RS20201166A1 - Detekcija toksina korišćenjem nanopora - Google Patents

Abstract

Predmetni pronalazak se odnosi na postupke, uređaje i nanopore za detekciju toksina u uzorku.

Description

DETEKCIJA TOKSINA KORIŠĆENJEM NANOPORA

OBLAST TEHNIKE

Predmetni pronalazak se odnosi na postupke, uređaje i nanopore za detekciju toksina u uzorku. Predmetni pronalazak se takođe odnosi na postupke dijagnostikovanja infekcije, postupke procene kvaliteta kozmetičkog uzorka koji sadrži toksin bakterije Clostridium botulinum i postupke detektovanja botulizma koji se prenosi hranom.

STANJE TEHNIKE

Infektivne bolesti dominiraju na tržištu molekularne dijagnostike sa udelom od preko 50,0% u 2014. godini zbog prisustva velikog obima upotrebe alata za molekularno ispitivanje za detekciju izuzetno velikog broja zaraznih bolesti (9). Očekuje se da će globalno tržište molekularne dijagnostike dostići preko 9,50 milijardi USD do 2022. godine, prema novom izveštaju kompanije Grand View Research Inc. Tako, sve veća potražnja za brzim i prenosnim uređajima prilagođenim za korisnika, za analizu i detekciju zaraznih bolesti, ključni je faktor koji pokreće unosan rast sektora uređaja za negu. Procenjuje se da će ovaj sektor rasti kumulativnom godišnjom stopom rasta od 11,8% tokom predviđenog perioda od 2015-2022. Jedna specifična oblast tržišta molekularne dijagnostike fokusirana je na detekciju neurotoksina, toksina Clostridium tetanus i Clostridium botulinum, kao i njihovih antitoksina. Ovi neurotoksini mogu imati ozbiljne štetne posledice po zdravlje ljudi, što bez primene antitoksina može imati smrtne posledice (1). Na primer, botulinum toksin izaziva bolest poznatu kao botulizam, koja se može prenijeti sirovom, neobrađenom hranom, preko rana i u obliku botulizma kod novorođenčadi (4).

Detekcija ovih toksina je od značaja za brojne sektore uključujući zdravstvene sisteme za dijagnostiku, vlade i biološke odbrambene industrije. Konkretno, industrija bezbednosti hrane oslanja se na detekciju botulinuma, a kozmetička industrija testira kvalitet botulinum toksina. Toksini Clostridium tetanus i Clostridium botulinum se produkuju i u femtomolarnim količinama kod čoveka. Takve količine mogu za nekoliko dana naneti ozbiljnu štetu različitim sistemima organa. Stoga je trenutna praksa davanje antitoksina odmah po dolasku pacijenta sa potencijalno zaraženom ranom u zdravstveni centar / bolnicu, bez izvođenja dijagnostičkih testova ili testova na nivou antitoksina (5). Trenutna praksa oslanja se samo na istorijske anamneze primene vakcine (antitoksina) i na procenu samog pacijenta (5).

Uprkos gorenavedenom, ,,zlatni“ standard za detekciju i karakterizaciju egzotoksina, uključujući toksina bakterija Clostridium tetanus i Clostridium botulinum, je test smrtnosti miša. Ostale dijagnostičke postupke koje se koriste uključuju lančanu reakciju polimeraze (PCR) i njihove modifikacije, kao i enzimski-zasnovan imunosorbenski test (ELISA).

Test smrtnosti miša uvedena je 1985. Analiza zahteva primenu različitih doza toksina ili rastvora toksina na grupu laboratorijskih miševa tokom određenog perioda. Vreme potrebno za postizanje rezultata je u proseku četiri dana, a granica detekcije je 20-30 pg/ml. U testu smrtnosti miša mogu se koristiti različite vrste uzoraka, poput bakterijskih kultura, krvnog seruma, fekalija, sadržaja stomaka i uzoraka iz okoline (7).

Metoda kvantitativne PCR (qPCR) može da se koristi za indirektno detekciju prisustva toksina detekcijom genomskog materijala Clostridium bakterija pomoću specifičnih prajmera . qPCR postupci nisu u mogućnosti da direktno otkriju toksine, ali su značajne za detekciju bakterija koje proizvode te toksine (7).

ELISA je biohemijski test koji je prvi put opisan 1978. Vreme potrebno za dobijanje podataka je 2 dana, a granica detekcije je 10 MLD50 (srednja letalna doza). Mogu se koristiti različiti uzorci, ali zbog niske granice detekcije i čestih lažno pozitivnih rezultata, retko se koristi u dijagnostičke svrhe (7).

Jedna od glavnih prepreka koja sprečava ranu, brzu i pouzdanu detekciju toksina Clostridium tetanus i Clostridium botulinum i dijagnozu odgovarajućih bolesti je niska femtomolarna koncentracija ovih toksina u bilo kom od datih uzoraka. Kao što je prethodno navedeno, mnogi od postojećih postupaka detektovanja nisu u stanju da detektuju femtomolarne koncentracije egzotoksina u krvi (7). Ostala pitanja koja treba razmotriti u vezi sa gore navedenim postupcima uključuju etička razmatranja i troškove korišćenja testova smrtnosti miša. Dalje, trenutni dostupni postupci ne mogu pouzdano da otkriju toksine u roku od nekoliko sati (7).

TEHNI KI PROBLEM

Postoji hitna potreba za poboljšanim postupcima za brzu detekciju toksina u uzorku. Pri razvoju takvih postupaka moraju se uzeti u obzir tri ključna parametra. Oni uključuju: (i) vreme potrebno za izvođenje postupka (11); (ii) osetljivost postupka detekcije; i (iii) prenosivost bilo kojeg takvog postupka. Predmetni pronalazak se bavi ovom potrebom obezbeđivanjem novih postupaka i uređaja za osetljivu i pouzdanu detekciju toksina u uzorku, pri čemu koncentracija toksina može biti u femtomolarnom opsegu, a postupak detekcije može se izvršiti u roku od nekoliko sati, ako ne i minuta, od dobijanje uzorka.

SUŠTINA PRONALASKA

Predmetni pronalazak zasnovan je na stvaranju novih postupaka, uređaja i nanopora za detekciju toksina u uzorku. Postupci i uređaji iz predmetnog pronalaska koriste elektroforetski pogonjenu translokaciju molekula kroz nanoporu za detekciju toksina u femtomolarnoj koncentraciji na osnovu njihovih fizičkih karakteristika, kao što su veličina, zapremina i naelektrisanje. Postupci detekcije, uređaji i nanopore mogu se koristiti za direktnu detekciju toksina u uzorku ili za indirektnu detekciju toksina obrazovanjem konjugata toksina sa antitelima i aptamerima specifičnim za toksin.

Postupci, uređaji i nanopore predmetnog pronalaska mogu se koristiti za tačnu detekciju toksina u roku od 90 minuta od dobijanja uzorka. Dalje, ovde opisani postupci i uređaji mogu da detektuju toksine u koncentraciji ispod 1pg / ml i dozvoljavaju više, testova za detekciju toksina korišćenjem jedne ili više nanopora i / ili nanopipeta. Tako, metode, uređaji i nanopore predmetnog pronalaska su veoma korisne u poređenju sa prethodno opisanim postupcima, uređajima i nanoporama, jer omogućavaju osetljivu detekciju toksina u uzorku u realnom vremenu. Shodno tome, predmetni pronalazak daje rešenja za gore navedene potrebe.

Shodno tome, pronalazak obezbeđuje:

Postupak otkrivanja toksina u uzorku, koji obuhvata:

(a) propuštanje uzorka kroz nanoporu; i

(b) merenje jonske struje.

Pronalazak takođe obuhvata:

Upotrebu nanopore u postupku otkrivanja toksina u uzorku, postupak koji obuhvata:

(a) propuštanje uzorka kroz nanoporu; i

(b) merenje jonske struje.

Dalje, pronalazak obezbeđuje:

Uređaj koji sadrži cis komoru i trans komoru, koje su povezane jednom ili više nanopora i pri čemu je elektroda postavljena u svakoj komori; pri čemu je elektroda povezana sa pojačavačem struje.

Pronalazak takođe obezbeđuje:

Nanoporu pogodnu za detekciju toksina u uzorku, gde postupak obuhvata:

(a) propuštanje uzorka kroz nanoporu; i

(b) merenje jonske struje.

Pronalazak takođe obuhvata:

Postupak dijagnostikovanja infekcije subjekta bakterijom koja proizvodi toksin, gde dati postupak obuhvata izvođenje postupka prema pronalasku za detekciju navedenog toksina.

Pronalazak takođe obuhvata:

Postupak dijagnostikovanja tetanusa ili njegovog rizika kod subjekta izvođenjem postupka dijagnostikovanja infekcije subjekta kako je ovde opisan za detekciju toksina Clostridium tetani. Pronalazak takođe obuhvata:

Postupak dijagnostikovanja botulizma ili njegovog rizika kod subjekta izvođenjem postupka dijagnostikovanja infekcije subjekta kako je ovde opisan za detekciju toksina Clostridium botulinum.

Pronalazak takođe obuhvata:

Postupak prema pronalasku, koji dalje uključuje primenu terapeutskog agensa, kao što je antitoksin koji neutrališe toksin, subjektu za kojeg je pomenutim postupkom utvrđeno da ima toksin.

Pronalazak takođe obuhvata:

Postupak za procenu kvaliteta kozmetičkog uzorka koji sadrži toksin Clostridium botulinum, gde dati postupak obuhvata izvođenje postupka prema pronalasku za detekciju toksina Clostridium botulinum.

Pronalazak takođe obuhvata:

Postupak za detekciju botulizma koji se prenosi hranom ili njegovog rizika, gde pomenuti postupak obuhvata izvođenje postupka prema pronalasku za detekciju toksina Clostridium botulinum.

Kratak opis slika

Slika 1: Tehnički crtež kertridža. Gore levo je prikazan pogled odozgo na kertridž koji pokazuje sve dimenzije. Za dodavanje pufera i uzorak potrebna su dva otvora od 2 mm. Centralni kanal obezbeđuje vezu između leve (cis) i desne (trans) komore u koju se ubacuje nanopipeta i zatim zatvara. Dole desno prikazan je trodimenzionalni prikaz kertridža.

Slika 2: Eksperimentalna postavka koja se koristi za snimanje jonske struje nanopipetom. Dve komore (cis i trans) povezane su jednom nanopipetom u kojoj je vrh nanopore okrenut ka cis komori. U svakoj komori postoji po jedna elektroda povezana na pojačavač struje. Negativna elektroda je u cis komori, a pozitivna u trans komori.

Slika 3: Fizičke karakteristike toksina korišćenih u pronalasku. (A) Grafikon molekulske težine u kDa toksina u odnosu na njihove izoelektrične tačke. (B) Tabela koja sumira procenjenu molekulsku težinu, prečnik i izoelektričnu tačku toksina tetanusa (TT), botulinum toksina tipa A (BTA) i botulinum toksina tipa E (BTE). (C) Strukture različitih TT i BT toksina / podjedinica su prethodno okarakterisane (6). Prikazane su trodimenzionalne molekularne strukture TT, BTA i BTE.

Slika 4: Normalizovani histogram površine događaja u femto-kulonima za translokacije nanopipetama monomernih i multimernih (pentamernih) BTA aptamera. Veličina uzorka za monomerni BTA i multimerni BTA je 3751, odnosno 750.

Slika 5. Primeri merenja jonske struje kontrole, toksina i toksin-antitoksina. (A) Kontrolni eksperiment u odsustvu toksina (gornji dijagram), dodavanje toksina (TT) u cis komoru (srednji dijagram) i dodavanje TT, zajedno sa antitelom TT antitelom u cis komoru (donji dijagram). (B) Kontrolni eksperiment u odsustvu toksina (gornji dijagram), dodavanje toksina (BTA) u cis komoru (srednji dijagram) i dodavanje BTA, zajedno sa pentamernim BTA aptamerima u cis komoru (donji dijagram).

Kratak opis sekvenci

SEQ ID NO: 1 prikazuje sekvencu pojedinačne jedinice aptamera koja se specifično vezuje za toksin Clostridium botulinum i čijih pet jedinica obrazuje pentamerni aptamer.

ATACGTTCGACTGCTACCCTCCACTTTTGACGGCTTCCTCGGGATTATACGGCT AACCGAGGGTGAGATGTACAGACTAG DETALJAN OPIS PRONALASKA

Podrazumeva se da različite primene opisanih postupaka i proizvoda mogu biti prilagođene specifičnim potrebama u tehnici. Takođe treba razumeti da je ovde korišćena terminologija namenjena samo opisivanju određenih izvođenja pronalaska i bez namene da ograničava obim pronalaska.

Kao što se koristi u ovoj specifikaciji i priloženim zahtevima, oblici jednine (u tekstu na engleskom) „а“, ,,an“ i ,,the“ uključuju reference u množini, osim ako kontekst jasno nalaže drugačije. Tako, na primer, referenca ,,nanopora“ uključuje ,,nanopore“, referenca ,,toksin“ uključuje ,,toksine“, referenca ,,uzorak“ uključuje ,,uzorke“, referenca ,,elektrolit“ uključuje ,,elektrolite“, referenca "elektroda" uključuje "elektrode", referenca "konjugat" uključuje "konjugate", a referenca "uređaj" uključuje "uređaje".

Sve publikacije, patenti i patentne prijave koje su ovde citirane, bilo prethodno ili u daljem tekstu, ovime su u celosti uključene referencom.

Predmetni pronalazak zasnovan je na otkriću da se toksin u uzorku može otkriti na osnovu svojih fizičkih karakteristika, kao što su veličina, oblik i naelektrisanje, merenjem promena jonske struje do kojih dolazi kada toksin prolazi kroz nanoporu. Takvi postupci detekcije mogu da se izvedu na uzorku koji sadrži sam toksin ili toksin-konjugat kako je ovde opisano.

Predmetni pronalazak se stoga odnosi na postupke, uređaje i nanopore za detekciju toksina ili konjugata toksina u uzorku. Predmetni pronalazak se takođe odnosi na postupke dijagnostikovanja infekcije kod subjekta sa bakterijom koja proizvodi toksin, i dalje obuhvata postupke za davanje terapeutskog agensa, kao što je antitoksin, subjektu kod kojeg je utvrđeno da ima toksin. Pored toga, predmetni pronalazak se odnosi na postupke procene kvaliteta toksina u kozmetičkom uzorku i postupke otkrivanja botulizma koji se prenosi hranom.

Karakteristike pronalaska su ovde detaljnije opisane.

Postupci detekcije

Pronalazak obezbeđuje postupak detekcije toksina u uzorku. Postupak detekcije toksina u uzorku obuhvata prolazak uzorka kroz nanoporu i merenje jonske struje.

Postupak detekcije može se koristiti za direktnu detekciju toksina u uzorku ili za indirektnu detekciju toksina formiranjem konjugata toksina sa antitelima i aptamerima specifičnim za toksin. Tako, u nekim realizacijama, postupak detekcije toksina u uzorku je direktan metod detekcije toksina u uzorku. Direktna detekcija opisuje detekciju nekonjugovanog toksina. Na primer, toksin nije konjugovan sa aptamerom ili antitelom, tj. toksin je u svom nativnom stanju i nije uvećan nijednim konjugovanim ostatkom koji bi uticao na njegov prolazak kroz nanoporu. Shodno tome, u nekim realizacijama pronalaska, toksin se može direktno detektovati u uzorku propuštanjem uzorka kroz kanal nanopore bez potrebe za daljim koracima konjugacije.

Svi postupci detekcije pronalaska korisne su time što se ne oslanjaju na fizičku interakciju sa nanoporom. Dakle, ovde su opisani postupci za detekciju toksina u uzorku bez interakcija. Postupak bez interakcije može opisati metodu u kojoj toksin ili toksin-konjugat fizički ne interaguju sa nanoporom. Na primer, u postupcima, uređajima i nanoporama pronalaska, dimenzije nanopore može premašiti dimenzije toksina ili konjugata toksina od interesa. Prema tome, u postupcima, uređajima i nanoporama predmetnog pronalaska, toksin ili toksin-konjugat je sposoban da u potpunosti translocira kroz nanoporu.

Dalje, postupci, uređaji i nanopore prema pronalasku obično se ne oslanjaju na obrazovanje konjugata nanopora-protein. Na primer, postupci pronalaska se ne oslanjaju na upotrebu hvatača za detekciju analita u rastvoru. Prema tome, postupci, uređaji i nanopore predmentnog pronalaska obezbeđuju brz pristup za detekciju toksina u uzorku.

Nanopore

Nanopora je ili sadrži bilo koju poru, kanal, otvor, šupljinu, itd. u supstratu ili membrani sa karakterističnim prečnikom reda veličine nanometra, koji omogućava prolaz molekula kroz istu. Nanopora za upotrebu u ovom pronalasku može da se nalazi unutar supstrata ili membrane. Nanopora može biti otvor napravljen u supstratu ili membrani. Nanopora može da se nalazi unutar otvora formiranog u supstratu ili membrani. Kao što je ovde dalje opisano, prisustvo supstrata ili membrane definiše cis stranu supstrata ili membrane i trans stranu supstrata ili membrane.

Cis strana supstrata ili membrane i trans strana supstrata ili membrane su tipično u osnovi fluidno izolovane jedna od druge, ali pri čemu se kretanje molekula, kao što su toksini ili toksin-konjugati, od trans strane supstrata ka cis strani supstrata kroz nanoporu može kontrolisano dozvoliti kroz primenu stimulusa, obično primenjenog potencijala, duž supstrata. Dakle, nanopora obezbeđuje tečnu komunikaciju između cis i trans stranica supstrata ili membrane. Cis strana supstrata ovde može da se označi kao cis komora, cis reakciona komora, cis deo, cis reakcioni deo ili cis rezervoar. Slično tome, trans strana supstrata ovde može da bude označena kao trans komora, trans reakciona komora, trans deo, trans reakcioni deo ili trans rezervoar. U jednom primeru realizacije predmetnog pronalaska, cis i/ili trans komore imaju zapreminu od ~ 48 μL (10<-6>L). Na primer, cis i/ili trans komore mogu da sadrže ~ 48 μL (10<-6>L) radnog rastvora kako je ovde opisano, pri čemu radni rastvor sadrži rastvor elektrolita, uzorak i po izboru puferovani rastvor predmetnog pronalaska.

Nanopora prema pronalasku omogućava molekulu, kao što je toksin ili toksin-konjugat, da teče sa jedne strane supstrata ili membrane na drugu pod dejstvom primenjenog potencijala. U postupcima i uređajima prema pronalasku, nanopora dozvoljava da toksin ili toksin- konjugat teče iz trans komore u cis komoru uređaja. Prema tome, uzorak koji će se testirati, a koji potencijalno sadrži toksin ili toksin-konjugat, može da se doda u trans komoru za analizu. Tipično, toksin ili toksinkonjugat u uzorku mogu da se pomeraju protokom jonske struje usled postavljanja elektrode u svaku komoru. Toksin ili toksin-konjugat u uzorku takođe može da se kreće difuzno.

U predmetnom pronalasku, nanopora se nalazi u provodnom tečnom medijumu, kao što je rastvor elektrolita. U jednoj realizaciji, rastvor elektrolita se distribuira između cis komore i trans komore, koje su povezane jednom ili više nanopora i / ili je elektroda postavljena u svaku komoru. Pojedinačne ili više elektroda mogu da budu postavljene u svaku komoru. U poželjnoj realizaciji, pojedinačna elektroda je postavljena u svakoj komori. U nekim realizacijama, elektroda je povezana sa pojačavačem snage, što može povećati jačinu struje, napona ili snage. U jednoj realizaciji, negativna elektroda je postavljena u cis komoru, a pozitivna elektroda u trans komoru. Elektrode mogu da budu sposobne, ali ne ograničavaju se, na detekciju razlika u jonskoj struji kroz dve komore ili struje tunela elektrona preko nanopore ili nanopipete. Pronalazak može dalje da obuhvati dodatnu elektrodu koja meri jonsku struju kroz nanoporu ili uređaj za prikupljanje podataka. Prema tome, u nekim realizacijama, elektrode su direktno povezane sa nanoporom ili blizu otvora nanopore. Alternativno, elektrode se postavljaju u komore na cis i trans strane supstrata ili membrane.

Postupak prema pronalasku može uključivati prolazak uzorka kroz jednu ili više nanopora. U poželjnoj realizaciji, postupak uključuje prolazak uzorka kroz jednu nanoporu. Shodno tome, u jednoj realizaciji predmetnog pronalaska datoj kao primer, uzorak koji potencijalno sadrži toksin ili toksin-konjugat dodat je u trans komoru. Dakle, primena električnog potencijala duž nanopore (tj. između dve komore) dovodi do toga da se toksin ili toksin- konjugat translocira iz trans komore u cis komoru kroz nanoporu. U poželjnoj realizaviji, nanopora prema pronalasku je nanopipeta i / ili nanopipeta sa vrhom koji je okrenut prema cis komori. Termin nanopora može ovde da se koristi za opisivanje nanopore ili nanopipete.

Veličina pora nanopore ili nanopipete je podešena ja tako da odgovara veličini toksina od interesa ili konjugata toksina kao što je ovde opisano. Tipično, prečnik nanopore ili nanopipete je veći od prečnika toksina ili konjugata toksina kako je ovde opisano. Na primer, prečnik nanopore ili nanopipete je najmanje 1,5 puta, najmanje 2 puta, najmanje 2,5 puta, najmanje 3 puta, najmanje 4 puta ili najmanje 5 puta veći od predviđenog prečnika toksina ili toksin -konjugata. U poželjnoj realizaciji, prečnik nanopore ili nanopipete kreće se od 1,5 puta do 3 puta prečnika toksina ili konjugata toksina. U jednoj realizaciji datoj kao primer, prečnik nanopore ili nanopipete kreće se od 10 nm do 300 nm, od 20 nm do 250 nm, od 30 nm do 200 nm ili od 50 nm do 150 nm za detekciju konjugata toksina. U poželjnoj realizaciji pronalaska, prečnik nanopore ili nanopipete kreće se od oko 50 nm do oko 150 nm za detekciju konjugata toksina. U sledećoj realizaciji datoj kao primer, prečnik nanopore ili nanopipete kreće se od 1 nm do 50 nm, od 2 nm do 40 nm, 3 nm do 30 nm ili od 5 nm do 25 nm za detekciju samog toksina. U poželjnoj realizaciji pronalaska, prečnik nanopore ili nanopipete kreće se od oko 5 nm do oko 25 nm za detekciju samog toksina. U bilo kojoj ovde opisanoj metodi ili uređaju, nanopora ili nanopipeta može biti biološka nanopora, nanopora čvrstog stanja, sintetička nanopora ili hibridna nanopora koja sadrži biološku ili sintetičku nanoporu u supstratu u čvrstom stanju. U poželjnoj realizaciji, nanopora ili nanopipeta je nanopora ili nanopipeta čvrstog stanja koja sadrži otvor formiran u supstratu u čvrstom stanju.

Supstrat u čvrstom stanju obično nije biološkog porekla. Drugim rečima, sloj u čvrstom stanju obično nije izveden ili izolovan iz biološke sredine kao što je organizam ili ćelija ili sintetički proizvedena verzija biološki dostupne strukture.

Supstrat u čvrstom stanju može da se formira u slojevima i od organskih i od neorganskih materijala ili od polimera i / ili može da sadrži staklo, silicijum, kao što je silicijum nitrid (SiN) i / ili a (SiO2); aluminijum, kao što je aluminijum oksid (Al<2>O<3>); titan, kao što je titan oksid TiО<2>); hafnijum, kao što je hafnijum oksid (HfO<2>); plastiku kao što je Teflon® ili elastomere poput dvokomponentne vulkanizovane silikonske gume; grafen; i kompozitni supstrat ili supstrat strukturne podloge koji sadrži dva ili više gore definisanih materijala, kao što je SiO<2>/SiN/SiO<2>supstrat.

U poželjnoj realizaciji pronalaska, nanopora je kvarc-borosilikatna pora. Pronalazači su otkrili da upotreba tako stabilnog materijala omogućava više merenja (do 1000) ponovnom upotrebom jedne nanopore ili nanopipete. Shodno tome, predmetni pronalazak pruža jeftin dijagnostički alat za višekratnu upotrebu.

U bilo kojoj od postupaka pronalaska, mogu se koristiti pojedinačne nanopore i / ili nanopipete ili više njih. Kada se koristi više nanopora i / ili nanopipeta, mogu da sadrže iste ili različite materijale. Na primer, tamo gde se koristi više nanopora i / ili nanopipeta, one mogu da sadrže iste ili različite supstance u čvrstom stanju.

Pronalazak dalje obezbeđuje nanoporu pogodnu za detekciju toksina u uzorku, postupak koja uključuje prolazak uzorka kroz nanoporu i merenje jonske struje kao što je ovde opisano.

Merenje jonske struje

Može se meriti svojstvo koje zavisi od toksina ili konjugata toksina koji se translocira kroz nanoporu. Merenja su električna merenja, posebno merenja jonske struje koja teče kroz nanoporu. U poželjnoj realizaciji pronalaska, može da se meri protok jonske struje kroz nanoporu. Kao što je ovde diskutovano, svojstvo ne zavisi od interakcije između toksina ili konjugata toksina i nanopore ili nanopipete. Dakle, postupak je postupak bez interakcije.

Sistem analize meri svojstvo, proizvodeći merenje koje zavisi od prisustva toksina. Poželjno je da sistem za analizu meri svojstvo u odnosu na nanoporu ili nanopipetu, poželjno je da sistem za analizu meri jonsku struju koja protiče kroz nanoporu ili nanopipetu pod dejstvom primenjenog potencijala kao promenu struje, napona ili njihove kombinacije. Shodno tome, nanopora ili nanopipeta su konstuisani tako da dozvoljavaju da joni pokretani primenjenim

se promena jonske struje duž nanopore ili nanopipete. Jonska struja se odnosi na struju na jednom otvoru nanopore ili nanopipete koja potiče od kretanja jona kada se u rastvoru jonske soli primeni napon.

U predmetnom pronalasku, promena jonske struje može dabude posledica translokacije toksina ili konjugata toksina kroz nanopore ili nanopipete. Promena jonske struje može da bude povećanje ili smanjenje jonske struje. U poželjnoj realizaciji, promena jonske struje je smanjenje jonske struje. U narednoj realizaciji, promena jonske struje je zastoj jonske struje, koji može da bude reprezentativan za fizičke karakteristike toksina ili konjugata toksina kako je ovde opisano. Zastoj jonske struje odnosi se na fizički efekat blokiranja jonske struje propuštanjem naelektrisanog molekula kroz nanoporu kako je ovde opisano, a koji se kreće elektroforetskom silom. Dakle, smanjenje jonske struje ili zastoj jonske struje može da ukase na prisustvo toksina ili konjugata toksina.

Tokom translokacije toksina ili konjugata toksina zuž nanopore ili nanopipete, prisustvo toksina ili konjugata toksina utiče na jonsku struju koja teče kroz nanoporu ili nanopipetu na način specifičan za taj toksin. Dakle, fluktuacije jonske struje mogu da otkriju identitet toksina ili konjugata toksina. Na primer, određeni toksin će smanjiti ili sniziti struju koja teče kroz nanopore tokom određenog srednjeg vremenskog perioda i do određene mere. Drugim rečima, toksin ili konjugat toksina stvara jedinstveni električni potpis koji delom zavisi od prečnika nanopore ili nanopipete. Znači, struja koja teče kroz nanoporu ili nanopipetu je karakteristična za određeni toksin. Merenje promene jonske struje može obuhvatati merenje promene provodljivosti, napona ili njihove kombinacije.

Mogu se izvesti kontrolni eksperimenti kako bi se utvrdio efekat određenog toksina na struju koja teče kroz nanoporu. Na primer, kontrolni uzorak može biti uzorak koji sadrži toksin ili toksinkonjugat od interesa. Rezultati sprovođenja postupka pronalaska na uspitanom uzorku mogu se zatim uporediti sa rezultatima dobijenim iz takvog kontrolnog eksperimenta kako bi se identifikovao određeni toksin. U realizaciji datoj kao primer, nanopora ili nanopipeta ima prečnik koji je veći od prečnik toksina Clostridium botulinum, a translokacija uzorka koji sadrži toksin Clostridium botulinum pripremljenog u rastvoru elektrolita, kroz nanoporu ili nanopipetu remeti jonsku struju koja teče kroz nanoporu ili nanopipetu. Tako se u uzorku može detektovati toksin Clostridium botulinum. U drugoj realizaciji, nanopora ili nanopipeta ima prečnik koji je veći od prečnika toksina Clostridium tetanus, a translokacija uzorka koji sadrži toksin Clostridium tetanus pripremljenog u rastvoru nanopipetu. Dakle, toksin Clostridium tetanus se može detektovati u uzorku.

Promena jonske struje izazvana kretanjem kroz nanoporuvariraće u zavisnosti od veličine toksina ili konjugata toksina u uzorku; prečnik nanopore ili nanopipete; vrsta soli koja se koristi u pronalasku; koncentracija date soli; i jačina struje koja ulazi u pojačavač snage. Promena jonske struje ograničena je strujom koja ulazi u pojačavač snage. Tako će maksimalna promena jonske struje biti jednaka struji koja napaja pojačavač snage. Na primer, ako je struja koja ulazi u pojačavač snage iznosi 10 nanoampera (nA), tada će maksimalna promena jonske struje koja se primećuje kada toksin pređe nanopore i / ili nanopipete iznositi 10 nA. Promena jonske struje izazvana blokadom nanopore ili nanopipete u uzorku je tipično u opsegu od 0,01 nA do 50 nA. Promena (povećanje ili smanjenje) jonske struje uzrokovana blokadom nanopore ili nanopipete je poželjno u opsegu od 1 nА do 40 nA, od 2 nA do 30 nA, od 5 nA do 15 nA. U poželjnoj realizaciji pronalaska, promena jonske struje izazvana blokadom nanopore ili nanopipete u uzorku je u opsegu od 5 nA do 15 nA. U nekim primerima izvođenja, promena jonske struje izazvana blokadom nanopore ili nanopipete u uzorku je u opsegu od 2 nA do 8 nA.

Promena jonske struje može se uporediti sa promenom jonske struje primećene u kontrolnom uzorku. Tako se u nekim realizacijama, postupci pronalaska mogu da korist ne samo za detekciju prisustva toksina u uzorku, već i za procenu promena ili razlika u količini toksina ili konjugata toksina u uzorku. To može biti razlika u količini toksina između dva različita uzorka, između ispitivanog uzorka i kontrolnog uzorka ili kontrolne vrednosti. U nekim realizacijama, kontrolni uzorak može da bude uzorak koji ne sadrži toksin ili toksin- konjugat. U drugim realizacijama, kontrolni uzorak može da bude uzorak koji sadrži poznati toksin ili toksin-konjugat. U nekim realizacijama, kontrolna vrednost se dobija propuštanjem toksina ili konjugata toksina kroz nanoporu u skladu sa bilo kojom ovde opisanom metodom.

Uslovi

Kao što je ovde detaljno opisano, postupci i uređaji prema pronalasku uključuju merenje svojstva nanopore ili nanopipete. To je tipično struja, naročito jonska struja, koja prolazi kroz nanoporu ili nanopipetu tokom interakcije sa toksinom ili toksin-konjugatom pod dejstvom primenjenog potencijala. Pogodni uslovi za merenje jonskih struja kroz nanopore dobro su poznati u tehnici.

os upc e e c e se o no zvo e naponom o se pr men u e na supsra u nanopor nanopipeti. Primenom napona između dve elektrode stvara se električno polje koje kroz pore nanopore ili nanopipete translocira pojedinačni toksin i / ili toksin-konjugat u uzorak koji se nalazi u rastvoru elektrolita. U postupcima i uređajima prema pronalasku, primenjeni napon i rastvor elektrolita su podešeni tako da je elektroforetska sila veća od elektroosmotske sile koja deluje u suprotnom smeru. Primenjen napon je obično od -IV do IV. Primenjen napon je poželjno u opsegu koji ima donju granicu odabranu od -800 mV, -700mV, -500mV, -300 mV, -200 mV, -100 mV, -50 mV, -20mV i 0 mV i gornju granicu nezavisno izabranu od 20 mV, 50 mV, 100 mV, 200 mV, 400 mV, 600 mV, 700mV i 800 mV. Preferirani napon je u opsegu 400mV do 700mV. U preferentnoj realizaciji, upotrebljeni napon je 700 mV. Moguće je povećati razliku između različitih toksina ili konjugata toksina korišćenjem nanopore promenom primenjenog potencijala.

Metode detekcije izvedene su u prisustvu rastvora elektrolita kako je ovde opisano. Bilo koje jonsko jedinjenje može biti pogodno za upotrebu kao elektrolit, uključujući jonska jedinjenja sa jednakom ili nejednakom raspodelom naelektrisanja. Rastvor elektrolita može da bude bilo koja hloridna so alkalnog metala. U aparatu datom kao primer, so je prisutna u vodenom rastvoru u komori. Tipično se koriste litijum hlorid (LiCl), kalijum hlorid (KCl), natrijum hlorid (NaCl), rubidijum hlorid (RuCl), magnezijum hlorid (MgCl<2>) ili cezijum hlorid (CsCl). Prednost se daje KCl. Koncentracija soli može da bude od 0,01 do 2,5 M. Koncentracija soli je tipično od 0,1 do 2,5 M, od 0,3 do 1,9 M, od 0,5 do 1,8 M, od 0,7 do 1,7 M, od 0,9 do 1,6 M ili od 1 M do 1,4 M. Visoke koncentracije soli pružaju visok odnos signala i šuma i omogućavaju da se struje koje ukazuju na prisustvo toksina ili konjugata toksina identifikuju u odnosu na pozadinu normalnih fluktuacija struje. Poželjno je da se koristi kalijum hlorid i u koncentraciji od 1M

Postupci se obično izvode u prisustvu pufera. U nekim realizacijama, postupci prema pronalasku se izvode bez pufera. U aparatima datim kao primer, pufer je prisutan u vodenom rastvoru u komori. Na primer, pufer može da bude prisutan u rastvoru elektrolita kako je ovde opisano. U postupcima može da se koristi bilo koji pufer. Jedan pogodan pufer je Tris- HCl pufer. Koncentracija pufera može biti od 0,1 mM do 50 mM. Koncentracija pufera je obično od 1 mM do 40 mM, od 2 mM do 20 mM ili od 5 mM do 15 mM. U jednoj realizaciji pronalaska, pufer je Tris-HCl i dat je u koncentraciji od 10 mM.

Postupci se obično izvode na pH od 4,0 do 10,0, od 4,5 do 9,5, od 5,0 do 9,0, od 5,5 do 8,8, od 6,0 do 8,7 ili od 7,0 do 8,8 ili 7,5 do 8,5. Primenjeno pH je poželjno oko 8,2.

os upc se o no sprovo e na - o , o - o , o - o , o -°C do 20 °C, od 0 °C do 15 °C ili od 5 °C do 10 °C. U poželjnoj realizaciji, postupci se izvode na sobnoj temperaturi, pri čemu je sobna temperatura u opsegu temperatura od 20 °C do 25 °C. Da bi se sprečila razgradnja toksina, postupke treba izvoditi na temperaturi ispod 37 °C. U postupcima prema pronalasku postoji veza između provodljivosti, jonske struje i temperature.

Uzorci za ispitivanje

Postupci i uređaji prema pronalasku uključuju detektovanje jednog ili više toksina ili konjugata toksina u uzorku. Uzorak je obično dodat rastvoru elektrolita u komori kao što je ovde opisano. Dakle, uzorak se može razblažiti u rastvoru elektrolita pre dodavanja u bilo koji od ovde opisanih uređaja, ili se uzorak može dodati u komoru uređaja kao što je ovde opisano, nakon dodavanja rastvora elektrolita. Bilo koji tečni ili vodeni uzorak može da bude pogodan za upotrebu u predmetnom pronalasku. Na primer, uzorak može da bude klinički, prehrambeni, ekološki ili kozmetički uzorak. Tipično, uzorak je biološki uzorak. Uzorak može da bude bilo koji biološki uzorak, preferentno tečni uzorak. Uzorak može da bude uzorak koji je dobijen od subjekta od interesa. Subjekat je poželjno sisar. Subjekt je poželjno čovek. Subjekat može da bude kojeg uzrasta. Na primer, subjekat može biti beba ili novorođenče. Subjekt može da bude dete ili adolescent. Subjekt može da bude odrasli subjekt kao što je odrasli čovek.

Uzorak može da bude uzorak pune krvi, proizvoda krvi, urina, cerebrospinalna tečnost (CSF) ili sinovijalna tečnost. Uzorak može da bude uzorak heparinizovane pune krvi. U jednom aspektu, krvni proizvod je krvna plazma ili krvni serum. Uzorak može da se koncentruje, razblaži ili prečistiti pre testiranja. U poželjnom izvođenju, uzorak je krvna plazma.

Alternativno, uzorak može da bude bilo koji prethodno izolovani ekstrakt celog proteina prisutan u vodenoj fazi.

Postupci i uređaji prema pronalasku takođe uključuju detektovanje jednog ili više toksina ili konjugata toksina u uzorku hrane. Na primer, postupci i uređaji iz pronalaska mogu da se koriste za detektciju prisustva toksina Clostridium botulinum u uzorku hrane. U slučaju uzorka hrane, uzorak može biti ekstrakt celog proteina prisutan u vodenoj fazi, koji se uzima iz uzorka hrane. Postupci i uređaji prema pronalasku takođe uključuju detekciju jednog ili više toksina ili konjugata toksina u kozmetičkom uzorku. Na primer, postupci i uređaji prema pronalasku mogu da se koriste za određivanje kvaliteta toksina Clostridium botulinum u kozmetičkom uzorku, kao što je uzorak botoksa.

U nekim realizacijama, poželjno je izvršiti metodu prema pronalasku brzo nakon dobijanja uzorka. Na primer, tamo gde se postupak sprovodi na uzorku pune krvi ili krvne plazme koji je dobijen od subjekta, poželjno je da se krv ne skladišti pre ispitivanja. Alternativno, gde je uzorak ceo proteinski ekstrakt prisutan u vodenoj fazi, poželjno je da se uzorak ne zamrzne pre ispitivanja.

Prema tome, u nekim realizacijama, postupak prema pronalasku se izvodi u realnom vremenu. Na primer, postupak prema pronalasku se izvodi na uzorku za manje od 120 minuta, manje od 90 minuta, manje od 60 minuta, manje od 30 minuta, manje od 15 minuta, manje od 10 minuta, manje od 5 minuta ili manje manje od 1 minuta nakon što je uzorak dobijen od subjekta koji se ispituje. U poželjnoj realizaciji, postupak prema pronalasku se izvodi na uzorku u roku od 90 minuta od dobijanja uzorka. Postupak prolaska toksina kroz nanoporu ili nanopipetu može da se izvrši u roku od 5-10 minuta. Toksin ili toksin-konjugat mogu se otkriti u roku od 120 sekundi, 60 sekundi, 30 sekundi, 10 sekundi, 5 sekundi ili 3 sekunde nakon prolaska uzorka kroz nanoporu ili nanopipetu.

Subjekt može biti ,,pacijent“, na primer, pacijent koji je oboleo ili za kojeg se sumnja da je oboleo od infekcije koja je posledica bakterije koja proizvodi toksin, kao što je ovde opisano, i kojem je potreban dijagnostički tretman ili za kojeg je potrebno pratiti progresiju bolesti ili stanja.

Kao što je ovde opisano, promena jonske struje primećena kada se uzorak propušta kroz nanoporu prema pronalasku, može da se uporedi sa promenom jonske struje koja se primećuje u kontrolnom uzorku. Kontrolni uzorak je poželjno iste vrste kao i uzorak od interesa. Na primer, kada uzorak pune krvi predtavlja uzorak od interesa, kontrolni uzorak jetakođe uzorak pune krvi. Poređenje sa kontrolom može biti direktno poređenje između uzorka od interesa i kontrolnog uzorka, tj. dva uzorka mogu da se paralelno obrađuju kao deo jednog eksperimenta. Alternativno, poređenje se može zasnivati na postojećoj kontrolnoj vrednosti na osnovu jednog ili više ranijih merenja uzetih iz kontrolnih uzoraka. Kontrolna vrednost i / ili vrednost dobijena iz uzorka od interesa može da se normalizuje uzimajući u obzir različite veličine uzorka ili različite količine ili koncentracije ćelija, kao što su neutrofili, u svakom uzorku.

Termin ,,toksin“, kao što se ovde koristi, uključuje bakterijske toksine, egzotoksine i endotoksine. U poželjnoj realizaciji pronalaska, toksin je iz člana roda Clostridium. Na primer, toksin može biti iz Clostridium tetani (Flugge, 1881 - tetanus toksin) ili Clostridium botulinum (van Ermengem, 1896 - botulinum toksin). U poželjnoj realizaciji pronalaska, detektuje se ceo toksin, tj. toksin nije proteolitički odcepljen pre detekcije. Shodno ovom, u postupcima prema pronalasku nije neophodno cepanje toksina pre analize. Umesto toga, ceo toksin se može otkriti propuštanjem celog toksina kroz nanoporu ili nanopipetu. Alternativno, ceo toksin može da bude konjugovan sa aptamerom ili antitelom kao što je ovde opisano za detekciju konjugata toksina.

Clostridium tetani obično napadaju ljude kroz rane i proizvode toksin tetanus poznat i kao tetanospasmin (2). Protokom krvi, ovaj toksin nailazi na nervni sistem i vezuje se za inhibitor intemeurona, koji inhibiraju sekreciju neurotransmitera glicina i γ -aminobuteme kiseline (GABA), što dovodi do opuštanja mišića. Konačna fiziološka posledica su mišićni tonus i mišićni spazam, koji bez lečenja mogu biti smrtonosni (3).

Kao što je ovde otkriveno, nanopore i / ili nanopipete pronalaska se podešava na osnovu veličine toksina ili konjugata toksina. Tipično, u postupcima ili uređajima prema pronalasku, prečnik nanopore je veći od prečnika toksina ili konjugata toksina kako bi se omogućio postupak detekcije bez interakcija. Toksini Clostridium botulinum tipa A i E imaju procenjenu molekulsku težinu od 149,5 kDa i 143,8 kDa i prečnik od 7,51 nm, odnosno 7,43 nm. Procenjuje se da toksin Clostridium tetani ima molekulsku težinu od 150,7 kDa i prečnik od 7,56 nm (slika ЗВ). Shodno ovom, nanopora ili nanopipeta pronalaska se podeđavaju u skladu s tim. U jednoj realizaciji pronalaska koristi se staklena nanopipeta koja ima spoljašnji prečnik 0,5 mm i unutrašnji prečnik 0,3 mm ili 0,2 mm. Takva nanopipeta može se proizvesti izvlačenjem uz pomoć lasera.

U realizaciji pronalaska, koncentracija toksina ili konjugata toksina u uzorku je manja od 100 pg/ml, manja od 50 pg/ml, manja od 20 pg/ml, manja od 10 pg/ml, manja od 5 pg/ml ili manje od 1 pg/ml. U realizaciji pronalaska, toksin ili konjugat toksina se detektuje u koncentraciji manjoj od 1 pg ml. Prema tome, postupci i uređaji iz pronalaska otkrivaju toksine u uzorku u klinički relevantnim koncentracijama.

Pronalazak takođe obuhvata indirektnu detekciju toksina, detekcijom konjugata toksina, pri čemu konjugat toksina može da bude formiran dodavanjem antitela ili aptamera u rastvor elektrolita i / ili uzorka da bi se formirao konjugat toksin-antitelo ili konjugat toksin-aptamer. Konjugat toksina može da se formira u uzorku pre dodavanja radnom rastvoru (tj. antitelo ili aptamer se ne dodaju direktno u rastvor elektrolita). Alternativno, konjugat toksina može da se formira u radnom rastvoru (tj. aptamer ili antitelo se dodaju direktno u rastvor elektrolita). Takvo formiranje konjugata može biti korisno za pojačavanje signala ili za poboljšanje odnosa signal-šum. Prema tome, formiranje konjugata toksina kako je ovde opisano može omogućiti bolju detekciju toksina. U jednoj realizaciji pronalaska, radni rastvor dalje sadrži antitelo koje se vezuje za toksin od interesa. Neograničavajući primeri antitela uključuju toksine Clostridium tetanus i Clostridium botulinum. Antitelo može da se doda radnom rastvoru u koncentraciji koja je najmanje jednaka koncentraciji toksina u uzorku ili najmanje 1,5 puta, najmanje 2 puta, najmanje 2,5 puta ili najmanje 3 puta koncentracije toksina u uzorku. U poželjnoj realizaciji, antitelo se dodaje radnom rastvoru u koncentraciji koja je 1,5 puta veća od koncentracije toksina u uzorku.

Termin ,,antitelo“, kao što se ovde koristi, uključuje molekule imunoglobulina koji se sastoje od četiri polipeptidna lanca, dva teška (H) lanca i dva laka (L) lanca međusobno povezana disulfidnim vezama, kao i njihove multimere(npr. IgM). Termin ,,antitelo“, kao što se ovde koristi, takođe uključuje antigen-vezujuće fragmente celih molekula antitela, ili bilo koji njihov derivat, koji mogu doprineti stvaranju „funkcionalnog antitela“, pokazujući željenu biološku aktivnost. Izrazi „antigen-vezujući deo “ antitela, „antigen-vezujući fragment “ i slično, kao što se ovde koriste, uključuju bilo koji prirodno prisutan, enzimski dostupan, sintetički ili genetski modifikovan polipeptid ili glikoprotein koji se specifično vezuje za antigen za formiranje kompleksa.

Neograničavajući primeri antigen-vezujućih fragmenata uključuju: (i) Fab fragmente; (ii) F(ab ') 2 fragmenta; (iii) Fd fragmente; (iv) Fv fragmente; (v) jednolančane Fv (scFv) molekule; (vi) dAb fragmente; i (vii) jedinice za minimalno prepoznavanje koje se sastoje od aminokiselinskih ostataka koji imitiraju hipervarijabilni region antitela (npr. izolovani hipervarijabilni (CDR) kao što je CDR3 peptid) ili graničeni FR3-CDR3-FR4 peptid. Drugi stvoreni molekuli, kao što su domen-specifična antitela, antitela za jedan domen, antitela sa u an enm omenom, merna an e a, - a em ena an e a, e a, r a e a, e ra e a, minitela, nanotela (npr. monovalentna nanotela, bivalentna nanotela itd.), mali modularni imunofarmaceutici (SMIP) i varijabilni IgNAR domeni ajkule takođe su obuhvaćeni izrazom „antige-vezujući fragment antigen“, ko što se ovde koristi.

Termin "antitelo", kao što se ovde koristi, takođe uključuje multispecifična (npr. bispecifična) antitela. Multispecifično antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment će obično sadržati najmanje dva različita varijabilna domena, pri čemu je svaki varijabilni domen sposoban da se specifično veže za odvojeni antigen ili za različit epitop na istom antigenu. U poželjnoj realizaciji pronalaska, antitelo je monoklonalno, poliklonalno ili pojedinačno domensko antitelo.

U sledećoj realizaciji pronalaska, radni rastvor dalje sadrži aptamer koji se vezuje za toksin od interesa. Nerestriktivni primerni ciljeva aptamera uključuju toksine Clostridium tetanus i Clostridium botulinum. Aptamer možeda se doda radnom rastvoru u koncentraciji koja je barem jednaka koncentraciji toksina u uzorku ili najmanje 1,5 put, najmanje 2 puta, najmanje 2,5 puta ili najmanje 3 puta koncentracije toksina u uzorku. U poželjnoj realizaciji, antitelo se dodaje radnom rastvoru u koncentraciji koja je 2 puta veća od koncentracije toksina u uzorku.

Termin "aptamer", kao što se ovde koristi, odnosi se na jednolančane nukleinske kiseline, dvolančane nukleinske kiseline ili peptide koji imaju stabilnu tercijarnu strukturu i mogu da se vežu za ciljni molekul sa visokim afinitetom i specifičnošću. Termin "aptamer", kao što se ovde koristi, uključuje oligonukleotide ili peptidne molekule koji se vezuju za određeni ciljni molekul. Primeri neograničavajućih aptamera uključuju dezoksiribonukleinsku kiselinu, ribonukleinske kiseline, zaključane nukleinske kiseline, peptidne nukleinske kiseline, modifikovane nukleinske kiseline i analoge nukleinske kiseline. Aptamer može da bude nemodifikovan (tj. prirodni aptamer) ili modifikovan. Konkretno, modifikovan aptamer može da sadrži bare jednu hemijsku modifikaciju.

U predmetnom pronalasku, aptamer može da bude monomerni aptamer, homooligomerni aptamer ili heterooligomerni aptamer koji se specifično vezuje za toksin od interesa. Homooligomerni aptamer opisuje upotrebu vvećeg broja aptamera iste sekvence koji ciljaju toksin od interesa. Heterooligomerni aptamer opisuje upotrebu većeg broja aptamera različitih sekvenci koji ciljaju iste ili različite delove toksina. U jednoj realizaciji, aptamer je monomerni aptamer, homooligomerni aptamer ili heterooligomerni aptamer koji se vezuje ili za toksine Clostridium tetanus i Clostridium botulinum. U poželjnoj realizaciji, aptamer je pentamerni aptamer koji ima pojedinačne aptamerne jedinice sa sekvencom SEQ ID NO:

1. Aptameri su povezani sa pet nukleotida (ATCTG) i specifično se vezuju za toksin Clostridium botulinum.

Da bi se detektovalo toksin-antitelo ili konjugat toksin-aptamer, nanopore ili nanopipete mora biti podešen kako je ovde opisano. U jednoj realiaciji, prečnik nanopore ili nanopipete se kreće od 50 do 150 nm za detekciju toksin-konjugata kako je ovde opisano.

Uređaji koji sadrže nanopore

Budući da postupci prema pronalasku uključuju kretanje uzorka, po izboru uzorak koji sadrži toksin kroz nanopom ili nanopipetu pod kontrolom primenjenog potencijala, kao što je ovde opisano, u svim postupcima pronalaska nanopora ili nanopipeta su predviđene kao komponenta uređaja koja sadrži nanopom ili nanopipetu i električne elemente za kontrolu. U jednom ostvarenju, pronalazak obezbeđuje uređaj koji sadrži cis komom i trans komoru kako je ovde opisano. Cis komora i trans komora povezane su jednom ili više nanopora ili nanopipeta, pri čemu je u svakoj komori postavljena elektroda kao što je ovde opisano.

Pojedinačne elektrode ili više njih mogu da budu postavljene u svaku komoru. U opcionoj realizaciji, elektroda je povezana na pojačavač snage. U nekim realizacijama, negativna elektroda je postavljena u cis komoru, a pozitivna elektroda u trans komoru, a nanopora i / ili vrh nanopipete okrenuti su prema cis komori. Elektrode mogu da imaju sposobnost da, ali se ne ograničavaju na to, da detektuju razlike u jonskoj struji kroz dve komore ili struje tunela elektrona (electron tunneling currents) preko nanopore ili nanopipete. Pronalazak može dalje da obuhvati dodatnu elektrodu koja meri jonsku struju kroz nanopom ili uređaj za prikupljanje podataka. Prema tome, u nekim realizacijama, elektrode su usmereno povezane sa nanoporom ili blizu otvora nanopore. Alternativno, elektrode se postavljaju u komore na cis i trans strane supstrata ili membrane.

Broj nanopora i / ili nanopipeta u uređaju može biti najmanje 1, najmanje 2, najmanje 5, najmanje 10, najmanje 20, najmanje 50 ili najmanje 100 nanopora ) ili nanopipeta. U poželjnoj realizaciji pronalaska, uređaj sadrži pojedinačnu nanopom ili nanopipetu (tj. jednu nanopom ili nanopipetu). Nanopore za upotrebu u uređaju mogu biti nanopore u skladu sa bilo kojim od ovde objavljenih otkrića. Na primer, nanopora može da bude nanopipeta. Nanopora može biti

borosilikatna pora.

Uređaj može biti isporučen sa ili bez rastvora elektrolita. Tamo gde je uređaj ima rastvor elektrolita, rastvor elektrolita je distribuiran između cis i trans komora i fluidno je povezan nanoporom ili nanopipetom. Rastvor elektrolita može biti bilo koji rastvor elektrolita kako je ovde opisano. U poželjnoj realizaciji, rastvor elektrolita je rastvor kalijum hlorida. U jednoj realizaciji pronalaska datoj kao primer, cis i/ili trans komore imaju zapreminu od ~48 mL (10<-6>L). Na primer, cis i/ili trans komore mogu da sadrže ~ 48 mL (10<-6>L) radnog rastvora kako je ovde opisano, pri čemu radni rastvor sadrži rastvor elektrolita i puferovani rastvor predmetnog pronalaska. Ovde opisani uređaji mogu se koristiti za detekciju toksina ili konjugata toksina u uzorku. Na primer, uzorak za ispitivanje može da se doda rastvoru elektrolita koji se nalazi u trans komori uređaja. Nakon primene električnog potencijala preko nanopore ili nanopipete sadržane u uređaju, uzorak translocira nanopore ili nanopipete iz trans u cis rezervoar. Ako uzorak sadrži toksin ili konjugat toksina, to može dovesti do promene jonske struje, koja se može detektovati kako je ovde opisano.

Neograničavajući uzorni pregledi koji ilustruju uređaje pronalaska dati su na slikama 1 i 2.

Postupci dijagnoze

Pronalazak obezbeđuje postupke dijagnosticiranja koje se mogu koristiti za određivanje stanja subjekta. Ovde opisani postupci mogu se koristiti za detekciju ili dijagnosticiranje infekcije bakterijom koja proizvodi toksin kod subjektom. Na primer, postupci prema pronalasku mogu se koristiti za detekciju ili dijagnosticiranje prisustva toksina, kao što je neurotoksin, u subjektu. Ovde opisani postupci za detekciju toksina Clostridium tetani mogu se koristiti za detekciju ili dijagnozu tetanusa ili njegovog rizika kod subjekta. Ovde opisani postupci za detekciju Clostridium botulinum mogu se koristiti za detekciju ili dijagnozu botulizma ili njegovog rizika kod subjekta.

Shodno tome, predmetni pronalazak obezbeđuje metodu detektovanja prisustva toksina kod sisara. Subjekt sisara može biti komercijalno uzgajana životinja, kao što je konj, krava, ovca ili svinja, laboratorijska životinja, poput miša ili pacova, ili kućni ljubimac, poput mačke, psa, zeca ili zamorca. Poželjno, subject je čovek.

Poželjno, uzorak je in vitro uzorak.

Dijagnostički postupci prema pronalasku mogu da obuhvate bilo koji jedan ili više ovde opisanih koraka. Na primer, postupci mogu da obuhvate procenu količine jednog ili više toksina pronalaska u uzorku i upoređivanje te količine sa kontrolnom vrednošću.

Dijagnostički postupcimogu se sprovesti upotrebom bilo koje ovde opisane metode detekcije. Ovi postupci mogu da se primene za pružanje informacija lekaru u vezi s prognozom i budućim lečenjem subjekta. Na primer, subjekat kome je dijagnostikovano prisustvo toksina primenom postupka prema pronalasku može zatim da se leči od datog toksina kao rezultat te dijagnoze.

Postupci prema pronalasku mogu dalje da sadrže korak davanja terapeutskog agensa, kao što je antitoksin koji neutrališe toksin, subjektu kojm je identifikovano metodom kao što je ovde opisano prisustvo toksina kao što je ovde opisan. U realizaciji datoj kao primer, kod subjekta može da bude identifikovano prisustvo toksina Clostridium tetanus ili Clostridium botulinum toksin.

Primene

Pronalazak se takođe odnosi na upotrebu nanopore ili nanopipete u metodi za detekciju toksina ili konjugata toksina kao što je ovde opisano u uzorku, postupak uključuje prolazak uzorka kroz nanoporu i merenje jonske struje.

Upotreba nanopore može da bude korisna za detekciju toksina u biotečnosti. Na primer, nanopora može da se koristi za detekciju prisustva potencijalno smrtonosnih neurotoksina u uzorku od subjekta kao što je gore opisano.

Alternativno, ovde opisane nanopore, postupci ili uređaji mogu da se koriste za određivanje kvaliteta toksina Clostridium botulinum za upotrebu u kozmetičkoj industriji (tj. aa Botoks). Na primer, ovde opisane nanopore, postupci ili uređaji mogu da se koriste za određivanje da li je toksin Clostridium botulinum oštećen i / ili intaktan u uzorku. U takvim okolnostima, ako je toksin oštećen i / ili fragmentisan, jedinstveni električni potpis toksina Clostridium botulinum će se promeniti. Shodno tome, upoređivanjem jonske struje kozmetičkog uzorka sa jonskom strujom izmerenom u kontrolnom uzorku, korisnik može da detektuje promene u fizičkim karakteristikama toksina. Takve promene u fizičkim karakteristikama mogu ukazivati na to da je kozmetički uzorak lošeg kvaliteta. Alternativno, nedostatak promene jonske struje kozmetičkog uzorka u poređenju sa kontrolnim uzorkom može ukazivati na to da je kozmetički uzorak dobrog kvaliteta i / ili da je pogodan za injekciju. Shodno tome, pre metn prona aza ta o e o ez e ue meto u procene va teta ozmet og uzor a o sa r toksin Clostridium botulinum, pomenuti postupak obuhvata izvođenje bilo koji od ovde opisanih metoda za detekciju toksina Clostridium botulinum.

U naredoj realizaciji, ovde opisane nanopore, postupci ili uređaji mogu da se koriste za olakšavanje ispitivanja botulizma koji se prenosi hranom u sirovim životinjskim ili biljnim proizvodima. Na primer, ovde opisane nanopore, postupci ili uređaji mogu da se koriste za određivanje toga da li je toksin Clostridium botulinum prisutan u uzorku hrane. Shodno tome, predmetni pronalazak takođe obezbeđuje metodu za detekciju botulizma koji se prenosi hranom ili njegovog rizika, pomenuti postupak obuhvata izvođenje bilo koje od ovde opisanih postupaka za detekciju toksina Clostridium botulinum.

Kompleti

Nanopore i / ili uređaji prema pronalasku mogu se spakovati u komplet, pri čemu komplet može da sadrži uputstva za upotrebu uređaja ili nanopore.

Sledeći primeri ilustruju pronalazak.

Primeri

Primer 1: Proizvodnja staklene nanopipete

Staklena kapilara spoljašnjeg prečnika od 0,5 mm i unutrašnjeg prečnika od 0,3 mm / 0,2 mm izrađena je laserskim izvlačenjem (15).

Primer 2: Izrada plastičnih čipova

Uložak od plastike prikazan na slikama 1 i 2 proizveden je ubrizgavanjem plastike u prototip kalupa. U proizvodnji kertridža korišćeni su materijali otporni na sol i nekorozivni materijali. Posebno, kertridž se sastoji od dva dela: jednog od polipropilenskog plastičnog materijala, a drugog od stakla ili prozirnog plastičnog materijala. Plastični deo se sastoji od dve komore zapremine ~ 48 mL (10<-6>L) i dva otvora za dodavanje ili izmenu rastvora. Staklena nanopipeta, kao što je opisano u primeru 1, smeštena je u centralni spojni kanal, koji se nalazi između leve i desne komore (cis i trans). Kad je staklena nanopipeta postavljena na mesto, zalepi se na stakleno dno ili plastičnu komponentu pomoću lepka otpornog na koroziju.

Primer 3: Detekcija konjugata toksin-antitelo u rastvoru pomoću nanopipete

Obe komore uložaka punjene su radnim puferom (1M KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,2) dok se staklena nanopipeta nije napunila. Dobijene su kalibracione IV krive za svaku nanopipetu kako bi se proverila provodljivost i kvalitet (slika 5A, gornji dijagram). Kriva IV opisuje linearnu krivu struje u odnosu na primenjeni napon. Kontrolno merenje je dobijeno pod konstantnim naponom od 700 mV.

Pojedinačni toksin (TT; kupljen od Sigme Aldrich) dodat je u radni pufer u cis komori u koncentraciji od 0,15-0,35 mM i zabeleženi su tragovi jonske struje na 700 mV (slika 5A, srednji dijagram). Konačno, u radni pufer je dodato poliklonalno antitelo na TT sa 1,5 put većom koncentracijom toksina, a jonski tragovi su zabeleženi na 700 mV (slika 5A, donji dijagram). Primer 4: Detekcija konjugata toksin-aptamer u rastvoru pomoću nanopipete

Kao i prethodno, obe komore uložaka napunjene su radnim puferom (1M KCl, 10 mM Tris- HCl, pH 8,2) dok se ne napuni staklena nanopipeta. Dobijene su kalibracione IV krive za svaku nanopipetu kako bi se proverila provodljivost i kvalitet (slika 5B, gornji dijagram). Dobijeno je kontrolno merenje pod konstantnim naponom od 700 mV.

Pojedinačni toksin (BTA; kupljen od Sigme Aldrich) dodat je u radni pufer u cis komori u koncentraciji od 0,15-0,35 mM i zabeleženi su tragovi jonski struje na 700 mV (slika 5B, srednji dijagram). Konačno, pentamerni aptamer DNK sa svakom jedinicom koja ima sekvencu SEQID NO: 1(16) dodat je u radni pufer pri dvostruko većoj koncentraciji toksina, a jonski tragovi su zabeleženi na 700 mV (slika 5B, donji dijagram). Normalizovani histogram površine događaja multimernih (pentameričnih) BTA aptamera prikazan je na slici 4.

Reference

1. Andreesen, J. R., Bahl, H., & Gottschalk, G. (1989). Introduction to the physiology and biochemistry of the genus Clostridium. In Clostridia (pp.27-62). Springer, Boston, MA.

2. Brook, I. (2008). Current concepts in the management of Clostridium tetani infection. Expert review of anti-infective therapy, 6(3), 327-336.

3. Aronoff, D. M. (2013). Clostridium novyi, sordellii, and tetani: mechanisms of disease. Anaerobe, 24, 98-101.

4. Sobel, J. (2005). Botulism. Clinical Infectious Diseases, 47(8), 1167-1173.

5. Roper, M. H. (2004). Tetanus Prophylaxis in the Emergency. Annals of emergency medicine, 43(3), 315-317.

6. Simpson, L. (Ed.). (2012). Botulinum neurotoxin and tetanus toxin. Elsevier.

7. Lindstrom, M., & Korkeala, H. (2006). Laboratory diagnostics of botulism. Clinical microbiology reviews, 19(2), 298-314.

8. Bashir, R., & Venkatesan, B. M. (2019). U.S. Patent No. 10,175,195. Washington, DC: U.S. Patent and Trademark Office.

9. Witonsky, J. (2011). Infectious disease molecular diagnostics: market review and opportunities. Genetic Engineering & Biotechnology News, 31(20), 14-14.

10. Hobbs, R. J., Thomas, C. A., Halliwell, J., & Gwenin, C. D. (2019). Rapid detection of botulinum neurotoxins—A Review. Toxins, 11(1), 418.

11. Chithra, A., Cariappa, K. M., Kamath, A. T., & Kudva, A. (2015). Role of rapid tetanus antibody test in accident and emergency department. Journal of maxillofacial and oral surgery, 14(3), 784-788.

12. Barker, G. C., Malakar, P. K., Plowman, J., & Peck, M. W. (2016). Quantification of nonproteolytic Clostridium botulinum spore loads in food materials. Applied and environmental microbiology, 82(6), 1675-1685.

13. Morel, C., McClure, L., Edwards, S., Goodfellow, V., Sandberg, D., Thomas, J., & Mossialos, E. (2016). Ensuring innovation in diagnostics for bacterial infection: implications for policy. European Observatory on Health Systems and Policies.

14. Takami, T., Park, B. H., & Kawai, T. (2014). Nanopipette exploring nanoworld. Nano Convergence, 7(1), 17.

15. Steinbock, L. J., Steinbock, J. F., & Radenovic, A. (2013). Controllable shrinking and shaping of glass nanocapillaries under electron irradiation. Nano Letters, 73(4), 1717-1723.

Steinbock, L. J., & Radenovic, A. (2016). U.S. Patent Application No.14/777,220.

16. Ryabko et al. (2014) Russian Federation Patent Application No. RU014145288/10A.

Claims (39)

Patentni zahtevi

1. Postupak detektovanja toksina u uzorku, koja obuhvata:

(a) propuštanje uzorka kroz nanoporu; i

(b) merenje jonske struje.

2. Postupak prema zahtevu 1, naznačen time, što je nanopora smeštena u rastvor elektrolita.

3. Postupak prema zahtevima 1 i 2, naznačen time, što translokacija toksina u uzorku kroz nanopore dovodi do promene jonske struje.

4. Postupak prema zahtevu 3, naznačen time, što promena jonske provodnosti je zastoj jonske struje.

5. Postupak prema bilo kom od zahteva 2 do 4, naznačen time, što se rastvor elektrolita distribuira između cis komore i trans komore, koje su povezane jednom ili više nanopora, i pri čemu je elektroda postavljena u svakoj komori.

6. Meotda prema zahtevu 5, naznačen time, što je elektroda povezana sa pojačavačem snage.

7. Postupak prema zahtevu 5 ili zahtevu 6, naznačen time, što je negativna elektroda postavljena u cis komoru, a pozitivna elektroda u trans komoru, i pri čemu je vrh nanopore okrenut ka cis komori.

8. Postupak prema bilo kom od zahteva 1 do 7, naznačen time, što postupak obuhvata prolazak uzorka kroz jednu nanoporu.

9. Postupak prema bilo kom od zahteva 1 do 8, naznačen time, što merenje promene jonske struje uključuje merenje promene struje, napona ili njihove kombinacije.

10. Postupak prema bilo kom od zahteva 1 do 9, naznačen time, što postupak je postupak bez interakcije.

11. Postupak prema bilo kom od zahteva 1 do 10, naznačen time, što toksin je bakterijski toksin, egzotoksin ili endotoksin.

12. Postupak prema bilo kom od zahteva 1 do 11, naznačen time, što bakterijski toksin je iz člana roda Clostridium.

13. Postupak prema bilo kom od zahteva 1 do 12, naznačen time, što toksin je:

(a) toksin Clostridium tetani ili

(b) toksin Clostridium botulinum .

14. Postupak prema bilo kom od zahteva 1 do 13, naznačen time, što nanopora je:

(a) nanopora čvrstog stanja; i / ili

(b) staklena nanopipeta.

15. Postupak prema zahtevu 14, naznačen time, što nanopora je kvarc-borosilikatna pora.

16. Postupak prema bilo kom od zahteva 1 do 15, naznačen time, što je promena jonske struje promena u opsegu od 5 nA do 15 nA.

17. Postupak prema bilo kom od zahteva 1 do 16, naznačen time, što se toksin detektuje u roku od 30 sekundi nakon prolaska uzorka kroz nanoporu.

18. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 17, naznačen time, što uzorak je uzorak pune krvi, proizvoda krvi, urina, cerebrospinalne tečnosti (CSF) ili sinovijalne tečnosti.

19. Postupak prema zahtevu 18, naznačen time, što proizvod krvi je krvna plazma, krvni serum, trombociti, eritrociti ili njihova kombinacija.

20. Postupak prema bilo kom od zahteva 1 do 17, naznačen time, što uzorak je:

(a) kozmetički uzorak;

(b) uzorak hrane; i / ili

(c) ekstrakt celog proteina.

21. Postupak prema bilo kom od zahteva 1 do 20, naznačen time, što rastvor elektrolita je rastvor kalijum hlorida.

22. Postupak prema bilo kom od zahteva 1 do 21, naznačen timem što je koncentracija toksina u uzorku ispod 1 pg / ml.

23. Postupak prema bilo kom od zahteva 1 do 22, naznačen time, što postupak dalje uključuje konjugaciju toksina sa antitelom ili aptamerom specifičnim za toksin da bi se formirao konjugat toksina.

24. Postupak prema bilo kom od zahteva 1 do 23, naznačen time, što je prečnik nanopore veći od prečnika toksina ili konjugata toksina.

25. Postupak prema bilo kom od zahteva 1 do 24, naznačen time, što je prečnik nanopore u rasponu od:

(a) oko 1,5 put do oko 3 puta veći od predviđenog prečnika toksina ili konjugata toksina; ili

(b) oko 5 nm do oko 25 nm za detekciju toksina; ili

(c) oko 50 nm do oko 150 nm za detekciju konjugata toksina.

26. Upotreba nanopore u metodi detekcije toksina u uzorku, pri čemu postupak obuhvata:

(a) propuštanje uzorka kroz nanopore; i

(b) merenje jonske struje.

27. Uređaj koji se sastoji od cis komore i trans komore, koji su povezani jednom ili više nanopora i pri čemu je elektroda postavljena u svakoj komori; pri čemu je po izboru data elektroda povezana sa pojačavačem struje.

28. Uređaj prema zahtevu 27, naznačen time, što sadrži jednu nanoporu.

29. Uređaj prema zahtevima 27 ili 28, naznačen time, što je negativna elektroda postavljena u cis komoru, a pozitivna elektroda u trans komori, i pri čemu je vrh nanopore okrenut ka cis komori.

30. Uređaj prema bilo kom od zahteva 27 do 29, naznačen time, što cis komora i trans komora sadrže rastvor elektrolita.

31. Uređaj prema bilo kom od zahteva 27 do 30, naznačen time, što nanopora je kao što je definisana u zahtevu 14 ili zahtevu 15.

32. Uređaj prema zahtevu 30 ili zahtevu 31, naznačen time, što rastvor elektrolita je rastvor kalijum hlorida.

33. Nanopora pogodna za detekciju toksina u uzorku, pri čemu postupak sadrži:

(a) propuštanje uzorka kroz nanoporu; i

(b) merenje jonske struje

34. Postupak dijagnostikovanja infekcije kod subjekta bakterijom koja proizvodi toksin, pomenuti, pri čemu postupak obuhvata izvođenje postupka prema bilo kom od zahteva 1 do 25 za detekciju datog toksina.

35. Postupak dijagnostikovanja tetanusa ili njegovog rizika kod subjekta izvođenjem postupka prema zahtevu 13 za detekciju toksina Clostridium tetani.

36. Postupak dijagnostikovanja botulizma ili njegovog rizika kod subjekta izvođenjem postupka prema zahtevu 13 za detekciju toksina Clostridium botulinum.

37. Postupak prema bilo kom od zahteva 1-25 ili 34 do 36, koja dalje uključuje primenu terapeutskog agensa, kao što je antitoksin koji neutrališe toksin, subjektu kog kojeg je identifikovano prisustvo toksina prema datom postupku.

38. Postupak procene kvaliteta kozmetičkog uzorka koji sadrži toksin Clostridium botulinum, gde postupak obuhvata izvođenje postupka prema zahtevu 13 za detekciju toksina Clostridium botulinum.

39. Postupak za detekciju botulizma koji se prenosi hranom ili njegovog rizika, naznačen time, što postupak obuhvata izvođenje postupka prema zahtevu 13 za detekciju toksina Clostridium botulinum