RS20230775A1 - Liposomski preparati za topikalnu primenu kod osoba sa hiperglikemijom - Google Patents

Abstract

Predmetnim pronalaskom se štite novi kozmetički preparati na bazi ekstrakta listova zelenog čaja (Camellia sinensis) i plodova kleke (Juniperus sp.) koji su izrađeni zelenim postupkom natkritične ekstrakcije i ugrađeni u liposome - savremene vezikularne nosače. Formulisani fitopreparati dobijeni prema pronalasku omogućavaju kontrolisano oslobađanje aktivnih komponenti koje ispoljavaju antimikrobno (anti-biofilm) dejstvo i namenjeni su za topikalnu primenu. Kombinacija esencijalnih sastojaka pokazuje neočekivanu efikasnost i jednostavna je za primenu na koži, omogućava uspostavljanje i održavanje normalnih, fizioloških parametara kompromitovane kože osoba kojima je dijagnostifikovana hiperglikemija. Zahvaljujući sinergističkom delovanju aktivnih principa iz okarakterisanih standardizovanih ekstrakata, tokom tretmana kože se postižu iznenađujuće efikasni i blagotvorni rezultati.

Description

LIPOSOMSKI FITOPREPARATI ZA TOPIKALNU PRIMENU

KOD OSOBA SA HIPERGLIKEMIJOM

OBLAST TEHNIKE

Predmetni pronalazak se odnosi na nove fitokozmetičke preparate na bazi efikasne kompozicije ekstrakta listova zelenog čaja (Camellia sinensis) i plodova kleke (Juniperus sp.). Nosioci aktivnosti su dobijeni ekstrakti, sami ili inkorporirani u biodegradabilne i biokompatibilne savremene vezikularne nosače, liposome. Fitopreparati dobijeni prema pronalasku namenjeni su topikalnoj primeni kontrolisanim oslobađanjem aktivnih komponenti sa antimikrobnim (anti-biofilm) i antioksidativnim dejstvom za uspostavljanje normalnih fizioloških parametara kompromitovane kože osoba sa hiperglikemijom.

Prema međunarodnoj klasifikaciji patenata pronalazak se može svrstati u klase: С11B 9/02, A23F (3/42, 3/16), A61K (8/00, 8/06, 8/11, 8/14, 36/14, 36/45, 36/82, 49/00, 49/18), A61P (17/00, 17/02), A61Q (19/00, 90/00) [2006.01].

TEHNIČKI PROBLEM

Pronalaskom se rešava tehnički problem dobijanja novih, stabilnih fitopreparata na bazi kompozicije koja se sastoji od ekstrakta plodova kleke (Juniperus communis) i listova zelenog čaja (Camellia sinensis), samih i/ili inkorporiranih u liposome, sa antimikrobnim (anti-biofilm) i antioksidativnim dejstvom, prvenstveno za ublažavanje tegoba kompromitovane kože osoba sa hiperglikemijom. Tehnološki doprinos predmetnog pronalaska je pronalaženje efikasnog načina olakšavanja tegoba koje prate stanje hiperglikemije, pre svega preveniranja nastanka zdravstvenih tegoba koje izazivaju rezistentni patogeni koji mogu lako da se razviju kod osoba sa kompromitovanim krvnim sudovima.

Tehnički problem koji se rešava pronalaskom je takođe razvoj nove tehnologije inkorporiranja kvantifikovanih ekstrakata listova zelenog čaja i ploda kleke u liposomske nosače, koji se mogu koristiti kao gotovi proizvodi ili naći primenu kao poluproizvodi u finalnom obliku u vidu liposomskog krema.

Lipofilni ekstrakti/etarsko ulje kleke mogu biti nestabilni i često izazivaju iritaciju na mestu primene. Tehnički problem koji se rešava pronalaskom je inkapsulacija ekstrakta/etarskog ulja kleke u liposome, stabilne vezikularne nosače.

Inovativnost liposomskog fitopreparata za topikalnu primenu ogleda se i u efikasnom odabiru i kombinovanju u određenom sastavu kompozicije sa sinergističkim delovanjem aktivnih komponenti iz izabranih biljnih vrsta, čime se na najbolji način postiže efikasna i jednostavna topikalna primena sa antimikrobnim delovanjem na uzročnike ovih procesa. Fitopreparati prema pronalasku omogućavaju kontrolisano oslobađanje aktivnih komponenti i omogućavaju uspostavljanje normalnih fizioloških parametara kompromitovane kože osoba sa hiperglikemijom.

STANJE TEHNIKE

Hiperglikemija je stanje povišene koncentracije glukoze u krvi, a pored brojnih slučajeva najčešće se javlja kao akutno stanje kod osoba sa dijabetesom tipa 1 i 2. Koža osoba sa hiperglikemijom je podložna iritaciji i promenama izazvanim bakterijskim i gljivičnim infekcijama, koje se manifestuju kao pruritis, svrab, pojava tanke i sjajne kože. Bakterije su često prisutne u zajednicama, tzv. biofilmovima, što omogućava zaštitu od odbrambenih mehanizama domaćina i obezbeđuje razvijanje rezistencije na konvencionalne antibiotike. Glukoza se apsorbuje direktno u sistemsku cirkulaciju odmah nakon jela, ali bez pomoći insulina ne može da prodre u većinu ćelija. Dijabetes drastično snižava efekte insulina jer pankreas nema mogućnost da proizvede insulin (dijabetes tip 1) ili zbog toga što ne proizvodi dovoljno insulina ili ćelije tela više ne reaguju efikasno na insulin (dijabetes tip 2). Kao posledica, koncentracija glukoze u krvi raste i dovodi do stanja hiperglikemije, ostavljajući posledice na celo telo, uključujući i kožu. Visok nivo šećera u krvi isušuje kožu i kompromituje imunološki sistem, što povećava rizik od kožnih infekcija. Telo pokušava da izluči višak šećera putem urina, time gubi vodu i koža se isušuje, naročito na nogama i stopalima. Primetno suva koža koja svrbi i zateže usled poremećenog snabdevanja kože hranljivim materijama čini da koža teže zadržava potrebnu vlagu, te se brže isušuje, remeti prirodnu ravnotežu u proizvodnji sebuma i radu znojnih žlezda, Oštećuje se hidrolipidni film koji oblaže epidermis, tako da ne pruža pouzdanu zaštitu kože i smanjuje barijernu funkciju kože i time može da naruši imuni sistem. Povećane su šanse da na koži nastanu posekotine i rane koje mogu da budu podložne infekciji dovodeći do oboljenja nerava (neuropatija) koja sprečava kožu da detektuje oštećenje. Krajnja neprijatna posledica je da koža može da postane krta i ispucala i predstavlja rizik po zdravlje. Koža je znatno tamnija, zadebljana, sa neravninama uz osećaj svraba i izmenjenog mirisa. Opisane dermatoze najčešće se javljaju na zadnjem delu vrata i prepona, laktovima, kolenima, zglobovima ruku i u regiji pazuha. Dijabetičarski žuljevi se uglavnom pojavljuju iznenada na prstima, šakama, stopalima, ponekad na nogama ili podlakticama. Obično su bele boje i stvaraju plikove sa mehurima. Može da se razvije prekomerno zadebljana koža (dijabetička digitalna skleroza), kada koža postaje čvrsta, zadebljala i voštana na zadnjoj strani ruku, prstima, a ponekad i na čelu, a može se proširiti i na gornji deo leđa i ramena. Simptomi su obično teži kod starih ljudi, s obzirom da se već samim prirodnim starenjem zdravih osoba koža isušuje (https://www.eucerin.rs/problemi-koze/koza-dijabeticara/uopsteno-o-kozidijabeticara, dostupno 10.3.2023.). Istraživanja pokazuju da se kožne promene pojavljuju kod 30-40% dijabetičara u toku života. Često su promene na koži prvi znak postojanja šećerne bolesti. Visok nivo šećera u krvi sprečava brzo zaceljivanje kože, dozvoljavajući da i najmanja oštećenja progrediraju u ozbiljne infekcije. Vlažne regije pogoduju razvijanju bakterija i gljivica, što važi posebno za nabore na koži i mesta poput pazuha, ispod grudi, oko noktiju i uglove usta. Od bakterijskih infekcija, najčešća je pojava stafilokoke, a manifestacije mogu da budu infekcija očiju, folikulitis, kao i promene na noktima. Koža postaje otečena i bolna, vruća je i svrbi.

Pravilna nega suve, krte, grube i oštećene kože osoba sa hiperglikemijom je veoma važna kako bi se sprečila ozbiljna oštećenja. Koži dijabetičara potrebna je u dovoljnoj količini svakodnevna primena emolijenasa koji omekšavaju kožu i hidratantnih kremova i losiona koji vlaže kožu. Shodno zahtevima i očekivanjima korisnika, istraživanja kozmetičke i farmaceutske industrije usmerena su na razvoj proizvoda sa aktivnim supstancama prirodnog porekla koje treba da umanje ili odlože pojavu oštećenja, da zaštite osetljivu kožu osoba sa hiperglikemijom i poboljšaju kvalitet života.

Na tržištu postoje preparati kao što su Eucerin UreaRepair Plus Losion sa 5% uree za veoma suvu i grubu kožu ili sa 10% uree za izuzetno suvu kožu koja svrbi i peruta se formulisani na bazi aktivnih sastojaka: uree, ceramida i drugih prirodno vlažećih faktora (www.eucerin.rs/problemi-koze/kozadijabeticara/uopsteno-o-kozi-dijabeticara, dostupno 10.3.2023.). Navedeni preparati, međutim, ne pokazuju antimikrobno i antibiofilm dejstvo na potencijalne uzročnike infekcija.

Antibiotici se najčešće koriste kao prvi izbor u terapiji i njihova primena vrlo često dovodi do izlečenja infekcije, ali u isto vreme doprinosi razvoju rezistencije. Naime, bakterije su često prisutne u zajednicama, tzv. biofilmovima, što omogućava zaštitu od odbrambenih mehanizama domaćina i obezbeđuje razvijanje rezistencije na konvencionalne antibiotike. Efekat formiranja biofilmova se ispoljava u sprečavanju prodiranja antimikrobnih agenasa u dublje slojeve zaštitnog biofilma, polimerni biofilm matriks vezuje pozitivno naelektrisane jone, a takođe omogućava koncentrisanje bakterijskih enzima, što sve zajedno uslovljava smanjenje efikasnosti delovanja klasičnih antibiotika. Na taj način, bakterije mogu da razviju rezistentne mehanizme, što predstavlja izuzetan problem i izazov je na naučnom nivou. Antimikrobna rezistencija predstavlja značajan medicinski problem u čitavom svetu. Poznato je da rezistentni patogeni predstavljaju globalnu opasnost po zdravlje ljudi. Prema objavljenim podacima iz 2015. godine, samo u Evropi, zabeleženo je godišnje više od 33.000 smrtnih slučajeva zbog infekcija uzrokovanih multirezistentnim bakterijama na antibiotike, što prouzrokuje direktne i indirektne materijalne troškove od oko 1,5 milijardi dolara. Takođe, podatak da od infekcija koje izazivaju bakterije rezistentne na antibiotike u Evropi od umre godišnje oko 25.000 pacijenata doveo je do porasta interesovanja za prirodne supstance sa antibakterijskim svojstvima, čija primena ne izaziva rezistenciju. Zato prioritetni status za istraživače imaju multirezistentni izazivači navedenih infekcija, naročito u bolničkoj sredini: Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klehsiella pneumoniae, Acinetobacter haumannii, Pseudomonas aeruginosa i Enterobacter spp. Poseban terapijski problem predstavljaju infekcije rana izazvane navedenim vrstama bakterija koje u značajnoj meri utiču na intenzitet inflamacije, lokalnog oštećenja tkiva (izazvanog direktnim delovanjem mikroorganizma i aktivacijom imunskog odgovora) i proces zarastanja rana. Infekcija pokreće imunološki odgovor, što uzrokuje upale i oštećenja tkiva usporavajući proces zarastanja. Sve više dokaza ukazuje na to da bakterije žive u zajednicama biofilma, što ih štiti od odbrane domaćina i razvija rezistenciju na antibiotike. Biofilmovi predstavljaju interaktivnu zajednicu međusobno povezanih agregata mikroorganizama uronjenih unutar matriksa sastavljenog od ekstracelularnih polimera. Mnoge bakterije formiraju značajne količine biofilma nakon adhezije za čvrste, žive ili nežive površine.

Prirodni proizvodi kao što su etarska ulja i biljni ekstrakti često ispoljavaju značajno antimikrobno dejstvo, između ostalih farmakoloških aktivnosti. Potvrđen je i pozitivan sinergistički efekat biljnih proizvoda sa antibioticima i njihov pozitivan učinak na brzinu zarastanja rana. Ekološki pokreti širom sveta podržali su ideju da je „prirodno jedino dobro“. Uzimajući u obzir kompleksnost etiologije bolesti koje su danas uzročnici najvećeg broja smrtnih slučajeva (kardiovaskularna oboljenja, dijabetes (Diabetes mellitus), infektivna oboljenja, tumori,

gastrointestinalni poremećaji), novi princip lečenja podrazumeva primenu lekovitih supstanci koje imaju potencijalno delovanje istovremeno na više nivoa. Na ovaj način, otvara se mogućnost upotrebe biljnih ekstrakata koji složenim i kompleksnim sastavom mogu istovremeno da deluju na više ciljnih mesta u organizmu, utičući pre svega na jačanje odbrambenih mehanizama organizma. Biljni lekoviti proizvodi imaju prednost u odnosu na konvencionalne lekove, jer predstavljaju sinergistički spoj aktivnih principa sa polifarmakološkim delovanjem.

Cilj savremenog koncepta primene lekova biljnog porekla je efikasnija i bezbednija primena biljnih preparata, zasnovana na rezultatima kliničkih ispitivanja. Racionalna fitoterapija je zasnovana na primeni preparata čija je efikasnost dozno definisana, sastojci identifikovani, a delotvornost potvrđena eksperimentalnim i kliničkim testovima. Preparati su izrađeni od standardizovanih ekstrakata biljnih droga i podležu zahtevima za farmaceutski kvalitet lekova. Pacijenti su postali svesni da modema medicina nije uvek u stanju da leči ili da spreči napredovanje bolesti i zato se lekovite biljke i biljni lekovi (fitopreparati) sve više se koriste preventivno, za olakšanje zdravstvenih tegoba, u terapiji blažih oblika bolesti ili kao dopunska terapija za lečenje hroničnih oboljenja. Nezadovoljstvo pacijenata tretmanom u lekarskoj ordinaciji u 21. veku i saznanje da sintetski farmaceutski preparati izazivaju neželjene posledice po zdravlje, utiče na sve veću potražnju biljnih lekovitih proizvoda.

Prirodna antimikrobna, antiinflamatorna i antioksidativna sredstva, etarska ulja i/ili polifenolna jedinjenja iz zelenog čaja i kleke, izabranih biljnih droga i plodova prema pronalasku, su poznata.

Juniperus communis L., Cupressaceae, kleka

Juniperus communis L. je malo stubasto drvo ili četinarski zimzeleni žbun. Plodovi su sferične bobice, prečnika 6-10 mm najčešće tamnoplave boje (nijanse boje od ljubičaste do tamnomrke), kojima treba dve godine da sazru. Listovi su uspravni, kruti, igličasti i bodljikavi dužine 1-2 cm. Poznata je pod narodnim imenima: venja, crna smreka, klekovina, plava kleka, smreka, smrča, smrek idr. Primena kleke je poznata još od antičkih vremena (lečenje i balzamovanje u starom Egiptu, Grčkoj i Rimu). Njena lekovita svojstva se pominju čak i u Bibliji. Tokom srednjeg veka verovalo se da pomaže u sprečavanju epidemija kuge, a koristila se za lečenje mnogih bolesti. Juniperus communis L. sadrži 362 istraženih hemijskih jedinjenja koja ispoljavaju 742 dejstava (Community herbal monograph on Juniperus communis L., pseudo- fructus, Fr. Ph. ANSM 2005 Juniperus communis ad preparationes homoeopathicas, jun 2022). Ekstrakt je bogat vitaminom C i snažan je antioksidans. Takođe, sadrži minimalno 0,012% seskviterpena, izraženih kao cedren (C15H24, Mw: 204,35 g/mol<-1>), u većoj koncentraciji α-pinen, α-terpinen, mircen, β-pinen kalcijum, hrom, kobalt, γ-cadinene, resin, γ-elemen (seskviterpen više od svih biljaka), pentosan, a sveži plod sadrži do 69% vode. Plod kleke se koristi u tradicionalnoj medicini za ublažavanje bolova, kod anoreksije, urogenitalnih infekcija. Efektivno deluje na Escherichia coli i Helicobacter spp. Preradom zrelih plodova kleke (Fructus Juniperi) mogu se dobiti: etarsko ulje, ekstrakti, vodene smeše, alkoholne smeše, aromatizovani napici, prirodni alkoholni destilat karakterističnog mirisa i ukusa, đubrivo organskog porekla i/ili briketi. Upotrebljava se mnogo više u narodnoj u odnosu na zvaničnu medicinu i spada u najpoznatije i najviše korišćene narodne lekove. Koristi se u medicini, veterini, prehrambenoj, kozmetičkoj, farmaceutskoj i veterinarskoj industriji. Poseduje antibakterijsko i antivirusno dejstvo i pomaže u kontroli rasta mikroorganizama (npr. bakterija i gljivica). Prisutni antioksidansi inhibiraju reakcije potpomognute kiseonikom, čime se izbegava oksidacija i propadanje sastojaka (https://cosmileeurope.eu/sr/inci/sastojak/7674/juniperuscommunis-sprout-extract/, dostupno 14. 2. 2023.). Etarsko ulje kleke, bogato α-pinenom koji je dominantan sastojak, sadrži u značajnoj količini i α-terpinen, mircen i β-pinen, poznato je zbog svojih antimikrobnih efekata. Prisutni monoterpeni, pored svog antibakterijskog učinka, povećavaju perkutanu adsorpciju lekovitih supstanci i drugih jedinjenja, zahvaljujući svom lipofilnom karakteru. Etarsko ulje kleke ima visoku komercijalnu vrednost zbog značajnog antibakterijskog i antivirusnog dejstva (Stanković M., Veljković V., Lazić M. (1994). Bioaktivni proizvodi iz ploda kleke (Juniperus communis L.), Monografija, Univerzitet u Nišu, Tehnološki fakultet Leskovac; Veljković V., Stanković B. (2003), The Encyclopedia of Food Science and Nutrition, 2nd ed. (Eds: B. Caballero, L. Trugo, P. Finglas), Academic Press. London, 3098-3107). Mikrotalasna hidrodestilacija je korišćena za izdvajanje etarskog ulja iz ploda kleke, analiziran je uticaj tehnoloških parametara hidrodestilacije i ispitana je antioksidativna i antimikrobna aktivnost (Pavićević, V. Bezotpadna tehnologija prerade ploda kleke (Juniperus communis L.), doktorska disertacija, TMF Beograd 2016). Poznato je da etarsko ulje kleke inhibira inicijalnu fazu i fazu sazrevanja biofilmova, naročito kod bakterija koje razvijaju rezistenciju (Staphylococcus aureus i Pseudomonas aeruginosa). Analiza aktivnosti metanolnih ekstrakata J. communis L. na Gram-pozitivne bakterije (Staphylococcus aureus ATCC 6538 i Bacillus subtilis ATCC 6633), Gram-negativne bakterije (Escherichia coli ATCC 8739 i Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027) i gljivice (Candida albicans) je pokazala njihov veliki antioksidativni i antimikrobni potencijal (Mahmutović, I., Dahija, S., Bešta-Gajević, R., & Karalija, E. (2017). Biological activity of Juniperus communis L. extracts. Radovi Poljoprivrednog Fakulteta Univerziteta u Sarajevu\Works of the Faculty of Agriculture University of Sarajevo, 62(67 (2)), 536-544).

Predmet zaštite patentne prijave W0-2022/018115 А1 je superkritični CO2ekstrakt Juniperus communis koji sadrži agatadiol i/ili deoksipodofilotoksin (u koncentracijama 1, 5, 10 i 25 µg/mL), kao i farmaceutske i nutraceutske kompozicije koje sadrže pomenuti ekstrakt za upotrebu u prevenciji i/ili lečenju bolesti ili stanja koje reaguju na pozitivne alosterične modulatore kanabinoidnog receptora tip 1. Prijava prikazuje i efekat deoksipodofilotoksina i ukupnog ekstrakta kleke na indukciju autofagije. Takođe, utiču na bolest ili stanje koje karakteriše neuropatski bol ili inflamatorni bol.

Patent KR100673574B1 štiti farmaceutsku kompoziciju i funkcionalnu hranu koja sadrži cedrol izolovan iz Juniperus chinensis

i njegovu farmaceutski prihvatljivu so, za prevenciju i lečenje bolesti kancera efektom inhibicije rasta ćelija raka i indukcije apoptoze.

Patent KR100711028B1 se odnosi na kompoziciju za prevenciju i lečenje dijabetesa tipa 2 i gojaznosti za snižavanje nivoa glukoze u krvi koja sadrži etanolni ekstrakt ploda kleke Juniperus chinensis ili cedrol ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so kao aktivni sastojak.

Predmet patentne prijave KR 2009/0011590A je kompozicija na bazi etanolnog ekstrakta ploda kleke za brzo poboljšanje simptoma dijabetesa i komplikacija gojaznosti snižavanjem ukupnog holesterola i triglicerola, kao i stabilnu kontrolu šećera u krvi.

Prijava US2015/0246087A1 otkriva kompozicije i formulacije koje sadrže frakcije biljnog materijala dobijene od Cupressaceae (Juniperus communis) za lečenje fibroznih stanja i neurodegenerativnih poremećaja.

Predmet zaštite patenta FI118117B, EP1933807B1 je kozmetički proizvod za tretman kože glave, koji sadrži 0,001 - 10% ekstrakta izdanaka kleke dobijenog superkritičnom ekstrakcijom ugljendioksidom, pored jednog ili više kozmetički prihvatljivih nosača i/ili pomoćnih agensa.

Camellia sinensis L., Theaceae, zeleni čaj

Camellia sinensis je ime grma ili malog drveta sa sjajnim, kožastim, eliptičnim do duguljasto jajastim i uglavnom nazubljeni listovima, dok cvetovi variraju po veličini, obliku i boji. Plod je odrvenela čaura sa nekoliko krupnih semenki. Iz listića, ali i pupoljaka listića, nastaje pravi čaj - u zavisnosti od faze u kojoj se beru i od daljeg procesa obrade listova mogu se dobiti sledeće vrste čaja: beli čaj, zeleni čaj ili beli, žuti, zeleni, ylong, cmi i fermentisani. Ekstrakt lista C. sinensis, poznat kao zeleni čaj, pokazuje dobra antioksidativna i antiinflamatorna svojstva. Bogat je polifenolima i sadrži čak do 30% od kojih je u najvećem procentu prisutan epigalokatehin galat, epikatehin galat, epikatehin i galokatehin. Listovi biljke C. sinensis sadrže mikro i makro elemente koji predstavljaju prirodan izvor za zadovoljavanje potreba čoveka za ovim elementima. Takođe, listovi sadrže i nekoliko alkaloida među koji su najpoznatiji: teofilin, teobromin i kofein. Količina teina zavisi od mnogo faktora kao što su npr. vrsta čaja, kvalitet listića, vrsta obrade listića, način pripreme. Ostale komponente uključuju tri vrste flavonoida, poznate kao kempferol, kvercetin i miricetin. Ekstrakt zelenog čaja, koji se koristi kao antioksidans je oficijalan po Francuskoj farmakopeji. C. sinensis se početno koristila u kineskoj medicini kao lek. Sadrži oko 300 hemijskih jedinjenja čija kombinacija u čaju je unikatna i zato se često koristi u tradicionalnoj, ali i savremenoj medicini. Primenjuje se u mnogim kozmetičkim proizvodima kao što su hidratantne kreme, kreme protiv starenja, kreme za sunčanje. U formulacijama za negu kože može da obezbedi UV zaštitu, antiinflamatorna i antioksidativna svojstva u borbi protiv oštećenja kože slobodnim radikalima. Postoji mnogo varijanti zelenog čaja koji se mogu formulisati u nezi kože i koristiti kao parfem.

Različite tehnike ekstrakcije su primenjivane u cilju dobijanja ekstrakata zelenog čaja bogatog polifenolima, a u današnje vreme privlači pažnju upravo primena savremene metode ekstrakcije primenom natkritičnih fluida, prvenstveno natkritičnog ugljenik(IV)-oksida, CO2. Optimalni uslovi ekstrakcije prema istraživanju Chen-a i saradnika bili su pritisak od 30 MPa, temperatura od 50°C, statičko vreme 10 min i dinamičko vreme od 90 min (Chen, Z., Mei, X., Jin, Y., Kim, E. H., Yang, Z., & Tu, Y. (2014). Optimisation of supercritical carbon dioxide extraction of essential oil of flowers of tea (Camellia sinensis L.) plants and its antioxidative activity. Journal of the Science of Food and Agriculture, 94(2), 316-321.). Na osnovu analize primenom tehnike gasne hromatografije-masene spektrometrije, u eteričnom ulju cvetova čaja identifikovano je 59 jedinjenja, uključujući alkane (45,4%), estre (10,5%), ketone (7,1%), aldehide (3,7%), terpene (3,7%), kiseline (2,1%), alkohole (1,6%), etre (1,3%) i druge (10,3%). Eterično ulje cvetova čaja pokazalo je relativno jaču aktivnost uklanjanja radikala DPPH od esencijalnih ulja geranijuma i nane, a njegova antioksidativna aktivnost bila je slabija od etarskog ulja karanfilića, askorbinske kiseline, terc-butilhidrokinona i butilovanog hidroksianizola.

Pronalazak CA2643860A1 se odnosi na ekstrakte zelenog čaja, postupke za njihovu pripremu korišćenjem sekvencijalnih koraka ekstrakcije da bi se dobile frakcija esencijalnog ulja, frakcija polifenola i frakcija polisaharida superkritičnom ekstrakcijom ugljen-dioksidom.

Predmet patentne prijave CN107050193A je metoda ekstrakcije aktivnog sastojka iz svežih listova i cvetova vrste čaja zlatne Camellia primenom alkalnog vodenog rastvora i pripreme napitka sa antibakterijskim, antiinflamatornim i detoksikacionim dejstvom.

Pronalazak CN108719493A otkriva metodu pripreme ulja zelenog čaja za prevenciju hiperlipidemije, u kombinaciji sa prahom ruzmarina, belog luka semena kasije, lecitina, listova ginka. Ulje zelenog čaja sposobno je da smanji holesterol i trigliceride u ljudskom telu, pogodno je za prevenciju i lečenje hiperlipidemije, hiperholesteremfje ili hipertrigliceridemije.

Vezikularni sistemi su veoma popularni kao nosači aktivnih supstanci, a među njima najčešće korišćeni su liposomi. Liposomi su vezikule koje se sastoje od jednog ili većeg broja fosfolipidnih dvoslojnih membrana (lamela) koje zatvaraju vodeno jezgro. Kao sirovine za izradu liposoma koristiće se prečišćeni fosfolipidi soje sa masnim kiselinama različitog stepena nezasićenosti, a samim tim i različitim sposobnostima prodiranja u kožu.

Brojni literturni podaci ukazuju da biljni ekstrakti i jedinjenja biljnog porekla mogu delovati sinergistički u kombinaciji sa konvencionalnim antibioticima protiv Gram-pozitivnih i Gramnegativnih bakterija, uključujući multirezistentne patogene. Potencijalni mehanizmi sinergistične aktivnosti mogu biti uslovljeni poremećajem bakterijske plazmatske membrane, inhibicijom sinteze |3-laktamaze i inhibicijom aktivnosti ispusnih pumpi tzv. ,,efflux pumps activity“ (učestvuju u transportu proteina, odn. u izlučivanju toksičnih supstanci iz ćelija u spoljno okruženje). Pored toga, efektne kombinacije aktivnih komponenti prirodnog porekla sa antimikrobnim svojstvima i ekonomski predstavljaju isplativija rešenja u odnosu na konvencionalne lekove. Postoje dokazi da biljke sadrže aktivna prirodna jedinjenja koja su u stanju da obezbede prevenciju i terapiju u stanjima infekcija uslovljenih formiranjem biofilma.

Liposomi su sferične, fosfolipidne čestice sa unutrašnjom vodenom fazom obavijenom sa više slojeva fosfolipidnih membrana (lamela). Predstavljaju nosače za lekovite supstance koje su hidrofilne (inkorporiraju se u vodenu fazu) i hidrofobne (inkorporiraju se u lipidni dvosloj). Pored toga, zbog svoje strukture, liposomi pokazuju sličnost sa biološkim membranama i samim tim su netoksični, neimunogeni, biorazgradivi i fiziološki prihvatljivi. Liposomi inkorporirani u podlozi omogućavaju bolji transport aktivnih supstanci u kožu od drugih topikalnih preparata.

Liposomi imaju nekoliko prednosti u odnosu na postojeće farmaceutske forme za tretman kože, koje uključuju biokompatibilnost, biodegradabilnost, produženo oslobađanje bioaktivnih komponenti i povoljan efekat na barijerna svojstva kože i njenu vlažnost. Efikasnost preparata namenjenog lokalnoj primeni podrazumeva njihovu multifunkcionalnost, uzimajući u obzir da promene koje se dešavaju na koži i tegobe koje prate hiperglikemiju su posledica procesa koje karakterišu komplikovane etiologije.

U cilju efikasnog tretmana kože kompromitovane hiperglikemijom aktuelna su istraživanja naučnika da formulišu adekvatne fitopreparate sa poželjnim efektom prevencije pojave bakterijske infekcije. Pregledom dostupnih patentnih prijava koje pokrivaju navedenu oblast može se konstatovati da postoje patenti i patentne prijave koji se odnose na topikalnu primenu preparata na bazi drugih kombinacija lekovitog bilja kod promena na koži. Detaljni pregled dostupne literature ukazuje da ne postoje kozmetički preparati na bazi kombinacije ekstrakata lista zelenog čaja i ploda kleke za negu kože kompromitovane prisustvom neke bolesti. Trenutno na tržištu nema topikalnih preparata koji sadrže kombinaciju ekstrakata zelenog čaja i kleke.

OPIS PRONALASKA SA PRIMERIMA IZVOĐENJA

Prema predmetnom pronalasku, štiti se kozmetički preparat za topikalnu primenu zasnovan na novoj kompoziciji ekstrakta biljnih sirovina i to listova zelenog čaja (Camellia sinensis) i plodova kleke (Juniperus sp.). Fitopreparati dobijeni prema pronalasku namenjeni su topikalnoj primeni kontrolisanim oslobađanjem aktivnih komponenti sa antimikrobnim (anti-biofilm) i antioksidativnim dejstvom za uspostavljanje normalnih fizioloških parametara kompromitovane kože osoba sa hiperglikemijom.

Kvantifikovani biljni ekstrakti su dobijeni zelenim procesima upotrebom natkritičnog ugljenik(IV)-oksida pod visokim pritiscima ili konvencionalnim metodama. Dobijeni ekstrakti su inkorporirani u biodegradabilne i biokompatibilne liposome, kao savremene vezikularne nosače.

Takođe, pronalaskom se štiti primena kompozicije prema pronalasku formulisana u obliku emulgela, kreme, losiona i micelarne vode obezbeđuje efikasno delovanje svih komponenti i najbolji efekat prilikom tretmana kože. Originalnost topikalnog fitopreparata ogleda se u liposomskoj inkapsulaciji natkritičnih i konvencionalnih ekstrakata sa pokazanim antibakterijskim i antioksidativnim svojstvima. Posebnu vrednost preparatu namenjenom topikalnoj primeni daje anti-biofilm efikasnost. Liposomski krem kao sistem za isporuku ovih ekstrakata omogućiće efikasno oslobađanje aktivnih principa i samim tim bolju aktivnost preparata na suvu i oštećenu kožu dijabetičara. Pronalazak obuhvata i zaštitu formulacije i tehnologije izrade topikalnih preparata, koja pruža najbolje rezultate u pogledu olakšavanja tegoba kod osoba sa dijabetesom.

Ciljevi inkorporiranja lekovitih i kozmetički aktivnih supstanci u nosače uključuju poboljšanje bezbednosti primene, povećanje efikasnosti i stabilnosti aktivnih supstanci i samih lekovitih/dijetetskih odnosno kozmetičkih proizvoda, mogućnost formulacije proizvoda sa teško rastvornim aktivnim supstancama, produženo oslobađanje aktivnih principa, poboljšanje organoleptičkih svojstava aktivnih supstanci/materija kao i gotovih proizvoda.

Predmetnim pronalaskom su definisani poluproizvodi kao sastavni delovi gotovih formulacija, sa razvijenim metodama identifikacije i kvantifikacije aktivnih komponenti. Predložena kompozicija biljnih ekstrakata/ulja kleke i lista zelenog čaja prema pronalasku je nova i originalna, a njena primenljivost zasnovana je na naučno potvrđenim biološkim svojstvima aktivnih komponenata. Prilikom izbora aktivnih sastojaka prirodnog porekla, prema pronalasku, razmatrana su naučno potvrđena fiziološka dejstva izabranog lekovitog bilja (antimikrobno, antiinflamatorno, protektivno).

Predmetnim pronalaskom se štite aktivne frakcije iz kleke i čaja dobijene primenom natkritične ekstrakcije, s obzirom da su nosioci brojnih aktivnosti neisparljiva jedinjenja, nepolarnog karaktera, rastvorljivi u natkritičnom ugljenik(IV)-oksidu (nkСО2) koji pokazuje visoku selektivnost ka aktivnim komponentama. U slučaju primene konvencionalnih metoda ekstrakcije organskim rastvaračem ekstrahuju se i štetne materije iz vazduha i padavina ( npr. teški metali), dok se primenom metode natkritične ekstrakcije pod visokim pritiscima, uz korišćenje ugljenik(IV)-oksida kao rastvarača, nije moguće ekstrahovati teške metale i ostale štetne materije, jer nisu rastvorljive u natkritičnom ugljenik(IV)-oksidu. Primenom metoda natkritične ekstrakcije mogu se prečistiti skoro do čistog oblika ekstrakti kleke i zelenog čaja.

Naime, u današnje vreme se sve više koriste ugušćeni gasovi, prvenstveno tečni i natkritični ugljenik(IV)-oksid, nkСО2za ekstrakcije prirodnih bioaktivnih jedinjenja, naročito u prehrambenoj, kozmetičkoj i farmaceutskoj industriji. Prednost primene tehnologije natkritične ekstrakcije predstavlja dobijanje visokokvalitetnih ekstrakata bez tragova organskih rastvarača na relativno niskim procesnim temperaturama (25-60°C). Variranjem procesnih parametara (operativnog pritiska i/ili temperature) moguće je jednostavno podešavanje selektivnosti ugušćenog gasa kao rastvarača putem jednostavne promene gustine, a time i viskoznosti i brzine difuzije. Ugušćeni ugljenik(IV)-oksid lako difunduje u čvrste supstance, jer ima niže vrednosti viskoznosti od tečnosti i površinski napon približno jednak nuli.

Natkritična ekstrakcija ploda kleke

Plod kleke (Juniperus sp.) se prema pronalasku tretira natkritičnim ugljenik(IV)-oksidom i na taj način se dobija lipofilni ekstrakt (koji predstavlja kombinaciju etarskog ulja i neisparljivih lipofilnih supstanci prisutnih u ispitivanom biljnom materijalu), sam ili impregniran u liposome, a primenjen je u formulaciji finalnog proizvoda za topikalnu administraciju.

Proces natkrtične ekstrakcije je optimizovan u cilju dobijanja većeg prinosa ekstrakata odgovarajućeg profila aktivnih komponenti. Varirani procesni parametri su pritisak, temperatura i vrsta za tri vrste biljne sirovine: J. communis, J. охусеdrus i J. sibirica. Ispitani su natkritični ekstrakti zrelih i zelenih plodova kleke, kao i listova/iglica kleke. U eksperimentima sa kosoloventom, 96% etanol je dodat u količini od 20 ± 2 mas% u odnosu na masu utrošenog СО2za ekstrakciju iz kleke bez upotrebe kosolventa, a nakon završetka ekstrakcije sa kosolventom iz smeše etanol se uklanja uparavanjem. Frakciona natkritična ekstrakcija je izvedena najpre na pritisku od 10 ± 5 MPa i temperaturi od 45 ± 2 °C do iscrpljenja biljne sirovine, a zatim na povišenom pritisku od 30 ± 5 MPa i istoj temperaturi (45 ± 2°C), u cilju ispitivanja hemijskog sastava ekstrakata, optimizacije procesa natkritične ekstrakcije i izbora najpogodnije vrste za dalji operativni rad. Parametri natkritične ekstrakcije (pritisak, temperatura, vreme trajanja eksperimenta, početna masa biljnog materijala, relativna potrošnja natkritičnog CO<2>), vreme trajanja i prinos prve frakcije, kao i ukupno vreme trajanja natkritične ekstrakcije i ukupan prinos zrelih i zelenih plodova kleke, kao i iglica kleke za tri izabrane vrste roda Juniperus sp. i to J. communis, J. oxycedrus i J. sibirica prikazani su u Tabeli 1.

Kumulativne krive frakcione natkritične ekstrakcije iz Juniperus communis na 10 MPa i 30 MPa na 45 °C iz: a) zrelog ploda kleke, b) zelenog ploda kleke, v) iglica kleke prikazane su na slici 1. Na osnovu prikazanih rezultata (slika 1) može se zaključiti da povećanje pritiska značajno utiče na kinetiku ekstrakcije. Dok relativno nizak pritisak od 10 MPa omogućava separaciju lakših frakcija, povišeni pritisak od 30 MPa omogućava separaciju težih frakcija ekstrakata. Maksimalni prinos na pritisku od 10 MPa omogućio je separaciju manje od 2% ekstrakta dok je povećanje pritiska do 30 MPa omogućilo separaciju do 8% ekstrakta iz J. communis. Maksimalni prinos na pritisku od 10 MPa omogućio je separaciju oko 1% ekstrakta dok je povećanje pritiska do 30 MPa omogućilo separaciju do 6% ekstrakta iz J. sibirica. Na osnovu dobijenih rezultata može se zaključiti da zrelost ploda ima neznatan uticaj na prinos ekstrakcije. Najveći prinos ekstrakcije je dobijen upotrebom vrste J. communis. Ukoliko se postignuti prinosi uporede sa maksimalnim prinosima etarskog ulja kod klasične i mikrotalasne hidrodestilacije objavljenim u disertaciji (Pavićević, V. Bezotpadna tehnologija prerade ploda kleke (Juniperus communis L.), doktorska disertacija, TMF Beograd 2016), koje se kreću u opsegu 2,15-2,31 i 1,58-1,94, uočava se značajna razlika postignuta predmetnim pronalaskom.

Hemijski sastav dobijenog superkritičnog ekstrakta J. communis L., Cupressaeeae prikazan je u Tabeli 2 (ekstrakta inkorporiranog u preparat koje je predmet zaštite)

Etarsko ulje kleke inhibira i inicijalnu fazu, kao i fazu sazrevanja biofilmova, naročito kod bakterija koje razvijaju rezistenciju (S. aureus i P. aeruginosa). Poznato je da je etarsko ulje kleke bogato α-pinenom i da poseduje antimikrobno dejstvo. Pored α-pinena koji je dominantan sastojak, sadrži u značajnoj količini i α-terpinen, mircen i β-pinen. Navedeni monoterpeni, pored svog antibakterijskog učinka, povećavaju perkutanu adsorpciju lekovitih supstanci i drugih jedinjenja, zahvaljujući svom lipofilnom karakteru.

Isparljiva jedinjenja su prisutna u etarskom ulju, dok ekstrakti sadrže i neisparljive terpenoide. Sasvim je iznenađujuće je prisustvo dva biološki aktivna jedinjenja agatadiola, diterpenskog alkohola, koji je prisutan u količini od 4,65%, kao i dezoksipodofilotoksin, koji je zastupljen u nešto nižoj koncentraciji od 1% u superkritičnom ekstraktu plođa J. communis L. Agatadiol i dezoksipodofilotoksin nisu izolovani metodama klasične i mikrotalasne hidrodestilacije objavljenim u disertacijama (Pavićević, V. Bezotpadna tehnologija prerade ploda kleke (Juniperus communis L.), doktorska disertacija, Univerzitet u Beogradu, TMF, 2016; Lesjak, M. Biopotencijal i hemijska karakterizacija ekstrakata i etarskih ulja vrsta roda Juniperus L. (Cupressaceae), doktorska disertacija, Univerzitet u Novom Sadu, Prirodno-matematički fakultet, Departman za hemiju, biohemiju i zaštitu životne sredine, 2011). Prema prijavi patenta W0-2022/018115 navedena jedinjenja su posebno korisna u lečenju bolesti ili stanja koje reaguje na pozitivne alosterične modulatore kanabinoidnog receptora tip 1, povezane sa psihijatrijskim poremećajima i neuropatskim ili inflamatornim bolom.

Dobijanje etarskih ulja superkritičnim fluidima je alternativa metodama klasične i mikrotalasne hidrodestilacije, koje se odvijaju uz primenu organskih rastvarača i/ili na povišenim temperaturama, dok navedena zelena metoda ekstrakcije pomoću natkritičnog CO<2>omogućava procese na niskim temperaturama, čime se ograničava termička degradacija komponenti i izbegava se upotreba zabranjenih rastvarača u kozmetičkim ili prehrambenim proizvodima (Pourmortazavi, S.M., Hajimirsadeghi, S.S., 2007. Supercritical fluid extraction in plant essential and volatile oil analysis. J. Chromatogr. A 1163(1), 2-24.). Ovom tehnikom se selektivno ekstrahuju sastojci eteričnog ulja i lake frakcije smola. Bobice kleke, J. communis L. su bogat izvor i isparljivih terpena i lipofilnih jedinjenja sa većom molarnom masom, kao što su smole i masti. U zavisnosti od izabranih parametara procesa moguće dobiti ekstrakte iz iste sirovine u različitom prinosu, različitog hemijskog sastava, fizičkih i organoleptičkih svojstava. Hemijski sastav i fizička svojstva ekstrakta (pri pritisku 80 bara na 40°C) bili su slični eteričnom ulju bobica kleke, ali sa nižim odnosom terpenskih ugljovodonika prema njihovim oksigenisanim derivatima (Maciejczyk E., Kuśmierz M., Dębczak, A. Rój, E. Kalemba, D. OP5. Juniper berry (Juniperus communis L.) supercritical extract, essential oil, and absolute comparison. Facta Universitatis, Series: Physics, Chemistry and Technology 2018, 16, (1) Special Issue 49<th>International Symposium on Essential Oils (ISEO2018) Book of Abstracts, p.37).

Posebna novost predmetnog pronalaska je činjenica da se variranjem operativnih parametra natkritične ekstrakcije došlo se do optimalnih uslova za postizanje neočekivano dobrih rezultata i uspešnog ekstrahovanja biološki važnih aktivnih komponenti agatadiola i dezoksipodofilotoksina, sa iznenađujuće visokim prinosom.

Ekstrakcija zelenog čaja (Camellia sinensis)

Analiza natkritičnog ekstrakta zelenog čaja dobijena osetljivom metodom tečne hromatografije ultra-visokog pritiska u sprezi sa tandem masenom spektrometrijom UHPLC/MS ukazala je na prisustvo interesantnih jedinjenja koja mogu predstavljati nosioce željenih aktivnosti. Hromatogram ispitivanog ekstrakta zelenog čaja Camellia sinensis snimljen na 435 nm u cilju detekcije karotenoida i derivata hlorofila prikazan je na slici 2. Rezultati identifikacije jedinjenja identifikovanih u SCO<2>ekstraktu zelenog čaja dodeljivanjem pikova hlorofila razdvojenih primenom UHPLC hromatografije su prikazani u Tabeli 3. Rezultati ukazuju da je pored karakterističnih jedinjenja u ekstraktu zelenog čaja uočljivo prisustvo jedinjenja koja u poslednje vreme privlače sve veću pažnju zbog bioloških svojstava: karotenoida i derivata hlorofila, feoforbida a i b, kao i feofitina.

Prikazani rezultati (Tabela 3) ukazuju da je postupkom natkritične ekstrakcije dobijen ekstrakt zelenog čaja sa značajnim prisustvom izolovanih komponenata hlorofila i to: hidroksi feofitin b, hidroksi feofitin b'. feofitin b, 15<2>-Me-fitol-rodin g7 estar (provizoran), hidroksi feofitin a, hidroksi feofitin a’, feofitin a, feofitin a’, slična struktura Aristophyll-C ili Micephyll- A i pirofeofitin a. Iz grupe karotenoida izolovani su: lutein izomeri / zeaksantin, n.i. karotenoidi, izomeri β-karotena (Tabela 3, Yu-Yi CHAN, Yann-Lii LEU, and Tian-Shung WU (1999): The Constituents of the Leaves of Aristolochia heterophylla HEMSL. Chem. Pharm. Bull.47(6) 887—889.

M. Roca, K. Chen, A. Pérez-Gálvez (2016) Chlorophyll In: Handbook on Natural Pigments in Food and Beverages, Elsevier, Vol.6, pp.125-158.

R. Aparacio-Ruiz, M. I. Mingues-Mosquera, B. Gandul-Rojas (2010): “Thermal degradation kinetics of chlorophyll pigments in virgin olive oils. 1. Compounds of series a“, J. Agric. Food Chem.

2010, 58, 6200-6208.

Н-М Wang, W-L Lo, L-Y Huang, Y-D Wang, C-Y Chen (2010): Chemical constituents from the leaves of Michelia alba. Natural Product Research, 24(5): 398-406.

K. Chen, J. J. Rios, A. Pérez-Gálvez, M. Roca (2015): Development of an accurate and highthroughput methodology for structural comprehension of chlorophylls derivatives. (I) Phytylated derivatives, Journal of Chromatography A, 1406: 99-108.). Identifikovana jedinjenja u ekstraktu zelenog čaja su nosioci potencijalne antimikrobne, antimutagene i antioksidativne aktivnosti.

Naime, fotosintetski pigmenti (po rastućem polaritetu) obuhvataju: karoten (narandžasti pigment), ksantofil (žuti), a feofitin a (sivo-braon pigment).

Hlorofil, kao zeleni pigment biljaka, učestvuje u procesu fotosinteze, u ključnom koraku apsorpcije svetlosne energije i konverzije u hemijsku energiju i hranljive materije. Tokom fotosinteze, biljke koriste sačuvanu energiju da konvertuju vodu i ugljen dioksid (apsorbovan iz vazduha) u glukozu. Prerada i digestija/varenje hrane mogu konvertovati hlorofil u derivate feofitina, pirofeofitina i feoforbida.

Feofitin je oblik hlorofila a koji služi kao prvi intermedijer fotosistema II na putu prenosa elektrona do plastohinona Q A tokom procesa fotosinteze (https://studybuff.com/what-is-thedifference-between-pheophytin-a-and-b/, dostupno 10. 12. 2022.). Feofitini nastaju kao posledica zamene jona magnezijuma u molekulima hlorofila sa dva jona vodonika. Gubitkom Mg<2+>kao centralnog jona, hlorofil se pretvara u supstancu sive (sivosmeđe) boje koja se zove feofitin a, dok je feofitin b maslinasto zelene boje.

Feoforbid predstavlja proizvod razgradnje hlorofila i derivat je feofitina gde je uklonjen i centralni magnezijum i hidrolizovan rep fitola.

Koristi se kao fotosenzibilizator u fotodinamičkoj terapiji (Chen, K., Preuß, A., Hackbarth, S., Wacker, M., Langer, K., & Röder, B. (2009). Novel photosensitizer-protein nanoparticles for photodynamic therару: photophysical characterization and in vitro investigations. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology, 96(1), 66-74). Nedavna istraživanja su pokazala da su hlorofili i njihovi derivati nešto više od boje u prehrambenoj tehnologiji i da su direktno povezani sa ublažavanjem određenih degenerativnih bolesti, imaju biološka svojstva, antioksidativnu i antimutagenu aktivnost u prevenciji raka (Ferruzzi, M. G.; Blakeslee, J. Digestion, absorption, and cancer preventive activity of dietary chlorophyll derivatives. Nutr. Res. (N.Y.) 2007, 27, 1-12). U zelenim uljima biljnog porekla, najrasprostranjenija reakcija je feofitinizacija, koja je rezultat generalizovanog oslobađanja kiselina nakon mehanizma razgradnje biljnog tkiva. Glavni pigment u ovom proizvodu je feofitin a, sa malim razlikama u zavisnosti od toga da li je maslinovo ulje ekstrahovano fizičkim ili hemijskim postupcima. Uslovi obrade mogu da promovišu aktivnost hidrolitičkih endogenih enzima kao što su hlorofilaza i/ili peroksidaza, lipoksigenaza, itd., tako da se defitilovani derivati hlorofila, uglavnom feoforbid a, i oksidovani 13<2>-OH-feofitin a i 15<1>-OH-lakton feofitin a, mogu naći u maslinovim ulju. Preovlađujuća reakcija je cepanje hromofora feofitina fotooksidacijom, dok se u mraku odvijaju reakcije feofitinizacije i alomerizacije, a druga oksidativna reakcija, dekarbometoksilacija na C- 13<2>, razvija se sporo, nastaje pirofeofitin. Ova reakcija postaje glavna u toplotnim tretmanima biljnih ulja i dovela je do istraživanja mogućnosti ovog pigmenta kao markera kvaliteta i sledljivost u devičanskom maslinovom ulju (Aparicio-Ruiz, R., Mínguez-Mosquera, M. I., & Gandul-Rojas, B. (2010). Thermal degradation kinetics of chlorophyll pigments in virgin olive oils. 1. Compounds of series a.Journal of Agricultural and Food Chemistry, 58( 10), 6200- 6208). Feoforbid se može stvoriti preradom i digestijom biljne materije (Xu, C., Zhang, J., Mihai, D. M., & Washington, I. (2014). Light-harvesting chlorophyll pigments enable mammalian mitochondria to capture photonic energy and produce ATP. Journal of cell science, 127(2), 388-399). Odsustvo atoma magnezijuma u feofitinima čini ih manje polarnim od hlorofila i tako imaju veću vrednost Rfu rastvaraču koji se koristi. Kao ksantofili, svi sadrže atome kiseonika, što ih čini polarnim, tako da imaju relativno male Rfvrednosti.

Karotenoidi imaju antioksidativna svojstva i klasifikovani su u dve glavne grupe: ksantofili i karoteni. Karotenoidi provitamina A uključuju α-karoten, β-karoten i β-kriptoksantin. Provitamin A karotenoidi uključuju lutein, zeaksantin i likopen. Karoteni doprinose fotosintezi prenosom svetlosne energije koju apsorbuju na hlorofil, štite biljna tkiva pomažući u apsorpciji energije iz singletnog kiseonika, pobuđenog oblika molekula kiseonika koji se formira tokom fotosinteze. Kao i drugi karotenoidi, ksantofili se nalaze u najvećoj količini u listovima većine zelenih biljaka, gde moduliraju svetlosnu energiju i možda služe kao nefotohemijski agensi za gašenje da bi se reagovali sa tripletom (pobuđenim oblikom) hlorofila, koji se prekomerno proizvodi pri visokim nivoima svetlosti. Karotenoidima se pored provitaminske funkcije, pripisuje antioksidativna i protektivna (hemopreventivna) uloga u humanom organizmu (Padovani, R. M., Amaya-Farfán, J. 2006. Procurement of β-carotene, lycopene, lutein and zeaxanthin in households of Brazil’s urban areas. Segurança Alimentar e Nutricional, 13(1), 49- 63). Štite tkiva različitim biohemijskim mehanizmima: antioksidativnim delovanjem ("gašenjem" singletnog kiseonika ili peroksil radikala), inhibicijom abnormalne proliferacije ćelija, podsticanjem interćelijske komunikacije, poboljšanjem imunološkog odgovora, modulacijom metabolizma kancerogenih supstanci, itd. Brojne studije ukazuju da je ishrana bogata karotenoidima povezana sa smanjenjem rizika od nekih degenerativnih bolesti, uključujući različite vrste kancera, kardiovaskulame ili oftalmološke bolesti (Stahl, W., Sies, H. 2003. Antioxidant activity of carotenoids. Molecular aspects of medicine, 24(6), 345-351).

Hlorofili mogu efikasno da apsorbuju kvante svetlosti, a mogu da oslobađaju i preuzimaju elektrone reverzibilno pomoću svog aromatičnog 18-elektron (18)-diazanulenskog makrociklusa (Chen, K. Chen, J. J. Rios, A. Pérez-Gálvez, M. Roca (2015). Development of an accurate and high-throughput methodology for structural comprehension of chlorophylls derivatives. (I) Phytylated derivatives Journal of Chromatography A, 1406, 99-108). Pored toga, dokazano je da ova fotohemijska jedinjenja poseduju istaknute prednosti za ljudsko zdravlje kada se konzumiraju zajedno sa biljnim proizvodima ili jestivim morskim algama u našoj svakodnevnoj ishrani, kao što su antimutageni efekat, antigeno toksična svojstva i moćan antioksidativni kapacitet za uklanjanje slobodnih radikala i sprečavanje oksidacije lipida. Pored komponenti fotosintetskog lanca (hlorofil a i b, i feofitin a), u zelenim tkivima se kao posledica prirodnog metabolizma ili tokom skladištenja/prerade hrane formiraju brojni kompleksni derivati hlorofila. Među derivatima hlorofila koji čuvaju fitilni lanac, postoje četiri glavne grupe derivata hlorofila. Feofitini nastaju kada se centralni atom magnezijuma tetrapirolnog prstena zameni sa dva atoma vodonika, kao posledica reakcije metal-helirajuće supstance tokom katabolizma hlorofila u starenju listova ili sazrevanju plodova, ili tokom kuvanja ili prerade hrane. Drugo, piro-derivati (piro-hlorofili i pirofeofitini) nastaju usled dekarbometoksilacije na poziciji C-13<2>u zagrejanim, konzervisanim ili skladištenim prehrambenim materijalima. Inače, različiti oblici hlorofila se obično koriste kao bioaktivni sastojci u nekim farmaceutskim formulacijama.

Lipofilni ekstrakt/etarsko ulje kleke mogu biti nestabilni i često izazivaju iritaciju na mestu primene, a predmetnim pronalaskom se rešava navedeni tehnički problem razvijanjem nove formulacije sa ekstraktom/etarskim uljem inkapsuliranim u liposome. Liposomi su biokampatibilni vezikularni nosači koji zbog svoje sličnosti sa ćelijskim membranama mogu da predstavljaju efikasne nosače za različite aktivne supstance. Liposomi stabilizuju kozmetički aktivne sastojke, mogu poboljšati njihovu efikasnost, omogućiti da se oni produženo i lokalizovano oslobađaju, ali i doprineti da kozmetički proizvod poveća vlažnost površine kože i popravi kožnu barijeru. Formulacija stabilnog, estetski prihvatljivog i efikasnog kozmetičkog proizvoda sa liposomima, naročito emulzionog tipa, zahtevan je zadatak. Najveći izazov u formulaciji kozmetičkog proizvoda je izbor odgovarajućih sastojaka proizvoda u kome će se očuvati stabilnost liposoma i zadovoljiti očekivanja korisnika u pogledu senzornih karakteristika.

Dobijeni ekstrakti su ugrađeni u savremene vezikularne nosače - liposome, radi poboljšanja bioraspoloživosti aktivnih komponenata. Pronalaskom se štite recepture za inkapsulaciju ekstrakta/etarskog ulja ploda kleke (Juniperi sp.) i ekstrakta lista zelenog čaja (C. sinensis) u liposome, kao i paleta fitopreparata koja maksimalno obezbeđuje delotvornost sastojaka, produženo oslobađanje i sinergizam. Prema pronalasku, kozmetički preparati zasnivaju se na novoj kombinaciji ekstrakta lista zelenog čaja i ekstrakta ploda kleke, samih i/ili inkapsuliranih u liposome, namenjenih za tretman kože kompromitovane hiperglikemijom (sa poželjnim efektom sprečavanja posledica uslovljenih bakterijskim infekcijama).

Inkapsulacija etarskog ulja kleke i ekstrakta lista zelenog čaja u liposome

Formulacija:

Aktivne komponente i sistemi za inkapsulaciju

Etarsko ulje kleke (Juniperi fructus) .........................................................0,10-1,00g

Cameliae sinensis extr ...............................................................................0,10-1,50 g

Pro-Lipo™ Neo ........................................................................................1,00-5,00 g

Phosal 40IP ............................................................................................... 5,00-5,40 g Komponente masne faze

Olivae oleum ............................................................................................4,00-5,0 g

Vitamin E .................................................................................................1,50-2,0 g

Panthenol .................................................................................................1,00-2,0 g

Prunus Amygdalus Dulcis (Sweet Almond) Oil .......................................7,00-8,0 g

Emulsatorski kompleks

Montanov 202 .......................................................................................3,50-4,0 g

Montanov 82 ........................................................................................ 3,50-4,0 g

Montanov 14......................................................................................... 1,50-2,0 g

Komponente vodene faze:

Glycerol ..............................................................................................40,0-45,0 g

Phenoxyethanol .................................................................................. 0,90-1,50 g

EDTA .................................................................................................0,01-0,10 g

Aqua purificata ................................................................................... do 100,00 g

Postupak inkapsulacije etarskog ulja u liposome

Faza 1:

Inkapsulacija ekstrakta/etarskog ulja ploda kleke (Juniperi fructus) u liposome vrši se korišćenjem sirovine za formiranje liposoma, Phosal 40IP (prazan nosač za lipofilne aktivne supstance, fosfolipidna formulacija fosfatidilholina, sadržaja > 37 %, u organskom suncokretovom ulju) tako što se ekstrakt/etarsko ulje homogeno izmeša sa sirovinom Phosal-om, a zatim se na laboratorijskoj mešalici masa podvrge mešanju pri 2000 obrtaja/minutu u trajanju od 10 minuta. Nakon toga se masa homogenizuje pri brzini homogenizacije od 3500 obrtaja/minutu, kako bi se formirala stabilna preemulzija. Izrada liposomske disperzije izvodi se korišćenjem ekstrudera kroz koji se ,,propusti“ preemulzija u više ciklusa (dok se ne formiraju liposomi željenog prečnika do 500 nm)..

Inkapsulacija ekstrakta zelenog čaja u liposome

Ekstrakt zelenog čaja - Сатеllае sinensis folium extract se inkapsulira u liposome korišćenjem Pro-Lipo™ Neo (sistema/sirovine za formiranje liposoma na bazi fosfatidilholina, propandiola i lecitina, koji predstavlja mešavinu odabranih fosfolipida organizovanih u lamelarne dvoslojeve) postupkom mešanja i homogenizacije na 2500 obrtaja/minutu.

Faza 2: Izrađene liposomske disperzije iz faze 1 inkorporiraju se u podlogu koja predstavlja stabilisanu emuiziju U/V. Podloga se izrađuje zasebnim zagrevanjem komponenata masne faze, emulgatora i koemulgatora na 85°C i komponenata vodene faze na 87°C, a zatim njihovim spajanjem uz rad homogenizatora na 2500 obrtaja/minutu i mešalice na 500 obrtaja/minutu. Uslovi se drže konstantnim 10 minuta, a zatim se isključuje homogenizator i uz hlađenje nastavlja mešanje mase.

Faza 3: Kada se uz hlađenje mase iz faze 2, dostigne temperatura od 35°C, u formiranu podlogu se dodaju liposomske disperzije iz faze 1. Dodavanje se vrši uz pažljivo mešanje mase na što je moguće nižim brzinama (najbolje 250 obrtaja/minutu), dok se ne formira homogena masa.

Faza 4: Homogenu masu osloboditi od vazduha procesom višekratnog vakuumiranja. Izmeriti pH vrednost i provodljivost i masu ubaciti u prihvatni sud na odležavanje i strukturiranje u trajanju od 24 sata.

Faza 5: Masa se puni u čistu ambalažu i signira.

Formulisani fitopreparati sa liposomima namenjeni su topikalnoj primeni i omogućavaju uspostavljanje normalnih fizioloških parametara kompromitovane kože dijabetičara kontrolisanim oslobađanjem aktivnih komponenti sa antimikrobnim (anti-biofilm) dejstvom. Prilikom izbora ekscipijensa/podloge za preparate namenjene tretiranju kože dijabetičara, uzeta je u obzir činjenica da su koža i meka tkiva praćeni inflamatomim odgovorom, koji dovodi do karakterističnih eritema, edema, osećaj topline, bola ili osetljivosti. Zato je važno da formulisani preparati imaju i antiinflamatorno/antieritematozno dejstvo aktivnih principa, pored anti-biofilm dejstva koje poseduju izabrane biljne komponente. Pri formulisanju preparata za topikalnu primenu u tretmanu kompromitovane kože dijabetičara, pored izbora emulgatora, odabrani su i adekvatni emolijensi (sredstava za vlaženje kože), kao što su trigliceridi kaprilne i kapronske kiseline, koji s jedne strane omekšavaju kožu i povećavaju njenu vlažnost, a sa druge obnavljaju barijernu funkciju kože ublažavajući simptome koji prate infekcije kože.

Preparat za primenu na osetljivoj koži mora da ispuni brojne zahteve (fizičko-hemijska stabilnost, efikasnost i bezbednost primene) i zato je izbor podloge važan za formulisanje proizvoda, jer konvencionalni emulgatori mogu da izazovu iritacije i oštećenje kože (Jaksic I, Lukic M, Malenovic A, Reichl S, Savic S. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 2012, 80:164-175); Daniels R, Knie U. Galenics of dermal products-vehicles, properties and drug release. Journal der Deutschen Dermatologischen Gesellschaft 2007, 5(5):367-383); Tasić-Kostov M, Savić S. New natural sugar-based surfactants intended for stabilization of cosmetic/dermopharmaceutical vehicles: Safety and efficacy assessment. Acta medica Medianae 2015, 57(l):34-39). Alkilpoliglukozidi su noviji, blagi, biodegradabilni emulgatori, koji osim što ne iritiraju, pokazuju pozitivni efekat vlaženja kože pri lokalnoj aplikaciji (Holmberg K. Natural surfactants. Current Opinion in Colloid & Interface Science 2001, (5(2): 148-159) i zato su primenjeni u formulisanju kozmetičkih preparata prema pronalasku.

Predmetnim pronalaskom su uspešno definisani uslovi inkorporiranja aktivnih ekstrakata prirodnog porekla u formulisanu podlogu sa pomoćnim materijama i emulgatorima alkilpoliglukozida, pri kojima dolazi do formiranja stabilnog krema, na osnovu čega se može zaključiti da kremovi sa alkilpoliglukozidima mogu biti dobri ekscipijensi za inkorporisanje prirodnih ekstrakata i potvrđena je njihova kompatibilnost sa korišćenim biljnim ekstraktima. Sa aspekta značaja efikasnosti i bezbednosti aktivnih materija kao i ekscipijensa na ukupne efekte preparata, utvrđen je zadovoljavajući stepen bezbednosti, kao i efikasnost kremova baziranih na ekstraktima prirodnog porekla i novim ,,prirodnim“-emulgatorima alkilpoliglukozidima.

Jedna od bitnih faza u razvoju kozmetičkih preparata, posebno ukoliko su u pitanju preparati namenjeni za nanošenje na kožu, svakako je razmatranje organoleptičkih, teksturnih i reoloških osobina, radi dizajniranja formulacije koja će pored toga što će omogućiti najbolju isporuku aktivne supstance biti i najprihvatljivija za korisnika.

Tekstura predstavlja sve mehaničke, geometrijske i površinske atribute proizvoda koje mogu biti detektovani od strane receptora. Osećaj izazvan nanošenjem na kožu jedno je od najvažnijih svojstava proizvoda namenjenih za primenu na koži, pored dugotrajne fizičke stabilnosti i fiziološkog efekta.

Senzorna svojstva u formulacijama za negu kože uglavnom proističu iz sastojaka poput emolijenasa, reoloških modifikatora, emulgatora i humektanasa. Dok senzorna analiza uzima u obzir tumačenje organoleptičkih atributa ispitivanog proizvoda koje se opažaju čulima, analiza teksture se oslanja na kvantitativna merenja svojstava proizvoda, korišćenjem različitih uređaja - analizatora teksture. Senzorna procena je u osnovi subjektivna procena, dok su za objektivnu procenu potrebna instrumentalna merenja.

Analiza profila teksture (TPA) se u današnje vreme koristi u mnogim naučnim i industrijskim oblastima, uključujući kozmetičku i farmaceutsku industriju. Instrument, analizator teksture, oponaša ljudski prst koji dodiruje površinu proizvoda (krema, gela, tečnosti, itd.). Ovaj uređaj meri reakciju uzorka na napetost, kompresiju, penetraciju i savijanje. Kada sonda dođe u kontakt sa uzorkom, instrument počinje da meri aktiviranu silu u toku vremena ispitivanja. Sonda ulazi u uzorak brzinom ispitivanja, dok se ne postigne navedena sila ili udaljenost. Nakon toga, sonda se vraća na start brzinom nakon ispitivanja. Sonda nastavlja da se kreće naviše i meri lepljivost uzorka. Sonda se kreće sve dok se ne vrati u početni položaj. Postoje dva ciklusa kompresije u TPA, kada sonda analizatora teksture ulazi u testirani proizvod smešten u posudu za uzorke. Tokom procesa formira se grafik krive sila-vreme sa koga se mogu očitati sledeći parametri TPA: čvrstoća nakon 1. ciklusa, čvrstoča nakon 2. ciklusa, kohezivnost, adhezivnost, rezilijentnost i elastičnost, itd.

Predmet pronalaska su farmaceutske kompozicije koje sadrže 0,10%-1,00% ekstrakta/ulja ploda kleke dobijenog postupkom natkritične ekstrakcije ugljenik(IV)-oksidom (čistog ili inkorporisanog u nosač na bazi liposoma) i 0,10%-1,00% ekstrakta lista zelenog čaja, kao i pogodne ekscipijense za odgovarajući farmaceutski oblik do 100%. Farmaceutski oblici, prema pronalasku, obuhvataju polučvrste i tečne preparate (emulgel, krema, losion i micelarna voda) koji su detaljno opisani kroz neograničavajuće primere izvodljivosti.

Emulgelovi predstavljaju emulzije (voda u ulju ili ulje u vodi) koji se dobijaju mešanjem emulzije i dispergovanog gelirajućeg sredstva, kao nosača aktivnih supstanci. Emulzije predstavljaju sistem sa kontrolisanim oslobađanjem dispergovane aktivne supstance u unutrašnjoj fazi. Gelovi formiraju mrežu koja zarobljava čestice aktivne faze. Aktivna supstanca mora da difunduje kroz spoljašnju fazu da bi došla do kože i apsorbovala se u njoj. Emulgelovi predstavljaju dobre sisteme za kontrolisanu isporuku aktivnih supstanci jer poseduju svojstva emulzija i gelova i niz drugih prednosti (lako nanošenje, dobru termodinamičku stabilnost, služe kao dobri nosači aktivnih supstanci i deluju kao penetracioni inhenseri).

Kremovi predstavljaju višefazne preparate na bazi masne (lipofilne) i vodene faze, a primenjuju se na koži i određenoj sluzokoži. Ubrzavaju proces oporavka tako što ubrzavaju vensku cirkulaciju i omogućavaju bolju prokrvljenost tkiva. Pomažu u jačanju krvnih sudova, sprečavaju njihovo pucanje, čime koža postiže elastičnost i zdrav izgled. Olakšavajući ishranu ćelija kiseonikom i hranljivim materijama, doprinose održavanju zdravlja kože i sluzokože kod osoba kod kojih postoji sklonost ka razvijanju proširenih vena i hemoroida.

Losion je preparat namenjen za pranje, negu, čišćenje i zaštitu kože. Manje je viskozan od kremova i lakše se razmazuju, a samim tim ih koža brže upija.

Micelarna voda je preparat na bazi micela, sfernih tečnih kristala. Sadrži surfaktante, molekule čiji je jedan kraj hidrofilni i privlači vodu, a drugi kraj je lipofilni i privlači ulja i masti. Koristi se za efikasno i prijatno čišćenje kože, manje je agresivna u odnosu na klasične preparate i uz to ima bolji efekat čišćenja.

Prirodna antimikrobna sredstva iz natkritičnih ekstrakata kleke i/ili zelenog čaja prema pronalasku poseduju aktivnost koja se ispoljava na nivou bakteriostatskog/baktericidnog efekta, zatim kao anti-biofilm aktivnost ili kroz sinergizam. Ne manje značajno je da koža osoba kojima je dijagnostifikovana hiperglikemija podložna iritaciji i promenama izazvanim bakterijskim i gljivičnim infekcijama, koje se manifestuju kao pruritis, svrab, pojava tanke i sjajne kože. Navedeni sekundarni metaboliti nosioci su interesantnih, antibakterijskih/anti-biofilm svojstava. Sve više podataka ukazuje da su bakterije prisutne u zajednicama, tzv. biofilmovima, što omogućava zaštitu od odbrambenih mehanizama domaćina i obezbeđuje razvijanje rezistencije na konvencionalne antibiotike. Efekat formiranja biofilmova se ispoljava u sprečavanju prodiranja antimikrobnih agenasa u dublje slojeve zaštitnog biofilma. Polimerni biofilm matriks vezuje pozitivno naelektrisane jone i omogućava koncentrisanje bakterijskih enzima, što zajedno uslovljava smanjenje efikasnosti delovanja klasičnih antibiotika. Na taj način, bakterije mogu da razviju rezistentne mehanizme, što predstavlja izuzetan problem i izazov je na naučnom nivou.

Pregled dostupnih podataka ukazuje da preparati na tržištu nisu standardizovani, stabilnost preparata nije na adekvatan način ispitana, a nema ni potvrde da preparati napravljeni od navedenih ekstrakata daju željene efekte antimikrobnog (anti-biofilm) dejstva kod kompromitovane kože dijabetičara i to kontrolisanim oslobađanjem aktivnih komponenti inkorporisanjem u nosače na bazi liposoma. Za potrebe razvoja proizvoda za topikalnu primenu, urađena su sledeća mikrobiološka ispitivanja:

- ispitivanje uticaja, različitih koncentracija natkritičnog ekstrakta/etarskog ulja ploda kleke na in vitro produkciju biofilma kliničkih izolata Acinetobacter baumannii,

- ispitivanje uticaja, različitih koncentracija koncentracija natkritičnih ekstrakata/etarskog ulja ploda kleke na in vitro produkciju biofilma standardnog soja Pseudomonas aeruginosa (PAO1) i kliničkog izolata P. aeruginosa i

- ispitivanje uticaja, različitih koncentracija natkritičnih ekstrakata/etarskog ulja ploda kleke na in vitro produkciju siderofora kliničkog izolata A. baumannii (308 strani).

Proizvodnja biofilma sojeva A. baumannii i P. aeruginosa nakon tretmana prikazana je na slici 3. Podaci su predstavljeni kao srednje vrednosti, *P < 0,05.

Proizvodnja siderofora soja A. baumannii 308 prikazana je na slici 4 kao procenat proizvodnje siderofora hidroksamatnog tipa predstavljen prema izračunatom intenzitetu narandžaste boje. Inače, A. baumannii je patogen koji je sposoban da izazove širok spektar bolesti u rasponu od opekotina, rana i infekcija urinarnog trakta do ozbiljnijih stanja kao što su pneumonija i sepsa. Zbog pojave teških infekcija stečenih u zajednici i brzom pojavom rezistencije na više lekova, Svetska zdravstvena organizacija stavila je A. baumannii na vrh liste bakterija koje hitno zahtevaju istraživanje i razvoj novih terapijskih pristupa, označivši je kao prioritetni „kritični” patogen.

Ustanovljeno da kombinacija ekstrakata ploda kleke i lista zelenog čaja prema pronalasku doprinosi iznenađujućem i neočekivanom antibiofilm efektu, što je veoma značajno za aplikaciju na suvu, istanjenu i oštećenu kožu osoba sa hiperglikemijom. Na taj način su efekti antibakterijskog delovanja objedinjeni i pojačani novom kompozicijom i kozmetičkim preparatima (sa poželjnim efektom sprečavanja posledica uslovljenim bakterijskim infekcijama) koji obezbeđuju pojačanu antiinflamatornu i protektivnu aktivnost za lokalnu primenu na koži.

Na tržište je moguće staviti isključivo preparate koji zadovoljavaju zahteve zakonske regulative, tj. mora da ispunjavaju zahtevane uslove deklarisanog kvaliteta, efikasnosti i bezbednosti. Dobijeni ekstrakti i poluproizvodi na bazi ekstraktima impregniranih nosača okarakterisani su sa hemijskog i farmakološkog aspekta, uz poštovanje važećih propisa i zakonske regulative u cilju primene u kozmetičkoj industriji.

Bezbednost i efekat primene formulisanog topikalnog fitopreparata testirani su u in vitro i in vivo ispitivanjima, u skladu sa važećom evropskom, odnosno nacionalnom regulativom -„Regulation (EC) No 1223/2009 of the European Parliament“, „Pravilnik o kozmetičkim proizvodima 60/2019-4, 47/2022-3, 21/2023-97).

Novost predmetnog pronalaska u odnosu na dostupno stanje tehnike predstavljaju:

→ novi proizvod/kompozicija na bazi ekstrakata/ulja ploda kleke (Juniperi fructus) i zelenog čaja (Camelliae sinensis folium),

→ novi proizvod/kozmetička kompozicija na bazi ekstrakata/ulja ploda kleke (Juniperi fructus) i zelenog čaja (Camelliae sinensis folium) inkorporiranih u vezikularne nosače - liposome,

→ novi proizvodi za topikalnu primenu na bazi ekstrakata/ulja ploda kleke (Juniperi fructus) i zelenog čaja (Camelliae sinensis folium) formulisani u obliku emulgela, kreme, losiona i micelarne vode, sa efikasno definisanim odnosom aktivnih komponenata, emulgatora, emolijenata i vode.

→ novi poluproizvod - inkapsulirani ekstrakt/etarsko ulje ploda kleke u liposome, povećane bioraspoloživosti.

→ novi poluproizvod-inkapsulirani ekstrakt zelenog čaja u liposome, povećane bioraspoloživosti.

→ novi postupak dobijanja inkapsuliranog sistema od ekstrakta/ulja ploda kleke (Juniperi fructus), ekstrakta zelenog čaja (Camelliae sinensis folium) i nosača na bazi liposoma.

→ nova neočekivano efikasna i jednostavna topikalna primena fitopreparata kontrolisanim oslobađanjem aktivnih komponenti sa antimikrobnim (anti-biofilm) dejstvom za ublažavanje tegoba kompromitovane kože osoba sa hiperglikemijom.

Prednosti unapređenog postupka natkritične ekstrakcije kleke u odnosu na rezultate objavljene u stanju tehnike, obuhvataju:

- visok prinos i iscrpnu ekstrakciju željenih bioaktivnih supstanci u ekstraktu,

- ekstrakti su veoma čisti i bez prisutnih organskih rastvarača do koncentracije u tragovima,

- neočekivan, iznenađujuće visok sadržaj izolovanih aktivnih komponenti agatadiola (4,65%) i dezoksipodofilotoksina (1%).

Prednosti postupka natkritične ekstrakcije zelenog čaja u odnosu na rezultate objavljene u stanju tehnike, ogleda se u izolovanju aktivnih komponenata hlorofila i to: feofitina a, feofitina a', hidroksi feofitina a, hidroksi feofitina a’, hidroksi feofitina b, hidroksi feofitina b’, feofitina b i pirofeofitina a, nosilaca potencijalne antimikrobne, antimutagene i antioksidativne aktivnosti.

OPIS SLIKA NACRTA

Slika 1. Kumulativne krive frakcione natkritične ekstrakcije iz kleke (Juniperus communis) na 45 °C 10 MPa i 30 MPa iz: a) zrelog ploda kleke, b) zelenog ploda kleke, c) iglica/listova kleke.

Slika 2. Hromatogram ispitivanog ekstrakta zelenog čaja snimljen na 435 nm u cilju detekcije karotenoida i derivata hlorofila.

Slika 3. Proizvodnja biofilma sojeva Acinetobacter baumannii i Pseudomonas aeruginosa nakon tretmana sa natkritičnim ekstraktima kleke. Podaci su predstavljeni kao srednje vrednosti, *P < 0,05.

Slika 4. Ispitivanje uticaja različitih koncentracija natkritičnog, SCO<2>, ekstrakta ploda kleke (50 µg/mL i 100 µg/mL) na adheziju Staphylococcus aureus i Enterococcus faecalis za laminin (a), odnosno kolagen (b).

Slika 5. Ispitivanje uticaja natkritičnog, SCO<2>, ekstrakta ploda kleke na proizvodnju siderofora soja Acinetobacter baumannii 308 - procenat proizvodnje siderofora predstavljen prema izračunatom intenzitetu narandžaste boje;

Slika 6. Viabilnost u zavisnosti od koncentracije natkritičnih ekstrakata ploda kleke i zelenog čaja (1000-31,125 µg/mL) i efekta citotoksičnosti za testirane uzorke.

Da bi se olakšalo razumevanje predmeta zaštite ovog pronalaska, u nastavku su dati primeri koji detaljnije objašnjavaju različite faze, ali ga ni u kom slučaju ne ograničavaju.

PRIMERI IZVODLJIVOSTI

Primer 1: Postupak natkritične ekstrakcije za dobijanja tečnog ekstrakta kleke

Frakciona natkrtična ekstrakcija zrelih i zelenih plodova kleke i listova/iglica kleke za tri izabrane vrste roda Juniperus sp. i to, J. communis, J. oxycedrus i J. sibirica je izvedena najpre na pritiscima od 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ili 15 MPa i temperaturama od 45 ± 2 °C do iscrpljenja biljne sirovine, a zatim na povišenom pritisku od 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 ili 35 MPa i istim temperaturama (45 ± 2 °C). U eksperimentima sa ko-soloventom, etanol je dodat u količini od 20 ±5 mas% u odnosu na masu utrošenog CO<2>. Podaci o početnoj masi biljnog materijala, vremenu trajanja natkrtične ekstrakcije i relativnoj potrošnji nkCO2prikazani su u Tabeli 1. Kumulativne krive frakcione natkritične ekstrakcije iz J. communis na 10 MPa i 30 MPa na 45 °C iz: a) zrelog ploda kleke, b) zelenog ploda kleke, v) iglica kleke prikazane su na slici 1. Relativno nizak pritisak (10 ± 5 MPa) omogućio je separaciju lakših frakcija, a povišeni pritisak (30 ± 5 Mpa) omogućio je separaciju težih frakcija ekstrakata. Maksimalni prinos na pritisku od 10 ± 5 MPa omogućio je separaciju manje od 2% ekstrakta dok je povećanje pritiska do 30 ± 5 MPa omogućilo separaciju do 8% ekstrakta iz J. communis, što je i najveći prinos ekstrakcije u odnosu na ostale ispitivane vrste. Hemijski sastav dobijenog superkritičnog ekstrakta J. communis L. prikazan je u Tabeli 2.

Primer 2: UHPLC/MS analiza hemijskog sastava natkritičnog ekstrakata zelenog čaja Rezultati ispitivanja hemijskog sastava natkritičnog ekstrakata zelenog čaja prikazani su u tabeli 3, a na slici 2. je hromatogram ispitivanog ekstrakta zelenog čaja snimljen na 435 nm u cilju detekcije karotenoida i derivata hlorofila. Prikazani rezultati (tabela 3) ukazuju da je postupkom natkritične ekstrakcije dobijen ekstrakt zelenog čaja sa značajnim prisustvom izolovanih komponenata hlorofila i to: hidroksi feofitin b, hidroksi feofitin b’, feofitin b, 15<2>-Me-fitol-rodin g7 estar (provizoran), hidroksi feofitin a, hidroksi feofitin a’, feofitin a, feofitin a’, slična struktura Aristophyll-C ili Micephyll-A i pirofeofitin a. Iz grupe karotenoida izolovani su: lutein izomeri / zeaksantin, n.i. karotenoidi, izomeri βkarotena (tabela 3). Identifikovana jedinjenja u ekstraktu zelenog čaja su nosioci potencijalne antimikrobne, antimutagene i antioksidativne aktivnosti.

Primer 3: Izrada liposomske disperzije obogaćene ekstraktom/etarskim uljem ploda kleke i ekstrakta lista zelenog čaja

Formulacija:

Aktivne komponente i sistemi za inkapsulaciju

Etarsko ulje kleke (Juniperi fructus) ........................................................0,10-1,00 g Cameliae sinensis extr ..............................................................................0,10-1,50 g

Pro-Lipo™Neo ........................................................................................ 1,00-5,00 g

Phosal 40IP .............................................................................................. 5,00-5,40 g Komponente masne faze

Olivae oleum ..............................................................................................4,00-5,0 g Vitamin E ...................................................................................................1,50-2,0 g Panthenol .....................................................................................................1,00-2,0 g

Prunus Amygdalus Dulcis (Sweet Almond) Oil ..........................................7,00-8,0 g Emulgatorski kompleks

Montanov 202 .......................................................................................... 3,50-4,0 g Montanov 82 ............................................................................................ 3,50-4,0 g Montanov 14............................................................................................. 1,50-2,0 g Komponente vodene faze:

Glycerol ....................................................................................................40,0-45,0 g

Phenoxyethanol ................................................................................... 0,90-1,50 g

EDTA ..................................................................................................0,01-0,10 g

Aqua purificata .................................................................................... do 100,00 g

Faza 1: Inkapsulacija ekstrakta/etarskog ulja ploda kleke (Juniperi fructus) u liposome vrši se korišćenjem sirovine Phosal 40IP (visokokvalitetna fosfatidna kiselina i DSPE), tako što se etarsko ulje (0,10-1,00 g) homogeno izmeša sa Phosal-om (5,00-5,40 g), a zatim se na laboratorijskoj mešalici masa podvrge mešanju pri 2000 obrtaja/minutu u trajanju od 10 minuta. Dobijena masa se homogenizuje pri brzini homogenizacije od 3500 obrtaja/minutu, kako bi se formirala stabilna preemulzija. Izrada liposomske disperzije izvodi se korišćenjem ekstrudera kroz koji se ,,propusti“ preemulzija u više ciklusa (dok se ne formiraju liposomi željenog prečnika do 500 nm).

Inkapsulacija ekstrakta zelenog čaja u liposome

Ekstrakt zelenog čaja - Camelliae sinensis folium (0,10-1,50 g) se inkapsulira u liposome korišćenjem sistema/sirovine Pro-Lipo™ Neo (1,00-5,00g) postupkom mešanja i homogenizacije na 2500 obrtaja/minutu.

Faza 2: Izrađene liposomske disperzije iz faze 1 inkorporiraju se u podlogu koja predstavlja stabilisanu emulziju U/V. Podloga se izrađuje zasebnim zagrevanjem komponenata masne faze, emulgatora i koemulgatora na 85°C i komponenata vodene faze na 87°C, a zatim njihovim spajanjem uz rad homogenizatora na 2500 obrtaja/minutu i mešalice na 500 obrtaja/minutu. Uslovi se drže konstantnim 10 minuta, a zatim se isključuje homogenizator i uz hlađenje nastavlja mešanje mase.

Faza 3: Kada se uz hlađenje mase iz faze 2, dostigne temperatura od 35°C, u formiranu podlogu se dodaju liposomske disperzije iz faze 1. Dodavanje se vrši uz pažljivo mešanje mase na što je moguće nižim brzinama (najbolje 250 obrtaja/minutu), dok se ne formira homogena masa.

Faza 4: Masu puniti u čistu ambalažu i signirati.

Primer 3а: Izrada liposomske disperzije obogaćene etarskim uljem/ekstraktom kleke

Faza 1: Inkapsulacija etarskog ulja/ekstrakta kleke (Juniperi fructus) u liposome vrši se korišćenjem sirovine Phosal 40IP (visokokvalitetna fosfatidna kiselina i DSPE lipidi), tako što se etarsko ulje (0,10-1,00 g) homogeno izmeša sa Phosal-om (5,00-5,40 g), a zatim se na laboratorijskoj mešalici masa podvrge mešanju pri 2000 obrtaja/minutu u trajanju od 10 minuta.

Faza 2: Masa se zatim homogenizuje pri brzini homogenizacije od 3500 obrtaja/minutu, kako bi se formirala stabilna preemulzija. Faza 3: Izrada liposomske disperzije izvodi se korišćenjem ekstrudera kroz koji se ,,propusti“ preemulzija u više ciklusa (dok se ne formiraju liposomi željenog prečnika do 500 nm).

Primer 3b: Izrada liposomske disperzije obogaćene ekstraktom zelenog čaja

Ekstrakt zelenog čaja (Camelliae sinensis folium) (0,10-1,50 g) se inkapsulira u liposome korišćenjem sistema/sirovine Pro-Lipo™ Neo (1,00-5,00 g) postupkom mešanja i homogenizacije na 2500 obrtaja/minutu.

Primer 4: Formulacija emulgela sa kombinacijom ekstrakta kleke i čaja

Za izradu fitopreparata tipa emulgela prema pronalasku u tabeli 4 je naveden sastav aktivnih komponenti i pogodnih ekscipijensa, njihov sadržaj i uloga u formulisanom emulgelu. Emulgelovi sa ekstraktima ploda kleke i lista zelenog čaja su efikasni u pogledu povećanja hidratacije kože, smanjenja transepidermalnog gubitka vode iz kože. Nakon dugotrajne upotrebe ne dovode do pojave iritacije ili crvenila kože i održavaju pH kože u fiziološkim granicama.

Postupak izrade:

U smešu vode, glicerola i konzervanasa, dodati hidroksietilcelulozu i ostaviti da bubri 30 minuta uz povremeno mešanje. Nakon potpune hidratacije derivata celuloze, vodenu fazu zagrejati na 70°C (±2).

Komponente masne faze istopiti i podesiti temperaturu mase na 70°C (±2). Spojiti masnu i vodenu fazu uz rad mešalice (brzina 200-1000 obrtaja/minutu) i homogenizatora (brzina 1000- 5000 obrtaja/minutu) u trajanju od 5-25 minuta. Započeti hlađenje mase. Na temperaturi od 35°C (±2), dodati u masu disperziju liposoma obogaćenih ekstraktima ploda kleke (izrađenu prema primeru 3а) i disperziju liposoma obogaćenih ekstraktom lista zelenog čaja (izrađenu prema primeru 3 b).

Mešati uz hlađenje, dok masa u sudu ne dostigne sobnu temperaturu.

Primer 5: Formulacija krema sa kombinacijom ekstrakta kleke i čaja

Prema pronalasku, za izradu preparata tipa krema u tabeli 5 je naveden sastav aktivnih komponenti i pogodnih ekscipijensa, njihov sadržaj i uloga u formulisanoj kremi.

Postupak izrade:

Smešu vode, glicerola i konzervanasa (vodenu fazu) zagrejati na 70°C (±2).

Komponente masne faze istopiti i podesiti temperaturu mase na 70°C (±2).

Spojiti masnu i vodenu fazu uz rad mešalice (brzina 200-1000 obrtaja/minutu) i homogenizatora (brzina 1000-5000 obrtaja/minutu) u trajanju od 5-25 minuta. Započeti hlađenje mase. Na temperaturi od 35°C (±2), dodati u masu disperziju liposoma obogaćenih ekstraktima ploda kleke i disperziju liposoma obogaćenih ekstraktom lista zelenog čaja.

Mešati uz hlađenje, dok masa u sudu ne dostigne sobnu temperaturu.

Primer 5a: Formulacija krema sa kombinacijom ekstrakta kleke i čaja

Komponente masne faze istopiti i podesiti temperaturu mase na 70°C (±2).

Spojiti masnu i vodenu fazu uz rad mešalice (brzina 200-1000 obrtaja/minutu) i homogenizatora (brzina 1000-5000 obrtaja/minutu) u trajanju od 5-25 minuta. Započeti hlađenje mase. Na temperaturi od 35°C (±2), dodati u masu disperziju liposoma obogaćenih ekstraktima ploda kleke i lista zelenog čaja (izrađenu prema opisu u primeru 3).

Mešati uz hlađenje. dok masa u sudu ne dostigne sobnu temperaturu.

Primer 6: Formulacija losiona sa kombinacijom ekstrakta kleke i čaja

Prema pronalasku, za izradu preparata tipa losiona u tabelama 6 i 6a je naveden sastav aktivnih komponenti i njihov sadržaj u formulisanom losionu.

Postupak izrade:

Smešu vode, glicerola i konzervanasa (vodenu fazu) zagrejati na 70°C (±2).

PEG-15-Stearyl Ether i Polisorbat 20 zagrejati na 70°C (±2).

Spojiti vodenu fazu sa istopljenom smešom PEG-15-stearil etra i Polisorbata 20 uz rad mešalice (brzina 200-1000 obrtaja/minutu) i homogenizatora (brzina 1000-5000 obrtaja/minutu) u trajanju od 5-25 minuta. Započeti hlađenje mase. Na temperaturi od 50°C (±2), u masu dodati glicerol i pantenol i nastaviti mešanje mase pod nepromenjenim uslovima. Na 35°C (±2), dodati u masu vitamin E i alantoin, a nakon mešanja u trajanju od 5 minuta dodati i disperziju liposoma obogaćenih ekstraktima ploda kleke (izrađenu prema primeru 3а) i disperziju liposoma obogaćenih ekstraktom lista zelenog čaja (izrađenu prema primeru 3b).

Mešati uz hlađenje, dok masa u sudu ne dostigne sobnu temperaturu.

Primer 6a: Formulacija losiona sa kombinacijom ekstrakta kleke i čaja

Postupak izrade:

Smešu vode, glicerola i konzervanasa (vodenu fazu) zagrejati na 70°C (±2).

PEG-15-Stearyl Ether i Polisorbat 20 zagrejati na 70°C (±2).

Spojiti vodenu fazu sa istopljenom smešom PEG-15-stearil etra i Polisorbata 20 uz rad mešalice (brzina 200-1000 obrtaja/minutu) i homogenizatora (brzina 1000-5000 obrtaja/minutu) u trajanju od 5-25 minuta. Započeti hlađenje mase. Na temperaturi od 50°C (±2), u masu dodati glicerol i pantenol i nastaviti mešanje mase pod nepromenjenim uslovima. Na 35°C (±2), dodati u masu vitamin E i alantoin, a nakon mešanja u trajanju od 5 minuta dodati i disperziju liposoma obogaćenih ekstraktima ploda kleke i lista zelenog čaja (izrađenu prema primeru 3).

Mešati uz hlađenje, dok masa u sudu ne dostigne sobnu temperaturu.

Primer 7: Formulacija micelarne vode sa kombinacijom ekstrakta kleke i čaja

Prema pronalasku, za izradu preparata tipa micelarne vode u tabelama 7 i 7a je naveden sastav i sadržaj komponenti potrebnih za formulaciju micelarne vode.

Disperzije liposoma sa inkapsuliranim ekstraktima ploda kleke i lista zelenog čaja homogenizovati u vodi sa polisorbatom 20 na laboratorijskom homogenizatoru (brzina 2000- 5000 obrtaja/minutu). Nakon formiranja transparentne disperzije dodati glicerol i konzervanse, rnešati još 10 minuta (brzina 500-1500 obrtaja/minutu. Zatim dodati pantenol, alantoin i niacin amid i nastaviti sa mešanjem još 10 minuta pod nepromenjenim uslovima.

Primer 7a: Formulacija micelarne vode sa kombinacijom ekstrakta kleke i čaja

Disperzije liposoma sa inkapsuliranim ekstraktima ploda kleke i lista zelenog čaja homogenizovati u vodi sa Polisorbat-om 20 na laboratorijskom homogenizatoru (brzina 2000- 5000 obrtaja/minutu). Nakon formiranja transparentne disperzije dodati glicerol i konzervanse, mešati još 10 minuta (brzina 500-1500 obrtaja/minutu. Zatim dodati pantenol, alantoin i niacin amid i nastaviti sa mešanjem još 10 minuta pod nepromenjenim uslovima.

Primer 8: Mikrobiološka ispitivanja natkritičnih ekstrakta kleke

Ispitivanje uticaja različitih koncentracija (50 µg/mL i 100 µg/mL) natkritičnog ekstrakta ploda kleke na in vitro produkciju biofilma i adheziju za proteine ekstracelularnog matriksa (laminin i kolagen) urađeno je na standardnim sojevima i kliničkim izolatima bakterija. U ispitivinje su uključeni: klinički izolati Acinetobacter baumannii 308, i Pseudomonas aeruginosa 86, i standardni sojevi: Pseudomonas aeruginosa (PAO1), Staphylococcus aureus ATCC 6538 i Enterococcus faecalis ATCC 29212.

Navedena ispitivanja izvršena su u mikrobiološkoj laboratoriji Farmaceutskog fakulteta Univerziteta u Beogradu.

Proizvodnja biofilma sojeva A. baumannii i P. aeruginosa pod uticajem različitih koncentracija ispitivanog ekstrakta prikazana je na slici 3. Podaci su predstavljeni kao srednje vrednosti, *P < 0,05. Iz prikazanih rezultata se može videti da je produkcija biofilma A. baumannii 308 u prisustvu natkritičnog ekstrakta SCO<2>ploda kleke u koncentraciji 50 µg/mL bila značajno smanjena u odnosu na kontrolu (50%). Pri većoj koncentraciji (100 µg/mL) ispitivanog ekstrakta produkcija biofilma A. baumannii 308 je bila neznatno smanjena u odnosu na kontrolu. U odnosu na vrstu P. aeruginosa (standardni soj PAO1 i klinički izolat 86) ekstrakt je ispoljio različite efekte u odnosu na ispitivanu koncentraciju. Pri većoj koncentraciji ekstrakta došlo je do povećane produkcije biofilma P. aeruginosa, pri čemu je za standardni soj ova razlika bila statistički značajna u odnosu na kontrolu. Manja koncentracija ekstrakta dovela do smanjenja produkcije biofilma, pri čemu je efekat bio izraženiji na standardni soj (70% u odnosu na kontrolni soj 100%).

Ispitivanje uticaja različitih koncentracija natkritičnog ekstrakta (SCO<2>) ploda kleke (50 µg/mL i 100 µg/mL) na adheziju S. aureus i E. faecalis za kolagen, odnosno laminin izvršeno je pomoću metode koju su opisali Malešević i sar. 2017 (Malešević M, Vasiljević Z, Sovtić A, Filipić B, Novović K, Kojić M, Jovčić B. Virulence traits associated with Burkholderia cenocepacia ST856 epidemic strain isolated from cystic fibrosis patients. Antimicrob Resist Infect Control. 2017, 6, 57. doi: 10.1186/s13756-017-0215-y). Rezultati su prikazani na slici 4, a (laminin) i b (kolagen). Iz prikazanih rezultata može se videti da su obe testirane koncentracije ekstrakta uticale na adheziju ispitivanih sojeva za laminin odnosno kolagen. Manja koncentracija ekstrakta (50 µg/mL) je imala izraženiji efekat na adheziju S. aureus za laminin (**P < 0,01), dok je uticaj ekstrakta na adheziju za kolagen bio izraženiji na bakteriju E. faecalis (u prisustvu veće koncentracije adhezija je bila 40% u odnosu na kontrolu).

Ispitivanje uticaja različitih koncentracija natkritičnih ekstrakata ploda kleke (50 µg/mL i 100 µg/mL) na in vitro produkciju siderofora kliničkog izolata (308 strain) A. baumannii je takođe izvedeno u mikrobiološkoj laboratoriji Farmaceutskog fakulteta Univerziteta u Beogradu.

Rezultati ispitivanja uticaja natkritičnog, SCO<2>, ekstrakta ploda kleke na proizvodnju siderofora soja A. baumannii 308 prikazani su na slici 5 kao procenat proizvodnje siderofora hidroksamatnog tipa i predstavljeni prema izračunatom intenzitetu narandžaste boje. Intenzitet narandžaste boje odgovara proizvodnji siderofora hidroksamatnog tipa. Slike su dobijene izolacijom narandžaste boje korišćenjem softvera ImageJ. Podaci su predstavljeni kao srednje vrednosti.

Prikazani rezultati nedvosmisleno pokazuju antibakterijsko dejstvo i antibiofilm dejstvo natkritičnog, SCO<2>, ekstrakta ploda kleke na uzročnike infekcija, inhibiraju adheziju za protein ekstracelularnog matriksa, inicijalnu fazu formiranja biofilma i fazu sazrevanja biofilmova kod testiranih sojeva multirezistentnih bakterija.

Primer 9: Ispitivanje citotoksičnosti ekstrakta kleke i zelenog čaja

Ispitivanje citotoksičnosti je rađeno na L929 ćelijskoj liniji mišjih fibroblasta koji se standardno koriste za ispitivanja preparata i bioaktivnih supstanci na fibroblastima kože. Za potrebe ispitivanja efekata ekstrakata kleke i zelenog čaja na viabilnost ćelija, ćelije su zasađene u sterilne ploče sa 96 mesta u gustini od 2x10<4>ćelija po mestu ploče, dok za potrebe ispitivanja ekstrakata na proliferaciju ćelija zasađeno 5x10<3>ćelija u standardnim uslovima za gajenje ćelija u kulturi. Procena efekata na viabilnost i proliferaciju ćelija vršena je primenom MTT testa.

Ekstrakti kleke i zelenog čaja su ispitivani u koncentracijama 1000 µg/mL (oznaka uzorka 1 na slici 6), 500 µg/mL (oznaka uzorka 2), 250 µg/mL (oznaka uzorka 3), 125 µg/mL (oznaka uzorka 4), 62.5 µg/mL (oznaka uzorka 5) i 31,125 µg/mL (oznaka uzorka 6).

Rezultati ispitivanja efekata natkritičnih ekstrakata kleke (označenih simbolima VT8) i zelenog čaja (označenih simbolima VT9) na viabilnosti fibroblasta u kulturi in vitro (ispitivanje citotoksičnosti) prikazani su na slici 6. Urađena su ispitivanja citotoksičnosti na L929 fibroblastima, koje podrazumevaju testiranje rastvorljivosti ekstrakata kleke i zelenog čaja u uslovima i medijumima za gajenje ćelija u kulturi, kao i pripremu ćelija za eksperiment. Uočen je koncentracijski-zavisan efekat sa izraženom citotoksičnošću najviše ispitivane koncentracije ekstrakta kleke i zelenog čaja (od 1000 i 500 µg/mL), pri čemu se citotoksičnost smanjuje sa smanjenjem koncentracije ekstrakata.

Zaključak je da postoji koncentracijski-zavisan efekat i efekat koji zavisi od tipa ekstrakta.

Claims (12)

PATENTNI ZAHTEVI

1. Kompozicija za kozmetičku upotrebu na bazi lekovitog bilja što sadrži:

a) 0,10%-1,00% ekstrakta/ulja kleke (Juniperus sp.) sa najmanje 4,56% agatidiola i najmanje 1% dezoksipodofilotoksina, dobijenog postupkom natkritične ekstrakcije ugljenik(IV)-oksidom i 0,10%-1,50% ekstrakta listova zelenog čaja (Camellia sinensis) dobijenog postupkom natkritične ekstrakcije ugljenik(IV)-oksidom sa izolovanom najmanje jednom od komponenata iz grupe hlorofila kao što su: feofitin a, feofitin a’, hidroksi feofitin a, hidroksi feofitin a’, feofitin b, hidroksi feofitin b, hidroksi feofitin b’ i pirofeofitin a; iz grupe karotenoida kao što su: lutein izomer/zeaksantin, karotenoid i izomer β-karotena ili

b) 0,10%-1,00% ekstrakta/ulja kleke (Juniperus sp.) sa najmanje 4,56% agatidiola i najmanje 1% dezoksipodofilotoksina dobijenog postupkom natkritične ekstrakcije ugljenik(IV)-oksidom inkapsuliranog u nosač na bazi liposoma i 0,10%-1,50% ekstrakta listova zelenog čaja (Camellia sinensis) dobijenog postupkom natkritične ekstrakcije ugljenik(IV)-oksidom sa izolovanom najmanje jednom od komponenata iz grupe hlorofila kao što su: feofitin a, feofitin a’, hidroksi feofitin a, hidroksi feofitin a’, feofitin b, hidroksi feofitin b, hidroksi feofitin b' i pirofeofitin a; iz grupe karotenoida kao što su: lutein izomer/zeaksantin, karotenoid i izomer β-karotena, inkapsuliranog u nosač na bazi liposoma ili

c) 0,10%-1,00% ekstrakta/ulja kleke (Juniperus sp.) sa najmanje 4,56% agatidiola i najmanje 1% dezoksipodofilotoksina dobijenog postupkom natkritične ekstrakcije ugljenik(IV)-oksidom inkapsuliranog u nosač na bazi liposoma i 0,10%-1,50% ekstrakta listova zelenog čaja (Camellia sinensis) dobijenog postupkom natkritične ekstrakcije ugljenik(IV)-oksidom sa izolovanom najmanje jednom od komponenata iz grupe hlorofila kao što su: feofitin a, feofitin a’, hidroksi feofitin a, hidroksi feofitin a’, feofitin b, hidroksi feofitin b, hidroksi feofitin b’ i pirofeofitin a; iz grupe karotenoida kao što su: lutein izomer/zeaksantin, karotenoid i izomer β-karotena ili d) 0,10%-1,00% ekstrakta/ulja kleke (Juniperus sp.) sa najmanje 4,56% agatidiola i najmanje 1% dezoksipodofilotoksina dobijenog postupkom natkritične ekstrakcije ugljenik(IV) -oksidom i 0,10%-1,50% ekstrakta listova zelenog čaja (Camellia sinensis) dobijenog postupkom natkritične ekstrakcije ugljenik(IV)-oksidom sa izolovanom najmanje jednom od komponenata iz grupe hlorofila kao što su: feofitin a, feofitin a’, hidroksi feofitin a, hidroksi feofitin a’, feofitin b, hidroksi feofitin b, hidroksi feofitin b’ i pirofeofitin a; iz grupe karotenoida kao što su: lutein izomer/zeaksantin, karotenoid i izomer P-karotena, inkapsuliranog u nosač na bazi liposoma, namenjenih za izradu proizvoda u polučvrstom i tečnom obliku za topikalnu primenu.

2. Kompozicija prema patentnom zahtevu 1, naznačena time, što izrada liposomske disperzije obogaćene ekstraktom/etarskim uljem ploda kleke i ekstraktom lista zelenog čaja obuhvata sledeće faze:

I. faza:

a) inkapsulacija etarskog ulja/ekstrakta kleke (Juniperi sp.) u liposome vrši se korišćenjem 5,00-5,40 g Phosal 40IP - sirovine za formiranje liposoma, praznog nosača za lipofilne aktivne supstance na bazi fosfolipidne formulacije fosfatidilholina, sa kojom se 0,10-1,00 g etarskog ulja homogeno izmeša, zatim se podvrge mešanju u trajanju od 10 min, homogenizuje se pri brzini 3500 obrtaja/min da se formira stabilna preemulzija, a izrada liposomske disperzije od preemulzije izvodi se pomoću ekstrudera u više ciklusa do formiranja liposoma prečnika do 500 nm;

b) inkapsulacija u liposome ekstrakta zelenog čaja (Cameliae sinensis) izvodi se korišćenjem 1,00-5,00 g Pro-Lipo™ Neo - sistema/sirovine za formiranje liposoma na bazi fosfatidilholina, propandiola i lecitina u lamelarnim dvoslojevima, mešanjem sa 0,10-1,50 g ekstrakta čaja i homogenizacijom pri 2500 obrtaja/min.

II faza: izrađene liposomske disperzije iz faze I inkorporiraju se u podlogu koja predstavlja stabilisanu emulziju U/V zagrevanjem na 85°C komponenata masne faze, emulgatora, koemulgatora i komponenata vodene faze na 87°C, a zatim njihovim spajanjem uz rad homogenizatora na 2500 obrtaja/min i mešalice na 500 obrtaja/min tokom 10 min;

III faza: kada ohlađena masa iz faze 2 dostigne 35°C u podlogu se dodaju liposomske disperzije iz faze I, uz mešanje pri 250 obrtaja/min da se formira homogena masa;

IV faza: homogena masa se oslobađa od vazduha procesom višekratnog vakuumiranja, izmeri se pH vrednost i provodljivost i ubaciti u prihvatni sud na odležavanje i strukturiranje u trajanju od 24 sata, nakon čega se

V faza: masa se puni u čistu ambalažu i signira.

3. Postupak dobijanja natkritičnog ekstrakta kleke naznačen time, što se proces ekstrakcije iz zrelih i/ili zelenih plodova i/ili lista kleke (Juniperus sp.) izvodi na temperaturi od 45 ± 2°C, bez ili sa dodatkom 96% etanola kao kosolventa u količini od 20 ± 2% u odnosu na masu utrošenog ugljenik(IV)-oksida za ekstrakciju bez kosolventa:

a) na pritisku od 10 ± 5 MPa, do iscrpljenja biljne sirovine, tokom 1,17 do 3 h i/ili

b) na pritisku od 30 ± 5 MPa, u ukupnom trajanju od 5,67 do 11,17 h i

što se nakon završene ekstrakcije sa kosolventom etanol iz smeše sa ekstraktom uklanja uparavanjem.

4. Postupak prema zahtevu 3, naznačen time, što je prinos ekstrakcije iz zrelih plodova kleke 5,46-7,14%, iz zelenih plodova kleke 5,20-7,01%, a iz lista kleke 1,07-4,65%.

5. Kozmetički preparat prema patentnim zahtevima 1 i 2, naznačen time, što je kompozicija inkorporisana u odgovarajuću podlogu u obliku emulgela, kreme, losiona ili micelame vode.

6. Kozmetički preparat u obiiku emulgeia prema zahtevima 1 i 2, naznačen time, što sadrži 0,50-10,00% disperzije liposoma sa inkapsuliranim ekstraktom ploda kleke i 0,50-10,00% disperzije liposoma obogaćenih ekstraktom zelenog čaja, kao i dodatke za formiranje farmaceutsko-tehnološkog oblika: 3,00-15,00% kaprilno/kaprinskih triglicerida, 2,00-7,00% izopropil miristata, 1,00-2,50% Polisorbata 80, 1,00-3,50% ši butera, 0,10-0,50% tokoferol acetata; 0,45-1,25% hidroksietilceluloze, 2,50-5,00% glicerola 0,85-0,90% fenoksietanola 0,05-0,10 etilheksilglicerina i prečišćene vode do 100,0%.

7. Kozmetički preparat u obliku krema prema zahtevima 1 i 2, naznačen time, što sadrži 0,50-10,00% disperzije liposoma sa inkapsuliranim ekstraktom ploda kleke i 0,50-10,00% disperzije liposoma obogaćenih ekstraktom zelenog čaja ili 0,50-20,00% disperzije liposoma sa inkapsuliranim ekstraktima ploda kleke i zelenog čaja, kao i uobičajene dodatke za formiranje farmaceutskotehnološkog oblika: 1,00-4,00% cetosterola, 3,00-8,00% triglicerida kaprilne i kapronske kiseline, 1,00-5,00% ši butera, 5,00-15,00% C12-15alkil benzoata, 4,00- 10,00% C12-14alkil poliglukozida/C12-14alkohola, 1,00-5,00 koko glukozida/alkohola kokosovog oraha; 0,85-0,90% fenoksietanola; 4,00-7,00% glicerola; 0,05-0,10 etilheksilglicerina i prečišćene vode do 100,0%.

8. Kozmetički preparat u obliku losiona prema zahtevima 1 i 2, naznačen time, što sadrži 0,50-10,00% disperzije liposoma sa inkapsuliranim ekstraktom ploda kleke i 0,50 -10,00% disperzije liposoma obogaćenih ekstraktom zelenog čaja ili 0,50-20,00% disperzije liposoma sa inkapsuliranim ekstraktima ploda kleke i zelenog čaja, kao i dodatke za formiranje farmaceutskotehnološkog oblika i dodatke za formiranje farmaceutsko-tehnološkog oblika: 10,0-20,00% PEG-15 Stearil Eter, 5,00-27,00% glicerola, 1,00-15,00% pantenola i 0,50-2,50% polisorbat 20, 0,50-2,00% alantoina; 0,85-0,90% fenoksietanola; 0,05-0,10 etilheksilglicerin, 0,05-2,00 tokoferol acetate i prečišćene vode do 100,0%.

9. Kozmetički preparat obliku micelarne vode prema zahtevima 1 i 2, naznačen time, što sadrži 0,50-10,00% disperzije liposoma sa inkapsuliranim ekstraktom ploda kleke i 0,50-10,00% disperzije liposoma obogaćenih ekstraktom zelenog čaja ili 0,50-20,00% disperzije liposoma sa inkapsuliranim ekstraktima ploda kleke i zelenog čaja, kao i dodatke za formiranje farmaceutsko-tehnološkog oblika, kao i dodatke za formiranje farmaceutsko-tehnološkog oblika: 5,00-27,00% glicerola, 1,00-15,00 pantenola, 0,05-2,50 polisorbata 20; 0,50-2,00% alantoina, 0,85-0,90 fenoksietanola, 0,05-0,10 etilheksilglicerina, 0,15-0,50 niacin amida u prečišćenoj vodi do 100%.

10. Kozmetička kompozicija prema zahtevima 1, 2, 5-9 za topikalnu primenu.

11. Kozmetička kompozicija prema zahtevima 1, 2, 5-9 za topikalnu primenu sa antimikrobnim i antibiofilm dejstvom.

12. Kozmetička kompozicija prema zahtevima 1, 2, 5-9 za topikalnu primenu sa antimikrobnim i antibiofilm dejstvom u tretmanu upala kompromitovane kože osoba sa hiperglikemijom.