RS30104A - Keratinociti koji se mogu primeniti kao biološki aktivne supstance za lečenje rana - Google Patents

Abstract

Pronalazak se odnosi na nove keratinocite koji se mogu kultivisati in vitro, kao i na njihovu prvenstvenu primenu za dobijanje proizvoda koji se može koristiti za lečenje akutnih i hroničnih rana.

Description

Keratinociti koji se mogu primeniti kao biološki aktivne supstance za lečenje rana

Oblast tehnike

Pronalazak se odnosi na nove keratinocite koji se mogu kultivisatiin vitro,kao i na njihovu efikasnu primenu za dobijanje proizvoda koji se može primeniti za lečenje akutnih i hroničnih rana. Shodno tome, predmetni pronalazak pripada oblasti medicine, a posebno oblasti zaceljivanja rana inženjeringom tkiva.

Stanje tehnike

Alogeni keratinociti se već duže vreme uspešno primenjuju za lečenje rana, a posebno ulceracija i/ili opekotina (Maier, 1993; Schonfeld et al., 1993). Rane koje nisu mogle biti izlečene uobičajenim metodama u toku dužih vremenskih perioda često se mogu uspešno lečiti korišćenjem alogenih keratinocita (Phillips i Gilchrest, 1993; Beele et al., 1991; Leigh et al., 1991; Lindgren et al, 1998). Kada je u pitanju primena alogenih keraticita, pažnja je u početku bila prevashodno usmerena na zamenu kože, ti. na regeneraciju transplantiranog epiderma. Međutim, uskoro je postalo očigledno daje uspeh ovog tretmana prevashodno baziran na stimulisanju sopstvene telesne reepitelizacije, a ne na "rastu" transplanta alogenih ćelija u rani. Brojna ispitivanja su nedavno pokazala da transplantirani keratinociti ostaju u rani samo u toku izvesnog vremenskog perioda, pa se onda eliminišu iz tela na način koji nije klinički uočljiv (Kawai et al., 1993). Na taj način stimulacija sopstvene telesne sposobnosti zaceljivanja pomoću alogenih keratinocita dovodi skoro do optimalnog oslobađanja mnoštva različitih faktora rasta, citokina, ekstracelularne matrice (ECM), malih molekula i proteaza kako u pogledu prostora, tako i u pogledu vremena (Lang et al., 1996; Marcusson et al., 1992). Kompleksnost i broj faktora koji se oslobađaju potvrdili su postojanje terapeutske prednosti u odnosu na uobičajene pojedinačne terapije, npr. sa izolovanim faktorima rasta. Međutim, pored glavnog efekta reepitelizacije, lečenje sa keratinocitima takođe uzrokuje i makroskopski i mikroskopski uočljive promene u granulacionom tkivu (Lang et al., 1996). Sledeće često opisivano dejstvo keratinocita koje je delotvorno za pacijenta jeste uočljiva analgezija posle transplantacije (Schonfeld et al., 1993).

Za lečenje rana prvenstvena je primena nediferenciranih keratinocita koji se aktivno dele, pošto je očigledno da keratinociti koji se aktivno dele imaju kompleksni profil sekrecije koji potpomaže zaceljivanje rana. Sa izuzetkom matičnih (stem) ćelija, nediferencirani keratinociti gube svoj potencijal proliferacijein vivoutoku prirodne diferencijacije posle samo nekoliko deoba ćelija, što predstavlja proces koji je do sada uvek bio uočen kodin vitro kulitvisanjakeratinocita (Barrandon i Green, 1987). Zbog toga su keratinociti koji se aktivno dele, a koji su posebno podesni za zaceljivanje rana, do sada morali da se kultivišu samo777vitro,zbog čega je njihova primena u medicinske svrhe bila teška i skupa.

Alogeni keratinociti se terapeutski primenjuju ili direktno u obliku takozvanih "keratinocitnih listova", koji se sastoje od višeslojnog, enzimski odvojenog agregata ćelija ili zajedno sa biokompatibilnim nosačima pod nazivom "biološki aktivni zavoji za zaceljivanje rana". Zadnje pomenuti imaju tu prednost što ćelijama nije potreban prethodni enzimski tretman kojim se odvajaju od supstrata u posudi za kultivisanje pre nego što se upotrebe. Pored toga, primena biokompatibilnih membrana kao nosača za kultivisanje keratinocita (EP 0 462 462, US 5,658,331; US 5,693,332; EP 0518 920) omogućava pripremu biološki aktivnih zavoja za zaceljivanje rana unapred, pošto ćelije više ne moraju da formiraju samostalan agregat ćelija. Za tretiranje rana mogu se primeniti nosači koji imaju već izrasle subkonfluente. Pored toga što su unapred na raspolaganju, primena subkonfluentnih agregata ćelija ima i tu dodatnu prednost što su odgovarajući kultivisani keratinociti manje diferencirani, te su zbog toga podesniji za lečenje rana.

Keratinociti se mogu krioprezervirati (čuvati u zamrznutom stanju) radi zaceljivanja rana, bez bilo kakvih škodljivih efekata, direktno ili zajedno sa biokompatibilnim nosećim materijalima na temperaturama između - 30 i -196 °C, ali prvenstveno između - 70 i - 90 °C (De Luca et al., 1992; Teepe et al., 1993). Ovo dalje poboljšava njihovu terapeutsku primenljivost, pošto je do određene mere moguće čuvati zalihe biološki aktivnih zavoja za zaceljivanje rana.

Tehnički problem

Keratinociti koji su poznati iz stanja tehnike i biološki aktivni zavoji za zaceljivanje rana koji se dobijaju od njih imaju izvesne nedostatke koji se otklanjaju predmetnim pronalaskom.

Očigledan nedostatak keratinocita primarnog porekla je do sada bio taj što pomenute ćelije mogu da se replikuju samo u nekoliko generacija ćelija procesom kultivisanja ćelijain vitro,a da pri tome ne izgube svoj visoki stepen deobe, a time i svoju podesnost za pripremu biološki aktivnih zavoja za zaceljivanje rana. Na osnovu stanja tehnike stručnjak iz odgovarajuće oblasti tehnike može kultivisanjemin vitropovećati broj ćelija samo za faktor od oko IO<3>do IO<4>(Tanczos et al., 1999).

Sledeći nedostatak koji proističe iz ovoga je činjenica da ograničena mogućnost gajenja pomenutih keratinocitain vitročini veoma bitnim često i kompleksno ponovno izolovanje; sa druge strane to znači da dobijeni replikovani ćelijski materijal nije uniforman (jednoobrazan) i da zbog toga zavoji za zaceljivanje rana koji se prave od njih imaju različit kvalitet, ili ga u najmanju ruku mogu imati.

Sledeći nedostatak je taj što ponovno izolovanje keratinocita od različitih donora (davalaca) stvara kod primaoca povećanu opasnost od infekcije sa agregatom za zaceljivanje rana. Tako se, na primer, može pojaviti povećana opasnost od SIDE ili hepatitisa.

Suština pronalaska

Pronalazak se odnosi na keratinocite sa visokim potencijalom proliferacije koji nisu imortalizovani i koji se mogu replikovati najmanje 150 puta pomoćuin vitrometoda za kultivisanje ćelija. Ovo rezultira sa faktorom multiplikacije ćelija od oko IO<44>. Odgovarajući keratinociti i dalje zadržavaju svoja svojstva koja su podesna za lečenje rana.

Keratinociti prema pronalasku su primarno keratinociti koji su izolovani od davaoca i koji se mogu kultivisatiin vitro,dok njihovo izolovanje i inicijalno kultivisanje može izvršiti svaki stručnjak iz odgovarajuće oblasti tehnike, na primer, prema procesu koji su opisali Rheinvvald i Green u 1975.

Pronalazak se prvenstveno odnosi na keratinocite koji su izolovani iz epidermalnog dela prepucijuma. Prednosni su keratinociti humanog porekla, a posebno keratinociti iz kulture KC - BI -1, koji su deponovani 27. juna 2001. godine kod DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen [Nemačka kolekcija mikroorganizama i ćelijskih kultura] GmbH, Braunšvajg, Nemačka, pod prijavnim brojem DSM ACC2514 u svrhe postupka patentiranja u skladu sa Budimpeštanskim sporazumom. Pronalazak se takođe odnosi i na keratinocite koji potiču od kulture KC - BI -1 (DSM ACC2514). Shodno tome, pronalazak se takođe odnosi i na sve ćelije i kulture koje su i/ili koje mogu biti generisane potprolaženjem (engl. "subpassaging") i/ili subkloniranjem originalne kulture KC - BI - 1.

Kultivisanje keratinocita prema pronalasku je opisano pomoću primera koji se odnosi na keratinocite KC - BI -1 (primer 1). Primena kompleksnog medijuma koji je specifikovan u primeru 1 i primena hraniteljskih ćelija (engl. "feeder cells"), a prvenstveno primena letalno ozračenih mišijih 3T3 fibroblasta su prvenstveni za njihovo kultivisanje. Količina fetusnog telećeg seruma trebala bi da iznosi između 2 i 10 %. Priprema hraniteljskih ćelija je poznata stručnjacima iz odgovarajuće oblasti tehnike i može se izvršiti, na primer, pomoću procesa koji je opisan u primeru 2. Subkultivisanje keratinocita prema pronalasku sa maksimalnom konfluencijom od 80% je posebno prvenstveno. Keratinociti mogu biti kultivisani na 35 do 38 °C, a prvenstveno na 37 °C, na relativnoj vlažnosti > 90%, a prvenstveno od 95% i sa zasićenjem sa CO2od 5 do 9%.

Sa procesom koji je opisan u primeru 1 vreme za replikaciju (udvostručavanje) populacije keratinocita, a posebno humanih keratinocita iz epidermalnog dela prepucijuma iznosi između 1 i 2 dana (Fig. 1). Ćelije se mogu kultivisati pomoću višestrukih prolaženja (prolaza) u suštini konstantnom brzinom replikacije (Fig. 2). Međutim, predmetni pronalazak nije ograničen samo na keratinocite KC - BI -1, već stručnjak iz odgovarajuće oblasti tehnike može izvesti pronalazak pod odgovarajućim uslovima i sa bilo kojim drugim keratinocitima prema zahtevima 1 - 8.

Izraz "nisu imortalizovani" u vezi predmetnog pronalaska znači da se primarno izolovani keratinociti i keratinociti koji se ovde kultivišu ne transformišu spontano i/ili da nisu transformisani molekularno - biološkim, hemijskim ili fizičkim metodama koje su poznate iz stanja tehnike. Zadnje navedeno znači da ćelije nisu tretirane npr. upotrebom virusnih faktora ili sekvenci, hemijskim mutagenim supstancama ili, na primer, zračenjem ili kombinacijom različitih procesa.

Keratinociti koji "nisu imortalizovani" takođe znače da u poređenju sa transformisanim tumorskim ćelijskim linijama (Harle - Bachor i Boukamp, 1993) ili u poređenju sa imortalizovanim ćelijskim linijama, a prvenstveno sa ćelijskom linijom HeLa, pomenuti keratinociti nemaju telomeraznu aktivnost ili da imaju bitno redukovanu telomeraznu aktivnost (upor. Fig. 3). Ovo je posebno slučaj u poređenju sa imortalizovanim keratinocitima ćelijske linije HaCat.

Izraz "nisu imortalizovani" takođe znači i da pomenuti keratinociti ne mogu da se replikuju u odsustvu fetusnog telećeg seruma i/ili u odsustvu hraniteljskih ćelija i/ili u odsustvu epidermalnog faktora rasta, EGF, što imortalizovani keratinociti, na primer, mogu (Schoop et al., 1999).

Međutim, izraz "nisu imortalizovani" takođe znači i da pomenuti keratinociti ne menjaju svoj karakteristični fenotip sa porastom replikacije ćelija (upor. Fig. 4).

"Nisu imortalizovani" takođe znači i da pomenuti keratinociti pokazuju normalni profil diferencijacije posle transplantacije na bezdlake miševe, a prvenstveno BALB/c. "Normalni potencijal diferencijacije" ovde znači sposobnost keratinocita da se razviju u terminalno diferencirane keratinocite i da obrazuju suprabazalne epidermalne slojeve, kaoi stratum corneumna isti način kao i autologi keratinociti.

Predmetni pronalazak se takođe odnosi i na keratinocite koji nisu imortalizovani i koji se mogu replikovati najmanje 200 puta pomoćuin vitrometoda za kultivisanje ćelija. Pronalazak se dalje odnosi na keratinocite koji nisu imortalizovani i koji se mogu replikovati najmanje 250 puta pomoćuin vitrometoda za kultivisanje ćelija. Pronalazak se takođe odnosi i na keratinocite koji nisu imortalizovani i koji se mogu replikovati najmanje 300 puta pomoćuin vitro metodaza kultivisanje ćelija.

Predmetni pronalazak prvenstveno omogućava da se replikuju pomenuti keratinociti od samo jednog davaoca ili od samo nekoliko davalaca. Polazeći od jedne donacije, može se dobiti, na primer, 10<44>ćelija posle 150 replikacija ćelija, 10<77>ćelija posle 250 replikacija ćelija i IO<90>ćelija posle 300 replikacija ćelija. Na taj način pronalazak po prvi put omogućava proizvodnju velikih količina standardizovanog

ćelijskog materijala za pripremu biološki aktivnih zavoja za zaceljivanje rana konstantnog kvaliteta koji se može verifikovati. Odgovarajuća količina standardizovanog ćelijskog materijala može se replikovati, na primer, polazeći od depoa krioprezerviranih ćelija, koji je sa svoje strane dobijen od keratinocita koji imaju svojstva prema pronalasku.

Korišćenjem standardizovanog ćelijskog materijala kao polaznog materijala za pripremanje biološki aktivnih zavoja za zaceljivanje rana opasnost od infekcije potencijalnih primalaca takođe se smanjuje, pošto je izolovanje keratinocita ograničeno na nekoliko davalaca, a prvenstveno samo na jednog davaoca.

Na taj način, pronalazak otklanja ozbiljne nedostatke koji se trenutno postoje usled samo ograničenog broja prolaza keratinocita kojei je do sada bio poznat.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na proizvod koji se sastoji od nosača koji je obložen sa keratinocitima prema pronalasku. "Obložen" za svrhe ovog pronalaska znači daje površina nosača delimično ili u potpunosti kolonizovana sa keratinocitima prema pronalasku. Delimično kolonizovani nosač je posebno podesan, pošto je potrebno kraće vreme kultivisanja da bi nosač mogao bude da upotrebljen za lečenje rana.

Podesan nosač za svrhe pronalaska je karakterisan sa time što je to biokompatibilni noseći materijal koji se može koristiti za pripremanje farmaceutske kompozicije. Mogu se koristiti hidrofobni biokompatibilni noseći materijali, kao što je, na primer, onaj koji je opisan u WO 91/13638. Međutim, takođe je moguća i primena nosećih materijala sa prevashodno hidrofilnim svojstvima.

Prednosni primer izvođenja predmetnog pronalaska obuhvata primenu nosećih materijala koji se sastoje od polimera esterifikovane hijaluronske kiseline. U posebno prednosnom primeru izvođenja se koristi polimer esterifikovane hijaluronske kiseline koji se sastoji od perforiranog polimernog filma definisane geometrije. Polimerni film ima, na primer, debljinu od 10 do 500 (im, i perforiran je, sa otvorima veličine između 10 i 1000 um, pri čemu ti otvori imaju definisanu, konstantnu veličinu i obrazuju pravilne nizove, koji se nalaze na međusobnom rastojanju od 50 do 1000 um. Film ove vrste je opisan u EP 0 462 426. Perforirani noseći materijali su posebno podesni, jer ne zahtevaju stavljanje biološki aktivnog zavoja za zaceljivanje rana u nekom posebnom smeru. U primeru 3 je, radi ilustracije, opisana priprema perforane noseće matrice od esterifikovane hijaluronske kiseline definisane geometrije, kolonizovane sa keratinocitima prema pronalasku. Noseća matrica je proizvod koji pravi Messrs Fidia Advanced Biopolimers Ltd., Abano Terme, Italija, koji se u Nemačkoj plasira pod komercijalnim imenom "Laserskin".

Posebno poželjna podobnost ovog nosećeg materijala za izradu biološki aktivnog zavoja za zaceljivanje rana zajedno sa keratinocitima već je dokazana na životinjskom modelu (Lam et al., 1999) i kod ljudi (Harris et al., 1999). Pored poboljšane migracije i diferencijacije epitelijalnih ćelija, matrica koja se sastoji od estra hijaluronske kiseline ima pozitivno dejstvo i na angiogenezu i na proizvodnju kolagena. Međutim, zavoji za zaceljivanje rana sa estrom hijaluronske kiseline kao matricom koji se sada primenjuju obloženi su sa autologim keratinocitima i/ili ekvivalentima kože kompleksne strukture koji se dobijaju od keratinocita i fibroblasta. Zbog toga oni imaju nedostatke koji su opisani napred u stanju tehnike. Ovi nedostaci se mogu na adekvatan način otkloniti primenom prednosnih alogenih keratinocita prema pronalasku.

Sledeći prednosni primer izvođenja pronalaska odnosi se na proizvod koji se sastoji od keratinocita prema pronalasku zajedno sa reapsorbilnim polimerima koji se obuhvataju poliestere, polikarbonate, polianhidride, poliortoestere, polidepsipeptide, polietarestere, poliamino kiseline, ili polifosfazene, a posebno poli(L- laktid), poli(D, L- laktdd), poli(L- laktid - ko - D, L- laktid), poli(glikoUd), poli(L-laktid - ko - glikolid), poli(L- laktid - ko - trimetilen - karbonat) ili poli(dioksanon). Ovi polimeri mogu biti perforirani ili neperforirani.

Predmetni pronalazak se takođe odnosi i na metod za krioprezervaciju (čuvanje u zamrznutom stanju) keratinocita prema pronalasku na temperaturi od - 20 °C do -196 °C, a prvenstveno na temperaturi ispod -180 °C. Pomenuti keratinociti mogu se zamrznuti standardizovanim metodama koje su poznate stručnjacima iz odgovarajuće oblasti tehnike. Kao krioprotektant,interalia,može biti primenjen DMSO. Takođe je moguća primena i drugih krioprotektanata, kao što su glicerol, hidroksietil škrob ili njihova kombinacija, kao i kombinacija pomenutih sa DMSO. Podesni metodi su opisani, na primer, u WO 96/24018, US 5,891,617 ili US 5,298,417.

Predmetni pronalazak se takođe odnosi i na krioprezervaciju nosača obloženih sa keratinocitima prema pronalasku, koja je karakterisana sa time što se keratinociti sa svojim odgovarajućim nosačima krioprezerviraju na temperaturi od - 20 °C do -196 °C, a prvenstveno na - 60 °C do - 80 °C. Prednost krioprezervacije se sastoji u tome što može da se čuva proizvod koji se dobija u velikim količinama, kao i da se ispita uniformnost njegovog kvaliteta uzimanjem slučajnih uzoraka pre kliničke primene. Konačno, čuvanje obezbeđuje da agregati za zaceljivanje rana za medicinske namene budu na raspolaganju u najkraćem vremenskom roku.

Podesni krioprotektant za proizvod prema pronalasku je hidroksietil škrob, na primer, u koncentraciji od 7 -13% (tež./tež.). Međutim, takođe je moguća i primena DMSO ili glicerola, kao i kombinacije različitih krioprotektanata, a posebno hidroksietil škroba, DMSO i/ili glicerola. Takođe je moguća i primena trehaloze kao krioprotektanta.

Posle brze reprodukcije na temperaturi od 37 °C do - 5 do -10 °C, a prvenstveno od - 6 do - 8 °C u toku 2 - 5 min, proizvod koji sadrži nosač i keratinocite prema pronalasku se održava na podesnoj temperaturi u toku 15 - 30 min, a prvenstveno u toku 23 - 26 min. Onda se proizvod hladi brzinom hlađenja od < 1 °C/min, a prvenstveno od 0,2 do 0,6 °C/min, te najpoželjnije od 0,4 °C/min, do temperature od npr. - 60 do - 80 °C.

U primeru 4 je, radi ilustracije, opisana krioprezervacija noseće matrice od estra hijaluronske kiseline obložene sa KC - BI -1. Međutim, takođe je moguća i primena drugih metoda krioprezervacije, kao što su npr. metode koje su opisane u WO 95/707611, WO 96/24018, EP 0 296 475; ne treba smatrati daje ova lista potpuna, već samo da ukazuje na metode za krioprezervaciju proizvoda koji se sastoje od biokompatibilnih nosača i keratinocita koji su deo aktuelnog stanja tehnike.

Predmetni pronalazak se takođe odnosi i na medicinsku primenu keratinocita prema pronalasku koji su ovde opisani i/ili proizvod koji se sastoji od pomenutih keratinocita i nosača koji su ovde opisani, a posebno na njihovu primenu za lečenje rana. Jedan primer izvođenja pronalaska se sastoji u primeni keratinocita prema pronalasku i/ili proizvoda koji se sastoji od pomenutih keratinocita i nosača za lečenje opekotina i/ili ulceracija. Opekotine koje se mogu lečiti su prvenstveno opekotine drugog stepena, dok su ulceracije prvenstveno hronične ulceracije potkolenice koje se teško leće, tipaUlcus cruris,a prvenstvenoUlcus cruris venosumili dijabetičke ulceracije, kao i dekubitusne ulceracije.

Medicinska primena obuhvata kombinovanu i/ili dopunsku primenu pomenutih keratinocita i/ili proizvoda koji se sastoji od keratinocita i nosača prema pronalasku sa uobičajenim terapijama za koje je iz stanja tehnike poznato da efikasno deluju na zaceljivanje rana. Ovo znači kombinovanu i/ili dodatnu primenu jedne ili više drugih supstanci sa efikasnim dejstvom na zaceljivanje rana. Mogu se pomenuti i dodatni i/ili kombinovani tretmaniUlcus cruris venosumasa hidrokoloidnim zavojima i/ili dodatna primena antimikrobnih sustanci, npr. davanje antibiotika.

Pronalazak se takođe odnosi i na keratinocite prema pronalasku i/ili na proizvod koji se sastoji od biokompatibilnog nosača i pomenutih keratinocita za pripremu medicinskog proizvoda za lečenje rana, a posebno za lečenje opekotina i/ili ulceracija, npr. za lečenje opekotina drugog stepena,Ulcus cruris { venosuma),dijabetičarskih ulceracija ili dekubitusnih ulceracija.

Pronalazak se dalje odnosi na metod za lečenje ovih rana, koji metod je karakterisan sa time što se keratinociti prema pronalasku i/ili proizvod prema pronalasku koji se sastoji od keratinocita i nosača stavljaju na rane koje treba lečiti. Keratinociti i pomenuti proizvod se mogu upotrebljavati ili svezi ili posle krioprezervacije. Odgovarajuća metoda za lečenje rana je opisana u primeru 5.

Opis slika nacrta:

Fig. 1: Replikacija keratinocita KC - BI- 1 kao funkcija vremena kultivisanja.Ovde je prikazan broj replikacija ćelija (CPD = Cumulative Population Doublings, prev. kumulativne replikacije populacije) keratinocita KC - BI -1 u toku perioda kultivisanja od 94 dana. U toku perioda posmatranja od 94 dana ćelije su se replikovale približno 75 puta. Ovo odgovara srednjem vremenu replikacije od 1,25 dana po jednoj replikaciji ćelija, ili 12,5 za 10 dana.Fig. 2: Replikacija keratinocita KC - BI- 1 u toku perioda od lOmeseci.Ovde je prikazana replikacija ćelija keratinocita KC - BI -1 u toku 10 meseci, koja je data kao replikacije populacije (PD = population dublings) u funkciji prolaza ćelija 1 - 67.Fig. 3: Određivanje relativne telomerazne aktivnosti.Ovde je prikazana relativna telomerazna aktivnost keratinocita KC - BI -1 posle prolaza 1,12,18, 40 i 57 u poređenju sa aktivnosti ćelijske linije HeLa. Na slici je uočljiva skoro nikakva ili samo neznatna telomerazna aktivnost keratinocita KC - BI - 1 u poređenju sa imortalizovanom ćelijskom linijom HeLa.Fig. 4: Morfologiju keratinocita KC- BI- 1 posle prolaza 5i 60.Kada se pod optičkim mikroskopom posmatraju keratinociti KC - BI -1, nema nikakve morfološke razlike između ćelija prolaza 5 (vreme kultivisanja 25 dana) i ćelija prolaza 60 (vreme kultivisanja 300 dana).

Ilustrativni primeri izvođenja

Primer 1: Proces za kultivisanje keratinocita prema pronalasku uzimanjem kulture KC - BI- 1 ( DSM

ACC2514) kao primera

1. Materijal

Keratinociti KC - BI -1; ozračeni 3T3 - mišji fibroblasti (hraniteljske ćelije, za dobijanje upor. primer 2); medijum za kultivisanje ćelija K/l (za kompoziciju vidi dole); EDTA (0,02%); tripsin/EDTA (0,05%/0,01%); boce za kultivisanje ćelija (T- boca): 25 cm<2>, 80 cm<2>,175 cm<2>.

2. Otapanje ćelija

2. 1 Otapanje hraniteljskih ćelija

Ćelije su brzo otopljene i stavljene u 5 -10 ml prethodno zagrejanog K/l medijuma. Odgovarajuća količina hraniteljskih ćelija je preneta u podesne boce za kultivisanje ćelija i pokrivena je sa K/l medijumom:

Hraniteljske ćelije se mogu koristiti odmah ili u toku 24 sata.

2. 2 Otapanje keratinocita

Ćelije su brzo otopljene i stavljene u 5 -10 ml prethodno zagrejanog K/l medijuma. Odgovarajuća količina ćelija je dodata u boce za kultivisanje ćelija koje su već sadržale hraniteljske ćelije i bile pokrivene sa svežim medijumom:

3. 0 Kultivisanje

Ćelije su inkubirane na 35 - 39 °C, a prvenstveno na 37 °C. Relativna vlažnost je bila > 90%, a prvenstveno 95% i koncentracija CO2je bila 5 - 9%. Keratinociti su subkultivisani do maksimalne

konfluencije od 80%.

Zatim je ispuštena izbistrena tečnost iznad ćelijske kulture. Hraniteljske ćelije su isprane dva puta sa 0,02% EDTA (2 -10 ml) i inkubirane u toku 5 -10 min na 37 °C , pa su onda odvojene od boce za kultivisanje ćelija lupkanjem (ili trešenjem). Keratinociti su onda tretirani sa tripsinom/EDTA (0,05%/0,01%, 1 - 6 ml) u toku 5 -10 min na 37 °C, pa su pažljivo odvojeni lupkanjem. Ukoliko je bilo neophodno, preostale ćelije su pažljivo ostrugane korišćenjem špatule (lopatice) za ćelije. Rastvor tripsin/EDTA je neutralizovan dodavanjem K/l medijuma i ćelije su odvojeni pažljivim usisavanjem pipetom i ispuštanjem iz nje (pipetiranjem). Ćelije su zasejane u onom broju koji je specifikovan u 2.2. Medijum za kultivisanje ćelija K/l je zamenjen na dan 3, pa onda na svaka dva dana.

4. 0 Priprema K/ l mediiuma

Sve komponente i rastvori za čuvanje su pomešani jedni sa drugima po redosledu koji je dat u Tabeli 1. Smeša je dopunjena do 1 litra sa WFI ("water for injection", prev. voda za injekcije). Onda je pH podešen na 7,0 do 7,2 sa NaOH ili HC1. Osmolaritet je trebao da iznosi između 320 - 400 mOsm/kg. Na kraju je medijum K/l sterilno filtriran.

4. 1 Priprema rastvora za čuvanje

Trijodotironin

13,6 mg trijodotironina je rastvoreno u 1 ml 0,1 NaOH, pa mu je dodato 99 ml PBS. Dobijeni rastvor je razblažen u PBS-u u odnosu 1:100. Po litru medijuma je bio potreban 1 ml ovog rastvora.

EGF

1 mg EGF je rastvoren u 100 ml WFI. Po litru medijuma je bio potreban 1 ml ovog rastvora,

rh - Insulin (rastvorljiv samo na pH < 4,0)

5g rh - insulinaje dodato 0,9LWFI, pa je pH podešen na 2,5 sa 6M HC1. Pošto se rh - insulin rastvorio, pH je podešen na 8,0 sa IM NaOH. Smeša je dopunjena do 1 litra saWFI. Po litru medijuma je bio potreban 1 ml ovog rastvora.

Međutim, ćelije se takođe mogu kultivisati i od svežeg materijala sa biopsije, npr. od epidermalnog dela prepucijuma. Primarno izolovanje nediferenciranih, proliferirajućih ćelija može se izvršiti primenom metoda koji su opisali Rheimvald i Green u 1975.

Hraniteljske ćelije koje se koriste mogu biti, na primer, ćelije koje su opisane u primeru 2. Takođe se podrazumeva daje moguća i primena drugih letalnih fibroblasta, a prvenstveno drugih mišijih fibroblasta, te najpoželjnije potomaka ćelijske linije 3T3.

Primer 2: Priprema ozračenih 3T3 hraniteljskih ćelija za kultivisanje keratinocita

1. Materijal

Misiji 3T3 fibroblasti (npr. ATCC CCL 92, 3T3 - Swiss albino, kontaktno - inhibirani fibroblasti) koji se mogu dobiti iz American Type Culture Collection (ATCC), 10801 Universitv Boulevard, Manassas, VA, USA, DMEM + 10%fetusni teleći serum( FCS) ;PBS; 0,2% rastvor tripsina; 0,04% rastvor EDTA; boce za kultivisanje ćelija (T- boce): 25 cm<2>, 80 cm<2>,175 cm<2>.

2. Otapanje ćelija

Ćelije su brzo otopljene, pa im je dodato 5 -10 ml prethodno zagrejanog medijuma. Medijum koji sadrži DMSO je odstranjen posle centrifugiranja. Ćelije su suspendovane u 5 -10 ml medijuma. Pošto je određen broj ćelija, ćelije su zasejane u podesne boce za kultivisanje ćelija sa gustinom od IO<3>do IO<4>ćelija/cm<2>. Onda su inkubirane na 35 - 39 °C, a prvenstveno na 37 °C. Relativna vlažnost je bila > 90%, a prvenstveno 95% i koncentracija CO2je bila 5 - 9%.

3. Kultivisanje ćelija

Rast ćelija je proveravan svakog dana. Gustina ćelija nije prešla maksimalnu konfluenciju od 70 - 80%. Ukoliko je bilo potrebno, subkultivisanje je vršeno svaka 2 do 4 dana. U tu svrhu medijum je odstranjivan, pa su ćelije ispirane sa podesnom količinom smeše EDTA i tripsina u odnosu 1: 2 (0,5 - 5 ml). Onda su ćelije koje su odvojene unete u 3,5 - 20 ml medijuma. Ćelije su ponovo zasejane sa gustinom od IO<3>do IO<4>ćelija/cm<2>.

4. Ozračivanje hraniteljskih ćelija

Hraniteljske ćelije su ozračene dozom zračenja od oko 60 Gy (6000 rad u<137>Cs izvoru).

I ozračene i neozračene ćelije mogu da se krioprezerviraju u tečnom azotu primenom standardnih metoda i da se čuvaju u toku dužih vremenskih perioda.

Primer 3: Metod oblaganja noseće matrice, u ovom slučaju Laserskina, sa keratinocitima iz kulture

KC- BI- 1 ( DSMACC2514)

Priprema biološki aktivnog zavoja za zaceljivanje rana prema pronalasku biće opisana na osnovu jednog primera. Zavoj za zaceljivanje rana koji je ovde opisan se sastoji od keratinocita KC-BI-1 prema pronalasku i Laserskina, bioreapsorbilne noseće matrice od estra hijaluronske kiseline.

Međutim, pronalazak nije ograničen samo na kombinaciju koja je ovde opisana. Umesto toga, za oblaganje mogu biti primenjeni bilo koji keratinociti koji imaju nova svojstva koja su navedena u zahtevima 1 do 8.

Takođe je moguće da se upotrebe i druge podesne noseće matrice, uz uslov da su one biokompatibilni noseći materijali koji se mogu koristiti za pripremanje farmaceutskih kompozicija. Na primer, mogu se primeniti hidrofobni biokompatibilni noseći materijali koji su opisani u WO 91/13638. Međutim, osim toga mogu se primeniti i noseći materijali sa prevashodno hidrofilnim svojstvima.

Sledeći podesan primer izvođenja pronalaska sadrži primenu keratinocita prema pronalasku zajedno sa reapsorbilnim polimerima koji obuhvataju poliestere, polikarbonate, polianhidride, poliortoestere, polidepsipeptide, polietarestere, poliamino kiseline ili polifosfazene, a posebno poli(L- laktid), poli(D, L - laktid), poli (L - laktid - ko - D, L - laktid), poli (glikolid), poli (L - laktid - ko - glikolid), poli (L - laktid - ko - trimetilen - karbonat) ili poli(dioksinon), kao i primenu perforiranih filmova koji se sastoje od pomenutih polimera.

1. Materijal

K/l medijum (upor. primer 1); PBS, 0,04% EDTA (razblažen do 0,02% sa PBS); tripsin/EDTA (0,0596/0,01%); sterilne Ruove posude (T 25 cm<2>, T 80 cm<2>, T 175 cm20, Laserskin (Messrs. Fidia Advanced Biopolimers srl, Abano Terme, Italija) u 144x21 Petrijevim šoljama (površina 145 cm<2>); 3T3 hraniteljske ćelije; keratinociti prema pronalasku kao što su, na primer, KC - BI -1.

2. Kultivisanje biološki aktivnih zavoja za rane

2. 1. Materijal

Ozračene hraniteljske ćelije, npr. mišiji 3T3 fibroblasti koji su navedeni u primeru 2; keratinociti prema pronalasku iz depozita; 8,5 cm x 8,5 cm komadi Laserskina u Petrijevoj šolji (gotov proizvod); K/2 medijum

2. 2. Zaseiavanje 3T3 hraniteljskih ćelija

Hraniteljske ćelije, pripremljene prema primeru 2, stavljene su na Laserskin sa gustinom zasejavanja od oko 15000 do 25000 ćelija/cm<2>(što približno odgovara 3x10<6>ćelija/Petrijevoj šolji). Petrijeva šolja je onda inkubirana na 35 do 37 °C na relativnoj vlažnosti > 90% i 5 -11 % CO2, a prvenstveno 7 - 9% , u inkubatoru na 37 °C. Keratinociti su zasejani na hraniteljskim ćelijama istog dana, ili najkasnije sledećeg dana (posle 24 sata) .

2. 3, Zaseiavanie i kultivisanje keratinocita

Biološki aktivni zavoji za zaceljivanje rana su pripremljeni sa keratinocitima prema pronalasku. Subkulti vi sanje keratinocita se može vršiti, na primer, kao što sledi: Subkonfluentne kulture su jednom isprane sa 0,02% EDTA (80 cm<2>Ruova šolja: 8 mL; 175 cm<2>Ruova šolja: 10 ml). Onda su hraniteljske ćelije inkubirane sa 0,02% EDTA u toku 5 -10 min na 37 °C (80 cm<2>Ruova šolja: 8 mL; 175 cm<2>Ruova šolja: 10 ml), pa su odvojeni pažljivim trešenjem.

Keratinociti su rastvoreni kao u primeru 1 u smeši tripsin/EDTA (0,05%/0,01%) (80 cm<2>Ruova šolja: 2 - 3 mL; 175 cm<2>Ruova šolja: 5 - 6 ml), onda su uneti u medijum za kultivisanje ćelija (80 cm<2>Ruova šolja: 7 - 8 mL; 175 cm<2>Ruova šolja: 14 -15 ml), pa su odvojeni pažljivim usisavanjem pipetom i ispuštanjem iz nje (pipetiranjem).

Keratinociti prema pronalasku su naneseni na Laserskin film snabdeven sa hraniteljskim ćelijama, sa gustinom zasejavanja od oko 15000 do 25000 ćelija/cm<2>(što približno odgovara 3x10<6>ćelija/Petrijevoj šolji). Onda su ćelije inkubirane sve do konfluencije od 30 -100%, a prvenstveno do konfluencije od 80 - 100%, na 35 - 39 °C, a prvenstveno na 37 °C. Relativna vlažnost je bila > 90%, a prvenstveno 95% i koncentracija CO2je bila 5 - 9%.

Primer 4: Metodkrioprezervacije biološki akivnogzavoja za zaceljivanje rana prema pronalasku

Pošto su keratinociti kolonizovani na noseću matricu sa konfluencijom od 30 -100% , a prvenstveno od 80 - 100%, proizvod prema pronalasku je mogao da se zamrzne u podesnim posudama, npr. PP kesama koje se zavaruju pod dejstvom toplote, pod kontrolisanim uslovima. Da bi se ovo izvelo, medijum za kultivisanje je pažljivo odstranjen i zamenjen je sa 20 ml K/2 medijuma za zamrzavanje na temperaturi od 2 - 6 °C. Proizvod je onda zapakovan pod sterilnim uslovima i zamrznut prema sledećoj proceduri: Posle brzog snižavanja temperature na - 5 do -10 °C, a prvenstveno na - 6 do - 8 °C u toku 2 - 5 min, proizvod je održavan na odgovarajućoj temperaturi u toku 15 - 30 min, a prvenstveno u toku 23 - 25

min. Onda je proizvod ohlađen na temperaturu, na primer, od - 60 do - 80 °C i to brzinom hlađenja od

< 1 °C/min, a prvenstveno od 0,2 do 0,6 °C/min, te najpoželjnije 0,4 °C/min. Proizvod je čuvan na - 60 do-80°C.

K/ 2 mediium za zamrzavanje:

K/l medijum za kultivisanje (upor. primer 1) je pomešan sa 7 -13% (tež./tež.) hidroksietil škroba.

Primer 5: Primerprimene noseće matrice kolonizovane sa keratinocitima prema pronalasku za

pokrivanje rana, sa primerom venoznih ulceracija na nozi

1. Transportovanie sveže pripremljenih zavoja za zaceljivanje rana

Pošto su keratinociti imali porast do konfluencije od 30 -100%, a prvenstveno od 80 -100% na Laserskinu, kultura je isprana jednom ili više puta sa podesnom količinom K/3 medijuma za transportovanje, a prvenstveno sa 30 ml. Biološki aktivni zavoj za zaceljivanje rana je transportovan u podesnoj količini K/3 medijuma za transportovanje, a prvenstveno u 20 ml. Slobodan prostor Petrijeve šolje je na kratko produvan sa smešom vazduha sa 5 -10% CO2, zatim je zatvoren sa lepljivom trakom, npr. Parafilmom, i odmah je isporučen klinici u kutiji za transportovanje.

K/ 3 mediium za transportovanje:

Medijum za gajenje K/l (upor. primer 1) bez fetusnog telećeg seruma( FCS).Međutim, takođe je moguća i primena jednostavnih fizioloških slanih rastvora, npr. baziranih na fosfat - boratu, npr. PBS, ili baziranih na HEPES-u (N - 2 - hidroksietilpiperazin - N' - 2 - etansulfonska kiselina) ili MES-u ([2 - N - morfolinojetansulfonska kiselina).

2. Transportovanje krioprezerviranih zavoja za zaceljivanje rana

Krioprezervirani zavoji za zaceljivanje rana klinikama se obično dopremaju na suvom ledu. Međutim, mogući su i drugi oblici transportovanja, uz uslov da se zavoji za zaceljivanje rana transportuju na temperaturi ispod - 60 °C.

Krioprezervirani zavoj za zaceljivanje rana je brzo otopljen. Onda je medijum za zamrzavanje odstranjen, pa je zavoj ispran jednom ili više puta sa K/3 medijumom za transportovanje (vidi gore) ili sa drugim podesnim fiziološkim rastvorom kao što je, na primer, Ringerov rastvor.

3. Terapeutska primena

Zavoj je onda stavljen na ranu. Kada se primenjuju neperforirani materijali, zavoj za zaceljivanje rana mora da se postavi korektno, odnosno tako da ćelije budu okrenute prema rani. Primena perforiranih nosača koji dozvoljavaju keratinocitima da kolonizuju obe strane nosača (npr. Laserskin) omogućava da zavoj za zaceljivanje rana prema pronalasku ne mora da bude postavljen na ranu koja se leći u bilo kom posebnom smeru. U zavisnosti od uspeha terapije, ovaj tretman se može ponoviti više puta.

Primer 6: Genetska karakterizacija ćelija keratinocita KC - BI- 1 ( DSMACC2514)

KC - BI -1 ćelije su subkultivisane kroz više prolaza korišćenjem metoda prema pronalasku koji je gore opisan. Ćelije iz prolaza 4,13 i 121 su onda podvrgnute genetskim analizama radi ispitivanja polimorfizma dužine DNKna 15 različitih lokusa (CSF1PO, D13S317, D16S539, D18S51, D21S11, D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179, FGA, Penta D, Penta E, TH01, TPOX i vWA). Analiza je izvršena primenom metoda koji je poznat iz stanja tehnike. U tu svrhu odgovarajući aleli su amplifikovani korišćenjem testa za određivanje paterniteta (PoewerPlex® 16 Svstem) koji proizvodi Messrs Promega (Manhajm, Nemačka), prema instrukcijama proizvođača. Aleli su mogli biti identifikovani određivanjem dužine fragmenata (standard dužine ILS 600 je deo napred navedenog kompleta). Podaci o frekvencijama alela u populaciji mogu se naći u odgovarajućim tabelama.

Analize su pokazale slaganje svih alela na svim lokusima za sve prolaze ćelija koji su analizirani. Ovako dobijeni podaci omogućavaju da KC - BI -1 ćelije budu genetski klasifikovane. Verovatnoća klasifikacije od > 99,999% je određena na osnovu frekvencija alela.

Literatura:

Beele H; Naevaert JM; Goetevn M; De Mil M; Kint A (1991): Repeated cultured epidermal allografts in the treatment of chronic leg ulcers of various origins. Dermatologica, 183 (1) 31 - 5.

De Luca M; Albanese E; Cancedda R; Viacava A; Faggioni A; Zambruno G; Giannetti A (1992): Treatment of leg ulcers with crvopreserved allogeneic cultured epithelium. A multicenter study. Archives of Dermatology, 128 (5) 633 - 8.

Harle - Bachor C; Boukamp P (1993) Telomerase activity in the regenerative basal layer of the epidermis in human skin and in immortal and carcinoma - derived skin keratinocvtes. PNAS 93; 6476 - 6481

Falanga V et al. (1998): Rapid Healing of venous ulcers and lack of clinical rejection with an allogeneic cultured human skin equivalent. Archives of Dermatology, 134, 293 - 300

Harris PA; Di Franncesco F; Barisoni D; Leigh IM; Navasaria (1999): Use of hyaluronic acid and cultured autologous keratinocytes and fibroblasts in extensive burns. Lancet, 353, 35 - 36

Kswai K, Ikarashi Y et al. (1993): Rejection of cultured keratinocvte allografts in persensitized mice.

Transplantation 56: 265 - 269

Lam PK; Chan ESY; Edward WH et al. (1999): Development and evaluation of a new composite Laserskin graft. J. of Trauma: Injurv, Infection and Critical Care, 47; 918 - 922

Lang E; Schafer BM; Eickhoff U; Hohl HP; Kramer, M D; Maier - Reif K (1996): Rapid Normalization of epidermal integrin expression after allografting of human keratinocvtes. Journal of Investigative Derrnatology, 107, 423 - 427

Leigh IM; Navsaria H; Purkis PE; McKay I (1991): Clinical practice and biological effects of keratinocvte grafting. Annals of the Academy of Medicine, 20 (4)

Lindgren C; Marcusson JA; Toftgard R (1998): Treatment of venous leg ulcers with cryopreserved cultured allogeneic keratinocytes: a prospective open controlled study. British Journal of Dermatology, 139 (2) 271 - 5.

Maier K (1993): Transplantation von in vitro Epidermis - Chancen and Risiken. Quintessenz 3:289 - 304

Phillips TJ; Gilchrest BA (1989): Cultured allogenic keratinocvte grafts in the management of wound healing: prognostic factors. Journal of Dermatologic Surgery and Oncology, 15 (11)

Reimvald, JG and Green (1975): Serial cultivation of strains of human epidermal keratinocvtes: the formation of keratinizing colonies from single cells. Cell 6, 331 - 344.

Schonfeld M; Moli I; Maier K; Jung EG (1993): Keratinozvten aus der Zellkultur zurTherapie von Hautdefekten. Hautarzt, 44: 281 - 289

Schopp VM; Mirancea N; Fusenig NE.(1999): Epidermal Organization and Differentiation of HaCaT Keratinocvtes in Organotypic Coculture with Human dermal Fibroblasts. J. Invest. Dermatologv 112.

343 - 353

Tanczos E; Horch RE; Bannasch H; Andree C; Walgenbach KJ; Voigt M; Stark GB (1999): Keratinozvtentransplantation and Tissue Engineering. Neue Ansatze in der Behandlung chronischer Wunden. Zentralbl Chir 124 Suppl 1, 81 - 86

Teepe RGC; Roseeuw Dl; Hermans J.; Koebrugge EJ; AltenaT; De Coninck A; Ponec M; Jan Vermeer B (1993): Randomized trial comparing cryopreserved cultured epidermal allografts with hydrocolloid dressings in healing chronic venous ulcers. Journal of the American Academy of Dermatology, 29/6 (982-988).

Wagner G; Horch R; Debus M; Tanczos E; Jiao XJ; Saied S; Stark G.B. (1997): Human keratinocytes cultured subconfluent on esterified hyaluronic acid membranes for resurface full thickness nude mice wounds. European Journal of Cell Biology, 74, No.47, pp. 61.

Claims (25)

1. Keratinociti, naznačeni time što nisu imortalizovani i što se mogu replikovati najmanje 150 puta pomoćuin vitrometoda za kultivisanje ćelija.

2. Keratinociti prema zahtevu 1, koji su izolovani iz epidermalnih delova prepucijuma.

3. Keratinociti prema zahtevu 1, naznačeni time što su ćelije iz kulture KC-BI-1 (DSM ACC 2514), ili keratinociti koji potiču od nje.

4. Keratinociti prema zahtevima 1 - 3, pri čemu pomenuti keratinociti a. ne mogu da se replikuju u odsustvu fetusnog telećeg seruma i/ili b. u odsustvu hraniteljskih ćelija i/ili c. u odsustvu epidermalnog faktora rasta (EGF).

5. Keratinociti prema zahtevima 1 - 4, pri čemu pomenuti keratinociti imaju malu telomeraznu aktivnost ili je uopšte nemaju, a prvenstveno u poređenju sa imortalizovanim keratinocitima, te prvenstveno u poređenju sa ćelijskom Unijom HaCaT.

6. Keratinociti prema zahtevima 1 - 5, naznačeni time, što se pomenuti keratinociti mogu replikovati najmanje 200 puta pomoćuin vitrometoda za kultivisanje ćelija.

7. Keratinociti prema zahtevima 1 - 6, naznačeni time što se pomenuti keratinociti mogu replikovati najmanje 250 puta pomoćuin vitrometoda za kultivisanje ćelija.

8. Keratinociti prema zahtevima 1 - 7, naznačeni time što se pomenuti keratinociti mogu replikovati najmanje 300 puta pomoćuin vitrometoda za kultivisanje ćelija.

9. Proizvod koji se sastoji od nosača koji je obložen sa keratinocitima prema jednom od zahteva 1 - 8, a. pri čemu je nosač delimično kolonizovan sa keratinocitima; ili b. pri čemu je nosač kompletno kolonizovan sa keratinocitima.

10. Proizvod prema zahtevu 9, naznačen time što je nosač biokompatibilni noseći materijal koji se može koristiti za pripremanje farmaceutske kompozicije.

11. Proizvod prema zahtevu 10, naznačen time što je noseći materijal hidrofobna ili hidrofilna biorazgradljiva membrana.

12. Proizvod prema zahtevima 10 ili 11, naznačen time što je nosač polimer od esterifikovane hijaluronske kiseline, a prvenstveno perforirani polimerni film definisane geometrije, a. pri čemu polimerni film ima debljinu od 10 do 500 p.m i perforiran je, sa otvorima veličine između 10 i 1000 pm, pri čemu ti otvori imaju definisanu, konstantnu veličinu i formiraju pravilan niz, u kome se nalaze na međusobno jednakim rastojanjima od 50 do 1000 um.

13. Proizvod prema zahtevima 10 ili 11, naznačen time što su noseći materijal poliester, polikarbonati, polianhidridi, poliortoestri, polidepsipeptidi, polietaresteri, poliamino kiseline ili polifosfazeni, a. a naročito poli (L- laktid), poli(D, L- laktid), poli (L-laktid - ko - D, L- laktid), poli (glikolid), poli(L- laktid - ko - glikolid), poli(L- laktid - ko - trimetilen - karbonat) ili poli(dioksanon), b. pri čemu su pomenuti polimeri perforirani ili c. nisu perforirani.

14. Postupak za krioprezervaciju keratinocita prema zahtevima 1 - 8 ili proizvoda prema zahtevima 9 - 13, pri čemu se keratinociti ili proizvod krioprezerviraju na temperaturi od - 20 °C do -196 °C, a prvenstveno na - 60 do - 80 C.

15. Keratinociti prema zahtevima 1 - 8 ili proizvod koji sadrži keratinocite i nosač prema zahtevima 9 - 13 koji su tretirani postupkom prema zahtevu 14.

16. Keratinociti prema zahtevima 1 - 8 i 15 ili proizvod prema zahtevima 10 -13 i 15 za medicinsku primenu.

17. Primena keratinocita prema zahtevima 1 - 8 i 15 ili proizvoda prema zahtevima 10 -13 i 15 za lečenje rana.

18. Primena prema zahtevu 17, pri čemu su rane prvenstveno opekotine ili ulceracije.

19. Primena prema zahtevu 17, pri čemu su rane prvenstveno opekotine drugog stepena.

20. Primena prema zahtevu 17, pri čemu su rane prvenstvno hronične ulceracije potkolenice koje se teško zaceljuju, tipaUlcus cruris,a prvenstvenoUlcus cruris venosum.

21. Primena prema zahtevu 17, pri čemu su rane prvenstveno ulceracije koje su uzrokovane dijabetesom.

22. Primena prema zahtevu 17, pri čemu su rane prvenstveno dekubitusne ulceracije.

23. Primena prema zahtevima 16-22 kao dopuna ili za istovremenu primenu sa jednom ili više supstanci koje imaju efikasno dejstvo na zaceljivanje rana.

24. Primena prema zahtevu 23, pri čemu je druga supstanca hidrokoloidni zavoj.

25. Primena prema zahtevu 23, pri čemu je druga supstanca antimikrobna supstanca kao što je (a) npr. antibiotik. IV/2004