RS20180459A2 - Dobijanje nanočestica kalcijum-alginata ultrasoničnim raspršivanjem kao nosača za imobilizaciju enzima - Google Patents

Abstract

Sadašnji pronalazak obezbeđuje postupak za proizvodnju kalcijum-alginatnih nanočestica raspršivanjem rastvora natrijum-alginata u rastvor kalcijum-hlorida korišćenjem metode ultrasoničnog raspršivanja sa sušenjem toplim vazduhom i geliranjem u koloni sa okvašenim zidovima. Postupak prema prikazanom pronalasku rešava definisani tehnički problem dobijanja kalcijum-alginatnih čestica nano veličina i njihove primene kao nosača za imobilizaciju alkalaze.

Description

ДОБИЈАЊЕ НАНОЧЕСТИЦА КАЛЦИЈУМ-АЛГИНАТА

УЛТРАСОНИЧИИМ РАСПРШИВАЊЕМ КАО НОСАЧА ЗА

ИМОБИЛИЗАЦИЈУ ЕНЗИМА

ОБЛАСТ ТЕХНИКЕ НА КОЈУ СЕ ПРОНАЛАЗАК ОДНОСИ

Овај проналазак припада области ХЕМИЈА и односи се на нови поступак за добијање калцијум-алгинатних наночестица који се заснива на комбиновању ултрасоничног распршивања, сушења топлим ваздухом и гелирања у колони са оквашеним зидовима и њиховом применом као носача за имобилизацију алкалазе. Наиме, алгинатне наночестице се добијају методом ултрасоничног распршивања раствора натријум-алгината при чему ваздух који носи распршене аеросолне честице натријум-алгината у зависности од температуре и незасићености у мањој или већој мери врши испаравање воде из њих и на тај начин им смањује величину, a тако добијене наночестице затим гелирају у колони са оквашеним зидовима. Према Међународној класификацији патент носи следеће ознаке: B01 2/02 и B01J 2/06 којима је дефинисано разлагање течног производа у капљице распршивањем и очвршћавањем капљица у течном медијуму.

ТЕХНИЧКИ ПРОБЛЕМ

Калцијум-алгинатне честице су хидрогел честице настале реакцијом јонског умрежавања, односно гелирања алгината у присуству Ca<2+>јона, односно разменом натријумових јона из натријум алгината и Ca<2+>јона. Најважнија својства ових честица важна за њихову примену у области фармације и биомедицине су нетоксичност, биокомпатибилност, биодеградабилност и рН-сензитивност. Сва претходно наведена својства чине их погодним носачима за различите лековите супстанце, укључујући и протеине, ензиме, гене, ћелије и др. и њихово контролисано отпуштање. Већина алгинатних честица описаних у литератури има пречник већи од 100μm. Субмикронске алгинатне честице (<1 µm) имају низ предности у односу на такве веће честице. Мање честице имају много већу механичку чврстоћу и већу специфичну површину. Оне могу лако да протичу кроз уске распршиваче и канале који би били блокирани већим честицама. Наночестице привлаче велику пажњу и имају низ предности у односу на веће честице посебно за контролисана отпуштање лекова и имобилизацију биокатализатора. Тако, једино честице нано величина могу да имају примену у васкуларној и трансфузионој медицини [1-11]. Осим тога, за администрацију лековитих суспстанци у респираторни тракт, потребна је формулација у виду капи течне суспензије, односно честица аеросола.

До сада су развијене различите методе гелирања алината (спољашње гелирање, унутрашње гелирање и гелирање хлађењем) као и методе за добијање честица калцијум-алгината (екструзионе, емулзионе, спреј-сушење, комплексна коацервација). Међутим, већина наведених поступака се односи на добијање честице микронских величина, док врло мало има литературннх података о добијању субмикронских честица, a и методе које су описане за добијање алгинатних наночестица, наноагрегата и нанокапсула, компликоване су за извођење, често подразумевају примену различитих хемикалија (осим алгината и извора Ca<2+>јона) и имају ограничену могућност контроле величина честица (стварање агрегата). Осим тога, већина поступака описаних у литератури за добијање алгинатних субмикронских честица нису погодни за добијање већих количина честица, што значи да нису од великог значаја за индустријску примену.

У овом патенту описан је поступак добијања калцијум-алгинатних наночестица распршивањем раствора натријум-алгината коришћењем методе ултрасоничног распршивања уз истовремено сушење честица аеросола алгината које су затим ношене струјом ваздуха до колоне са оквашеним зидовима где се одвија гелирање раствором калцијум-хлорида.

СТАЊЕ ТЕХНИКЕ

Алгинатни наночестични системи су добијани следећим методама:1)

комплексирање- форма комплекса може да се јави или у воденом раствору при чему долази до стварања алгинатних наноагрегата или на граници уљане капи при чему долази до формирања алгинатних нанокапсула; за гелирање алгината користи се калцијум из калцијум-хлорида, a до појаве гела може доћи и приликом мешања алгината са супротно налектрисаним полиелектролитом попут хитозана; 2) емулговање алгината у уљаној фази- заједно са екстерним или интерним гелирањем алгинатне емулзионе капи формирају алгинатне наносфере [12-16]. Једну од првих метода за добијање алгинатних наноагрегата (пречника 250-850 nm) као носиоца лека описао је Rajaonarivony, 1993. године [15]. Честице су формиране додавањем најпре калцијум-хлорила, a потом поли-L-лизина у раствор натријум-алгината. Концентрације натријум-алгината и калцијум-хлорида су биле ниже од обично потребних за стварање карактеристичног алгинатног хидрогела тако да је дошло до стварања пред-гел стања које се састојало из наноагрегата диспергованих у континуалној воденој фази. Додавање поли-L-лизина довело је до стварања полиелектролитског комплекса којим су ти наноагрегата били обложени. Убрзо се поли-L-лизин показао као токсичан и имуноген након убризгавања у организам пa je замењен хитозаном [16-22]. Једна од најчешће коришћених метода за добијање алгинатних нанокапсула је таложење полимера на граници капи након уклањања растварача [12,13,15], Када се заврши таложење, полимерна љуска се стабилизује физичким или ковалентним међумолекулским умрежавањем. Припрема алгинатних нанокапсула врши се прво мешањем лекова или једињења која ће бити инкапсулирана са органским растварачем и на тај начин се добија унутрашња уљана фаза капсуле. Ова смеша се постепено додаје воденом раствору алгината који садржи површински активне материје (нпр. Tween 80). Потом, применом великих смицајних сила настаје емулзија типа вода у уљу (В/У). Често се калцијум из раствора калцијум-хлорида постепено додаје емулзији како би дошло до депоновања алгината и како би се створила мембрана наночестица. Заједно са калцијум-хлоридом може се додати хитозан што доводи до стварања полиелектролитног комплекса између алгината и хитозана и тиме се повећава стабилност капсуле, a истовремено се смањује и порозност мембране. Овако добијене нанокапсуле су величине 500-700 nm, a уколико се не додаје хитозан настају мање честице-150 nm [17, 22, 23].

Један од начина добијања алгинатних наносфера је процес емулзификације заједно са екстерним гелирањем који се одвија у два корака. У првом кораку алгинатни раствор који садржи одређено једињење (лек или ензим) је емулгован у уљаној фази како би се добила емулзија типа В/У. У другом кораку додаје се раствор калцијум-хлорида што доводи до гелирања алигинатних капи емулзије, праћено раслојавањем емулзије [24]. Алгинатне наносфере могуће је добити и процесом емулзификације заједно са интерним гелирањем [25]. Примена ултразвучне технологије за добијање фино диспергованих капи полимера се показала као погодна за добијање полимерних микрочестица, у виду ултрасоничног атомизера, који може бити и повезан са уређајем за спреј- сушење и спреј-очвршћавање [26-29]. До формирања капи применом ултразвучне енергије долази када се течни филм уведе на вибрирајућу површину тако да је правац вибрирања нормалан у односу на површину филма, тако да течност абсорбује вибрациону енергију и ствара јединствене капиларне таласе. Изнад одређене критичне амплитуде, капиларни таласи постају нестабилни, те колабирају формирајући капљице. Поступак ултрасоничне атомизације је патентиран 2004. године (US 6,767,637 В2) за добијање микрокапсула са лековитом супстанцом која постаје инкорпорирана унутар воденог језгра обавијеног полимерном мембраном која настаје након размене молекула растварача између језгра и омотача капсуле; добијене микрокапсуле су величине до 500 μm. Још један систем са ултрасоничним неболизером је патентиран 2012. године (US8206622 В2) за добијање течних аеролсол капи из раствора који садржи полианјонски полимер у континуалној струји гаса. Величина честица добијена овим поступком је износила 2 до 15 μm. Предложени патент представља нов поступак за добијање калцијум-алгинатних наночестица распршивањем раствора натријум-алгината у раствор калцијум- хлорида коришћењем методе ултрасоничног распршивања са сушењем топлим ваздухом и гелирањем у колони са оквашеним зидовима. Патент има два новитета. Први је сушење честица чиме се (1) добијају функционалне честице јер им се повећава концентрација алгината сушењем па тиме и чврстина (без сушења се може користити само 0,5% алгинат што даје механички веома слабе честице, док се сушењем повећава концентрација алгината), (2) смањује величина честица до нано нивоа. Други новитет је начин сакупљања честица коришћењем колоне са оквашеним зидовима чиме се превазилазе многобројни проблеми у односу на друге методе код којих долази до агломерисања на месту увођења аеросола у систем за гелирање.

СУШТИНА ПРОНАЛАСКА

За добијање калцијум-алгинатних наночестица коришћен је ултразвучни генератор промена фреквенције (KCW-6TD, 220V/50Hz, Omron Profi Sonic). Примењивана је константна фреквенција уређаја од 1,7 MHz. Као додатак апаратури за ултразвучну атомизацију увели смо грејач повезан на реостат ради регулисања температуре ваздуха. Његова улога је сушење честица аеросола. Стаклена цев у којој је смештен грејач, једним крајем је повезана са компресором који омогућава струјање топлог ваздуха, a други крај се рачва на два дела. Један део тог краја повезан је директно са уређајем у чијем се резервоару налази раствор натријум-алгината преко пластичног црева, a други део такође преко пластичног црева омогућава транспорт сушених честица које су ношене струјом ваздуха до колоне са оквашеним зидовима са одговарајућим раствором калцијум-хлорида (слика 1). Процесни услови за добијање наночестица калцијум алгината су следећи: улазна температура ваздуха од 20 до 150<0>C, проток ваздуха из компресора од 0,1 до 10 l/min и проток кроз перисталтичку пумпу од 0,5 до 5 l/min.

За одређивање морфолошких карактеристика и расподеле величина алгинатних честица добијених ултразвучном атомизацијом, коришћена је метода скенирајуће електронске микроскопије (СЕМ) (уређај SEM JOEL 5300, повезан са полуаутоматским анализатором слике Videoplan5 Kontron) и оптички микроскоп. Узорци за СЕМ су припремани тако што су честице, након лиофилизације превучене танким слојем злата да би се обезбедила њихова електропроводљивост, што је потребно за формирање слике помоћу овог микроскопа. Величина честица одређивана је на више узорака честица, a потом су њихове величине упоређене са несушеним калцијум-алгинатним честицама исте концентрације.

ОПИС СЛИКА ПРОНАЛАСКА

Слика 1 представља шематски приказ апаратуре за добијање калцијумалгинатних наночестица.

ДЕТАЉАН ОПИС ПРОНАЛАСКА

Следећи примери су само илустративни и немају за циљ да ограниче домете овог проналаска на било који начин.

Пример 1

Раствори натријум-алгината концентрације 0,4 мас.%, добијени су растварањем натријум-алгината мале вискозности у прашкастом облику, у дестилованој води. Раствори су мешани помоћу магнетне мешалице (350 o/s), a до потпуног растварања алгината долазило је након 40 мин. Раствор 2 мас. % калцијумхлорида добијен је растварањем дате соли у дестилованој води. За добијање калцијум-алгинатних наночестица коришћен је ултразвучни генератор са грејачем (за добијање сушених честица) и без грејача (за добијање несушених честица). Скенирајући електронски микроскоп је коришћен за одређивање расподеле величина алгинатних честица. Добијено је да су несушене честице претежно сферног облика пречника у опсегу 1,1-1,9 μm, a да су сушене честице такође претежно сферног облика и знатно мањег пречника, који је у опсегу 300-470 nm. Резултат указује на то да повезивањем грејача са ултразвучним генератором се добијају честице нано величине, док се без грејача добијају веће честице микро величине.

Пример 2

Раствори натријум-алгината концентрације 0,5 мас. %, добијени су растварањем натријум-алгината ниске вискозности у прашкастом облику, у дестилованој води. Раствори су мешани помоћу магнетне мешалице (350 o/s), a до потпуног растварања алгината долазило је након 40 мин. 2 мас. % раствор калцијумхлорида добијен је растварањем дате соли у дестилованој води. За добијање калцијум-алгинатних наночестица коришћен је ултразвучни генератор са грејачем (за добијање сушених честица) и без грејача (за добијање несушених честица). Скенирајући електронски микроскоп је коришћен за одређивање расподеле величина алгинатних честица. Добијено је да су несушене честице претежно сферног облика и да им се пречник креће у опсегу 1,1-3,1 μm a да су сушене честице такође претежно сферног облика и знатно мањег пречника, који је у опсегу 300-600 nm. Као и у примеру 1 коришћењем грејача добијене су честице нано величина. Такође, може да се закључи да повећавањем концентрације алгината се добијају честице већих димензија па је са становиштва величине честица 0,4 мас. % раствор натријум-алгината погоднији јер се добијају честице мањег пречника.

Пример 3

Овај пример показује да се алгинатне наночестице добијене поступком који описује овај патент могу и практично применити за имобилизацију протеазе из Bacillus licheniformis (alcalase). Раствори натријум-алгината концентрације 0,4 мас. %, добијени су растварањем натријум-алгината ниске вискозности у прашкастом облику, у дестилованој води. Раствори су мешани помоћу магнетне мешалице (350 o/s), a до потпуног растварања алгината долазило је након 40 мин. 2 мас.% раствор калцијум-хлорида добијен је растварањем дате соли у дестилованој води. За добијање калцијум-алгинатних наночестица коришћен је ултразвучни генератор са грејачем. Добијене калцијум-алгинатне наночестице су активиране и по завршетку активације извршена је имобилизација алкалазе. За активацију носача алгинатне честице које се налазе у раствору 1,5 мас.% CaCl2 се стављају у епендорф епрувете, a потом се узорци центрифугирају 10 min брзином од 4 000 o/min. Након центрифугирања се декантује течност и измери се 0,5 g алгинатних честица. Измерена маса носача се стави у ерленмајер од 100 ml. Активација носача се врши тако што се у ерленмајеру где се налази измерена маса носача дода 5,0 ml 5 mM Трис пуфера pH 8,5 и 10 mg EDAC-a. Затим се смеша остави 30 минута уз мешање на ваздушној тресилици на температури од 25 °С.

За имобилизацију ензима после завршене активације носача у смешу се додаје 0,3 ml алкалазе и Трис пуфер до 10 ml. Имобилизација се врши на температури од 25 °С у ваздушној тресилици у временском периоду од 20 сати. Након одређеног времена имобилисани ензим се одваја вакуум филтрацијом.

Да би се одредио проценат везаног ензима, израчунава се масени принос имобилизације (ηenz) који представља однос масе везаног ензима (Pg) и масе ензима у почетном раствору (Po):

За одређивање активности алкалазе после извршене имобилизације, раствори у ерленмајерима се преносе у епендорф епрувете и центрифугирају 10 min брзином од 4000 o/min. Затим се мере различите вредности маса имобилисаниx честица у опсегу од 0,01 g до 0,12 g и стављају у епендорф епрувете. У узорак се потом ставља 125 μl 2,0 % (w/v) раствора азоказеина у 50 mM Трис пуферу pH 9,0. Инкубирање се врши 30 минута на температури од 37<0>C. После инкубације потребно је зауставити реакцију. Реакција се зауставаља тако што се у узорак дода 600 μl 10,0 % (w/v) раствора трихлорсирћетне киселине. Такав узорак треба хладити у леденом купатилу 10 минута. Након истека 10 минута треба центрифугирати узорке 10 минута при брзини од 8000 o/min. После центрифугирања микропипетом се пипетира 600 μl узорка из епендорф епрувете и ставља у кивете дужине 1 cm. Затим се додаје 700 μl 1 M NaOH. Кивете се стављају у спектрофотометар, a затим се мери апсорбанција на 440 nm.

Потребно је направити и слепу пробу која се припрема на исти начин као и узорак само што се раствор трихлорсирћетне киселине меша са узорком пре додатка супстрата и одмах ставља у ледено купатило.

Да би добијене активности имобилисаних ензима могле да се изразе по маси сувог носача, одређен је степен влажности носача, јер се влажан носач суспендује у раствору ензима за имобилизацију. Степен влажности, f, је однос масе влажног носача и масе носача осушеног до константне вредности. Концентрација протеина је одређена методом по Брадфорду која се заснива на нековалентном везивању протеина и анјонског облика молекула Coomassie Blue G-250. Овај реагенс реагује првенствено са остацима аршнина, али може да реагује у малој мери и са другим базним аминокиселинама (лизином и хистидином), као и ароматичним аминокиселинама (триптофаном, фенилаланином и тирозином).

Концентровани раствор боје Coomassie Blue G-250 се припреми растварањем 100 mg боје прво у 95% етанолу, a затим се овај раствор пренесе у нормални суд од 200 ml, дода се 100 ml фосфорне киселине и допуни до црте дестилованом водом. Брадфордов реагенс се припрема разблаживањем концентрованог раствора боје Coomassie Blue G-250 и филтрирањем разблаженог раствора кроз филтер папир. Разблаживање се изводи тако што се 200 ml концентрованог раствора боје Coomassie Blue G-250 допуни до 1 l дестилованом водом. Првих 20-30 ml процеђеног раствора треба одбацити. У епрувету се пренесе 0,04 ml узорка непознате концентрације протеина и 2 ml Брадфордовог реагенсa и ова смеша се промеша на вортексу. Након 5 минута мери се апсорбанца на 595 nm. На основу одређене стандардне праве, израчунава се концентрација протеина у узорку. Стандардна права се конструише припремањем раствора стандардног протеина у опсегу концентрација ОД до 1 mg/ml. Потом се по 0,04 ml сваког од припремљениx раствора пренесе у други сет епрувета. Реакција започиње додавњем 2 ml Брадфордовог реагенса. Смеша се промеша на вортексу и након 5 минута мери се апсорбанца на 595 nm.

Одређена је маса везаног ензима од 571,6 mg/g сувог носача и масени принос имобилизације од 97,2 %. Наведеним поступком одређена је и активност имобилисане алкалазе у зависности од масе имобилизата и утврђено је да износи од 0,00105 ±0,000010 до 0,00133 ± 0,000011 IU за масу имобилизата од 0,0266 g до 0,1112 g.

Пример 4

Раствори натријум-алгината концентрације 0,5 мас.%, добијени су растварањем натријум-алгината мале вискозности у прашкастом облику, у дестилованој води. Раствори су мешани помоћу магнетне мешалице (350 o/s), a до потпуног растварања алгината долазило је након 40 мин. 2 мас.% раствор калцијумхлорида добијен је растварањем дате соли у дестилованој води. За добијање калцијум-алгинатних наночестица коришћен је ултразвучни генератор са грејачем. Добијене калцијум-алгинатне наночестице су активиране и по завршетку активације извршена је имобилизација алкалазе, као што је описано у примеру 3. Одређена је маса везаног ензима од 266,7 mg/g сувог носача и масени принос имобилизације од 97,5 %. Наведеним поступком одређена је и активност имобилисанe алкалазе у зависности од масе имобилизата и утврђено је да износи од 0,00099 ±0,000012 IU до 0,00128 ± 0,000014 IU за масу имобилизата од 0,0231 g до 0,1056 g.

Claims (3)

Патентни захтев

1. Поступак производње калцијум-алгинатних наночестица назначен тимe, што сe састоји из

(1) примене ултрасоничног распршивања са додатим греј ачем, који омогућава сушење честица аеросола;

(2) колоне са оквашеним зидовима за гелирање честица.

2. Поступак према захтеву 1, назначен таме, што се може опционо варирати концентрација натријум-алгината у циљу добијана честица различитог пречника.

3. Поступак према захтеву 1, назначен тиме, што се може опционо вршити имобилизација ензима у циљу добијања имобилизата различитих активности.