RS20170731A1 - Dobijanje biokompatibilinih kompozitnih prevlaka hidroksiapatit/hitozan/grafen sa gentamicinom na titanu iz vodene suspenzije - Google Patents

Description

II Опис проналаска

Добијање биокомпатибилних композитних превлака

хидроксиапатит/хитозан/графен са гентамицином на титану из водене суспензије

а) Област технике на коју се патент односи

Проналазак представља нов производ, биокомпатибилне композитне превлаке хидроксиапатит/хитозан/графен са гентамицином на титану уз развој поступка за добијање овог производа, базираног на електрофоретском таложењу превлака из стабилне водене суспензије хидроксиапатита, хитозана, графена и гентамицина при константном напону.

Према томе проналазак припада области ХЕМИЈА.

б) Технички проблем

Због своје велике механичке чврстоће и отпорности према дејству телесних течности, тј. корозионе стабилности, титан се најчешће користи за израду ортопедских и денталних импланата. Недостатак примене метала у биомедицинске сврхе лежи у чињеници да су то материјали који немају биофункционалност. Имплантирањем метала у ткиво, тренутно започиње интеракција површине импланта са околним ткивом, која је детерминисана биофункционалношћу материјала. Модификацијом површине металног импланта повећава се његова биофункционалност путем промене површинског састава, структуре и морфологије површине импланта, док механичке особине и корозиона стабилност метала остају очуване. Хидроксиапатит (НАР) има најприближнији хемијски састав минералној компоненти коштаног ткива, па се стога најчешће примењује као превлака или као једна од компоненти композитних превлака у циљу повећања биокомпатибилности импланта. Хидроксиапатит у контакту са телесним течностима, представља основу на којој долази до раста новог слоја коштаног апатита [1,2]. Корозија титана in vivo се дешава услед његове интеракције са телесном течношћу, протеинима и ћелијама [3]. Да би се површина метала учинила повољнијом за процес интеграције са околним ткивом, модификује се наношењем хидроксиапатита [4]. Проблем код превлака хидроксиапатита се огледа у великој кртости ових превлака и скупљању приликом синтеровања, што у великој мери ограничава њихову примену [5]. Комбинацијом хидроксиапатита и различитих врста биополимера, синтетских или природних, постижу се физичко-хемијске и механичке особине које су најприближније особинама природног коштаног ткива [6]. Хитозан (CS), као природан полимер или биополимер, због своје антимикробне активности, хемијске постојаности и биокомпатибилности може се применити као биомедицински имплант [7]. У форми композита са хидроксиапатитом, повећава адхезију превлаке, задржавајући биокомпатибилност хидроксиапатита. Побољшање механичких својстава биокомпозитних превлака хидроксиапатита и биополимера се успешно може постићи додатком мале количине графена (Gr) [8-11].

Инфекције кости које се дешавају код отворених прелома или након хирушких захвата (артопластика кука или колена) могу довести до значајних компликација као што су остеонекроза, сепса или чак ампутација [12]. Стандардна процедура након интервенције подразумева системску антибиотску терапију. Ефикасност терапије овог типа може бити ограничена услед смањеног дотока крви или због мале брзине продирања крви у ткиво. Додатно, дуготрајна терапија антибиотицима високих доза може довести до низа споредних ефеката. Са друге стране, значајно је ефикаснија локална примена високих доза антибиотика у краћем временском интервалу, на месту потенцијалне појаве запаљенског процеса која се постиже пласирањем импланта или испуна код дефеката коштаног ткива, које садрже инкорпорисан антибиотик [13]. Најчешће примењиван антибиотик, код спречавања/лечења бактеријских инфекција околног ткива након пласирања коштаног импланта је гентамицин (Gent). То је аминогликозидни антибиотик широког спектра, којим се може третирати велики број бактеријских инфекција, а нарочито инфекције изазване грам-негативним бактеријама.

Технике које се могу користити за наношење превлака на металну основу код добијања импланата коштаног ткива су термичко прскање, плазма-спреј техника, таложење пулсирајућим ласером, сол-гел поступак, биомиметички раст, електрофоретско таложење [14]. Уколико је неопходно инкорпорисати антибиотик у превлаку током формирања саме превлаке неопходно је применити „хладне технике“ формирања превлака, да не би дошло до структурних промена антибиотика [15, 16]. Применом поступка електрофоретског таложења могуће је добити униформне превлаке на металним супстратима сложених облика уз могућност прецизне контроле дебљине, морфологије и стехиометрије превлаке [14]. Електрофоретско таложење биокомпатибилних превлака, односно композитних превлака на бази хидроксиапатита изводи се на собној температури [1, 17-20], што ову технику чини потенцијално погодном за примену код ко-таложења композитних превлака и гентамицина истовремено.

У овом патенту је описан начин добијања биокомпатибилних композитних хидроксиапатит/хитозан/графен превлака са гентамицином (HAP/CS/Gr/Gent) из водене суспензије на титану поступком електрофоретског таложења које су показале широку зону инхибиције према Staphylococcus aureus and Escherichia coli бактеријама током агардифузионог теста.

ц) Стање технике

Повећање биокомпатибилности титана, односно способности металног импланта за што ефикаснију интеграцију са околним ткивом, може се постићи функционализацијом површине импланта титана, тј. наношењем биокерамичких превлака. Биокерамичке превлаке се могу наносити различитим методама, као што су термичко прскање, таложење пулсирајућим ласером, сол-гел поступак, биомиметички раст и електрофоретско таложење [14].

Електрофоретско таложење (EPD) је електрохемијски поступак за добијање превлака на металним супстратима. Примењује се за добијање функционалне и композитне керамике, танких филмова, као и превлака комплексног састава. Од посебног значаја је EPD биокерамичких превлака на медицинским имплантима, које, по свом саставу, могу бити калцијум-фосфатне превлаке или композитне превлаке калцијум-фосфата и других органских/неорганских једињења. Предности ове методе су могућност наношења превлака на металне супстрате различитих облика, ниска цена опреме, добијање адхерентне и хомогене превлаке, као и таложење композитних превлака униформне дебљине на собној температури [1,2, 17-25].

Ф

Композити на бази хидроксиапатита и полимера су веома атрактивни јер се комбинује одлична биокомпатибилност, биоактивност и остеокондуктивност хидроксиапатита, са добрим механичким својствима полимерних материјала. Поред тога што НАР има сличну хемијску структуру као минерални део природне кости, он показује биоактивност кроз могућност формирања коштаног апатита на површини у присуству телесних течности [25]. Са друге стране, НАР је крт материјал, што у знатној мери ограничава његову примену. Развијање материјала на бази биоактивних композита који истовремено садрже НАР и полимер је од веома великог значаја [5].

Хитозан је један од природних полисахарида који се често примењује у композитним превлакама. Велику примену налази у медицини, у форми импланата, биосензора, носача лекова итд., зато што је хемијски постојан, показује антимикробна својства и биокомпатибилан је [26].

У биомедицинске сврхе, графен се може употребити као материјал за носаче лекова и генетске информације, у терапијама канцера, као биосензор, итд [27]. Примена је превасходно за ојачавање композитне основе (као нанофилер) због својих изузетних термичких и механичких карактеристика, укључујући велику специфичну површину и електричну проводљивост [11, 28-30]. Такође, показано је да током интеграције импланта са околним ткивом, графен стимулише адхезију остеобласта и пролиферацију ћелија [28]. У циљу добијања биоматеријала који имају карактеристике и особине природног коштаног ткива веома се интензивно испитују композитни материјали на бази хидроксиапатита, хитозана и графена. Овако добијени биоматеријали морају да поседују биокомпатибилност, остварују остеоинтеграцију и поседују антимикробна својства. Композитне превлаке хидроксиапатита, хитозана и графена могу се добити електрофоретским таложењем на титану [1] или легури магнезијума [31], полазећи из купатила која садрже хидроксиапатит, хитозан и графен, у мешаном систему вода/етанол. Добијене превлаке на титану су се показале нетоксичне према тестираним здравим имунокомпетентним хуманим мононуклеарним ћелијама периферне крви (РВМС) [1]. Такође, композитне превлаке хидроксиапатита, хитозана и графен-оксида на титану могу се добити електрофоретским таложењем из мешаног система етанол/вода [32,33]. Формирање биофилма на металном импланту подразумева могућност адхезије бактерија на површини импланта, доводећи до настанка упалног процеса, што може водити ка губљењу функције импланта и неповољном исходу. Један од основних захтева је обезбеђивање услова на самом импланту да се онемогући адхезија бактерија (формирање биофилма) у времену непосредно након хирушког захвата [34, 35].

Без обзира на бројне методе којима је могуће обезбедити лечење инфекција као и профилаксу, бактеријске инфекције и даље остају највећи проблем код ортопедских процедура. У том смислу, локално (on-site) ослобађање антибиотика отвара могућност успешније борбе против бактеријских колонизација импланата у почетном периоду након хирушког захвата, обезбеђујући бољи успех лечења, што је показано у in vivo и in vitro испитивањима [13, 36].

Један од веома значајних начина повећања ефикасности деловања антибиотика на сузбијање формирања биофилмова је локално отпуштање антибиотика са површине превлаке самог импланта [34]. Главна предност локалног отпуштања антибиотика на месту пласирања импланта лежи у чињеници да је могуће локално применити веома високе дозе антибиотика, без ризика за достизање нивоа системске токсичности лека. Додатно, на овај начин могуће је селективно администрирати одређени антибиотик, у зависности од специфичних патогена, који би могли изазвати инфекцију на месту пласирања импланта.

Ефикасност локално примењеног антибиотика зависи од брзине и начина отпуштања лека. Делимично, ово зависи од основе (матрице) у коју је инкорпорисан антибиотик [15, 34, 37]. Инкорпорација антибиотика у превлаку може се остварити потапањем превлаке у раствор антибиотика, биомиметичким ко-таложењем из пресићених раствора калцијума и фосфата који садрже антибиотик [16] или електрофоретским таложењем, када се истовремено, у једном. ступњу, таложе превлака и антибиотик [38]. Тако су електрофоретским таложењем добијене композитне превлаке хитозан/ванкомицин из воденог раствора на легури титана [39], вишеслојне превлаке хитозан/биоактивно стакло/ванкомицин на титану из водене суспензије [40], превлаке хитозан/биоактивно стакло/ампицилин из мешаног система вода/етанол на титану [41] и превлаке хитозан/желатин/ампицилин из мешаног система вода/етанол на титану [42] као модели за превлаке са контролисаним отпуштањем антибиотика, као и превлаке куркумина из мешаног система вода/етанол на стенту од нерђајућег челика [43]. Један од антибиотика који се веома често примењује када су присутне инфекције коштаног ткива настале након пласирања импланта или тешких траума коштаног система је гентамицин. Из тог разлога је од изузетног значаја испитивање контролисаног отпуштања гентамицина у околно ткиво. У циљу добијања композитних превлака са антибактеријским својствима на нерђајућем челику, антибиотик гентамицин је инкорпорисан у превлаку биоактивно стакло (45S5)/хитозан електрофоретским таложењем из воденог купатила [44]. Такође, хепарин као антикоагулант је успешно таложен на нерђајућем челику EPD техником из воденог купатила у форми композитних превлака хитозан/хепарин за модификацију НАР/хитозан превлака [45], док је превлака фиброин/тетрациклин таложена на титану из воденог купатила [46].

д) Излагање суштине проналаска

Суштина овог проналаска је нов производ, односно биокомпатибилне композитне превлаке хидроксиапатит/хитозан/графен са гентамицином на титану уз развој поступка за добијање ових производа, базираног на електрофоретском таложењу превлака из стабилне водене суспензије хидроксиапатита, хитозана, графена и гентамицина при константном напону. Добијање превлака за биомедицинску намену подразумева одсуство или, у најмањој могућој мери присуство хемикалија које би могле представљати непожељне супстанце за примену у живим организмима, односно изазвати контаминацију производа на било који начин. Из тог разлога, добијање превлака из воденог система представља један од значајних резултата представљених овим проналаском. Електрофоретско таложење композитних превлака хидроксиапатит/хитозан/графен са гентамицином омогућава контролу дебљине, адхезије и морфологије превлака. Превлаке се добијају електрофоретским таложењем на титанској катоди из водене суспензије која садржи хидроксиапатит, хитозан, графен и гентамицин, као резултат реакције на катоди између позитивно наелектрисаних колоидних честица у суспензији и негативно наелектрисаних хидроксилних јона насталих редукцијом воде под дејством електричне струје на константном напону. Предност овог поступка је једноставност, брзина, и могућност контроле дебљине, адхезије и морфологије превлаке променом параметара таложења, тј. напона и времена таложења. Тиме се постиже и боља контрола дебљине, адхезије и морфологије финалног производа који је описан у овом проналаску. Посебна предност оваквог начина инкорпорисања гентамицина у композитну превлаку лежи у чињеници да се електрофоретско таложење изводи из воденог система у једном ступњу, тј. коталожењем из четворокомпонентне водене суспензије. То је изузетна предност у односу на све до сада познате податке из литературе који се односи на ову проблематику, имајући у виду да је производ намењен за биомедицинску примену.

е) Кратак опис слика нацрта

Слика 1. представља шематски приказ електрохемијске ћелије коришћене за електрофоретско таложење превлака хидроксиапатит/хитозан/графен без и са гентамицином на титану: (1) помоћна електрода (РЕ), (2) радна електрода (RE), (3) ћелија за електрофоретско таложење (Ć), (4) извор једносмерног напона (U).

Слика 2. представља зоне инхибиције превлака хидроксиапатит/хитозан/графен без и са гентамицином на титану након 24 сата у присуству Staphylococcus aureus: (а) контролни узорак са бунаром у коме је нането 50 μl раствора гентамицина концентрације 1 mg/ml, (б) превлаке 2- HAP/CS/Gr и 4-HAP/CS/Gr/Gent.

Слика 3. представља зоне инхибиције превлака хидроксиапатит/хитозан/графен без и са гентамицином на титану након 24 сата, у присуству Escherichia coli: (а) контролни узорак са 50 μl раствора гентамицина концентрације 1 mg/ml, (б) превлаке 2- HAP/CS/Gr и 4-HAP/CS/Gr/Gent.

ф) Детаљан опис проналаска

У овом проналаску је развијен електрохемијски поступак за добијање превлака хидроксиапатит/хитозан/графен са гентамицином на титану из водене суспензије, који се састоји и из следеће три фaзе:

1. припрема површине титана за наношење превлака хидроксиапатит/хитозан/графен са гентамицином хемијским путем

2. оптимизација процеса електрофоретског таложења превлака хидроксиапатит/хитозан/графен без гентамицина из водене суспензије на површини титана

3. електрофоретско таложење превлака хидроксиапатит/хитозан/графен са гентамицином из водене суспензије на површини титана на претходно одређеним оптималним условима

1. Припрема површине титана за наношење превлака хидроксиапатит/хитозан/графен са гентамицином хемијским путем

Површина титанских плочица, димензија 20 mm х 10 mm, дебљине 0,25 mm, се прво полира са грубим 800 потом са финим 1200 брусним папиром, након чега се мокро исполира са алумином (0,3 μm). Након полирања, плочице титана се одмашћују у ацетону у ултразвучном купатилу 15 min, а затим се држе у етанолу до почетка експеримента да би се спречила спонтана оксидација површине титана на ваздуху.

2. Оптимизација процеса електрофоретског таложења превлака хидроксиапатит/хитозан/графен без гентамицина из водене суспензије на површини титана

Електрофоретско таложење HAP/CS/Gr превлака без гентамицина на површини титана је изведено из водене суспензије, добијене додавањем компонената НАР, CS и Gr у концентрацијама од 1,0 мас. %, 0,05 мас. % и 0,01 мас%, редом, у 100 ml 1 vol% воденог раствора сирћетне киселине. рН вредност суспензије је износила 4,40. Пре почетка таложења, суспензија је третирана током четири циклуса мешања (1 циклус се састоји од 15 min мешања на магнетој мешалици и потом 15 min у ултразвучном купатилу) у циљу хомогенизације честица у суспензији. Таложење превлака је вршено потенциостатски, у опсегу вредности напона од U= 4 V до U= 10 V, варирањем времена таложења од 8 до 15 min, на собној температури. Најбољи резултати су добијени применом напона од 5 V у току времена од 12 min (оптимални услови таложења). Коришћен је уређај ELECTROPHORESIS POWER SUPPLY EV231 (PEQLAB, Erlangen, Germany). Електрохемијска ћелија коришћена за таложење превлака хидроксиапатит/хитозан/графен без и са гентамицином на титану је приказана на слици 1 и садржала је следеће компоненте:

радна електрода: Ti плочица димензија 20 х 10 mm

помоћне електроде : две Pt плочице димензија 10x10 mm

Добијене превлаке сушене су на собној температури током 24 часа.

3. Електрофоретско таложење превлака хидроксиапатит/хитозан/графен са гентамицином из водене суспензије на површини титана на претходно одређеним оптималним условима.

Електрофоретско таложење HAP/CS/Gr/Gent превлака на површини титана је изведено из водене суспензије, добијене додавањем компонената НАР, CS, Gr и гентамицина у концентрацијама од 1,0 мас. %, 0,05 мас. %, 0,01 мас% и 1,0 mg/ml, редом, у 100 ml 1 vol% воденог раствора сирћетне киселине. рН вредност суспензије је износила 4,40. Суспензија је остављена у фрижидеру 5 дана. Пре почетка таложења, суспензија је третирана током четири циклуса мешања (1 циклус се састоји од 15 min мешања на магнетој мешалици и потом 15 min у ултразвучном купатилу) у циљу хомогенизације честица у суспензији. иЗатим је таложење превлаке вршено потенциостатски, на претходно одређеним оптималним условима, напону од U = 5 V за време таложења од 12 min, на собној температури. Коришћен је исти уређај и иста електрохемијска ћелија приказана на слици 1. Добијене превлаке сушене су на собној температури током 24 часа. Маса превлаке HAP/CS/Gr/Gent добијене при оптималним условима је износила 2,5 mg.

Квалитативни фазни састав превлака хидроксиапатит/хитозан/графен без и са гентамицином је испитиван методом дифракције X - зрака (XRD). Интензитети дифрактованог CuKα рендгенског зрачења (λ = 1,5406 Å) мерени су на собној температури у интервалима 0,02° и времену од 1,0 s, у опсегу од 4° до 65° 29. Дифракциони максимуми одговарају хидроксиапатиту и титану (потиче од супстрата). Због веома малих концентрација хитозана и графена, као и због значајног преклапања са дифракционим максимумима за хидроксиапатит, на дифрактограму се виде само максимуми који одговарају хидроксиапатиту.

Присуство хитозана и графена у превлакама хидроксиапатит/хитозан/графен без и са гентамицином је доказано коришћењем инфрацрвене спектроскопске анализе (FTIR) ATR техником у опсегу од 4000 cm<-1>до 400 cm<-1>. Трака које се јавља на таласној дужини од 1546 cm<-1>одговара N-H вибрацијама савијања код хитозана. Трака која се јавља на таласној дужини од 1560 cm<-1>одговара скелетној вибрацији графенских нанолистова. Остале траке које се јављају на инфрацрвеном спектру одговарају хидроксиапатиту. Антибактеријска активност превлака хидроксиапатит/хитозан/графен без и са гентамицином у присуству Staphylococcus aureus TL (колекција бактеријских култура, ТМФ, Универзитет у Београду, Србија) и Escherichia coli (АТСС 25922) показана је применом теста агар дифузије. Инокулуми оба микроорганизама су припремљени од свеже преконоћне културе у LB бујону (Lennox) (10 g / L триптона, 5 g / L екстракта квасца, 5 g/LNaCl). Културе су инкубиране на 37°С. Тестови агар дифузије су изведениу LB бујону који садржи 0,7 mas. % агара. Агар дифузиона метода подразумева сипање хранљиве подлоге у Петријеве шоље, да би се формирао слој дебљине 4 mm. Након сушења, на целу површину агара равномерно се наноси суспензија циљаних бактерија да би се добио семиконфлуентан раст. Петријеве посуде су остављене током 15 минута да се осуше на ваздуху и потом су Ti плочице са HAP/CS/Gr и HAP/CS/Gr/Gent превлакама постављене на површину агара. Петријеве посуде су инкубиране 24 h на 37 º С. Ширина зоне инхибиције (mm) је затим измерена за сваки узорак понаособ.

Као контрола је коришћено понашање Staphylococcus aureus, Грам-позитивне бактерије, у присуству раствора чистог гентамицина. Уочена је јасна зона инхибиције код раствора чистог гентамицина (Слика 2а, пречник бунара - 10 mm) која је износила 31 mm у пречнику. Није уочена зоне инхибиције код HAP/CS/Gr превлаке (Слика 2б, узорак 2). Зона инхибиције је детектована код превлаке HAP/CS/Gr/Gent и то 36 mm дужине и 27 mm ширине (Слика 2б, узорак 4).

За други микроорганизам који је тестиран - Грам-негативну бактерију, Escherichia coli, као контрола је коришћено њено понашање у присуству раствора чистог гентамицина. У присуству Escherichia coli уочена је јасна зона инхибиције код раствора чистог гентамицина (Слика За, пречник бунара - 10 mm). Светлија зона инхибиције, која указује на максималну осетљивост је износила у пречнику 24 mm, а тамнија-умерено осетљива зона инхибиције била је 30 mm. Није уочена зона инхибиције код HAP/CS/Gr превлаке (Слика 3б, узорак 2). Зона инхибиције је јасно уочена код превлаке HAP/CS/Gr/Gent. Светлија зона инхибиције- осетљива, је била 24 mm дужине и 21 mm ширине, а тамније зона инхибиције-умерено осетљива је износила 28 mm дужине и 25 mm ширине (Слика 3б, узорак 4).

Спречавање адхезије и колонизације бактерија на површини имланта је од круцијалног значаја у смислу превенције инфекције на месту уградње. У овом проналаску је показано да је могуће добити титански имплант са превлаком која поседује антибактеријску активност, и то у једном ступњу из четворокомпонентног воденог система. Такође, у овом проналаску је показано да би имплант у форми композитне превлаке хидроксиапатит/хитозан/графен са са инкорпорисаним антибиотиком гентамицином, на титану, имао могућност превенције адхезије бактерија и потенцијал да служи као локални носач лекова. 4

г) Начин индустријске или друге примене проналаска

Биокомпатибилне композитне превлаке хидроксиапатит/хитозан/графен са гентамицином на титану добијене електрофоретским таложењем из водене суспензије се могу користити као ортопедски импланти за кукове и колена и као дентални импланти. На тај начин се овај производ може користити у медицини, стоматологији, и ветерини као имплант коштаног ткива, јер је превлака биоактивна, и омогућава раст нове апатитне фазе, и у исто време локално отпуштање гентамицина би обезбедило спречавање/лечење упалног процеса околног ткива на месту пласирања импланта. Из изложеног следи да је ове композитне превлаке са инкорпорисаним гентамицином могуће применити као носаче лекова.

Claims (2)

III Патентни захтев

1. Поступак за добијање биокомпатибилних композитних превлака хидроксиапатит/хитозан/графен са гентамицином на титану из водене суспензије, н а з н а ч е н т и м е , што обухвата:

(а) фазу припреме,, површине титана за наношење превлака хидроксиапатит/хитозан/графен са гентамицином хемијским путем, где се површина титана прво полира са грубим 800 потом са финим 1200 брусним папиром, мокро полира са алумином (0,3 μm), одмашћују у ацетону у ултразвучном купатилу 15 min, и узорци држе у етанолу до почетка експеримента да би се спечила спонтана оксидација површине титана на ваздуху;

(б) фазу оптимизације процеса електрофоретског таложења превлака хидроксиапатит/хитозан/графен без гентамицина на површини титана из водене суспензије, добијене додавањем компонената НАР, CS и Gr у концентрацијама од 1.0 мас. %, 0,05 мас. % и 0,01 мас%, редом, у 100 ml 1 vol% воденог раствора сирћетне киселине. рН вредност суспензије је износила 4,40. Таложење превлака је вршено потенциостатски, у опсегу вредности напона од U = 4 V до U = 10 V, варирањем времена, таложења од 8 до 15 min, на собној температури, уз мешање. Најбољи резултати су добијени применом напона од 5 V у току 12 min.

(в) фазу електрофоретског таложење превлака хидроксиапатит/хитозан/графен са гентамицином на површини титана из водене суспензије, добијене додавањем компонената НАР, CS, Gr и гентамицина у концентрацијама од 1,0 мас. %, 0,05 мас. %, 0,01 мас% и 1,0 mg/ml, редом, у 100 ml 1 vol% воденог раствора сирћетне киселине. рН вредцост суспензије је износила 4,40. Таложење превлака је вршено потенциостатски, на претходно одређеним оптималним условима, напону од U = 5 V, за време таложења од 12 min, на собној температури, уз мешање.

2. Поступак према захтеву 2, н а з н а ч е н т и м е , што се за биокомпатибилну композитну превлаку хидроксиапатит/хитозан/графен са гентамицином на титану из водене суспензије концентрације 1,0 мас. % НАР, 0,05 мас. % CS, 0,01 мас.% Gr и 1.0 mg/ml Gent имплементира напон од 5 V током 12 min.