RS49927B

RS49927B - Preparati ob fuzionog proteina i postupci

Info

Publication number: RS49927B
Application number: YUP-279/99A
Authority: RS
Inventors: Michael Benjamin Mann; Randy Ira Hecht
Original assignee: Amgen Inc.,
Priority date: 1996-12-20
Filing date: 1997-12-11
Publication date: 2008-09-29
Also published as: AR009436A1; JP2001512417A; YU27999A; ATE351910T1; CN1246154A; DE69737266T2; HU227088B1; PL334242A1; BR9713755A; SK287578B6; AU5606098A; DE69737266D1; EA200100216A1; EA199900575A1; KR20000069617A; EP0954588B1; PT954588E; NO992779D0; EP0954588A1; HUP0000302A3

Abstract

Protein formule odabrane iz grupe koju čine: R1 - R2 i R1 - L - R2, gde je R1, Fc protein, R2 je OB protein, a L je linker, pri čemu je Fc protein odabran iz grupe koju čine: (a) amino kiseli ne 1-233 SEQ ID No:9 i 12 i amino kiseline 1-228 SEO ID No. 15 i 18 (b) amino kiseli ne 1-233 SEQ. ID. br. 9 sa različitim amino kiselinama supstituisanim ili izostavljenim u jednom ili više od sledećih položaja: (i) jedan ili više ostataka cisteina zamenjeno ostatkom alanina ili serina; (ii) jedan ili više ostataka tirosina zamenjeno ostatkom fenilalanina; (iii) amino kiselina na položaju 5 zamenjena alaninom; (iv) amino kiselina na položaju 20 zamenjena glutamatom; (v) amino kiselina na položaju 103 zamenjena alaninom; (vi) amino kiselina na položaju 105 zamenjena alaninom; (vii) amino kiselina na položaju 107 zamenjena alaninom; (viii) amino kiseline na položajima 1, 2, 3, 4, ili 5 izostavljene ili supstituisane; i (ix) kombinacija poddelova i-viii; (c) sekvenca amino kiseline poddelova (a) ili (b) sa metionil ostatkom na N-kraju; (d) Fc protein, kog od delova (a) do (c) koji se sastoji od hemijske grupe vezane za proteinski deo, pri čemu je hemijska grupa, polietilen glikol i (e) derivat poddela (d) gde je polietilen glikol vezan isključivo na N-kraju datog proteinskog dela.Prijava sadrži 5 nzavisnih i 6 zavisnih zahteva. Prijava sadrži još 5 nezavisnih i 6 zavisnih zahteva.

Description

Oblast tehnike

Pronalazak spada u oblast preparativne hernije.

Tehnički problem

Predmetni pronalazak se odnosi na preparate Fc-OB fuzionog proteina i postupke za njihovo dobijanje i primenu.

Stanje tehnike

Mada je molekularna osnova za gojaznost široko nepoznata, identifikacija "OB gena" i kodiranog proteina ("OB protein" ili "leptin") donekle je razjasnila mehanizme koje telo koristi za regulisanje masnih naslaga. Videt PCT publikaciju, VVO 96/05309 (12/22/96), Friedman et al.; Zhang et al., Nature 372: 425-432 (1994), videti takođe, the Correction at Nature 374: 479

(1995). OB protein je aktivanin vivokod ob/ob mutanata miševa (miševi koji su gojazni zbog defekta u proizvodnji proizvoda OB gena) kao i kod normalnih divljih miševa. Biološka aktivnost se sama manifestuje, između ostalog, u gubitku težine. Videti generalno, Barrinaga, "Obese" Protein Siims Mice, Science 269: 475-456 (1995). OB protein, njegovi derivati i primena kao modulatora za kontrolu težine i gojaznosti kod životinja, uključujući sisare i ijude, detaljnije je opisano u PCT publikaciji WO 96/05309 (12/22/96), koja je ovde data kao referenca, uključujući slike.

Drugi biološki efekti OB proteina nisu dobro okarakterisani. Poznato je, na primer, da administriranje OB proteina u ob/ob mutante miševe rezultira u smanjenju nivoa seruma insulina, i nivoa seruma glukoze. Takođe je poznato da administriranje OB proteina rezultira u smanjenju masnih naslaga. Ovo je primećeno i kod ob/ob mutanata miševa, isto kao kod ne-gojaznih normalnih miševa. Pellevmounter et al., Science 269: 540-543 (1995); Halaas et al., Science 269: 543-546 (1995). Videti takođe Campfield et al., Science 269: 546-549 (1995)

(Peripheral and central administration of microgram doses of OB protein reduced intake and body vveight of ob/ob and diet-induced obese mice but not in db/db obese mice.) Ni u jednom

od ovih izveštaja nije primećena toksičnost, čak pri najvećim dozama.

Uprkos obećavajućim rezultatima kliničke primene OB proteina, način dejstva OB proteinain vivonije razjašnjen do kraja. Informacija o OB receptom, pokazuje visok afinitet vezivanja OB proteina detektovan kod hipotalamusa pacova, koji označava lokaciju OB receptora. Stephens et al., Nature 377: 530-532. Db/db miš pokazuje identični fenotip kao ob/ob miš, t.j., ekstremna gojaznost i tip II dijabetesa; smatra se da je ovaj fenotip zbog defektivnog OB receptora, posebno što db/db miševima nedostaje odgovor na administriranje OB proteina. Videti Stephens et al., supra.

Sa prednostima rekombinantnih DNK tehnologija, raspoloživost rekombinantnih proteina za terapeutsku primenu je dovela do prednosti u formulaciji proteina i hemijskoj modifikaciji. Jedan cilj takve modifikacije je zaštita proteina i smanjene degradacija. Fuzija proteina i hemijsko vezivanje može efikasno da blokira proteolitički enzim iz fizičkog kontakta sa samom kičmom proteina, i tako da spreči degradaciju. Dodatne prednosti uključuju, pod nekim okolnostima, povećanje stabilnosti, vremena cirkulacije, i biološke aktivnosti terapeutskog proteina. Tekst koji opisuje modifikaciju proteina i proteine fuzije je Francis, Focus on Grovvth 3:4-10 (maj 1992) (publikovan od Mediscript, Mountvievv Court, Friern Barnet Lane, London N20, OLD, UK).

Jedna takva modifikacija je primena Fc dela imunoglobulina. Antitela sadrže dva funkcionalno nezavisna dela, promenljivi (varijabilni) domen poznat kao "Fab", koji vezuje antigen, i konstantni domen, poznat kao "Fc" koji obezbeđuje link (vezu) za funkcije efektora kao što su komplementne ili fagocitne ćelije. Fc deo imunoglobulina ima dug polu-život u plazmi, dok je Fab skraćenog života. Capon, et al.,Nature 337: 525-531 (1989).

Proizvodi terapeutskog proteina su građeni pomoću Fcdomena radi obezbedenja dužeg polu-života ili uključivanja funkcija kao što je Fc vezivanje receptora, vezivanje proteina A, komplementnog fiksiranja i plancentalnog transfera koji su svojstveni Fc proteinima imunoglobulina. Na primer, Fc deo lgG1 antitela koji je spojen za N-terminalni kraj CD30-L, molekul koji vezuje CD30 receptore koji eksprimiraju ćelije tumora Hodgkin-ovog oboljenja, anaplastične limfoma ćelije, ćelije leukemije T-ćelija i druge tipove malignih ćelija. Videti US patent br. 5,480,981. IL-10, antiinflamatorni agens i agens protiv odbacivanja su spojeni sa mišijim Fcy2a radi povećanja kratkog poluživota cirkulacije citokina. Zheng, X.et al.,The Journal of Immunologv, 154: 5590-5600 (1995). Ispitivanjem je procenjena ptrimena receptora faktora nekroze tumora vezanog sa Fc proteinom čoveka lgG1 za tretiranje (lečenje) pacijenata sa septičkim šokom. Fisher, C.etal.,N. Engl. J. Med., 341: 1697-1702

(1996); Van Zee, K. etal., The Journal of Immunologv, 156: 2221-2230 (1996). Fc je takođe spojen sa CD4 receptorom radi dobijanja terapeutskog proteina za lečenje AIDS-a. Videti, Capon et al., Nature, 337: 525-531 (1989). Dalje, N-kraj interleukina 2 takođe je spojen sa Fc delom lgG1 ili lgG3 radi prevazilaženja kratkog polu-života interleukina 2 i njegove sistemske toksičnosti. Videti Harvill et al., Immunotechnologv, 1: 95-105 (1995).

Zbog identifikacije OB proteina kao potencijalnog terapeutskog agensa, postoji potreba da se razviju AB analogni preparati za kliničku primenu u kombinaciji sa ili na mesto adminsitracije AB proteina. Takav razvoj mogao bi da uključi preparate OB analoga, gde formulacije proteina i hemijske modifikacije postižu smanjenu degradaciju proteina, povećanu stabilnost i vreme cirkulacije. Predmetni pronalazak obezbeđuje takve preparate.

Opis rešenja tehničkog problema

Predmetni pronalazak se odnosi na preparate Fc-OB fuzionog proteina, postupke dobijanja ovih preparata i njihove primene. Posebno, predmetni pronalazak se odnosi na genetski fuzioni protein koji sadrži Fc deo ili analoge imunoglobulina spojene sa delomo N-kraja OB proteina ili analoga. Fc-OB fuzioni protein je sposoban za dimerizaciju preko cisteinskih ostataka Fcdela. Neočekivano, modifikacija genetske fuzije sa Fc na N-kraju OB proteina pokazuje prednosti u stabilnosti, brzini klirensa i smanjenoj degradaciji koji nisu viđeni kod OB proteina ili sa fuzijom Fc za C-kraj OB proteina. Iznenađujuće i u isto vreme važno, modifikacija N-kraja obezbeđuje neočekivanu zaštitu proteina od degradacije, povećava vreme cirkulacije i stabilnost, u poređenju sa OB proteinom ili Fc modifikacijom na C-kraju OB proteina. Takve neočekivane prednosti od Fc modifikacije na OB proteinu mogle bi da budu podesne kod potrošača OB proteina, u tome što ove promene doprinose manjim zahtevanim dozama ili manje frekventnom doziranju. Tako, kao što je detaljnije opisano u daljem tekstu, predmetni pronalazak ima više aspekata koji se odnose na genetsku modifikaciju proteina preko fuzije Fc dela za OB protein (ili njegove analoge), kao i na specifične modifikacije, dobijanja i postupke njegove primene.

Shodno tome, u jednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje Fc-OB fuzioni protein gde je Fc genetski spojen za N-kraj OB proteina (ili njegovih analoga). Dalje, Fc deo se takođe može vezati za N-kraj OB proteina (ili njegovih analoga) preko peptida ili hemijskih linkera kako je poznato u tehnici. Kako je prethodno dato i opisano sa više detalja u daljem tekstu, Fc-OB fuzioni protein ima neočekivane zaštite od degradacije i povećano vreme cirkulacije kao i povećanu u poređenju sa OB proteinom ili C-krajem OB-Fc fuzionih proteina. Dodatni aspekti predmetnog pronalaska, zato, uključuju ne samo preparate Fc-OB fuzionog proteina, već i DNK sekvence koje kodiraju ove proteine, pripadajuće vektore i ćelije domaćina koje sadrže ove vektore, oba korisna za dobijanje fuzionih proteina predmetnog pronalaska.

U drugom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje postupke za dobijanje Fc-OB fuzionog proteina. Takvi postupci obuhvataju rekombinantne DNK tehnike za dobijanje rekombinantnih proteina. Dalje, takvi aspekti uključuju i postupke fermentacije i prečišćavanja.

U drugom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje postupke za tretiranje viška težine kod pojedinca ili životinja, uključujući modulaciju i/ili taloženje masnoće administriranjem Fc-OB fuzionih proteina. Zbog karakteristika Fc-OB fuzionih proteina, razmatrani su postupci koji redukuju količinu i/ili frekvenciju doziranja OB proteina primenom Fc-OB agensa za redukciju težine.

U narednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje terapije za lečenje komplikacija gojaznosti (komorbiditet) kao što je dijabetes, dis- ili hiperlipidemije, artetijska skleroza, arterijski plak, redukcija ili prevencija formiranja kamena u žuči, prejedanje i takođe povećanje osetljivosti insulina i/ili povećanje mase nemasnog tkiva.

U drugom aspektu, predmetni pronalazak takođe obezbeđuje odgovarajuće farmaceutske preparate Fc-OB proteina, njihovih analoga ili derivata, za primenu u gore navedenim terapijama.

Posebno, predmetni pronalazak opisuje i protein formule odabrane iz grupe koju čine: Fm-R2 i L-R2, gde je R1, Fc protein, R2je OB protein i L je linker i gde je Fc protein odabran iz grupe koju čine.

(a) Amino kiseline 1-233 SEQ ID Nos. 9 i 12 i amino kiseline 1-228 SEQ ID Nos. 15 i 18; (b) Amino kiseline 1-233 SEQ ID Nos. 9 sa različitih amino kiselina supstituisanih ili izostavljenih u jednom od sledećih položaja: (i) jedan ili više cisteinskih ostataka zamenjenih ostatkom alanina ili serina; (ii) jedan ili više tirozinskih ostataka zamenjenih ostatkom fenilalanina; (iii) amino kiselina na položaju 5 zamenjena alaninom; (iv) amino kiselina na položaju 20 zamenjena glutamatom; (v) amino kiselina na položaju 103 zamenjena alaninom; (vi) amino kiselina na položaju 105 zamenjena alaninom; (vii) amino kiselina na položaju 107 zamenjena alaninom;

(viii) amino kiseline na položajima 1, 2, 3, 4 i/ili 5 izostavljene ili supstituisane; i

(ix) kombinacija poddelova i-viii; (c) aminokiselinska sekvena dodelova (a) ili (b) sa ostatkom metionila na N-kraju; (d) Fc protein jednog od poddelova (a) do (c) koji obuhvataju hemijske grupe vezane za

proteinski deo i gde je hemijska grupa, polietilen glikol i

(e) Derivat poddela (d) gde je polietiken glikol vezan isključivo za N-kraj date proteinske

grupe;

Kao i sekvenca nukelinskih kiselina koja kodira protein sa formulom odabranom iz grupe koju čine: R1-R2 i R1-L-R2, gde je R1, Fc protein, R2je OB protein i L je linker i gde je Fc protein odabran iz gupe koju čine: (a) amino kiseline 1-233 SEQ ID Nos. 9 i 12 i amino kiseline 1-228 SEQ ID No. 15 i 18; (b) amino kiseline 1-233 SEQ ID No. 9 sa različitom amino kiselinom supstituisanom ili izostavljenom na jednom ili više sledećih položaja: (i) jedan ili više cisteniskih ostataka zamenjen ostatkom alanina ili serina; (ii) jedan ili više tirozinskih ostataka zamenjen fenilalaninskim ostatkom; (iii) amino kiselina na položaju 5 zamenjena alaninom; (iv) amino kiselina na položaju 20 zamenjena glutamatom; (v) amino kiselina na položaju 103 zamenjena alaninom; (vi) amino kiselina na položaju 105 zamenjena alaninom;

(vii) amino kiselina na položaju 107 zamenjena alaninom

(viii) amino kiseline na položajima 1, 2, 3, 4 i/ili 5 izostavljene ili supstitusiane; i (ix) . kombinacija pšoddelova i-viii; i

(c) aminokiselinska sekvenca poddelova (a) i (b) sa ostatkom metionila na N-kraju,

i srodni vektori, ćelije domaćini, postupci za dobijanje proteina predmetnog pronalaska i farmaceutski preparati.

Kratak opis crteža

Slika 1: Rekombinantni metOB miša(dvostruka) DNK (SEQ. ID. Br.: 1 i 2) i sekvenca amino kiselina (SEQ. ID. Br. 3).

Slika 2: Rekombinantni humani metOB analog (dvostruka) DNK (SEQ. ID. Br.: 4 i 5) i sekvenca amino kiselina (SEQ. ID. Br. 6).

Slika 3 (A-C): Rekombinantni humani metFc-OB (dvostruka) DNK (SEQ. ID. Br.: 7 i8) i sekvenca amino kiselina (SEQ. ID. Br. 9).

Slika 4 (A-C) Varijanta rekombinantnog humanog metFc-OB (dvostruka) DNK (SEQ. ID. Br.: 10 i 11) i sekvenca amino kiselina (SEQ. ID. Br. 12).

Slika 5 (A-C) Varijanta rekombinantnog humanog metFc-OB (dvostruka) DNK (SEQ. ID. Br.:

13 i 14) i sekvenca amino kiselina (SEQ. ID. Br. 15).

Slika 6 (A-C) Varijanta rekombinantnog humanog metFc-OB (dvostruka) DNK (SEQ. ID. Br.:

16 i 17) i sekvenca amino kiselina (SEQ. ID. Br. 18).

Detaljan opis

Predmetni pronalazak se odnosi na preparate Fc-OB fuzionog proteina, postupke za dobijanje ovih preparata i njihove primene. Posebno, predmetni pronalazak se odnosi na genetsku ili hemijsku fuziju Fc dela imunoglobulina za N-kraj OB proteina. Neočekivano, fuzija Fc za N-kraj OB proteina pokazuje prednosti koje nisu viđene u OB proteinu ili sa fuzijom Fc na C-kraju OB proteina. Iznenađujuće, N-kranje modifikovan Fc-OB protein obezbeđuje neočekivanu zaštitu proteina ođ degradacije, povećano vreme cirkulacije i povećanu stabilnost. Shodno tome, Fc-OB fuzioni protein, i njegovi analozi i derivati, isto kao, odgovarajući postupci primene i dobijanja, opisani su detaljnije opisanu u daljem tekstu.

Preparati

Fc sekvenca rekombinantnog humanog Fc-OB sekvence data u SEQ. ID. Br. 9 (Videti sliku 3) može se odabrati iz humanog imunoglobulin lgG1 teškog lanca, videti Ellison, J.W. et al., Nucleic Acids Res. 10: 4071-4079 (1982), ili bilo koje druge Fc sekvence poznate u tehnici (t.j. druge IgG klase uključujući ali ne ograničavajući se na lgG-2, lgG-3 i lgG-4, ili druge imunoglobuline). Varijante, analozi ili derivati Fc dela mogu se dobiti sa, na primer, pravljenjem različitih supstitucija ostataka ili sekvenci.

Ostaci cisteina se mogu izostaviti ili zameniti drugim amino kiselinama radi sprečavanja formiranja unakrsnih disulfidnih veza Fc sekvenci. Posebno amino kiselina na položaju 5 u SEQ. ID. Br. 9 je ostatak cisteina. Rekombinantni Fc-OB sekvenca od SEQ. ID. Br. 9 je Fc-Ob protein 378 amino kiseline (ne broji se ostatak metionina). Prva sekvenca amino kiseline za rekombinantni Fc-OB protein sa slike 3 je označena kao +1 sa metioninom na -1 položaju.

Ostatak cisteina na položaju 5 može se ukloniti ili supstituisati jednom ili više amino kiselina. Ostatak alanina može se supstituisati cisteinskim ostatkom na položaju 6 dajući varijantu sekvence amino kiseline sa slike 4 (SEQ. ID. Br. 12). Rekombinantni Fc-OB protein sa slike 4 je Fc-OB protein 378 amino kiseline (ne broji se metioninski ostatak). Prva sekvenca amino kiseline za rekombinantni Fc-OB protein sa slike 4 je označena kao +1 sa metioninom na -1 položaju.

Slično, cistein na položaju 5 u SEQ. ID. Br. 9 može se supstituiati serinom ili drugim ostakom amino kiseline ili da se izostavi. Varijanta ili analog se takođe može dobiti delecijom amino kiselina na položajima 1, 2, 3, 4 i 5 sa varijantom u SEQ. ID. Br. 15 (videti sliku 5). Takođe se mogu izvesti supstitucije na ovim položajima i one su u obuhvaćene predmetnim pronalaskom. Rekombinantni Fc-OB protein sa slike 5 je Fc-OB protein od 373 amino kiseline (ne broji se ostatak metionina). Prva sekvenca amino kiselina za rekombinantni Fc-OB protein sa slike 5 označena je kao +1 sa metioninom na -1 položaju.

Mogu se takođe izesti modifikacije uvođenjem četiri supstitucije amino kiselina da se odstrani mesto vezivanja Fc receptora i komplementno mesto vezivanja (C1q). Ove modifikacije varijante SEQ. ID. Br. 15 mogi da uključe leucin na položaju 15 supstituisan glutamatom, glutamat na položaju 98 supstituisan alaninom, i lizine na položajima 100 i 102 supstituisane alaninima (videti slike 6 i SEQ. ID. Br. 18). Rekombinantni Fc-OB protein sa slike 6 je Fc-OB protein od 373 amino kiseline (ne broji se ostatak metionina). Prva sekvenca amino kiseline za rekombinantni Fc-OB protein sa slike 6 označena kao +1 sa metioninom na -1 položaju.

Slično, jedan ili više ostataka tirosina takođe se može zameniti ostacima fenialanina. Dalje, takođe su razmatrane druge varijante umetanja amino kiseline, delecije i/ili supstitucije i obuhvaćene su predmetnim pronalaskom. Dalje, alteracije mogu da budu u obliku promenjenih amino kiselina, kao recimo peptidomimetičke ili D-amino kiseline. Fc protein se može vezati i na OB proteine Fc-OB proteina delovima "linkera" gde su hemijske ili amino kiseline promenljivih dužina. Takvi hemijski linkeri su dobro poznati u tehnici. Sekvence amino kiseline linksera mogu da sadrže ali nisu ograničene na:

(j) bilo koja kombinacija poddelova (a) do (i).

OB deo Fc-OB fuzionog proteina može se odabrati od mišjeg rekombinanta pokazanog u SEQ. ID. Br. 3 (videti sliku 1), ili rekombinantnog humanog proteina pokazanog u Zhang et al., Nature, supra, (ovde dat kao referenca) ili od onih kojima nedostaje ostatak glutaminila na položaju 28. (Videti Zhang et al., Nature, supra, na strani 428.) Može se takođe koristiti analog rekombinantnog humanog OB proteina pokazanog u SEQ. ID. Br. 6 (videti sliku 2), koji sadrži: (1) arginin na mestu lizina na položaju 35; i (2) leucin na mestu izoleucina na položaju 74. (Skraćenica za ovaj analog je rekombinantni humani R->L<35>, l->L<74>). Sekvence amino kiselina za rekorabinantne humane i rekombinantne proteine miša ili analoge sa ili bez spojenog Fc dela na N-kraju OB proteina pokazani su u daljem tekstu sa ostatkom metionila na položaju-1; ali kao sa bilo kojim od ovih OB proteina i analoga, ostatak metionila ne mora da bude prisutan.

Protein miša je u suštini homolog humanom proteinu, naročito zrelom proteinu, i, dalje, posebno na N-kraju. Može se dobiti analog rekombinantnog humanog proteina menjanjem (npr. Supstitucijom ostataka amino kiseline), u rekombinantnoj sekvenci čoveka, amino kiselina koje se razlikuju od sekvence miša. Zato što rekombinantni humani protein ima biološku aktivnost kod miševa takav analog mogao bi verovatno da bude aktivan kod ljudi. Na primer, korišćenje humanog proteina koji ima lizin na ostatku 35 i izoleucin na ostatku 74 prema oznakama u SEQ. ID. Br. 6, gde je prva amino kiselina valin, i amino kiselina na položaju 146 je cistein, može se supstituisati sa drugom amino kiselinom jedna ili više amino kiselina na položajima 32, 35, 50, 64, 68, 71, 74, 77, 89, 97, 100, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138, 142, i 145. Može se odabrati amino kiselina na odgovarajućem položaju proteina miša (SEQ. ID. Br. 3), ili druga amino kiselina.

Mogu se dalje dobiti "konsenzus" molekuli bazirani na sekvenci OB proteina pacova. Murakamiet al.,Biochem. Biophvs. Res. Comm. 209: 944-952 (1995) ovde dat kao referenca.

OB protein pacova razlikuje se od humanog OB proteina u sledećim položajima (prems oznakama u SEQ. ID. Br. 6): 4, 32, 33, 35. 50. 68, 71. 74. 77, 78, 89. 97. 100, 101, 102, 105. 106. 107.108, 111, 118. 136. 138 i 145. Jedna ili više amino kiselina se može supstituisati drugom amino kiselinom, na ovim različitim položajima. Položaji u polu crnoj štampi su oni gdese OB protein miša isto kao OB protein pacova razlikuje od humanog proteina i tako, su posebno podesni za alteracije. Na jednom ili više položaja, može se supstituisati amino kiselina odgovarajućeg OB proteina pacova, ili druga amino kiselina.

Položaji OB proteina miša i pacova koji se razlikuju od zrelog OB proteina su: 4, 32, 33, 35, 50, 64, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138, 142, i 145. OB protein prema SEQ. ID. Br. 6 koji ima jednu ili više navedenih amino kiselina zamenjenih drugom amino kiselinom, npr. amino kiselina nađena u odgovarajućem nizu pacova ili miša, može takođe da bude efikasan.

Dalje, amino kiseline nađene u OB proteinu Macaca (Rhesus) majmuna koje se razlikuju od OB proteina odraslog čoveka (sa identitetima datim u zagradama jednoslovnim oznakama amino kiseline): 8 (S), 35 (R), 48 (V), 53 (Q), 60 (I), 67 (N), 68 (L), 89 (L), 100 (L), 108 (E), 112 (D), i 118 (L). Budući da je rekombinantni humani OB protein aktivan kod cvnomolgus majmuna, može da bude efikasan humani OB protein prema SEQ. ID. Br. 6 (sa lizinom na položaju 35 i izoleucinom na položaju 74) koji ima jednu ili više različitih amino kiselina majmuna, zamenjenu drugom amino kiselinom, kao što su amino kiseline date u zagradama. Treba naglasiti da su neke različite amino kiseline majmuna takođe one nađene u gore neavedenim vrstama miša (položaji 35, 68, 89, 100 i 112). Tako, može se dobiti mišji/majmunski/humani konsenzus molekul sa (korišćenje brojanja od SEQ. ID. br. 6 koji ima lizin na položaju 35 i izoleucin na položaju 74) jednom ili više amino kiselina na položajima zamenjenim sa amino kiselinom: 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111,

112, 118, 136, 138, 142, i 145.

Drugi analozi mogu se dobiti eliminisanjem dela proteina iz aminokiselinske sekvence. Na primer, zrelom proteinu može da nedostaje vodeća sekvenca (-22 do -1). Mogu se dobiti sledeći skraćeni oblici molekula humanih OB proteina (prema oznakama u SEQ. ID. Br. 6):

(a) amino kiseline 98-146

(b) amino kiseline 1-32

(c) amino kiseline 40-126

(d) amino kiseline i (vezano na) 112-146.

(e) amino kiseline 1-99 i (vezano na) 112-146 koji ima jednu ili više amino kiselina 100-111 postavljenu između amino kiselina 99 i 112.

Dalje, skraćeni oblici mogu takođe da imaju alterovanu jednu ili više amino kiselina koje su različite (kod OB proteina pacova, miša, ili majmuna) od humanog OB proteina. Dalje, bilo koje promene mogu da budu u obliku promenjenih amino kiselina, npr. peptidomimetinske ili D-amino kiseline.

Zato, predmetni pronalazak obuhvata Fc-OB protein gde je OB protein odabran od: (a) aminokiselinske sekvence 1-146 kako je pokazano u SEQ. ID. Br. 3 (niže) ili

SEG..ID. Br. 6; (b) aminokiselinske sekvence 1-146 kako je pokazano u SEQ. ID. Br. 6 koji ima ostatak lizina na položaju 35 i ostatka izoleucina na položaju 74; (c) aminokiselinske sekvence poddela (b) koji ima različitu amino kiselinu supstituisanu u jednom ili više ođ sledećih položaja (prema oznakama u SEQ. ID. Br. 6 i preostaje isto brojanje čak i bez glutaminil ostatka na položaju 28): 4, 32, 33, 35, 50, 64, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138, 142, i 145; (d) aminokiselinske sekvence poddelova (a), (b) ili (c) kome opcionalno nedostaje glutaminil ostatak na položaju 28; (e) aminokiselinske sekvence poddelova (a), (b), (c), ili (d) koji ima metionil ostatak na N-kraju; (f) skraćenog analoga OB proteina odabranog između: (prema oznakam u SEQ. ID. Br. 6):

(i) amino kiselina 98-146

(ii) amino kiselina 1-32

(iii) amino kiselina 40-116

(iv) amino kiselina 1-99 i 112-146

(v) amino kiselina 1-99 i 112-146 koje imaju jednu ili više amino kiselina 100-111 postavljenu između amino kiselina 99 i 112; i (vi) skraćenog OB analoga poddela (i) koji ima jednu ili više amino kiselina 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138, 142, i 145 supstituisanu drugom amino kiselinom; (vii) skraćenog analoga poddela (ii) koji ima jednu ili više amino kiselina 4, 8 i 32 supstituisanu drugom amino kiselinom; (viii) skraćenog analoga poddela (iii) koji ima jednu ili više amino kiselina 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111 i 112 zamenjenu sa drugom amino kiselinom; (ix) skraćenog analoga poddela (iv) koji ima jednu ili više amino kiselina 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 112, 118, 136, 138, 142, i 145 zamenjenu drugom amino kiselinom; i (x) skraćenog analoga poddela (v) koji ima jednu ili više amino kiselina, 4, 32, 33, 35, 50, 64, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138, 142, i 145 zamenjenu drugom amino kiselinom; (xi) skraćenog analoga bilo kog od delova (i)-(x) koji ima N-terminalni metionil ostatak; i (g) OB proteina ili analoga derivata bilo kog od poddelova (a) do (f) koji se sastoji od hemijske grupe spojene za proteinski deo; (h) derivata poddela (g) gde je hemijska grupa, polimera rastvorljiv u vodi; (i) derivata poddela (h) gde je pomenuta grupa polimera rastvorljivog u vodi, polietilen glikol; (j) derivata poddela (h) gde je data grupa polimera rastvorljivog vodi, poliamino kiselinska grupa; (k) derivata poddela (h) do (j) gde je data grupa vevana na jedinom N-kraju proteinske grupe; i (I) OB proteina, analoga ili derivata bilo kog od poddelova (a) do (k) u farmaceutski prihvatljivom nosaču.

Derivati

Ovi Fc-OB fuzioni proteini (ovde termin "protein" je korišćen da obuhvati "peptid", Fc,

OB ili analoge, npr. oni navedeni infra, ako nije drugačije naznačeno) su derivatizovani sa vezivanjem jedne ili više hemijskih grupa za deo Fc-OB fuzionog proteina. Ovi hemijski modifikovani derivati mogu se dalje formulisati za intraarterijsku, intraperitonealnu, intramuskularnu subkutalnu, intravensku, oralnu, nazalnu, pulmonarnu, topikalnu administraciju ili drugim načinom administracije kako je diskutovano u daljem tekstu. Nađena je hemijska modifikacija biološki aktivnih proteina koja obezbeđuje dodatne prednosti pod izvesnim okolnostima, kao što je povećanje stabilnosti i vremena cirkulacije terapeutskog proteina i smanjenje imunogenosti. Videti, US patent br. 4,179,337, Daviš et al., izdanje decembar 18, 1979. Za pregled, videti Abuchowskiet al.,u Enzvms as Drugs. (J. S. Holcerberg i J. Roberts, eds. str. 367-383 (1981)); Franciset al.,supra.

Hemijske grupe pogodne za takvu derivatizaciju mogu se odabrati od različitih polimera rastvornih u vodi. Odabrani polimer treba da bude rastvoran u vodi tako da protein na koji je on vezan se ne taloži u vodenoj sredini, kao što je fiziološka sredina. Poželjno, za terapeutsku dobijenog krajnjeg proizvoda, polimer će biti farmaceutski prihvatljiv. Prosečan stručnjak će moći da odabere željeni polimer baziran na razmatranjima da li će konjugat polimer/protein biti korišćen terapeutski, i ako je tako, željeno doziranje, vreme cirkulacije, otpornost na proteolizu, i druga razmatranja. Za ove proteine i peptide, efikasnost derivatizacije može da se postigne sa administriranjem derivata, u željenom obliku (t.j., sa osmotskom pumpom, ili, poželjnije, sa injekcijom ili infuzijom, ili, dalje formulisanim za oralnu, pulmonarnu ili nazalnu distribuciju, na primer), i zapažanjem bioloških efekata kako je ovde opisano.

Polimer rastvorljiv u vodi može se odabrati iz grupe koja sadrži, na primer, polietilen glikol, kopolimere etilen glikol/propilen glikola, karboksimetilcelulozu, dekstran, polivinil alkohol, polivinil pirolidon, poli-1, 3-dioksolan, po!i-1,3,6-trioksan, etilen/maleinski anhidrid kopolimer, poliamino kiseline (ili homopolimeri ili slučajni kopoiimeri), i dekstran ili poli(n-vinil pirolidon) polietilen glikol, propilen glikol, propilen glikol homopolimere, polipropilen oksid/etilen oksid kopolimere, polioksietilovane poliole i polivinil alkohol. Polietilen glikol propionaldehid može da ima prednosti u proizvodnji zbog svoje stabilnosti u vodi. Takođe se mogu koristiti sukcinat i stiren.

OB ili Fc proteini korišćeni da se formuliše Fc-OB fuzioni protein, mogu se dobiti vezivanjem poliamino kiselina ili tačke granjanja amino kiselina za deo Fc ili OB proteina. Na primer, poliamino kiselina može da bude dodatni nosač proteina koji, slično Fc spojenom na OB protein ili OB analog iz predmetnog pronalaska, služi takođe da se poveća polu život cirkulacije proteina pored prednosti postignutim preko Fc-OB fuzionog proteina. Za ove terapeutske ili kozmetičke potrebe predmetnog pronalaska, takve poliamino kiseline treba da budu one koje imaju ili ne stvaraju antigenski odgovor neutralizacije, ili druge suprotne odgovore. Takve poliamino kiseline mogu da budu odabrane iz grupe koja sadrži serum albumin (takav kao humani serum albumin), dodatno antitelo ili njegov deo (t.j. Fc oblast), iii druge poliamino kiseline, t.j. lizine. Kako je naznačeno u daljem tekstu, mesto vezivanja poliamino kiseline može da bude na N-kraju Fc-OB protein dela, ili C-kraju, ili drugim mestima između, koja takođe mogu da budu spojena sa delom hemijskog "linkera" za Fc-OB protein.

Polimer može da bude bilo koje molekulske težine, i može da bude razgranat ili nerazgranat. Za polietilen glikol, poželjna molekulska težina je između oko 2 kDa i oko 100 kDa (termin "oko" označava da u dobijanjima polietilen glikola, neki molekuli će biti veće ili manje težine, od navedene molekulske težine) radi lakog rukovanja i proizvodnje. Mogu se koristiti druge veličine, zavisno od željenog terapeutskog profila (t.j., trajanje željenog zadržanog oslobađanja, efekti, ako treba biološka aktivnost, pogodnost rukovanja, stepen ili nedostatak antigeniciteta i drugi poznati efekti polietilen glikola na terapeutski protein ili analog).

Broj molekula polimera tako učvršćenih može da varira i prosečan stručnjak će moći da utvrdi uticaj na funkciju. Može se mono- derivatizovati, ili može da se obezbedi za di-, tri-, tetra- ili neku kombinaciju derivatizacije, sa istim ili različitim hemijskim delovima( t. j.,polimeri, kao što su polietilen glikoli različitih težina). Odnos molekula polimera prema molekulima proteina (ili peptida) će se menjati, kao njihove koncentracije u reakcionoj smeši. Generalno, optimalni odnos (u uslovima efikasnosti reakcije u tome da nema viška nereagovanog proteina ili polimera) će biti određen faktorima npr. željenim stepenom derivatizacije (t.j., mono, di-, tri-, itd.), molekulskom težinom odabranog polimera, da li je polimer razgranat ili nerazgranat, i reakcioni uslovi. Hemijski delovi treba da budu vezani na protein razmatrajući efekat na funkcionalne ili antigenske domene proteina. Postoji više postupaka vezivanja koji stoje na raspolaganju prosečnom stručnjaku npr. EP 0 401 384 (vezivanje PEG-a za G-CSF), videti takođe Maliket al.,Exp. Hematol. 20: 1028-1035 (1992) (opis pegilovanja GM-CSF trezil hloridom). Na primer, polietilen glikol može da bude kovalentno vezan preko aminokiselinskih ostatakaviareaktivne grupe, kao što je slobodna amino ili karboksilna grupa. Reaktivne grupe su one na koje može da bude vezan aktiviran molekul polietilen glikol. Aminokiselinski ostaci koji imaju slobodnu amino grupu mogu da budu ostaci lizina i N-terminalni aminokiselinski ostatak. Oni koji imaju slobodnu karboksilnu grupu mogu da uključe ostatke asparaginske kiseline, ostatke glutaminske kiseline, i C-terminalni aminokiselinski ostatak. Sulfhidrilne grupe mogu takođe da se koriste kao reaktivna grupa za vezivanje jednog ili više molekula polietilen glikola. Poželjno za terapeutske potrebe se vezuje na amino grupu, i to na N-terminalni deo ili grupu lizina. Vezivanje na ostatke važne za vezivanje receptora bi trebalo izbegavati ukoliko se želi vezivanje receptora.

Može se specifično želeti da se N-krajnje hemijski modifikuje Fc-OB fuzioni protein. Korišćenjem polietilen glikola kao ilustracija ovih preparata, može se odabrati od različitih molekula polietilen glikola (prema molekulskoj težini, grananju, itd.), odnos molekula polietilen glikola prema molekulima proteina (ili peptida) u reakcionoj smeši, tip reakcije pegilovanja koja treba da se izvrši, i postupak dobijanja odabranog N-terminalno pegilovanog proteina. Postupak dobijanja N-terminalno pegilovanog preparata (t.j., po potrebi razdvajanje ovog dela od drugih monopegilovanih grupa) može da bude sa prečišćavanjem N-terminalno pegilovanog materijala iz populacije pegilovanih molekula proteina. Selektivna N-terminalna hemijska modifikacija može se izvršiti sa reduktivnom alkilacijom koja koristi diferencijalnu reaktivnost različitih tipova primarnih amino grupa (lizin u odnosu na N-kraj) raspoloživih za derivatizaciju u datom proteinu. Pod podesnim reakcionim uslovima, dolazi do u suštini selektivne derivatizacije proteina na N-kraju, karbonil grupom koja sadrži polimer. Na primer, može se selektivno N-terminalno pegilovati protein reakcijom na pH koji dozvoljava da se koristi prednost pKarazlika između e-amino grupe ostatka lizina i a-amino grupe N-terminalnog ostatka proteina. Ovakvom selektivnom derivatizacijom, kontrolisano je vezivanje polimera rastvorljivog u vodi na protein: konjugacija sa polimerom dešava se pretežno na N-kraju proteina i nema značajnih modifikacija drugih reaktivnih grupa, kao što su amino grupe bočnog lanca lizina. Reduktivnim alkilovanjem polimer rastvorljiv u vodi može da bude tipa kao što je prethodno opisano i treba da ima jedan reaktivni aldehid za kuplovanje sa proteinom. Može da se koristi polietilen glikol propionaldehid koji sadrži jedan reaktivni aldehid.

N-terminalno pegilovan derivat je poželjan za lakšu proizvodnju leka. Pegilovanje N-kraja osigurava homogeni proizvod kao karakterizaciju .proizvoda koji je pojednostavljen u odnosu na di-, tri- ili druge multi-pegilovane proizvode. Primena gornjeg postupka reduktivnog alkilovanja za dobijanje N-terminalnog proizvoda je poželjna zbog lakšu komercijalnu proizvodnju.

Kompleksi

Fc-OB fuzioni protein može administrirati kao kompleksiran u veznom preparatu. Ovakav vezni preparat može da ima uticaj na produženo vreme cirkulacije čak duže nego ono postignuto sa Fc-OB fuzionim proteinom.

Takav preparat može da bude protein (ili srodno, peptid). Primer vezivanja proteina je receptor OB proteina ili njegov deo, takav kao njegov rastvoran deo. Drugi proteini vezivanja mogu se utvrditi ispitivanjem OB proteina ili Fc-OB proteina u serumu, ili empirijskim skriningom na prisustvo vezivanja. Korišćeni proteini vezivanja tipično ne utiču na sposobnost OB proteina, Fc-OB fuzionih proteina, na vezivanje na endogenih receptora OB proteina i/ili uticaj transdukcionih signala.

Farmacutski preparati

Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje postupke rimene farmaceutskih preparata Fc-OB fuzionih proteina i derivata. Takvi farmaceutski preparati mogu da budu za administraciju injekcijom, ili oralnu, pulmonarnu, nazalnu, transdermalnu ili druge oblike adminsitracije. Generalno, predmetnim pronalaskom obuhvaćeni su farmaceutski preparati koji sadrže efikasne količine proteine ili proizvode derivata pronalaska zajedno sa farmaceutski prihvatljivim razblaživačima, konzervansirna, rastvaračima, emulgatorima, pomoćnim sredstvima (adjuvansima) i/ili nosačima. Ovi preparati obuhvataju razblaživače sa različitim sadržajem pufera (t.j., Tris-HCi, acetat, fosfat), različitog pH i jonske jačine; aditive npr. deterdženti i agense koji pospešuju rastvaranje (t.j., Tvveen 80, Polvsorbate 80), antioksidanase (t.j., askorbinska kiselina, natrijum metabisulfit), konzervanse (t.j., Thimersol, benzil alkohol) i bulking -supstance mase (t.j., laktoza, manitol); inkorporiranje materijala u određena dobijanja polimernih jedinjenja npr. polimlečna kiselina, poliglikolna kiselina, itd. ili u lipozome. Hilauronska kiselina se može takođe koristiti, i ovo može da ima uticaj na pospešivanje kontinuiranog oslobađanja u cirkulaciji. Takvi preparati mogu da utiču na fizičko stanje, stabilnost, brzinuin vivooslobađanja, i brzinuin vivoklirensa ovih proteina i derivata. Videti, npr., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990), Mask Publishing Co., Easton, PA 18042) strane 1435-1712 koje su ovde uključene kao referenca.

Preparati se mogu pripremiti u tečnom obliku, ili u kao suvi prah, kao što je liofilizovan oblik. Takođe su opisane formulacije sa kontitnuiranim oslobađanjem koje se mogu implantirati, kao transdermalne formulacije.

Ovde su sadržani oralni dozni čvrsti oblici, koji su generalno opisani u Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. 1990 (Mack Publishing Co. Easton PA 18042) u glavi 89.

Čvrsti dozni oblici uključuju tablete, kapsule, pilule, pastile ili lozengete, vrećice, ili kuglice. Takođe, lipozomalna ili proteinska kapsulacija može se koristiti za formulisanje ovih preparata (kao, na primer, proteinske mikrosfere opisane u US

Patentu br. 4,925,673). Lipozomalno kapsuliranje se može koristiti i lipozomi se mogu derivatizovati sa različitim polimerima (t.j., US Patent br. 5,013,556). Opis mogućih čvrstih oblika doziranja za terapiju dat je kod Marshall, K.: Modem Pharmaceutics Edited by G. S. Banker i C. T. Rhodes Chapter 10, 1979.

Generalno, formulacija će uključiti Fc-OB fuzioni protein i inertne sastojke koji dozvoljavaju zaštitu od stomačne okoline i oslobađanje biološki aktivnog materijala u crevima.

Takođe su posebno uključeni oralni dozni oblici gore datih derivatizovanih proteina. Fc-OB fuzioni protein se može hemijski modifikovati tako da oralna distribucija derivata bude efikasna. Generalno, uključena hemijska modifikacija podrazumeva vezivanje bar jednog dela na sam molekul proteina (ili peptida), gde dati deo dozvoljava (a) inhibiciju proteolize; i (b) ulaz u krvotok iz želuca ili creva. Takođe je poželjno povećati ukupnu stabilnost proteina i vreme cirkulacije u telu. Primeri takvih grupa su: polietilen glikol, kopolimeri etilen glikola i propilen glikol, karboksimetil celuloza, dekstran, polivinil alkohol, polivinil pirolidon i poliprolin. Abuchowski i Daviš, Soluble Polymer-Enzyme Adducts, u: "Enzymes as Drugs", Hocenberg i Roberts, eds., Wiley-lnterscience, New York, NY, (1981), str. 367-383; Newmark, et al., J. Appl. Biochem. 4: 185-189 (1982). Drugi polimeri koji se mogu koristiti su poli-1,3-dioksolan i poli-1,3,6-tioksokan. Poželjni za farmaceutsku primenu, kako je gore naznačeno, su polietilen glikolne grupe.

Za Fc-OB fuzioni protein, analog ili derivat, mesto oslobađanja može da bude želudac, tanko crevo (npr., duodenum, jejunum, ili ileum), ili debelo crevo. Prosečan stručnjak ima raspoložive formulacije koje se neće rastvoriti u želucu, jveć će se materijal osloboditi u duodenumu ili još u crevima. Poželjno, oslobađanjem će izbeći štetni efekti na okolinu želuca, ili zaštitom Fc-OB fuzionog proteina ili oslobađanjem biološki aktivnog materijala izvan okoline želuca, kao npr. creva.

Da bi se osigurala potpuna otpornost na želudačni sok, od ključne važnosti je nepropusna obloga najmanje od pH 5.0. Primeri često korišćenih inertnih sastojaka koji se upotrebljavaju kao gastroreistentne obloge su celuloza acetat trimetilat (CAT), hidroksipropilmetilceluloza ftalat (HPMCP), HPMCP 50, HPMCP 55, polivinil acetat ftalat (PVAP), Eudragit L30D, Aquateric, celuloza acetat ftalat (CAP), Eudragit L, Eudragit S, i Shellac. Ove obloge mogu se koristiti kao smeša filmova.

Obloga ili smeša obloga može takođe da se koristi na tabletama, koje nisu namenjene za zaštitu od želudačnih sokova. Ovo može da uključi šećerne obloge, ili obloge koje čine tabletu lakšom za gutanje. Kapsule mogu da sadrže čvrstu čauru (npr. želatinsku) za distribuciju suvog terapeutskog leka t.j. prah; za tečne oblike, može se koristiti obloga od mekog želatina. Materijal čaure vrećice može da bude gusti škrob ili jestivi papir. Za pilule, pastile, presovane tablete ili tabletne triturate, mogu se

koristiti tehnike vlažnih postupaka.

Terapeutski lek može da bude uključen u formulaciji kao fine multipartikule u obliku granula ili peleta sa veličinom čestica od oko 1 mm. Formulacija materijala za administraciju kapsule mogla bi da bude takođe kao prah, lako komprimovan cilindar ili ravan kao tablete. Terapeutski lek može da se dobije sa komprimovanjem.

Agensi za boje i arome se takođe mogu dodati. Na primer, protein (ili derivat) se može formulisati (npr. sa lipozomom ili kapsulacijom mikrosfere) i zatim dalje da uđe u sastav jestivog proizvoda, npr. ohlađeni napitak koji sadrži boje ili aromate.

Može se razblažiti ili povećati zapremina terapeutskog leka dodatkom inertnog materijala. Ovi razblaživači mogli bi da uključe ugljenje hidrate, posebno manitol, a-laktozu, anhidrovanu laktozu, celulozu, sukrozu, modifikovane dekstrane i škrob. Neke neorganske soli mogu takođe da se koriste kao punila uključujući kalcijum trifosfat, magnezijum karbonat i natrijum hlorid. Neki komercijalno raspoloživi razblaživači su Fast-Flo, Emđex, STA-Rx 1500, Emcompress i Avicell.

Agensdi dezintegracije (dezintegranti) mogu da uđu u sastav formulacije terapeutskog leka u čvrstom doznom obliku. Materijali korišćeni kao dezintegranti su, ali nisu ograničeni na škrob uključujući komercijalni dezintegrant baziran na škrobu,Explotab.Mogu se koristiti natrijum škrob glikolat,Amberlite,natrijum karboksimetilceluloza, ultramilopektin, natrijum alginat, želatin, pomorandžina kora, karboksimetil celuloza, prirodni sunđer i bentonit. Drugi oblik agensa za dezintegraciju su nerastvorljive katjonske izmenjivačke smole. Sprašene gume se mogu koristiti kao dezintegranti i kao veziva i ovi mogu da sadrže sprašene gume npr. agar, Karava ili tragakant. Kao dezintegranti takođe je korisna alginska kiselina i njena natrijumova so.

Veziva se mogu koristiti za održavanje terapeutskog agensa zajedno za formiranje čvrste tablete i uključuju materijale od prirodnih proizvoda kao što je akacija, tragakant, škrob i želatin. Drugi sadrže metil celulozu (MC), etil celulozu (EC) i karboksimetil celulozu (CMC). Polivinil pirolidon (PVP) i hidroksimetil celuloza (HPMC) se zajedno mogli koristiti u alkoholnim rastvorima za granuliranje terapeutskog leka

Antifrikcioni agens može da bude sadržan u formulaciji terapeutskog leka za sprečavanje slepljivanja za vreme postupka formulacije. Maziva (lubrikanti) se mogu koristiti kao sloj između terapeutskog leka i ploče zida, i to su,ali nisu ograničena na: stearinsku kiselinu uključujući njene magnezijum i kalcijum soli, politetrafluoroetilen (PTFE) tečni parafin, biljna ulja i voskovi. Rastvorljiva maziva se takođe mogu koristiti npr. natrijum lauril sulfat, magnezijum lauril sulfat, polietilen glikol raznih molekulskih težina, Carbowax 4000 i 6000.

Mogla bi da se dodaju i sredstva za klizenje koja mogu da poboljšaju osobine tečljivosti leka za vreme formulacije i da pomognu preuređenje za vreme kompresije. Sredstva za klizenje mogu da uključe škrob, talk, pirogenski silicijum dioksid i hidratisan silikoaluminat.

Da bi se potpomoglo rastvaranje terapeutskog leka u vodenoj sredini, može se dodati surfaktant kao što je okvašivač. Površinski aktivne supstance mogu da budu anjonski deterdženti npr. natrijum lauril sulfat, dioktil natrijum sulfosukcinat i đioktil natrijum sulfonat. Mogu se koristiti i katjonski deterdženti i to: benzalkonium hlorid ili benzetomium hlorid. Lista potencijalnih nejonskih deterdženata koji se mogu dodati u formulaciju kao površinski aktivne supstance su: lauromakrogol 400, polioksil 40 stearat, polioksietilen hidrogenizovano ricinusovo ulje 10, 50 i 60, glicerol monostearat, polisorbat 40, 60, 65 i 80, sukrozu estra masne kiseline, metil celulozu i karboksimetil celulozu. Ove površinski aktivne supstance se mogu dodati u formulaciju proteina ili derivata ili same ili kao smeša u različitim odnosima.

Aditivi koji potencijalno poboljšavaju apsropsciju proteina su na primer masne kiseline oleinska kiselina, linoleinska kiselina i linoleninska kiselina.

Kontrolisano oslobađanje formulacije može da bude poželjno. Lek bi mogao da bude inkorporiran u inertni matriks koja dozvoljava oslobađanje ili difuzijom ili mehanizmima ispiranja (luženja) n.p., guma. Mogu se takođe uključiti matrikse sporog razlaganja u formulaciju, n.p., alginati i polisaharidi. Drugi oblik kontrolisanog oslobađanja ovog terapeutskog leka je postupkom baziranim na Oros terapeutskom sistemu (Alza Corp.), n.p., lek se zatvara u polupropusnu (semipermeabilnu) membranu koja dozvoljava ulazak vode i potiskuje lek kroz jedan mali otvor usled osmotskih efekata. Neke gastrorezistente obloge takođe imaju efekat odloženog oslobađanja.

Druge obloge mogu da se koriste za formulaciju. Ove uključuju brojne šećere koji se mogu primeniti u sudu za oblaganje. Terapeutski agens mogao bi takođe biti u

tableti obloženoj filmom i materijali korišćeni u ovoj prilici podeljeni su u 2 grupe. Prva grupa su ne-crevni materijali i uključuju metil celulozu, etil celulozu, hidroksietil celulozu, metilhidroksi-etil celulozu, hidroksipropil celulozu, hidroksipropil-metil celulozu, natrijum karboksi-metil celulozu, providon i polietilen glikole. Druga grupa sadrži gastrorezistentne materijale koji su obično estri ftalne kiseline.

Smeša materijala mogla bi da se koristi da se obezbedi optimalno obaganje filmom. Obloga od filma može da se realizuje u uređaju za obloganje (dražiranje) ili u fluidizovanom sloju ili kompresijom obloge.

Ovde je razmatrana i pulmonarna distribucija ovog proteina. Protein (ili derivat) se distribuira u pluća sisara dok se inhalira i prolazi kroz epitelijalnu liniju pluća u krvotok. (Drugi izveštaji ovog uključuju Adjeiet al.,Pharmaceutical Research 7: 565-569

(1990); Adjeier al.,International Journal of Pharmaceutics 63: 135-144 (1990)(leuprolid acetat); Braquet et al., Journal of Cardiovascular Pharmacologv 13 (suppl. 5): s. 143-146 (1989)(endotelin-1); Annals of Internal Medicine 3: 206-212 (1989) (al-antitripsin); Smith et al., J. Clin. Invest. 84: 1145-1146 (1989) (a-1-proteinaza); Osvvein et al., "Aerosolization of Proteins", Proceedings of Svmposium on Respirator;/ Drug Deliverv II, Kevstone, Colorado, March, 1990 (rekombinantni humani faktor rasta); Debs et al., The Journal of Immunologv 140: 3482-3488 (1988) (interferon-y i faktor a nekroze tumora) i Platz et al., US patent br. 5,284,656 (faktor stimulisanja kolonije granulocita).

Sadržani za primenu predmetnog pronalaska u praksi su i mehanički uređaji namenjeni za pulmonarnu distribuciju terapeutskih proizvoda, uključujući ali ne ograničavajući se na: raspršivače, merodozne raspršivače (inhalatore), i inhalatore praha, svi poznati

prosečnom stručnjaku.

Neki specifični primeri komercijalno raspoloživih uređaja podesnih za primenu predmetnog pronalaska su Ultravent nebilizer, proizvodnje Mallinckrodt, Inc., St. Louis, Missouri; the Acorn II raspršivač, proizvodnje Marquest Medical Products, Englevvood, Colorado; Ventolin inhalator izmerene doze, proizvodnje Glaxo Inc., Research Triangle Park, North Carolina; i Spinhaler inhalator praha, proizvodnje Fisons Corp., Bedford, Massachusetts.

Svi okvi uređaji zahtevaju primenu formulacija podesnih za raspršavanje proteina (ili analoga ili derivata). Tipično, svaka formulacija je specifična za tip korišćenog uređaja i može da uključi primenu podesnog materijala za guranje unapred, dodatno razblaživačima, pomoćnim sredstvima i/ili nosačima korisnim u terapiji.

Protein treba da bude najpodesnije dobijen u posebnom obliku sa srednjom veličinom čestica manjom od 10 um (ili mikrona), najpoželjnije 0.5 do 5 um, za najefikasniju distribuciju u distalna pluća.

Nosači su ugljeni hidrati npr. trehaloza, manitol, ksilitol, sukroza, laktoza, i sorbitol. Drugi sastojci za primenu u formulacijama mogu da uključe DPPC, DOPE, DSPC i DOPC. Mogu se koristiti prirodni ili sintetički surfaktanti. Polietilen glikol može da se koristi (čak nezavisno od njegove primene u derivatizaciji proteina ili analoga). Mogu se koristiti i dekstrani, npr. ciklodekstran. Mogu se koristiti žučne soli i drugi srodni pojačavači. Celuloza i derivati celuloze mogu se koristiti. Mogu se koristiti i amino kiseline, npr. primena u formulaciji pufera.

Takođe je obuhvaćena primena lipozoma, mikrokapsula ili mikrosfera, inkluzionih kompleksa, iii drugih tipova nosača.

Formulacije podesne za primenu raspršivačem, ili mlaznih ili ultrazvučnih, tipično će sadržati Fc-OB protein, njegove analoge ili derivate, rastvorene u vodi u koncentraciji od oko 0.1 do 25 mg biološki aktivnog proteina po ml rastvora. Formulacija može takođe da uključi pufer i prost šećer (n.p., za stabilizaciju proteina i regulaciju osmotskog pritiska). Formulacija raspršivača može takođe da sadrži surfaktant, radi redukcije ili sprečavanja površinski izazvanog nagomilavanja proteina uzrokovanog atomizacijom rastvora u formiranju aerosola.

Formulacije za korišćenje sa merodoznim raspršivačem generalno će sadržati fino izdeljen prah koji sadrži protein (ili derivat) suspendovan u materijalu koji se potisukuje unapred pomoću površinski aktivne supstance. Materijal koji se potiskuje unapred može da bude bilo koji konvencionalni materijal koji se koristi za ove potrebe, takav kao hlorofluorougljenik, hidrohlorofluorougljenik, hidrofluorougljenik, ili ugljovodonik, uključujući trihlorofluorometan, dihlorodifluorometan, dihlorotetrafluoroetanol, i 1,1,1,2-tetrafluoroetan, ili njihove kombinacije. Podesni surfaktanti uključuju sorbitan trioleat i soja lecitin. Oleinska kiselina može takođe da bude korisna kao površinski aktivna supstanca.

Formulacije za raspršivanje iz inhalatorskog uređaja sa prahom će sadržavati fino izdeljen suvi prah koji sadrži protein (iii derivat) i može takođe da uključi punioce, kao što su laktoza, sorbitol, sukroza, manitol, trehaloza, ili ksilitol u količinama koje olakšavaju raspršivanje praha iz uređaja, n.p., 50 do 90% težinskih formulacije.

Takođe je razmatrana nazalna distribucija proteina. Nazalna distribucija dozvoljava priolaz proteina u krvotok direktno posle administriranja terapeutskog proizvoda u nos, bez potrebe za deponovanjem proizvoda u plućima. Formulacije za nazalnu distribuciju uključuju one sa dekstranom ili ciklodekstranom. Distribucija prenosom preko drugih sluznih membrana takođe je razmatrana.

Doziranje

Rosečan stručnjak će moći da postigne efikasno doziranje administriranjem i praćenjem željenog terapeutskog efekta. Zbog modifikacije N-kraja OB proteina, predmetni pronalazak obezbeđuje neočekivanu zaštitu proteina od razglaganja, i povećava vreme cirkulacije i stabilnost, kada se poredi sa OB proteinom ili modifikacijom C-kraja OB proteina. Stručnjak će zato moći da ustanovi da od ovih promena efikasno doziranje može da zahteva manje doze ili manje frekventno doziranje.

Poželjno, formulacija molekula će biti takva da će količina od oko 10 ug/kg/dan i 10mg/kg/dan dati željeni terapeutski efekat. Efikasne doze mogu da budu određene korišćenjem dijagnostičkih alata tokom vremena. Na primer, dijagnostičko merenje količine OB proteina ili Fc-OB fuzionog proteina u krvi (ili plazmi ili serumu) može prvo da bude korišćen za određivanje endogenih nivoa proteina. Takvi dijagnostički alati mogu da budu u obliku eseja antitela, npr. „sendvič" metod testiranja antitela. Količina endogenog OB proteina prvo kvantitativno odredi, pa zatim se odredi osnovna linija. Terapeutske doze su definisane kao endogeno i egzogeno određivanje količine OB proteina ili Fc-OB fuzionog proteina (što znači, proteina, nađenog u telu, ili samo-proizvedenog ili administriranog) se nastavlja tokom trajanja terapije. Doziranje zato može da varira tokom terapije, u početku sa relativno visokim dozama, dok se ne vidi terapeutski benefit, i manjim dozama korišćenim da se održe terapeutski benefiti.

Idealno, u situacijama gde se želi isključivo redukcija nivoa lipida krvi, gde se želi održavanje redukcije nivoa lipida krvi, ili pak povećanje nemasnog tkiva, doziranje će biti nedovoljno da bi dovelo do gubitka težine. Tako, za vreme početka terapije gojazne osobe, doze se mogu administrirati tako da dolazi do gubitka mase i uporedno snižavanje nivoa lipida krvi ili uporedno do smanjenja masnog tkiva/povećanja količine nemasnog tkiva. Kada se jednom postigne dovoljan gubitak težine, može se administrirati dovoljna doza tako da se spreči ponovno povećanje težine, dovoljna da se održe željeni nivoi lipida u krvi ili povećanje količine nemasnog tkiva (ili sprečavanje gubitka nemasnog tkiva). Kako su efekti OB ili Fc-OB proteina reverzibilni (npr., Campfield et al., Science 269: 546-549 (1995) na 547), ove doze mogu se odrediti empirijski,. Tako, ako doza dovede do primetnog gubitka težine kada se taj efekat ne želi, onda admisnitriranjem manje doze može da se postigne željeni nivo lipida krvi ili da se poveća količina nemasnog tkiva, ili pak da se održi željena težina.

Za povećanje osetljivosti na insulin pojedinca, mogu se uzeti u obzir slična razmatranja doza. Povećanje mase nemasnog tkiva bez gubitka težine može se postići dovoljno da se smanji količina insulina (ili potencijalno, amulina, tiazolidinediona, ili drugih potencijalnih lekova za tretiranje/lečenje dijabetesa) koju bi pojedinac administrirao za lečenje dijabetesa.

Za povećanje ukupne jačine, postoje slična razmatranja doziranja. Povećanje mase nemasnog tkiva sa uporednim ukupnim povećanjem jačine može se postići dozama koje su nisu dovoljne da dovedu do gubitka težine. Drugi benefiti, npr. povećanje broja crvenih krvnih ćelija (i oksidacija u krvi) i smanjenje u resorpciji kosti ili osteoporozi mogu se takode postići bez gubitka težine.

Kombinacije

Ovde opisani postupci mogu se koristiti u kombinaciji sa drugim lekovima, npr. onim korisnim za lečenje dijabetesa (n.p., insulin, moguće, tiazolidinedioni, amulin, ili njegovi antagonisti), holesterola i lekovima za snižavanje krvnog pritiska (npr. oni koji smanjuju nivoe lipida krvi ili drugi kardiovaskularni lekovi), i lekovima za povećanje aktivnosti (n.p., amfetamini). Takođe se mogu koristiti lekovi koji smanjuju apetit (npr. oni koji utiču nivoe serotonina ili neuropeptida Y). Takvo administriranje može da bude istovremeno ili može da bude in seriatim.

Dalje, ovi postupci se mogu koristiti u kombinaciji sa hirurškim zahvatima, npr. kozmetičke operacije namenjene za promenu celokupnog izgleda tela (npr., liposukcija ili laserske operacije namenjene za redukuju telesne težine). Zdravstveni benefiti operacija na srcu, npr. bajpas operacije ili druge operacije namenjene za olakšavanje stanja uzrokovanog blokadom krvnih sudova masnim naslagama, npr. arterijski plak, mogu se povećati uporednom primenom ovih preparata i postupaka. Postupci za eliminisanje kamena u žuči, npr. ultrazvučni ili laserski postupci, takođe se mogu koristiti pre, za vreme ili posle toka ovih terapeutskih postupaka. Dalje, ovde opisani postupci mogu se koristiti kao pomoćni npr. kod operacija ili terapija polomljenih kostiju, oštećene mišiće, ili kod drugih terapija koje bi se mogle poboljšati sa povećanjem mase mišićnog tkiva.

Sledeći primeri su dati radi bolje ilustracije pronalaska, ali se ne mogu smatrani kao ograničenje njegovog obima.

PRIMER 1: Primena Fc- OB proteina miša via subkutalne injekcije

Ovaj primer pokazuje da subkutalno injektiranje Fc-OB proteina miša dovodi do gubitka težine kod normalnih miševa. Normalnim (ne-gojaznim) CD1 miševima administriranje Fc-OB protein miša subkutalnim injekcijama u toku 22 dana. Doza od 10 mg proteina/kg telesne težine/dan dovelo je do gubitka od 14% (+/-1.1%) u odnosu na osnovnu liniju težine do 22. dana injektiranja. Doziranje PBS rezultiralo je do gubitka 3.9% (+/- 3.3%) u odnosu na osnovnu liniju težine do 22. dana injektiranja. Gubitak težine primenom 10 mg protein/kg telesne težine/dan Fc-OB proteina kod gojaznih CD1 miševa rezultirao je u gubitku od 10% (+/- 4.3%) u odnosu na osnovnu liniju težine, a doziranje PBS rezultiralo je u gubitku 8.7% (+/- 1.3%) u odnosu na osnovnu liniju težine, oba do 22. dana injektiranja.

Niže su predstavljeni procenti (%) razlika od težine osnovne linije kod CD1 miševa (starih 8 nedelja):

Kako može da se vidi, na kraju 22 dana subkutalnog režima, životinje koje primaju Fc-OB protein izgubile su preko 14.1% od svoje telesne težine kod mršavih i 10% telesne kod gojaznih, kada se poredi sa životinjama koje primaju samo PBS nosač i poređenjem sa osnovnom linijom.

Iznenađujuće, životinje koje primaju Fc-OB protein do 22 dana nastavile su da gube težinu do 28 dana, 4 dana posle poslednje injekcije. Administriranje normalnim (ne-gojaznim) CD1 miševima 10 mg proteina/kg telesne težine/dan mišjeg Fc-OB proteina subkutalnim injekcijama zaustavljeno 22 dana rezultiralo je u gubitku od 21% u odnosu na baznu liniju težine 28 dana u poređenju sa gubitkom od 14% 22 dana. Slično, administriranje gojaznim CD1 miševia 10 mg proteina/kg telesne težine mišjeg Fc-OB proteina zaustavljeno na dan 22, rezultiralo je u gubitku od 13% od osnovne linije težine na dan 28 poređeno sa 10% gubitka na dan 22. Na dan 34, gubitak težine je održavan na 10% gubitka kod gojaznih miševa dok su mršavi miševi nadoknadili 5% gubitka. Kontrole u svakom sistemu od dana 22 do dana 34 imale su srednju vrednost dobitka od 4% kod gojaznih miševa i 7% kod mršavih miševa.

PRIMER 2: Primena humanog Fc- OB proteina preko subkutalne injekcije kod C57

miševa

Ovaj primer pokazuje da subkutalno injektiranje humanog Fc-OB proteina rezultira u gubitku težine kod normalnih miševa. Normalnim (ne-gojaznim) C57 miševima je ađministriran humani Fc-OB protein subkutalnim injekcijama u periodu od 7 dana. Doza od 10 mg proteina/kg telesne težine/dan dovelo je do gubitka od 12% (+/-1.3%) od osnovne linije težine do 7 dana injektiranja. Doziranje od 1 mg proteina/kg telesne težine/danu rezultiralo je u gubitku od 8.9% (+/- 1.5%) od osnovne linije težine zaključno sa 7. danom injekcija. Gubitak težine primenom 10 mg proteina/kg telesne težine/dan humanog OB proteina kod gojaznih C57 miševa rezultiralo je u gubitku od 1.1% (+/- 0.99%) od osnovne linije težine, a doziranje od 1 mg protein/kg telesne težine/dan rezultiralo je u gubitku od 2.5% (+/- 1.1%) osnovne linije težine, oba zaključno sa 7 danom injektiranja.

Rezultati

U daljem tekstu dati su procenti (%) razlika od osnovne linije težine kod C57 miševa (starih 8 nedelja):

Kako se može videti na kraju dana 17 posle 7 dana subkutalnog režima od 10 mg/kg/dan, životinje koje primaju Fc-OB protein nadoknadile su 8% svoje telesne težine. Životinje koje primaju doze od 1 mg/kg/dan posle 7 dana subkutalnog režima vratile su se na 6.4% telesne težine posle 12 dana.

Ova ispitivanja takođe pokazuju da u periodu regeneracije od dana 7 do dana 22, posle poslednje injekcije na dan 7, regeneracija telesne težine je sporija kod Fc-OB tretiranih C57 miševa od one kod OB tretiranih miševa. Ovo ukazuje da Fc-OB protein nije očišćen brzo kao OB protein i tako izaziva produženi efekt gubitka težine.

PRIMER 3: Doza-odgovor kof C57 miševa tretiranih Fc-OB fuzionim proteinom

Dodatna ispitivanja su pokazala da postoji doza-odgovor na kontinualno administriranje Fc-OB proteina. U ovom ispitivanju, gojaznim C57 miševima, težine 35-40 g administriran je rekombinantni humani Fc-OB protein postupcima sličnim prethodnom primeru. Rezultati su dati u Tabeli 3 u daljem tekstu, (sa % gubitka telesne težine poređenjem sa osnovnom linijom, merenom kao gore):

Kako se može videti, povećanje doze od 0.25 mg/kg/dan do 1 mg/kg/dan povećava gubitak težine od 4% na 16%. Takođe je važno da je na dan 5, doziranje od 1 mg/kg/dan rezultiralo u 16% redukcije telesne težine. Ova ispitivanja su takođe pokazala sporu brzinu regeneracije težine od 0% što ukazuje na to da Fc-OB protein nije brzo očišćen što izaziva produženi efekat gubitka težine.

PRIMER 4: Farmakokinetici rekombinantnog humanog Fc-OB kod CD-1 miševa i pasa

Ova ispitivanja su pokazala farmakokinetičke osobine rekombinantnog humanog met Fc-OB proteina kod CD-1 miševa i pasa. Posle intravenskog ili subkutalnog doziranja od 1 mg/kg/dan, određene su koncentracije seruma rekombinantnog humanog met Fc-OB proteina i humanog met OB proteina, imunosorbent esejem vezanog enzima

(ELISA).

Kod obe vrste, primećeno je povećanje izlaganja, kada se meri koncentracijama seruma viših pikova (maksimuma) i većim delovima ispod krive koncentracije seruma (AUC), kada se poredi sa rekombinantnim met-humanim OB proteinom. Fc-OB ima manje sistemski klirens nego rekombinantni humani OB protein. Ovo se vidi u manjem klirensu i dužem polu životu Fc-OB u odnosu na OB protein. Povećanje veličine uzrokuje ne samo povećanje stabilnosti proteina, već i smanjenje u efikasnosti renalnog (bubrežnog) klirensa. Kao rezultat, Fc-OB ima sporiji klirens od sistemske cirkulacije. Povećanja pika vremena, maksimalna (pik) koncentracija seruma i AUC Fc-OB proteina su saglasna sa manjim klirensom. Fc-OB protein će dovesti do suštinski većeg sistemskog izlaganja u odnosu na OB protein. Rezultati su pokazani niže u tabeli 4.

Tabela 4

PRIMER 5:

Ovaj primer pokazuje da kod normalnih miševa koji nisu gojazni i nemaju povišene nivoe lipida krvi, administriranje humanog rekombinantnog Fc-OB proteina dovodi do snižavanja nivoa holesterola, glukoze i triglicerida. Dalje, ovaj primer pokazuje da ovi nivoi ostaju niski tokom perioda regenracije od tri dana.

Normalnim CD1 miševima administriran je rekombinantni humani Fc-OB protein via subkutalnih injekcija. Uzorci krvi uzeti su 24 sata posle dana 23, dana poslednje injkecije. Kako je prethodno diskutovano, životinje su gubile težinu pri administriranjim dozama. Kako je pokazano u tabeli 5, miševi su imali suštinsku redukciju seruma holesterola, glukoze i triglicerida zavisno od doze kada se porede sa kontrolama.

Ovi podaci pokazuju da je Fc-OB protein, efikasan agensi snižavanja lipida u krvi.

PRIMER 6:

Gojaznom humanom pacijentu administriran je Fc-OB protein radi redukcije težine. Gojazni pacijent ima i povišene nivoe lipida krvi, uključujući povišene nivoe holesterola, iznad 200 mg/100 ml. Pacijent dostiže zadovoljavajući redukciju težine u toku terapije Fc-OB. Doza održavanja Fc-OB proteina je administrirana ne-gojaznom pacijentu radi održavanja sniženih nivoa lipida krvi, uključujući snižene nivoe holesterola, ispod 200 mg/100 ml. Administrirana doza nije dovoljna da dovede do daljeg gubitka težine. Administriranje je hronično. Nivoi cirkulacije Fc-OB proteina može se pratiti dijagnostičkim kompletom, npr. esej antitela u odnosu na OB protein (ili drugi antigenski izvor ako je primenljiv).

PRIMER 7:

Ne-gojazni humani pacijent podvrgnut je operaciji koronarnog bajpasa ili drugom invazivnom tretmanu radi ublažavanja naprdnih stanja formiranja arterijskog plaka. Posle operacije, pacijentu je administrirana doza za održavanje Fc-OB proteina radi sprečavanja ponovnog stvaranja arterijskog plaka. Admisnitrirana doza nije dovoljna da dovede do gubitka težine. Administriranje je hronično. Nivoi cirkulacije Fc-OB proteina mogu se pratiti dijagnostičkim kompletima, npr. esej antitela u odnosu na OB protein (ili drugi antigenski izvor ako je primenljiv).

PRIMER 8:

Ne-gojazni humani pacijent sa hipertenzijom nastalom usled ograničenog protoka krvi zbog zapušenih arterija. Pacijentu se administrira doza Fc-OB proteina, dovoljna da se redukuje arterijski plak koji dovodi do začepljenja arterija. Zatim stanje pacijenta je praćeno zbog daljeg formiranja arterijskog plaka i hipertenzije. Ako se stanje ponovi, pacijentu se ponovo administrira efikasna količina Fc-OB proteina dovoljna da se uspostavi protok krvi, ali ne i dovoljna da dovede do gubitka težine. Nivoi cirkulacije Fc-OB proteina mogu se pratiti dijagnostičkim kompletima, npr. esej antitela u odnosu na OB protein (ili drugi antigenski izvor ako je primenljiv).

PRIMER 9:

Humani pacijent ima kamen u žuči. Kamen u žuči nije uklonjen, a nastojalo se da se izbegne formiranje dodatnog kamen u žuči, ili je kamen u žuči uklonjen, a žučna kesa ostaje (kao, na primer, laserskom ili ultrazvučnom operacijom) i težilo se ka tome da se izbegne formiranje dodatnog kamenja u žuči. Pacijentu se admisnitrira efikasna količina Fc-OB proteina, radi prevencije oakumuliranja dodatnog kamenja u žuči ili ponovnog akumuliranja kamena u žuč.i Nivoi cirkulacije Fc-OB proteina mogu se pratiti dijagnostičkim kompletima, npr. esej antitela u odnosu na OB protein (iii drugi antigenski izvor ako je primenljiv).

PRIMER 10:

Humani pacijent dijabetičar želi da primenjuje smanjene doze insulina za lečenje dijabetesa. Pacijentu se administrira efikasna količina Fc-OB proteina, radi povećanja mišićne mase (mase nemasnog tkiva). Osetljivost pacijenta na insuiin se povećava, a dozira insulina potrebna da se ublaže simptomi dijabetesa je smanjena, ili u uslovima smanjenja jedinica potrebnog insulina, ili u uslovima smanjenog broja potrebnih injekcija insulina po danu. Nivoi cirkulacije Fc-OB proteina mogu se pratiti dijagnostičkim kompletima, npr. esej antitela u odnosu na OB protein (ili drugi antigenski izvor ako je primenljiv).

PRIMER 11:

Ne-gojazni pacijent želi povećanje mase mišićnog tkiva u terapeutske svrhe, npr. oporavak od bolesti koja je umanjila masu mišićnog tkiva. Pacijentu je uadministrirana efikasna količina Fc-OB proteina, njegovog analoga ili derivata radi željenog povećanja mase mišićnog tkiva. Povećanje mase mišićnog tkiva praćeno je pomoću DEXA skaniranja Nivoi cirkulacije Fc-OB proteina mogu se pratiti dijagnostičkim kompletima, npr. esej antitela u odnosu na OB protein (ili drugi antigenski izvor ako je primenljiv).

MATERIJALI I POSTUPCI

Životnje. Divlji tip CD1 miševa i (+/+) C57B16 miševi su korišćeni za gornje primere. Starost miševa u početnoj tački vremena je bila 8 nedelja, a životnje su bile težinski stabilne.

Hranjenje i merenje težine. Miševima je davana isitnjena hrana za glodare (PMI

Feeds, Inc.) u hramilicama za hranu u prahu (Allentovvn Caging and Equipment) koje omogućavaju tačnije i osetljivije merenje od primene regularne hrane u blokovima.

Težina je merena u isto vreme svaki dan (2:00 p. m.) za željeni period. Telesna težina na dan pre injektiranja definisana je kao osnovna linija težine. Korišćeni miševi su bili težine 18-22 grama.

Kavez. Miševi su bili zatvoreni pojedinačno, i držani su pod humanim uslovima.

Administracija proteina ili nosača. Protein (kako je niže opisano) ili nosač (fosfatom puferovan rastvor soli, pH 7.4) su administrirani subkutalnim injekcijama ili intravenozno.

Kontrole. Kontrolne životinje bile su, one kojima je injektiran samo nosač bez Fc-OB fuzionog proteina ili OB proteina dodanog u nosač.

Protein. Sekvence ID. br. 1, 2 i 3 date za rekombinantnu OB DNK miša i protein (alika 1), i sekvenca ID. br. 4, 5 i 6 date za analog humane rekombinantne OB DNK i proteina (slika 2). Kako je primećeno iznad rekombinantnog humanog OB proteina kao u SEQ. ID.

br. 6 inalazi se ostatak lizina na položaju 35 i ostatak izoleucina na položaju 74. Dalje, rekombinantni humani protein je dao Zhang et al., Nature, supra, i u PCT publikaciji WO 96/05309 (12/22/96) i mišji i humani analogni rekombinantni proteini sa slika 1 i 2 su ilustrativni za OB protein koji može da se koristi za dobijanje Fc-OB fuzionog proteina predmetnih postupaka lečenja i proizvodnje leka. Drugi OB OB ili Fc proteini mogu se takođe koristiti za dobijanje FC-OB fuzionog proteina.

Ovde kao prva amino kiselina amino-kiselinske sekvence za rekombinantni OB protein je valin i označena je kao +1, a amino kiselina na položaju -1 je metionin. Amino kiselina C-kraja je broj 146 (cistein) (videti slike 1 i 2). Prva amino kiselina sekvence rekombinantnog humanog Fc-OB proteina sa slike 3 je glutamat i označen je kao +1 i jeste, a amino kiselina na položaju -1 je metionin. Amino kiselina C-kraja je broj 378 (cistein). Prva amino kiselina sekvence varijante rekombinantnog humanog Fc-OB proteina sa slike 4 je glutamat i označen je kao +1, a amino kiselina na položaju -1 je metionin. Amino kiselina C-kraja je broj 378 (cistein). Prva amino kiselina sekvence rekombinantne varijantre humanog Fc-OB proteina sa slike 5 je asparaginska kiselina i označena je +1, a amino kiselina na položaju -1 je metionin. Amino kiselina C-kraja je broj 373 (cistein). Prva amino kiselina sekvence za rekombinantnu humanu Fc-OB varijantu proteina sa slike 6 je asparaginska kiselina i označena je kao +1, i jeste, a amino kiselina na položaju -1 je metionin. Amino kiselina C-kraja je broj 373 (cistein).

Vektor eksprimirania i soj domaćina

Plazmidni ekspresioni vektor je pAMG21 (ATCC broj pristupa 98113), koji je derivat pCFM1656 (ATCC broj pristupa 69576) i sadrži odgovarajuće restrikciona mesta za ubacivanje gena nizvodno odluksPR promotora (videti US patent br. 5,169,318 za opisluksekspresionog sistema). Fc-OB DNK, opisan u daljemtekstu i prikazan na slikama 3-6, kreiran je i spojen u ekspresioni vektor pAMG21 linearizovan sa restrikcionim endonukleazama Ndel i BamHI i transformisan u E. Coli soj domaćina, FMS. E. coli FM5 ćelije su izvedene u Amgen Inc., Thousand Oaks, CA od E. Coli soja K-12 (Bachmann, et al., Bacterial. Rev. 40: 116-167 (1976)) i sadrže integrisan lambda faga represor gen, cl857 (Sussman et al., C. R. Acad. Sci. 254: 1517-1579 (1962)). Proizvodnja vektora, transformacija ćelije, i selekcija kolonije izvršeni su prema standardnim postupcima, (n.p., Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratorv Manual, 2d Edition, Cold Spring Harbor Laboratorv Press, Cold Spring Harbor, NY.) Ćelije domaćina su razvijene u LB sredini.

Konstrukcija Fc- OB DNK

Plazmid pFc-A3 (opisan u daljem tekstu) služio je kao izvor niza za teški lanac humanog imunoglobulina lgG-1 amino kiseline broj 99 (Glu) na prirodnom karboksilnom kraju (terminusu). Sekvenca humanog lgG-1 može da se dobije od Genebank (PO 1857).

Sekvenca humanog OB opisana gore kao i Zhang et al., Nature, supra, i PCT publikacija VVO 96/05309. DNK OB je spojena u vektor eksprimiranja pCFM1656 linerarizovan sa restrikicionim endonukleazama Xbal i BamHI korišćenjem standardnih postupaka kloniranja,npr.,Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratorv Manual, 2d Edition, Cold Spring Harbor Laboratorv Press, Cold Spting Harbor, N.Y. Plazmid pCFM1656 koji nosi DNK sekvencu OB služio je kao izvor sekvence za rekombinantni humani OB gen.

Genetsko spajanje ove dve sekvence izvršeno je postupkom PCR preklapanja nastavaka (Ho, S. N., et al., Site Directed Mutagenesis Bv Overlap Extension Using The Polvmerase Chain Reaction.Gene 77:51-59 (1989)). Proizvod PCR-a je raskinut restrikicionom endonukleazom Ndel radi stvaranja 5'—kohezivnog kraja i restrikcionom endonukleazom BamHI radi stvaranja 3'-kohezivnog kraja. Vektor, pAMG21 je slično raskinut. Spajanje je izvršeno sa fragmentom fuzije i linearizovanim vektorom. Spojeni DNK je transformisan elektroportacijom uE. colisoju domaćina. Klonovi koji su preživeli na pločama agara obeleženim kanamicinom (50ug/ml) provereni su na ekspresiju Fc-OB proteina. Izolovan je plazmid od pojedinih klonova i verifikovana je sekvenca kodirajućeg gena.

Kada su željene dodatne modifikacije Fc-OB gena, PCR tehnika je oponovo korišćena radi građenja promena. Dva seta promena su izvršena na N-kraju Fc dela fuzionog proteina (SEQ. ID. br. 9) radi kreiranja varijanti SEQ. ID. br. 12 i 15. Druga varijanta je konstruisana radi uvođenja četiri supstitucije amino kiselina radi uklanjanja mesta vezivanja Fc-receptora (leucin na položaju 15 supstituisanom glutamatom), i komplementnog mesta vezivanja (Clq) (glutamat na položaju 98 supstituisan alaninom, lizin na položaju 100 supstituisan alaninom, i lizin na položaju

102 supstituisan alaninom (videti, Xin Xiao Zheng et al., J. Immunol. 154: 5590-5600

(1995)). Templat za ovu konstrukciju je SEQ. ID. br. 15 a rezultujuća varijanta bio je SEQ. ID. br. 18.

Konstrukcija vektora pFC- A3

Plazmid pFc-A3, koji sadrži područje kodiranja Fc dela teškog lanca humanog imunoglobulina lgG-1 (videti Ellison, J. W. et al., Nucleic Acids Res. 10:4071-4079 (1982)), od prve amino kiseline Glu-99 pregibnog domena na karboksilnom kraju plus 5'-Notl fuzionog mesta i 3'-Sall i Xbal mesta, napravljen je PCR amplifikacijom cDNK biblioteke slezene čoveka. PCR reakcije su bile u konačnoj zapremini od 100 ml i korišćene su 2 jedinice Vent DNK polimeraze u 20 mM Tris-HCI (pH 8.8), 10 mM KC1, 10 mM (NH4)2S04, 2 mM MgS04, 0.1% Triton X-100 sa 400 mM svaki dNTP i 1 ng od cDNK biblioteke radi amplifikacije zajedno sa 1uM iz svakog primera. Reakcije su započete denaturacijom na 95°C tokom 2 min., praćeno sa 30 ciklusa od 95°C tokom 30 s, 55°C tokom 30 s, i 73°C tokom 2 min. 5-prajmerje uključio Noti mesto neposredno 5' na prvi ostatak (Glu-99) glavnog domena od lgG-1. 3'-priajer je uključio Sali i Xbal mesta. PCR proizvod od 717 baznih parova se vari sa Noti i Sali, što rezultuje da je DNK fragment izolovan elektroforezom kroz 1% agarozu i prečišćen i kloniran u Noti, Satl-svaren pBluescript II KS vektor (Stratagene). Dodatak u rezultujući plazmid, pFc-A3, je sekvencionisan radi potvrde tačnosti PCR reakcije.

Postupci za proizvodnju

Postupci niže za proizvodnju su korišćeni radi proizvodnje biološki aktivnog rekombinantnog mišjeg ili humanog metionil analoga OB proteina i Fc-OB proteina. Slični postupci se mogu koristiti za dobijanje biološki aktivnog humanog metionil OB proteina.

Postupak fermentacije

Korišćen je postupak fermentacije šarže. Preparati medijuma su dati u daljem tekstu.

Deo medijuma koji sadrži pretežno izvore azota je sterilisan (podizanjem temperature na 120~123°C tokom 25-35 minuta) u sudu za fermentaciju. Posle hlađenja aseptično su dodati ugljenik, magnezijum fosfat, i izvori tragova metala. Preko noći u fermentor je dodato 500 ml kulture bakterije koja proizvodi gornjeg rekombinantnog proteina miša (razvijena u LB tečnosti). Kada je optička gustina kulture (merena na 600 nm kao indikator za gustinu ćelije) dostigla 15-25 absorpcionih jedinica, rastvor autoizazivača (0.5 mg/ml homoserin laktona) je dodat (1 ml/l) u kulturu radi izazivanja ekspresije rekobinantnog gena. Postupak fermentacije je ostavljen da se nastavi tokom dodatnih 10 do 16 sati, uz sakupljanje tečnosti pomoću centrifugiranja.

Preparat medijuma:

Rastvor metala u tragovima:

Gvožđe hlorid (FeCI3.6H20): 27 g/l

Cink hlorid (ZnCI2.4H20): 2 g/l

Kobalt hlorid (CoCI2.6H20): 2 g/i

Natrijum molibdat (NaMo04.2H20): 2 g/l

Kalcijum hlorid (CaCI2.2H20): 1 g/l

Kupri sulfat (CuS04.5H20): 1.9 g/l

Borna kiselina (H3B03): 0.5 g/l

Mangan hlorid (MnCI2.4H20): 1.6 g/l

Natrijum citrat dihidrat: 73.5 g/l

Postupak prečišćavanja za humani Fc- OB fuzioni protein

Prečišćavanje humanog Fc-OB fuzionog proteina je izvršeno sa fazama datim u daljem tekstu (ako nije drugačije naznačeno, sledeće faze su izvršene na 4°C). Prečišćavanje mišjeg i humanog OB proteina opisan je u PCT publikaciji WO 96/05309, supra. 1. Pasta ćelije. Pasta ćelijeE. coli jesuspendovana u 5 zapremina destilovane vode. Ćelije u vodi su dalje razorene sa dva prolaza kroz mikrofluidizer.

Razorene ćelije su centrifugirane na 4.2k rpm tokom 1 sata u Beckman JB-6 centrifugi sa J5-4.2 rotorom. 2. Uključivanje frakcija od ispiranja. Prethodno dobijensupernatant je uklonjen i kuglice su ponovo suspendovane sa pet zapremina destilovane vode. Smeša je centrifugirana kao u fazi 1. 3. Rastvaranje. Kuglice su rastvorene sa 10 zapremina 50 mM tris, pH 8.5, 8 M gvanidin hidrohlorida, 10 mM ditiotreitola i mešana tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Rastvor je napravljen 40 mM cistamin dihidrohlorida i mešan 1 sat. 4. Rastvor iz faze 3 je dodan u 20 do 30 zapremina sledećeg rastvora: 50 mM tris, pH 8.5, 0.8 M arginina, 2 M uree, i 4 mM cisteina. Rastvor je mešan 16 sati na 8°C. 5. Izmena pufera. Rastvor iz faze 4 je koncentrovan i diafiltriran u 10 mM tris, pH 8.5. 6. Taloženje kiseline. Rastvor iz faze 5 je podešen na pH 4.75 sa 50% glacialnom kiselinom i inkubiran 30 minuta na sobnoj temperaturi. Rastvor je filtriran. 7. Katjonska izmenivačka hromatografija. Rastvor iz faze 6 je podešen na pH 7.0 i smešten u CM Sepharose Fast Flow kolonu na 10°C. Isprano je gradijentom 20 zapremina kolone 10 mM fosfata, pH 7.0, 0 do 0.1 M NaCI. 8. Anjonska izmenjivačka hromatografija. CM tečnost eluiranja iz faze 7 razblažena je 5 puta sa 5 mM tris, pH 7.5 i naneta na Q Sepharose Fast Flow na 10°C. Eluirano je gradijentom 20 zapremina kolone 10 mM tris, pH 7.5, 0 do 0.2M NaCI. 9. Hromatografija zasnovana na hidrofobnim interakcijama. Q Sepharose tečnost je napravljena od 0.75 amonijum sulfata i naneta na kolonu metil Macroprep hidrofobnih interakcija na sobnoj temperaturi. Eluirano je gradijentom 20 zapremina kolone 10 mM fosfata, pH 7.0, 0.75M do OM amonijum sulfata. 10. Izmena pufera. Tečnost iz faze 9 je koncentrovana i dijalizovana u odnosu na PBS pufer.

Kako je predmetni pronalazak opisan u uslovima poželjnih realizacija, razume se da će se varijacije i modifikacije javiti kod stručnjaka. Zato, on je namenjen da pridruženi patentni zahtevi pokriju sve takve ekvivalentne varijacije koje dolaze unutar obima pronalaska kako je zahtevano.

Claims

1. Protein formule odabrane iz grupe koju čine: Ri- R2i Ri- L - R2, gde je R-,, Fc protein, R2je OB protein, a L je linker, pri čemu je Fc protein odabran iz grupe koju čine: (a) amino kiseline 1-233 SEQ ID No:9 i 12 i amino kiseline 1-228 SEQ ID No. 15 i 18 (b) amino kiseline 1-233 SEQ. ID. br. 9 sa različitim amino kiselinama supstituisanim ili izostavljenim u jednom ili više od sledećih položaja : (i) jedan ili više ostataka cisteina zamenjeno ostatkom alanina ili serina; (ii) jedan ili više ostataka tirosina zamenjeno ostatkom fenilalanina; (iii) amino kiselina na položaju 5 zamenjena alaninom; (iv) amino kiselina na položaju 20 zamenjena glutamatom; (v) amino kiselina na položaju 103 zamenjena alaninom; (vi) amino kiselina na položaju 105 zamenjena alaninom; (vii) amino kiselina na položaju 107 zamenjena alaninom; (viii) amino kiseline na položajima 1, 2, 3, 4, ili 5 izostavljene ili supstituisane; i (ix) kombinacija poddelova i-viii; (c) sekvenca amino kiseline poddelova (a) ili (b) sa metionil ostatkom na N-kraju; (d) Fc protein, kog od delova (a) do (c) koji se sastoji od hemijske grupe vezane za proteinski deo, pri čemu je hemijska grupa, polietilen glikol i (e) derivat poddela (d) gde je polietilen glikol vezan isključivo na N-kraju datog proteinskog dela.

2. Protein prema zahtevu 1, naznačen time, što je sekvenca linkera, jedna ili više amino kiselina odabrana iz grupe koju čine glicin, asparagin, serin, teronion i alanin.

3. Protein iz zahteva 1, naznačen time, stoje linker odabran iz grupe koju čine: (j) bilo koja kombinaciju poddelova (a) do (i).

4. Sekvenca nukleinske kiseline kodiranja proteina, naznačena time, što je formule odabrane iz grupe koju čine: Ri- R2i Ri- L -R2, gde Rije Fc protein, R2je OB protein, i L je linker, pri čemu je Fc protein odabran iz grupe koju čine: (a) amino kiseline 1-233 SEQ. ID Nos.: 9 i 12 i amino kiseline 1-228 SEQ ID Nos.

15 i 18; (b) amino kiseline 1-233 SEQ ID No. 9 sa različitom amino kiselinom supstituisanom ili izostavljenom u jednom od sledećih položaja: (i) jedan ili više ostataka cisteina zamenjeno ostatkom alanina ili serina; (ii) jedan ili više ostataka tirosina zamenjeno ostatkom fenilalanina; (iii) amino kiselina na položaju 5 zamenjena alaninom; (iv) amino kiselina na položaju 20 zamenjena glutamatom; (v) amino kiselina na položaju 103 zamenjena alaninom; (vi) amino kiselina na položaju 105 zamenjena alaninom; (vii) amino kiselina na položaju 107 zamenjena alaninom; (viii) amino kiseline na položajima 1, 2, 3, 4 i/ili 5 izostavljene ili supstituisane; i (ix) kombinacija poddelova i-viii; i (c) sekvenca amino kiseline poddelova (a) ili (b) sa ostatkom metionila na N-kraju;

5. Sekvenca nukleinske kiseline prema zahtevu 4, naznačena time, što je sekvenca linkera, jedna ili više amino kiselina odabrana iz grupe koju čine Gly, Asn, Ser, Thr i Ala.

6. Sekvenca nukleinske kiseline prema zahtevu 4 koja kodira protein, naznačena time, što je linker odabran iz grupe koju čine: (j) bilo koja kombinacija poddelova (a) do (i).

7. Vektor, naznačen time što sadrži sekvencu nukleinskih kiselina prema zahtevu 4.

8. Vektor prema zahtevu7, naznačen time, što je vektor, pAMG21 (ATCC98113) i sekvenca nukleinskih kiselina prema zahtevu 4.

9. Prokariotska ili eukariotska ćelija domaćina, naznačena time, što sadrži vektor iz zahteva 7.

10. Postupak za proizvodnju proteina iz zahteva 1, naznačen time, što obuhvata faze kultivisanja, pod odgovarajućim uslovima, ćelije domaćina iz zahteva 9 i izolovanja dobijenog proteina.

11. Postupak iz zahteva 10, naznačen time, što sadrži fazu prečišćavanja dobijenog proteina.

1 2. Farmaceutski preparat, naznačen time, što sadrži efikasnu količinu proteina iz zahteva 1, u farmaceutski prihvatljivom razblaživaču, pomoćnom sredstvu (adjuvansu) ili nosaču.

13. Farmaceutski preparat prema zahtevu 12, za proizvodnju leka za lečenje oboljenja iz grupe koja obuhvata višak težine, dijabetes, visok nivo lipida u krvi, arterijsku sklerozu, arterijski plak, smanjenje ili prevenciju formiranja kamena u žuči, nedovoljnu masu mišićnog (nemasnog) tkiva, nedovoljnu osetljivot na insulin i slog.