RS20060141A - Peptidi i jedinjenja koja se vežu za receptor - Google Patents

Peptidi i jedinjenja koja se vežu za receptor

Info

Publication number
RS20060141A
RS20060141A YUP-2006/0141A YUP20060141A RS20060141A RS 20060141 A RS20060141 A RS 20060141A YU P20060141 A YUP20060141 A YU P20060141A RS 20060141 A RS20060141 A RS 20060141A
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
peptide compound
peptide
cells
mepeg
glycol
Prior art date
Application number
YUP-2006/0141A
Other languages
English (en)
Inventor
Brian R. Macdonald
Jeffery Kenneth Weis
Edward John Yurkow
Original Assignee
Ortho-Mcneil Pharmaceutical Inc.,
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=34272720&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS20060141(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Ortho-Mcneil Pharmaceutical Inc., filed Critical Ortho-Mcneil Pharmaceutical Inc.,
Publication of RS20060141A publication Critical patent/RS20060141A/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/524—Thrombopoietin, i.e. C-MPL ligand
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/03—Peptides having up to 20 amino acids in an undefined or only partially defined sequence; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Polyethers (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

Peptidi i jedinjenja koja se vežu za receptor opisana su peptidna jedinjenja koja se vežu i aktiviraju receptor trombopoietina (c-mpl ili TPO-R) ili drugačije deluju kao TPO agonist.

Description

PEPTIDIIJEDINJENJA KOJASEVEŽUZARECEPTOR
Ova prijava traži prioritet US Američke serijske prijave br. 60/498,740 od 28 Avgusta 2003.
Prikazani pronalazak obezbeđuje peptidno jedinjenje koje se veže za i aktivira receptor trombopoietina (c-mpl ili TPO-R) ili deluje drugačije kao TPO agonist. Pronalazak je iz oblasti biohemije i medicinske hernije i naročito bezbeđuje TPO agoniste za upotrebu u lečenju humanih bolesti.
Megakariociti su ćelije koje potiču iz koštane srži, koje su odgovorne za proizvodnju krvnih pločica koje cirkulišu. Mada čine <0.25% ćelija koštane srži u većini vrsta, imaju >10 puta zapreminu od tipičnih ćelija koštane srži. Videti Kuter, et al., Proc. Natl. Acd. Sci. USA 91: 1114-11108 (1994). Megakariocite podležu postupku poznatom kao endomitoza u kome se replicira njihov nukleus, ali ne dolazi do podele ćelije i na taj način se dobijaju poliploidne ćelije. Kao odgovor na smanjeni broj krvnih pločica, povećava se brzina edomitoze, nastaju megakariocite veće ploidnosti i broj megakariocita može porasti do 3 puta. Videti Harker, J. Clin. Invest., 47:458-465 (1968). Nasuprot tome, kao odgovor na povećan broj krvnih pločica, brzina endomitoze opada, nastaju megakariociti manje ploidnosti i broj megakariocita može pasti 50%.
Nije poznat tačni fiziološki mehanizam povratene sprege kojim masa krvnih pločica koje cirkulišu reguliše brzinu endomitoze i broj megakariocita. Sada se misli daje trombopoietin (TPO), trombopoietski faktor koji cirkuliše koji je uključen u posredovanje u povratnoj petlji. Specifičnije, TPO je pokazano da je glavni krvni regulator u situacijama koje uključuju trombocitopeniju. Videti, npr., Metcalf, Nature, 369:519-520 (1994). Pokazano je u nekoliko studija da TPO povećava broj krvnih pločica, povećava veličinu krvnih pločica i povećava inkorporaciju izotopa u krvne pločice životinje primaoca. Specifično, TPO se smatra da utiče na megakariocitopoiezu na nekoliko načina: (1) dovodi do porasta u velični i broju megakariocita; (2) izaziva porast u sadržaju DNK u obliku poliploidije kod megakariocita; (3) povećava endomitozu megakariocita; (4) izaziva povećano sazrevanje megakariocita; i (5) izaziva porast u procentima ćelija prekusora, u obliku malih acetilholinesterazno-pozitivnih ćelija u koštanoj srži.
Krvne pločice (trombociti) su neophodni za zgrušavanje krvi. Kada je njihov broj veoma nizak pacijent su veoma ozbiljnoj opasnosti od smrti usred katastrofalnog krvarenja. Prema tome TPO ima potencijalno korisnu primenu i u dijagnozi i u lečenju različitih hematoloških poremećaja, na primer, primarno bolesti koja je u vezi sa nedostatkom krvnih pločica. Tekuća klinička ispitivanja sa TPO su ukazala da TPO može biti davan sa sigurnošću pacijentu. Pored toga, skora ispitivanja su obezbedila osnovu za projekciju efikasnosti TPO terapije u lečenju trombocitopenije a naročito trombocitopenije kao rezultata hemoterapije, terapije zračenja ili transplantacije koštane srži kao lečenja kancera ili lmfoma. Videti npr. McDonald, Am. J. Ped. Hematology/Oncology, 14:8-21 (1992).
Gen koji kodira TPO je kloniran i karakterisan. Videti Kuter, et al., Proc. Natl. Acd. Sci. USA, 91:11104-1108 (1994); Barlev, et al., Cell 77:1117-1124 (1994); Kaushanskv et al., Nature 369:568-571 (1994); Wendling, et al., Nature, 369:571-574 (1994); i Sauvage et al., Nature 369:533-538
(1994). Trombopoietin je glikoprotein sa bar dva oblika, sa molekulski masama od 25 kDa i 31 kDa sa uobičajenim N-terminalnim amino-kiselinskim sekvencama. Videti, Bartlev et al., Cell, 77:1117-1124 (1994). Thrombopoietin ima dva različita regiona odvojena sa potencijalnim Arg-Arg mestom cepanja. Amino terminalni region kod čoveka i miša je visoko konzerviran i delom je homologan sa eritropoietinom i interferonom-a i interferonom-b. Karboksi terminalni region pokazuje divergenciju kod različitih vrsta.
Opisane su DNK sekvence i kodirane peptidne sekvence za humani TPO-R (takođe poznat kao c-mpl). Videti Vigon, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5640-5644 (1992). TPO-R je član familije receptora hematopoietinskog faktora rasta, familija je karakterisana uobičajenim strukturnim dizajnom ekstracelularnog domena, uključujući četiri konzervirana C ostatka u N terminalnom delu i WSXWS motiv (SEQ NO:l) blizak transmembranskom regionu. Videti Bazan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6934-6938 (1990). Dokaz da ovaj receptor igra funkcionalnu ulogu u hematopoiezi uključuje zapažanje da je kod miša njegova ekspresija ograničena na slezinu, koštanu srž ili fetalnu jetru (videti Souvri, et al., Cell 63:1137-1147 (1990)) i megakariocite, krvne pločice i CD34+ ćelije kod ljudi (videti Methia et al., Blood 82:1395-1401 (1993)). Pored toga, izlaganje CD34+ ćelija sintetskim oligonukleotidima koji su 'antisense' prema mpl RNK značajno inhibira pojavu megakariocinih kolonija bez uticaja na obrazovanje eritroidne ili mieloidne kolonije. Neki radnici su postulirali da funkcije receptora kao homodimera, su slične situaciji sa receptorima za G-CSF i eritropoietin.
Dostupnost kloniranih gena za TPO-R olakšava potragu za agonistima ovih važnih receptora. Dostupnost rekombinantnih proteina receptora omogućava ispitivanja interakcije receptor-ligand u različitim nasumičnim i poli nasumičnim peptidnim raznovrsnim generacijskim sistemima. Sistemi su opisani u US patentu br. 6,251,864, 6,083,913, 6,121,238, 5,932,546, 5,869,451, 6,506,362 i 6,465,430 i u Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6378-63-82 (1990) od kojih je svaki ovde navedeni uključen kao referenca.
Lagana regeneracija nivoa krvnih pločica kod pacijenata koji pate od trombocitopenije je ozbiljan problem i podržava hitnost pretraživanja za agoniste faktore rasta krvi sposobne da ubrzaciju regeneraciju krvnih pločica. Prikazani pronalazak obezbeđuje takve agoniste.
Prikazani pronalazak se odnosi na definisana peptidna jedinjenja niske molekulske mase koja imaju jake osobine vezivanja za TPO-R, mogu aktivirati TPO-R i potencijalno dozvoliti smanjene sporedne efekte u poređenju sa poznatim TPO agonistima. Prema tome, peptidna jedinjenja mogu biti korisna za terapeutske svrhe u lečenju stanja u kojima posreduje TPO (npr. trombocitopenija koja je rezultat hemoterapije, radiacione terapije ili trasfuzije koštane srži) kao i za dijagnostičke svrhe u izučavanju mehanizama hematopoieze i za in vitro ekspanziju megakariocita i izvršnih progenitorskih ćelija.
Peptidna jedinjenja pogodna za terapeutske i/ili dijagnostičke svrhe ima IC50od oko 2 mM ili manje, kao što je određeno na primer testom afinitetog vezivanja iznetim u Primerima 3 US patenta br. 5,869,451 gde niži IC50 je u korelaciji sa većim afinitetom vezivanja za TPO-R. Test u US patentu br.
5,869,451 je kao što sledi: Afiniteti peptidnih jedinjenja su mereni u kompetitivnom testu vezivanja. Bunarčići mikrotitarskih ploča su obloženi sa 1 mg septavidina, blokirani sa PBS/1% BSA, a zatim sa 50 ng biotinilovanog anti-receptornog imobiliziranog antitela (Abl79). Bunarčići su zatim tretirani sa razblaženjem 1:10 rastvorog sakupljenog TPO-R. Različite koncentracije peptidnog jedinjenja su pomešane sa konstantnim količinama skraćenog oblika TPO koji sadrži ostatke 1-156 spojene sa C-krajem maltoznog vezujućeg proteina (MBP-TPO]56). Peptidna smeša MBP-TPO156 je dodata u bunarčiće obložene sa TPO-R, inkubirane u toku 2 sata na 4°C i zatim isprane sa PBS. Količina MBP-TP0156koja je vezana u ravnotežnom stanju je merena dodavanjem zečijeg anti-seruma usmerenog protiv MBP, a zatim sa alkalnom fosfatazom konjugovanom sa kozijim anti-zečijim IgG. Zatim je određena količina alkalne fosfataze u svakom bunarčiću korišćenjem standardnih postupaka. Test je izveden u opsegu koncentracija peptidnih jedinjenja i rezultati su grafički prikazani tako da y osa predstavlja količinu vezivanja MBP-TPOi56i x osa predstavlja koncentraciju peptidnog jedinjenja. Može se odrediti koncentracija na kojoj će peptidno jedinjenje smanjiti 50% (IC50) vezanu količinu MBP-TPOi56za imobilizirani TPO-R. Disocijaciona konstanta (Kd) za peptid bi bila slična merenju IC50korišćenjem ovih uslova testiranja. Za farmaceutske svrhe, peptidna jedinjenja poželjno imaju IC50koji nije veći od 100 yM, poželjnije, ne više od 500 nM. U poželjnim izvođenjima, molekulska težina peptidnog jedinjenja je od oko 250 do oko 8,000 daltona. Ukoliko peptidna jedinjenja prema ovom pronalasku su oligomerizovana, dimerizovana i/ili derivatizovana sa hidrofilnim polimerima kao što je ovde opisano, molekulske težine takvih peptidnih jedinjenja će biti suštinski veće i mogu biti u opsegu od oko 500 do oko 120,000 daltona, poželjnije od oko 8,000 do 80,000 daltona.
Kada se koriste za dijagnostičke svrhe, peptidna jedinjenja prema prikazanom pronalasku poželjno su obeležena sa detektabilnom oznakom i prema tome, peptidna jedinjenja bez takve oznake služe kao intermedijeri u pripremanju obeleženih peptidnih jeidnjenja.
Peptidna jedinjenja koja ispunjavaju definisani kriteriju za molekulsku težinu i afinitet vezivanja za TPO-R sadrže 9 ili više aminokiselina, gde su aminokiseline one koje se javljaju u prirodi ili sintetičke aminokiseline (koje se ne javljaju u prirodi).
Prema tome, poželjna peptidna jedinjenja sadrže jedinjenje koje ima:
(1) molekulsku masu koja je manja od oko 500 daltona i
(2) afinitet vezivanja za TPO-R koji je izražen kao IC5okoji nije veći od oko 100 uM.
gde od nula do svih ~C(0)NH— veza peptidnih jedinjenja su zamenjene sa vezom izabranom iz grupe koju čine -CH2OC(0)NR~ veza; fosfonatna veza ~CH2S(0)2NR- veza: ~CH2NR~ veza; -C(0)NR6~ veza i -NHC(0)NH~ veza gde R je vodonik ili niži alkil i R6 je niži alkil,
dalje, gde je N-kraj pomenutog peptida izabran iz grupe koja se sastoji od - NRR<1>grupe; -NRC(0)R grupe; ~NRC(0)OR grupe; ~NRS(0)2R grupe; ~ NHC(0)NHR grupe; sukcinimidne grupe; benziloksikarbonil-NH-- grupe; i benzilkarbonil-NH-- grupe koja ima od 1 do 3 supstituenta na fenil prstenu izabrana iz grupe koju sadrži niži alkil, niži alkoksi, hloro i bromo, gde R i R1 su nezavisno izabrani iz grupe koju sadrže vodonik i niži alkil,
i još dalje gde C-kraj pomenutog peptidnog jedinjenja ima formulu —C(0)R gde R<2>je izabran iz grupe koju čine hidroksi, niži alkoksi i NR<3>R<4>gde R<3>i R<4>su nezavisno izabrani iz grupe koju čine vodonik i niži alkil i gde atom azota -NR<3>R<4>grupe mogu opciono biti amino grupa N-terminala petida tako da obrazuje ciklični peptid,
i njihova fiziološki prihvatljiva so.
U sličnim izvođenjima, pronalazak se odnosi na obeležena peptidna jedinjenja koja sadrže gore opisana peptidna jedinjenja koja imaju kovalentno vezanu oznaku sposobnu za detekciju.
U jednom izvođenju, jezgro peptidnog jedinjenja sadrži amino kiselinsku sekvencu (SEQ ID NO:2):X9Xg GX]X2X3X4X5XgX7gde X9 je A, C, E, G, I, L, M, P, R, Q, S, T ili V; i X8 je A, C, D, E, K, L, Q, R, S, T ili V; i X6 je P-(2-naftil)alanin (na koji se ovde poziva kao na '2-Nal') ostatak. Poželjnije X9 je A ili I; i X8je D, E ili K. Dalje X, je C, L, M, P, Q, V; X2 je F, K, L, N, Q, R, S, T ili V; X3 je C, F, I, L, M, R, S, V ili W; X4 je bilo koji od 20 genetički kodiranih L-aminokiselina; X5je A, D, E, G, K, M, Q, R, S, T, V ili Y; i X7 je C, G, I, K, L, M, N, R ili V.
Naročito poželjna peptidna jedinjenja uključuju aminokiselinsku sekvencu I EGPTLRQ (2-Nal) L A A R (Sar) (SEQ ID NO: 7), gde (2-Nal) je p-(2-naftil)alanin i (Sar) je sarkozin.
U drugom izvođenju, peptidna jedinjenja prikazanog pronalaska su poželjno dimerizovana ili oligomerizovana da bi se povećao afinitet i/ili aktivnost jedinjenja. Primer poželjnog dimernog peptidnog jedinejnja uključuju, ali bez ograničenja, sledeće: gde Xioje sarkozin ili ostatak P-alanina (SEQ ID NO:7). Gornja struktura može takođe biti predstavljena sledećom strukturom: (H-IEGPTLRQ(2-Nal)LAARX10)2K-NH2. Kada je Xiosarkozin, jedinjenje ima sledeću strukturu:
gde (2-Nal) je p-(2-naftil)alanin i (Sar) je sarkozin (SEQ ID NO: 7). Ovo peptidno jedinjenje, koje takođe može biti predstavljeno sa sledećom strukturom (H-IEGPTLQ(2-Nal)LAAR(Sar))2K-NH2na koji se ovde poziva kao na 'TPO jedinjenje br. 1'
U još jednom izvođenju, poželjna peptidna jedinjenja za upotrebu u ovom pronalasku uključuju peptidna jedinjenja koja su kovalentno vezana za jedan ili više različitih hidrofilnih polimera. Pogodni hidrofilni polimeri uključuju, ali bez ograničenja, polialkiletre na primer polietil glikol i polipropilen glikol, polimlečna kiselina, poliglikolna kiselina, polioksialken, polivinilalkohol, polivinilpirolidon, celuloza i celulozni derivati, dekstran i derivati dekstrana itd. kao što je opisano u US patentu br. 5,869,451 čiji čitav sadržaj je ovde uključen kao referenca.
Ovde opisana peptidna jedinjenja su korisna u sprečavanju i lečenju bolesti koje su posredovane sa TPO i naročito lečenja hematoloških bolesti, uključujući ali bez ograničenja, trombocitopeniju kao rezultat hemoterapije, terapije zaračenja ili transfuzije koštane srži. Prema tome, prikazani pronalazak takođe obezbeđuje postupak lečenja u kome pacijent ima poremećaj koji je podložan lečenju primanjem TPO agonista ili davanjem teraputski efikasne doze ili kolčine peptidnih jedinjenja prema prikazanom pronalasku.
Pronalazak takođe obezbeđuje farmaceutsku kompoziciji koja sadrži jedno ili više ovde opisanih peptidnih jedinjenja i fiziološki prihvatljivih nosača. Ove farmaceutski prihvatljive kompozicije mogu biti u različitim oblicima uključujući oralne dozne oblike, kao i inhalacione praškove i rastvore i injektibilne i infuzibilne rastvore.
KRATAK OPIS SLIKA NACRTA
Slika 1 pokazuje i upoređuje aktivnost TPO jedinjenja br. 1 sa peptidnim jedinjenjem stanja tehnike (na koje se ovde poziva kao na 'peptidna jedinjenja prethodnog stanja tehnike'). Razlika između TPO jedinjenja br. 1 i jedinjenja prethodnog stanja tehnike je da jedinjenje iz prethodnog stanja tehnike ima P-(l-naftil)alanin (1-Nal) gde je (2-Nal) u TPO jedinjenju br.l.
Slika 2 prikazuje aktivnost PEGilovanog TPO jedinjenja br.l u odnosu na PEGilovano peptidno jedinjenje prethodnog iz prethodnog stanja tehnike.
Slika 3 pokazuje i upoređuje in vivo promenu u broju krvnih pločica kod pacova i pokazuje relativnu aktivnost PEGilovanog TPO jedinjenja br.l prema PEGilovanom peptidnom jedinjenju iz prethodnog stanja tehnike.
Slika 4 i 5 pokazuju i porede broj i zapreminu krvnih pločica koje cirkulišu na dozno zavisan način, respektivno posle upotrebe PEGilovanog peptidnog jedinejnja prethodnog stanja tehnike i upotrebe PEGilovanih TPO jedinjenja br.l.
Sledeće definicije su iznete da ilustruju i definišu značenje i obim ovde različitih korišćenih izraza da bi se opisao pronalazak.
'Agonist' se ovde odnosi na biološki aktivan ligand koji se vezuje na njegov komplemetntarni biološki aktivni receptor i kasnije aktivira ili izaziva biološki odgovor kod receptora ili povećava prethodno postojeću aktivnost receptora.
'Peptidno jedinjenje' odnosi se na molekul koji hidrolizom daje aminokiseline i/ili aminokiselinske derivate i/ili zamene aminokiselina.
'Farmaceutski prihvatljive soli' odnose se na netoksični alkalni metal, zemnoalkalni metal i amonijum soli koje se uobičajeno koriste u farmaceutskoj industriji uključujući natrijum, kalijum, litijum, kalcijum, magnezijum, barijum, amonijum i protaminsku cinkovu so, koje su pripremljene postupcima dobro poznatim u stanju tehnike. Izraz takođe uključuje netoksične kiselinske adicione soli, koje su generalno pripremljene reagovanjem jedinjenja ovog pronalaska sa pogodnim organskim ili neorganskim kiselinama. Reprezentativne soli uključuju hidrohloride, hidrobromide, sulfate, bisulfate, acetate, oksalate, valerate, oleate, laurate, borate, benzoate, laktate, fosfonate, tozilate, citrate, maleate, tumarate, sukcinate, tartarate, napsilate i slično.
'Farmaceutski prihvatljiva kisela adiciona so' odnosi se na one soli koji zadržavaju svoju biološku efiksanost i osobine slobodnih baza i koje nisu biološki ili drugačije nepoželjne, obrazovane sa neorganskim kiselinama tako da hidrohloridna kiselina, hidrobromidna kiselina, sumporna kiselina, azotna kiselina, fosforna kiselina i slično i organskim kiselinama kao što je sirćetna kiselina, propionska kiselina, glikolna kiselina, pirogrožđana kiselina, oksalna kiselina, maleinska kiselina, malonska kiselina, ćilibarna kiselina, maleinska kiselina, fumarna kiselina, vinska kiselina, limunska kiselina, benzoeva kiselina, cinaminska kiselina, bademova kiselina, metansulfonska kiselina, etansulfonska kiselina, p-toluensulfonska kiselina, salicilna kiselina i slično. Za opis farmaceutski prihvatljivdih kiselih adicionih soli kao prolekovi, videti Bundgaad, H. supra.
'Farmaceutski prihvatljiv estar' odnosi se na one estre koji zadržavaju, posle hidrolize estarske veze, biološku efiksanost i osobine karboksilnih kiselina ili alkohola i nisu biološki ili na neki drugi način nepoželjne. Za opisivanje
farmaceutski prihvatljivih estara kao prolekova, videti Bundgaad, H. ed. Design of Prodrugs, Elsevier Science Publishers, Amsterdam (1985). Ovi estri su tipično obrazovani od odgovarajućih karboksilnih kiselina i alkohola. Generalno, obrazovanje estara može biti postignuto preko konvencionalnih sintetičkih tehnika (Videti, npr. March, Advanced Organic Chemistrv, 4th Ed., John Wiley & Sons, New York (1992)393-396 i tamo citirane reference i Mark et al. Encvclopedia of Chemical Tehnologv, John Wiley & Sons, New York (1980)). Alkoholna komponenta estara će generalno sadržati (i) C2-Ci2alifatični alkohol koji može ili ne mora sadržati jednu ili više dvostrukih veza i može ili ne mora sadržati razgranate ugljenike ili (ii) C7-Ci2aromatične ili heteroaromatične alkohole. Ovaj pronalazak se takođe odnosi na upotrebu onih kompozicija koje su i ovde opisani estri i u isto vreme su njihove farmaceutski prihvatljive kiselinske adicione soli.
'Farmaceutski prihvatljivi amidi' se odnose na one amide koji zadržavaju, posle hidrolize amidne veze, bilošku efiksanost i osobine karbocikličnih kiselina ili amina i nisu biološki ili na neki drugi način neprihvatljivi. Za opisivanje farmaceutski prihvatljivih amida kao prolekova, videti Bundgaard, H. ed. Design of Prodrugs, Elsevier Science Publishers, Amsterdam (1985). Ovi amidi su tipično obrazovani od odgovarajućih karboksilnih kiselina i amina. Generalno, obrazovanje amida može se postići pomoću konvencionalnih sintetskih tehnika (videti, npr. March, Advanced Organic Chemistry, 4th Ed., John Wiley & Sons, New York (1992), p.393 i Market al. Encyclopedia of Chemical Technology, John Wiley & Sons, New York (1980)). Ovaj pronalazak se takođe odnosi na upotrebu onih kompozicija koje su i ovde opisani amidi i u isto vreme njihove farmaceutski prihvaltjive kisele adicione soli.
'Farmaceutski ili terapeutski prihvatljivi nosači' odnose se na nosače medijuma koji utiču na efiksanost biološke aktivnosti aktivnih sastojaka i koji su netoksični za domaćina ili pacijenta.
'Stereoizomeri' se odnose na hemijska jedinjenja koja imaju istu molekulsku težinu, hemijsku kompoziciju i konstituciju kao druga, ali sa različito grupisanim atomima. To jest, izvesne identične hemijske grupe imaju različitu orijentaciju u prostoru i prema tome, kada su čisti imaju sposobnost rotiranja ravni polarizovane svetlosti. Međutim, neki čisti stereoizomeri mogu imati optičku rotaciju koja je tako mala da ju je nemoguće detektovati sa ovim eksperimentom. Jedinjenja prema prikazanom pronalasku mogu
imati jedan ili više asimetričnih ugljenikovih atoma i prema tome uključivati različite stereoizomere. Svi stereoizomeri su uključeni u obim prikazanog pronalaska.
'Terapeutski- ili farmaceutski-prihvatljive količine' kada se odnose na kompozicije ovog pronalaska su količine kompozicije dovoljne da izazovu željeni biološki rezultat. Rezultati mogu biti ublažavanje znakova, simptoma ili uzroka bolesti, ili bilo koja poželjna alternacija biološkog sistema. U prikazanom pronalasku, rezultat će tipično uključivati pad imunološkog i/ili inflamatornog odgovora na infekciju ili povredu tkiva.
Ostatci aminokiselina u peptidima imaju sledeće skraćenice: Fenilalanin je Phe ili F; Leucin je Leu ili L; Izoleucin je Ile ili I; Metionin je Met ili M; Valin je Val ili V; Serin je Ser ili S; Prolin je Pro ili P; Treonin je Thr ili T; Alanin je Ala ili A; Tirozin je Tyr ili Y; Histidin je His ili H; Glutamin je Gln ili Q; Aspragin je Asn ili N; Lizin je Lys ili K; Asparaginska kiselina je Asp ili D; Glutaminska kiselina je Glu ili E; Cistein je Cys ili C; Triptofan je Trp ili W; Arginin je Arg ili R; i Glicin je Gly ili G. Dodatno, t-Buo je terc-butoksi, Bzl je benzil, CELA je cikloheksilamin, Ac je acetil, Me je metil, Penje penicilamin, Aib je aminoizobuterna kiselina, Nvaje norvalin, Abuje aminobuterna kiselina, Thi je tienilalanin, OBn je O-benzil i hyp je hidroksiprolin.
Peptidni analozi su uobičajeno korišćeni u farmaceutskoj industriji kao ne-peptidni lekovi sa osobinama analognim onima šablonskih peptida. Ovi tipovi nepeptidnih jedinjenja su 'peptidni mimetici' ili 'peptidni podraživači' ili 'peptidomimetici' (Luthman et al. A Textbook of Dru Design and Development 14:386-406, 2nd Ed, Hanvood Academic Publishers (1996); Joachim Grante, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 33:1699-1720 (1994); Fauchere, j. Adv. Drug Res., 15.29 (1986); Veber and Freidinger TINS, p. 392 (1985); i Evans et al., J. Med. Chem. 30:1229 (1987), koji su uključeni ovde kao reference). Peptidni mimetici koji su strukturno slični terapeutski korisnim peptidima mogu biti korišćeni da izazovu ekvivalentani ili poboljšani terapeutski ili profilaktički efekat. Generalno, peptidomimetici su strukturno slični paradigmi polipeptida (tj. polipeptid koji imaju biološku ili farmakološku aktivnost), kao to su polipeptidi koji se javljaju u prirodi i koji imaju sposobnost vezivanja za receptor, ali imaju jednu ili više peptidnih veza opciono zamenjenih sa alternativnom vezom kao što je —CH2NH—, — CH2S—, itd. postupkom poznatim u stanju tehnike i dalje opisanom u sledećim referencama: Spatola, A.F. Chemistry and BioChemistry of Amino Acids, Peptides and Proteines, B. Weinstein, eds., Marcel Dekker, New York, p.267 (1983); Spatola, A.F., Vega Data (March 1983), Vol. 1, Issue 3, Peptide Backbone Modifications (generalni pregled); Morlev, Trends Pharm. Sci, pp 463-468 (1982) (opšti pregled). Hudson et al. Int. J. Pept. Prot. Res., 14:177-185 (1979); Spatola et al., Life Sci. 38:1243-1249 (1986; Hann, J. Chem. Soc. Perkin Trans. I, 307-314 (1982); Almquist, et al. J. Med. Chem., 23:1392-1398, (1980); Jennings-White et al., Tetrahedron Lett. 23:2533
(1982); Szelke, et al., European Appln. EP 45665 (1982); Holladay, et al., Tetrahedron Lett, 24:4401-4404 (1983); i Hruby, Life Sci., 31:189-199
(1982); od kojih je svaki ovde uključen kao referenca. Naročito poželjna ne peptidna veza je -CH2NH~. Takvi peptidni mimetici mogu imati značajne prednosti u odnosu na polipeptidna izvođenja, uključujući na primer: ekonomičniju proizvodnju, veću hemijsku stabilnost, povećane faramkološke osobine (polu-život, absorpciju, jačinu, efikasnost itd), promenjivu specifičnost (npr. širi spektar biološke aktivnosti), smanjenu antigenost i drugo. Obeležavanje peptidomimetika uglavnom uključuje kovalentno vezivanje jednog ili više obeleživača, direktno ili preko spejsera (npr. amidne grupe), za deo koji ne smeta na peptidomimetiku koji su predviđeni podacima kvatitativno strukturne aktivnosti i/ili molekulskog modelovanja. Takvi položaji koji ne ometaju generalno su položaju koji ne obrazuju direktni kontakt sa makromolekulima (npr. superfamilija molekula imunoglobulina) za koje peptidomimetici se vežu da izazovu terapeutski efekat. Derivatizacija (npr. obeležavanje) peptidomimetika ne bi trebalo da suštinski ima uticaj na željenu biološku ili farmakološku aktivnost peptidomimetika. Generalno, pepetidomimetici peptida koji se vezuju za receptor vežu se za receptor sa visokim afinitetom i poseduju detektabilnu biološku aktivnost (tj. agonističku ili antagonističku aktivnost fenotipskih promena jednog ili više receptora u kojima posreduju).
Sistemska supstitucija jedne ili više aminokiselina konsezusne sekvence sa D-amino kiselinom istog tipa (npr. D-lizin umesto L-lizina) može biti korišćen da stvori stabilnije peptide. Pored toga, ograničeni peptidi koji sadrže konsezusnu sekvencu ili suštinski identičanu varijaciju konsezusne sekvence mogu biti dobijeni postupcima poznatim u stanju tehnike (Rizo, et al., Ann. Rev. Biochem, 61:387 (1992), uključeni ovde kao referenca); na primer, dodavanjem unutrašnjih cisteinskih ostataka sposobnih da obrazuju intramolekularne disulfidne mostove koji ciklizuju peptid.
'Detektabilna oznaka' odnosi se na materijale' koji kada se kovalentno vežu za peptidno jedinjenje prema pronalasku, dozvoljavaju detekciju peptidnog
jedinjenja in vivo u pacijentu kome je dato peptidno jedinjenje. Pogodne detektabilne oznake su dobro poznate u tehnici i uključuju kao primere radioizotope, fluorescentne obeleživače (npr. fluorescin) i slično. Korišćenje određenih detektabilnih obeleživača nije kritično i izabrano je u odnosu na količinu obeleživača koja se koristi, kao i na toksičnost obeleživača u količini u kojoj se obeleživač koristi. Odabir obeleživača u odnosu na takve faktore je u okviru umešnosti ljudi iz struke.
Ko valentno vezivanje detektabilnih obeleživača za peptidna jedinjenja je postignuto kovalentnim postupkom dobro poznatim u stanju tehnike. Na primer, kada<125I>radioizotop je korišćen kao detektabilni obeleživač, kovalentno vezivanje<125>I za peptidno jedinjenje može se postići ugradnjom aminokiseline tirozina u peptidno jedinjenja i zatim jodovanjem peptidnog jedinjenja (videti, npr. Weaner et al., Svnthesis and Application of isotopicallv Lablled Compounds, pp 137-140 (1994)). Ugradnja tirozina na N ili C kraju peptidnog jedinjenja je dobro poznata u herniji. Na isti način,<32>P može biti ugrađen u peptidno jedinjenje kao fosfatna grupa, na primer, preko hidroksilne grupe na peptidnom jedinjenju korišćenjem konvencionalne hernije.
II. Pregled
Prikazani pronalazak obezbeđuje peptidna jedinjenja koja se vezuju za i aktiviraju TPO-R ili se na drugi način ponašaju kao TPO agonisti. Ova peptidna jedinjenja uključuju 'vodeća' peptidna jedinjenja i 'derivate' peptidnih jedinjenja koji su konstruisani tako da imaju istu ili različitu molekulsku strukturu ili oblik kao vodeća peptidna jedinjenja, ali koja se razlikuju od vodećih peptidnih jedinjenja ili u odnosu na osetljivost hidrolizi ili proteolizi i/ili u odnosu na druge biološke osobine, kao što su povećani afinitet za receptore. Prikazani pronalazak takođe obezbeđuje kompozicije koje sadrže efiksanu količinu peptidnog jedinjenja i određenije peptidno jedinjenja, koje je korisno za lečenje hematoloških poremećaja i naročito, trombocitopenije u vezi sa hemoterapijom, radiacionom terapijom ili transfuzijom koštane srži.
Nađeno je da jezgro peptidnih jedinjenja može sadržati aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO:2): X9X8G X, X2X3X4X5X6X7gde X6može biti p-(2-naftil)alanin i gde X9je A, C, E, G, I, L, M, P, R, Q, S, T ili V; i X8 je A, C, D, E, K, L, Q, R, S, T ili V. Poželjnije X9 je A ili I; i X8 je D, E ili K. Dalje Xjje C, L, M, P, Q, V; X2je F, K, L, N, Q, R, S, T ili V; X3je C, F, I, L, M, R, S, V ili W; X4je bilo koja od 20 genetski kodiranih L-aminokisleina; X5 je A, D, E, G, K, M, Q, R, S, T, V ili Y; i X7 je C, G, I, K, L, M, N, R ili V.
Međutim, kao što je dalje opisano, nađeno je da zamenom X6sa P-(2-naftil)alanin, jedinjenje obezbeđuje različite osobine u odnosu na jedinjenje koje sadrži P-(l-naftil)alanin. Prema tome, naročito poželjni peptidi uključuju aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO:7): I E G P T L R Q (2-Nal) L A A R (Sar).
U drugom izvođenju, peptidna jedinjenja prema prikazanom pronalasku su poželjno dimerizovana ili oligomerizovana da bi se povećao afinitet i/ili aktivnost jedinjenja. Primer poželjnih dimerizovnih peptidnih jedinjenja uključuje, ali bez ograničenja kao što sledi:
gde Xioje sarkozin ili P-alaninski ostatak (SEQ ID NO:7). Treba primetiti da jedan od Xioostatka može biti sarkozin i drugi ostatci mogu biti P-alanin. Gornja struktura može takođe biti predstavljena kao što sledi: (H-IEGPTLRQ(2-Nal )LAARX10)2K-NH2.
Poželjno peptidno jedinjenja je kao što sledi:
gde (2-Nal) je p-(2-naftil)alanin i (Sar) je sarkozin (SEQ ID NO: 7). Na ovo peptidno jedinjenje je se ovde poziva kao na 'TPO jedinjenje br.l')
Peptidnim jedinjenjima koja imaju IC50koji je veći od 100 mM nedostaje dovoljno vezivanje da bi se omogućila upotreba ili u dijagnostičkom ili u terapeutskom aspektu prema ovom pronalasku. Poželjno, za dijagnostičke svrhe, peptidna jedinjenja imaju IC5ood oko 2 mM ili manje i za farmaceutske svrhe, peptidna jedinjenja imaju IC50od oko 100 uM ili manje.
Slika 1 upoređuje aktivnost tri različite partije TPO jedinjenja br.l sa jednom partijom peptidnog jedinjenja iz stanja tehnike korišćenjem standardnih tehnika testa relativnih jedinica luminiscencije. Test koristi mišije ćelije konstruisane da stabilno eksprimuju humani TPO receptor i luciferazni reporter konstrukt vođen sa fos promoterom. Razlika između TPO jedinjenja br. 1 i peptidnog jedinjenja iz stanja tehnike je da pedtidno jedinjenje iz prethodnog stanja tehnike ima P-(l-naftil)alanin (1-Nal) gde TPO jedinjenje br. 1 ima (2-Nal). Na slici 1 na TPO jedinjenje br.l se poziva kao na 2-Nal, a na peptidno jedinjenje iz prethodnog stanja tehnike se poziva kao na 1-Nal (stanje tehnike). Kao što je pokazano na si. 1, slična je aktivnost za svako jedinjenje.
Slika 2 upoređuje nekoliko različitih partija PEGilovanih TPO jedinjenja br. 1 (pegilacija jedinjenja prema prikazanom pronalasku je opisana u više detalja dole) prema nekoliko partija PEGilovanih peptidnih jedinjenja iz stanja tehnike. Obe partije PEGilovanih peptidnih jedinjenja iz stanja tehnike pokazuju visoku aktivnost sa suštinski istim nivoom aktivnosti kao ne-PEGilovanog peptidnog jedinjenja prethodnog stanja tehnike. Preostale linije prikazuju aktivnost različitih partija PEGilovanog TPO jedinjenja br. 1. Kao što je prikazano na slici 2, u ovom modelu, poslednji imaju manju reaktivnost u odnosu na PEGilovana peptidna jedinjenja prethodonog stanja tehnike. PEGilovano TPO jedinjenje br. 1 na koje se poziva kao na PEG-2-Nal i PEGilovano peptidno jedinjenje prethodnog stanja tehnike na koje se poziva kao na PEG-1-Nal (stanje tehnike) na slici 2.
Slika 3 pokazuje relativnu jačinu PEGilovanog peptidnog jedinjenja prethodnog stanja tehnike i PEGilovanog TPO jedinjenja br. 1. Pomoću modela sa pacovom, sl.3 pokazuje in vivo promene u broju krvnih pločica posle davanja PEGilovanog peptidnog jedinjenja prema stanju tehnike i PEGilovanog TPO jedinjenja br. 1. Kao što je prikazano na sl.3, najveća doza PEGilovanog TPO jedinjenja br. 1 ima istu aktivnost kao najmanja doza PEGilovanog peptidnog jedinjenja iz stanja tehnike. Manje jako jedinjenja može obezbediti manje drastičan stimulans prema ciljnim ćelijama, koji će smanjiti rizik sporednih efekata izazvanih prekomernom stimulacijom ciljnih ćelija, kao što su ozbiljna trombocitopenija koja prati ciklus hemoterapije. Na sl.3 na PEGilovano TPO jedinjenje br.l se poziva kao na PEG-2-Nal a na PEGilovano peptidno jedinjenje iz prethodnog stanja tehnike se poziva kao na PEG-1-Nal (stanje tehnike)
SI. 4 i 5 pokazuju rezultate ispitivanja jedno naspram drugog odgovora na doze PEGilovanog peptidnog jedinjenja prethodnog stanja tehnike i PEGilovanog TPO jedinjenja br.l kod normalnih miševa. Na sl.4 i 5 na PEGilovano TPO jedinjenje br.l se poziva kao na PEG-2-Nal, a na PEGilovano peptidno jedinjenje iz prethodnog stanja tehnike na koje se poziva kao na PEG-1-Nal (stanje tehnike). SI 4 pokazuje povećane nivoe krvnih pločica i si. 5 pokazuje srednju vrednost zapremine krvnih pločica šest (6) dana posle tretmana. Dozni opseg je bio od 10 do 3000ug/kg. Oba peptidna jedinjenja povećavaju broj krvnih pločica koje cirkulišu na dozno-zavisan način sa relativnim povećanjem u odnosu na posmatranu kontrolnu grupu pri dozama niskim kao 30 ug/kg za oba jedinjenja. Pri maksimalanom odgovoru, ova peptidna jedinjenja povećavaju broj krvnih pločica na nivo koji je četvorostruko veći od kontrolnih vrednosti. Dizno zavisne krive za ova peptidna jedinjenja su veoma slične ukazujući da na ovom modelu suštinski ne postoji razlika između dva testirana proizvoda na osnovu njihove krajnje tačke.
IV. Pripremanje peptidnih jedinjenja
A. Sinteze na čvrstoj fazi
Peptidna jedinjenja prema pronalasku mogu biti pripremljena klasičnim postupcima poznatim u stanju tehnike, na primer, korišćenjem standardnih tehnika za čvrstu fazu. Standardni postupci uključuju eksluzionu sintezu na čvrstoj fazi, postupke delimične sinteze na čvrstoj fazi, kondenzaciju fragmenata, klasične sinteze u rastvoru i čak tehnologije rekombinantne DNK. Videti npr. Merrifield, J. Am. Chem. Soc, 85:2149 (1963), koji je uključen ovde kao referenca. Na čvrstoj fazi, sinteza je tipično započeta od C-terminalnog kraja peptida korišćenjem alfa-amino zaštićene smole. Pogodni polazni materijal može biti pripremljen, na primer, vezivanjem poželjnih alfa-aminokiselina za hlorometilovanu smolu, hidroksimetilovanu smolu ili benzhidrilaminsku smolu. Jedna takva čvrsta hlorometilovana smola je pod trgovačkim imenom BIO-BEADS SX-1 od Bio Laboratories, Richmond, CA i pripremanje hidroksimetilne smole je opisano kod Bodonszkv et al., Chem. Ind. (London), 38:1597 (1966). Benzhidrilaminska smola (BHA) je opisana kod Pietta and Marshall, Chem. Commn., 650
(1970) i komercijalno je dostupna od Beckman Instruments, Inc. Palo Alto, Calif, u hidrohloridnom obliku.
Prema tome peptidna jedinjenja prema pronalasku mogu biti pripremljena kuplovanjem alfa amino zaštićenih aminokiselina sa hlorometilovanim smolama uz pomoć na primer cezujum bikarbonata kao katalizatora prema postupku opisanom kod Gisin, Helv., Chim. Acta, 56:1467 (1973). Posle početnog kuplovanja alfa-amino zaštitna grupa je uklonjena reagensom po izboru uključujći trifluorosirćetnu kiselinu (TFA) ili rastvor hidrohlorne kiseline (HC1) u orgasnkim rastvaračima na sobnoj temperaturi.
Alfa-amino zaštitne grupe su one koje su korisne u tehnici postepene sinteze peptida. Uključuju zaštitne grupe tipa acila (npr. formil, trifluoroacetil, acetil), zaštitne grupe aromatičnog uretanskog tipa (npr. benziloksikarbonil (Cbz) i supstituisani Cbz), alifatične uretanske zaštitne grupe (npr. t-butiloksikarbonil (Boe), izopropiloksikarbonil, cikloheksiloksikarbonil) i zaštitne grupe alkil tipa (npr. benzil, trifenilmetil). Boe i Fmoc su poželjne zaštitne grupe. Zaštitna grupa bočnih lanaca ostaje nedirnuta u toku kuplovanja i ne čepa se prilikom skidanja zaštitne grupe sa amino kraja ili u toku kuplovanja. Zaštitna grupa bočnih lanaca može se ukloniti posle završene sinteze u krajnjem peptidu i posreakcionim uslovima koji neće menjati ciljni protein.
Zaštitne grupe bočnih lanaca Tyr uključuju tetrahidropiranil, terc-butil, tritil, benzil, Cbz, Z~Br~Cbz i 2,5-dihlorobenzil. Zaštitne grupe bočnih lanaca za Asp uključuju benzil, 2,6-dihlorobenzil, metil, etil i cikloheksil. Zaštitne grupe bočnih lanaca za Thr i Ser uključuju acetil, benzoil, tritil, tetrahidropiranil, benzil, 2,6-dihlorobenzil i Cbz. Zaštitne grupe bočnih lanaca za Thr i Ser je benzil. Zaštitne grupe bočnih lanaca za Arg uključuje nitro, Tozil (Tos), Cbz, adamantiloksikarbonil mezitoilsulfonil (Mts) ili Boe. Zaštitne grupe bočnih lanaca za Lys uključuju Cbz, 2-hlorobenziloksikarbonil (2-C1—Cbz), 2-bromobenziloksikarbonil (2-BrCbz), Tos ili Boe.
Posle uklanjanja alfa-amino zaštitne grupe, preostale zaštićene aminokiseline su kuplovane u stupnjevima željenim redom. Višak svake zaštićene aminokiseline je generalno korišćen sa odgovarajućim aktivatorom karboksilne grupe kao što je dicikloheksilkarbodiimid (DCC) u rastvoru, na primer, u smešama metilen hlorida (CH2C12), dimetilformamida (DMF). Pošto su kompletirane željene aminokiselinske sekvence, željeni peptid je dekuplovan sa obezbeđene smole tretiranjem sa reagensom koji je kao trifluorosirćetna kiselina ili fluorovodonik (HF) koji ne seče samo peptid sa smole nego takođe seče sve preostale zaštitne grupe bočnih lanaca. Kada je korišćena hlorometilovana smola, tretiranje sa fluorovodonikom dovodi do obrazovanja slobodnih peptidnih kiselina. Kada je korišćena benzhidrilaminska smola, tretiranje sa fluorovodonikom direktno dovodi do slobodnih peptidnih amida. Alternativno, kada je korišćena hlorometilovana smola, peptid sa zaštićenim bočnim lancem može biti dekuplovan tretiranjem peptidne smole sa amonijakom da bi se dobio željeni amid zaštićenog bočnog lanca ili sa alkilaminom da bi se dobio alkilamid ili dialkilamid sa zaštićenim lancom. Zaštita bočnih lanaca je zatim uklonjena na uobičajeni način tretiranjem sa fluorovodonikom i dobijeni su slobodni amidi, alkilamidi ili dialkilamidi.
Ovi postupci sinteze peptida na čvrstoj fazi su dobro poznati u tehnici i dalje opisani kod John Morrow Stewart and Janis Dillaha Young, Solid Phase Peptide Svntheses (2 nd ed., Pierce Chemical Companv, 1984).
B. Sintetičke aminokiseline
Ovi postupci mogu takođe biti korišćeni u sintezi peptida u kojoj aminokiseline koje su drugačije od 20 koji se u prirodi javljaju, genetički kodiranih amininokiselina su zamanjene u jednom, dva ili više položaja bilo kog jedinjenja prema pronalasku. Može se zameniti bočni lanac koji se javlja u prirodi 20 genetski kodiranih aminokiselina (ili D aminokiselina) sa drugim bočnim lancima, na primer sa grupama kao što su alkil, niži alkil, ciklični 4-, 5-, 6- do 7-ciklični alkil, amid, amid nižeg alkila, amid di(nižeg alkila), niži alkoksi, hidroksi, karboksi i njihovi niži estarski derivati i sa 4-, 5-, 6- do 7-članim heterociklima. Naročito, mogu biti korišćeni analozi prolina u kojima je veličina prstena prolinkog ostatka promenjena sa 5-članog na 4, 6 ili 7 članova. Ciklične grupe mogu biti zasićene ili nezasićene i ukoliko su neazcisćene mogu biti aromatične ili nearomatične. Heterociklične grupe poželjno sadrže jedan ili više heteroatoma azota, kiseonika i/ili sumpora. Primeri takvih grupa uključuju furazanil, furil, imidazolidinil, imidazolil, imidazolinil, izotiazolil, izoksazolil, morfolinil (npr. morfolino), oksazolil, piperazinil (npr. 1-piperazinil), piperidil (npr. 1-piperidil, piperidino), piranil, pirazinil, pirazolidinil, pirazolinil, pirazolil, piridazinil, piridil, pirimidinil, pirolidinil (npr. 1-pirolidinil), pirolinil, pirolil, tiadiazolil, tiazolil, tienil, tiomorfolinil (npr. tiomorfolino) i triazolil. Ove heterociklične grupe mogu biti supstituisane ili nesupstituisane. Gde je grupa supstituisana, supstituent može biti alkil, alkoksi, halogen, kiseonik ili supstituisani ili nesupstituisani fenil.
Takođe peptidi prema sadašnjem pronalasku mogu se lako modifikovati fosforilacijom (videti npr. W Banmvarth et al., Biorganic and Medical Chemistrv Letters 6(17):2141-2146 (1996)) i drugi postupci za pripremanje peptidnih derivata jedinjenja prema prikazanom pronalasku su opisani kod Hruby et al. Biochem. J., 268(2):249-262 (1990). Prema tome peptidna jedinjenja prema pronalasku takođe služe kao osnova za prirpemanje peptidnih mimetika sa sličnom biološkom aktivnošću.
C. Terminalne modifikacije
Ljudi iz struke će zanti da su dostupne različite tehnike za konstruisanje peptidnih jedinjenja sa istom ili sličnom željenom biološkom aktivnošću kao odgovarajućih peptidnih jedinjenja, ali sa povoljnijom aktivnošću nego peptidnih jedinjenja u odnosu na rastvorljivost, stabilnost i osetljivost prema hidrolizi i proteolizi. Videti na primer, Morgan, et al., Ann. Rep. Med, Chem., 24:243-252 (1989). Sledi opisivanje postupaka pripremanja peptidnih jedinjenja modifikovanih na N-terminalnoj amino grupi, C-terminalnoj karboksilnoj grupi i/ili promena jedne ili više amido veza u peptidu u neamidnu vezu. Razume se da dve ili više takvih modifikacija može biti kupiovano u jednoj strukturi peptidnog jedinjenja (npr. modifikacija na C-terminalnoj karboksilnoj grupi i inkluzija -CH2-karbamatne veze između dve aminokiseline u peptidnom jedinjenju).
1. N-terminalne modifikacije
Tipično peptidna jedinjenja su sintetizovana kao slobodne kiseline, ali kao što je gore primećeno, mogu biti lako pripremljeni kao amidi ili estri. Amino i/ili karboksi kraj peptidnih jedinjenja prema pronalasku mogu se modifikovati da se dobiju druga jedinjenja prema pronalasku. Modifikacije amino kraja uključuju metilaciju, acetailaciju, dodavanje benziloksikarbonil grupe ili blokiranje amino kraja sa bilo kojom blokirajućom grupom koja sadrži karboksilatnu funkcionalnost definisanu kao RCOO--, gde R je izabran iz grupe koja sadrži nafil, akridinil, steroidil i slične grupe. Modifikacije karboksi kraja uključuju zamenjivanje slobodnih kiselina sa karboksamidnom grupom ili obrazovanjem cikličnih laktama na karboksilnom kraju da bi se uvelo strukturno ograničenje.
Modifikacije amino kraja koje su gore navedene uključuju alkilaciju, acetilaciju, dodavanje karbobenzoil grupa, obrazovanje sukcinimidne grupe itd. (videti npr. Murrav et al., Burger's Medical Chemistrv and Drug Discoverv, 5th ed., vol. 1, Manfred E. Wolf, ed., John Wiley and Sons, Inc.
(1995)). Naročito, N-terminalne amino grupe mogu zatim reagovati kao što sledi: (a) obrazovati amidne grupe formule RC(0)NH~, gde R je gore definisan, reakcijom sa acil halogenidom ili simetričnim anhidridom. Tipično, reakcija može biti izvedena dovođenjem u kontakt oko ekvimolarne količine ili viška (npr. oko 5 ekvivalenata) kiselinskog halogenida sa peptidom u inertnom razblaživaču (npr. dihlorometanu) poželjno koji sadrži višak (npr. oko 10 ekvivalenata) tercijarnog amina kao što je diizopropiletilamin, koji vezuje kiselinu koja nastaje u toku reakcije. Reakcioni uslovi su inače konvencionalni (npr. sobna temperatura u toku 30 minuta). Alkilacija terminalne amino da bi se dobio niži alkil-N-supstituent posle reakcije sa kiselinskim halogenidom kao što je gore opisano će obezbediti N-alkil amidnu grupu formule RC(0)NR~. (b) obrazovati sukcinimidnu grupu reakcijom sa sukcinil anhidridom.
Kao ranije, može biti korišćena približno ekvimolama količina ili višak sukcinil anhidrida (npr. oko 5 ekvivalenata) i amino grupa je pretvorena postupcima dobro poznatim u tehnici u sukcinimid uključujući upotrebu viška (npr. deset ekvivalenata) tercijarnog amina kao što je diizopropiletilamin u pogodnom inertnom rastvaraču (npr. dihlorometanu). Videti npr. Wollenberg et al., US Pat. br. 4,612,132 koji je uključen ovde kao referenca u njegovoj celosti. Razume se da sukcinil grupa može biti supstituisana na primer sa alkil ili —SR supstituentima koji su priprmeljni na konvencionalni način da bi se dobili supstituisani sukcinimidi na N-kraju peptida. Takvi alkil supstituenti su pripremljeni reakcijom nižih olefina sa maleinskim anhidridom na način opisan u Wollenberg et al. supra i —SR supstituenti su pripremljeni reakcijom RSH sa maleinskim anhidridom, gde je R kao što je gore definsiano;
(c) obrazovati beziloksikarbonil-NH-- ili supstituisani benziloksikarbonil-N— grupu reakcijom sa približno ekvivalentnom količinom ili viškom CBZ--C1 (tj. benziloksikrabonil hloridom) ili supstituisanim CBZ—Cl u pogodnom inertnom rastvaraču (npr. dihlorometanu) koji poželjno sadrži tercijarni amin koji veže stvorenu kiselinu u toku reakcije; (d) obrazovati sulfonamidnu grupu reakcinom sa ekvivalentnom količinom ili viškom (npr. 5 ekvivalentata) R--S(0)2C1 u pogodnom inertnom razblaživaču (dihlorometanu) da bi se pretvorio terminalni amin u sulfonamid, gde R je kao što je gore definsiano. Poželjno, inertni razblaživač sadrži višak tercijarnog amina (npr. deset ekvivalenata) kao što je diizopropiletilamin, koji vezuje kiselinu koja je stvorena u toku reakcije. Ostali reakcioni uslovi su konvencionalni (npr. sobna temperatura u toku 30 min). (e) obrazovati karbamatnu grupu reakcijom sa ekvivalentnom količinom ili viškom (npr. 5 ekvivalenata) R--OC(0)Cl ili R-OC(0)OC6H4-p-N02u pogodnom inertnom razblaživaču (npr. dihlorometanu) da bi se pretvorio krajnji amin u karbamat, gde je R kao što je gore defmisano. Poželjno inertni razblaživač sadrži višak (npr, oko 10 ekvivalenata) tercijarnog amina, kao što je diizopropiletilamin, koji vezuje bilo koju stvorenu kiselinu u toku reakcije. Inače ostali reakcioni uslovi su konvencionalni (npr. sobna temperatura u toku 30 minuta) i (f) obrazovati urea grupu reakcijom ekvivalentne količine ili viška (npr. 5 ekvivalenata) R-N=C=0 u pogodnom inertnom razblaživaču (npr.
dihlorometanu) da bi se pretvorio terminalni amin u urea (tj. RNHC(O)NH-) grupu, gde je R kao što je gore defmisano. Poželjno, inertni razblaživač sadrži višak (npr. oko 10 ekvivalenata) tercijarnog amina, kao što je diizopropiletilamin. Inače ostali reakcioni uslovi su konvencionalni (npr. sobna temperatura u toku 30 minuta).
2. C-terminalne modifikacije
U pripremanju peptidnih jedinjenja u kojim je C-terminalana karboksilna grupa zamenjena sa estrom (tj. ~C(0)OR gde R je kao što je gore defmisano), korišćene su smole za pripremanje peptidnih kiselina i peptidi za zaštićenim bočnim lancima su cepani sa bazom i odgovarajućim alkoholom, npr. metanolom. Zaštitne grupe bočnih lanaca su zatim uklonjene na uobičajeni način tretiranjem sa fluorovodonikom da bi se dobio željeni estar.
U pripremanju peptidnih jedinjenja u kojima C-terminalna karboksilna grupa je zamenjena sa amidom ~C(0)NR3R4 , korišćena je benzhidrilaminska smola kao čvrsti nosač za peptidnu sintezu. Posle završene sinteze, tretiranje sa fluorovodonikom da bi se oslobodio peptid iz nosača dovodi direktno do slobodnih peptidnih amida (tj. C-terminal je ~C(0)NH2). Alternativno, upotreba hlorometilovane smole u toku peptidne sinteze kuplovane sa reakcijom sa amonijakom radi cepanja peptida zaštićenih bočnih lanaca od nosača dovodi do slobodnih peptidnih amida i reakcije sa alkilaminom ili dialkilaminom dovodi do alkilamida ili dialkilamida sa zaštićenim bočnim lancem (tj. C-kraj je~C(0)NRR<1>gde R i R<1>su kao što je gore defmisano). Zaštita bočnih lanaca je zatim uklonjena na uobičajeni način tretiranjem sa fluorovodnikom i dobijeni su slobodni amidi, alkilamidi ili dialkilamidi.
Peptidno jedinjenje se može ciklizovati prema pronalasku, ili ugraditi desamino ili deskarboksi ostatak na kraj peptidnog jedinjenja tako da ne postoji terminalna amino grupa ili karboksilna grupa, da bi se povećala osetljivost prema proteazama ili smanjila konformacija peptidnih jedinjenja. C-terminalne funkcionalne grupe peptidnih jeidnjenja prema prikazanom pronalasku uključuju amid, amid niži alkil, amid di(niži alkil), niži alkoksi, hidroksi i karboksi i njihovi niži estarski derivati i njihove farmaceutski prihvatljive soli.
Dodatno gore iznetom N-terminalne i C-terminalne modifikacije, peptidnih jedinjenja prema pronalasku, uključujući peptidopodraživače, mogu poželjno biti modifikovani sa ili kovalentnim kuplovanjem sa jednim ili više hidrofilnih polimera. Nađeno je da kada su peptidna jedinjenja derivatizovana sa hidrofilnim polimerima, njihova rastvorljivost i poluživot u krvotoku su povećani i njihova imunogenost je maskirana. Gore pomenuto se može postići sa malo, ukoliko je ima, smanjenja u njihovoj aktivnosti vezivanja. Neproteinski polimeri pogodni za upotrebu prema prikazanom pronalasku uključuju, ali bez ograničenja, polialkiletre na primer polietilen glikol i polipropilen glikol, polimlečne kiseline, poliglikolene kiseline, polioksialkene, polivinilalkohol, polivinilpirolidon, celulozu i celulozne derivate, dekstran i derivate dekstrana itd. Generalno, takvi hidrofilni polimeri imaju prosečnu molekulsku težinu koja je u opsegu od oko 500 do oko 100,000 daltona, poželjnije od oko 2,000 do oko 40,000 daltona i čak poželjnije od oko 5,000 do oko 20,000 daltona. U poželjnim izvođenjima, takvi hidrofilni polimeri imaju prosečnu molekulsku težinu od oko 5,000 daltona, 10,000 daltona i 20,000 daltona.
Peptidna jedinjenja prema pronalasku mogu biti derivatizovana sa ili kuplovanjem za takve polimere korišćenjem bilo kog postupka iznetog u Zallipskv, S; Bioconjugate Chem., 6:150-165 (1995); Monfardini, C, et al., Bioconjugate Chem., 6:62-69 (1995); US Pat. br. 4,640,835; US Pat. br. 4,496,689; US pat. br. 4,301,144; US Pat. br. 4,670,417; US Pat. br. 4,791,192; US Pat. br. 4,179,337 ili WO 95/34326, od kojih su svi uključeni ovde kao refernce u njihovoj celovitosti.
U sadašnjem poželjnom izvođenju, peptidna jedinjenja prema prikazanom pronalasku su derivatizovana sa polietilen glikolom (PEG). PEG je linearan, vodorastvoran polimer etilen oksidnih ponavljajućih jedinica sa dve terminalne hidroksilne grupe. PEGs su klasi fiko vani po njihovim molekulskim težinama u tipičnom opsegu od oko 500 daltona do oko 40,000 daltona. U sadašnjim poželjnim izvođenjima, ovde korišćeni PEGs imaju molekulsku masu koja je u opsegu od 5,000 daltona do oko 20,000 daltona. PEGs kupio van za peptidno jedinjenje prema prikazanom pronalasku može biti ili razgranat ili nerazgranat (Videti, npr. Monfardini, C. et al., Bioconjugate Chem., 6:62-69 (1995)). PEGs su komercijalno dostupni od Sheanvater Polvmers, Inc. (Huntsville, Ala) (koji su deo Nektar Therapeutics (San Carlo, CA), Sigma Chemical Co. i drugih kompanija. Takvi PEGs uključuju ali bez ograničenja, monometoksipolietilen glikol (MePEG-OH), monometoksipolietilen glikol-sukcinat (MePEG-S), monometoksipolietilen glikol-sukcinimidil sukcinat (MePEG-S-NHS), monometoksipolietilen glikol-amin (MePEG-NH2), monometoksipolietilen glikol-trezilat (MePEG-TRES) i monometoksipolietilen glikol-imidazol-karbonil (MePEG-IM).
Ukratko, u jednom izvođenju, hidrofilni polimer, koji je korišćen, npr. PEG je poželjno obezbeđen najednom kraju sa nereaktivnom grupom kao stoje metoksi ili etoksi grupa. Posle toga, polimer je aktiviran na drugom kraju reakcijom sa pogodnim aktivirajućim sredstvom, kao što je cijanurski halogenidi (npr. cijanurski hlorid, bromid ili fluorid), diimadozl, anhidridni reagens (npr. dihalosukcinski anhidrid, kao što je dibromosukcinski anhidrid), acil azid, p-diazonijumbenzil etar, 3-(p-diazonijumfenoksi)-2-hidroksipropiletar) i slično. Aktivirani polimer je zatim reagovao sa peptidnim jedinjenjem prema prikazanom pronalasku i dobijeno je peptidno jedinjenje derivatizovano sa polimerom. Alternativno, funkcionalna grupaupeptidnim jedinjenjima prema pronalasku može biti aktivirana za reakciju sa polimerom, ili dve grupe mogu biti spojene u usklađenoj reakciji kuplovanja korišćenjem poznatih postupaka kuplovanja. Lako će se oceniti da peptidna jedinjenja prema pronalasku mogu biti derivatizovana sa PEG korišćenjem mnoštva drugih reakcionih šema poznatih i korišćenih u stanju tehnike.
Kada peptidna jedinjenja su derivatizovana sa hidrofilnim polimerom, njihova rastvorljivost i polu život u krvotoku je povećan i njihova imunogenost je smanjena. Gore izento može se postići sa malo, ukoliko ga ima, gubitka biološke aktivnosti. U poželjnim izvođenjima, derivatizovani peptidi imaju aktivnost koja je 0.1 do 0.01 puta aktivnost nemodifikovanih peptida. U poželjnijim izvođenjima, derivatizovani peptidi imaju aktivnost koja je 0.1 do 1-puta aktivnost nemodifikovanih peptida. U čak poželjnijim izvođenjima, derivatizovani peptidi imaju aktivnost koja je veća od nemodifikovanih peptida.
D. Modifikacijeosnovogniza
Ostali postupci za pripremanje peptidnih derivata jedinjenja prema prikazanom pronalasku su opisani u Hruby, et al., Biochem J., 268(2):249-262 (1990), uključen ovde kao referenca. Prema tome, peptidna jedinjenja prema pronalasku takođe služe kao strukturni modeli za nepetidna jedinjenja sa sličnom biološkom aktivnošću. Ljudi iz struke će zanti da su dostupne različite tehnike za konstruisanje jedinjenja koja imaju istu ili različitu željenu biološku aktivnost kao vodeće peptidno jedinjenje ali sa pogodnijom aktivnošću u odnosu na vodeće u pogledu rastvorljivosti, stabilnosti i osetljivosti na hidrolizu i proteolizu. Videti Morgan et al, Ann. Rep. Med. Chem., 24:243-525 (1989) koji su uključeni ovde kao reference. Ove tehnike uključuju zamenjivanje peptidnog osnovonog niza sa nizom koji se sastoji od fosfonata, amidata, karbamata, sulfonamida, sekundarnih amina i N-metilaminokiselina.
Pogodni reagensi, uključuju na primer, analoge aminokiselina u kojima karboksilna grupa aminokiselina je zamenjana sa ostatkom koji je pogodan za obrazovanje jedne od gornjih veza.
Slično, zamena amido veza u peptidu sa fofonatnom vezom, može biti postidnuta na način iznet u US patentu br. 5,359,115 i US 5,420,328, čiji su opisi uključeni ovde kao referenca u njihovoj celovitosti.
E. Obrazovanje disulfidne veze
Jedinjenja prema prikazanom pronalasku mogu postojati u ciklizovanom obliku sa intramolekulskom disulfidnom vezom između tiol grupa ugrađenih cisteina, ukoliko su prisutni. Alternativno, intramolekulska disulfidna veza između tiol grupa cisteina može biti izazvana da bi se dobilo dimerno (ili više oligomerno) jedinjenje. Jedan ili više cisteinskih ostataka mogu takođe biti supstituisani sa homocisteinom.
V. Korišćenje
Peptidna jedinjenja prema pronalasku su korisna in vitro kao jedinstveno oruđe za razumevanje biološke uloge TPO, uključujući procenivanje mnogo faktora koji utiču ili kroz koje se utiče na proizvodnju TPO i postupka vezivanja receptora. Prikazana peptidna jedinjenja su takođe korisna u razvijanju drugih jedinjenja koja se vežu za i aktiviraju TPO-R, jer prisutna peptidna jedinjenja obezbeđuju važne informacije u odnosu između strukture i aktivnosti koja će olakšati takvo razvijanje.
Peptidna jedinjenja su takođe korisna kao kompetitivna sredstva vezivanja u testovima ispitivanja novih agonista TPO receptora. U takvim izvođenjima testova, peptidna jedinjenja prema pronalasku mogu biti korišćena bez modifikacije ili mogu biti modifikovani na različite načine; na primer, obeležavanjem, kao što je kovalentno ili nekovalentno vezivanje ostatka koji direktno ili indirektno obezbeđuje detektabilni signal. U bilo kom od ovih testova, materijali mogu biti obeleženi direktno ili indirektno. Mogućnosti za direktno obeležavanje uključuju obeležene grupe kao što su: radioaktivno obeležene kao što su 125I, enzimi (US Pat. br. 3,645,090) kao što su peroksidaze i alkalne fosfataze i fluorescentne obeleživače (US pat. br. 3,940,475) sposobne za praćenje promena u florescentnom intenzitetu, pomaka talasne dužine ili fluorescentne polarizacije. Mogućnosto za indirektno obležavanje uključuju biotinilaciju jednog konstituenta koji prati vezivanje za avidin kuplovan ua jednu od gornjih obeleženih grupa. Peptidna jedinjenja mogu takođe uključivati spejsere ili linkere u slučajevima u kojima su peptidna jedinjenja vezana za čvrsti nosač.
Povrh toga, zasnovano na njihovoj sposobnosti da se veže za TPO receptor, peptidna jedinjenja prema prikazanom pronalasku mogu biti korišćena kao reagensi za detektovanje TPO receptora na živoj ćeliji, fiksiranim ćelijama, u biološkim tečnostima, homogenatima tkiva, u prečišćenim, prirodnim, biološkim materijalima itd. Na primer, obeležavanjem takvih peptidnih jedinjenja, mogu se identifikovati ćelije koje imaju TPO-R na njihovoj površini. Pored toga, na osnovu, njihove sposobnosti da se vežu za TPO receptor, peptidna jedinjenja prema prikazanom pronalasku mogu biti korišćena u in situ obrazovanju mrlja, FACS (fluorescentno aktivirano ćelijsko sortiranje), Western blotting, ELISA, itd. Pored toga, zasnovano na njihovoj sposobnosti da se veže za TPO receptor, peptidna jedinjenja prema prikazanom pronalasku mogu biti korišćena u prečišćavanju receptora ili u prečišćavanju ćelija koje vrše ekspresiju TPO receptora na ćelijskoj provršini (ili unutar permeabiliziranih ćelija).
Peptidna jedinjenja prema prikazanom pronalasku mogu biti takođe korišćena kao komercijalni reagensi za različite medicinska ispitivanja i dijagnostičke upotrebe. Takve upotrebe uključuju ali bez ograničenja (1) upotrebu kao kalibracionog standarda za kvantifikovanje aktivnosti kadidata za agoniste TPO u različitim funkcionalnim testovima; (2) upotrebu da se održi proliferacija i rast TPO zavisnih ćelijksih linija; (3) upotrebu u strukturnim analizama TPO receptora kroz ko-kristalizaciju; (4) upotrebu u istraživanju mehanizama TPO signalne transdukcije/aktivacije receptora, i (5) druge primene ispitivanja i dijagnoze u kojima TPO receptor je poželjno aktiviran ili takva aktivacija je konvencionalno kalibrisana protiv poznatih količina TPO agonista i slično.
Polipeptidna jedinjenja prema prikazanom pronalasku mogu biti korišćena za in vitro ekspanziju megakariocita i njihove izvršne prethodnike, obe u konjukciji sa dodatnim citokinima ili njima samima. Videti, npr. DiGiusto, et al. PCT objavu br. 95/05843 koja je uključena ovde kao referenca. Hemoterapija i terapije zračenja izazivaju trobocitopeniju ubijanjem zrelije populacije megakariocita koje se brzo dele. Međutim, ovi terapeutski tretmani mogu takođe smanjiti broj i životnost nezrelih, slabije mitotički aktivnih prekusornih ćelija megakariocita. Prema tome, ublažavanje trombocitopenije sa TPO ili peptidnim jedinjenjem prema prikazanom pronalasku može biti ubrzano infuzijom pacijentima posle hemoterapije ili terapije zračenja njegovih ili njenih ćelija obogaćenih megakariocitima i nezrelim prekusorima in vitro kulture.
Peptidna jedinjenja prema pronalasku mogu biti takođe davana toplokrvnim životinjama, uključujući ljude, da se aktivira in vivo TPO-R. Prema tome, prikazani pronalazak obuhvata postupke za terapeutsko lečenje poremećaja u kojima posreduje TPO koji se sastoji iz davanja peptidnog jedinjenja prema pronalasku u količinama dovoljnim da podražavaju efekat TPO na TPO-R in vivo. Na primer, peptidna jedinjenja prema pronalasku mogu biti davana za lečenje različitih hematoloških poremećaja, uključujući ali bez ograničenja poremećaje krvnih pločica i trobocitopeniju, naročito kada je u vezi sa transfuzijom koštane srži, terapijom zračenja i hemoterapijom.
U nekim izvođenjima prema pronalasku, TPO antagonisti su poželjno prvi davani pacijentima koji su pod hemoterapijom ili terapijom zračenja, praćeni davanjem agonista TPO prema pronalasku.
Aktivnost peptidnih jedinjenja prema prikazanom pronalasku mogu biti procenjena ili in vitro ili in vivo u jednom od brojnih modela opisanih u McDonald, Am. J. Pediatric Hematology/Oncology, 14:8-21 (1992), koji su uključeni ovde kao referenca.
Prema jednom izvođenju, kompozicije, prema prikazanom pronalasku su korisne za tretiranje trombocitopenije u vezi sa transfuzijom koštane srši, terapijom zračenja ili hemoterapijom. Peptidna jedinjenja tipično će biti davana profilaktički pre hemoterapije, terapije zračenja, ili transplantacije koštane srži ili posle takvog izlaganja.
Prema tome, prikazani pronalazak takođe obezbeđuje farmaceutkse kompozicije koje sadrže, kao aktivno sredstvo, bar jedno od peptidnih jedinjenja prema pronalasku zajedno sa farmaceutski prihvatljivim nosačem ili razblaživačem. Peptidna jedinjenja prema ovom pronalasku mogu biti davana oralno, pulmonarno, parenteralno (intramuskularno, intraperitonealno, intravenski (IV) ili subkutanoznom injekcijom), inhalacijom (preko formulacije finog praha), transdermalno, nazalno, vaginalno, rektalno ili sublingvalnim putem davanja i mogu biti formulisana u doznim oblicima odgovarajućim za svaki način davanja. Videti, npr. PCT patent objavljen kao WO 94/17784; i Pitt et al. Evropska patenta prijava 613,683 od kojih je svaki uključen ovde kao referenca.
Čvrsti dozni oblici za oralno davanje uključuju kapsule, tablete, pilule, praškove i granule. U takvim čvrstim doznim oblicima, aktivno peptidno jedinjenje je pomešano sa bar jednim inertnim farmaceutski prihvatljivim nosačem kao što je saharoza, laktoza ili škrob. Takvi dozni oblici mogu sadržati, kao u normalnoj praksi, dodatne supstance koje su drugačije nego inertna sredstva za razblaživanje, npr. sredstva za klizanje, kao što je magnezijum stearat. U slučaju kapsula, tableta i pilula, dozni oblici mogu takođe sadržati sredstva za puferovanje. Tablete i pilule mogu dodatno biti pripremljene sa entero oblogama.
Tečni dozni oblici za oralno davnje uključuju farmaceutski prihvatljive emulzije, rastvore, suspenzije, sirupe, sa eliksirima koji sadrže inertne razblaživače koji se uobičajeno koriste u stanju tehnike, kao što je voda. Pored takvih inertnih razblaživača, kompozicije mogu takođe uključiti adjuvante, kao što su sredstva za vlaženje, emulgovanje i sredstva za suspendovanje i zaslađivači, arome i mirisna sredstva.
Preparati prema ovom pronalasku za parenteralno davanje uključuju sterilne vodene ili nevodene rastvore, suspenzije ili emulzije. Primeri nevodenih rastvarača ili sredstava su polipropilen glikol, polietilne glikol, biljna ulja, kao što je maslinovo ulje i kukuruzno ulje, želatin i njektibilni organski estri kao što je etil oleat. Takvi dozni oblici mogu takođe sadržati adjuvante kao što su sredstva za održavanje, sredstva za kvašenje, emulgovanje, i sredstva za dispergovanje. Oni mogu biti sterilizovani, na primer, ceđenjem kroz filter koji zadržava bakterije, inkorporacijom sterilizirajućih sredstava u kompozicije, ozračavanjem kompozicija ili zagrevanjem kompozicija. One mogu takođe biti proizvedene korišćenjem sterilne vode ili nekog drugog sterilnog injektibilnog medijuma, neposredno pre upotrebe.
Kompozicije za rektalno ili vaginalno davanje su poželjno supozitorije koje mogu sadžati, pored aktivne susptance, ekscipijente kao što su kako buter ili vosak za supozitorije. Kompozicije za nazalnu ili sublingvalno davanje su takođe pripremljene sa standardnim ekscipijentima dobro poznatim u tehnici.
Kompozicije koje sadrže peptidno jedinjenje mogu biti davane za profilaktičke i/ili terapeutske tretmane. U terapeutskim primenama, kompozicije su davane pacijentu koji već pati od bolesti, kao što je gore opisano u količni koja je dovoljna da izleči ili bar delom zaustavi simtome bolesti i njene komplikacije. Količina adekvatna da ovo postigne je 'terapetski efiksana doza'. Količine koje postižu ovo će zavisiti od ozbiljnosti bolesti i težine i opšteg stanja pacijenta.
Kompozicije prema pronalasku mogu takođe biti mikroinkapsulirane, na primer, postupkom Tice i Bibi (u Treatise on Controlled Drug Deliverv, ed. A. Kvdonieus, Marcel Dekker, New York (1992), pp 315-339).
U profilaktičkim primenama, kompozicije koje sadrže peptidna jedinjenja prema pronalasku se daju pacijentu koji je podložan ili na drugi način u opasnosti od određene bolesti. Takva količina je definisana da je 'profilaktički efiksana doza'. U ovoj upotrebi, precizna količina ponovo zavisi od pacijentovog stanja zdravlja i težine.
Količine peptidnog jedinjenja neophodne za efikasnu terapiju će zavisiti od mnogo različitih faktora, uključujući načine davanja, ciljno mesto, fiziološko stanje pacijenta i druge lekove koji se daju. Prema tome, doze za tretiranje treba titrirati za optimizaciju sigurnosti i efikasnosti. Tipično, korišćene doze in vitro mogu obezbeđivati korisne uputstva za količine korisne za in situ davanje ovih reagenasa. Testiranje životinja na efikasne doze za tretiranje određenih poremećaja će obezbediti dalje predvidive indikacije humanog doziranja. Različita razmatranja su opisana, npr kod Gilman, et al. (eds), Goodman and Gilman's. The Pharmacological Basis of Therapeutics, 8 th ed., Pergamon Press (1990); and Remington's Pharmaceutical Sciences, 7th Ed., Mack Publishing Co, Easton, Pa (1985); od kojih je svaki uključen ovde kao referenca.
Peptidna jedinjenja prema ovom pronalasku su efikasna u tretiranju stanja u kojima posreduje TPO kada se daju u doznom opsegu koji je od oko 0.001 mg do oko 10 mg/kg telesne težine po danu. Korišćena specifična doza je regulisana naričitim stanjem koje se leči, putem davanja kao i procenivanjem kliničara u zavisnosti od faktora kao što su ozbiljnost stanja, godine i opšti uslovi pacijenta i slično.
PRIMER 1
Peptidne sinteze na čvrstoj fazi
Peptidna jedinjenja prema pronalasku mogu biti sintetizovana, na primer, korišćenjem Merrifield-ove tehnike sinteze na čvrstoj fazi (videti Stevvard and Young, Solid Phase Peptide Svnthesis, 2 d. edition, Pierce Chemical, Rockford 111. (1984) and Merrifield, J. Am. Chem. Soc, 85:2149 (1963)) ili Applied Biosvstems Inc. Model 431A ili 433A peptidni sitetizer. Peptidna jedinjenja mogu biti spojena korišćenjem standardnih protokola Applied Biosvstems Inc. Synth Assist™ 1.0.0 ili Synth Assist™ 2.0.2. Svako kuplovanje može biti izvedeno u toku 2x30 min. sa HBTU (2-(lH-benzatriazol-l-il)-l,l,3,3-tetrametiluronijum heksafluorofosfat) i HOBt (1-hidroksibenzotriazol).
Smola može biti HMP smola (p-hidroksimetil fenoksimetil)polistiren smola ili PAL (Milligen/Biosearch), koja je umrežena polistirenska smola sa 5-(4'-fmoc-aminometil-3,5'-dimetiloksifenoksi)valerijanskom kiselinom kao linkerom. Upotreba PAL smole dovodi do karboksilnog terminala u obliku amida posle cepanja peptida sa smole. Posle cepanja, HMP smola proizvodi karboksilni kiselinski ostatak na C-kraju krajnjeg proizvoda. Većina reagenasa, smola, i zaštićenih aminokiselina (slobodnih ili na smoli) može biti nabavljeno od Millipore ili Applied Biosystems Inc.
Fmoc grupa može biti korišćena za amino zaštitu u toku postupka kuplovanja. Zaštita primarnog amina na aminokiselinama može se postići sa Fmoc i grupama za zaštitu sporednih lanaca kao što je t-butil za serin, tirozin, glutaminsku kiselinu i treonin; tritil za glutamin; Pmc (2,2,5,7,8-pentametilhroman-6-sulfonil) za arginin; N-t-butiloksikarbonil za triptofan; N-tritil za histidin i S-tritil za cistein.
Uklanjanje peptidnog jedinjenja sa smole i simultano skidanje zaštite sa grupa sporednog lanca može se postići tretiranjem sa reagensom K ili njihovim blagim modifikacijama. Alternativno, u sintezi ovih peptida, sa amidovanog karboksilnog kraja, potpuno sklopljen peptid može biti cepan sa smešom 90% trifluorosirćetne kiseline, 5% etanditiolne kiseline i 5% vode inicijalno na 4°C i postepeno povećavanjem sobne temperature. Peptidna jedinjenja sa kojih je skinuta zaštita mogu biti staložena sa dietil etrom, Prečišćavanje može biti preparativnom, sa reverznom fazom, visoko efikasnom tečnom hromatografijom na koloni od silika gela sa vezanim Ci8sa gradijentom acetonitril/voda u 0.1% trifluorosirćetnoj kiselini. Homogena peptidna jedinjenja mogu biti karakterisana sa Fast Atom Bombardment masenom spektrometrijom ili masenom spektrometrijom u elektrospreju i kada je to moguće i analizom aminokiselina.
U poželjnom izvođenju, peptidna jedinjenja prema ovom pronalasku su dimerizovana korišćenjem standardnih sintetskih postupaka poznatih i korišćenih od strane ljudi iz struke. Prateći ove sintetske šeme, ljudi iz struke će lako pripremiti dimerno peptidno jedinjenje u saglasnosti sa prikazanim pronalaskom. Pored toga, očigledno je za ljude iz struke da dimerne podjedinice mogu lako biti vezane korišćenjem poznatih metodologija ili linkera.
PRIMER 2
Pegilacija peptidnih jedinjenja
Pegilacija peptidnih jedinjenja prema prikazanom pronalasku može se izvesti dobro poznatim tehnikama. Na primer, peptidna jedinjenja prema pronalasku mogu biti rastvorena u 100 mM bicinu pH 8.0 pri koncentraciji od 10 mg/ml, dodati u 1.25 molarni višak sprašenog PEG2 (komercijalno dostupnog iz Sheanvater Polvmers, Inc. (Huntsville, Ala.)) i mešani na sobnoj temperaturi do završetka reakcije, tipično 1-2 sata. Reakcija je praćena sa HPLC sa reverznom fazom korišćenjem 40-65% gradijenta acetonitrila sa YMC ODS AQ kolonom. Kada je reakcija završena, rastvor je dodat na drugi molarni višak 1.25 sprašenog PEG2 i postupak je ponovljen 4 puta koristeći ukupno 5 mola PEG2 za svaki mol polipetida. Rastvor je razblažen 2 puta sa PBS da bi se smanjila viskoznost i nanet je na superdeks 200 kolonu (Pharmacia), prethodno uravnoteženu i eluiranu sa PBS. Frakcije sa kolone za eksluziju po veličini mogu biti analizirane sa HPLC sa reverznom fazom. Frakcije koje sadže di-PEG peptidne jedinjenja koja se eluiraju pre bilo kog mono-PEGpeptidnog jedinjenja mogu biti sakupljene i čuvanje na 5°C ili liofilizirane.
Mada samo poželjna izvođenja pronalaska su gore specifično opisana, podrazumeva se da modifikacije i varijacije pronalaska su moguće bez odstupanja od suštine i nameravnog obima pronalaska.

Claims (66)

1. Peptidno jedinjenje koje se vezuje za receptor trombopoietina, naznačeno time, što pomenuto peptidno jedinjenje se satoji od (H-IEGPTLRQ(2Nal)LAARX10)2K-NH2, gde Xi0 je izabran iz grupe koju čine sarkozin ili [3-alanin.
2. Peptidno jedinjenje prema zahtevu 1, naznačeno time, što pomenuto peptidno jedinjenje je kovalentno vezano za hidrofilni polimer.
3. Peptidno jedinjenje prema zahtevu 2, naznačeno time, što pomenuti hidrofilni polimer je prosečne molekulske mase između oko 500 do oko 40,000 daltona.
4. Peptidno jedinjenje prema zahtevu 2, naznačeno time, što pomenuti hidrofilni polimer ima prosečnu molekulsku masu između oko 5,000 do oko 20,000 daltona.
5. Peptidno jedinjenje prema zahtevu 2, naznačeno time, što pomenuti polimer je izabran iz grupe koja se sastoji od polietilen glikola, polipropilen glikola, polimlečne kiseline i poliglikolne kiseline.
6. Peptidno jedinjenje prema zahtevu 5, naznačeno time, što pomenuto peptidno jedinjenje je kovalentno vezano za polietilen glikol.
7. Peptidno jedinjenje prema zahtevu 1, naznačeno time, što svaka dimerna podjedinica pomenutog peptidnog jedinjenja je kovalentno vezana za hidrofilni polimer.
8. Farmaceutska kompozicija, naznačena time, što sadrži peptidno jedinjenje prema zahtevu 1 u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim nosačem.
9. Postupak tretiranja pacijenta koji pati od poremećaja koji je osetljiv na lečenje sa agonistom trombopoietina, naznačen time, što se sastoji od davanja pacijentu terapeutski efikasne doze ili količine peptidnog jedinjenja prema zahtevu 1.
10.Fiziološki aktivna, suštinski neimunogena vodorastvorna polipeptidna kompozicija, naznačena time, što se sastoji od peptidnog jedinjenja prema zahtevu 1, kupiovanog sa sredstvom za kuplovanje za bar jednan polimer koji ima molekulsku težinu koja je između oko 500 do oko 20,000 daltona izabrana iz grupe koju čine polietilen glikol i polipropilen glikol, gde pomenuti polimer je nesupstituisan ili supstituisan sa alkoksi ili alkil grupama, pomenuti alkoksi ili alkil grupe poseduju manje od 5 ugljenikovih atoma.
11 .Polipetidna kompozicija prema zahtevu 10, naznačena time, što pomenuti polimer ima molekulsku težinu od oko 750 do oko 15,000 daltona.
12. Polipeptidna kompozicija prema zahtevu 10, naznačena time, što pomenuti polimer ima molekulsku težinu od oko 5,000 do oko 10,000 daltona.
13. Polipetidna kompozicija prema zahtevu 10, naznačena time, što pomenuti polimer je polietilen glikol.
14.Suštinski neimunogena vodrorastvorna polipeptidna kompozicija, naznačena time, što sadrži peptidno jedinjenje prema zahtevu 10 i farmaceutski prihvatljiv nosač.
15. Postupak aktiviranja receptora trombopoietina u ćeliji, naznačen time, što se sastoji od dovođenja u kontakt pomenute ćelije sa efikasnom količinom peptidnog jedinjenja koje uključuju (H-IEGPTLRQ(2-Nal)LAARXio)2K-NH2, gde X]0 je izabran iz grupe koja se sastoji od sarkozina ili<p->alanina.
16. Postupak prema zahtevu 15, naznačen time, što pomenute ćelije sadrže humane magekariocite, krvne pločice ili CD34+ ćelije.
17. Postupak prema zahtevu 15, naznačen time, što pomenute ćelije sadrže TPO-zavisne ćelije.
18. Postupak tretiranja trombocitopenije kod subjekta, naznačen time, što se sastoji od: (a) dobijanja populacije ćelija pomenutog subjekta koje čine ćelije prekusora megakariocita; (b) tretiranja pomenutih ćelija prema postupku zahteva 15; i (c) davanja pomenutih tretiranih ćelija pomenutom subjektu, da bi se povećao broj megakariocita prisutan u pomenutom subjektu u poređenju sa onim koji bi se javio bez takvog tretmana.
19. Postupak prema zahtevu 18, naznačen time, što pomenuta trombocitopenija je posledica hemoterapije.
20. Postupak prema zahtevu 19, naznačen time, što pomenuta populacija ćelija je dobijena pre pomenute hemoterapije.
21. Postupak prema zahtevu 18, naznačen time, što pomenuta trombocitopenija je posledica terapije zračenja.
22. Postupak prema zahtevu 19, naznačen time, što pomenuta populacija ćelija je dobijena pre pomenute terapije zračenja.
23. Postupak tretiranja pacijenta koji pati od trombocitopenije, naznačen time, što se sastoji od davanja pomenutom pacijentu terapeutski efikasne doze peptidnog jedinjenja koje obuhvata (H-IEGPTLRQ(2-Nal)LAARXi0)2K-NH2, gde Xi0 je izabran iz grupe koju čine sarkozin ili P-alanin.
24. Postupak prema zahtevu 23, naznačen time, što pomenuta trombocitopenija je posledica hemoterapije ili terapije zračenja.
25. Postupak prema zahtevu 24, naznačen time, što antagonist TPO je davan pomenutom pacijentu pre pomenute hemoterapije ili terapije zračenja.
26. Postupak prema zahtevu 23, naznačen time, što pomenuta trombocitopenija je posledica transfuzije koštane srži.
27. Postupak profilaktičkog tretiranja pacijenta koji je u opasnosti od trombocitopenije, naznačen time, što se sastoji od davanja pomenutom pacijentu profilaktički efiksane količine peptidnog jedinjenja koje obuhvata (H-IEGPTLRQ(2Nal)LAARX10)2K-NH2;gde X10je izabran iz grupe koju čine sarkozin ili (3-alanin.
28. Postupak prema zahtevu 27, naznačen time, što pomenuto jedinjenje je davano pre transpantacije koštane srži, hemoterapije ili terapije zračenja.
29. Peptidno jedinjenje koje se veže za receptor trombopoietina, naznačeno time, što pomenuto peptidno jedinjenje ima: (1) molekulsku masu manju od oko 8000 daltona, i (2) afinitet vezivanja za receptor trombopoietina izražen sa IC50koji nije viši od oko 100 uM, gde pomenuto peptidno jedinjenje sadrži sledeće sekvence aminokiselina: X9Xg G Xi X2X3X4X5Xg X7gde X9 je A, C, E, G, I, L, M, P, R, Q, S, T ili V; X8 je A, C, D, E, K, L, Q, R, S, T ili V; X, je C, L, M, P, Q, V; X2 je F, K, L, N, Q, R, S, T ili V; X3 je C, F, I, L, M, R, S, V ili W; X4 je bilo koja od 20 genetski kodiranih L-aminokiselina; X5je A, D, E, G, K, M, Q, R, S, T, V ili Y; X7 je C, G, I, K, L, M, N, R ili V, i X6 je f3-(2-naftil)alanin.
30. Peptidno jedinjenje prema zahtevu 29, naznačen time, što pomenuta sekvenca aminokiselina je ciklizirana.
31. Peptidno jedinjenje prema zahtevu 29, naznačeno time, što je pomenuta sekvenca aminokiselina je dimerizovana.
32. Postupak aktiviranja receptora trombopoietina u ćeliji, naznačen time, što obuhvata dovođenje u kontakt pomenute ćelije sa efikasnom količinom peptida koji ima molekulsku masu manju od oko 8000 daltona, pomenuti peptid se sastoji od sledeće sekvence aminokiselina: X9X8 G X]X2X3X4XjXg X7gde X9 je A, C, E, G, I, L, M, P, R, Q, S, T ili V; X8je A, C, D, E, K, L, Q, R, S, T ili V; X, je C, L, M, P, Q, V; X2 je F, K, L, N, Q, R, S, T ili V; X3je C, F, I, L, M, R, S, V ili W; X4je bilo koja od 20 genetski kodiranih L-aminokiselina; X5je A, D, E, G, K, M, Q, R, S, T, V ili Y; X7 je C, G, I, K, L, M, N, R ili V, i X6 je (3-(2-naftil)alanin.
33. Peptidno jedinjenje prema zahtevu 32, naznačeno time, što pomenuta sekvenca aminokiselina je ciklizirana.
34. Peptidno jedinjenje prema zahtevu 32, naznačeno time, što pomenuta sekvenca aminokiselina je dimerizovana.
35. Postupak aktiviranja receptora trombopoietina u ćeliji, naznačen time, što obuhvata dovođenje u kontakt pomenute ćelije sa efikasnom količinom peptidnog jedinjenja kovalentno vezanog za hidrofilni polimer, pomenuto peptidno jeidnjenje sadrži aminokiselinsku sekvencu I E G P T L R Q (2-Nal) L A A R (Sar).
36. Postupak prema zahtevu 35, naznačen time, što pomenuti hidrofilni polimer ima prosečnu molekulsku težinu između oko 500 do oko 40,000 daltona.
37. Postupak prema zahtevu 35, naznačen time, što pomenuti hidrofilni polimer ima prosečnu molekulsku težinu koja je između oko 5,000 do oko 20,000 daltona.
38. Postupak prema zahtevu 35, naznačen time, što pomenuti polimer je izabran iz grupe koju čine polietilenglikol, polipropilen glikol, polimlečna kiselina i poliglikolna kiselina.
39. Postupak prema zahtevu 38, naznačen time, što pomenuto peptidno jedinejnje je kovalentno vezano za polietilen glikol.
40. Postupak prema zahtevu 35, naznačen time, što pomenute ćelije su in vivo.
41. Postupak prema zahtevu 35, naznačen time, što pomenute ćelije su in vitro.
42. Postupak prema zahtevu 35, naznačen time, što pomenute ćelije sadrže humane magakariocite, krvne pločice ili CD34+ ćelije.
43. Postupak prema zahtevu 35, naznačen time, što pomenute ćelije sadrže TPO-zavisne ćelije.
44. Postupak lečenja trombocitopenije kod subjekta, naznačen time, što obuhvata: (a) dobijanje populacije ćelija pomenutog subjekta koje sadrže ćelije prekusora megakariocita; (b) tretiranje pomenutih ćelija prema postupku iz zahteva 35; i (c) davanje pomenutih tretiranih ćelija pomenutom subjektu, da poveća broj megakariocita prisutnih kod subjekta u poređenju sa onim koji bi se javio bez tretmana.
45. Postupak prema zahtevu 44, naznačen time, što pomenuta trombocitopenija je usled hemoterapije.
46. Postupak prema zahtevu 45, naznačen time, što pomenuta populacija ćelija je dobijena pre pomenute hemoterapije.
47. Postupak prema zahtevu 44, naznačen time, što pomenuta trombocitopenija je usled terapije zračenja.
48. Postupak prema zahtevu 47, naznačen time, što pomenuta populacija ćelija je dobijena pre terapije zračenja.
49. Peptidno jedinjenje prema zahtevu 29, naznačeno time, što peptidno jedinjenje sadrži sledeću aminokiselinsku sekvencu IEGPTLRQ (2-Nal) L A A R (Sar).
50. Peptidno jedinjenje koje se vezuje za receptor trombopoietina, naznačeno time, što pomenuto peptidno jedinjenje se sastoji od (H-IEGPTLRQ(2-Nal)LAAR(Sar))2K-NH2.
51. Peptidno jedinjenje prema zahtevu 50, naznačeno time, što pomenuto peptidno jedinjenje je kovalentno vezano za polimer.
52. Peptidno jedinjenje prema zahtevu 51, naznačeno time, što pomenuti hidrofilni polimer je izabran iz grupe koju čine polietilen glikol, polipropilen glikol, polimlečna kiselina i poliglikolna kiselina.
53. Peptidno jedinjenje prema zahtevu 52, naznačeno time, što pomenuto peptidno jedinjenje je kovalentno vezano za polietilen glikol.
54. Peptidno jedinjenje prema zahtevu 53, naznačeno time, što pomenuti polietilen glikol ima prosečnu molekulsku težinu koja između oko 5,000 do 20,000 daltona.
55. Peptidno jedinjenje prema zahtevu 53, naznačeno time, što polietilen glikol je izabran iz grupe koju čine monometoksipolietilen glikol (MePEG-OH), monometoksipolietilen glikol-sukcinat (MePEG-S), monometoksipolietilen glikol-sukcinimidil sukcinat (MePEG-S-NHS), monometoksipolietilen glikol-amin (MePEG-NH2), monometoksipolietilen glikol-trezilat (MePEG-TRES) i monometoksipolietilen glikol-imidazolil-karbonil (MePEG-IM).
56. Peptidno jedinjenje koje se veže za trombopoietinski receptor, naznačeno time, što ima sledeću formulu: gde (2-Nal) je P-(2-naftil)alanin i (Sar) je sarkozin.
57. Peptidno jedinjenje prema zahtevu 56, naznačeno time, što pomenuto peptidno jedinjenje je kovalentno vezano za hidrofilni polimer.
58. Peptidno jedinjenje prema zahtevu 57, naznačeno time, što pomenuti hidrofilni polimer je izabran iz grupe koju čine polietilen glikol, polipropilen glikol, polimlečna kiselina i poliglikolna kiselina.
59. Peptidno jedinjenje prema zahtevu 57, naznačeno time, što pomenuto peptidno jedinjenje je kovalentno vezano za polietilen glikol.
60. Peptidno jedinjenje prema zahtevu 59, naznačeno time, što pomenuti poletilen glikol ima prosečnu molekulsku težinu između oko 5,000 do oko 20,000 daltona.
61. Peptidno jedinjenje prema zahtevu 59, naznačeno time, što polietilen glikol je izabran iz grupe koju sadrže monometoksipolietilen glikol (MePEG-OH), monometoksipolietilen glikol-sukcinat (MePEG-S), monometoksipolietilen glikol-sukcinimidil sukcinat (MePEG-S-NHS), monometoksipolietilen glikol-amin (MePEG-NH2), monometoksipolietilen glikol-trezilat (MePEG-TRES) i monometoksipolietilen glikol-imidazolil-karbonil (MePEG-IM).
62. Peptidno jedinjenje prema zahtevu 56, naznačeno time, što svaka od dimernih podjedinica pomenutog peptidnog jedinjenja je kovalentno vezana za hidrofilni polimer.
63. Peptidno jedinjenje prema zahtevu 62, naznačena time, što pomenuti hidrofilni polimer je izabran iz grupe koja se sastoji od polietlen glikola, polipropilen glikola, polimlečne kiseline i poliglikolne kiseline.
64. Peptidno jedinjenje prema zahtevu 63, naznačen time, što pomenuto peptidno jedinjenje je kovalentno vezano za polietilenglikol.
65. Peptidno jedinjenje prema zahtevu 64, naznačen time, što pomenuti poletilen glikol ima prosečnu molekulsku težinu od između oko 5,000 do oko 20,000 daltona.
66.Peptidno jedinjenje prema zahtevu 65, naznačeno time, što polietilen glikol je izabran iz grupe koju čine monometoksipolietilen glikol (MePEG-OH), monometoksipolietilen glikol-sukcinat (MePEG-S), monometoksipolietilen glikol-sukcinimidil sukcinat (MePEG-S-NHS), monometoksipolietilen glikol-amin (MePEG-NH2), monometoksipolietilen glikol-trezilat (MePEG-TRES) i monometoksipolietilen glikol-imidazolil-karbonil (MePEG-IM).
YUP-2006/0141A 2003-08-28 2004-08-13 Peptidi i jedinjenja koja se vežu za receptor RS20060141A (sr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US49874003P 2003-08-28 2003-08-28
PCT/US2004/026422 WO2005023834A2 (en) 2003-08-28 2004-08-13 Peptides and compounds that bind to thrombopoietin receptors

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS20060141A true RS20060141A (sr) 2008-08-07

Family

ID=34272720

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
YU20060141A RS56387B1 (sr) 2003-08-28 2004-08-13 Peptidi i jedinjenja koja se vežu za trombopoetinski receptor
YUP-2006/0141A RS20060141A (sr) 2003-08-28 2004-08-13 Peptidi i jedinjenja koja se vežu za receptor

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
YU20060141A RS56387B1 (sr) 2003-08-28 2004-08-13 Peptidi i jedinjenja koja se vežu za trombopoetinski receptor

Country Status (32)

Country Link
US (1) US7576056B2 (sr)
EP (1) EP1675606B1 (sr)
JP (1) JP4848277B2 (sr)
KR (2) KR101183875B1 (sr)
CN (2) CN102241742B (sr)
AR (1) AR045530A1 (sr)
AU (1) AU2004270656B2 (sr)
BR (1) BRPI0414008B8 (sr)
CA (1) CA2537421C (sr)
CY (1) CY1118965T1 (sr)
DK (1) DK1675606T3 (sr)
EA (1) EA009286B1 (sr)
EC (1) ECSP066396A (sr)
ES (1) ES2626107T3 (sr)
HR (1) HRP20170810T1 (sr)
HU (1) HUE032370T2 (sr)
IL (1) IL173965A (sr)
IS (1) IS8300A (sr)
LT (1) LT1675606T (sr)
ME (1) ME00313B (sr)
MX (1) MXPA06002292A (sr)
NO (1) NO344233B1 (sr)
NZ (1) NZ545455A (sr)
PL (1) PL1675606T3 (sr)
PT (1) PT1675606T (sr)
RS (2) RS56387B1 (sr)
SG (1) SG131110A1 (sr)
SI (1) SI1675606T1 (sr)
TW (1) TWI348375B (sr)
UA (1) UA82710C2 (sr)
WO (1) WO2005023834A2 (sr)
ZA (1) ZA200602495B (sr)

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7091311B2 (en) * 1996-06-07 2006-08-15 Smithkline Beecham Corporation Peptides and compounds that bind to a receptor
DK2319928T3 (da) 1998-10-23 2013-06-24 Kirin Amgen Inc Dimere trombopoietiske peptidomimetika, der binder til MPL-receptor og har trombopoietisk aktivitet
MXPA05003057A (es) * 2002-09-18 2006-04-18 Johnson & Johnson Metodos para aumentar la produccion de celulas madre hematopoyeticas y plaquetas.
US20040149235A1 (en) * 2002-10-04 2004-08-05 Pogue Albert S. Apparatus and method for removal of waste from animal production facilities
RS56387B1 (sr) 2003-08-28 2017-12-29 Ortho Mcneil Pharm Inc Peptidi i jedinjenja koja se vežu za trombopoetinski receptor
US7723295B2 (en) * 2003-08-28 2010-05-25 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Peptides and compounds that bind to a receptor
US7615533B2 (en) 2004-08-16 2009-11-10 Janssen Pharmaceutica N.V. TPO peptide compounds for treatment of anemia
EP1986677A2 (en) * 2006-01-25 2008-11-05 Amgen Inc. Thrombopoietic compounds
AR059573A1 (es) * 2006-02-14 2008-04-16 Janssen Pharmaceutica Nv Uso de compuestos peptidicos de tpo y composiciones farmaceuticas en el tratamiento de la anemia
PT1984014E (pt) * 2006-02-14 2014-11-13 Janssen Pharmaceutica Nv Utilização de compostos de péptidos tpo e composições farmacêuticas no tratamento da anemia
US7981425B2 (en) 2006-06-19 2011-07-19 Amgen Inc. Thrombopoietic compounds
US20090311344A1 (en) * 2008-06-03 2009-12-17 Yurkow Edward J Dosing Regimen
JP5709113B2 (ja) 2011-06-23 2015-04-30 株式会社島津製作所 分岐型両親媒性ブロックポリマー、それを用いた分子集合体及び薬剤搬送システム
KR102688415B1 (ko) 2017-07-26 2024-07-24 잔센파마슈티카엔.브이. 표적화된 방사선 치료요법에 의해 유도된 혈관 무결성을 보호하는 조성물
JP2022523663A (ja) 2019-01-25 2022-04-26 ヤンセン ファーマシューティカ エヌ．ベー． 放射線処置および／または放射線模倣剤処置を伴う、肝損傷を緩和し、肝臓の肥厚、再生、および細胞の生着を促進するための方法
MX2021008928A (es) 2019-01-25 2021-11-04 Janssen Pharmaceutica Nv Métodos para mejorar la protección contra lesiones vasculares y de organos, la recuperación hematopoyética y la supervivencia en respuesta a la radiacion corporal total/exposicion química.
US11273203B2 (en) 2019-01-25 2022-03-15 Janssen Pharmaceutica Nv Methods of mitigating toxic effects of vesicants and caustic gas
WO2023056444A1 (en) 2021-10-01 2023-04-06 Janssen Pharmaceutica N.V. Methods of increasing progenitor cell production
WO2024095178A1 (en) 2022-11-01 2024-05-10 Janssen Pharmaceutica Nv Thrombopoietin mimetic for use in the treatment of acute liver failure

Family Cites Families (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5143854A (en) 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
US5326558A (en) 1989-08-08 1994-07-05 Genetics Institute, Inc. Megakaryocytopoietic factor
IL96477A0 (en) 1989-12-01 1991-08-16 Amgen Inc Megakaryocyte production
DK167813B1 (da) 1989-12-07 1993-12-20 Carlbiotech Ltd As Pentapeptidderivat, farmaceutisk acceptable salte heraf, fremgangsmaade til fremstilling deraf og farmaceutisk praeparat indeholdende et saadant derivat
US5571508A (en) 1989-12-18 1996-11-05 Amrad Corporation Limited Method for the treatment of thrombocytopenia and pharmaceutical compositions useful therefor
IT1241395B (it) 1990-04-02 1994-01-10 Eniricerche Spa Composti immunogenici,il procedimento per la loro sintesi e loro impiego per la preparazione di vaccini antimalaria
US5141851A (en) 1990-04-18 1992-08-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Isolated farnesyl protein transferase enzyme
US5250732A (en) 1991-07-18 1993-10-05 Genentech, Inc. Ketamine analogues for treatment of thrombocytopenia
US5270170A (en) 1991-10-16 1993-12-14 Affymax Technologies N.V. Peptide library and screening method
WO1993025221A1 (en) 1992-06-11 1993-12-23 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Erythropoietin drug delivery system
EP0673387B1 (en) 1992-12-11 1999-09-22 University Of Florida Materials and methods for control of pests
AU8124694A (en) 1993-10-29 1995-05-22 Affymax Technologies N.V. In vitro peptide and antibody display libraries
SG47030A1 (en) 1994-01-03 1998-03-20 Genentech Inc Thrombopoietin
WO1995021919A2 (en) 1994-02-14 1995-08-17 Kirin Brewery Company, Limited Protein having tpo activity
AU691828B2 (en) 1994-02-14 1998-05-28 University Of Washington Hematopoietic protein and materials and methods for making it
SG79882A1 (en) 1994-02-14 2001-04-17 Kirin Brewery Protein having tpo activity
CA2169173C (en) 1994-02-14 2002-10-15 Kenneth Kaushansky Methods for stimulating erythropoiesis using thrombopoietin
US5766581A (en) 1994-03-31 1998-06-16 Amgen Inc. Method for treating mammals with monopegylated proteins that stimulates megakaryocyte growth and differentiation
US5571686A (en) 1994-04-14 1996-11-05 Massachusetts Institute Of Technology Method of using megapoietin for prolonging the survival & viability of platlets
WO1996014293A1 (en) * 1994-11-04 1996-05-17 Santen Pharmaceutical Co., Ltd. Novel 1,3-dialkylurea derivative having hydroxyl group
AU4163196A (en) 1994-11-30 1996-06-19 Zymogenetics Inc. Low molecular weight thrombopoietin
US5641655A (en) 1994-11-30 1997-06-24 Zymogenetics, Inc. Methods for producing thrombopoietin polypeptides using a mammalian tissue plasminogen activator secretory peptide
DE69636714T2 (de) 1995-04-26 2007-10-18 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. G-CSF TPO Fusionsproteine
US6251864B1 (en) * 1995-06-07 2001-06-26 Glaxo Group Limited Peptides and compounds that bind to a receptor
US5869451A (en) * 1995-06-07 1999-02-09 Glaxo Group Limited Peptides and compounds that bind to a receptor
ES2303338T3 (es) * 1995-06-07 2008-08-01 Glaxo Group Limited Peptidos y compuestos que se unen a un receptor de trombopoyetina.
US6060052A (en) 1995-10-30 2000-05-09 Systemix, Inc. Methods for use of Mpl ligands with primitive human hematopoietic stem cells
US5932546A (en) 1996-10-04 1999-08-03 Glaxo Wellcome Inc. Peptides and compounds that bind to the thrombopoietin receptor
DE60032783T2 (de) 1999-09-24 2007-12-06 Smithkline Beecham Corp. Thrombopoietinmimetika
DE60123115T2 (de) * 2000-12-22 2007-03-29 Ipsen Manufacturing Ireland Ltd. Verfahren für die synthese eines lhrh peptides
AU2002307062A1 (en) 2001-04-02 2002-10-15 Purdue Pharma L.P. Thrombopoietin (tpo) synthebody for stimulation of platelet production
MXPA05003057A (es) * 2002-09-18 2006-04-18 Johnson & Johnson Metodos para aumentar la produccion de celulas madre hematopoyeticas y plaquetas.
RS56387B1 (sr) 2003-08-28 2017-12-29 Ortho Mcneil Pharm Inc Peptidi i jedinjenja koja se vežu za trombopoetinski receptor

Also Published As

Publication number Publication date
JP4848277B2 (ja) 2011-12-28
WO2005023834A3 (en) 2005-05-06
KR101183875B1 (ko) 2012-09-27
BRPI0414008B1 (pt) 2018-05-15
NZ545455A (en) 2009-02-28
MEP48508A (en) 2011-02-10
BRPI0414008A (pt) 2006-10-24
US20050137133A1 (en) 2005-06-23
ME00313B (me) 2011-05-10
UA82710C2 (uk) 2008-05-12
AR045530A1 (es) 2005-11-02
CN1871022B (zh) 2011-07-06
ES2626107T3 (es) 2017-07-24
CY1118965T1 (el) 2018-01-10
EA009286B1 (ru) 2007-12-28
SI1675606T1 (sl) 2017-07-31
RS56387B1 (sr) 2017-12-29
PL1675606T3 (pl) 2017-08-31
EP1675606B1 (en) 2017-04-05
CA2537421C (en) 2011-09-27
CN102241742A (zh) 2011-11-16
AU2004270656B2 (en) 2011-03-10
AU2004270656A1 (en) 2005-03-17
DK1675606T3 (en) 2017-06-19
EP1675606A4 (en) 2009-09-30
IL173965A (en) 2015-10-29
IL173965A0 (en) 2006-07-05
CN1871022A (zh) 2006-11-29
NO20061346L (no) 2006-05-22
IS8300A (is) 2006-02-14
HUE032370T2 (en) 2017-09-28
CN102241742B (zh) 2014-04-02
BRPI0414008B8 (pt) 2021-05-25
KR20120078742A (ko) 2012-07-10
CA2537421A1 (en) 2005-03-17
US7576056B2 (en) 2009-08-18
ZA200602495B (en) 2007-06-27
EP1675606A2 (en) 2006-07-05
KR20070017942A (ko) 2007-02-13
MXPA06002292A (es) 2006-09-04
HRP20170810T1 (hr) 2017-08-11
SG131110A1 (en) 2007-04-26
EA200600477A1 (ru) 2007-02-27
JP2007504132A (ja) 2007-03-01
TW200517103A (en) 2005-06-01
TWI348375B (en) 2011-09-11
LT1675606T (lt) 2017-11-10
NO344233B1 (no) 2019-10-14
PT1675606T (pt) 2017-05-22
HK1096873A1 (en) 2007-06-15
ECSP066396A (es) 2006-08-30
WO2005023834A2 (en) 2005-03-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6251864B1 (en) Peptides and compounds that bind to a receptor
US5869451A (en) Peptides and compounds that bind to a receptor
CA2537421C (en) Peptides and compounds that bind to thrombopoietin receptor
NO344405B1 (no) Peptidforbindelse som binder til TPO reseptor for terapeutisk behandling av blodplateforstyrrelse eller trombocytopeni hos mennesker
HK1123811B (en) Use of peptides that bind to tpo receptor
HK1163698B (en) Peptides and compounds that bind to a receptor
HK1163698A (en) Peptides and compounds that bind to a receptor
HK1096873B (en) Peptides and compounds that bind to thrombopoietin receptors