RS20060255A - Test za brzo dijagnostikovanje alchajmerove bolesti - Google Patents

Test za brzo dijagnostikovanje alchajmerove bolesti

Info

Publication number
RS20060255A
RS20060255A YUP-2006/0255A YUP20060255A RS20060255A RS 20060255 A RS20060255 A RS 20060255A YU P20060255 A YUP20060255 A YU P20060255A RS 20060255 A RS20060255 A RS 20060255A
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
disease
cells
stimulation
alzheimer
surface markers
Prior art date
Application number
YUP-2006/0255A
Other languages
English (en)
Inventor
Thomas Arendt
Jens Stieler
Original Assignee
Universitat Leipzig,
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Universitat Leipzig, filed Critical Universitat Leipzig,
Publication of RS20060255A publication Critical patent/RS20060255A/sr

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5047—Cells of the immune system
    • G01N33/505—Cells of the immune system involving T-cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70503—Immunoglobulin superfamily, e.g. VCAMs, PECAM, LFA-3
    • G01N2333/70514—CD4
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70503—Immunoglobulin superfamily, e.g. VCAMs, PECAM, LFA-3
    • G01N2333/70517—CD8
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/7056—Selectin superfamily, e.g. LAM-1, GlyCAM, ELAM-1, PADGEM
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2814—Dementia; Cognitive disorders
    • G01N2800/2821—Alzheimer

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)

Abstract

Dati pronalazak odnosi se na postupak za postavljanje dijagnoze za Alchajmerovu bolest ili početnu fazu bolesti ili predispozicije za ovo oboljenje, gde se postupak zasniva na kvantifikaciji mitogenski izraženih površinskih markera, po mogućstvu CD69, i periferno pristupačnih ćelija, kao što su na primer, ćelije kože ili limfocita, (a) pre i (b) nakon mitogene stimulacije, gde specifični indeks stimulacije a: b predstavlja znak prisustva Alchajmerove bolesti ili rane faze iste ili predispozicije za ovo oboljenje. Dati pronalazak se takodje odnosi na kitove pogodne za izvodjenje dijagnostičkih postupaka prema pronalasku

Description

TEST ZA BRZO DIJAGNOSTIFIKOVANJE ALCHAJMEROVE BOLESTI
Dati pronalazak odnosi se na postupak za postavljanje dijagnoze za Alchajmerovu bolest ili početnu fazu bolesti ili predispozicije za ovo oboljenje, gde se postupak zasniva na kvantifikaciji mitogenski izraženih površinskih markera, po mogućstvu CD69, periferno pristupačnih ćelija, na primer, ćelija kože ili limfocita, (a) pre i (b) nakon mitogene stimulacije, gde specijalni indeks stimulacije a: b predstavlja znak prisustva Alchajmerove bolesti ili njene rane faze ili predispozicije za ovo oboljenje. Dati pronalazak se takodje odnosi na kitove pogodne za izvodjenje dijagnostičkih postupaka prema pronalasku.
Alchajmerova bolest ne može da bude dijagnostifikovana sa najvećom mogućom izvesnošću kliničkim sredstvima i dostupnim parakliničkim postupcima i postupcima koji se zasnivaju na aparatima i tehnologijama kao takvim. Dijagnostička diferencijacija u pogledu ostalih uzroka demencije često je veoma teška, posebno u ranijim fazama bolesti. U tim veoma ranim fazama bolesti, medjutim, postavljanje pouzdane dijagnoze je značajno iz dva razloga. Sa jedne strane, to dozvoljava dijagnostičku diferencijaciju potencijalno izlečivih oblika demencije, što omogućava da oni budu podvrgnuti efikasnom tretmanu, a sa druge strane, to je preventiva za bilo koji oblik terapeutske intervencije u neurodegenerativom procesu Alchajmerove bolesti, koja može da bude uspešni samo u ovim ranijim fazama bolesti. Takva dijagnostička izvesnost, može da bude potvrdjena biomarkerima za utvrdjivanje Alchajmerove bolesti, tj. primenom lako odredivih bioloških promena sa osetljivošću i specifičnošću koja je adekvatna ovom oboljenju.
Biomarkeri za Alchajmerovu bolest stoga imaju značaj prilikom odredjivanja dijagnoze i naročito pomažu kod pouzdane identifikacije rizičnih grupa i pacijenata u predkliničkom stanju i ranim kliničkim fazama oboljenja. Biomarkeri takodje služe i kod daljih ispitivanja i samim tim utiču na odredjivanje prognoze i kontrole odgovora na terapeutske intervencije. Modeli biomarkera trebalo bi da budu uskladjeni sa izvesnim teorijskim i praktičnim zahtevima. Oni naročito treba da budu visoko specifični i osetljivi, da imaju sposobnost da identifikuju predklinička stanja, i da imaju visoko pozitivnu i negativnu prognostičku vrednost. Ukoliko je moguće, biomarkeri mogu da se odredjuju na neinvazivni način i da ne predstavljaju teret niti da izazovu strah kod pacijenta. Ukoliko je moguće, analize ne treba da budu skupe i treba da budu prilagodjene tako da ih lako može koristiti i porodični lekar. Nažalost, nijedan od do sada poznatih biomarkera za Alchajmeorvu bolest ne ispunjava pomenute zahteve. Naročito zbog niskog stepena osetljivosti i specifičnosti poznatih biomarkera, oni nisu pogodni za upotrebu kao dijagnostička sredstva. Ostala dijagnostička ispitivanja imaju veće zahteve po pitanju osetljivosti i specifičnosti za komplikovane tehničke predradnje i stoga nisu pogodna za lokalnu upotrebu sa glavnom grupom pacijenata.
Stoga se pronalazak suštinski zasniva na tehničkom problemu obezbedjivanja jednostavnog postupka za dijagnozu Alchajmerove bolesti, koja dozvoljava postavljanje dijagnoze za Alchajmerovu bolest, otkrivanje prekliničkih faza bolesti i dijagnostičku diferencijaciju Alchajmerove bolesti u odnosu na ostale demencije sa adekvatnom osetljivošču i specifičnošću.
Rešenje tehničkog problema je nadjeno u obezbedjivanju izvodjenja iz pronalaska koji su okarakterisani patentnim zahtevima.
Moguće je da se razvije dijagnostički postupak koji se zasniva na odredjivanju mitogenskog indeksa (aktivacionog indeksa) korišćenjem periferno pristupačnih ćelija pacijenata, kao što su ćelije kože ili ćelije limfocita u krvi, sa ili bez mitogene stimulacije, na primer, nakon imunomagnetnog odvajanja ćelije. Aktivacija tih ćelija praćena je predstavljanjem aktiviranih markera na površini koji se mogu kvantitativno detektovati, po mogućstvu interakcijama antigen-antitelo, magnetnih čestica koje su po mogućstvu obložene sa antitelima koja se koriste, što omogućava razdvajanje ćelija putem magneta i nakon toga kvantifikovanje broja ćelija koje pokrivaju ovaj površinski marker pre i nakon mitogene stimulacije. Ovaj postupak pokazuje devijacije koje su specifične za tu bolest u odnosu na normalne nalaze. Postupak prema pronalasku stoga dozvoljava postavljanje dijagnoze za Alchajmerovu bolest, detekciju prekliničkih stanja bolesti i dijagnostičku diferencijaciju Alchajmerove bolesti u odnosu na ostale demencije (dementna stanja).
Stoga se dati pronalazak odnosi na postupak za dijagnostifikovanje Alchajmeorve bolesti ili početne faze bolesti kao i na utvrdjivanje predispozicije za ovo oboljenje iz uzoraka pacijenata, gde postupak obuhvata faze: (a) mitogene stimulacije periferno pristupačnih ćelija u uzorku; (b) kvantifikacije mitogenski stimulisanih ćelija u okviru populacije ćelija pre i nakon faze (a) pomoću jednog ili više površinskih markera izraženih nakon mitogene stimulacije, gde su ćelije koje poseduju površinske markere odvojene od ćelija bez površinskih markera korišćenjem antitela usmerenih prema površinskim markerima; i (c) odredjivanje indeksa stimulacije koji predstavlja odnos izmedju broja ćelija
koje poseduju površinski marker ili markere pre i nakon faze (a), gde
indeks stimulacije najmanje 10 puta, maksimalno 100 puta, nadilazi nestimulisani kotrolni uzorak, koji predstavlja znak Alchajmerove bolesti ili rane faze bolesti ili predispozicije za ovu bolest.
Stručnjak upućen u stanje tehnike poznaje odgovarajuće mere koje služe za dobijanje uzoraka od pacijenata pogodnih za izvodjenje postupka prema pronalasku, koji sadrže dovoljnu količinu mitogenski stimulisanih ćelija. Na primer , odgovarajući uzorci su uzorci dermalnih (kožnih) tkiva, uzorci krvi, po mogućstvu venske krvi, ćelija iz cerebrospinalne tečnosti, i ćelija iz urina.
U poželjnom izvodjenju dijagonstičkog postupka prema pronalasku, na primer, u slučaju kada se koristi uzorak krvi, dodaje se jedinjenje za sprečavanje koagulacije, na primer natrijum citrat ili heparin, za potrebe stabilizacije pre ostalih faza postupka.
Pojam " postavljanje dijagnoze za Alchajmerovu bolest " kako se koristi u ovom tekstu, takodje obuhvata dalje ispitivanje i na taj način prognozu, kontrolu efikasnosti terapeutskih intervencija kao i dijagnostičku diferencijaciju bolesti u odnosu na ostale demencije.
Pojam " periferno pristupačne ćelije " kako se ovde koristi, odnosi se na ćelije koje mogu da budu uklonjene bez operacije ili (minimalno) invazivnim postupkom iz ljudskog organizma i one obuhvataju na primer, ćelije kože i limfocite iz perifernog krvotoka, gde su poslednje poželjne za postupak prema pronalasku.
Mitogenska stimulacija za postizanje eksperesije površinskih markera može da bude izazvana poznatim stimulatorima, kao što su fitohemaglutinin (PHA), protein A, PWM ili ostalim jedinjenjima koja imaju trofični ili mitogeni efekat. Stimulacija može da bude izazvana dodatkom pojedinačnih jedinjenja ili kombinovanim dodatkom više jedinjenja.
Stručnjak upućen u stanje tehnike poznaje eksperimentalne uslove za stimulaciju, na primer, u pogledu koncentracije korišćenih mitogena, trajanja stimulacije i ostalih stanja inkubacije. Stimulacija treba da se odigrava u odgovarajućim posudama koje dozvoljavaju adekvatnu izmenu gasova. Koncentracije sredstava za stimulaciju treba da budu unutar fiziološkog opsega koje je 1 u,g/ml do 20 ug/ml PHA, 1 fig/ml do 50 u.g/ml PWM, i 10 ug/ml do 200 [xg/ml proteina A. Period stimulacije zavisi od brzine ekspresije molekula koji se ispituje. Medjutim, stiumlacioni period od 2 do 24 sata može da bude neophodan za odredjena ispitivanja. U slučaju CD69 optimalan je period stimulacije od 4 sata. Stimulacija treba da se odigrava u fiziološkim uslovima i može da se sprovodi u gasnom inkubatoru na 37°C i sa 5% CO2.
Stručnjak upućen u stanje tehnike takodje poznaje odgovarajuće površinske markere pomoću kojih se mitogena stimulacija manifestu)e sama po sebi, kao što su na primer, CD69, CD25, CD45RO, CD63 i HLA-Dr, gde je poželjan površinski marker CD69. Za potrebe datog pronalaska, takodje je moguće da se odredi kombinacija površinskih markera ili drugih specifikacija ćelija koje su odvojene pomoću odredjenog površinskog markera, na primer, CD69, u pogledu ostalih subpopulacija, na primer, pomoću (na primer CD4+ i/ili CD8<*>i/ili CD 19+ i/ili CD56+) subpopulacije.
Indeks stimulacije (aktivacioni indeks) proizilazi iz odnosa broja ćelija koje poseduju površinski marker ili markere pre ili posle stimulacije. Indeks stimulacije koji najmanje 10 puta, maksimalno 100 puta, nadilazi nestimulisani kontrolni uzorak, predstavlja znak Alchajmerove bolesti ili ukazuje na ranu fazu bolesti ili postojanje preispozicije za ovu bolest.
Indeks stimulacije koji je manji od 10 puta, gde nestimulisani kontrolni uzorak ne pokazuje znake Alchajmerove bolesti ili znake rane faze bolesti ili ukazuje na postojanje predizspozicije za bolest. Ćelije koje poseduju površinske markere mogu da se odrede prema uobičajenim postupcima, na primer, postupkom po Western blot-u, ELISA, RIA, FACS, LSC itd.
Da bi se odredile ćelije koje poseduju površinske markere, one se odvajaju od ćelija bez površinskih markera, kao i ćelija koje poseduju druge površinske markere na osnovu karakterističnih ćelijskih osobina. Antitela koja su pogodna za ovu svrhu mogu da budu monoklonalne, poliklonalne ili sintetička antitela ili njihovi fragmenti. Sa tim u vezi, pojam " fragment " označava sve delove monoklonalnog antitela (na primer, Fab, Fv ili pojedinačni lanac Fv fragmenata) koji zadržavaju istu epitopsku specifičnost kao i kompletnog antitela. Proizvodnja tih fragmenata poznata je stručnjacima upućenim u stanje tehnike, gde se mnoga antitela koja su usmerena prema površinskim markerima takodje mogu kupiti.
Prema najpoželjnijem izvodjenju dijagnostičkog postupka prema pronalasku, antitelo ili antitela koja su specifična za površinske markere vezana su za magnetne čestice, na primer za paramagnetne slojeve (koji se mogu nabaviti od DYNAL A.S., poštanski broj 158 Sk0yen, N-0212 Oslo, Norveška), koji dozvoljavaju razdvajanje ćelija sa odgovarajućih površinskih markera preko imunomagnetskog odvajanja prema postojećem postupku.
Indeks stimulacije može se odrediti na osnovu količine ćelija razdvojenih pomoću željenog površinskog markera na bazi sadržaja nukleinskih kiselina i proteina korišćenjem postupaka, na primer nakon liziranja ćelija spektrofotometrijskim odredjivanjem sadržaja nukleinskih kiselina ili proteina ili nakon bojenja nukleinskih kiselina upotrebom specifičnih boja, kao što su etidijum bromid, propidijum jodid, akridinsko narandžasto, DAPI itd, postupkom fotometrijske kvantifikacije. Broj ćelija može da se izračuna iz sadržaja proteina i/ili nukleinskih kiselina u uzorku primenom kalibracionih kriva.
Dati pronalazak takodje se odnosi na kit koji je pogodan za izvodjenje dijagonstičkog postupka prema pronalasku i koji sadrži barem jednu od sledećih komponenti: (a) jedinjenje za mitogensku stiumulaciju; (b) barem jedno antitelo usmereno prema površinskom markeru koje je izraženo nakon mitogene stimulacije, po mogućstvu antitelo vezano za magnetnu česticu.
Kit prema pronalasku takodje sadrži po mogućstvu
(a) barem jednu reakcionu posudu; (b) jedinjenje za spečavanje koagulacije i/ili pufer za liziranje ćelije; (c) pufer za fiksiranje ćelije; (d) supstance potrebne za kvantifikovanje (odredjivanje količine) DNK-a i/ili koncentracije proteina i već pripremljenih rastvora za proizvodnju kalibracione krive; (e) magnet za razdvajanje ćelija koje su vezane za magnetne čestice (koje su
prisutne ukoliko se koristi antitelo vezano za magnetne česticu); i
(f) reagens za uklanjanje vezanih magnetnih čestica (koji je prisutan ukoliko se
koristi antitelo vezano za magnetne čestice).
U poželjnom izvodjenju za kit prema pronalasku, antitelo je anti-CD69. Osim toga, kit može dodatno da sadrži antitela anti-CD4 i/ili anti-CD8, ili umesto antitela anti-CD69, antitela anti-CD4 i/ili anti-CD8.
Konačno, kit prema pronalasku može da bude prisutan u kombinaciji sa jednim ili više odgovarajućih sredstava za detektovanje, kao što su na primer, fluorescentno sredstvo koje se vezuje za primarno antitelo, sekundarno antitelo, sredstvo za detektovanje proteina i/ili nukleinskih kiselina, na primer, kao što je na primer, boja za umetanje, itd.
Primer
Odredjivanje indeksamitogenestimulacije pomoću CD69 kod pacijenata koji
pate od Alchajmerove bolesti
Odredjivanje do sada poznatih parametara Alchajmerove bolesti koje se može izvesti kod živećih pacijenata (biomarkeri), pokazuje nedovoljnu osetljivost i specifičnost ili nije prilagodjeno ispitivanju na velikom broju slučajeva bilo zbog visokih troškova ili zbog izuzetno komplikovane izvedbe testa. Na klinici, sigurnost dijagnoze je samo 80% do 90% i teško je izvodiva naročito u ranijim stadijumima bolesti prema dijagnostičkoj diferencijaciji. Detekcija prekliničkih stadijuma bolesti trenutno nije moguća zbog nedostatka pogodnog biomarkera.
U slučaju Alchajmerove bolesti, neurodegenerativne promene se zasnivaju na poremećenim procesima unutarćelijskog prenosa trofičnih i mitogenih signala. Ove disfunkcije u unutarćelijskoj signalnoj transdukciji nisu ograničene na nervni sistem. Slične se takodje mogu naći u ćelijama kože i u limfocitima perifernog krvotoka ovih pacijenata. Zbog specifičnosti njihove bolesti, ova promena je od dijagnostičke vrednosti i kao takva pogodna za biomarker.
U primeru koji sledi, odgovor na pitanje da li postoji poremećaj tipičan za Alchajmerovu bolest kod unutarćelijskog prenosa trofičnih i mitogenih signala tražen je imunomagnetskim odvajanjem ćelija limfocita sa prezentovanim CD69 pre i nakon mitogene stimulacije.
Krv je sakupljena punkcijom vena pomoću sistema za uzimanje krvi kompanije SARSTEDT. Krv se stabilizuje tokom vadjenja pomoću antikoagulanasa ugradjenih u sistem za vadjenje krvi, kao što su natrijum citrat ili natrijum heparin. U ovom obliku, krv se može čuvati na sobnoj temperaturi 24 do 48 časova. Eksperimenti stimulacije su radjeni u reakcionim sudovima u kojima je moguća dobra aeracija, kao što je to ploča za suspenzionu kulturu sa 24 bunarčića kompanije Greiner bio-one. U ovom slučaju, mitogeni fitohemaglutinin (PHA), protein A i mitogen POKEWEED (PWM) su korišćeni odvojeno ili u različitim kombinacijama, svaki za po 400 uL stabilizovane pune krvi. Finalne koncentracije odgovarajućih mitogena su bile u okviru fizioloških granica i iznosile su 12 |j,g/mL za PHA, 50 ug/mL za protein A i 4 ug/mL za PWM u ovom primeru. Stimulacija je radjena pod fiziološkim uslovima na 37°C i pri koncentraciji C02od 5 % tokom 4 sata u gasnom inkubatoru. Po 100 uL svakog uzorka stimulisane pune krvi je inkubirano sa magnetskim kuglicama obloženim različitim antitelima. U ovom primeru, korišćene su anti-CD4 i anti-CD8 antitelom obložene magnetne kuglice kompanije Dynal. Odgovarajuće magnetne kuglice su dodate u višku u odgovarajuće uzorke (suspenzija od 10 uL magnetnih kuglica) da bi se osiguralo izolovanje odgovarajuće kompletne subpopulacije limfocita. Nakon inkubacionog perioda od 30 minuta na 4°C, odgovarajuća subpopulacija limfocita je odvojena magnetnim putem i nakon ispiranja koje je usledilo, prebačena u 100 |^L definisanog medijuma, u ovom primeru RPMI1640, pomešanog sa 1% fetalnim govedjim serumom (FCS). Vezane magnetne kuglice za svaki uzorak su u ovom primeru uklonjene pomoću 10 |a.L DETACHaBEAD perlica kompanije Dynal. Nakon inkubacionog perioda od 45 min na sobnoj temperaturi, uklonjene magnetne kuglice su odvojene a ćelijska suspenzija, nakon nekoliko ispiranja, premeštena u definisan medijum, u ovom primeru RPMI1640. Dodatkom specifičnog pufera za lizu, ćelije su lizirane, DNK obeležena specijalnim bojama za DNK kao što je etidijum-bromid, propidijum-jodid, akridin narandžasto ili DAPI, a zatim fotometrijski kvantifikovana. Sadržaj proteina u uzorcima je uporedjen pomoću Bradford-ove metode za odredjivanje proteina. Broj ćelija je izračunat iz DNK i/ili proteinskog sadržaja u uzorcima pomoću kalibracionih krivi. Ovaj postupak omogućava direktan zaključak o broju ćelija. Izračunavanje odnosa broja CD69-prezentujućih ćelija pre i posle stimulacije mitogenom (indeks stimulacije) dalo je informaciju o promenama sposobnosti stimulacije ovih ćelija mitogenom.
Indeks stimulacije koji najmanje 10 puta, i maksimalno 100 puta, nadilazi nestimulisani kontrolni uzorak, je znak Alchajmerove bolesti ili rane faze ove bolesti ili pak predispozicije za ovu bolest. Indeks stimulacije koji je manji od 10 puta od nestimulisanog kontrolnog uzorka nije znak za Alchajmerovu bolest niti za njenu ranu fazu niti pak za predispoziciju za ovu bolest.
Prema još jednom eksperimentu, odredjuje se sadržaj proteina u uzorku i sadržaj DNK-a bez dodatka supstanci za bojenje DNK za kvantifikaciju (odredjivanje količine) CD69 prisutnih ćelija. U ovom slučaju, odredjuje se apsorpcija svetlosti koja ima odredjene talasne dužine (na primer, 260 nm ili 280 nm) od DNK-a ili proteina.

Claims (13)

1. Postupak za dijagnostifikovanje Alchajmerove bolesti ili početne faze bolesti kao i utvrdjivanja predispozicije za ovo oboljenje iz uzoraka pacijenata, gde postupak obuhvata faze: (a) mitogene stimulacije periferno pristupačnih ćelija u uzorku; (b) kvantifikacije mitogenski stimulisanih ćelija u okviru populacije ćelija pre i nakon faze (a) pomoću jednog ili više površinskih markera izraženih nakon mitogene stimulacije, gde su ćelije koje poseduju površinske markere odvojene od ćelija bez površinskih markera korišćenjem antitela usmerenih naspram površinskih markera; i (c) odredjivanje indeksa stimulacije koji predstavlja odnos izmedju broja ćelija koje poseduju površinski marker ili markere pre i nakon faze (a), gde indeks stimulacije najmanje 10 puta, maksimalno 100 puta nadilazi nestimulisani kontrolni uzorak, koji predstavlja znak Alchajmerove bolesti ili rane faze ove bolesti ili pak predispozicije za ovu bolest.
2. Postupak prema patentnom zahtevu 1, naznačen time, što je uzorak krv i što su ćelije limfociti.
3. Postupak prema patentnom zahtevu 1 ili 2, naznačen time, što je površinski marker CD69.
4. Postupak prema patentnom zahtevu 3, naznačen time, što su CD69<+>ćelije nadalje naznačene u pogledu subpopulacije CD4<+>i/ili CD8<+>.
5. Postupak prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 4, naznačen time, što se krv stabilizuje pomoću jednog ili više jedinjenja za sprečavanje koagulacije pre faze (a).
6. Postupak prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 5, naznačen time, što su ćelije stimulisane sa PHA, protein A ili PWM.
7. Postupak prema patentnom zahtevu 1, naznačen time, što su antitela u fazi (b) vezana za magnetne kuglice i što se separacija vrši putem imunomagnetske separacije.
8. Postupak prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 7, naznačen time, što je indeks stimulacije odredjen na osnovu sadržaja proteina i/ili nukleinskih kiselina u ćelijama koje poseduju površinske markere pre i nakon faze (a).
9. Kit za dijagnostifikovanje Alchajmerove bolesti ili početne faze bolesti kao i utvrdjivanja predispozicije za ovo oboljenje, gde se pomenuti pomenuti kit sastoji od sledećih komponenti: (a) jedinjenja za mitogensku stiumulaciju; i (b) barem jednog antitela usmerenog prema površinskom markeru koje je izraženo nakon mitogene stimulacije.
10. Kit prema patentnom zahtevu 9, naznačen time, što sadrži: (c) jedinjenje za sprečavanje koagulacije; i/ ili (d) pufer za liziranje ćelije.
11. Kit prema patentnom zahtevu 9 ili 10, naznačen time, što je antitelo vezano za magnetnu kuglicu.
12. Kit prema bilo kojem od patentnih zahteva 9 do 11, naznačen time, što je antitelo anti-CD69.
13. Kit prema patentnim zahtevima 9 do 12, koji takodje sadrži anti-CD4 i/ili anti-CD8 antitel.
YUP-2006/0255A 2003-10-22 2004-09-29 Test za brzo dijagnostikovanje alchajmerove bolesti RS20060255A (sr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE10349162A DE10349162A1 (de) 2003-10-22 2003-10-22 Schnelltest zur Diagnose der Alzheimerschen Erkrankung
PCT/EP2004/010889 WO2005050219A1 (de) 2003-10-22 2004-09-29 Schnelltest zur diagnose der alzheimerschen erkrankung

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS20060255A true RS20060255A (sr) 2008-09-29

Family

ID=34529710

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
YUP-2006/0255A RS20060255A (sr) 2003-10-22 2004-09-29 Test za brzo dijagnostikovanje alchajmerove bolesti
RS20060255A RS52875B (sr) 2003-10-22 2004-09-29 Test za brzo dijagnostikovanje alchajmerove bolesti

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20060255A RS52875B (sr) 2003-10-22 2004-09-29 Test za brzo dijagnostikovanje alchajmerove bolesti

Country Status (15)

Country Link
US (2) US20070218497A1 (sr)
EP (1) EP1685408A1 (sr)
JP (1) JP2007509331A (sr)
KR (1) KR101138343B1 (sr)
CN (1) CN1871519A (sr)
AU (1) AU2004290789B2 (sr)
BR (1) BRPI0415212A (sr)
CA (1) CA2540841A1 (sr)
DE (1) DE10349162A1 (sr)
IL (1) IL175004A0 (sr)
NO (1) NO335704B1 (sr)
RS (2) RS20060255A (sr)
RU (1) RU2426130C2 (sr)
WO (1) WO2005050219A1 (sr)
ZA (1) ZA200603178B (sr)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1876449A1 (en) * 2006-07-07 2008-01-09 Universität Leipzig Cell cycle-based blood test to diagnose Alzheimer's disease
AU2010207640B2 (en) * 2009-01-20 2016-09-08 Cambridge Enterprise Limited Methods for predicting autoimmune disease risk
GB201212084D0 (en) * 2012-07-06 2012-08-22 Randox Lab Ltd Tropomyosin isoforms related to alzheimers disease and mild cognitive impairment
WO2014205406A1 (en) * 2013-06-20 2014-12-24 Amarantus Bioscience Holdings, Inc. Methods, systems, and composition related to neural disorders
CN106885909B (zh) * 2017-01-19 2018-11-20 上海市东方医院 一种用于早期诊断阿尔茨海默病的试剂盒
CA3055754A1 (en) * 2017-03-06 2018-09-13 Talaris Therapeutics, Inc. Methods and compositions for determining the potency of a therapeutic cellular composition
MX2022000444A (es) * 2019-07-10 2022-02-10 Todos Medical Ltd Un biomarcador para la enfermedad de alzheimer utilizando muestras de sangre de sujetos con diagnostico clinico de la enfermedad de alzheimer.
CN117210549B (zh) * 2023-08-29 2025-03-07 遵义市第一人民医院(遵义医学院第三附属医院) 检测人atp5d、cd69和cxcr4基因的物质及其应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19936035C2 (de) * 1999-07-30 2002-11-21 Univ Leipzig Lymphozytenproliferationstestkit
US20020081635A1 (en) * 2000-05-11 2002-06-27 Thomas Terry E. Novel antibody compositions for preparing enriched T cell preparations

Also Published As

Publication number Publication date
JP2007509331A (ja) 2007-04-12
CN1871519A (zh) 2006-11-29
US20150079609A1 (en) 2015-03-19
DE10349162A1 (de) 2005-06-02
BRPI0415212A (pt) 2006-12-05
US20070218497A1 (en) 2007-09-20
NO20061758L (no) 2006-07-06
WO2005050219A1 (de) 2005-06-02
CA2540841A1 (en) 2005-06-02
KR101138343B1 (ko) 2012-04-26
AU2004290789B2 (en) 2010-01-21
RS52875B (sr) 2013-12-31
RU2426130C2 (ru) 2011-08-10
ZA200603178B (en) 2007-07-25
AU2004290789A1 (en) 2005-06-02
IL175004A0 (en) 2006-08-20
NO335704B1 (no) 2015-01-26
KR20060100423A (ko) 2006-09-20
RU2006112203A (ru) 2007-11-27
EP1685408A1 (de) 2006-08-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6916626B1 (en) Detection of Candida
US20150079609A1 (en) Quick test for the diagnosis of alzheimer&#39;s disease
EP2992332B1 (en) In vitro method for the early detection of a potential inflammation associated with rejection of a transplant
US12584925B2 (en) Method of treating large vessel occlusion stroke
JP4272431B2 (ja) 診断試験法
US10191048B2 (en) Fluorometric immunoassay for detection of anti-dsDNA antibodies
JP2026507052A (ja) 椎間板変性度の鑑別診断におけるｃｉｔｅｄ４及び／又はｍｅｔｒｎの使用
EP3631456A1 (en) Method of detecting colitis ulcerosa
CN117741154B (zh) 用于认知障碍检测的生物标志物组合及应用
Hiroki et al. A high‐throughput TREC‐and KREC‐based newborn screening for severe inborn errors of immunity
CN119301450A (zh) 用于快速确定免疫状态的功能测定
CN112534262A (zh) 检测手足口病的方法
EP1393076B1 (de) Verfahren zur vorhersage eines transplantatabstossungsrisikos und immunologischer testkit
Puranik et al. Insight into Early Diagnosis of Multiple Sclerosis by Targeting Prognostic Biomarkers
WO2021125732A1 (ko) 콧물 시료를 이용한 경도 인지 장애의 진단용 바이오마커 조성물 및 이를 이용한 경도 인지 장애의 진단 방법
WO2020198299A1 (en) Compositions and methods for characterizing and treating alzheimer&#39;s disease
MXPA06004451A (en) Quick test for the diagnosis of alzheimer&#39;disease
US20210208148A1 (en) Method for confirming prdm14 expression
US20250110131A1 (en) Breast implant-associated anaplastic large cell lymphoma diagnostic test
US20090311719A1 (en) In vitro method for diagnosing neurodegenerative diseases
CA3059601C (en) Methods for aiding in diagnosing and evaluating a mild traumatic brain injury in a human subject using cardiac troponin i and early biomarkers
WO2025078596A1 (en) Early biomarker for parkinson&#39;s disease
US20220196669A1 (en) Method for detecting or monitoring the development of a chronic proliferative disease by immunoassay
DE102015108523A1 (de) Peptid-Biomarker für Krebs