RS20050907A - Ćelije koje se koriste kao nosači za bakterije - Google Patents

Abstract

Ovaj pronalazak se odnosi na upotrebu korišćenje ćelija, u koje je ubačen (unet) mikroorganizam koji sadrži stranu DNK, posebno se odnosi na bakterijski mikroorganizam, u cilju proizvodnje farmaceutske kompozicije. Poželjno je da strana DNK kodira definisani aktivni agens, i farmaceutska kompozicija je tako koncipirana da se može koristiti u prevenciji ili terapiji onih bolesti koje mogu da se leče primenom pomenutog aktivnog agensa.

Description

ĆELIJE KOJE SE KORISTE KAO NOSAČI ZA BAKTERIJE

Oblast pronalaska

Pronalazak se odnosi na ćelije koje su inficirane bakterijama, kao i na njihovo korišćenje u postupku za dobijanje farmaceutske kompozicije, pogotovo u lečenju malignih tumora.

Istorija pronalaska i od ranije poznato u vezi sa pronalaskom

Novi pristupi u terapiji bolesti koje su ranije bile neizlečive ili neadekvatno lečene podrazumevaju puno različitih mogućnosti za primenu genske terapije i imunoterapije.

U genskoj terapiji je cilj da se nukleotidna sekvenca koja kodira željeni protein transportuje posredstvom pogodnog nosača do ciljnog tkiva i da tamo prodre u ćelije, te da se transdukuje u ćelije ciljnog tkiva i da one eksprimiraju željeni protein. Razvijeni su i testirani brojni i različiti tehnološki pristupi u genskoj terapiji. Medjutim, uopšteno gledano, rezultati kliničkih istraživanja koja imaju za cilj da testiraju različite pristupe u genskoj terapiji su izgleda razočaravajući, a pogotovo u lečenju neoplazija. Najviše zbog tehničkih problema. Dakle, prenosioci sekvenci nukleinskih kiselina nisu dovoljno specifični za ćelije ciljnog tkiva, mali je broj ćelija koje su transdukovane, a problem je i nizak nivo i kratko trajanje ekspresije željenog proteina da bi se postiglo terapijsko delovanje.

Jedan od uspostavljenih oblika imunoterapije, koji se naziva vakcinacija, je imunizacija sa antigenom. Posle imunizacije antigenom, organizam produkuje specifična antitela i/ili specifične citotoksične limfočite koji imaju preventivno ili

1

terapijsko delovanje, na primer protiv infektivnih agenasa. U zadnjih nekoliko decenija, isprobani su različiti pristupi u lečenju nedovoljno izlečivih ili neizlečivih bolesti vakcinisanjem. U prvom planu je terapija neoplazija tumorskim vakcinama. Cilj je da se pokrene (indukuje) imunski odgovor prema tumoru korišćenjem tumorske vakcine, koji dovodi do liziranja tumorskih ćelija i konačno do eliminacije tumorskog tkiva u potpunosti. Medjutim, do sada nije bilo značajnih pomaka u terapiji tumora tumorskim vakcinama. Umnogome, razlog tome je takozvana imunotolerancija koju domaćin ima prema sopstvenom tumoru. Te stoga, iako je moguće preko velikog broja imunoterapijskih pristupa relativno dobro indukovati tumor-specifičan T-ćelijski odgovor, ova reakcija često nije praćena tumoricidnim efektom (npr., Thurner et al.., J. Exp Med 190: 1669-1678 (1999)). Rezultati novijih istraživanja ukazuju na različite uzroke. Ovde se ubrajaju nedovoljno prodiranje specifičnih T-ćelija u tkivo tumora (Mukai et al., Cancer Research 59:5245-5249

(1999)) i/ili inaktivisanje T-ćelija unutar tumora, npr., preko TGF-p" ili preko ekspresije negativnih regulatornih markera kao što je B7-H1 u tkivu tumora ili stimulisanje regulatornih T-ćelija koje imaju imunosupresivno delovanje (Pregledni rad: Bach, Nature Reiews, 3:189-198 (2003)).

Nekoliko postupaka za tumorsku imunizaciju se sada koristi u različitim kliničkim fazama i često se zasnivaju na dendritičnim (denritskim) ćelijama (ukratko je izloženo kod Bacherau et al., Cell, 106:271-4 (2001)). Najčešći tip vakcinisanja dendritičnim ćelijama obuhvata aktivisanje ćelijaex vivo,ubacivanje antigena ("pulsiranje antigenom") (na primer prečišćenog proteina, ekstrakta tumorskih ćelija ili definisanih peptida) i zatim njihova primena. Druga mogućnost koja se takodje koristi, su postupci koji podrazumevaju fuzionisanje ćelija. U ovom slučaju, na primer, zračene tumorske ćelije se fuzionišu sa dendritičnim ćelijama odgovarajućim postupkom, kao što je delovanje električnog polja, a zatim sledi primena ovako dobijenih tumorskih vakcina (Kugler et al., Nat Med 6:322-6 (2000)).

Razvijen je novi postupak, uspelo se uz pomoć rekombinantnih atenuisanih bakterija kao što su, na primer, salmonellae i listeriae, koje se koriste za prenošenje odredjenih tumorskih antigena, da se prekine imunotolerancija pacijenta prema sopstvenom tumoru (DE 102 08 653; DE 102 06 325, koje još nisu objavljene). Mehanizmi koji omogućavaju da se prekine imunotolerancija nisu još uvek detaljno poznati. Medjutim, nakupljanje (akumulacija) bakterija kao što su, na primer, salmonellae i listeriae u tumorskom tkivu, do kojeg dolazi nakon ubrizgavanja, kao i zapaljenje koje se javlja usled nakupljanja tih bakterija izgleda da u ovom slučaju igra važnu ulogu. Dakle, poznato je da i.v. primena salmonellae može da bude praćena nakupljanjem ovih bakterija u tkivu tumora. Medjutim, istraživanja kinetike ovog procesa su pokazala da tek nešto malo bakterija može da se nadje u tkivu tumora u vremenu kratko nakon i.v. ubrizgavanja bakterija, i one su sposobne za fokalno umnožavanje preferencijalno u tumorskom tkivu. Što dalje znači, da ukoliko se relativno velike količine bakterija mogu opaziti u tumoru nakon i.v. ubrizgavanja, one potiču od relativno malog broja prekursora (Mei et al., Anticancer Res 22:3261-69 (2002)). Medjutim ovo nije povoljno za terapeutsku primenu, na primer u smislu genske terapije u kojoj se salmonellae koristi kao prenosilac gena, jer u ovom slučaju kolonizacija tumora nije ravnomerna (uniformna); čak naprotiv, dobij a se tek je nekoliko mesta sa velikim brojem bakterija.

Tumori sadrže pored pravih tumorskih ćelija i vezivnog tkiva i značajan broj leukocita, naročito limfočita (tumor infiltrišući limfočiti; TIL tumor-infiltrating lzmphocvtes) i makrofaga (makrofage koji su prisutni u tumoru; TAM tumor-associated macrophages). Pretpostavlja se da je lokalizacija leukocita u tumoru pod uticajem ekspresije produkata tumorskih ćelija, pogotovo pod uticajem citokina, endotelina, kao i hipoksije takodje (Sica et al., Int Immunopharmacol, 2: 1045-1054 (2002); Grimshaw et al., Eur J Immunol, 32:2393-2400 (2002)).

Funkcija leukocita lokalizovanih u tumoru je kontradiktorna. Za TAM je posebno pokazano da imaju antitumorsku aktivnost

(prezentacija antigena; citotoksičnost; Funada et al., Oncol Rep, 10:309-313 (2003); Nakavama et al.., Anticancer Res, 22:4291-4296; Kataki et al. , J Lab Clin Med, 140:320-328 (2002)) i da promovišu rast tumora (sekrecija faktora rasta; pospešuju angiogenezu i rast metastaza; Leek i Harris J., Mammarv gland Biol Neoplasia, 7:177-189 (2002); smanjena sekrecija citotoksičnih citokina kao što su IL-lalfa; IL-lbeta; IL-6; TNF alfa; Kataki et al., J Lab Clin Med, 140:320-328 (2002)) .

Već neko vreme čine se pokušaji da se utiče na rast tumora preko primene citotoksičnih limfocita, TIL, natural killer ćelija, makrofaga ili dendritičnih ćelija. Klinički nalazi su medjutim bili kontradiktorni (Faradji et al., Cancer Immunol Immunothrap, 33:319-326 (1991); Montovani et al., Immunologv Today, 13:265-270

(1992); Ravaud et al., British J of Canncer, 71:331-336 (1995); Semino et al., Minerva Biotec, 11:311-317 (1999)). Moguće je eksperimentalno pokazati da injekcija blago aktiviranih makrofaga, može da dovede do pospešivanja rasta tumora, ali injekcija snažno aktiviranih makrofaga može da dovede do inhibicije rasta tumora (Mantovani et al., Immunologv Today 13:265-270 (1992)). U svetlu ovih nalaza, primena aktiviranih makrofaga po svoj prilici favorizuje lokalizaciju tumora (Fidler, Adv Pharmacol, 30:271-326

(1974); Chokri et al., Int J Immunol 1:79-84, (1990)). Niti je injekcija leukocita koji su bili transdukovaniin vitrosa genskom sekvencom koja kodira jedan antitumorski protein do sada dovela do bilo kakavog pomaka u kliničkom lečenju tumora (Hege i Roberts, Current Opinion in Biotechnlogv, 7:629-634 (1996)). Medjutim, u ovim istraživanjima je pokazano da leukociti, ali i druge ćelije, a pogotovo tumorske ćelije, mogu da stignu do tkiva tumora posle i.v. ubrizgavanja (Shao J et al., Drug Deliv 2 (2001)), ali da se ubrizgane ćelije neuporedivo najviše naseljavaju u normalnim tkivima kao što su pluća, slezina i jetra (adams J, Clin PatholMol Path 49:256-267 (1996)).

Tehnički problem u pronalasku

Pronalazak se zasniva na tehničkom problemu produkovanja sredstava pomoću kojih je moguće poboljšati lokalizaciju mikroorganizama koji sadrže stranu DNK koja kodira aktivnu supstancu u odredjeno mesto gde su ciljne ćelije, pogotovo lokalizaciju u tumor.

Sagledavanja i principi pronalasaka, kao i njegova izvodjenja

Pronalazak se zasniva na predstavi da makrofagi ili dendritične ćelije koje su bile inficirane, tj., u koje su ubačene bakterijein vitro,njih prenose nakon intravenske primene u tkivo tumora, tako da je količina bakterija koje su lokalizovane u tumoru nakon i.v. ubrizgavanja makrofaga u koje su ubačene bakterijein vitrobila značajno veća u odnosu na posle i.v. ubrizgavanja odgovarajuće količine slobodnih bakterija, tako da su se čak i inficirane ćelije koje su u odnosu na tumor heterologne nakupljale u tumorima, kao i da se ovaj efekat održava čak i kada su inficirane ćelije bile prethodno inaktivisane zračenjem.

Ukoliko se, na primer, makrofagi koriste kao prenosioci za salmonellae, deset puta više salmonellae je detektovano u tumorskom tkivu, 18 sati nakon i.v. primene makrofaga u koje je ubačena salmonellae u odnosu na posle i.v. ubrizgavanja odgovarajuće količine slobodne salmonellae pokazano na dva modela transgenih tumora (model tumora pluća: Raf transgeni miševi,Kerkhoff et al., Cell Growth Differ, 11:185-90 (2000), model tumora dojke: Her-2 transgeni miševi, Bouchard et al., Cell, 57:931-6 (1989) ) .

Slični nalazi se dobijaju kada se koristi heterologna tumorska linija. Tumorska ćelijska linija 4T1 (ATCC No. CRL-2539) je izvedena iz tkiva tumora mlečne žlezde BALB/c miša i primenjena je, posle infekcije sa atenuisanom listeriae, u opisani model Raf tumora (C5BL/6 background). Što se tiče u ovom slučaju upotrebe inficiranih ćelija, zapaženo je da je umnogome povećan broj bakterija u tkivu tumora, koji se održavao čak i kada su ćelije bile prethodno zračene.

Dakle, moguće je u principu proširiti ova iznenadjujuća zapažanja na bilo koje ćelije, koje mogu da budu inficirane bakterijama ili za koje bakterije mogu čvrsto da se zalepe, te na taj način mogu da budu nosači-prenosioci za ove bakterije. Stoga, za gore pomenute modele tumora, nadjeno je da je lokalizacija salmoellae u tkivu tumora je bila mnogo veća posle i.v. ubrizgavanja tumorskih ćelija koje su inficirane sa salmonellae u poredjenju sa i.v. ubrizgavanjem odgovarajuće količine slobodne salmonellae.

Bakterije imaju jako adjuvantno delovanje pogotovo preko bakterijskih konstituenata kao što su lipopolisaharidi (LPS), konstituenti ćelijskog zida, bičevi (flagella), bakterijska DNK koja sadrži imunostimulatorne CpG motive, a svi oni interaguju sa različitim takozvanim Toli-like receptorima (TLR) na antigen prezentujućim ćelijama, pa su stoga sposobne da ih stimulišu. Zato je za očekivati da primena ćelija, koje su prethodno inficirane sa bakterijama, ne samo da će dovesti do poboljšanog nakupljanja bakterija u tumoru, nego da će ova infekcija takodje prouzrokovati zapaljenje i jačanje sistemskog i lokalnog imunskog odgovora. Ovaj postupak može dakle takodje da se primeni u cilju povećanja lokalnog imunskog odgovora, kao dela imunoterapije.

Pronalazak se dakle odnosi na ćelije sisara u koje su ubačene bakterije, kao i na upotrebu ovih ćelija u prevenciji ili lečenju bolesti.

Ćelije u kontekstu ovog pronalaska mogu na primer da budu autologni, alogeni ili ksenogeni makrofagi, limfočiti, dendritične ćelije ili tumorske ćelije. Kada se koriste tumorske ćelije poželjno je da se one tretiraju zračenjem ili citostaticima, tako da njihov kapacitet da se dele bude blokiran.

Poželjno je da se ove ćelije izoluju iz krvi ili iz tumora pomoću postupaka koji su poznati i uobičajeno se koriste u struci. Medjutim, takodje je moguće da se koriste autologne, alogene ili ksenogene ćelije koje su uspostavljene u kulturi, takozvane ćelijske linije koje su izvedene iz normalnih tkiva ili iz tumora. Ovakve ćelijske linije su raspoložive i dostupne u bilo kom broju ili bilo kog tipa, na primer iz ćelijskih biblioteka kao što je Američka biblioteka ćelija tkiva (American tissue cell librarv-ATTC). Dalje, takodje je moguće koristiti ćelije koje su bile modifikovane postupcima koji su poznati i uobičajeno se koriste u ovoj oblasti. Pod modifikacijama ovde se naročito podrazumevaju genske modifikacije, ali i dodatno ubacivanje novih molekula u ćelije, kao što su na primer, peptidi, proteini, farmakološki aktivne supstance ili virusne partikule.

Dodatno ubacivanje molekula ili čestice u kontekstu pronalaska se odnosi na apsorpciju bakterija na ćeliju, fagocitozu bakterija od strane ćelije i/ili infekciju ćelije.

U kontekstu pronalaska, bakterije su, na primer, Gram-negativne i Gram-pozitivne bakterije, poželjno je selektivno da to budu intracelularne bakterije, poželjno je da to budu salmonellae ili listeriae, poželjno je da bakterije imaju kapacitet da se dele, ali da nisu patogene za recipijenta ili da je virulentnost bakterija atenuisana ili da su bakterije ubijene. Bakterije čija je virulentnost atenuisana imaju svojstvo da u najmanje jednom hromozomu ovih bakterija postoji najmanje jedan gen za metabolički enzim koji je izbrisan (deletiran) ili imitiran tako da je metabolički enzim defektan. U ovim bakterijama je moguće da i) u hromozomu bude deletiran jedan gen za enzim koji katalizuje sintezu aromatičnih aminokiselina, na primer genaroA ,koji kodira prvi enzim u biosintezi aromatičnih aminokiselina, tako da ove bakterije mogu da rastu samo na podlogama koje sadrže aromatične aminokiseline, ii) proteini koji omogućavaju kretanje bakterije budu eksprimirani neoštećeni, na primer da bude očuvana funkcija genaiapiactA, i da iii) gen trpS koji kodira triptofanil-tRNK sintetazu bude deletiran u hromozomu, pri čemu su u ove bakterije ubačeni plazmidi, iv) čija je replikacija stabilisana odgovaarajučim oridžinom replikacije, na primer pomoću ori pAMpi (Simon i Chopin, 1988), v) koji ulazi u sastav gena za trpS koji kodira triptofanil-tRNK sintetazu, vi) koji ulazi u sastav gena za endolizin, na primer gen za liziranje kod faga A118{ ply118; Loessner et al., 1995) pod kontrolom promotora koji može da se aktivira u citosolu ćelija sisara, na primer promotoractA [ PactA,Dietrich et al., 1988), i vii) koji ulazi u sastav najmanje jedne nukleotidne sekvence koja kodira najmanje jednu aktivnu supstancu pod kontrolom promotora koji može da se aktivira u bakterijama ili u ćelijama sisara, pod uslovom da je moguće aktivirati promotor nespecifično u odnosu na tip ćelije, specifično u odnosu na tip ćelije, specifično u odnosu na ćelijski ciklus, specifično u odnosu na funkciju ćelije ili u zavisnosti od prisutnih metabolita, medikamenata ili od koncentracije kiseonika.

Bakterije ovog tipa, usled gubitka najmanje jednog gena za

esencijalni metabolički protein, pokazuju drastično smanjenje virulentnosti, na primer mereno na osnovu njihovog potencijala da se dele in vivo, ali i pored toga pokazuju značajno povećanu baktofekciju, liziranje bakterija u citosolu, oslobadjanje plazmida koji su prisutni u bakterijama, kao i stabilnu ekspresiju aktivne supstance koju kodira plazmid.Ovakav bakterijski mikroorganizam u veoma uopštenom smislu reči sadrži stranu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira aktivnu supstancu i koja je, ne uvek, pod kontrolom regulatorne nukleotidne sekvence, gde je u hromozomalnoj DNK mikroorganizma prirodna sekvenca nukleinske kiseline bakterije koja kodira ekspresiju bakterijskog enzima ili deletirana ili mutirana sa proviso tako da je proizvod translacije koji potiče od toga zapisa nefunkcionalan, i gde mikroorganizam ne sadrži stranu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira enzim.

Medju porimere za intracelularne bakterije ubrajaju se : Mvcobacterium tuberculosis, M. bovis, M. bovis soj BCG, BCG podsojevi, M. avium, M. cellailare, M. africanum, M. kansasii,M. marinum, M. ulcerans, M. avium podvrsta paratuberculosis, Nocardia asteroides, Nocardia podvrste, Legionella pneumophila, Legionella podvrste, Salmonella typhi, S. typhimurium, Salmonella podvrste, Shigella podvrste, Yersinia pestis, Pasteurella haemolytica, Pasteurella multocida, Pasteurella podvrste, Actinobacillus pleuropneumoniae, Listeria monocytogenes, L. ivanovii, Brucella abortus, Brucella podvrste, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatis, Chlamydia psittaci i Coxiella brunetii.

Medju primere za atenuisanje salmonellae ubrajaju se : inaktivišuće mutacije u genu pab, genu pur, genu aro, asd, genu dap, u nadA, pncB, galE, pmi, fur, rpsL, ompR, htrA, hemA, cdt, cya, crp, dam, phoP, phoQ, rfc, poxA, galU, metL, metH, mviA, sodC, recA, ssrA, ssrB, sirA, sirB, sirC, inv, hilA, hilC, hilD, rpoE, flgM, tonB ili slyA, i njihove kombinacije. Inaktivišuće mutacije gena koje su nabrojane kao primeri za atnusanje salmonellae su poznati stručnjaku iz ove oblasti.

Pronalazak se dalje odnosi na ćelije koje su nosači za bakterije, pri čemu su u ove bakterije prethodno uvedene nukleotidne sekvence koje kodiraju proteine, koji su, preferabilno, aktivne supstance koje se koriste u prevenciji i lečenju bolesti.

Medju ove proteine se ubrajaju, na primer: antigeni koji su izvedeni od infektivnih agenasa kao što su virusi, bakterije, mikoplazme, paraziti, antigeni specifični za tumore, pogotovo proteini koje kodiraju onkogeni, zatim antitela, epitop vezujući fragmenti antitela i fuzionisani proteini koji se sastoje od najmanje jednog epitop vezujućeg fragmenta antitela prema antigenu na tumorskoj ćeliji, na limfočitu kao što je na primer, T-limfocit, ili na endotelnoj ćeliji kao što je na primer, tumorska endotelna ćelija, pa zatim enzimi, pogotovo enzimi koji aktivišu neaktivne prekursore medikamenata, kao što su na primer, p-glukuronidaza, fosfataza, hidrolaza, lipaza, imunosupresivni citokini kao što je na primer, IL-10, imunostimulišući citokini kao što su na primer, IL-1, IL-2, IL-3 ili IL-6, hemokini, interferoni, faktori rasta, kao što su na primer, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, FGF; VEGF ili EGF, ili inhibišući proteini za citokine, hemokine, interferone ili faktore rasta".

Ekspresiju ovih gena u bakterijama regulišu odgovarajući promotori, što pruža mogućnost da promotori potiču iz bakterijskog genoma ili iz virusnog denoma ili iz eukariotskog genoma, te ih je tako moguće nespecifično, specifično za ćeliju ili specifično u odnosu na funkciju aktivirati.

Dalje, u poželjnom izvodjenju ovog pronalaska, nukleotidne sekvence koje omogućavaju transmembransku ekspresiju ili sekreciju genom kodiranog proteina u bakterijskoj ćeliji, su vezane za gen. Primeri za te takozvane signalne sekvence su opisani u sledećim referencama EP 1042495, EP1015023 i Hess et al., PNAS USA93:1458-1463 (1996).

Pronalazak se dalje odnosi na korišćenje ćelije koja je opisana u pronalasku u prevenciji i lečenju bolesti. Ćelije kako je navedeno u pronalasku poželjno je da se koriste za lečenje malignih bolesti ili bolesti imunskog sistema. U ovu svrhu, gen koji je ubačen u baktreije kodira protein koji i) ima citolitičko delovanje na tumor, ii) ima proinflamatorno delovanje, iii) inhibiše ćelije imunskog sistema koje su negativni regulatori, što je slučaj na primer, sa inhibisanjem CTLA-4, B7-H1 ili CD25 ili TGF-J3, iv) ima imunosupresivne efekte ili v)može da konvertuje neaktivne prekursore supstanci koje imaju citotoksično, imonomodulatorno ili imunosupresivno delovanje, u aktivni oblik supstance.

U cilju prevencije ili lečenja bolesti, optimalno je da se daje od 100 do IO<9>ćelija, koje najbolje je da nose oko 0,1 (srednja vrednost) do 100 bakterija po ćeliji. Ove ćelije se nanose lokalno na kožu, u cirkulaciju, u telesne šupljine, u tkivo, u organ ili se daju oralno, rektalno ili bronhijalno, makar jedanput.

Ćelije koje su opisane u pronalasku, koriste se u lečenju bolesti, kao što su na prrier, neoplazije, autoimunske bolesti, hronična zapaljenja i bolesti u vezi sa transplantiranim organima.

Pronalazak je detaljnije objašnjen u tekstu ispod, kroz izvodjenja pronalaska u vidu primera.

Primeri koji treba da ilistruju pronalazak

Primer 1: Salmonella Typhimurium 7207 koju nose inficirani autologni makrofagi kostne srži

1.1 Izolovanje makrofaga kostne srži (M$).

Za izolovanje makrofaga kostne srži korišćeni su BxB23 miševi, starosti 2-3 meseca, MMTV/neu transgeni miševi starosti 2 meseca. Makrofagi su izolovani prema sledećem protokolu: i) izvaditi femur iz miša ii) izvaditi meka tkiva iz kostiju i prebaciti u Petrijevu šolju i bilateralno otvoriti rasecanjem iii) isprati kostnu srž prošpricavanjem sa 2ml DMEM 10 (DMEM Gibco sa 10% FCS Gibo, 2 mM L-glutamin Gibco, 50 uM ]3-merkaptoetanol) uz pomoć igle u Bluecup sa DMEM 10 iv) centrifugirati 5 minuta na 1200 rpm, aspirirati i prebaciti u 5ml medijuma za diferentovanje. Napraviti ćelijsku suspenziju da bude 1 x IO<5>ćelija/ml u medijumu za diferentovanje (DMEM 10 + lOng/ml GM-CSF (rekombinantni mišji granulocitno-monocitni faktor rasta kolonija; RD Svstems, Wiesbaden Cat. No.: 415-ML) i podeliti na delove od po 5ml u Nunc posude za kultivisanje (NUNCLON™, 58mm, NUNC No.: 16955), v) inkubirati na 37° C i 10% C02 tokom 8 dana, vi)

1.2 Infekcija makrofaga sa Salmonella typhimurium 7207 (SL7207)

in vitro.Adherentni makrofagi, ćelijska frakcija koja je zalepljena za NUNC posudu za kultivisanje, su isprani u DMEM a zatim su adherentne ćellije prikupljene uz pomoć cell scraper-a (štapića za grebanje), izbrojane i

prebačene u medij um za diferentovanje. Infekcija sa SL7207 (Hoiseth S.K. et al., Nature 291:238-239 (1981)) je uradjena prema sledećem protokolu: i) 37° C, lh u inkubatoru: MOI (multiplicitv of infection) višestrukost infekcije 1:20, ii) IO<6>makrofaga je zasejano u 2ml medijuma u NUNC posude za kultivisanje i inkubirano sa 2 x 10<7>bakterija (MOI = 20) lh na 37° C, iii) zatim su ćelije isprane, iv) inkubirane sa gentamicinom ( u finalnoj koncentraciji lOOug/ml (Sigma)) lh, na 37° C, v) zatim su isprane i odredjen je broj ćelija, ćelije su zatim razlivene u moždano-srčani infuzioni agar (Gibco) (BHI ploče-brain and heart infusion plates) za brojanje jedinica rasta kolonija bakterija (CFU; colony-forming units).

1.3 Rezultati unošenja u makrofage.

Sa MOI vrednošću od 20 i vremenom unošenja od jednog sata moguće je stalno detektovati oko IO<4>salmonellae u IO<5>makrofaga. Gustina unošenja bakterija je ostala približno konstantna tokom 12 sati nakon unošenja i ne pokazuje baš nikakvu proliferaciju.

1.4 Primena makrofaga koji su inficiraniin vitrosa SL7207 kod BxB23 i MMTV/neu miševa sa tumorom

5 x IO<5>makrofaga iz kostne srži koji su inficirani in vitro i

resuspendovani u lOOul PBS-a, je i.v. ubrizgano, po mišu u repnu venu BxB23 i MMTV/neu miša sa tumorom (eksperimentalne životinje kod kojih je zapaženo da imaju tumor u odmakloj fazi, starosti oko 12 meseci, masa pluća zbog postojanja tumora pluća kod BxB23 miša bila je dostigla 0,75-l,25g). U zavisnosti od dizajna

eksperimenta, ubrizgano je 3-5 x 10<4>S. tvphimurium 7207 (odredjeno preko broja CFU) po mišu. U kontrolnoj grupi, S. typhimurium72 07 (2,5 x IO<5>bakterija je resuspendovano u lOOul PBS-a po mišu) je i.v. ubrizgana u BxB23 i MMTV/neu miša sa tumorom. Posle 18 sati životinje su žrtvovane i odredjen je broj CFU (na BHI pločama) u plućima (BxB23) i u tumoru (MMTV). Napredovanje infekcije je praćeno u kontrolnoj grupi posle i.v. ubrizgavanja S. typhimurium aroA 7207. Razvoj infekcije je

praćen preko broja bakterija odredjivanjem CFU u različitim vremenima po istom protokolu.

1.5 : Nakupljanje S. typhimurium 7207 u tumorima nakon i.v.

ubrizgavanja. Količina salmonellae koja je pronadjena u tumorom zahvaćenim plućima kod BxB23 miševa i u tumorima dojke kod MMTV/neu miševa nakon davanja makrofaga koji su inficirani salmonelom je bila preko 10 puta veća nego kod

životinja u kontrolnoj grupi, koje su bile tretirane sa slobodnim oblikom salmonellae, 18 sati posle infekcije. Nakon ubrizgavanja makrofaga u koje su ubačene bakterije, nakupljanje bakterija čak i nakon 18 sati posle ubrizgavanja je bilo toliko veliko (za faktor 10 veće u odnosu na ubrizgavanje samih-ogoljenih bakterija, vidi sliku 1 i odgovarajuću tabelu) koliko je moglo srazmerno da se postigne u kontrolnoj grupi (tj., posle ubrizgavanja samih bakterija) tek nakon nekoliko dana (5. dan nakon infekcije). To znači da je bilo moguće uz pomoć ćelija u koje su bile ubačene bakterije, dakle ćelija koje su opisane u pronalasku, da dodje do nakupljanja značajno većeg broja bakterija za značajno kraće vreme u tumoru, nego što je bilo moguće nakon ubrizgavanja čiste suspenzije bakterija. Odredjivanjem broja CFU u plućima i organima 1., 7., 14. dana nakon ubrizgavanja ćelija iz pronalaska, pokazalo se da je broj CFU ostao konstantno visok ili povećan u plućima BxB23 miša sa tumorom, dok se broj CFU u plućima C57BL/6 kontrolnih miševa, i u slezini BXB23 miševa i C57BL/6 miševa značajno smanjio ispod vrednosti u odgovarajućim plućima ili čak nije bio detektabilan (vidi sliku 2 i sliku 3, prateće tabele; slika 2 prikazuje uporedjivanje broja CFU u plućima BxB23 miša koji ima tumor (pluća) sa plućima C57BL/6 kontrolnih životinja, na slici 3 poredjenje broja CFU u tumorima dojke sa brojem u slezini MMTV/neu miševa nakon i.v. ubrizgavanja 5 x IO<5>S. tzphimurium).

Primer 2: Inficirane heterologne ćelije su izvor L. monocvtogenes.

4T1 ćelije (ATCC CRL-2539) tumorske linije koje potiču iz tumora mlečne žlezde BALB/c miševa, su inficirane sa atenuisanim sojem L. monocvtogenes i sa MOI vrednošću 10 u periodu od 1 sata. Ćelije su zatim isprane i slobodne bakterije su ubijene jednočasovnom inkubacijom sa gentamicinom. Odredjivanjem broja CFU izračunato da je ubacivanje bakterija u ćelije 0,15 bakterija po ćeliji. Ćelijska suspenzija je napravljena da broj ćelija bude 5 x IO<6>ćelija po ml u PBS-u. Povrh toga, neke od inficiranih ćelija su inaktivisane zračenjem. 0,lml ove suspenzije (tj . , 5 x IO<5>inficiranih ćelija (kad se meri na osnovu CFU listeriae: 7,3 x10<4>),3,5xIO<5>inficiranih i zračenih ćelija ili (brojanih po CFU) 3,5x 10<5>slobodne listeriae, svaka u lOOul PBS-a) po mišu su ubrizgane u BxB23 miševe koji imaju tumor (starost > 10 meseci) ili u C57BL/6 miševe iste starosti.

Sa dozom zračenja koja je korišćena primećena je redukcija, detektovana preko odredjivanja CFU, za slobodne bakterije maksimalno 25%,odakle se može izračunati infektivna doza od oko 3,8 x 10<4>bakterija u slučaju zračenih ćelija. 17 časova posle infekcije, odredjene su bakterijske CFU u plućima i jetri metodom serijskog razblaženja u BHI pločama (Gibco) granica detekcije je 10 bakterija po organu).

Sudeći na osnovu detektabilnih CFU u slezini, kod svih životinja je infekcija bila uspešna. Broj CFU posle ubrizgavanja živih ili zračenih ćelija opisanih u pronalasku, je bio značajno veći u plućima BxB23 miševa sa tumorom i C57BL/6 kontrolnih miševa u odnosu na posle ubrizgavanja bakterijske suspenzije, i broj bakterija posle ubrizgavanja ćelija opisanih u pronalasku je bio značajno povećan u plućima BxB23 miševa sa tumorom u odnosu na broj bakterija u plućima C57BL/6 kontrolnih miševa (faktor 10). Znatno više bakterijskih CFU je bilo detektabilno u slezini svih grupa u poredjenju sa plućima, ali nije bilo moguće detektovati jasnu razliku u broju bakterijskih CFU posle ubrizgavanja ćelija opisanih u pronalasku ili bakterijske suspenzije, kako kod BxB23 miševa sa tumorom, tako i kod C57BL/6 kontrolnih miševa (vidi sliku 4 i odgovarajuću tabelu).

Kao što je već pokazano u gore pomenutim kontrolnim grupama u eksperimentima sa makrofagama u koje su ubačene S. typhimurium 7207 atenuisane virulentnosti, kao i u slučaju L. monocvtogenes atenuisane virulentnosti, utvrdjeno je da postoji smanjenje u broju bakterijskih CFU u slezini kao i u drugim, organima koji nisu zahvaćeni tumorom, u okviru perioda od 5 dana, maksimalno 14 dana nakon ubrizgavaja, kako ćelija iz pronalaska tako i čiste bakterijske suspenzije, kako kod BxB23 miševa sa tumorom tako i kod C57BL/6 kontrolnih miševa do nivoa koji su značajno ispod nivoa CFU u plućima kod BxB23 miševa sa tumorom (pluća).

Nasuprot svemu ovome, prvobitno povećan broj bakterijskih CFU u plućima BxB23 miševa sa tumorom (pluća) traje posle ubrizgavanja ćelija opisanih u pronalasku bar tokom čitavog perioda, ili se čak u početku povećava, tek toliko da bi ponovo pao posle produžene plato faze.

Tabela 1: Broj bakterija u plućima ili u tumorima inficiranih miševa 18 sati nakon i.v. ubrizgavanja inficiranih makrofaga ili slobodne salmonellae. Tabela 2: Poredjenje broja CFU u plućima BxB23 miševa sa tumorom (pluća) sa plućima C57BL/6 kontrolnih životinja

Tabela 3: Poredjenje broja CFU u tumorima dojke i u slezini MMTV/neu miševa posle i.v. ubrizgavanja 5 x IO<5>S. typhimurium aroA

Tabela 4: Broj bakterija kod inficiranih miševa 17 sati nakon infekcije sa inficiranim 4T1 ćelijama tumora dojke sa (zračene ćelije) ili bez (inficirane ćelije) zračenja dozom od 25 gray ili slobodnom listeriae.

Tabela 5: Broj bakterija u slezini inficiranih miševa 17 časova nakon infekcije sa inficiranim 4T1 ćelijama tumora dojke sa (zračene ćelije) ili bez (inf. ćelije) zračenja dozom od 25 gray ili slobodnom listeriae.

Claims (1)

1. Ćelija sisara koja je prenosilac bakterija i koja se koristi u cilju prevencije i lečenja bolesti, pri čemu je ćelija autologna, alogena ili ksenogena i odabrana je iz grupe koja se saastoji od "makrofaga, dendritičnih (dendritskih) ćelija, granulocita, limfocita, tumorskih ćelja i ćelija tkiva.". Ćelija, kako je naznačeno u patentnom zahtevu 1, koja je inaktivirana zračenjem ili drugim postupkom. Ćelija, kako je naznačeno u patentnom zahtevu 1 ili 2, gde su bakterije žive, nevirulentne, sa atenuisanom virulencijom ili mrtve. Ćelija prema ma kom od patentnih zahteva 1 do 3, naznačena time što su bakterije odabrane iz grupe "Mvcobacterium tuberculosis, M. bovis, M. bovis soj BCG, BCG podsojevi, M. avium, M. cellailare, M. africanum, M. kansasii, M. marinum, M. ulcerans, M. avium podvrsta paratuberculosis, Nocardia asteroides, Nocardia podvrste, Legionella pneumophila, Legionella podvrste, Salmonella typhi, S. tvphimurium, Salmonella podvrste, Shigella podvrste, Yersinia pestis, Pasteurella haemolytica, Pasteurella multocida, Pasteurella podvrste, Actinobacillus pleuropneumoniae, Listeria monocytogenes, L. ivanovii, Brucella abortus, Brucella podvrste, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatis, Chlamydia psittaci i Coxiella brunetii". Ćelija prema ma kom od patentnih zahteva 1 do 4, naznačena time što bakterije nose rrekombinantnu DNK, DNK koja kodira bar jednu aktivnu supstancu. Ćelija prema ma kom od patentnih zahteva 1 do 5, naznačena time što bar jednu aktivnu supstancu produkuju same bakterije, uz pomoć odgovarajućih promotora, ili njenu ekspresiju reguliše eukariotski promotor. Ćelija prema ma kom od patentnih zahteva 1 do 6, naznačena time što produkuje proizvode koji su intracelularni, vezani za membranu ili su sekretorni. Ćelija prema ma kom od patentnih zahteva 1 do 7, naznačena time što je aktivna supstanca odabrana iz grupe koja sadrži "antigene infektivnih agenasa kao što su virusi, bakterije, mikoplazme, paraziti, antigene koji su specifični za tumore, a pogotovo proteine koje kodiraju onkogeni, antitela, epitop vezujuće fragmente antitela i fuzioniisane proteine koji se sastoje od najmanje jednog epitop vezujućeg framenta antitela, prema, na primer, atigenu tumorske ćelije, limfocita, kao što je na primer T-limfocit ili endotelne ćelije, kao što je na primer tumorska endotelna ćelija, enzime, a pogotovo enzime koji aktiviraju neaktivne prekursore medikamenta, kao što je na primer, beta-glukuronidaza, fosfataza, hidrolaza, lipaza, imunosupresivne citokine, kao što je IL-10, imunostimulirajuće citokine, kao što su na primer, IL-1, IL-2, IL-3 ili IL-6, hemokini, interferoni, faktori rasta, kao što su naprimer, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, FGF; VEGF ili EGF, ili inhibišuće proteine za citokine, hemokine, interferone ili faktore rasta". Upotreba ćelija koje su naznačene u patentnim zahtevima 1 do 8 u cilju prevencije i lečenja bolesti, naznačena time što aktivna supstanca blokira negativne regulatorne elemente u tumorskom tkivu. Upotreba ćelije prema ma kom od patentnih zahteva 1 do 8 u prevenciji ili terapiji bolesti, naznačena time što bakteruje služe kao proinflamatorni stimulatori u tkivu tumora. Upotreba ćelije prema ma kom od patentnih zahteva 1 do 8 u prevenciji ili terapiji bolesti, naznačena time što se dendritične ćelije ili makrofagi koriste istovremeno i kao nosači-prenosioci za antigen vakcine. Upotreba ćelije prema ma kom od patentnih zahteva 1 do 8 u prevenciji ili terapiji bolesti, naznačena time što je aktivna supstanca i/ili antigen vakcine ubačen u dendritične ćelije ili u makrofageex vivo.Upotreba prema patentnom zahtevu 12, naznačena time što antigene vakcine čine tačno odredjeni peptidi. Upotreba prema patentnom zahtevu 10, naznačena time što je ćelija fuzionisana sa drugom ćelijom koja eksprimira tkivni antigen ili tumorski antigen. Upotreba prema patentnom zahtevu 14, nazanačena time što su fuzionisane ćelije autologne tumorske ćelije. Upotreba ćelija prema ma kom patentnom zahtevu 1 do 8, u prevenciji ili terapiji bolesti. Upotreba ćelije naročito prema patentnom zahtevu 1 do 8, u koju je ubačen mikroorganizam koji sadrži stranu DNK, pogotovo bakterijski mikroorganizam, u cilju produkcije farmaceutske kompozicije. Upotreba prema patentnom zahtevu 17, naznačena time što strana DNK kodira odredjenu aktivnu supstancu, kao i time što je farmaceutska kompozicija namenjena za prevenciju ili lečenje obolelih od bolesti koja može da se predupredi i/ili leči primenom te aktivne supstance.