RS20190610A1 - Osteoinduktivni koštani graft na bazi nanohidroksiapatita i kopolimera mlečne i glikolne kiseline poli(laktid-ko-glikolid)-plga za reparaciju koštanih tkiva dugih kostiju - Google Patents

Abstract

Predmetni pronalazak se odnosi na proces dobijanja osteoinduktivnih resorbilnih 3D graftova na bazi nanoHA i PLGA/PLA kao koštanih zamenika, metodom ekstruzionog štampanja. Takvi graftovi imaju potencijalnu primenu u reparaciji nadkritičnih koštanih defekata i defekata velikih dimenzija kod prekida kontinuiteta cevastih kostiju. Dizajn grafta obezbeđuje njegovu izvanredno visoku poroznost i izuzetne mehaničke karakteristike, što ga čini primenljivim i kod velikih koštanih defekata kosti koje se nalaze pod opterećenjem, što je jedinstven uspeh. Pored toga on poseduje izuzetno visoku osteoinduktivnost, koja omogućava brzu transformaciju grafta/implanta u novoformirano koštano tkivo, što je potvrđeno brojnim histološkim analizama. Pored toga, korišćenjem široke skale različitih in vitro testova (testovi na L929 fibroblastima i matičnim ćelijama izolovanim iz zubne pulpe, test genotoksičnosti na humanim limfocitima) i in vivo testova (test kutane i subkutane iritacije, test akutne toksičnosti), uključujući i test dugotrajne toksičnosti, utvrđeno je da je materijal netoksičan. Time je otvoren put za njegovu potencijalnu kliničku primenu u raznim granama implantologije, od maksilofacijalne hirurgije do ortopedije i rekonstruktivne hirurgije.

Description

Osteinduktivni graft na bazi nano-hidroksiapatita i kopolimera mlečne i glikolne kiseline (poli(laktid-ko-glikolid) - PLGA) za reparaciju koštanih tkiva dugih kosti

Opis pronalaska

Osteoinduktivni koštani zamenici u inženjerstvu koštanih tkiva tkiva, koji omogućavaju popravke nadkritčnih koštanih defekata, naročito defekata vezanih za izmenu delova oštećenih dugih kosti opisani su u ovom patentu. Koštani zamenici zasnovani su na kompozitnom sistemu koji čine nanohidroksiapatit (nano-HA) i PLGA, pri čemu je nosivi deo strukture, izgrađen od HA, dok je površinski sloj granula prekriven tankim filmom PLGA. Kao privremeni polimerni nosač (templejt) korišćena su polimerna vlakna u obliku sita odgovarajućeg promera i polimerna vlakna kao dispergujući element, koji svojim dimenzijama omogućavaju neprekidnost mreže pora unutar HA nosača. Pored toga, korišćeni su kao i dispergujući elementi i polistirenski polimeri tačno definisane raspodele veličine čestica, radi obezbeđenja multimodalnosti disperzione faze, koja je potom uklanjana na različite načine: rastvaranjem ili pak izgaranjem, sa naknadnim sinterovanjem, pri čemu je obezbeđen granulat koji je nakon prekrivanja tankim filmom PLGA bio pogodan za 3D štampu.3D štampanje izvođeno je tako što je kao model služio rendgenski ili mikro CT snimak dela kosti koji je trebalo zameniti, da bi se koristeći odgovarajući softver kroz gradijentno naslojavanje nano-HA i PLGA kompozita, primenom metode ekstruzionog štampanja dobio potpuno advekatan deo sa delom kosti koju treba zameniti. Nanostrukturni dizajn HA sa visokim stepenom aktivnosti i dobro podešenim brzinama rastvaranja kristalne rešetke, koje su optimizovane na vrednosti biološkog apatita, dale su takvim konstruktima, ne samo adekvatne mehaničke karakteristike, nego i izuzetnu osteokonduktivnost, što je omogućilo da se novostvorena kost stvara brzinom kojom se rastvara sam implant, što je bilo od ključnog značaja za postizanje efikasne i brze osteointegracije, kroz proces potpune zamene implanta novoformiranom kosti.

Oblast tehnike kojoj pronalazak pripada

Ovaj pronalazak se odnosi na tehnološki proces dizajniranja složenih koštanih graftova/implanata koji služe za regeneraciju koštanih nadkritčnih defekata i koštanih defekata nastalih kod prekida kontinuiteta dugih kostiju. Preciznije, pronalazak se odnosi na dizajn bioinduktivnih koštanih implanata koji mogu da trpe prirodna opterećenja, dok se u transformišu u prirodnu kost, koja je po svojim karakteristikama bliska karakteristikama prirodne kosti.

Tehnički problem koji pronalazak rešava

Reparacija i rekonstrukcija kosti su važan klinički problem. Zavisno od vrste kliničke primene procenjuje se da su neke od njih izuzetno česte i da kao kod paradentologije one obuhvataju vrlo široke slojeve stanovništva reda čak i do nekoliko procenata, dok složenije rekonstrukcije koštanih tkiva obuhvataju nekoliko promila. Naravno, imajući u vidu da su sa osteoinduktivnim materijalima, kakav je i materijal koji je predmet ovog patenta, moguće reparirati i znatno veći obim koštanih defekata, koji uključuju zamenu kancerom obolelih koštanih tkiva, kao i rekonstrukcije usmerene ka rekonstruktivnoj i plastičnoj hirurgiji; tada se obim novih primena značajno povećava, umnožavajući značajno mogućnosti primene ove vrste implanata.

Stanje tehnike

Tradicionalni biološki postupci, koji uključuju autografte i alografte spongiozne kosti zasnivaju se najčešće na primeni vaskularizovanih graftova iz fibule i ilijačne kreste. U današnje vreme porasta primene koštanih graftova, stopa neuspeha je vrlo visoka i ona se kreće u rasponu od 16% do 50%. Stopa neuspelih autograftova odgovara donjoj granici navedenog intervala. Ipak, zbog ograničenja u mogućnosti primene autograftova, veoma je velika potražnja za graftovima donora, ali tu se pojavljaju razna pitanja kao što su: ograničenost količine takvih graftova, njihove advekatnosti oblika i veličine, nepredvidivost brzine reparacije kosti, problematčna brzina resorpcije. Pri tome kod većih defekata, dolazi i do potpune resorpcije koštanog grafta pre nego što se do kraja dovede proces osteogeneze. Vreme koje je potrebno uložiti da bi se autograft izvadio je vrlo skupo, a često su i donatori tkiva retki. Mnoga donirana tkiva uzeta sa umrlih osoba su povezana sa infekcijom i hematomom. Alografti dovode do rizika oboljenja i/ili infekcije, što može prouzrokovati slabljenje ili potpuni gubitak induktivnih faktora kostiju. Vaskularizovani graftovi zahtevaju ozbiljan mikrohirurški operativni postupak, što zahteva sofisticiranu infrastrukturu. Tehnike ometanja osteogeneza često su teški i dugotrajni procesi, koji zahtveju visoku motivisanost pacijenata.

Inženjerstvo koštanih tkiva korišćenjem ćelija u kombinaciji sa sintetičkim ekstracelularnim matriksom je novi pristup u odnosu transplantacije tkiva. Predloženi su brojni koncepti tkivnog inženjerstva vezani za dizajniranje novih koštanih graftova. Takva rešenja pokušavaju da oponašaju uspeh autograftova, uklanjanjem ćelija iz pacijenta biopsijom, nakon čega sledi rast dovoljne količine mineralizovanog tkiva in vitro da bi se potom izveo postupak implantiranja, u formi 3D skafolda za upotrebu kao funkcionalno ekvivalentnog autogenog koštanog tkiva. Na ovaj način, reprodukuju se suštinska svojstva autogenog koštanog materijala, stvarajući idealno okruženje za koštanu regeneraciju tkiva, koje uključuje sledeće karakteristike: visoko porozni materijal sa 3D arhitekturom koja omogućava ostaoblastnu i osteoprogenitorsku ćelijsku migraciju i revaskularizaciju grafta; sposobnost da se poveže sa okolnom kosti domaćina i da nastavi normalan proces remodelovanja kosti; normalna proliferacija koštanih ćelija, i osteogenih faktora rasta radi ubrzanog zarastanja i diferencijacije lokalnih osteoprogenitorskih ćelija.

Graftovi na bazi prirodnih ili sintetičkih materijala unutar tela stvaraju privremene strukture, koje omogućavaju telu da koristeći svoje vlastite ćelije formira novo koštano tkivo dok se skafold postepeno apsorbuje. Konvencionalni dvodimenzionalni skafoldi su zadovoljavajući za umnožavanje ćelija, ali su u mnogo manjoj meri zadovoljavajući kada je u pitanju generisanje funkcionalnih tkiva. Iz tog razloga, trodimenzionalni (3D) bioresorbilni i posebno osteoinduktivni skafoldi su poželjni za generisanje i održavanje visoko diferenciranih tkiva. Idealni skafold treba da poseduje sledeće karakteristike: visoko poroznu strukturu, sa međusobno povezanim porama za rast ćelija i transporta nutrijenata i metaboličkog otpada; da bude biokompatibilan i bioresorbilan, sa kontrolisanom brzinom degradacije i resorpcije i da se suštinski podudara ta brzina sa brzinom stvaranja novog tkiva; da poseduje odgovarajuću površinsku hemiju pogodnu za kačenje ćelija, proliferaciju i diferencijaciju; da poseduje dovoljno kanala za promovisanje vaskularne integracije i da poseduje mehanička svojstva slična svojstvima tkiva koja se zamenjuju. In vivo, unutrašnjost skafolda sa mrežom pora treba da bude zaštitićena od proliferativnih ćelija i njihovog ekstracelularnog matriksa tokom dovoljno dugog vremena. Ovo je posebno važno za noseća tkiva poput kosti i hrskavice.

Biomehanički stabilni skafold sa izuzetno visokom otvorenom poroznošću i adekvatnom višemodalnom raspodelom veličine pora je ključan za nastajanje nove kosti u in vivo uslovima. Popravka i rekonstrukcija velikih koštanih defekata kao i produženje donjih ekstremiteta, je klinički izazov posebne vrste. Ovaj problem još nije rešen. Trenutno nijedan od predlaganih pristupa nije pokazao dugotrajnu efikasnost koja podseća na prirodnu kost. Pogodan skafold tek treba da se projektuje. Keramički materijali su krti i skafoldi su skloni preranom lomu. U mnogim slučajevima HA keramika je veoma slabo resorptivna, jer period resorbovanja traje više od 6 godina. Bioresorbilni polimerni skafoldi su korišćeni ali nijedan nije projektovan za aplikacije za duga koštana tkiva. Ovi polimeri sa visokom temperaturom staklastog prelaza poput poliglikolne kiseline (PGA) i polimlečne kiseline (PLA) su krti i neki se razgrađuju prebrzo, pa nisu u stanju da izazovu dugotrajnu mehanoterapijsku indukciju neophodnu za pravilan proces remodeliranja kosti. Nastajanje kiseline u velikoj koncentraciji pri njhovoj razgradnji, kod polimera sa prekratkim vremenom degradacije, takođe sprečava pravilno formiranje ćelija i rast kosti. Drugi problem je što skafoldi velikih dimenzija nemaju dovoljno kanala da obezbede bogatu vaskulaturu krvnih sudova za odvođenje otpadnih proizvoda, kao i isporuku nutrijenata po celom obimu. Skafoldi sa visokom poroznošću takođe nemaju dovoljnu mehaničku stabilnost da bi se mogli da iskoriste za strukturana koštana tkiva u inženjerstvu dugih kostiju.

Izlaganje suštine inovacije

Predmetni pronalazak opisuje postupak fabrikacije i dizajna pora cevastog skafolda, koja poseduje centralni kanal i višestruke bočne kanale koji su otporni na lom i poseduju dovoljnu fleksibilnost, pri dejstvu sila na savijanje, pritisak i torziju. Dizajn koji ima centralnu kanal omogućava jednostavnu proliferaciju različitih konstituenata kao što su ćelije, tkiva i njihovi produkti, faktori rasta, lekovi i njihove kombinacije, dok bočni kanali duž celog obima skafolda omogućavaju komunikaciju krvnih sudova. Konstrukcija se sastoji iz dva sloja: unutrašnjeg poroznog dela koji ima centralni kanal sa mikro-kanalima duž ravni površine, koje obezbeđuju, primarno mesto za osteogenezu i pružaju adekvatnu čvrstoću na pritisak; i spoljneg poroznog dela koji poseduje mikro kanale duž centralne ose, koji omogućavaju ćelijsku proliferaciju, vaskularnu integraciju kao i torzionu i savojnu stabilnost. Pri dizajnu ovakvog grafta udeo poroznog bioresorbilnog polimera u kompozitu nano-HAadekvatne biorastvorljivosti je povećan, da bi u unutrašnjem delu najvećim delom bio prisutan nanokompozit sa znatno manjim udelom polimera. Skafold predstavlja mreža granula nano-HA sa izuzetno visokom poroznošću i resorbilnošću koja je podešena na resorpciju prirodne kosti, u koju su utopljene granule kompozita nano i mikro HA visoke otvorene poroznosti koja omogućava visoku mehaničku stabilnost skafolda i njegovu izuzetnu osteoinduktivnost. Površinska mikro-vlakna su razmaknuta, tako da omogućavaju neometan protok nutrienata i metabolita razgradnje koštanih tkiva, dok je pogodnim dimenzionim dizajnom i dizajnom forme punilaca obezbeđena multimodalnost raspodele veličine pora, uz podešavanje njihove kinetike rastvaranja ili izgaranja obezbeđena je visoka proliferativna sposobnost ovakvih konstrukata, koji su zbog svojih mehaničkih svojstava i visoke bioresorbilnosti veoma pogodni za sanaciju velikih koštanih defekata, uključujući idefekte vezane za duge kosti i za njihovu nadogradnju.

Kratak opis slika i prikaz tabela koje odražavaju odražavaju suštinu inovacije

Sl.1. CT snimci granula skafolda koje su konstruktivni delovi inplantiranog koštanog grafta

Sl.2. Mikro CT snimak 3D grafta i repariranih delova ulne zeca sa mikroarhitekturom konstrukta. Ukupna poroznost grafta od oko 68% obezbeđuje pogodne uslove za rast kosti. Nova kost je potpuno formirana u oblasti kontakta grafta sa netaknutim delom kosti, dok je u centralnom delu prisutan deo neresporbovanog grafta. Unutar kompletne strukture grafta, formirana je kvalitetna trabekularna kost.

Sl.3. Na redgenogramima antebrahokarpalnih kostiju kunića snimljenim tri nedelje po izvršenoj osteotomiji i plasiranju implantata (levo slika), primećuju se znaci stvaranja krečnih senki endostalnog kalusa na okrajcima proksimalne dijafize ulne, kao i na manjim sekvestrima koji se nalaze u nivou preloma. Kalus je u vidu pahuljastih, mrljastih, mlečnobelih formacija koje intenziviraju fiziološku makrostrukturu kosti.Linije rasvetljenja frakture su nejasno definisane i bez izrazitijih tragova kostnih apozicija novog tkiva. Senka grafta je imbibirana krečnim zasenčenjima i utapa se u strukture okolne kosti. Takođe postoji i manji otok mekih tkiva koji se stapa sa senkom susednih mišića. Devet nedelja posle operacije (slika u sredini), linija loma je nejasna zahvaljujući impregnaciji sa mineralnim depozitom i novostvorenim koštanim tkivom, koje snažno prodire u konstrukt sa obe strane gde se nalazi netaknuta kost. Senka konstrukta je manje izražena nego u prethodnoj fazi radiografije i delimično zamenjena sa novoformiranom kosti. Spongioza ulne u liniji diskontinuiteta je kondenzovana i primetno je zadebljanja kompaktna kost. Došlo je do ebrunizacije spongioze na srednjoj dijafizi radijusa. Na rendgenogramima antebrahokarpalnih kostiju kunića snimljenim 12 nedelja po završenoj osteotomiji i plasiranju koštanog grafta (implanta) (desno slika) primećuju se znaci intenzivnog stvaranja endostalnog i periostalnog kalusa na mestima preloma koji u vidu dobro formiranih depozita prožimaju i oblažu kost. Linije rasvetljenja frakture se slabo naziru jer su prožete novoformiranim koštanim tkivom koje klinasto prodire sa proksimalne i distalne strane u graft. Senka grafta je manjih dimenzija nego u prethodnoj fazi snimanja i donekle je zamenjena novonastalom koštanom supstancom. Spongioza ulne je u nivou linije prekida kontinuiteta mrljasto kondenzovana, a primećuje se i znatno zadebljanje kompakta. Na srednjoj dijafizi radijusa je vidljiva eburnizacija spongioze .

Sl.4. SEM: Nanotopologija unutrašnjih zidova skafolda

a) Lamele dužine iznad 5 μm; b) vlakna dužine 5-10 μm i prečnika 40 nm i c) iglice dužine 1 μm i prečnika 40 nm

Sl.5.3D (a) i 2D (b) AFM: Dužina kanala 30 μm, širina 3 μm, debljina grana: 3-5 μmm. Orijentacija dirigovana templejtom

Sl.6. Histološki rezultati in vivo implantiranog grafta koji je ugrađen u ulnu zeca, iz koje je isečen deo kosti u dužini 2.2 cm: Toluidin plavo bojenje uzorka novoformiranog koštanog tkiva. Gore uvećana slika. Defekt je skoro u potpunosti ispunjen novoformiranim koštanimg tkivom. Diskretna linija razgraničenja je primetna, ona predstavlja granicu između zrele i nezrele nove kosti. Prisutne su brojne čestice grafta (crvene strelice), okružene koštanim tkivom, bez prisustva mekog tkiva (10x). Crveni kvadrat: Hijalina hrskavica je dominantna, što ukazuje da pored endesmalnog dolazi i do endohodralnog okoštavanja. Zeleni kvadrat: Diskretne čestice materijala okružene su novoformiranim koštanim tkivom, koje je pretežno lamelarne strukture (100k). Žuti kvadrat: Morfološki paterni nastalih jezgara u osteocitnim prazninama ukazuju na intenzivam proces reparacije kosti. Cestice skafolda su kompletno uronjene u novoformiranu kost, što ukazuje na izvrsnu osteokonduktivnost koštanog grafta (100 х).

Sl.7. Goldner trihrom bojenje novostvorene kosti. Gore uvećana slika. Zelena boja označava mineralizovanu, dok crvena boja označava nemineralizovanu novu kost. Žuti kvadrat: Široko područje hijalinske hrskavice i pretežno prisustvo nemineralizovanog koštanog tkiva ukazuje na aktivnu osteogenezu (40x). Zeleni kvadrat:Uočavaju se endesmalna i endohondralna vrsta osifikacije. Novoformirana kost nije uglavnom zrela i nemineralizovana je (100x). Plavi kvadrat:Čestice materijala (plave strelice) potpuno su ugrađene u strukturu novoformiranog koštanog tkiva, bez prisustva fibroznih tkiva između njih i nove kosti (100x).

Sl.8. Kritični defekt u alveolarnoj kosti ispunjen implantiranim HA 5, 15 i 25 nedelja nakon implantacije

Sl.9. Kompaktna nofovormirana kost potpuno je ispunila kritični defekt u alveolarnoj kosti i u celosti zamenila implantirani HA

Tabela 1. 3D analiza arhitekture novoformirane kosti: Svi morfometrijski elementi 3D arhitekture grafta i novoformirane kosti analizirani su i poređeni sa podacima koji su karakteristični za netaknuti deo kosti, u neposrednoj blitini implantiranog grafta, kao što su broj slojeva, njihova pozicija, zapremina tkiva kosti, površina koštanog tkiva, intersekcija površine, gistina novonastale kosti, faktori trabekularnih paterna, trabekularne separacije, momenti inercije, otvorena i ukupna poroznost, trabekularna debljina, pokazuju da materijal dat našim izumom je u veoma bliskoj saglasnosti sa odgovarajućim faktorima za prirodnu kost.

Detaljan opis pronalaska

Popravka i rekonstrukcija velikih koštanih defekata, kao što je produženje donjih ekstremiteta, ozbiljan je klinički izazov. Nastajanje takvih koštanih defekata može biti uslovljeno kongenitalnim abnormalnostima, traumom ili bolešću. Ovaj problem još uvek je veoma aktuelan. Do sada nijedan od naučnih pristupa nije pokazao dugoročnu efikasnost, koja bi bila uporediva sa prirodnom kosti. Današnje inženjerstvo tkiva uključuje matične ćelije i neki prikladno odabrani skafold koji treba da omogući što efikasniji odgovor. Keramički skafoldi, kao što je makroporozni HA dali su neke polazne kliničke uspehe. Ali, budući da su keramički materijali krti, skafoldi su skloni prevremenom lomu. Neki, iako bioaktivni, nisu resorptivni i posle niza godina pokazuju ozbiljan rizik od infekcije. Mnogi se ne resorbuju čak ni posle 6 godina.

Biomehanički stabilni skafold sa dobrim mehaničko-indukcionim osobinama je zato poželjan.

Iako se bioresorbilni polimerni skafoldi već dugo se koriste, samo retki među njima dizajnirani za primenu za duga koštana tkiva. To je zbog toga što neki od ovih polimera poseduju visoku temperaturu staklsatog prelaza (PGA i PLA). Pored toga, oni su krti i razgrađuju se prebrzo, što može da izazove dugoročne probleme tokom procesa remodelovanja kostiju. Uz to, veliki udeo ovakvih polimera, stvara kao nus proizvod degradacije, metabolite koji sprečavaju pravilan razvoj ćelija i rast kosti. Drugi problem je što veliki graftovi datih vrsta nemaju dovoljno kanala da obezbede bogate vaskulature krvnih sudova za odvođenje otpadnih proizvoda, kao i isporuku nutrijenata po celoj njihovoj zapremini.

Kod našeg izuma, poroznost i veličina pora koji igraju ključnu ulogu u formiranju kostiju u in vivo uslovima, izuzetno je dobro podešena. Zahvaljujući većoj poroznosti i veličini pora folazi do bržeg prorastanja kostiju, iako se pri tome smanjuju mehaničke osobine skafolda. Optimizacija ta dva međusobno protivurečna faktora, koja je ostvarena u našem izumu, daje najbolju efikasnost skafolda. Predmetni pronalazak opisuje postupak izrade i dizajn našeg visokoporoznog skafolda koji poseduje centralni kanal i višestruke bočne kanale,, koji je uprkos tako optimiziranoj poroznosti, otporan na lom, ali i ima dovoljnu stabilnost na sile smicanja, torzije i uvijanja. Spora degradacija skafolda, koja je omogućena kroz optimizaciju proizvoda rastvorljivosti skafolda, obezbeđuje da 3D matrica održava svoj strukturni integritet i mehaničke osobine tokom kompletnog procesa reparacije koštanog tkiva. Skafoldi, koji su opisani u ovom patentu, pogodni su za regeneraciju kosti, kod raznih vrsta koštanih defekata, koji uključuju paradentologiju, maksilofacijalnu hirurgiju, ali i šire kao rekonstruktivni delovi kostiju gde god se pojavljuje potreba za saniranjem defekata ili za stvaranjem uslova nove “anti ageing“ terapije i primena u oblasti plastične hirurgije i ortopedije. Pored toga, skafoldi koji su ovde opisani su idealni zamenici za delove dugih kostiju u koštanom tkivnom inženjerstvu. Takođe, moguće je njihovom primenom uticati na povećanje dužine kostiju kod gornjih i donjih ekstremiteta ljudskog tela.

Dizajn centralnog kanala, koji je obezbeđen ovim pristupom omogućava optimalnu proliferaciju ćelija, koštane srži, faktora rasta, lekova i njihovih kombinacija. Spoljašnji deo grafta izrađen je pretežno od poroznih bioresorbilnih polimera ili kompozita nano-HA -biodegradibilni polimer. Graft ima realan oblik dela kosti koji zamenjuje. Sam proces izrade grafta može biti izveden tako da ima vrlo raznovrsan dizajn, koji uključuje subelemente različite forme, zavisno od unapred željene arhitekture (eliptični, ovalni, cilindrični, konusni ili njihova kombinaciju).

Bioresorbilni polimeri, prirodni i sintetički, uključuju polilaktide, poliglikolide, polikaprolaktone, polianhidride, poliamide, poliuretane, poliesteramide, poliortoestre, polidioksianone, poliacetale, poliketale, polikarbonate, poliortokarbonate, polifofazene, polihidroksibutirate, polihidroksivalerate, polialkilen oksalate, polialkilen sukcinate, poli(maleinske kiseline), poli(amino kiseline), polivinilpirolidon, polietilen glikol, polihidroksiceluloze, citin, citozan, , i njihove kopolimere, terpolimere, ili druge pogodne kombinacije. Pogodni bioresorbilni polimeri biraju se na osnovu njihovih mehaničkih i degradacionih svojstva i prihvatljivosti za proces remodelovanja kostiju. Na osnovu prethodnih iskustava, prednost u ovom izumu data je polilaktidnim (PLA), poli(laktid-ko-glikolidnim) i polikaprolaktonskim polimerima, jer poseduju najbolju kombinaciju degradacionihi mehaničkih karakteristika,

Arhitekturu spoljašnjeg dela grafta čini niz slojeva kompozita sastavljenog od granula nanohidroksiapatita i mikrovlakana bioresorbilnog polimera (PLA). Štampanje je izvedeno tako da su mikro-vlakna razmaknuta, između 400 i 800 μm, što je moguće kontrolisati samim softverom koji se koristi pri štampi.

Arhitektura mikro-vlaknasog grafta se dizajnira u slojevima, tako da se svaki nosi sloj sa mikrovlaknima postavlja pod drugim uglom u odnosu na prethodni sloj. Slojevi se mogu postaviti tako da jedan u odnosu na drugi zahvataju uglove od oko 0° do oko 90° .

Spoljašnji deo grafta je obmotan oko unutrašnjeg dela. Zavisno od očekivanog opterećenja grafta taj deo sadrži 2 ili više slojeva. U tom delu, mrežica mikro-vlakana je napravljena od poroznog bioresorbilnog kompozita, sa uvećanim udelom polimera i nešto manjim udelom nano-HA, dok je u unutrašnjem delu prevladavajući udeo nano-HA. Oba dela nalaze se u vrlo bliskom kontaktu tako što se koristi kratkotrajni termički tretman na 90 °C koji uslovljava bolje međusobno povezivanje različitih slojeva. Debljina tako štampanih slojeva bira se tako da konstruktu obezbedi maksimalne mehaničke karakteristike i veoma dobru proliferativnost. Debljina spoljašnjeg sloja najčešće iznosila je 1,5-2,5 mm, dok je preostalu debljinu činio unutrašnji sloj, čija je debljina bila reda veličine 1-2,5 cm. Veličine pora su imale dimenzije od manje od 100 μm do reda veličine do 800 μm, sa najvećim udelom pora u opsegu 150-300 μm.

Pored toga, skafoldi treba da poseduju određenu mehaničku čvrstoću. Način na koji se vrši naslojavanje u spoljašnjem delu grafta i izbor samog polimernog kompozita određuje njegovu mehaniku, koja je u našim slučajevima iznosila od 5-50 MPa. Same granule koje čine osnovni deo unutrašnjeg dela grafta imale su čvrstoće oko 5-15 MPa. Vrednosti spoljašnjeg dela grafta zavisno od broja slojeva projektovane su i na veće vrednosti, koje se mogu da kreću i do 100 MPa, ako je to potrebno zbog opterećenja koje trpi kost u in vivo uslovima. Navedene vrednosti bile su dovoljne da bi se dobila zadovoljavajuča mehanika kosti koje se nalaze pod opterećenjem što je izuzetno značajno za stabilnost grafta u procesu njegove transformacije u prirodnu kost.

Unutrašnji deo grafta čini centralni kanal, čiji je prečnik pogodan za transport nutrijenata, metabolita, ćelija, faktora rasta i raznih njihovih kombinacija. Centralni kanal ima prečnik koji je pogodan da obavi sve funkcije koje se od njega, posebno vaskulatornu funkciju i skladan dotok ćelija, faktora rasta i nutrijeneta u sve delove grafta, sledeći pravila dinamike fluida. Njegova geometrija se definiše na osnovu prečnika i arhitekture kanala prirodne koste, koju zamenjuje dati graft. Njegov tipični prečnik je oko 5-10 mm.

Graft može da poseduje bočne ili sporedne kanale. Takvi kanali omogućavaju povezivanje krvnih sudova. Oni mogu biti nasumično i uniformno raspoređeni. U jednoj realizaciji, bočni kanali su ravnomerno raspoređeni. Razmak se bira tako da zadovolji sve zahteve vezane za ravnomeran protok svih gore navedenih elemenata, posebno progenitorskih ćelija i faktora rsata, kao i metabolita, po celoj zapremini grafta, koji se očekuju od takvog grafta. Njihov prečnik je najčešće oko 250 μm, dok njihove maksimalne dimenzije mogu imati prečnik i do 700μm. Najmanje dimenzije prečnika ovih kanala su oko 50-100 μm.

Graft generalno ima dva kraja. Krajevi mogu biti otvoreni ili zatvoreni, ili pak otvoreni na jednom kraju i zatvoreni na drugom. Jedan ili oba kraja grafta mogu se zatvoriti dodavanjem jednog ili više slojeva mreže mikro-vlakana. Mikrovlakna u spoljašnjem i unutrašnjem delu grafta mogu biti ista ili različita.

Ovde opisani skafoldi/graftovi, su posebno koriste u regeneraciji kosti, u popravci ili popuni koštanih defekta, u oralnoj maksilofacijalnoj hirurgiji. Pored toga, ovakvi graftovi su idealni za inženjerstvo tkiva dugih kosti. Oni omogućavaju povećanje dužine kosti gornjih i donjih ekstremiteta ljudskog tela. Graft može biti implantiran sa ili bez dodatka bioaktivnih i/ili inertnih agenasa. Pored toga, graftovi mogu biti kultivisani in vitro sa ćelijama izolovanim iz donatora, kao što je pacijent, pre implantiranja grafta u pacijenta, da bi se ubrzala osteointegracija

nakon implantiranja u pacijenta.

Primeri

Regeneracija koštanih tkiva koristeći PLA - nano-HA koštani graft u ulni zeca

Primeri sinteze nanoHA

Prah nanoHA pripremljen je metodom hidrotermalne sinteze, uz primenu kopolimera polietilenvinilacetata i polietilenversatata, primenom pritisaka 5, 25 i 50 barra, i temperatura od 125, 150 i 180 C, tokom vremena 8 do 24h. Na osnovu datih vrednosti parametara sinteze napravljena je matrica eksperimenta, u kojoj se svaki parametar sinteze ukrstio sa svakim drugim, na osnovu čega je dobijena lepeza prahova različitih veličina čestica, odnosa površine i zapremine i veličine kristalita, kao osnovnih elemenata strukture, datih nanoHA prahova, a samim tim i prahova sa različitom hemijskom rastvorljivošću, merenom preko perioda rastvorljivosti svakog od dobijenih prahova. Dobijeni prahovi imali su štapićastu do heksagonalne forme, dimenzija od 50 do 200 nm. Nakon toga, prahovi su podvrgnuti mehanohemijskom postupku redukcije veličine čestica do dimenzija koje su iznosile oko 10 nm, da bi se dobila još veća hemijska i biološka aktivnost dobijenog praha.

Dopunsko dizajniranje nanoHA tokom procesa hidrotermalne sinteze izvedeno je delimičnom zamenom Ca<2+>jona sa jonima Mg<2+>, Zn<2+>, Sr<2+>i jona PO43- sa jonima CO3<2->i SiO4<2->, u granicama od 0.5-3.5 at%, nakon čega je sistem ponovo podvrgnut procesu rastvaranja u rastvoru sa optimalno definisanim pH vrednostima, da bi se utvrdili parametri brzine njegove degradacije i podesili na optimalnu vrednost.

nanoHA koji je pokazivao idealno podešenu brzinu hemijske degradacije, korišćen je za pripremu granula i grafta kompozitnog sistema nanoHA polilaktid ko glikolid.

Priprema grafta

Graft je pripremljen tako što je za njegovo štampanje korišćen kompozit PLA i nano-HA praha za štampu spoljašnjeg dela grafta u razmeru 80: 20 i nano-HA granula prevučenih tankim filmom PLGA za štampanje unutrašnjih deiova grafta, sa dominantnim udelom nano-HA granula. HA granule dobijene su tako što je korišćen višestepeni templejt koji se sastojao iz nano-HA čija je rastvorljivost prethodno podešena dodatkom odgovarajućih Mg ili Zn jona, kao i silikatnih jona, na vrednosti rastvorljivosti prirodne kosti. Mikroporozni templejt je obezbeđen primenom hidroksimetil celuloze i celuloznih etara čija je molekulska masa varirala između 30000 i 100000 Da, uz dodatak male količine aktiviranih montimolironita, u pogodnoj koncentraciji, koji obezbeđuje dobru reologiju sistema i podešavanje veličline mikro pora i pora srednje veličine, dok je kao makrotemplejt korišćena poliuretanska mreža, okaca oko 1-1.5 mm, u tankim slajsevima, koji su pogodni za tehniku impregnacije takve strukture sa datom suspenzijom. Nano-HA je služio i kao ojačivačka komponenta. Posle sušenja dati sistem je termički tretiran na 1100 °C radi kvalitetnijeg sinterovanja, Sličan rezultat je dobijen i kroz proces luženja hidrofobnog polimernog dela templejta primenom određene višemodalne raspodele polistirena, i naknadnim sinterovanjem na temperaturama od oko 1100 °C. Različite poroznosti dobijaju se pri različitim odnosima templejta na osnovi poliuretanske mreže i suspenzije sa nano-HA. Dobijene poroznosti tokom eksperimenata iznosile su između 60 i 78 %. Za testove biokompatibilnosti i implantacije korišćeni su uzorci sa poroznošću koja je iznosila od 70-75%.

Za dizajn spoljne mreže grafta korišćen je nanoprah aktiviranog HA, dok su za unutrašnji deo grafta korišćene granule HA koje su prethodno impregnirane sa PLGA. Kroz adekvatan način štampe, koji je detaljno opisan u prethodnom delu ovog izuma, dobijeni su graftovi koji se mogu koristiti kao reparatorni elementi i za duge kosti. Dobijeni rezultati tokom brojnih bioloških testova pokazali su da se dobijeni konstrukti mogu uspešno koristiti za repariranje koštanih tkiva ne samo u maksilofacijalnoj i oralnoj hirurgiji, nego i za nadogradnju koštanih tkiva ekstremiteta, rekonstruktivnu hirurgiju, kod zamene kancerom zahvaćenih delova kosti itd.

Trodimenzionalno (3D) modelovanje i štampanje grafta

Kompjuterizovana tomografija (CT) korišćena je za skeniranje ulne zeca, koja je dobijena preoperativno, iz anestezirane životinje, koristeći Scanora 3D (Tuusula, Finska) 3D skener i sledeće parametre: 13 mA, 90 kV i voksel rezolucija od 0,2 mm. Nakon toga, CT snimci su pretvoreni u 3D model pomoću Slicer softvera, verzija 4.3.1 (Brigham i Womans Hospital, Inc, Boston, MA) i Blender softver. Zatim, 3D model je importovan u Autodesc 3D Mak 2010 (Autodesc Inc.). Defekat dimenzija i granica (22 mm Ks 7 mm) je prethodno isplaniran i na osnovu njega je štampan identični graft. To je potvrđeno pomoću Meshmiker softvera i uvezeno u Slice3R softver (Affero Inc.) za generaciju G-koda. Štampač koji je izrađen prema sopstvenom dizajnu (Albos doo, Beograd, Srbija) i Pronterface softver su korišćeni za štampanje 3D koštanog konstrukta, korišćenjem sledećih parametara: brzina štampanje 50 mm/s, visina sloja 0,2 mm, ispuna od 60%, 0 debljine ljuske i bez podrške materijala. Skafold je proizveden kombinovanjem biorazgradivog PLA i nano-HA kompozita sa PLGA, sa postupno povećanim procentom nano-HA ka centralnom delu konstrukta.

Test mikro poroznosti štampanog grafta i novostvorene kosti

Svaki uzorak kosti je skeniran u suvom stanju u rezoluciji 10 μm koristeći mikro-CT (SkyScan 1172 x-Ray Mikrotomografiju, SkyScan, Kontich, Belgija). Akvizicije su izvedene na voltaži od 85 kV, strujom u cevi 118 μА, vremenom izlaganja od 1000 ms, koristeći aluminijumski i bakarni filter debljine 0,5 mm, i rotacijom od 180°. Dobijeni snimci su rekonstruisani korišćenjem NRecon v.

1.6.9.8 softvera sa korekcijom snopa od 45%, korekcijom prstenastih artefakata od 6%, i ublažavanjem od 2. Slike su zatim analizirane korišćenjem CTAn 1.16.4.1 softvera.

Ispitivani su sledeći parametri mikroarhitekture kortikalnog implanta ili novonastale kosti: kortikalna debljina (Ct.Th, mm), koja predstavlja prosečnu debljinu nastale kortikalne kosti; poroznost (Ct.Po, %), koja predstavlja zapreminu pora u odnosu na ukupnu zapreminu implanta ili novonastale kosti, prečnik pora (Po.Dm, μm) koji predstavlja prosečni prečnik pora i faktor gustine međusobne povezanosti pora (Po.Sp, 1/mm<3>), koja predstavlja prosečnu udaljenost između pora.

In vivo implantacija personalizovanog grafta u ulni zeca

Zec koji je prethodno skeniran radi dizajniranja grafta podvrgnut je intramuskularnoj premedikaciji (kombinacija ketamidora (ketamin hidro-hlorid) 10%, Richter Pharma Ag -Austrija, 35 mg/kg, sa ksilazinom (Ksilased) 2%. Bioveta, Češka, 5 mg/kg). Za analgeziju je korišćen butorfanol u intramuskularnoj dozi od 0,1 mg/kg, (Richter Pharma Ag, Austrija). Linearna incizija kože od 3,5 cm je izvedena u oblasti ulne pod lokalnom anestezijom (lidokain- hlorid 2%, Galenika ad Srbija). Meka tkiva su lateralizovana, a u ulnu kosti je ugrađen 3D štampani koštani konstrukt koji je odgovarao obliku i dimenzijama defekta koji je isečen iz kosti. Naime, defekt je napravljen korišćenjem poznate udaljenosti od proksimalnog dela ulne (30 mm) što je omogućilo precizno pozicioniranje grafta. Nakon toga, osteotomski je napravljen isečak kroz celu debljinu kosti (prečnik 22 mm). Hirurška rana je zatvorena na nivoima više tkiva sa hirurškim šavovima (Vicril, ETHICON, 3-0). Radi umanjenja bola 5 dana posle operacije korišćen je butorfanol svaka 4 sata. Zec je žrtvovan posle 12 nedelja nakon ugradnje implanta. Nakon toga, kost ulne sa implantiranim konstruktom i 10 mm okolne stare kosti sa koštanim defektnim regionom je uklonjena i fiksirana u 4% neutralnom formalinu, radi histološke analize koja je potom sledila.

Evaluacija dobijenih rezultata

2D radiografija: Antero-posteriororna (AP) i lateralna radiograftja primenom analize X-zracima posle 12 nedelja

3D mikro CT procena: Skyscan 1072, napon 85 kV i struja 118 μA. Trabekularna debljina, trabekularna separacija i BVF (zapreminski udeo kosti) određeni su posle 12 nedelja.

Gustina mineralizovanog dela kosti (BMD): Lunar PIXImus denzitometrija, koristeći mašinu za skeniranje regije uzorka tkiva novonastale kosti posle 12 nedelja pri čemu su skenirani delovi uzorka podeljeni u kvadrate dimenzija od 0.08 cm.

Histološka i histomorfometrijska analiza posle 12 nedelja

Uzorci za histološke analize su pripremljeni standardnim postupkom koji uključuje fiksaciju u 4% puferovanom formaldehidu, dekalciftkaciju u mravljoj kiselini, dehidraciju i ugradnju u paraplast. Longitudinalni preseci debljine 4 μm bojeni su hematoksilinom i eozinom, Goldner trihrom tehnikom, koja je pogodna za prezentaciju koštanog tkiva i Toluidin plavim, koji je pogodan za procenu koštane vitalnosti. Dvodimenzionalne fotografije su napravljene digitalnim o oapara om on , ema a . s o o a ana za e zvr ena or en em sve osnog mikroskopa (Leitz rada Luks M Fuorescence Mikroskop, Ernst Leitz Veclar GmbH, Nemačka).

Histomorfometrijska analiza je izvedena korišćenjem softverskog paketa (Nikon University Suite, verzija 4.3, Leica Microsistems, Nemačka). Četiri centralne sekcije su analizirane po uzorku, sa razmakom od 50 uM između sekcija.

Morfometrijske procena je izvršena pomoću finalnog uvećanja od 400x, pri čemu su analizirani sledeći parametri:

1. Prisustvo, ukupna površina i histološke karakteristike novoformiranog koštanog tkiva. Ovo su ujedno najvažniji parametri sa stanovišta regeneracije kosti.

2. Ukupna površina mineralizovane i ne-mineralizovane kosti. Metod trihromnog bojenja po Goldneru bio je izabran za ovu analizu, jer je dozvolio da mineralizovana kost bude prikazana u zelenom delu spektra a nemineralizovana u crvenom delu spektra. Prisustvo nemineralizovane kosti je najvažniji parametar u proceni aktivne osteogeneze i efikasnosti procesa remodelovanja kosti.

3. Ukupna površina novoformirane koštane srži.

4. Ukupna površina grafta i vezivnog tkiva čestica.

5. Prisustvo i broj ćelija inflamatornog infiltrata, što je najvažniji parametar biokompatibilnosti testiranih materijala in vivo. Polazeći od pretpostavke da će efikasnost regeneracije se razlikuje u centralnom regionu reparirane kosti u odnosu na njene periferne delove koji su u dodiru sa delom netaknute kosti svi histološki i histomorfometrijski parametri su određivani u obe ove oblasti.

Imunohistohemijsko bojenje za konfokalnu mikroskopiju

U formalinu fiksirani i u paraplast uronjeni preseci koštanih tkiva ulne zeca su pripremljeni u formi tankih slajseva, osušeni na vazduhu i deparafinizovani u nizu alkoholnih mešavina (2x5 minuta u ksilenu, apsolutni etanol, 96%, 70% etanol i destilovana voda). Isečci su čuvani 25 minuta na 90 °C u antigen demaskirajućem rastvoru (Vector Laboratories, USA). Da bi blokirali nespecifično bojenje, isečci su inkubirani u 5% goveđem serum albuminu (BSA, Sigma-Aldrich) razblaženom u PBS (PBS-BSA) tokom 30 minuta pre dodavanja primarnih i sekundarnih antitela. Prečišćena primarna antitela osteopontina, BMP2 i osteokalcina (Thermo Fisher Scientific; razblaženja 1: 200, 1: 100 i 1: 100 u odnosu na 5% BSA) su primenjena na uzorcima tokom 24 h na 4 °C, iza čega je sledio 1h inkubacije drugog Aleka Fluor 488-konjugovanog antitela (Thermo Fisher Scientific, razređenje 1: 500 u PBS) u vlažnoj tamnoj komori. Za bojenje jezgra, dodat je propidijum jodid (Thermo Fisher Scientific koncentracije 1 ug/ml) u PBS na periodima od 5 minuta na sobnoj temperaturi u tamnoj ovlaženoj komori. Svaki korak je praćen sa 3 ispiranja u PBS tokom 5 minuta. Konačno, ispitivani delovi su prekriveni fluorescentnim medijumom (DAKO, Glostrup, Danska) i ispitivani sa konfokalnim mikroskopom (Laser Scanning Microscope, LSM META 510, Carl Zeiss, USA). Sekcije su ispitivane pomoću 20 ili 40 objektiva. Da bi se potvrdila specifičnost bojenja, izvršena je kontrola bojenja sa sekundarnim antitelom (npr primarno antitelo je zamenjeno sa 5% BSA).

Rezultati

Rezultati histološke analize pokazali su da je zarastanje defekta proteklo uredno, bez komplikacija u smislu nekroze, infekcije ili krvarenja. Hirurški defekt je nakon dvanaeste nedelje zarastanja bio ispunjen novoformiranim koštanim tkivom i ostacima još uvek neresorbovanih partikula grafta. Novoformirano koštano tkivo je u kontinuitetu sa “starom” kosti, odvaja ih samo vrlo diskretna demarkaciona linija. U ovoj regiji, kao i u novoformiranoj kosti, uočene su sitne, pojedinačne partikule grafta, koje je koštano tkivo u potpunosti okruživalo, bez interponiranja vezivnog tkiva, što govori u prilog snažnih osteokonduktivnih svojstava materijala. Flistološka analiza pokazala je da je manji deo novoformirane kosti bio mineralizovan, dok je najveći deo bio još uvek nemineralizovan, što govori u prilog aktivne osteogeneze. Takođe, novoformirano koštano tkivo najvećim delom je pokazivalo znake lamelarne, zrele organizacije, sa vitalnim osteocitima, koncentrično postavljenim oko Haversovih kanala, ali je bila prisutna i fibrozna, nezrela kost, što govori u prilog aktivne remodelacije koštanog tkiva. Uočeno je da koštano tkivo u velikoj meri pokazuje spongioznu građu sa novoformiranom koštanom srži, između trabekula. Uočeni su i delove hijaline hrskavice što govori u prilog da su prisutna oba načina osifikacije, direktni i indirektni.

Rezultati histomorfometrijske analize pokazuju da je ukupna površina novoformirane kosti 37,91%, a novoformirane koštane srži, smeštene u šupljinama trabekularne kosti 40,41%, što ukupno čini gotovo 80% hirurškog defekta. Ovakav nalaz govori u prilog gotovo kompletne koštane regeneracije. Ovako povoljan terapijski rezultat može se dovesti u vezu sa izvanrednim osteokonduktivnim svojstvima materijala, veličinom partikula, njihovom poroznošću, ali i idealnom vremenskom usklađenošću između osteogeneze sa jedne strane i resorpcije materijala sa druge strane. Partikule grafta činile su 21,16 % površine defekta, i najvećim delom bile ugrađene u novoformirano koštano tkivo. Vezivnog tkiva bilo je samo po periferiji defekta. U njemu nisuuočene ćelije zapaljenskog infiltrata, što govori u prilog biokompatibilnosti materijala.

Suština tehničkog dela rešenja pronalska je u formulaciji potpuno nove procedure/procesa dobijanja specifičnog keramičko-polimernog kompakta, koja je najvećim delom sadržana u realizaciji specifične geometrije koja u svojoj hijerarhiji sadrži međusobno povezane makrostrukturne elemente reda veličine stotina mikrometara i elemente najnižeg nivoa hijerarhije reda svega nekoliko nanometara. Takva geometrija svojim specifičnostima omogućava jednostavnu proliferaciju koštanih ćelija u svim smerovima, koje se zbog izuzetno dobro definisane morfologije unutrašnjih zidova na mikro i nano nivou i aktivnih polimernih struktura veoma lako lepe i naležu na zidove skafolda što njihovu signalizaciju i transfer informacija čini izuzetno efikasnim.

To je omogućilo, pre svega dobijanje praha karbonatnog HA pomerene stehiometrije dobro definisane forme i raspodele veličine čestica na nanonivou primenom hidrotermalne metode, kombinovane sa povšinski aktivnom kopolimerom polietilen vinil acetata i polivinilaversatata. Završni nanometarski dizajn praha dat je primenom mehanohemijske metode. Drugu faza procesa obuhvatilo je dobijanje samog skafolda (keramičkog nosača dobro definisane raspodele pora i morfologije unutrašnjih zidova, koristeći metodu polimernog modela za definisanje forme skafolda i metodu sinterovanja radi postizanja njegovih konačnih mehaničkih karakteristika, dok se u zadnjoj fazi procesa izvodi depozicija vrlo tankih polimernih filmova (najčešće na bazi PLGA) i biomimetski tretmanom radi finalizacije dizajna povšine nosača, indukcijom biološkog apatita na površini date strukture keramički nosač-polimer. Parametri procesa u svim fazama definisani su vrlo precizno što proces čini visokoreproduktivnim.

Dobre hemijske karakteristike skafolda podrazumevaju, pre svega optimalnu brzinu degradacije skafolda koja treba da se nalazi u dinamičkoj ravnoteži sa brzinom nastajanja nove kosti uz posredstvo koštanih ćelija osteoblasta. Radi postizanja takvih karakteristika skafolda, prahovi HA dizajnirani su tako da njihova brzina hemijske degradacije odgovara brzini hemijske degradacije biološkog HA. Ovi sistemi imaju pomeren hemijski sastav u odnosu na stehiometrijski sastav apatita sa ugrađenim jonima, najčešće katjonima Mg<2+>i Zn<2+>i anjonima CO3<2->, SiO4<2->na pozicijama koje odgovaraju jonima kalcijuma, odnosno fosfatnim jonima. Brzina degradacije ispitivana je kroz program degradacije datih prahova u formi kapsula debljine 1 mm uz primenu trispufera i HEPES-a kao reagenasa za stabilizaciju pH vrednosti rastvora. Praćenja su izvedena u dugim vremenskim intervalima, u okviru utvrđene vremenske skale da bi se definisala kinetika degradacije hidroksiapatitnog sistema i za svaki od njih utvrdio odgovarajući proizvod rastvorljivosti.

Da bi se u punoj meri pokazao praktični efekat dobijenih koštanih granula i koštanog grafta, oni su podvrgnuti širokom spektru bioloških istraživanja, koja su pored testova implantacije, podrazumevala i niz komplementarnih testova koji uključuju test citotoksičnosti, genotoksičnosti (kometa test), LDH test, test alkalne fosfataze, na kulturama ćelija fibroblasta L929 kao i testove senzibilnosti (kutana i subkutana iritacija), kao i testove akutne i subhrone toksičnosti, te nizom testova izvedenim na matičnim ćelijama, koje su pokazale efiksanost i brzinu procesa diferencijacije matičnih ćelija u osteoblaste, na površini datih konstrukata. Svi testovi pokazali su izvrsnu osteoinduktivnost materijala i oseteintegrativnost, uz izuzetnu bioprihvatljivost i zanematljivu citotoksičnost, što materijal preporučuje za testove kliničke primene u različitim oblastima implantologije koštanog tkiva.

Claims (6)

Patentni zahtev odnosi se na:

1. Osteinduktivni graft na bazi nano-HA i kopolimera mlečne i glikolne kiseline, naznačen time, odnosi se na dizajn bioresorbilnog osteoinduktivnog grafta, metodom ekstruzionog štampanja, na bazi kompozita koji se sastoji iz aktiviranog nano-HA, prekrivenim tankim filmom PLGA, i PLA, pri različitim omerima te dve komponente unutar centralnog dela grafta i na njegovom spoljašnjem omotaču.

2. Osteinduktivni graft na bazi nano-HA i kopolimera mlečne i glikolne kiseline prema zahtevu 1, naznačen time odnosi se na hemijski postupak sinteze nanohidroksiapatita, kombinacijom hidrotermalne metode i mehanohemijske metode, pod pritiscima od 5-30 bara, na temperaturi od 125-180 °C, tokom vremena od 8-24h, uz prisustvo povšinski aktivne supstance kopolimera polivinilacetata i polivinil vesatata.

3. Osteinduktivni graft na bazi nano-HA i kopolimera mlečne i glikolne kiseline prema zahtevu 1, naznačen time odnosi se na proces optimizacije rastvorljivosti, u skladu sa procedurom dobijanja nanoHA opisanom u zahtevu 2, koji podrazumeva ugradnju različitih jona kao što su Mg<2+>, Sr<2+>, Mn<2+>i Zn<2+>, ili pak SiO4<2->jona i njihovih kombinacija, u kristalnu rešetku HA, primenom odgovarajućih hemikalija koje su nosioci takvih jona, u koncentracionim granicama između 0.5 i 3.5 at% u odnosu na odgovarajuće jone unuta nano-HA, koje izmenjuju (jone Ca<2+>i PO4<3->).

4. Osteoinduktivni graft na bazi nano-HA i kopolimera mlečne i gčokpčne kiseline prema zahtevu 1, naznačen time odnosi se na nano-HA sferne ili štapićaste forme dimenzija dužine do 100 nm i prečnika nekoliko nanometara, dobijen postupcima sinteze hifrotermalne obrade uz primenu površinski aktivne supstance na nazi polietilenvinilacetata i polietilenvinilversatata, kao i drugim srodnim metodama sinteze, kao što su metoda udruženih agenasa, metoda dvostruke micele i metode sinteze u periodičnom ultrazvučnom ili radiofrekventnom polju.

5. Osteinduktivni graft na bazi nano-HA i kopolimera mlečne i glikolne kiseline, naznačen time, odnosi se na granule, dobijene primenom poliuretanske mreže kao makro templejta i mreže nano-HA u suspenziji hidroksimetil celuloze (HC), koja formira tanki film na površini nano-HA kao mikrotemlejta i čestica dispergujuće faze reda veličine 100 do 300 μm, uz dodatak visokoadhezivnih skrobnih etara, montimorilonita i heksa metafosfata, koji obezbeđuju da sistem mehanički ne kolapsira pri brzom sinterovanju i omogućavaju učvršćivanje veza između čestica nano-HA, stvarajući veoma porozne kompakte zadovoljavajućih mehaničkih karakteristika.

6. Osteinduktivni graft na bazi nano-HA i kopolimera mlečne i glikolne kiseline, naznačen time, odnosi se na način štampanja grafta, prema kome je svaki naredni red postavljen pod uglom od najčešće 50° u odnosu na prethodni sloj, na taj način proizvodeći međusobno povezane pore i obezbeđujući dobre mehaničke karakteristike grafta i njegovu primenu ne samo kod superkritičnih defekata svih vrsta u maksilofacijalnoj hirurgiji, nego i kod opterećenih delova kosti, kao i kod produženja dužine kosti gornjih i donjih ekstremiteta, te rešavanje defekata dugih kosti i incizija velikog obima, kao i u oblasti rekonstruktivne hirurgije koštanih tkiva koja su bila prethodno obolela od karcinoma kostiju ili kod primene u oblasti plastične hirurgije kod rekonstruktivnih zahvata na kostima lica.

20