RS20130348A1 - Postupak programiranog zamrzavanja svežih deleukocitovanih trombocita uz dodatak dimetilsulfoksida - Google Patents

Abstract

Kontrolisano, programirano zamrzavanje (kriokonzervisanje) jedinice svežih koncentrovanih deleukocitovanih trombocita u prisustvu intraćelijskog krioprotektora, u cilju postizanja maksimalne morfološke i funkcionalne očuvanosti trombocita nakon odmrzavanja, a neposredno pre terapijske upotrebe, omogućava značajno povećanje procenta funkcionalno i morfološki sposobnih trombocita sa 50% kod standardnih postupaka zamrzavanja, na 90% pod uslovima kontrolisanog zamrzavanja deleukocitovaih trombocita. Ovim su postignute značajne uštede u svežim jedinicama trombocita, povećan je kvalitet zamrznute jedinice trombocita, smanjen je broj neophodnih davalaca krvi i omogućeno je posedovanje dovoljnih i potrebnih količina trombocita za specifične potrebe.

Description

1

POSTUPAK PROGRAMIRANOG ZAMRZAVANJA SVEŽIH

DELEUKOCITOVANIH TROMBOCITA UZ DODATAK

DIMETILSULFOKSIDA

OBLAST TEHNIKE

Predmet pronalaska spada u oblast medicine.

TEHNIČKI PROBLEM

Kojim postupkom programirano zamrzavati (kriokonzervisati) jedinice svežih koncentrovanih deleukocitovanih trombocita u prisustvu intraćelijskog krioprotektora, kako bi se ostvarila maksimalna morfološka i funkcionalna očuvanost trombocita nakon odmrzavanja, a neposredno pre terapijske upotrebe.

STANJE TEHNIKE

Procedure zamrzavanja, skladištenja u zamrznutom stanju (kriokonzervacija) i odmrzavanja pojedinih izolovanih ćelija iz krvi se izvodi u cilju posedovanja što kvalitetnijih krvnih komponenti za terapijsku upotrebu, kada na raspolaganju nema jedinica svežih trombocita i ostalih krvnih ćelija. Standardne metode koje su u upotrebi za postupak kriokonzervacije trombocita, imaju još uvek samo delimično rešene probleme vezane za njihovu primenu. Ranije procedure su podrazumevale prost sistem zamrzavanja trombocita sa svim ostalim krvnim ćelijama sem eritrocita, u prisustvu 5-6% dimetilsulfoksida, koji ima funkciju krioprotektora. (Kao krioprotektor može se koristiti i higroksietilni škrob, glicerol, propan-l,2-diol, glicerol-glikoza). Takav sadržaj je skladišten u plastične kesice i plasiran u zamrzivač koji linearno vrši zamrzavanje sadržaja do temperature od -80°C. Ovakvim postupkom je uspevano da se sačuva nešto više od 50% kvalitetnih trombocita koji bi se nakon odmrzavanja koristili u transfuziji. Postoje stepen iskorištenja trombocita bio relativno mali, da bi se smanjio broj potrebnih donatora krvi bilo je potrebno razviti postupak koji bi omogućio bolje očuvanje i time veći prinos kvalitetnih trombocita nakon procesa odmrzavanja sveže zamrznutih krvnih ćelija.

Uočeno je da se najveći gubitak trombocita dešava u procesu zamrzavanja u temperaturnom opsegu od -14°C do -16°C, kada dolazi do oslobađanja toplote fuzije, pri čemu se značajno oštećuje membrana tombocita. Takvi trombociti nisu dovoljno kvalitetni u morfološkom i funkcionalnom smislu, pa im je i uloga pri terapijskoj primeni sma<n>jena.

U literaturnim podacima postoje neujednačenosti vezane za neprogramirano zamrzavanje bez korišćenja kompjuterizovane kontrole brzine hlađenja. Radovi u kojima se koristi neprogramirano zamrzavanje su: 1. Bock M, Schleuning M, Heim MU, Mempel W. Crvopreservation of human platelets with dimethvl sulfoxide: changes in biochemistry and cell function. Transfusion 1995;35:921-4.

Pojedinačne jedinice trombocita su zamrzavane uz upotrebu 5% rastvora DMSO. Došlo je do značajnog porasta srednjeg volumena trombocita, oslobađanja natrijuma, kalijuma i laktat dehidrogenaze u ekstraćelijski proctor, uz jaku aktivaciju komplementa, kao i značajne ekspresije P selektina na površini membrane. Tako dobijena jedinica trombocita je zamrzavana linearnim postupkom (konstantnom brzinom zamrzavanja), pri čemu je procenat funkcionalno i morfološki sposobnih trombocita nakon odmrzavanja bio 50%. 2. Schiffer CA, Aisner J, Wiernik PH. Frozen autologous platelet transfusion for patients with leukemia. N Engl J Med 1978; 299: 7-12.

Korišćeni su pulirani trombociti uz 5% DMSO koji su zamrzavani neprogramirano u tečnom azotu. Nakon odmrzavanja je oporavak trombocita iznosio 53% u odnosu na period pre zamrzavanja. 3. Daly PA, Schiffer CA, Aisner J, Wiernik PH. Successful transfusion of platelets crvopreserved for more than 3 years. Blood 1979; 54: 1023-7.

Trombociti su zamrzavani korišćenjem 5% dimetillsulfoksida uz kontrolisano zamrzavanje brzinom od -l°C/min do -80°C, ili jednostavnim skladištenjem u zamrzivač na -120°C u tečnom azotu. Prosečan oporavak trombocita je bio oko 46%. 4. Melaragno AJ, Carciero R, Feingold H, Talarico L, Weintraub L, Valeri CR. Crvopreservation of human platelets using 6% dimethylsulfoxide and storage at -80°C. Effects of 2 years of frozen storage at -80°C and transportation in dry ice. Vox Sang 1985; 49: 245-58.

Trombociti su prikupljeni afereznim postupkom ili od davalaca krvi i pulirani pre zamrzavanja. Zamrznuti su pomoću 6% DMSO-na -80°C u mehaničkom zamrzivaču. Oporavak trombocita nakon odmrzavanja je iznosio oko 75%, dok je kod trombocitopeničnih bolesnika iznosio 50%. 5. Dijkstra-Tiekstra MJ, de Korte D, Pietersz RN, Reesink HW, van der Meer PF,Verhoeven AJ. Comparison of various dimethylsulphoxide-containing solutions for crvopreservation of leucoreduced platelet concentrates. Vox Sang. 2003;85:276-82.

Deleukocitovani trombociti su pokazali dobar morfološki skor (>250), prihvatljivu ekspresiju CD62P (< 35%), nisku CD63 ekspresiju (< 20%), nakon odmrzavanja. Oporavak trombocita je bio 80%, a ekspresija CD42b između 70 i 85%.

S obzirom da linearno zamrzavanje nije dalo dovoljno veliki broj funkcionalno i morfološki sposobnih trombocita nakon odmrzavanja, pojavila se potreba za pronalaženjem novih postupaka zamrzavanja jedinica trombocita umesto postojećeg linearnog zamrzavanja konstantnom brzinom. Neki autori su se opredelili za programirano zamrzavanje (kontrolisana brzina hlađenja), a rezultati su dati u radovima: 6. Lazarus HM, Kaniecki-Green EA, Warm SE, Aikawa M, Herzig RH. Therapeutic effectiveness of frozen platelet concentrates for transfusion. Blood. 1981;57:243-9. 7. Kotelba-Witkowska B, Schiffer CA. Cryopreservation of platelet concentrates using glycerol-glucose. Transfusion 1982; 22: 121-4. 8. Dayian G, Pert JH. A simplified method for freezing human blood platelets in glycerol-glucose using a statically controlled cooling rate device. Transfusion 1979; 19: 255-60. 9. Spector JI, Yamaha JA, Marchionni LD, Emerson CP, Valeri CR. Viability and function of platelets frozen at 2°C to 3°C per minute with 4 or 5% DMSO and stored at -80°C for

8 months. Transfusion 1977; 17: 8-15.

10. Zaroulis CG, Spector JI, Emerson CP, Valeri CR. Therapeutic transfusions of previouslv frozen washed human platelets. Transfusion 1979; 19: 371-8. 11. Vučetić D. Procena kvaliteta kriokonzervisanih trombocita u odnosu na trombocite skladištene u tečnom stanju. 2007. god. Doktorska disertacija, Vojnomedicinska akademija, Beograd. 12. B. Balint, D. Paunović, D. Vučetić, D. Vojvodić, M. Petakov, M. Trkuljić. Controlled-rate versus uncontrolled-rate freezing as predictors for platelet cryopreservation efficacv. Transfusion. 2006: 46: 230-5.

Mišljenja nisu sasvim usklađena ni u vezi različitih procedura programiranog zamrzavanja i stepena oporavka odmrznutih ćelija. Po nekim autorima optimalna brzina hlađenja tokom zamrzavanja trombocita iznosi l°C/min (rad br. 6), a po drugima ona je oko 2-3°C/min (radovi 9 i 10). Trombociti se mogu zamrznuti i skladištiti na -80°C do dve godine ili na -150°C do tri godine, sa zadovoljavajućim rezultatima (radovi 3, 4), pri čemu dolazi do smanjenja terapijske efikasnosti za 40-50% u odnosu na sveže trombocite, što se još uvek nije pokazalo kao dovoljno dobro rešenje, jer je stepen iskorištenja trombocita još uvek mali.

Autori koji su se bavili ispitivanjem mogućnosti kontrolisanog zamrzavanja su primenjivali različite brzine zamrzavanja u određenim temperaturnim opsezima, ali za sve njih je karakteristično da su kontrolisano zamrzavanje sprovodili nad jedinicama trombocita koje nisu prethodno deleukocitovane. Procenat funkcionalno i morfološki očuvanih trombocita nakon odmrzavanja je kod njih bio u opsegu od 50-70%).

Za razliku od metode autora Dijkstra-Tiekstra MJ, de Korte D, Pietersz RN, et al. u časopisu Vox Sang 2003, koja je pomenuta u stanju tehnike, naša metoda zamrzavanja podrazumeva kontrolisan postupak zamrzavanja deleukocitovane jedinice trombocita, što je suštinska razlika u odnosu na sve ostale postupke zamrzavanja, bilo nefiltriranih odnosno filtriranih-deleukocitovanih jedinica, a procenat funkcionalno i morfološki sposobnih trombocita je povećan na 90% .

SUŠTINA PRONALASKA

Suština ovog pronalaska se sastoji u tome kako da se programirano zamrzavaju (kriokonzervišu) jedinice svežih koncentrovanih deleukocitovanih trombocita u prisustvu intraćelijskog krioprotektora (6% dimetilsulfoksida), da bi se postigla maksimalna morfološka i funkcionalna očuvanost trombocita nakon odmrzavanja, a neposredno pre terapijske upotrebe.

Zamrzavanje trombocita i drugih krvnih sastojaka se vrši u cilju permanentnog obezbeđivanja neophodnih i hitnih potreba za transfuzijama, kada nema na raspolaganju dovoljnih količina svežih krvnih komponenti. Zamrznute krvne komponente na niskim temperaturama mogu da se održe i do 2 - 3 godine, što predstavlja značajnu zalihu za zbrinjavanje neodložnih i hitnih zahteva za transfuzijom.

Prilikom zamrzavanja može doći do oštećenja trombocita. Kriooštećenja se mogu manifestovati od ćelijskih lezija različitog stepena, preko slabljenja i gubitka pojedinih funkcija, pa do potpune destrukcije ćelija. Ona su uzrokovana dehidratacijom ćelija i/ili direktnim mehaničkim oštećenjima ćelija usled intracelularnog kristalizovanja leda. Prvi dolazi do izražaja pri sporom hlađenju tokom zamrzavanja (sporije od 10°C/min), a drugi deluje pri velikim brzinama hlađenja (brže od 10°C/min) tokom zamrzavanja. Uticaj dinamike hlađenja i zagrevanja na preživljavanje kriokonzervisanih ćelija, prevaziđen je utvrđenom optimalnom brzinom hlađenja i zagrevanja tokom zamrzavanja i odmrzavanja, koje su specifične za svaku vrstu izolovanih ćelija. Optimalna brzina zamrzavanja je dovoljno velika da svede na minimum izloženost ćelija efektu rastvora, smanjujući stepen ćelijske dehidratacije i dovoljno mala da dozvoli izlazak vode iz ćelije, redukujući obim intracelularnog kristalizovanja leda.

U odnosu na prethodno navedene postupke zamrzavanja trombocita koji se primenjuju, ova nova metoda kontrolisanog zamrzavanja deleukocitovanih trombocita ima nekoliko suštinski bitnih razlika. One se sastoje u sledećem: Od svih postojećih metoda, krioprotektora, kao i krvnih komponenti koje za krajnji produkt imaju zamrznutu jedinicu trombocita, zaključeno je da najbolje rezultate daju krvne jedinice iz kojih su odstranjeni leukociti. Ovo se postiže filtrovanjem jedinice koncentrovanih trombocita, čime se dobija značajno prečišćena jedinica trombocita. Leukociti prisutni u jedinici krvi prilikom zamrzavanja dovode do dodatnih oštećenja trombocita, pa je njihovim odstranjivanjem omogućeno povećanje broja morfološki i funkcionalno sposobnih trombocita nakon odmrzavanja. Procenat morfološki i funkcionalno sposobnih trombocita u jedinicama trombocita iz kojih nisu izdvojeni leukociti iznosi oko 50%. Za razliku od ove klasične metode, pri zamrzavanju jedinica trombocita iz kojih su odstranjeni leukociti (što je primenjeno u našem postupku zamrzavanja deleukocitovanih trombocita), procenat funkcionalno sposobnih trombocita se povećava na oko 70-80%. Za razliku od linearnog-neprogramiranog zamrzavanja jedinica trombocita, ovde je primenjen postupak kontrolisanog-programiranog zamrzavanja, koji podrazumeva da se u određenim fazama brzina zamrzavanja ubrza. Uočeno je da se na temperaturama od -14°C do -16°C oslobađa toplota fuzije, koja deluje oštećujuće na membranu trombocita, čime ih onesposobljava za dalju upotrebu. Bilo je značajno smanjiti vreme trajanja perioda u kom se oslobađa toplota fuzije, čime bi se spečilo oštećenje membrane trombocita. Skraćenjem vremena zamrzavanja u oblasti od -14°C do -16°C, oslobađanje toplote fuzije se značajno smanjuje, a time omogućava da se u nastavku procesa zamrzavanja trombocita ove krvne ćelije dovedu do duboke faze zamrznutosti na -80°C gotovo neoštećene. Ovakvim postupkom kontrolisanog zamrzavanja deleukocitovanih jedinica trombocita se procenat funkcionalno i morfološki sposobnih trombocita povećava na 90%.

Značajnim povećanjem procenta funkcionalno i morfološki sposobnih trombocita sa 50% (za krvne jedinice iz kojih nisu uklonjeni leukociti i koje su linearno zamrzavane) na 90%, odnosno sa 70-80% (za deleukocitovane trombocitne jedinice koje su linearno zamrzavane) na 90% koliko se dobije našim postupkom kontrolisanog zamrzavanja, značajno je povećan stepen iskorištenosti krvnih jedinica, čime se bitno ostvaruje povećanje dostupnosti kvalitetnih jedinica trombocita u trenutku hitne i neodložno potrebne intervencije.

Ovako bitnim povećanjem morfološki i funkcionalno sposobnih trombocita se smanjuje potreba za velikim brojem donatora sveže krvi.

Dugovremenskim skladištenjem morfološki i funkcionalno sposobnih kontrolisano-zamrznutih trombocita, obezbeđeni su kvalitetni trombociti isključivo od određene kompatibilne osobe, čime je sprečena imunizacija na specifične antigene drugih nebiranih davalaca.

Kontrolisano zamrzavanje deleukocitovanih jedinica trombocita omogućava kontinuirano snabdevanje trombocitima i tokom praznika odnosno letnjih meseci kada postoje nestašice, kao i kod specifičnih bolesnika kojima su oni preko potrebni (transplantirani, hematološki, bolesnici sa antitrombocitnim antitelima. i retkim krvnim grupama, kao i u slučaju masovnih nesreća ili u ratnim dejstvima).

Značajnim povećanjem procenta funkcionalno i morfološki sposobnih trombocita gotovo se dvostruko povećava zapreminska količina jedinica trombocita koja može da se čuva u određenim namenskim zamrzivačima.

Sa ekonomskog aspekta omogućena je značajna ušteda materijalnih sredstava, jer se povećanjem kvaliteta trombocitnih jedinica smanjuje broj utrošenih pratećih materijala koji se koriste za skladištenje (plastične kese, dimetilsulfoksid, plazma, reagensi za testiranje krvnih grupa davalaca, kao i testova za detekciju markera transfuzijski transmisivnih bolesti, a značajna je i ušteda električne energije i ostalog potrošnog materijala).

DETALJAN OPIS

Jedinice koncentrovanih trombocita se pripremaju iz krvi od nebiranih dobrovoljnih davalaca (starosti od 18 do 65 godina) koji nisu uzimali preparate acetilsalicilne kiseline (tokom poslednjih 7 dana). Eksfuzija krvi (uzimanje krvi od davalaca) se obavlja prema uputstvu proizvođača plastičnih kesa, uz napomenu da se za ispitivanje upotrebljavaju samo one jedinice krvi kod kojih je vreme eksfuzije bilo kraće od šest minuta. Krv u volumenu od 450+45 ml prikuplja se u osnovnu kesu četvorodelnog sistema plastičnih kesa (Terumo, Tokyo, Japan), koja sadrži 63 ml antikoagulaciono-konzervišućeg rastvora CPD, koji se sastoji od: limunske kiseline - 206 mg, natrijum citrata - 1,66 g, natrijum dihidrogenfosfata - 140 mg i glukoze - 1,46 g. U jednoj pratećoj kesi je smešteno 100 ml specifičnog aditivnog rastvora SAGM (sačinjenog od: natrijumovog hlorida - 877 mg, adenina - 16,9 mg, dekstroze - 818 mg i manitola - 525 mg) za resuspenziju jedinica koncentrovanih eritrocita (KE). Ostale dve prateće kese su prazne, namenjene za prikupljanje plazme, odnosno primarnog "buffy coat-a" (BC-I). Prema proizvođaču kese omogućavaju skladištenje trombocita do 5 dana na temperaturi od 22+2°C i uz stalno potresanje. Za centrifugovanje jedinica cele krvi i BC-I upotrebljena je centrifuga Hettich-Roto Silenta RP (Hettich, Tuttlingen, Nemačka). Jedinice cele krvi se centrifugiraju sa 3 890xg (g - centrifugalna sila) u trajanju od 10 minuta. Razdvajanje centrifugovane krvi na plazmu, BC-I i KE se obavlja upotrebom automatskog aparata za obradu krvi EX-30 (Terumo, Tokyo, Japan). BC-I se prikuplja tokom prva dva do tri sata posle uzimanja krvi, a jedinice BC-I se skladište na temperaturi od 20±2°C, u termostatu Cooled Orbital Incubator (Gallenkamp, Ieics, Engleska) uz stalno horizontalno potresanje (sa frekvencijom od 80 ciklusa u minuti) električnom tresilicom, ugrađenom u navedeni termostat. Ovo je procedura koja se standardno obavlja.

Deleukocitovani trombociti se dobijaju puliranjem (skupljanjem) pet ABO identičnih BC-I-a u kesi za puliranje uz dodavanje 250g plazme. Ovakva suspenzija se potom centrifugira na 1000xg tokom 3 minute i 30 sekundi. Supernatant (suspenzija) plazme bogat trombocitima se istiskuje u kesu za skladištenje trombocita kroz leukoredukcioni filter (Imugard III filter, Terumo, Tokyo, Japan), što rezultuje dobij anj em 300ml deleukocitovanih trombocita. Ovakvi trombociti se skladište tokom 24 sata na temperaturi od 22±2°C uz stalno horizontalno potresanje (sa frekvencijom od 80 ciklusa u minuti) električnom tresilicom, ugrađenom u navedeni termostat. Kao krioprotektor se koristi DMSO (molekulske mase 78 daltona) koji se nalazi u staklenim bocama u vidu koncentrovanog (99%) rastvora u pakovanjima od 250 ml (Dimethylsulfoxide, Serva Feinbiochemica, New York, USA). Nakon sterilizacije filtrovanjem pomoću Sartorius-ovog politetrafluoretilenskog filtra promera 0,2 um, rastvor DMSO se razliva bez razređivanja u sterilne staklene boce u zapremini od po 25 ml i skladišti na 4°C (tačka mržnjenja koncentrovanog rastvora DMSO je 18°C) do upotrebe.

Deleukocitovani trombociti u plazmi (300ml) se centrifugiraju na 3000xg tokom 6 minuta, da bi se koncentrovali trombociti na dnu kese (tkz. "trombocitno dugme"). Supernatant se istiskuje u drugu kesu pomoću plazma ekstraktora, ostavljajući "trombocitno dugme" na dnu kese. Ovom "trombocitnom dugmetu" se dodaje 50ml plazme. Nakon 60 minuta inkubacije na sobnoj temperaturi, "trombocitno dugme" je u potpunosti resuspendovano, nakon čega se u kesu plastičnom brizgalicom lagano dodaje plazma sa DMSO u koncentraciji od 12% (kesa se sve vreme blago protresa), da bi nakon dodavanja ana partes, u kesi finalna koncentracija DMSO-a bila 6%. Nakon toga, svaka jedinica deleukocitovanih trombocita se deli podjednako u dve kese za zamrzavanje ("Cryocyte freezing containers", Nexell Therapeutics Inc., Irvine, CA, USA). Pre zamrzavanja, preostali vazduh se odstranjuje iz kese.

Nakon toga kese se stavljaju u aluminijumske kontejnere debljine 0,5 cm, i prebacuju u aparatPlaner Kryo 560- 16(Planer Products Ltd, Sunbury-on-Thames, Engleska) u kom se primenjuje procedura programiranog zamrzavanja. Tokom zamrzavanja, temperatura je kompjuterski kontrolisana (pedeset minuta), pri čemu je proces podeljen na nekoliko faza. Dijagram kinetike hlađenja prilikom korišćenja procedure programiranog zamrzavanja ćelija je prikazan u shemi 1.

Kao što se to u shemi 1 vidi, koristi se originalna procedura programiranog zamrzavanja. Početna temperatura u komori aparata sa tečnim azotom, iznosi 20±2°C/min, a programirano zamrzavanje se prekida na temperaturi od -70°C, kada se uzorci zamrznutih ćelija postavljaju u mehanički zamrzivač i čuvaju na temperaturi od -90±5°C. Potrebno je istaći da se ekvilibracija pri korišćenju procedure programiranog zamrzavanja izvodi na 0°C i da se u Illb fazi zamrzavanja, za vreme promene tečne u čvrstu materiju tj. u temperaturnom opsegu od -5°C do -15°C, kinetika hlađenja korigovana: umesto l°C/min, koristi se intenzivnije hlađenje od 2°C/min radi kompenzacije oslobođene toplote fuzije.

Odmrzavanje suspenzija deleukocitovanih trombocita se izvodi postavljanjem kesa sa zamrznutim trombocitima u vodeno kupatilo na temperaturi od 37+3°C uz lagano mešanje, što traje oko 3 minute, dok se u potpunosti ne odmrznu. Neposredno nakon odmrzavanja, trombociti se prebacuju iz kesa za zamrzavanje u PVC kese od 300ml (P4164; Fresenius Hemocare), i skladište na temperaturi od 22+2°C uz stalno horizontalno potresanje na tresilici. Ovo je standardna procedura odmrzavanja prethodno zamrznutih jedinica trombocita.

Claims (1)

1. Postupak programiranog zamrzavanja svežih deleukocitarnih trombocita uz dodatak dimetilsulfoksida u kontrolisanim uslovima, naznačeno time, što se u kesicu sa deleukocitovanim trombocitima doda 6% dimetilsulfoksid sa plazmom, što se kesica plasira u zamrzivač sa kontrolisanim zamrzavanjem, što se proces zamrzavanja odvija tako da se od 25°C do 0°C vrši brzinom od 5°C/min u toku pet minuta, što se od petog do desetog minuta obavlja ekvilibracija na konstantnoj temperaturi od 0°C, što se od desete do petnaeste minute vrši snižavanje temperature na -5°C brzinom od l°C/min, što se od petnaeste do dvadesete minute temperatura snižava na -16°C brzinom od 2°C/min, što se od dvadesete do četrdetet pete minute zamrzavanje obavlja brzinom od l°C/min do temperature -40°C, što se od četrdeset pete do četrdeset devete minute hladi do -65°C brzinom od 5°C/min, što se nakon četrdeset devete minute temperatura spušta do ispod -70°C čime se, ovim postupkom, jedinica trombocita sa 90% funkcionalno i morfološki sposobnih trombocita održava do trenutka terapijske upotrebe.