa određenim obrascem odlaganja imunoglobulina, koje je vidljivo korišćenjem imunofluorescencije u kombinaciji sa izraženom ćelijskom proliferacijom. Granularni depoziti imunoglobulina karakterišu prvu kategoriju: glomerulonefritis sa imunim kompleksima. Linearno odlaganje imunoglobulina duž glomerularne bazalne membrane karakteriše drugu kategoriju: anti-GBM bolest. Minimalno odlaganje imunoglobulina karakteriše treću kategoriju: slabo-imuni glomerulonefritis. Glomerulonefritis sa imunim kompleksima predstavlja odgovor na poznati antigeni stimulus (npr. post-streptokokni glomerulonefritis) ili može biti deo multisistemskog poremećaja sa imunim kompleksima (npr., lupusa, krioglobulinemije ili bakterijskog endokarditisa); u određenim slučajevima, nije moguće odrediti uzrok, pa se bolest označava kao idiopatska. Anti-GMB bolest je redak poremećaj u kome nastaju autoantitela koja napadaju kolagen tipa IV. Većina pacijenata sa anti-GMB bolešću takođe ima plućnu hemoragiju, stanje koje se naziva Gudpasterovim sindromom. Slabo-imuni glomerulonefritis se karakteriše nenormalnim nivoima cirkulišućih antitela specifičnim za citoplazmu neutrofila, što ukazuje na poremećaj regulacije huoralnog imuniteta.

Imunološki posredovani glomerulonefritis je prisutan u velikom delu stečenih bubrežnih oboljenja. Generalno, postoji odlaganje antitela u glomerularnoj petlji, često autoantitela. Ćelijski imunološki mehanizmi koji su uključeni u imunološki posredovanom glomerulonefritisu dalje modulišu proizvodnju antitela i indukuju ispoljavanje od antitela zavisne citotoksičnosti. Najveći broj glomerulonefritisa koji su izazvani antitelima kod pacijenata je inicirano reakcijom cirkulišućih antitela sa autoantigenima.

Antitela mogu biti nađena u glomerulu kao posledica nekoliko različitih procesa. Prvo, cirkulišuća autoantitela mogu da reaguju sa sopstvenim autoantigenima koji su komponente normalnog glomerula. Drugo, cirkulišuća autoantitela i strani antigeni koji su deponovani u glomerulu mogu da dovedu doin situformiranja glomerularnih imunih kompleksa. Treće, imuni kompleksi koji su nastali u sistemskoj cirkulaciji mogu biti zarobljeni u glomerulu. Lokalizacija odlaganja antitela u velikoj meri određuje kliničke karakteristike glomerularne bolesti. Akutno odlaganje antitela u subendotelnom prostoru ili u mezangijumu može da pokrene jako izraženi nefritski odgovor, koji se karakteriše brzom regrutacijom leukocita i trombocita iz glomerularnih kapilara. Odlaganje antitela u subepitelnom prostoru tipično indukuje nefrotski tip odgovora, koji se karakteriše proteinurijom uz slabije izraženi inflamatorni ćelijski infiltrat.

Bilo koji od ovih imunoloških procesa može započeti kaskadu inflamatornih reakcija u glomerulu, što vodi oštećenju glomerula, a potom i poravci oštećenja. Reaktivnost autoantitela prema sopstvenim ili stranim antigenima koji se nalaze u glomerulu dovodi do aktivacije komplementa, do proizvodnje hemoatraktanata, hemokina i citokina. Tako, pokreću se mehanizmi koji su zavisni, kao i oni koji su nezavisno od komplementa, što vodi oštećenju glomerularnih ćelija. Leukociti i trombociti se takođe regrutuju u glomerulu, što vodi daljem oštećenju. Produženo odlaganje imunih kompleksa tokom meseci do godina, može da provocira izraženo povećanje proizvodnje bazalne membrane. Proces rezolucije kod bilo kog tipa imunološki posredovane glomerulopatije nemože da započne sve dok se ne okonča lokalna imunološka aktivnost, dok ne prestane dalja proizvodnja antitela ili stvaranje imunih kompleksa, uz uklanjanje odloženih ili cirkulišućih imunih kompleksa, uz sprečavanje nastanka daljeg imflamatornog regrutovanja ćelija, sa oslobađanjem medijatora inflamacije u bubrežnim tkivima i uz normalizaciju vaskularnog tonusa i endotelijaine adhezivnosti.

Nakon oštećenja glomerula, može doći do ozdravljenja uz stvaranje ožiljka. Oporavak može biti potpun, bez rezidualnog oštećenja. Češće, glomerularno ožiljavanje može biti rašireno, sa posledicama po funkciju bubrega. Primećeno je da faktor transformacije p (TGF-p), citokin koji prati proces ozdravljenja u glomerulu, stimuliše proizvodnju ekstracelularnog matriksa i inhibira sintezu tkivnih proteaza koji razgrađuju proteine matriksa, pa tako pospešuje formiranje ožiljaka nakon oštećenja glomerula. Ožiljavanje nakon oštećenja glomerula dalje oštećuje preostale vijabilne nefrone, što vodi progresivnom gubitku nefrona. Pošto se gubi još funkcionalnih nefrona, preostali nefroni vrše kompenzaciju, kao što je gore opisano, a taj proces ih takođe oštećuje. Konačni rezultat može biti progresivno smanjenje bubrežne funkcije, koje kulminira hroničnom insuficijencijom bubrega sa razvojem terminalne faze bubrežne bolesti.

IFN-P preparati takođe mogu da se koriste za lečenje fokalne glomeruloskleroze i kolabirajućih glomerulopatija, uključujući idiopatske i sekundarne oblike nastale usled HIV infekcije. Kolabirajući glomerulonefritis je brzo progresivna bolest koja vodi do bubrežne insuficijencije za koju ne postoji efikasna terapija. Oboljenje se najčešće javlja kod HIV pacijenata. S obzirom da proteinurija ima važnu ulogu u ovom oboljenju, očekuje se da IFN-P preparati, koji značajno smanjuju proteinuriju, pokažu značajno dejstvo u smislu poboljšanja simptoma u ovoj bolesti. Drugo oboljenje u kome proteinurija ima važnu ulogu i u kome se očekuje da IFN-P preparati budu od koristi jeste bolest sa minimalnim promenama, koja se takođe označava i kao nefropatija sa minimalnom promenom (NMP), kao i nefrotski sindrom sa minimalnom promenom (NSMP).

Shodno tome, IFN-P preparati mogu da se koriste za lečenje bubrežnih stanja koja su udružena sa inflamacijom u glomerulima, npr., za lečenje bilo kog od sledećih bubrežnih stanja: fokalne glomeruloskleroze i kolabirajućeg glomerulonefritisa, bolesti sa minimalnim promenama, akutnog glomerulonefritisa, glomerulonefritisa sa polumesecima, nefritskog sindroma, nefrotskog sindroma, primarnog glomerulonefritisa, sekundarnog glomerulonefritisa, proliferativnog glomerulonefritisa, membranoznog glomerulonefritisa, membranoproliferativnog glomerulonefritisa, glomerulonefritisa sa imunim kompleksima, glomerulonefritisa kod anti-GBM oboljenja, slabo-imunog glomerulonefritisa, dijabetične glomerulopatije, hroničnog glomerulonefritisa i hereditarnog nefritisa. Svako oboljenje ili stanje koje nastaje kao posledica ovih bubrežnih bolesti, kao što je hronična bubrežna bolest i terminalna faza bubrežne bolesti, takođe može da bude tretirano postupcima prema predmetnom pronalasku.

Subjekti za lečenje

Uopšteno, postupci predmetnog pronalaska mogu se koristiti kod bilo kog subjekta koji pripada nekoj vrsti sisara i koji je oboleo od ili kod koga postoji rizik da se razvije glomerulonefritis, hronična bubrežna insuficijencija, ili kod koga postoji rizik za primenu terapije zamene bubrežne funkcije (npr., hronične dijalize ili transplantacije bubrega). Izraz "subjekat koji je oboleo ili kod koga postoji rizik od razvijanja gromeluronefritisa ili hronične bubrežne insuficijencije" odnosi se na subjekta kod koga se sa razlogom očekuje da može da boluje od progresivnog gubitka bubrežne funkcije povezanog sa progresivnim prestankom funkcije nefrona. Da li je subjekat oboleo ili da li postoji rizik za razvoj glomerulonefritisa ili hronične bubrežne insuficijencije rutinski može odrediti stručnjak sa prosečnim poznavanjem medicinske ili veterinarske veštine. Subjekti koji su oboleli ili kod kojih postoji rizik od razvijanja gromeluronefritisa ili hronične bubrežne insuficijencije (ili kod kojih postoji rizik od primene terapije zamene bubrežne funkcije) obuhvataju, bez ograničenja: subjekte za koje se može smatrati da boluju od hronične bubrežne insuficijencije, krajnjeg stupnja bubrežne bolesti, hronične bubrežne nefropatije, hipertenzivne nefroskleroze, hronične glomerulonefroze, naslednog nefritisa i/ili bubrežne displazije; subjekti koji imaju proteinuriju, promene elektrolita u serumu, npr., kod kojih postoji azotemija (uremija, npr., povišene vrednosti uree u krvi); subjekti sa retencijom soli, koja može da rezultuje hipertenzijom i edemom, hematurijom i nenormalnim sedimentom urina, uključujući eritrocitne cilindre; subjekte sa hipoalbuminemijom, hiperlipidemijom i lipidurijom; subjekte kod kojih biopsija ukazuje na postojanje glomerularne hipertrofije, tubularne hipertrofije, hronične glomeruloskleroze i/ili hronične tubulointersticijalne skleroze; subjekti kod kojih je ultrazvukom, magnetnom rezonancom (NMR), CAT skenerom ili drugom ne-invazivnom metodom potvrđena bubrežna fibrioza ili postojanje bubrega manjih od normalnih. Ostale pokazatelji oboljenja ili postojanja rizika od razvoja glomerulonefritisa ili hronične bubrežne insuficijencije kod subjekta su dobro poznate stručnjacima sa uobičajenim poznavanjem medicinske strule. Na primer, svi ovde navedeni kriterijumi mogu da se koriste za određivanje postojanja oboljenja ili rizika od razvoja glomerulonefritisa ili hronične bubrežne insuficijencije kod subjekta: postojanje neuobičajen broj širokih cilindara prisutnih u mokraćnom sedimentu; jačina glomerularne filtracije (JGF) koja je hronično manja od 50%, a posebno koja je manja od 40%, 30%, 20% očekivane vrednosti JGF za datog subjekta; pripadnost muškom polu i telesna masa od najmanje 50 kg sa JGF koja je hronično manja od 50 ml/min, a posebno manji od 40 ml/min, 30 ml/min ili 20 ml/min; pripadnost ženskom polu i telesna masa od najmanje 40 kg sa JGF koja je hronično manja od 40 ml/min, a posebno manja od 30 ml/min, 20 ml/min ili 10 ml/min; broj funkcionalnih nfrona koji je manji od 50%, a posebno manji od 40%, 30%, ili 20% od broja funkcionalnih nefrona koje poseduje zdrav i po drugim osobinama sličan subjekat; postojanje samo jednog bubrega i stanje nakon transplantacije bubrega.

Subjekti - sisari koji se mogu lečiti postupcima prema predmetnom pronalasku obuhvataju, bez ograničenja, ljudske subjekte. Dodatno, predmetni pronalazak može da se koristi u lečenju domaćih životinja - sisara, koji se drže kao kućni ljubimci (npr., psi, mačke, konji), koji imaju izraženu komercijalnu vrednost (npr., krave - muzare, goveda, sportske životinje), koji imaju izraženu vrednost za nauku (npr., primerci ugroženih vrsta koji se nalaze zatočeni ili na slobodi) ili koji imaju izraženu neku drugu vrednost. Indikacije za primenu tretmana preparatima IFN-P nad subjektima su identične navedenim pokazateljima postojanja rizika od pojave glomerulonefritisa, hronične bubrežne insuficijencije ili krajnjeg stupnja bubrežne bolesti, npr., kod kojih postoji rizik od primene terapije zamene bubrežne funkcije. U nekim slučajevima, subjekti koji se tretiraju ne poseduju navedene pokazatelje za lečenje preparatima IFN-p. U nekim slučajevima, međutim, subjekti mogu da imaju drugačije simptome (npr., virusno oboljenje, kao što je infekcija hepatitisom) za koje je indikovano lečenje preparatima IFN-p. U takvim slučajevima, lečenje treba prilagoditi kako bi se izbegla primena prevelikih doza preparata.

Stručnjak sa uobičajenim poznavanjem medicinske iii veterinarske prakse obučen je da prepozna subjekte kod kojih postoji značajno povećan rizik od pojave glomerulonefritisa, hronične bubrežne insuficijencije ili kod kojih postoji rizik od primene terapije zamene bubrežne funkcije. Klinička ili ne-klinička ispitivanja, kao i značajno iskustvo, koje se odnosi na već iznete ili neke druge postupke lečenja, očekivano mogu da daju informaciju veštom praktičaru, na osnovu koje će odlučiti da li kod određenog subjekta postoji rizik od razvijanja glomerulonefritisa, hronične bubrežne insuficijencije, ili rizik od primene terapije zamene bubrežne funkcije, ka i da li je određeni postupak lečenja prilagođen potrebama subjekta, što se odnosi i na lečenje prema predmetnom pronalasku.

Uopšteno, može se smatrati da su subjekti - sisari oboleli, ili da kod njih postoji rizik od razvijanja glomerulonefritisa, hronične bubrežne insuficijencije, rizik od primene terapije zamene bubrežne funkcije, onda kada im je već postavljena dijagnoza tog stanja, ili onda kada se smatra postoji verovatnoća da su pogođeni stanjem koje, uobičajeno, vodi progresivnom gubitku bubrežne funkcije, što je povezano sa progresivnim gubitkom u funkcionisanju nefrona. Takva stanja uključuju, bez ograničenja, krajnji stupanj bubrežne bolesti, hroničnu nefropatiju usled dijabetesa, glomerulopatiju usled dijabetesa, bubrežnu hipertrofiju usled dijabetesa, hipertenzivnu nefrosklerozu, hipertenzivnu glomerulosklerozu, hroničnu glomerulosklerozu, nasledni nefritis, bubrežnu displaziju i hronično odbacivanje koje nastaje

■: nakon transplantacije bubrežnog alografta^ i slično. Ove i druge bolesti i stanja poznata u nauci, tipično vode progresivnom gubitku u funkcionisanju nefrona i nastanku hronične bubrežne insuficijencije.

Često, vešt praktičar u medicinskim ili veterinarskim naukama može da postavi prognozu, dijagnozu ili da donese odluku! o lečenju, na osnovu ispitivanja uzorka dobijenih biopsijom bubrega. Takve biopsije obezbeđuju mnoštvo informacija korisnih u dijagnostikovanju bubrežnih funkcija. Subjekti koji su oboleli ili kod kojih postoji rizik od razvoja glomerulonefritisa, hronične bubrežne insuficijencije ili kod kojih postoji rizik od primene terapije zamene bubrežne funkcije, mogu se prepoznati putem histoloških pokazatelja u uzorku dobijenom biopsijom bubrega, koji obuhvataju, bez ograničenja, prisustvo zapaljenskih ćelija, npr., T - ćelija i makrofaga u glomerulima, postojanje glomerularne hipertrofije, tubularne hipertrofije, glomeruloskleroze, tubulointersticijalne skleroze i si.

Manje invazivne tehnike procenjivanja morfologije bubrega uključuju magnetnu rezonancu - NMR, CAT skener i ultrazvuk. Postoje tehnike slikanja koje koriste kontrastna sredstva ili sredstva za vizuelizaciju (npr., radioaktivne boje), ali treba napomenuti da su neka od tih sredstava posebno otrovna za bubrežna tkiva i strukture, pa stoga njihova upotreba se ne savetuje kod subjekata koji su oboleli ili kod kojih postoji rizik od razvoja glomerulonefritisa i hronične bubrežne insuficijencije. Takve ne invazivne tehnike se mogu koristiti za detektovanje stanja kao što su fibroza ili skleroza, fokalna bubrežna nekroza, bubrežne ciste i masivna bubrežna hipertrofija, na osnovu koje se subjekat svrstava u kategoriju koja se karakteriše rizikom od razvoja glomerulonefritisa, hronične bubrežne insuficijencije, ili postojanja rizika od primene terapije zamene bubrežne funkcije.

Često, prognoza, dijagnoza i/ili odluke o lečenju su bazirane na kliničkim pokazateljima bubrežne funkcije. Jedan takav pokazatelj je prisustvo neuobičajenog broja "širokih cilindara" ili "cilindara specifičnih za bubrežnu insuficijenciju" u sedimentu mokraće; što ukazuje na tubularnu hipertrofiju i sugeriše postojanje kompenzatorne bubrežne hipertrofije, koja je tipična za hroničnu bubrežnu insuficijenciju. Drugi pokazatelj bubrežne funkcije jeste jačina

glomerularne filtracije (JGF), koja se može meriti direktno kvantifikovanjem nivoa klirensa pojedinih markera, ili koja može biti potvrđena putem indirektih merenja.

Postupci lečenja koji se odnose na predmetni pronalazak ne moraju se ograničiti na subjekte sa nekim određenim vrednostima JGF, ili sa određenim vrednostima posebnih markera bubrežne funkcije. U stvari, nije neophodno da JGF subjekta, ili bilo koji pojedinačni marker bubrežne funkcije, bude određen pre primene postupka lečenja prema predmetnom pronalasku. Štaviše, merenje JGF se smatra poželjnim načinom procenjivanja bubrežne funkcije.

Kao što je poznato u struci, JGF odslikava klirens referentnog jedinjenja ili markera iz plazme u urin. Jedinjenje - marker koje se posmatra, obično je ono koje se slobodno filtrira u glomerulima, a koje se ne luči i ne reapsorbuje aktivno u bubrežnim tubulima i koje nije značajno vezano za proteine plazme. Stopa klirensa je tipično definisana gore navedenom formulom, koja se odnosi na zapreminu urina proizvedenog u periodu od dvadeset četiri časa i na relativne koncentracije markera u urinu i plazmi. Preciznije, JGF treba da se koriguje za vrednost površine tela. Referentno jedinjenje koje je "zlatni standard" je inulin, zbog svojstava njegove filtracije i osobine da se ne vezuje za nosače u serumu. Koncentraciju ovog jedinjenja je, međutim, teško kvantifikovati u krvi i urinu. Zato se češće od klirensa inulina koriste vrednosti klirensa drugih jedinjenja, uključujući kreatinin. Dodatno, često se koriste razne formule, sa ciljem da se uproste procene JGF, uzimajući u obzir nivoe markera u urinu, dnevne vrednosti proizvedenog urina ili vrednosti površine tela. Ove vrednosti se mogu proceniti na osnovu drugih faktora, osnovnih vrednosti koje su ustanovljene za dati subjekat ili na osnovu standardnih vrednosti sličnih subjekata. Ove procene, međutim, treba koristiti sa oprezom, jer mogu podstaći nepravilne pretpostavke koje se tiču bubrežne funkcije normalnih ili zdravih subjekata. Dodatno, za procenu klirensa se koristi p-aminohipurat (PAH).

U nauci su razvijeni razni postupci i formule koje opisuju očekivane vrednosti JGF za zdrave subjekte sa određenim karakteristikama. Posebno, postoje formule koje daju očekivanu vrednost JGF na osnovu nivoa kreatinina u plazmi, godišta, telesne mase i pola (videti, npr., odeljak "Definicije" u ovom tekstu). I druge formule se, naravno, mogu iskoristiti i mogu se napraviti tabele standardnih vrednosti za subjekte datog godišta, telesne mase, pola i/ili koncentracije kreatinina u plazmi. Noviji postupci merenja ili procenjivanja JGF (npr., korišćenje nuklearne magnetne rezonance - NMR ili NMR tehnologija) su takođe sada dostupni u struci i mogu se koristiti u skladu sa predmetnim pronalaskom (videti, npr., U.S. patente br. 5,100,646 i 5,335,660).

Uopšteno, bez obzira na način procene ili merenja JGF, može se smatrati daje subjekat oboleo ili da poseduje rizik za razvoj glomerulonefritisa, hronične bubrežne insuficijencije ili da poseduje rizik od primene terapije zamene bubrežne funkcije, onda kada subjekat ima JGF koja je hronično manja od 50% očekivane JGF za datog subjekta. Rizik se smatra većim ako je JGF još manja od tog nivoa. Stoga, smatra se daje subjekat posebno izložen riziku, ako je JGF hronično manja od 40%, 30%, ili 20% očekivane vrednosti JGF. Za muškarce mase od najmanje 50 kg, može se smatrati da su oboleli, ili da su izloženi riziku od pojave glomerulonefritisa, hronične bubrežne insuficijencije, ili primene terapije zamene bubrežne funkcije, onda kada subjekat ima JGF koja je hronično manja od oko 50 ml/min. Rizik se smatra većim ako je JGF još manja. Stoga, smatra se da je subjekat posebno izložen riziku, ako je JGF hronično manja od 40, 30 ili 20 ml/min. Za žene mase od najmanje 40 kg može se smatrati da su obolele, ili da su izložene riziku od pojave glomerulonefritisa, hronične bubrežne insuficijencije, ili primene terapije zamene bubrežne funkcije, onda kada subjekat ima JGF koja je hronično manja od oko 40 ml/min. Rizik se smatra većim ako je JGF još manja. Stoga, smatra se daje subjekat posebno izložen riziku, ako ima JGF koja je hronično manja od 30, 20 ili 10 ml/min. Uopšteno, smatra se daje subjekat oboleo, ili da poseduje rizik od razvijanja glomerulonefritisa, hronične bubrežne insuficijencije ili od primene terapije zamene bubrežne funkcije, ukoliko ima manje od oko 50% funkcionalnih nefrona, u odnosu na broj nefrona kod zdravih subjekata sličnih karakteristika. Kao što je i prethono rečeno, rizik se smatra još većim, ako je broj funkcionalnih nefrona jođ manji. Stoga, smatra se daje subjekat posebno izložen riziku ako je broj funkcionalnih nefrona manji od 40%, 30% ili 20% broja nefrona kod zdravog subjekta sličnih karakteristika.

Konačno, treba obratiti pažnju da se za subjekte koji poseduju samo jedan bubreg, bez obzira na način gubitka drugog bubrega (npr., fizička trauma, hirurško otklanjanje, defekat pri rođenju), može smatrati da suprima faciepod rizikom od razvijanja glomerulonefritisa, hronične bubrežne insuficijencije ili primene terapije zamene bubrežne funkcije. Ovo se posebno odnosi na subjekte koji su bubreg izgubili kao posledicu bolesti ili stanja koje može da utiče i na preostali bubreg. Slično tome, za subjekte koji su već recipijenti transplantiranog bubrega ili koji su već hronično korisnici dijalize (npr., hronična hemodijaliza ili kontinuirana ambulantna peritonealna dijaliza) može se smatrati da su izloženi riziku od razvijanja glomerulonefritisa, hronične bubrežne insuficijencije ili da postoji rizik od primene terapije zamene bubrežne funkcije.

Subjekti koji mogu biti lečeni shodno postupcima predmetnog pronalaska, takođe, uključuju one koji imaju stanje ili bolest za koju se zna da se može lečiti IFN-P, npr., subjekti koji su oboleli od multiple skleroze i virusne infekcije. Primer virusne infekcije koja se može lečiti je, npr., infekcija hepatitisom B. U takvim situacijama, može se razviti režim primene IFN-p preparata koji je prilagođen lečenju tih stanja. Subjekti, takođe, mogu biti oni koji imaju virusnu infekciju koja se ne može lečiti IFN-p preparatima,,ili koji ne nemaju virusnu infekciju koja izaziva glomerulonefritis. Shodno tome, primeri takvih subjekata uključuju one koji nisu nosioci virusa hepatitisa, npr., hepatitisa B ili C, ili gde glomerulonefritis nije izazvan virusom hepatitisa, npr., virusom hipatitisa B ili C. Alternativno, subjekat, takođe može biti neko ko je oboleo ili kod koga će se verovatno razviti glomerulonefritis izazvan virusnom infekcijom. U drugim rešenjima, subjekat ne boluje od krajnjeg stupanja bubrežne bolesti ili karcinom bubrežnih ćelija.

Formulacije i postupci lečenja

IFN-P preparati mogu se primeniti na bilo koji način koji je kompatibilan sa određenim sredstvom koje se primenjuje za bubrežnu terapiju. Stoga, poželjna primena može biti oralna ili parenteralna, uključujući intravensku, intraperitonealnu i bubrežnu intrakapsularnu primenu. Dodatno, primena ovde opisanih sredstava (npr., IFN-P preparata) može biti u vidu periodičnih injekcija u bolusu, ili u vidu kontinuirane intravenske ili intraperitonealne primene iz eksternog rezervoara (npr., plastična kesa) ili unutrašnjeg rezervoara (npr., biološko - razgradivi implant ili implantirana pumpa). U postupku prema predmetnom pronalasku, poželjno je da se IFN-P preparati primenjuju parenteralno. Pojam "parenteralno", kako se ovde koristi, uključuje primenu u vidu aerosola, subkutanu, intravensku, intramuskularnu, intraartikularnu, intrasinovijalnu, intrasternalnu, intratekalnu, intrahepatičnu, intralezionalnu ili intrakranijalnu injekciju ili infuziju.

Sredstva predmetnog pronalaska mogu se primeniti kod pojedinca bilo kojim pogodnim postupkom, poželjno je da to bude direktno (npr., lokalno, kao i injekcijom ili topijski na određeno mesto u tkivu) ili sistematski (npr., parenteralno ili oralno). Tamo gde se sredstvo primenjuje parenteralno, npr., intravenski, subkutano ili intramuskularno, poželjno je da sredstvo bude u obliku vodenog rastvora. Rastvor je fiziološki prihvatljiv, tako da pored primene željenog sredstva kod subjekta, rastvor ne utiče na ravnotežu elektrolita i/ili ravnotežu tečnosti. Tečni medijum za sredstvo stoga može da obuhvati normalni fiziološki rastvor (npr., 0,9% NaCl, 0,15 M, pH 7 - 7,4).

Poželjna je primena IFN-p preparata u vidu sterilnih farmaceutskih preparata koji sadrže farmaceutski prihvatljiv nosilac, koji može biti bilo koji od brojnih, dobro poznatih nosilaca, kao što su voda, fiziološki rastvor, fosfatima zasićeni slani rastvor, dekstroza, glicerol, etanol i slično, ili njihova kombinacija. IFN-p preparati se mogu pripremiti u preparatu koji sadrži jedan ili više proteina, npr., u cilju stabilizovanja IFN-P preparata. Na primer, IFN-P preparati mogu se mešati sa albuminom.

Farmaceutski preparati mogu da sadrže IFN-P preparat zajedno sa farmaceutski prihvatljivim nosiocem. Pojam "nosilac", kako se ovde koristi, uključuje prihvatljive adjuvante i vehikulume. Farmaceutski prihvatljivi nosioci koji se mogu koristiti u farmaceutskim preparatima prema predmetnom pronalasku obuhvataju, bez ograničenja, jonske izmenjivače, aluminijum, aluminijum stearat, lecitin, serumske proteine, kao što je humani serumski albumin, sredstva za puferovanje kao što su fosfati, glicin, sorbinska kiselina, kalijum sorbat, parcijalne gliceridske smeše zasićenih biljnih masnih kiselina, vode, soli ili elektrolita, kao što su prolamin sulfat, dinatrijum hidrogen fosfat, kalijum hidrogen fosfat, natrijum hlorid, soli cinka, koloidni silikat, magnezijum trisilikat, polivinil pirolidon, sredstva na bazi celuloze, polietilen glikol, natrijum karboksimetilcelulozu, poliakrilate, voskove, polietilen - polioksipropilen - blok polimere, polietilen glikol i lanolin.

IFN-p ili njegove varijante takođe mogu da se primenjuju u formi sistema za dopremanje lipozoma, kao što su male unilamelarne vezikule i multilameralne vezikule. Lipozomi se mogu formirati iz raznih fosfolipida, koji sadrže holesterol, stearilamin ili fosfatidilholin. U nekim rešenjima, film lipidnih komponenti je hidratisan vodenim rastvorom leka do forme lipidnog sloja koji enkapsulira lek, kao što je opisano u U. S. patentu br. 5,262,564.

IFN-P ili njihove varijante mogu se, takođe, povezati sa rastvorljivim polimerima kao nosiocima leka koji usmeravaju. Takvi polimeri uključuju polivinilpirolidon, piran kopolimer, polihidroksipropil-metakrilamid-fenol, polihidroksietilaspanamidfenol ili polietilenoksid-polilizin substituisan sa ostacima palmitoila. IFN-p ili njihove varijante mogu se, takođe, povezati sa proteinima, kao što su, na primer, receptorski proteini ili albumin. Dalje, IFN-p ili njihove varijante mogu se spajati sa jedinjenjima iz klase biorazgradljivih polimera, što je korisno za postizanje kontrolisanog oslobađanja leka, na primer, sa polilaktinskom kiselinom, poli-epsilon kaprolaktonom, polihidroksi buternom kiselinom, poliortoestrima, poliacetalima, polidihidropiranima, policijanokrilatima i sa unakrsno povezanim ili amfipatičnim blok kopolimerima ili hidrogelovima.

Prema predmetnom pronalasku, farmaceutski preparati mogu biti u formi sterilne injekcije, na primer sterilne vodene ili uljane suspenzije koja se može primeniti kao injekcija. Suspenzije mogu biti formulisane upotrebom tehnika koje su poznate u struci, koristešćenjem sredstava za dispergovanje i vlaženje i sredstava za suspendovanje. Sterilni preparat za ubrizgavanje može takođe biti sterilni rastvor u obliku injekcija ili suspenzije u netoksičnom diluentu ili rastvaraču koji je prihvatljiv za perenteralnu upotrebu, na primer u rastvoru 1, 3-butandiolu. Među prihvatljivim vehikulumima i rastvorima koji se mogu koristiti spadaju voda, Ringerov rastvor i izotonični rastvor natrijum hlorida. Dodatno, sterilna fiksirana ulja se konvencionalno koriste kao medijumi za rastvaranje ili suspendovanje. U ovu svrhu, bilo koja mešavina fiksnih ulja može se iskoristiti, uključujući sintetske mono- ili di- gliceride. Masne kiseline, kao što su oleinska kiselina ili njeni gliceridski derivati, koriste se u pripremanju preparata za injektiranje, isto kao i prirodna farmaceutski prihvatljiva ulja, kao što su maslinovo ulje ili ricinusovo ulje, posebno njihove polioksietilisane varijante. Ovi uljani rastvori ili suspenzije mogu takođe da sadrže alkohol dugog lanca kao diluent ili dispergujuće sredstvo.

Farmaceutski preparati koji sadrže IFN-P preparate mogu se, takođe, davati oralno. Na primer, mogu se primenjivati u bilo kom doznom obliku koji je prihvatljiv za oralnu upotrebu, uključujući, bez ograničenja, kapsule, tablete, vodene rastvore ili suspenzije. U slučaju tableta za oralnu upotrebu, nosioci koji se uobičajeno koriste jesu laktoza i kukuruzni škrob. Uobičajeno se dodaju lubrikanti, kao što je magnezijum stearat. Za oralnu primenu u obliku kapsule korisni diluenti obuhvataju laktozu i suvi kukuruzni škrob. Kada postoji potreba da se oralno primeni vodena suspenzija, aktivna sredstva se kombinuju sa emulgujućim i suspendujućim sredstvima. Ako se to želi, mogu se dodati određeni zaslađivači, ili sredstva za davanje ukusa i boje. Topijsko - transdermalni flasteri se takođe mogu primenjivati.

U željenom rešenju, IFN-p ili njegova varijanta se primenjuje kao tečni preparat koji sadrži stabilizujuće sredstvo. Stabilizujuće sredstvo može biti prisutno u količini od oko 0,3 % do oko 5% (maseni procenti) u odnosu na IFN-p ili njegove varijante. Stabilizujuće sredstvo može biti amino kiselina (npr., glutaminska kiselina i aspartinska kiselina) ili arginin ili glicin. Ako je stabilizujuće sredstvo arginin - HC1, poželjno je da njegova koncentracija bude u rasponu od 0,5% (w/v) do 5%, a najpoželjnije je da to bude 3,13% (što je ekvivaleno koncentraciji od 150mM arginina- HC1). Ako je stabilizujuće sredstvo glicin, poželjno je da njegova koncentracija bude u rasponu od 0,5% (w/v) do 2,0%, a najpoželjnije je da to bude 0,52% (što je ekvivaleno koncentraciji od 66,7 - 266,4 mM, a najpoželjnije 70 mM). Ako je stabilizujuće sredstvo glutaminska kiselina, poželjno je da njena koncentracija bude u rasponu od 100 mM do 200mM, a najpoželjnije je da bude 170 mM (što je ekvivaleno količini od 1,47% do 2,84%, a najpoželjnije 2,5% (w/v procenti)). Željeni raspon koncentracija IFN-P ili njegove varijante u tečnoj formulaciji je između 30 |ag/ml do oko 250 |ig/ml. Željena koncentracija varira između 48 i 78 (ig/ml, a najpoželjnija koncentracija je oko 60 ug/ml. U pogledu vrednosti koja se odnosi na Međunarodne standardne, interni Biogen standard je standardizovan u odnosu na Međunarodni standard za interferon Svetske zdravstvene organizacije, Natural #Gb - 23 - 902 - 531, tako daje raspon koncentracije izražen u I.J. (za zapreminu injekcije od 0,5 ml) od oko 6 MU do oko 50 MIJ, a najpoželjnija koncentracija je 12 MU.

Poželjno, stabilizujuće sredstvo za aminokiseline je arginin, u svom kiselom obliku (arginin - HC1), u rastvoru pH vrednosti od oko 5,0. Shodno tome, poželjni su poli - jonski ekscipijenti. Poželjno, tečni preparat se nalazi u posudi, npr., špricu, kod koje je površina u kontaktu sa tečnošću presvučena sa materijalom koji je inertan u odnosu na IFN-P, npr., silikonom ili polietrafluoroetilenom. Još poželjnije, preparat ima pH vrednost između 4,0 i 7,2. Poželjno je da rastvor koji sadrži stabilizujućie sredstvo nije liofilizovan i da nije izložen dejstvu kiseonika ili gasa koji sadrži kiseonik (npr., vazduh), tokom pripreme i čuvanja.

Organske kiseline i fosfatni puferi koji se prema predmetnom pronalasku koriste za održavanje pH vrednosti u rasponu od 4,0 do 7,2, a još poželjnije u rasponu od 4,5 do oko 5,5,

a najpoželjnije na 5,0, mogu biti konvencionalni puferi ili organske kiseline ili njihove soli,

kao što su citratni puferi (npr., smeša mononatrijum citrata i dinatrijum citrata, smeša limunske kiseline i trinatrijum citrata, smeša limunske kiseline i mononatrijum citrata, itd.), sukcinatni puferi (npr., smeša ćilibarne kisline i mononatrijum sukcinata, smeša ćilibarne kiseline i natrijum hidroksida, smeša ćilibarne kisline i dinatrijum sukcinata), tartaratni puferi, fumaratni puferi, glukonatni puferi, oksalatni puferi, laktatni puferi, fosfatni puferi i acetatni puferi, kao što je opisano u WO 98/28007.

Primeri formulacija, koje se mogu pripremiti kako je opisano u WO 98/28007, uključuju:

(i) 20 mM acetatni pufer, pH vrednosti 5,0, pri čemu je poželjno da pufer pre toga nije

bio liofilizovan i da sadrži IFN-p i najmanje jedan sastojak koji je izabran iz grupe koju čine:

(a) 150 mM arginin - HC1; (b) 100 mM natrijum hlorid i 70 mM glicin; (c) 150 mM arginin -

HC1 i humani serumski albumin koncentracije 15 mg/ml; (d) 150 mM arginin - HC1 i 0,1% Pluronic F - 68; (e) 140 mM natrijum hlorid; (f) 140 mM natrijum hlorid i humani serumski albumin koncentracije 15 mg/ml; i (g) 140 mM natrijum hlorid i 0,1% Pluronic F - 68; (ii) tečnost čija je pH vrednost 5,0, koja sadrži IFN-P ili njegovu varijantu, 170 mM L-glutaminsku kiselinu i 159 mM natrijum hidroksid, pri čemu je poželjno da tečnost nije prethodno liofilizovana; i (iii) 20 mM fosfatni pufer pH vrednosti 7,2, koji poželjno nije liofilizovan i koji sadrži IFN-p i najmanje jedan sastojak koji je izabran iz grupe koju čine: (a) 140 mM arginin - HC1 i (b) 100 mM natrijum hlorid i 70 mM glicin.

Takođe, poželjni preparati obuhvataju polisorbat, npr., 0,005% (w/v) polisorbat 20.

IFN-p preparati mogu biti formulisani u obliku suvog praha, koji može, a ne mora biti rastvoren ili suspendovan pre upotrebe kod subjekta. Posebno, pokazano je da IFN-P može da se konjuguje sa polimerima, npr., sa PEG, kada je posebno stabilan u suvom obliku (videti, npr., WO 00/23114 i PCT/US/95/06008).

Farmaceutski preparati prema predmetnom pronalasua mogu se, takođe, primenjivati u vidu nazalnog aerosola ili inhalacijom, upotrebom raspršivača, inhalatora za suvi prašak ili inhalatora sa prethodno određenom dozom. Takvi preparati se dobijaju tehnikama koje su dobro poznate u praksi farmaceutskog formulisanja i mogu se pripremiti kao rastvori u fiziološkom rastvoru, korišćenjem benzil alkohola ili drugih pogodnih konzervansa, sredstava koja povećavaju apsorpciju, čime se povećava biološka raspoloživost, fluorougljenika i/ili drugih konvencionalnih sredstava za razblaživanje ili dispergovanje. Prema drugom rešenju, preparati koji sadrže jedinjenje prema predmetnom pronalasku takođe mogu da sadrže i dodatno sredstvo izabrano iz grupe koju čine kortikosteroidi, anti - inflamatoma sredstava, imunosupresivi, anti - metaboliti i imunomodulatori. Jedinjenja iz svake od ovih klasa mogu se izabrati među sredstvima koja su navedena za odgovarajuću grupu jedinjenja u knjizi "Comprehensive Medical Chemistrv", Pergamon Press, Oxford, Engleska, str. 970 - 986

(1990), čiji opis je ovde uključen prema referenci. Specifična jedinjenja su teofilin, sulfasalazin i aminosalicilati (anti - inflamatoma jedinjenja); ciklosporin, FK - 506 i rapamicin (imunosupresori); ciklofosfamid i metotreksat (antimetaboliti); steroidi (inhalacijom, oralno ili topijski) i drugi interferoni (imunomodulatori). Korisni rastvori za parenteralnu primenu mogu se pripremiti bilo kojim postupkom koji je poznat u farmaceutskoj struci, što je opisano, na primer, u knjizi "Remington's Pharmaceutical Sciences" (Gennaro, A., urednik), Mack Pub., 1990. Parenteralna primena se generalno koristi u obliku subkutanih, intramuskularnih ili intravenskih injekcija i infuzija. Na primer, kada se koristi subkutana injekcija za primenu IFN-p, npr. PEGilliranog INF-p, u dozi od 0,01 - 100 uk/kg, ili poželjnije 0,01 - 10 ug/kg, tokom jedne nedelje, mogu se primeniti dve injekcije u 0. i 72. času sa dozama od 0,005 - 50 ug/kg, ili poželjnije od 0,005 - 5 ug/kg, respektivno. Dodatno, jedan pristup za parenteralnu primenu koristi implantaciju sporo otpuštajući sistem ili sistem sa odloženim otpuštanjem, koji obezbeđuje da se održava konstantna doza, shodno U.S. patentu br. 3,710,795, koji je ovde inkorporiran po referenci. Kao stoje poznato stručnjaku, formulisani preparati sadrže terapijski efikasne količine IFN-P preparata. Preciznije, oni sadrže količine koje obezbeđuju dopremanje odgovarajućih koncentracija IFN-p preparata do bubrežnih tkiva ili drugih poželjnih tkiva tokom vremena koje je dovoljno da spreči nastanak, inhibira, odloži ili ublaži trajan ili progresivan gubitak bubrežne funkcije, ili količline koje na neki drugi način obezbeđuju terapijsku efikasnost. Kao što je poznato stručnjacima, koncentracija ovde opisanih jedinjenja u terapijskom preparatu prema predmetnom pronalasku varira u zavisnosti od brojnih činilaca, uključujući biološku efikasnost izabranog sredstva, hemijske karakteristike (npr. hidrofobnost) jedinjenja koja se koriste, formulaciju jedinjenja sa ekscipijentima, način primene, kao i predviđeni tretman, bilo da se aktivni sastojak direktno primenjuje u bubregu ili bubrežnoj kapsuli, bilo da se primenjuje sistemski. Poželjna doza koja treba da se primeni takođe verovatno zavisi i od takvih promenljivih kao što su stanje bubrežnog tkiva, stepen gubitka bubrežne funkcije i opšte zdravstveno stanje određene osobe. Doze mogu da se primenjuje kontinuirano ili dnevno, ali je trenutno poželjno da se doze primenjuju jednom, dva ili tri puta nedeljno, sve dok postoji zadovoljavajući odgovor (što se meri, na primer, stabilizacijom i/ili poboljšanjem bubrežne funkcije praćenjem odgovarajućih medicinskih markera i/ili indeksima kvaliteta života). Reda primena doze, na primer, mesečna primena, takođe može da se koristi. Ne smatra se da je primena intravenske ili intraperitonealne infuzije, dva ili tri puta nedeljno preterano nezgodna kod osoba kojima je inače potrebna kontinuirana hemodijaliza ili hemodijaliza dva ili tri puta nedeljno. dodatno, kako bi se sprečila primena česetih infuzija, savetuje se implantacija polu-trajnog stenta (npr., intravenski, intraperitonealno ili intrakapsularno). Dozni režim za IFN-P se bira uzimajući u obzir različite činioce, uključujući tip, vrstu, starosnu dob, telesnu masu, pol i medicinsko stanje pacijenta; ozbiljnost stanja koje treba da se leči; način primene; funkciju bubrega i jetre pacijenta; kao i specifično jedinjenje koje se koristi ili njegovu so. takođe, u obzir se uzimaju aktivnost jedinjenja prema predmetnom pronalasku i osetljivost pacijenta na neželjena dejstva. Prosečni lekar ili veterinar mogu lako da odrede i prepišu efikasnu količinuleka koja je potrebna da se spreči nastanak, da se uspori ili zaustavi progresija oboljenja. Oralne doze prema predmetnom pronalasku, poželjno za pegilirane IFN-p preparate, nalaze se u opsegu od oko 0,01 -H00 ug/kg/dan p.o., ili poželjnije u opsegu od 0,01 - 10 ug/kg/dan. Poželjno je da preparati budu obezbeđeni u obliku označenih tableta koje sadrže 0,5 - 5000 ug, ili poželjnije 0,5 - 500 ug aktivne supstance. Bez obzira na način primene, mogu se koristiti podeljene ili pojedinačne doze. Na primer, jedinjenja prema predmetnom pronalasku mogu da se primene dnevno ili nedeljno, u pojedinačnoj dozi, ili ukupna doza može da se primeni u dve, tri ili četiri podeljene doze. Bilo koji od gore navedenih farmaceutskih preparata može da sadrži u vidu aktivnih sastojaka od 0,1 - 99%, od 1 - 70% ili poželjno od 1 - 50% aktivnih jedinjenja prema predmetnom pronalasku. Tok bolesti i odgovor na tretman lekom mogu da se prate kliničkim ispitivanjem i laboratorijskim pretagama. Efikasnost terapije prema predmetnom pronalasku se određuje stepenom u kome su prethodno opisani znaci i simptomi stanja, npr. hroničnog hepatitisa, ublaženi i stepenom u kome su očekivana sporedna dejstva interferona (tj. gripu sločni simptomi, kao što su povišena temperatura, glavobolja, groznica, mialgija, umor itd. i simptomi povezani sa centralnim nervnim sistemom, kao što su depresija, parestezije, umanjena koncentracija itd.) eliminisana ili značajno umanjena. IFN-P preparati mogu da se primene sami ili u kombinaciji sa drugim molekulima za koje je poznato da su od koristi u tretmanu stanja koja su ovde opisana, npr., sa anti-inflamatornim lekovima. Kada se korste u kombinaciji sa drugim sredstvima, može biti poželjno da se shodno tome izmene doze IFN-P preparata. Količina aktivnog sastojka koja može da se kombinuje sa nosiocem, kako bi se dobio oblik pojedinačne doze varira u zavisnosti od organizma koji se tretira, a posebno od načina primene. Međutim, treba naglasiti da specifična dozna i režim tretmana za svakog pojedinačnog pacijenta zavisi od brojnih činilaca, uključujući aktivnost specifičnih jedinjenja koja se koriste, starosnu dob, telesnu masu, opšte zdravstveno stanje, pol, način ishrane, vreme primene, brzinu ekskrecije, kombinaciju lekova, kao i procenu ordinirajućeg lekara i ozbiljnost specifičnog oboljenja koje se tretira. Količina aktivnog sastojka može takođe da zavisi od terapijskog ili profilaktičkog sredstva (ukoliko takvo postoji) sa kojim se aktivni sastojak zajedno primenjuje. Efikasna doza i brzina doze IFN-P preparata zavisi od brojnih činilaca, kao što su priroda inhibitora, veličina pacijenta, cilj tretmana, priroda patološkog stanja koje treba da se leči, specifični farmaceutski peparat koji se koristi, kao i procena ordinirajućeg lekara. Korisni su nivoi doze aktivnog sastojka između 0,001 i 100 mg/kg tm/dan, poželjno između 0,1 i 50 mg/kg tm/dan.Najpoželnije, IFN-P preparat se primenjuje u dozi između 0,1 mg/kg tm/dan i 20 mg/kg tm/dan, poželjno između 1 mg/kg tm/dan i 3 mg/kg tm/dan, u intervalima od 1 do 14 dana. Poželjne dozese sastoje od injekcije od oko 6 MIU nedeljno ili tri puta nedeljno. Moguće je postići optimizaciju doza, npr., IFN-p preparata, procenom cirkulišuće ili lokalne koncentracije IFN-p preparata.

U najpoželjnijem rešenju, AVONEX<®>se primenjuje kod osoba kojima je potreban. AVONEX<®>se prodaje u vidu liofilizovanog praška siedeći sastava:

Formulacija po 1 ml doze:

30 ug IFN-P-1 a (6 miliona internacionalnih jedinica (MIU))

50 mM natrijum fosfat

100 mM natrijum hlorid

15 mg humanog serumskog albumina

pH 7,2

Specifična aktivnost AVONEX<®>interferona je 2 * IO<8>jedinica/mg, tj. 200 MU antivirusne aktivnosti po miligramu IFN-p-1 a proteina. Pacijent rekonstituiše prašak sterilnom vodom pre primene intramuskularne injekcije zapremine 1 ml nedeljno. AVONEX<®>takođe može da se pripremi kao tečna formulacija sledećeg sastava:

Formulacija po 0,5 ml doze:

30 ^ IFN-p-1 a (6 MIU)

20 mM acetat (natrijum acetat i sirćetna kiselina)

150 mM arginin HC1

0,005% (vv/v) polisorbat 20

voda za injekcije

pH 4,8

Ova formulacija može da se pakuje u vidu prethodno napunjenog šprica. Pacijent može da koristi špric manuelno ili uz pomoć samoinjektora. Dozni režim je 6 MIU (tj. 30 ug) intramuskularno jednom nedeljno. s

U drugom rešenju, IFN-p perparat je REBIF<®>, koji se obezbeđuje u vidu liofilizovanog praška i u vidu tečnog preparata. Liofilizovani prašak je sledećeg sastava:

Formulacija po 2,0 ml doze:

3 MIU IFN-p-1 a

manitol

HSA

natrijum acetat

pH5,5

Specifična aktivnost REBIF<®>interferona je 2,7 * IO<8>jedinica /mg, tj. 270 MU antivirusne aktivnosti po miligramu IFN-P-1 a proteina. Pacijent rekonstituiše prašak rastvorom natrijum hlorida (0,9% NaCl) pre subkutanog injektiranja tri puta nedeljno.

Tečna formulacija REBIF<®>je sledećeg sastava:

Formulacija po 0,5 ml doze:

6 ili 12 MIU IFN-p-1 a

4 ili 2 mg HSA

27,3 mg manitola

0,4 mg natrijum acetata

voda za injekcije

Tečna formulacija se pakuje u vidu prethodno napunjenog šprica i primenjuje se uz ili bez korišćenja uređaja za samoinjektiranje (Rebiject), subkutano, tri puta nedeljno(6 ili 12 MIU, što odgovara dozi od 66 ug/nedeljno ili 132 ug/nedeljno, respektivno).

U još jednom rešenju, IFN-Ppreparat je BETASERON<®>(proizvođač Berlex), a to je IFN-p koji sadrži Cys-17 u Ser mutaciju i proizvodi seu e. coli.Ovaj neglikozilirani IFN-p je manje potentan od AVONEX<®>ili REBIF<®>, koji se proizvode u CHO ćelijama. Doze''- se prodaju količini od 250 ug (8 MIU), i u obliku liofilizovanog i u obliku tečnog preparata, za primenu u vidu subkutane injekcije svakog drugog dana. BETAFERON<®>je drugi komercijalno dostupni IFN-p, koji može da se primenjuje subkutano, prema uputstvu proizvođača.

IFN-P ili njegova varijanta takođe mogu da se primene zajedno sa rastvorljivim IFN receptorom tipa I ili njegovim delom, kao što je IFN- vezujući lanac receptora, kao što je opisano, npr., u U.S. patentu br. 6,372,207. Kao što je opisano u ovom patentu, primena IFN tipa I u obliku kompleksa sa IFN vezujućim lancem receptora, poboljšava stabilnost IFN i povećava njegovu potentnost. Kompleks može biti nekovalentni ili kovalentni.

IFN-P preparati mogu da se testiraju na životinjskim modelima glomerulonefritisa. Sisarski modeli glomerulonefritisa kod, na primer, miševa, pacova, zamoraca, mačaka, pasa, ovaca, koza, svinja, krava, konja i ne-humanih primata, može da se kreira upotrebom odgovarajuće direktne ili indirektne nokse ili povrede bubrežnog tkiva životinje. Životinjski modeli glomerulonefritisa mogu, na primer, da se kreiraju ubrizgavanjem antitela u glomerularnu bazalnu membranu, kao što je to slučaj u pacovskom modelu nefrotoksičnog nefritisa (NTN), koji je opisan u Primerima. Drugi životinjski modeli mogu da se kreiraju ubrizgavanjem anti-Thyl antitela u organizam životinje, kao što je dalje opisano u Primerima. Još jedan životinjsi model se kreira imunizacijom sa autologom glomerularnom membranom ili unilateralnom opstrukcijom uretera (UOU).

Terapijska efikasnost IFN-P preparata u izazivanju klinički značajnog poboljšanja markera bubrežne funkcije može da se procenjuje nakon njihove primene kod sisara (npr., kod čoveka) koji je oboleo ili poseduje rizik da će razviti glomerulonefritis ili hroničnu insuficijenciju bubrega i obuhvata praćenje, bez ograničenja, brzine povećanja proteinurije, nivoa uree u krvi, brzine porasta kreatinina u serumu, jačine glomerularne filtracije (JGF), odnosa urea u krvi/kreatinin, serumske koncentracije natrijuma (Na<+>), odnosa koncentracije kreatinina u urinu i plazmi, odnos konc. uree u urinu i plazmi, osmolalnosti urina, diureze i sličnih parametara (videti, na primer, Brenner & Lazarus (1994), u Harisons' Principles of Internal Medicine, 13. izdanje).

Predmetni pronalazak je dalje ilustrovan sledećim primerima, koji ni na koji način ne ograničavaju obim zaštite predmetnog pronalaska. Sadržaj svih citiranih referenci (uključujući literaturne refernce, prijavljene patente, objavljene patentne prijave koje citiraju u ovoj prijavi), ovde su jasno inkorporirane po referenci.

Praksa predmetnog pronalaska koristi, osim ako drugačije nije naglašeno, konvencionalne tehnike biologije ćelije, ćelijskih kultura, molekularne biologije, transgene biologije, mikrobiologije, rekombinantne DNK i imunologije, koje su poznate strzčnjacima. Takve tehnike su potpunije objašnjene u literaturi. Videti, na primer, Molecular Cloning A Laboratorv Manual, 2. izdanje., urednik Sambrook, Fritsch & Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press : 1989); DNA Cloning, Vol. I & II (urednik D. N. Glover, 1985); Oligonucleotide Svnthesis (urednik M. J. Gait, 1984); Mullis et al. U.S. patent br. 4,683,195; Nucleic Acid Hybridization (urednici B. D. Hames & S. J. Higgins, 1984); Transcription And Translation (urednici B. D. Hames & S. J. Higgins, 1984); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); esej, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (urednici J. H. Miller & M. P. Calos, 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods In Enzymology, Vol. 154 i 155 (urednici Wu et al.), Immunochemical Methods in Cell And Molecular Biology (urednici Mayer & Walker, Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Vol. I - IV (urednici D. M. Weir & C. C. Blackwell, 1986); Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986).

Primeri

Primer 1

IFN-P indukuje značajno smanjenje proteinurije u insuficijenciji bubrega

Ovaj Primer opisuje sposobnost IFN-P da značajno smanji proteinuriju u pacovskom modelu NTN (nefrotoksični nefritis), koji predstavlja inflamatorni model koji je histološki veoma sličan humanom glomerulonefritisu sa polumesecima i koji izaziva hroničnu insuficijenciju bubrega.

Navedeno oboljenje je kod pacova indukovano i.v. injekcijom nefrotoksičnog seruma (NTS), dobijenog imunizacijom zečeva preparatom liofilizovane pacovske glomerularne bazalne membrane (GBM). NTS se brzo vezuje za GBM, što vodi snažnom intraglomerularnom imunološkom odgovoru sa povećanjem ekspresije pro-inflamatornih citokina i adhezionih molekula. Nastaje influks leukocita u glomerul. U glomerulima se javljaju područja nekroze sa odlaganjem finrina i raskidanjem kapilarnim petlji. Ovo vodi razvoju polumesečastih nakupina inflamatornih ćelija i proliferaciji epitelnih ćelija u Boumanovom prostoru. Ovaj inflamatorni odgovor se karakteriše gubitkom velikih količina proteina urinom. U glomerulima nastaje progersivno ožiljavanje sa nakupljanjem kolagena u kapilarnoj mreži i fibrozna transformacija polumesečastih formacija. Nakon toga, kod pacova nastaje terminalna faza bubrežne insuficijencije. Tako, u ovom modelu, pacovi odgovaraju na prisustvo anti-GBM antitela razvojem akutne, ali prolazne bubrežne bolesti, a potom 100% životinja razvija HBI dobro poznatog toka. Različiti sojevi pacova poseduju različitu osetljivost za razvoj ovog oblika bubrežnog oštećenja, pri čemu su Wistra - Kvoto (WKY) pacovi izrazito osetljivi. Navedeni životinjski model je dalje opisan u, npr., Tam et al. (1999) Nephrol. Dial. Transplant. 14 : 1658 i u AUen et al. (1999) J. Immunol. 162 : 5519.

IFN-P koji se koristi u ovoj studiji je pacovski IFN-P koji odgovara aminokiselinama 22 - 184 sekvence čiji je GeneBank pristupni br. P70499. Pacovski IFN-P je eksprimiran u S-32 ćelijama jajnika kineskog hrčka (CHO), koje su prilagođene rastu u suspenziji i sekretovan je u podlogu kulture. Ćelije su uzgajane u podlozi koja sadrži serum u kulturama u fermentoru. IFN-p je prečišćen iz kondicionirane podloge kulture korišćenjem sekvencijalne hromatografije na Pharmacia SP-sefarozi, Blue sefarozi i Superose 12 smolama, kao i na Biorad Bio-Scale keramičkom hidroksiapatitu i Bio-Scale S smolama.. Zatim je IFN-p ekstenzivno dijaliziran nasuprot 25 mM rastvoru citrata i 150 mMNaCl (pH 4,5) i sterilisan filtracijom (0,2 um). Preparat IFN-P je >99% čist, što je određeno denzitometrijom Coomassie - obojenim neredukujućim SDS-PAGE gelova. Specifična aktivnost je oko 3 * IO8 jedinica/mg, mereno na pacovskim RATEC ćelijama.

U ovom primeru, NTN je indukovana kod 28 WKY pacova nabavljenih od Charles River Laboratories. Četiri pacova su ubijena 14. dana zbog kontrolnih histoloških analiza, a drugi su randomizirani da prime ili IFN-P u dozi od 3 * IO3 jedinica/dan i.p. ili IFN-P u dozi od 6 x IO<3>jedinica/dan i.p. ili samo vehikulum. Injekcije su davane 6 dana nedeljno, a tretman je nastavljen do 30. dana. Proteinurija je određivana 7. dana, a zatim jednom nedeljno. Pacovima je uzimana krv 14., 28. dana i na dan žrtvovanja. U vreme žrtvovanja, bubreg, pluća, jetra i slezina su fiksirani u formalinu, a drugi bubreg je brzo zamrznut.

Parametri funkcije koji su analizirani u vom i/ili u sledećim primerima su procenjeni na siedeći način: Albuminurija / proteinurija: odslikavaju glomerularno propuštanje, a u manjoj meri i nefunkcionalnost tubularnog metabolizma filtriranih proteina. Interpretacija ovih podataka može biti teška, jersu oni proizvod dve nezavisne promenljive; povećanje propustljivosti GBM vodi izraženijoj proteinuriji, a smanjenje jačine glomerularne filtracije smanjuje glomerularnu proteinuriju.

Urin je sakupljan u metaboličkim kavezima 24 časova pre analize. Koncentracija albumina u urinu je određena raketnom imunoelektroforezom. Koncentracija proteina u urinu je određena precipitacijom sulfosalicilnom kiselinom.

Serumska koncentracija kreatinina i klirens kreatinina (CrCl): Periferna krv je uzeta u vreme analiziranja radi određivanja koncentracije kreatinina u serumu korišćenjem Olvmpus reagenasa i Olvmpus AU600 analizatora (Olvmpus, Eastleigh, U.K.). KOncentracija kreatinina u urinu je takođe merena (Bayer RA-XT, Newbury, U.K.), da bi se omogućilo izračunavanje klirensa kreatinina.

Preživljavanje: krajnji ishod ovih ispitivanja je ili nagla smrt ili žrtvovanje životinja, kako bi se smanjio njihov distres. Životinje su dnevno posmatrane od strane nezavisnog posmatrača u maniru slepe studije, a moribundne životinje su žrtvovane onda kada se to činilo potrebnim od ruke treće strane. Praktično, oko polovine životinja u studijama preživljavanja je dostiglo tačku u kojoj su žrtvovane.

Napravljeni su isečci tkiva koji su obojeni hematoksilinom i eozinom radi grubog vrednovanja glomerularnog ožiljavanja, tubularnog propadanja, intersticijalnih inflamatornih infiltrata i intersticijalne fibroze korišćenjem arbitrarnih skala ocenjivanja.

Glomerularna fibroza: procenat kortikalne površine koja je obojena Masson - trihrom histohemijskim postupkom (predstavlja način za procenu kolagenog sadržaja u bubregu) određen je softverski. Kao područje interesovanja za izračunavanje specifične glomerularne fibroze takođe mogu biti izabrani pojedinačni glomeruli. Kako bi se ocenio stepen intersticijalne finroze u glomerulu, u parafinu fiksirani isečci bubrega su obojeni korišćenjem standardnog trihrom postupka (Martius žuto, brilijant kristal ljubičasto i anilinsko plavo). Da bi sekvantifikovale glomerulske fibrinske nakupine (npr., fibrinoidna nekroza), u parafinu fiksirani isečci bubrega su obojeni korišćenjem Mrtius žute boje, koja boji fibrin u crvenu / narandžastu boju. Isečci su ispitivani pod uvećanjem od 200 x korišćenjem Olvmpus BX40 mikroskopa (Olvmpus Optical, London, U.K.), na koji je postavljena digitalna kamera (Photonic Science, East Sussex, U.K.). Slike su napravljene i analizirane korišćenjem Image-Pro Plus™ softvera (Media Cvbernetics, Silver Spring, MD).

Kvantifikacija procenta bubrežne kortikalne površine koja je obojena braon bojom nakon bojenja imunoperoksidazom isečaka bubrega na prisustvo ED(A) domena fibronektina izgleda da pravi razliku između HBI različite funkcionalne ozbiljnosti. Slično tome, imunohistohemijska analiza kolagena tipa III omogućava izračunavanje procenta obojene kortikalne površine.

Ekspresija glomerularnog glatkomišićnog a aktina (SMA) je merena imunofluorescencijom. Ovaj protein definiše populaciju "miofibroblastnih" čelija u glomerulu, za koje se smatra da imaju ključnu ulogu u glomerularnoj fibrozi. Kvantifikacija imunofluorescentnog bojenja na a-SMA dobro korelira sa ocenama glomerularne fibroze dobijenim Masson - trihrom bojenjem.

Rezultati koji su prikazani na Slici 3, ukazuju na smanjenje proteinurije 21. i 28. dana kod životinja koje su tretirane sa obe doze IFN-p. Nije zapažena razlika u nivoima kreatinina u serumu; klirensu kreatinina; glomerularnom ili tubulointersticijalnom ožiljavanju zapaženom na H & E obojenim isečcima na "slepi" način (tj. nije bilo histološkog ožiljavanja); broju makrofaga ili CD8+ ćelija u glomerulu; ili odlaganju glomerularnog ED(A) finbronektina ili kolagena tipa IV.

Primer 2

IFN-P takođe značajno smanjuje proteinuriju tokom akutne faze oštećenja bubrega

Ovaj Primer pokazuje da, kao dodatak smanjenju proteinurije u kasnijim stadijumima

bubrežne isuficijencije, IFN-P takođe smanjuje proteinuriju u akutnoj fazi oštećenja bubrega.

U ovom Primeru, NTN je indukovana kod 32 pacova, injektiranjem 0,1 ml NTS i.v., kao što je gore opisano. Osam životinja je tretirano sa pacovskim IFN-P u dozi od 6 * 10<J>jedinica/dan i.p. tokom 6 dana nedeljno, od 0. do 14. dana. Osam životinja je tretirano sa RSA i.p. tokom 6 dana nedeljno, od 0. do 14. dana. Osam životinja je tretirano sa pacovskim IFN-P u dozi od 6 x 10<3>jedinica/dan i.p. tokom 6 dana nedeljno, od 0. do 28. dana. Osam životinja je tretirano sa RSA i.p. tokom 6 dana nedeljno, od 0. do 28. dana. Urin je prikupljan u metaboličkim kavezima tokom dana 7, 14, 21 i 28, radi merenja proteinurije i kreatinina. Svim pacovima je uzeta krv 14. dana i na dan žrtvovanja, radi određivanja kreatinina u serumu. Polovina pacova iz svake'grupe je žrtvovana tokom 14. dana, a druga polovina tokom 28. dana. Jedan čas pre žrtvovanja tokom 28. dana, životinjama je ubrizgan BrdU, radi procene ćelijske proliferacije. Sledeća tkiva su fiksirana u formalinu radi histološke analize: tkivo bubrega, pluća, jetre i slezine. Isečci bubrega su fiksirani u Carnov fiksativu zbog ispitivanja bojenja sa BrdU. Tkivo bubrega je takođe brzo zamrznuto. Semikvantitativnom analizom je procenjivano glomerularno ožiljavanje i fibroza na isečcima obojenim H & E.

Rezultati koji su prikazani na Slici 4 ukazuju da IFN-P izaziva značajno smanjenje proteinurije tokom dana 14, 21 i 28. Nije primećena razlika u serumskim nivoima kreatinina i klirensu kreatinina tokom dana 14 i 28. Histološki, primećeno je značajno smanjenje broja makrofaga u glomerulima (ED1<+>ćelije) i CD8<+>ćelija tokom dana 14, ali je primećen i njihov veći broj tokom dana 28. Takođe je primećeno značajno smanjenje a-aktina iz glatkih mišića glomerula tokom dana 28. Stoga, tretman sa IFN-P ima dejstvo na proteinuriju, smanjuje inflamaciju, ali nema očiglednog uticaja na stvaranje ožiljaka.

U drugom priemru, NTN je indukovana kod 16 WKY pacova, od kojih je osam tretirano pacovskim IFN-p u dozi od 6 * IO5 jedinica/dan i.p. tokom 6 dana nedeljno, od 0. do 7. dana, a drugih osam je treirano samo vehikulumom (pacovskim serumskim albuminom - RSA (rat serum albumin)) i.p. tokom 6 dana nedeljno, od 0. do 7. dana. Pacovi su držani u metaboličkim kavezima tokom dana 6 i 7. Svi pacovi su žrtvovani tokom 7. dana. Jedan čas pre žrtvovanja pacova, ubrizgan im je BrdU, radi procene ćelijske proliferacije. U vreme žrtvovanja, tkiva bubrega, pluča, jetre i slezine su fiksirana u formalinu. Tkivo bubrega je fiksirano u Carnov fiksativu radi procene bojenja sa BrdU i brzo je zaleđeno. Rezultati pokazuju da nema značajne razlike u proteinuriji, histologiji glomerula ili broju makrofaga ili CD8<+>ćelija u glomerulima. Međutim, ocena fibroze tokom 7. dana je manja kod životinja koje su tretirane sa IFN-p, u odnosu na kontrolne životinje. Dodatno, broj proliferišućih ćelija u glomerulu je značajno manji kod životinja tretiranih sa IFN-P u odnosu na kontrolne životinje (videti Sliku 5).

Primer 3

IFN-p indukuje značajno smanjenje proteinurije u životinjskom modelu bubrežne

insuficijencije sa Thy glomerulonefritisom

Ovaj primer takođe pokazuje daje proteinurija značajno smanjena pomoću IFN-P kod mezangijalnog proliferativnog glomerulonefritisa.

U vom primeru, korišćen je životinjski model Thyl glomerulonefritisa. Ovo je životinjski model mezangijalnog proliferativnog glomerulonefritisa, koji se karakteriše povećanom proteinurijom, proliferacijom mezangijalnih ćelija i akumulacijom mezanisjalnog matriksa. Model se zasniva na činjenici da mezangijalne ćelije eksprimiraju Thyl antigen. Lewis pacovima je data jedna i.v. injekcija monoklonalnog anti-Thyl antitela. Ovo vodi brzoj i reproducibilnoj nekrozi glomerularnih mezangijskih ćelija (mezangioliza) koja je posredovana komplementom. Proteinurija je primetna nakon 24 časa i traje najmanje 10 dana. Nakon mezangiolize sledi faza brze popravke, u kojoj mezangijalne ćelije proliferišu, tako da postoji proizvodnja mezangijalnog matriksa u višku. Ovo je reproducibilni model proteinurije i proliferacije mezangijalnih ćelija.

THyl glomerulonefritis je indukovan kod 16 Lewis pacova i kod 4 WKY pacova injektiranjem 0,2 ml (2,5 mg/kg) anti-Thyl antitela ER4. Osam Lewis pacova je primilo pacovski IFN-P u dozi od 6 x 10<3>jedinica/dan i.p. tokom 6 dana nedeljno, od 0. do 10. dana. Osam Lewis pacova je primilo sam vehikulum (pascovski serumski albumin - RSA), i.p. tokom 6 dana nedeljno, od 0. do 10. dana. Četiri WKY pacova nije primilo nikakav tretman, a progresija bolesti je posmatrana od 0. do 10. dana. Pacovi su postavljeni u metaboličke kaveze tokom 6., 7., 9. i 10. dana. Životinje su žrtvovane 10. dana. Jedan čas pre žrtvovanja, injektiran im je BrdU radi procene ćelijske proliferacije. U vreme žrtvovanja, tkiva bubrega, pluća, jetre i slezine su fiksirana u formalinu. Tkivo bubrega je fiksirano u Carnoy fiksativu, radi procene bojenja sa BrdU i brzo je zamrznuto.

Rezultati koji su prikazani na Slici 6 pokazuju daje proteinurija značajno smanjena tokom 7. i 10. dana. Nije bilo značajne razlike u nivou kreatinina u serumu, mada je klirens kreatinina pokazao trend opadanja u tretiranoj grupi (Slika 7). Nije bilo razlike u akutnom oštećenju glomerula na osnovu procene prisustva glomerularnih mikroaneurizmi. Međutim, glomerularna hipercelularnost je značajno smanjena kod pacova koji su tretirani sa IFN-P (Slika 8).

Primer 4

IFN-p indukuje značajno smanjenje proteinurije u životinjskom modelu puromicin

aminonukleozidne nefropatije(PAN)

PAN je indukovan kod 4 mužjaka Wistar pacova telesne mase od po 200 g. Dva pacova su primila 20 mg puromicin aminonukleozida (PA) i.p. tokom 0. dana, a dva pacova su primila 20 mg PA i.v. tokom 0. dana. Pacovi su držani u metaboličkim kavezima tokom dana 3 i 4 i tokom dana 7 i 8. Svi pacovi su žrtvovani tokom 8. dana. Rezuktati ukazuju da proteinurija ima srednju vrednost od 46 mg/24 časa i 287 mg/24 časa, tokom dana 4 i 8, respektivno, kod pacova kojima je PA ubrizgan i.p., a 122 mg/24 časa i 194 mg/24 časa tokom dana 4 i 8, respektivno, kod pacova kojima je PA ubrizgan i.v.

Efekat IFN-P u ovom životinjskom modelu je siedeći. PAN je indukovan kod pacova na gore opisani način. Pacovi su primili 6xIO2, 6 x 10J, 6 x IO4, 6 x 103 jedinica pacovskog IFN-P ili sam pufer. Rezultati koji su prikazani na Slici 9 pokazuju da primena IFN-P značajno smanjuje proteinuriju tokom dana 7 i 14, čak i pri najmanjim dozama IFN-p.

Stoga, rezultati u ovom i u prethodnim primerima pokazuju da IFN-p smanjuje inflamaciju u bubrežnoj bolesti, što je jasno vidljivo na osnovu smanjenja proteinurije i glomerularne proliferacije, kao i na osnovu smanjenja broja inflamatornih ćelija, npr. makrofaga i CD9<*>ćelija u glomerulu. Stoga, IFN-P može da se koristi za tretman, npr., za sprečavanje nastanka glomerulonefritisa i akutne i hronične insuficijencije bubrega.

Ekvivalenti

Stručnjaci znaju ili mogu da dođu do uvida korišćenjem uobičajenih eksperimenata da postoje mnogi ekvivalenti specifičnih rešenja predmetnog pronalaska. Ti ekvivalenti su obuhvaćeni obimom zaštite predmetnog pronalaska koji je definisan patentnim zahtevima koji slede.

Claims

1. Upotreba IFN-P terapijskog sredstva za proizvodnju medikamenta za lečenje ili prevenciju glomerulonefritisa kod sisara.

2. Upotreba prema zahtevu 1, naznačena time stoje glomerulonefritis izabran iz grupe koju čine fokalna glomeruloskleroza, kolabirajuće glomerulopatije, oboljenje sa minimalnim promenama, glomerulonefritis sa polumesecima, nefritski sindrom, nefrotski sindrom, primarni glomerulonefritis, sekundarni glomerulonefritis, proliferativni glomerulonefritis, membranozni glomerulonefritis, membranoproliferativni glomerulonefritis, glomerulonefritis sa imunim kompleksima, glomerulonefritis sa antitelima protiv glomerularne bazalne membrane, slaboimuni glomerulonefritis, dijabetična glomerulopatija, hronični glomerulonefritis i nasledni nefritis.

3. Upotreba prema zahtevu 1 ili 2, naznačena time što IFN-P terapijsko sredstvo sadrži IFN-p u zrelom obliku.

4. Upotreba prema bilo kome od zahteva 1-3, naznačena time što IFN-P terapijsko sredstvo ne sadrži početni metionin.

5. Upotreba prema bilo kome od zahteva 1-4, naznačena time što IFN-P je humani IFB-3.

6. Upotreba prema zahtevu 5, naznačen time što IFN-p je bar oko 95% identičan sa zrelim oblikom humanog IFN-P pune dužine koji sadrži sekvencu čiji je ID broj 4.

7. Upotreba prema zahtevu 6, naznačena time što IFN-P sadrži sekvencu čiji je ID broj 4.

8. Upotreba prema bilo kome od zahteva 1-7, naznačena time što IFN-P je glikoziliran.

9. Upotreba prema bilo kome od zahteva 1-7, naznačena time što IFN-p nije glikoziliran.

10. Upotreba prema zahtevu 5, naznačena time što IFN-p je IFN-P-la.

11. Upotreba prema zahtevu 5, naznačena time što IFN-P je IFN-P-lb.

12. Upotreba prema bilo kome od zahteva 1-11, naznačena time što IFN-P terapijsko sredstvo sadrži IFN-P fuzionisan sa konstantnim domenom molekula imunoglobulina.

13. Upotreba prema zahtevu 12, naznačen time što molekul imunoglobulina je molekul humanog imunoglobulina.

14. Upotreba prema zahtevu 13, naznačena time što molekul imunoglobulina je teški lanac IgGl.

15. Upotreba prema zahtevu 14, naznačena time što IFN-P sadrži sekvencu čiji je ID broj 14.

16. Upotreba prema bilo kome od zahteva 1-15, naznačena time što IFN-P terapijsko sredstvo sadrži pegilirani IFN-P.

17. Upotreba prema bilo kome od zahteva 1-16, naznačena time što IFN-P terapijsko sredstvo sadrži sredstvo za stabilizaciju.

18. Upotreba prema zahtevu 17, naznačena time što sredstvo za stabilizaciju je aminokiselina kisele reakcije.

19. Upotreba prema zahtevu 18, naznačena time što sredstvo za stabilizaciju je arginin.

20. Upotreba prema bilo kome od zahteva 1-19, naznačena time što IFN-P terapijsko sredstvo ima pH vrednost između oko 4,0 i 7,2.

21. Upotreba prema bilo kome od zahteva 1-20, naznačena time što se IFN-p terapijsko sredstvo primenjuje intravenozno (i.v.).

22. Upotreba prema bilo kome od zahteva 1-20, naznačena time što se IFN-p terapijsko sredstvo primenjuje intramuskularno (i.m.).

23. Upotreba prema bilo kome od zahteva 1-20, naznačena time što se IFN-P terapijsko sredstvo primenjuje subkutano.

24. Upotreba prema bilo kome od zahteva 1-23, naznačena time što lečenje obuhvata primenu nekoliko doza IFN-P terapijskog sredstva na sisaru.

25. Upotreba prema zahtevu 24, naznačena time što se IFN-P terapijsko sredstvo primenjuje jednom nedeljno u dozi od oko 6 MIU.

26. Upotreba prema zahtevu 24, naznačena time što se IFN-P terapijsko sredstvo primenjuje tri puta nedeljno u dozi od oko 3 MIU.

27. Upotreba prema bilo kome od zahteva 1-26, naznačena time što lečenje smanjuje proteinuriju kod sisara.

28. Upotreba prema bilo kome od zahteva 1-27, naznačena time što lečenje smanjuje proliferaciju glomerularnih ćelija.

29. Upotreba prema bilo kome od zahteva 1-28, naznačena time što lečenje smanjuje glomerularnu inflamaciju.

30. Upotreba prema bilo kome od zahteva 1-29, naznačena time što je sisar čovek.

31. Upotreba prema zahtevu 30, naznačena time što sisar je onaj sisar kod koga je verovatno da će se razviti glomerulonefritis na šta ukazuju znaci inflamacije bar jednog glomerula.

32. Upotreba prema bilo kome od zahteva 1-31, naznačena time što sisar nije onaj sisar koji je nosilac virusa koji izaziva glomerulonefritis ili onaj sisar kod koga je glomerulonefritis izazavan virusom.

33. Upotreba prema zahtevu 32, naznačena time što sisar nije onaj sisar koji je nosilac virusa hepatitisa ili kod koga je glomerulonefritis izazvan virusom hepatitisa.

34. Upotreba prema zahtevu 33, naznačena time što sisar nije onaj sisar koji je nosilac virusa hepatitisa B ili C ili kod koga je glomerulonefritis izazvan virusom hepatitisa B ili C.

35. Upotreba prema bilo kome od zahteva 1-34, naznačena time što se sisar ne nalazi u terminalnom stadijumu bubrežne bolesti ili ne poseduje karcinom bubrežnih ćelija.

36. Upotreba IFN-(3 terapijskog sredstva u proizvodnji medikamenta za lečenje ili prevenciju hronične bubrežne insuficijencije kod sisara.

37. Upotreba prema zahtevu 36, naznačena time što IFN-p terapijsko sredstvo sadrži IFN-p u zrelom obliku.

38. Upotreba prema bilo kome od zahteva 36-37, naznačena time što IFN-p terapijsko sredstvo ne sadrži početni metionin.

39. Upotreba prema bilo kojem od zahteva 36-38, naznačena time što IFN-P je humani IFN-p.

40. Upotreba prema zahtevu 39, naznačena time što IFN-P je bar oko 95% identičan sa zrelim oblikom humanog IFN-P pune dužine koji sadrži sekvencu čiji je ID broj 4.

41. Upotreba prema zahtevu 40, naznačena time što IFN-P sadrži sekvencu čiji je ID broj 4.

42. Upotreba prema bilo kome od zahteva 36-41, naznačena time što IFN-P je glikoziliran.

43. Upotreba prema bilo kome od zahteva 36-41, naznačena time Što IFN-P nije glikoziliran.

44. Upotreba prema zahtevu 39, naznačena time što IFN-p je IFN-P-1 a.

45. Upotreba prema zahtevu 39, naznačena time što IFN-P je IFN-P-lb.

46. Upotreba prema bilo kome od zahteva 36-45, naznačena time što IFN-P terapijsko sredstvo sadrži IFN-P fuzionisan sa konstantnim domenom molekula imunoglobulina.

47. Upotreba prema zahtevu 46, naznačen time što molekul imunoglobulina je molekul humanog imunoglobulina.

48. Upotreba prema zahtevu 47, naznačena time što molekul imunoglobulina je teški lanac IgGl.

49. Upotreba prema zahtevu 48, naznačena time što IFN-P sadrži sekvencu čiji je ID broj 14.

50. Upotreba prema bilo kome od zahteva 36-49, naznačena time što IFN-P terapijsko sredstvo sadrži pegilirani IFN-p.

51. Upotreba prema bilo kome od zahteva 36-50, naznačena time što IFN-P terapijsko sredstvo sadrži sredstvo za stabilizaciju.

52. Upotreba prema zahtevu 51, naznačena time što sredstvo za stabilizaciju je aminokiselina kisele reakcije.

53. Upotreba prema zahtevu 52, naznačena time što sredstvo za stabilizaciju je arginin.

54. Upotreba prema bilo kome od zahteva 36-53, naznačena time što IFN-p terapijsko sredstvo ima pH vrednost između oko 4,0 i 7,2.

55. Upotreba prema bilo kome od zahteva 36-54, naznačena time što se IFN-p terapijsko sredstvo primenjuje intravenozno (i.v.).

56. Upotreba prema bilo kome od zahteva 36-54, naznačena time što se IFN-P terapijsko sredstvo primenjuje intramuskularno (i.m.).

57. Upotreba prema bilo kome od zahteva 36-54, naznačena time što se IFN-P terapijsko sredstvo primenjuje subkutano.

58. Upotreba prema bilo kome od zahteva 36-57, naznačena time što lečenje obuhvata primenu nekoliko doza IFN-p terapijskog sredstva na sisaru.

59. Upotreba prema zahtevu 58, naznačena time što se IFN-P terapijsko sredstvo primenjuje jednom nedeljno u dozi od oko 6 MIU.

60. Upotreba prema zahtevu 58, naznačena time što se IFN-P terapijsko sredstvo primenjuje tri puta nedeljno u dozi od oko 3 MIU.

61. Upotreba prema bilo kome od zahteva 36-60, naznačena time što lečenje smanjuje proteinuriju kod sisara.

62. Upotreba prema bilo kome od zahteva 36-61, naznačena time što lečenje smanjuje proliferaciju glomerularnih ćelija.

63. Upotreba prema bilo kome od zahteva 36-62, naznačena time što lečenje smanjuje glomerularnu inflamaciju.

64. Upotreba prema bilo kome od zahteva 36-63, naznačena time što je sisar čovek.

65. Upotreba prema zahtevu 64, naznačena time što sisar je onaj sisar kod koga je verovatno da će se razviti hronična bubrežna insuficijencija, na ukazuje smanjena bubrežna funkcija.

66. Upotreba prema bilo kome od zahteva 36-65, naznačena time što sisar nije onaj sisar koji je nosilac virusa koji izaziva hroničnu bubrežnu insuficijenciju ili onaj sisar kod koga je hronična bubrežna insuficijencija izazavana virusom.

67. Upotreba prema zahtevu 66, naznačena time što sisar nije onaj sisar koji je nosilac virusa hepatitisa ili kod koga je hronična bubrežna insuficijencija izazvana virusom hepatitisa.

68. Upotreba prema zahtevu 67, naznačena time što sisar nije onaj sisar koji je nosilac virusa hepatitisa B ili C ili kod koga je hronična bubrežna insuficijencija izazvana virusom hepatitisa B iliC.

69. Upotreba prema bilo kome od zahteva 36-68, naznačena time što se sisar ne nalazi u terminalnom stadijumu bubrežne bolesti ili ne poseduje karcinom bubrežnih ćelija.

70. Postupak za lečenje glomerulonefritisa kod sisara, naznačen time što obuhvata identifikaciju sisara koji pati od glomerulonefritisa i primenu na sisaru terapijski efikasne količine IFN-P terapijskog sredstva.

71. Postupak prema zahtevu 70, naznačen time što glomerulonefritis je izabran iz grupe koju čine fokalna glomeruloskleroza, kolabirajuće glomerulopatije, oboljenje sa minimalnim promenama, glomerulonefritis sa polumesecima, nefritski sindrom, nefrotski sindrom, primarni glomerulonefritis, sekundarni glomerulonefritis, proliferativni glomerulonefritis, membranozni glomerulonefritis, membranoproliferativni glomerulonefritis, glomerulonefritis sa imunim kompleksima, glomerulonefritis sa antitelima protiv glomerularne bazalne membrane, slaboimuni glomerulonefritis, dijabetična glomerulopatija, hronični glomerulonefritis i nas leđni nefritis.

72. Postupak prema zahtevu 70 ili 71, naznačen time što IFN-p terapijsko sredstvo sadrži IFN-p u zrelom obliku.

73. Postupak prema bilo kome od zahteva 70-72, naznačen time što IFN-p terapijsko sredstvo ne sadrži početni metionin.

74. Postupak prema bilo kojem od zahteva 70-73, naznačen time što IFN-P je humani IFN-p.

75. Postupak prema zahtevu 74, naznačen time što IFN-P je bar oko 95% identičan sa zrelim oblikom humanog IFN-P pune dužine koji sadrži sekvencu čiji je ID broj 4.

76. Postupak prema zahtevu 75, naznačen time što IFN-P sadrži sekvencu čiji je ID broj 4.

77. Postupak prema bilo kome od zahteva 70-76, naznačen time što IFN-P je glikoziliran.

78. Postupak prema bilo kome od zahteva 70-77, naznačen time što IFN-P nije glikoziliran.

79. Postupak prema zahtevu 74, naznačen time što IFN-P je IFN-P-1 a.

80. Postupak prema zahtevu 74, naznačen time što IFN-P je IFN-P-lb.

81. Postupak prema bilo kome od zahteva 70-80, naznačen time što IFN-P terapijsko sredstvo sadrži IFN-P fuzionisan sa konstantnim domenom molekula imunoglobulina.

82. Postupak prema zahtevu 81, naznačen time što molekul imunoglobulina je molekul humanog imunoglobulina.

83. Postupak prema zahtevu 82, naznačen time što molekul imunoglobulina je teški lanac IgGl.

84. Postupak prema zahtevu 83, naznačen time što IFN-p sadrži sekvencu čiji je ID broj 14.

85. Postupak prema bilo kome od zahteva 70-84, naznačen time što IFN-P terapijsko sredstvo sadrži pegilirani IFN-p.

86. Postupak prema bilo kome od zahteva 70-85, naznačen time što IFN-p terapijsko sredstvo sadrži sredstvo za stabilizaciju.

87. Postupak prema zahtevu 86, naznačen time što sredstvo za stabilizaciju je aminokiselina kisele reakcije.

88. Postupak prema zahtevu 87, naznačen time što sredstvo za stabilizaciju je arginin.

89. Postupak prema bilo kome od zahteva 70-88, naznačen time što IFN-P terapijsko sredstvo ima pH vrednost između oko 4,0 i 7,2.

90. Postupak prema bilo kome od zahteva 70-89, naznačen time što se IFN-P terapijsko sredstvo primenjuje intravenozno (i.v.).

91. Postupak prema bilo kome od zahteva 70-89, naznačen time što se IFN-P terapijsko sredstvo primenjuje intramuskularno (i.m.).

92. Postupak prema bilo kome od zahteva 70-89, naznačen time što se IFN-P terapijsko sredstvo primenjuje subkutano.

93. Postupak prema bilo kome od zahteva 70-92, naznačen time što lečenje obuhvata primenu nekoliko doza IFN-P terapijskog sredstva na sisaru.

94. Postupak prema zahtevu 93, naznačen time što se IFN-P terapijsko sredstvo primenjuje jednom nedeljno u dozi od oko 6 MIU.

95. Postupak prema zahtevu 93, naznačen time što se IFN-P terapijsko sredstvo primenjuje tri puta nedeljno u dozi od oko 3 MIU.

96. Postupak prema bilo kome od zahteva 70-95, naznačen time što lečenje smanjuje proteinuriju kod sisara.

97. Postupak prema bilo kome od zahteva 70-96, naznačen time što lečenje smanjuje proliferaciju glomerularnih ćelija.

98. Postupak prema bilo kome od zahteva 70-97, naznačen time što lečenje smanjuje glomerularnu inflamaciju.

99. Postupak prema bilo kome od zahteva 70-98, naznačen time što je sisar čovek.

100. Postupak prema zahtevu 99, naznačen time što sisar je onaj sisar kod koga ustanovljeno da ima glomerulonefritis na osnovu prisustva inflamacije bar jednog glomerula; hipertrofije glomerula; hipertrofije tubula; glomeruloskleroze; ili tubulointersticijalne skleroza.

101. Postupak prema bilo kome od zahteva 70-100, naznačen time što sisar nije onaj sisar koji je nosilac virusa koji izaziva glomerulonefritis ili onaj sisar kod koga je glomerulonefritis izazavan virusom.

102. Postupak prema zahtevu 101, naznačen time što sisar nije onaj sisar koji je nosilac virusa hepatitisa ili kod.koga je glomerulonefritis izazvan virusom hepatitisa.

103. Postupak prema zahtevu 102, naznačen time što sisar nije onaj sisar koji je nosilac virusa hepatitisa B ili C ili kod koga je glomerulonefritis izazvan virusom hepatitisa B ili C.

104. Postupak prema bilo kome od zahteva 70-103, naznačen time što se sisar ne nalazi u terminalnom stadijumu bubrežne bolesti ili ne poseduje karcinom bubrežnih ćelija.

105. Postupak za lečenje hronične bubrežne insuficijencije kod sisara, naznačen time što obuhvata identifikaciju sisara koji pati od hronične bubrežne insuficijencije i primenu na sisaru terapijski efikasne količine IFN-P terapijskog sredstva.

106. Postupak prema zahtevu 105, naznačen time što IFN-P terapijsko sredstvo sadrži IFN-P u zrelom obliku.

107. Postupak prema bilo kome od zahteva 105-106, naznačen time što IFN-P terapijsko sredstvo ne sadrži početni metionin.

108. Postupak prema bilo kojem od zahteva 105-107, naznačen time što IFN-P je humani IFN-p.

109. Postupak prema zahtevu 108, naznačen time što IFN-P je bar oko 95% identičan sa zrelim oblikom humanog IFN-P pune dužine koji sadrži sekvencu čiji je ID broj 4.

110. Postupak prema zahtevu 109, naznačen time što IFN-P sadrži sekvencu čiji je ID broj 4.

111. Postupak prema bilo kome od zahteva 105-110, naznačen time što IFN-P je glikoziliran.

112. Postupak prema bilo kome od zahteva 105-110, naznačen time što IFN-p nije glikoziliran.

113. Postupak prema zahtevu 108, naznačen time što IFN-P je IFN-p-1 a.

114. Postupak prema zahtevu 108, naznačen time što IFN-P je IFN-P-lb.

115. Postupak prema bilo kome od zahteva 105-114, naznačen time što IFN-P terapijsko sredstvo sadrži IFN-P fuzionisan sa konstantnim domenom molekula imunoglobulina.

116. Postupak prema zahtevu 115, naznačen time što molekul imunoglobulina je molekul humanog imunoglobulina.

117. Postupak prema zahtevu 116, naznačen time što molekul imunoglobulina je teški lanac IgGl.

118. Postupak prema zahtevu 117, naznačen time što IFN-P sadrži sekvencu čiji je ID broj 14.

119. Postupak prema bilo kome od zahteva 105-118, naznačen time što IFN-P terapijsko sredstvo sadrži pegilirani IFN-p.

120. Postupak prema bilo kome od zahteva 105-119, naznačen time što IFN-P terapijsko sredstvo sadrži sredstvo za stabilizaciju.

121. Postupak prema zahtevu 120, naznačen time što sredstvo za stabilizaciju je aminokiselina kisele reakcije.

122. Postupak prema zahtevu 121, naznačen time što sredstvo za stabilizaciju je arginin.

123. Upotreba prema bilo kome od zahteva 105-122, naznačena time što IFN-P terapijsko sredstvo ima pH vrednost između oko 4,0 i 7,2.

124. Postupak prema bilo kome od zahteva 105-123, naznačen time što se IFN-p terapijsko sredstvo primenjuje intravenozno (i.v.).

125. Postupak prema bilo kome od zahteva 105-123, naznačen time što se IFN-P terapijsko sredstvo primenjuje intramuskularno (i.m.).

126. Postupak prema bilo kome od zahteva 105-123, naznačen time što se IFN-P terapijsko sredstvo primenjuje subkutano.

127. Postupak prema bilo kome od zahteva 105-126, naznačen time što lečenje obuhvata primenu nekoliko doza IFN-P terapijskog sredstva na sisaru.

128. Postupak prema zahtevu 127, naznačen time što se IFN-P terapijsko sredstvo primenjuje jednom nedeljno u dozi od oko 6 MIU.

129. Postupak prema zahtevu 127, naznačen time što se IFN-P terapijsko sredstvo primenjuje tri puta nedeljno u dozi od oko 3 MIU.

130. Postupak prema bilo kome od zahteva 105-129, naznačen time što lečenje smanjuje proteinuriju kod sisara.

131. Postupak prema bilo kome od zahteva 105-130, naznačen time što lečenje smanjuje proliferaciju glomerularnih ćelija.

132. Postupak prema bilo kome od zahteva 105-131, naznačen time što lečenje smanjuje glomerularnu inflamaciju.

133. Postupak prema bilo kome od zahteva 105-132, naznačen time stoje sisar čovek.

134. Postupak prema zahtevu 133, naznačen time što sisar je onaj sisar kod koga je ustanovljena hronična bubrežna insuficijencija, na osnovu postojanja smanjene bubrežne funkcije.

135. Postupak prema bilo kome od zahteva 105-134, naznačen time što sisar nije onaj sisar koji je nosilac virusa koji izaziva hroničnu bubrežnu insuficijenciju ili onaj sisar kod koga je hronična bubrežna insuficijencija izazavana virusom.

136. Postupak prema zahtevu 135, naznačen time što sisar nije onaj sisar koji je nosilac virusa hepatitisa ili kod koga je hronična bubrežna insuficijencija izazvana virusom hepatitisa.

137. Postupak prema zahtevu 136, naznačena time što sisar nije onaj sisar koji je nosilac virusa hepatitisa B ili C ili kod koga je hronična bubrežna insuficijencija izazvana virusom hepatitisa B ili C.

138. Postupak prema bilo kome od zahteva 105-137, naznačena time što se sisar ne nalazi u terminalnom stadijumu bubrežne bolesti ili ne poseduje karcinom bubrežnih ćelija.