RS49960B - Postupak za regulisanje smanjenja aktivnosti osteoprotegerinskog liganda - Google Patents

Abstract

Upotreba - OPGL polipeptida životinjskog porekla ili njegove podsekvence, ili - analoga OPGL koji je izveden iz životinjskog OPGL polipeptida u koji je uvedena modifikacija koja rezultuje u tome da imunizacija životinje analogom indukuje proizvodnju antitela na životinjski OPGL polipeptid, za dobijanje farmaceutske kompozicije koja sadrži OPGL polipeptid, podsekvencu ili analog za smanjenje OPGL kod životinja, naznačen time, što je OPGL polipeptid, autologni-protein za lečenje, prevenciju ili poboljšanje osteoporoze ili drugih stanja koje karakteriše prekomerna resorpcija kostiju. Prijava sadrži 7 zavisnih i 28 nezavisnih zahteva.

Description

Oblast pronalaska

Predmetni pronalazak se odnosi na poboljšanja u lečenju i prevenciji osteoporoze i drugih bolesti koje karakteriše gubitak koštanog tkiva. Detaljnije, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za smanjenje osteoprotegerinskog liganda (OPGL) omogućavajući stvaranje antitela na OPGL kod subjekata koji pate od ili su pod rizikom od oboljevanja od osteoporoze. Pronalazak takođe obezbeđuje postupke za proizvodnju mođifikovanih OPGL koji su korisni u ovom postupku. Pronalazak takođe obezbeđuje postupka za identifikovanje analoga OPGL koji su korisni u postupcima predmetnog pronalaska.

Stanje tehnike

Osteoporoza je jedan od najvećih zdravstvenih problema širom sveta koji neprekidno raste, Procena je da je obolelo oko 75 miliona ljudi u Sjedinjenim Američkim Državama, Evropi i Japanu, zajedno. Prema tome, to je načešća sistemska bolest kostiju u inđustrijalizovanom delu sveta.

Osteoporoza deluje na svaku četvrtu ženu u postmenopauzi i na većinu starijih, uključujući i značaj broj muškaraca. Godine 1984, procenjeno je da troškovi lečenja osteoporoze u Sjedinjenim Američkim Državama sa 15 miliona obolelih iznose 3.8 milijarde USD na godišnjem nivou. Ekstrapolacijom ovoga sledi da svetski troškovi iznose više od 20 milijardi USD.

Osteoporoza je sistemska bolest skeleta koju karakteriše mala masa kostiju i mikro-arhitektonsko propadanje koštanog tkiva, sa posledičnim povećanjem krtosti kostiju i susceptibilnosti na frakture (lomljenje). Mada su ovim pogođene sve kosti, tipične su i najčešće frakture kičme, zgloba ruke i kuka. Rizik od razvoja osteoporoze raste sa starenjem i veći je kod žena nego kod mušakraca. Čini se da etiologija leži u mehanizmima naglašavanja normalnog gubitka koštane mase, do koje dolazi posle menopauze kod žena i dešava se kod svih osoba koje stare.

Maksimum koštane mase se postuže oko 35 godine starosti. Posle postizanja ovog maskimuma, masa kostiju opada tokom života zbog narušavanja ravnoteže u remodelovanju. Kost gubi i mineralni i organski matriks, ali zadržava osnovnu organizaciju.

Kost se sastoji od mineralizovanog ekstracelularnog matriksa koji čine različiti proteini i proteoglikani; glavna komponenta je kolagen tipa I. Mineral koji oblaže ekstracelularni matriks je hidroksiapatit (Ca3(P04)2Ca(OH)2). Kost je kontinualno modelirana tokom rasta i razvoja i remodeluje se tokom života kao odgovor na fizičke i hemijske signale.

Rast, razvoj i održavanje kostiju su visoko regulisani procesi, koji na ćelijskom nivou uključuju koordinisanu regulaciju ćelija koje formiraju kosti (osteoblasti-matične kostne ćelije) i ćelija koje resorbuju kosti (osteoklasti). Nivo koštane mase odražava ravnotežu između stvaranja (formiranja ) kostiju i njihove resporpcije.

Osteoblasti potiču od matičnih ćelija mezenima i proizvode koštani matriks tokom razvoja, posle povrede kostiju i tokom normalnog remodelovanja kostiju koji se dešava tokom života. Osteoklasti diferenciraju od hematopoietičkih prekursora monocit-makrofagnog vezivanja i resorbuju koštani matriks.

Neravnoteža funkcionisanja osteoblasta i osteoklasta može da rezultuje u skeletalnim neneormalnostima okakrakterisanim povećanom koštanom masom (osteopetroza) ili umanjenom koštanom masom (osteoporoza).

Ispitivanja osteopetrozisa na miševima mutantima su pokazala da genetički nedostatak u razvoju osteoklasta, sazrevanju i/ili aktivaciji dovodi do smanjenja resorpcije kostiju i uniformno rezultuje u ozbiljnoj osteopetrozi (Marks, 1989). Međutim, do sad je relativno malo poznato o rastvorljivim faktorima koji fiziološki deluju u regulaciji razvoja osteoklasta.

Nedavno, međutim, su opisana i okarakterisana dva proteina koja učestvuju u ovoj regulaciji (Simonet et al., 1997; Lacev et al, 1998). Ova dva proteina suosteoprotegerini

osteoprotegerinski ligand.

Osteoprotegrerinje nov sekretovan član familije receptora tumour nekrozis faktora.In vitro.osteoprotegerin blokira osteoklastogenezu tako da zavisi od doze. Transgenski misiji

eksprimujući osteoprotegerin pokazuje opšte povećanje gustine kostiju (osteopetrosis) povezanu sa smanjenjem osteoklasta. Administracija rekombinantog osteoprotegerina proizvodi slične efekte kod normalnih miševa i štiti od gubitka koštane mase povezane sa ovarijektomijom (hirurško uklanjanje jajnika) kod pacova (Simonet et al., 1997). Dodatno, kod osteoprotegerin-deficijentnih miševa ("knock out" miševa) iako normalni pri rođenju, dolazi do razvoja ranog početka osteoporoze i arterijske kalcifikacije (Bucav et al, 1998). Ova zapažanja ističu verovatnoću daje osteoprotegerin blokira diferencijaciju osteoklasta, najvažniji ukoliko nije sama ćelija kostno-resorbujućeg tipa, ukazujući na to da može da deluje kao humoralni regulator resorpcije kostiju. Osteoprotegerin je predmet zaštite WO 97/23614.

Hipotezirano je da osteoprotegerin može da ispolji svoj efekat vezivanjem za i neutralisanjem faktora koji stimuliše razvoj osteoklasta i tako inhibira sazrevanje osteoklasta (Simonet et al., 1997).

Osteoprotesesterinski U<g>and (OPGL)je novi član familije tumour nekrozis faktora citokina koji postoji i kod oblika vezanog za membranu i kod slobodnog oblika. OPGL se vezuje za osteoprote gerin sa vezujućim binding afinitetom od 4 nM.In vitro,OPGL aktivira zrele osteoklaste i modulira stvaranje osteoklasta od prekursora koštane srži u prisustvu CSF-1. Pokazano je da se OPGL vezuje za površinu progenitora osteoklasta u CSF-1 -tretiranoj koštanoj srži. Receptor za OPGL na ovim hematopoeitičnim matičnim ćelijama je, međutim, nepoznat. Rekombinantni rastvoran OPGL je snažan induktor resorpcije kostijuin vivo(Lacey etal., 1998).

Opis OPGL - a

OPGL je sintetisan kao tip II transmembranski protein koji se sastoji od 317 aminokiselinskih ostataka (humani, cf. SEQ ID NO: 2) ili 316 aminokiselinskih ostataka (misiji, cf. SEQ ID NOs: 4 and 6). Upoređivanjem dve aminokiselinske sekvence pokazuje da je nađeno da 87% identičnih aminokiselinskih ostataka na homologim položajima.

Aminokiselinska sekvenca OPGL sadrži kratki citoplazmični domen na N-kraju, nakon kojeg sledi pretpostavljeni transmembranski region između aminokiselinskih ostatak 49 i 69. Na osnovu njegove homologije sa tumour nekrozis faktorom alfa, predloženo je da ekstracelularni deo OPGL-a sadrži dva domena: "Stalk" region koji se proteže od aminokiselinski ostataka 70 do 157 i region aktivne grupe liganda koja se proteže od amino kiselinskog ostatka 158 do C-kraja.

Čini se daje protein najsrodmji OPGL-u , citokin TRAIL koji indukuje apoptozu sa manje od 25% identičnih aminokiselinskih ostataka. OPGL je nedavno i kloniran u drugom kontektu i nazvan je TRANCE (Wong et al., 1997, J. Biol. Chem. 272: 25190-25194) i RANKL (Ander- son et al., 1997, Nature 390: 175-179). Protein je takođe poznat i kao faktor diferencijacije osteoklasta (ODF).

Nekoliko varijacija delecijeN-kraja mišijeg OPGL-a je eksprimovano uE. colii prečišćeno. Ove varijante se sastoje od aminokiselinskih ostataka: 75-316,128-316,137-316 i 158-316. Tri najkraće varijante imaju sličnu strukturu (3-ravni, na osnovu ispitivanja cirkularnog dihroizma (CD) i mogu da se vežu za osteoprotegerin. Još važnije je to da su tri varijante aktivne uin vitroanalizi (Lacey et al., 1998).

Najkraće varijante su dalje ispitivane. Poput tumour nekrozis faktora alfa, ova varijanta OPGL-a postoji kao trimer u rastvoru i formira 3: 3 komplekse kada se inkubira sa osteoprotegerinom. Nađeno je da afinitet vezivanja iznosi 4 nM. Ova varijanta indukuje značajno povećanje jonizovanog kalcijuma (hiperkalcemija) u krvi miševain vivo.Ko-administracija osteoprotegerina značajno smanjuje ovaj hiperkalcemični efekat OPGL-a.

Najduža varijanta (adminokiselinski ostatak 75-316) OPGL-a nije se vezala za osteoprotegerin i nema biološku aktivnost.

U vreme izvođenja varijante delecije N-kraja prirodno mesto cepanja u OPGL-u nije bilo poznato. Eksprimovanje OPGL-a ćele dužine u humanim 293 fibroblastima rezultovalo je u rastvornom OPGL-u sa početkom na amino ostatku 139 u proteinu miša ili homologom aminokiselinskom ostatku 140 u humanom proteinu. Ova ispitivanja eksprimovanja su pokazala daje rastvorni OPGL koji nastaje kao rezultat eksprimovanja u humanim ćelijama, glikozilovan. Ovo nije neočekivano budući da i misiji i humani OPGL ima potencijalna mesta N-glikozilacije u domenu C-kraja liganda.

Koncentracije osteoprotegerina u krvi i tkivima nisu poznate, ali protein pokazuje značajnu biološku aktivnost pri koncentraciji od 1 ng/ml.

W0 98/25958 opisuje protein "499E9" koji ima sekvencu mišijeg OPGL-a. Upotreba i stvaranje anti-499E9 antitela su razmatrani, ali ne postoji indikacija da protein 499E9 učestvuje u homeostazi kostiju i ne postoji nagoveštaj da se protein 499E9 može koristiti kao imunogen u autologom domaćinu u cilju prestanka tolerancije na 499E9.

Biološka aktivnost OPGL - a

OPGL je snažan faktor diferencijacije osteoklasta kada se kombinuje sa CSF-1. Ni jedna od ovih komponenti sama ne može da indukuje diferencijaciju osteoklasta iz matičnih ćelija.

OPGL je snažan aktivator zrelog osteoklasta. Sam po sebi OPGL aktivira zrele osteoklaste da resorbuju kost. OPGL nije razmatranđa deluje kao faktor rasta osteoklasta ili faktor preživljavanja osteklasta u ovim eksperimentima.

Čini se da dejstvo OPGL-a nije ograničeno na vrstu kao misiji OPGL koji takođe indukuje stvaranje osteoklasta u kulturama humanih mononukelarnih ćelija periferne krvi.

Predmet pronalaska

Predmet pronalaska je da obezbedi nove terapije za stanja okarakterisana prekomernom resorpcijom kostiju poput osteoporoze. Dalje, predmet je i razvoj autovakcine na OPGL, u cilju dobijanja novog tretmana (lečenja) osteoporoze i drugih patoloških bolesti koja uključuju prekomernu resorpciju kostiju.

Opis pronalaska

Našli smo da gore navedeni podaci ukazuju na patofiziološku ulogu OPGL-a.In vivodokaz je delimično posledica slučaja ili indirektan, ali po našem mišljenju uverljiv posebno u kombinaciji sa direktnim dokazom.

Zapažanje da injekcija rekombinantnog domena C-kraja OPGL-a mišu dovodi do izbiljne hiperkalcernije prema našem mišljenju direktno ukazuje na patofiziološku ulogu.

Indirektan dokaz dolazi od osteoprotegerin-deficijentnog miša ("knock out "miša) kod kojeg uprkos tome što je normalan pri rođenju, dolazi do ranog razvoja osteoporoze. Ovo ukazuje na to da uklanjanjem proteina koji vezuje OPGL i neutralisanjem njegovo efekta dolazi do razvoja osteoporoze. Došli smo da zaključka daje najverovatniji razlog za ovo povećanje maturacije osteoklasta i aktivacija izazvana OPGL-om,

Druga dva indirektna dokaza su daje i kod miševa koji su transgenski za osteoprotegerin i kod miševa kojima je injektiran rekombinantni osteoprotegerin došlo do razvoja osteopetroze. Ovo pokazuje da neprirodno visok nivo proteina koji vezuje OPGL i neutrališe njegove efekte dovodi do osteopetroze. Tako smo zaključili da za to postoje razlozi u smanjenju maturacije osteoklasta i aktivaciji izazvanoj neutralizacijom OPGL-a.

Stoga predlažemo model gde OPGL i osteoprotegerin deluju kao pozitivni i negativni regulatori razvoja osteoklasta, respektivno. Drugim rečima, OPGL potpomaže resorpciju kostiju dok osteoprotegerin inhibira resorpciju kostiju.

Tako, u odnosu na osteoporozu, OPGL se može smatrati za "patogeni agens" koji potpomaže resorpciju kostiju koja na kraju dovodi do osteoporoze. Slično, osteoprotegerin se može smatrati kao "terapeutski agens" koji deluje na suprot "patogenom agensu" neutrališući njegov efekat.

Stoga predlažemo smanjenje diferencijacije/maturacije/stvaranja (formiranja) osteoklasta i aktivaciju osteoklasta krozin vivostvaranja antietla koja mogu da neutrališu OPGL, obezbeđiijući tako bezbedno i efikasno sredstvo za lečenje/poboljšanje i/ili sprečavanje osteoporoze i drugih bolesti koje su okarakterisane prekomernom brzinom resorpcije kostiju u poređenju sa brzinom stvaranja kostiju.

Tako, u svom najširem i najopštijem obimu, predmetni pronalazak se odnosi na primenu:

• OPGL polipeptida životinje ili njegovu podsekvencu, ili

• analoga OPGL-a koji je izveden od životinjskog OPGL polipeptida pri čemu je uvedena modifikacija koja rezultuje u tome da intimizacija životinje analogom,

indtikuje stvaranje antitela na životinjski OPGL polipeptid,

za dobijanje farmaceutske kompozicije koja sadrži OPGL protein, subsekvencu ili analog, za smanjenje OPGL-a kod datih životinja gde je OPGL polipeptid autologni (sopstveni) -protein za lečenje, prevenciju ili poboljšanje osteporoze ili drugog stanja koje karakteriše prekomerna resorpcija kostiju.

Najatraktivniji aspekt ovog pristupa je taj da se npr. osteoporoza može kontrolisati periodičnom, ali ne veoma čestom imunizacijom, na suprot terapeutskom pristupu koji obuhvata čestu (npr. dnevnu) administraciju osteoprotegerina ili molekula koji imaju afinitet vezivanja za analoge OPGL-a. Očekuje se da bi 1-4 godišnje injekcije imunogenskć kompozicije bile dovoljne da za postizanje željenog efekta, dok bi administracija osteoprotegerina ili drugih inhibitora aktivnosti OPGL-a zahtevale administraciju na dnevnoj bazi.

Pronalazak se takođe odnosi ina primenu fragementa nukelinskih kiselina koji kodira OPGL, podsekvencu OPGL-a ili analog OPGL-a za dobijanje preparata ili farmaceutske kompozicije koja sadrži date fragemente nukleinskih kiselina, za smanjenje OPGL-a kod životinja za lečenje. prevenciju ili poboljšanje osteoporoze ili drugih stanja koje karatekriše prekomerna resorpcija kostiju.

Pronalazak se dalje odnosi na primenu vektora sa fragmentom nukleinskih kiselina koji kodira OPGL, podsekvencu OPGL-a ili analog OPGL-a za dobijanje farmaceutske kompozicije koja sadrži dati vektor za smanjenje OPGL-a kod životinja za lečenje, prevenciju ili poboljšanje osteporoze ili drugih stanja koja su okarakterisana prekomernom resorpcijom kostiju.

Konačno, pronalazak se odnosi na postupak lečenja osteoporoze i drugih bolesti koje karakteriše prekomerna resoprcija kostiju, pri čemu je administriran ne-OPGL molekul (obično antitelo) koji blokira interakciju između OPGL-a i njegovih receptora na ćelijama osteoklasta.

Pronalazak se takođe odnosi i na postupak identifikovanja analoga OPGL-a kao i na postupak za dobijanje kompozicije koja sadrži analoge OPGL-a.

Detaljan opis pronalaska

Definicije

U daljem tekstu definisani su i do detalja objašnjeni izrazi koji su korišćeni u predmetnoj specifkaciji i zahtevima u cilju pojašnjenja obima pronalaska.

Izrazi "T-limfociti" i "T-ćelije" će se naizmenično koristiti za limfocite timusnog porekla koji su odgovorni za imune odgovore posrednovane različitim ćelijama kao i pomoćne aktivnosti u humoralnom imunom odgovoru. Slično, izrazi "B-limfocit"i "B-ćelija će se naizmenično koristiti za limfocite koje proizvodi antitelo.

"OPGL polipeptid" ovde označava polipeptide sa aminokiselinskom sekvencom gore opisanih OPGL proteina izvedenih od ljudi i miševa (ili okrnjene aminosekvence koje dele veliki deo epitopa B-ćelija sa intaktnim OPGL), ali su ovim izrazom obuhvaćeni i polipeptidi sa aminokiselinskom sekvencom koja je identična analozima ova dva proteina izolovana iz drugih vrsta. Takođe, neglikozilovani oblici OPGL -a koji su dobijeni u prokariotskim sistemima su obuhvaćeni ovim izrazom, kao i oblici sa različitim modelima glikozilacije kao posledica primene npr. kvasaca ili drugih ne-sisarskih eukarriotskih ekspresionih sistema. Treba, međutim, napomenuti da korišćenje izraza " OPGL polipeptid", ima namenu da objasni dati polipeptid kao normalno ne-imunogeni kada se daje životinji koja se leči. Drugim recima, OPGL polipeptid je autologni (sopstveni) -protein ili njegov analog koji obično neće podići imuni odgovor na OPGL date životinje.

"OPGL analog" je OPGL polipeptid koji je izložen promenema u svojoj primarnoj strukturi. Ova promena može da npr. bude u obliku fuzije OPGL polipeptida i odgovarajućeg fuzionog partnera (fj. promena u primarnoj strukturi isključivo obuhvata dodavanje aminokiselinskih ostataka na C- i/ili N-kraju) i/ili može biti u obliku umetanja i/ili delecije i/ili supstitucije aminokiselinske sekvence OPGL polipeptida . Ovim izrazom su takođe obuhvaćeni derivatizovani OPGL molekuli, cf. videti deo o modifikacijama OPGL-a u daljem tekstu.

Treba napomenuti da upotreba kseno-analoga kao vakcine na ljudima (npr. pseći ili svinjcki analog) humanog OPGL-a može se zamisliti da proizvodi željeni imuninet na OPGL. Ova upotreba kseno-analoga za imunizaciju se takođe smatra kao deo pronalaska.

Izraz "polipeptid" u ovom kontekstu označava i kratke peptide sa 2 do 10 aminokiselinskih ostataka, oligopeptide sa 11 do 100 amino kiselinskih ostataka i polipeptidi koji se sastoje od više od 100 aminokiselinskih ostataka. Dalje, izraz takođe obuhvata i proteine, tj. funkcionalne biomolekule koji sadrže bar jedan polipeptid, kada sadrže najmanje dva polipeptida, mogu obrazovati komplekse, biti kovalentno vezani ili mogu biti nekovalentno vezani. Polipeptid(i) u proteinu se mogu glikozilovati i/ili lipidizovati i/ili da sadrže prostetične grupe.

Izrazu "podsekvenca"označava bilo koji konsekutivni deo od najmanje 3 amino kiseline ili, kada je relevantno, najmanje 3 nukleotida, izvedena direktno od prirodnih OPGL aminokiselinskih sekvenci ili sekvenci nukleinskih kiselina.

Izraz "životinja" u opštem kontekstu označava životinjske vrste (poželjno sisare), poputHomo sapiens- a, Canis domesticus- a,itd., i to ne samo jednu životinju. Dalje, izraz takođe označava populaciju ovih životinjskih vrsta, budući daje važno da su jedinke imunizovane prema postupku pronalaska, svi u suštini sa istim OPGL omogućavajući imunizaciju životinja istim imunogenima. Ukoliko, na pnmer, u različitim populacijama ljudi postoje genetske varijante OPGL-a, onda će možda biti neophodno upotrebi ti različite imunogen na različitim populacijama ljudi u cilju "probijanja" autotolerancije na OPGL u populaciji. Prosečnom stručnjaku će biti jasno daje životinja u ovom kontekstu, živo biće sa imunim sistemom. Preferentno je daje životinja, kičmanjak, poput sisara.

Pod izrazom" in vivosmanjenje aktivnosti OPGL-a " podrazumeva se smanjenje broja interakcija između OPGL -a i njegovih (nepoznatih) receptora u živim organizimima (ili između OPGL-a i drugih mogućih biološki važnih učesnika koji se vezuju za ovaj molekul). Smanjenje se može postići prema različitim mehanizmima: na primer, najjednostavnija je obična interferencija sa aktivnim mestima u OPGL-u, vezivanjem antitela. Međutim, takođe je obuhvaćeno predmetnim pronalaskom i to da vezivanje antitela dovodi do uklanjanja OPGL-a pomoću ćelija čistača (eng. Scavenger cell) (kao što su makrofage i druge fagocitne ćelije).

Izraz "izvođenja prezentovanja imunom sistemu" odnosi se na to daje imuni sistem životinja izložen imunogenom izazovu na kontrolisan način. Kao što sledi iz opisa datog u daljem tekstu, ovakav izazov imunog sistema može se izvesti na različite načine, od kojih je najvažnija vakcinacija polipeptidom koji sadrži "farmakcinu" (tj. vakcinu koja je asministrirana za lečenje ili poboljšati trenutno stanje uzrokovano bolešću) ili vakcinacija "farmakcinom" nukelinske kiseline. Rezlutat koji treba postići je da su imunološki kompetentne ćelije kod životinja sukobljene sa antigenom na imunološki efikasan način, dok je precizan način postizanja ovog rezultata od manje važnosti za inventivne ideje koje leže u osnovi predmetnog pronalaska.

Izraz "imunološki efiksana (delotvorna) količina " ima svoje uobičajeno značenje u tehnici, tj. količina imunogena koja može da indukuje imuni odgovor koji značajno angažuje patogene agense koji dele imunološke karakteristike sa imunogenom.

Kada se koristi izraz daje OPGL "modifikovan", ovaj se odnosi na hemijsku modifikaciju polipeptida koji Čini osnovni skelet OPGL-a. Ova modifikacije može da bude npr. derivatizacija (npr. alkilovanje) određenih aminokiselinskih ostataka u OPGL sekvenci. no budući da će biti objašenjeno u tekstu opisa koji sledi, preferentne modifikacije obuhvataju primene u primarnoj strukturi aminokiselinske sekvence OPGL- a.

Kada se razmatra "autotolerancija na OPGL" treba naglastiti daje OPGL autologni-protein u populaciji koja se podvrgava vakcinisanju, normalni pojedincima u populaciji ne podiže imuni odgovor na OPGL; ne može se izostaviti, međutim, da neke individue u populaciji životinja mogu da proizvedu anitela na prirodni OPGL, npr. kao deo autoimunog poremećaja. U svakom slučaju, životinje će normalno biti autotolerantne na sopstveni OPGL, ali se ne može isključiti i to da će date životinje takođe tolerisati analoge OPGL-a koji su izvedeni od drugih životinjskih vrsta koje pripadaju populaciji sa različitim OPGL fenotipom.

"Strani epitop T-ćelije " (ili: "strani epitop T-limfocita") je peptid koji može da se veže za MHC molekul i koji stimuliše T-ćelije kod životinjskih vrsta. Preferentni strani epitopi T-ćelija u predmetnom pronalasku su "slobodni"epitopi. tj. epitopi koji se vezuju za značajniji deo posebne klase molekula MHC kod životinjskih vrsta ili populacije. Poznat je samo ograničen broj ovih slobodnih epitopa T-ćelija i biće do detalja opisan u daljem tekstu. Treba napomenuti i to da imunogeni, koji su upotrebljeni prema predmetnom pronalasku, mogu da budu efikasni u najvećem mogućem deki populacije životinja, može biti neophodno 1) umetnuti nekoliko stranih epitopa T-ćelija u isti analog OPGL -a ili 2) pripremiti nekoliko anloga OPGL-a, pri čemu svaki analog ima različite umetnute slobodne epitope. Takođe treba napomenuti da koncept stranih epitopa T-ćelija takođe obuhvata korišćenje kriptičnih epitopa T-ćelija, tj. epitopa koji su izvedeni od autolognih -proteina i koji ispoljavaju imunogeno ponašanje samo kadaa su izolovani, a da ne deo datog autolognog -proteina o kojem je reč.

"Strani epitop pomoćnićkih T limfocita" (strani Thepitop) je strani epitop T ćelije koji vezuje MHC molekule Klase II i može se nalaziti na površini antigen-prezentujuće ćelije antigen( eng. antigen presenting cell.APC) vezan za MHC molekul Klase II.

Izraz "Funkcionalni deo" (bio)molekula u ovom kontekstu označava deo molekula koji je odgovoran za bar jedan od biohemijskih ili fizioloških efekata koje ispoljava molekul. U stanju tehnike je poznato da mnogi enzimi i drugi efektorni molekuli imaju aktivno mesto koje je odgovorno za efekte koje ispoljava dati molekul. Drugi delovi molekula mogu da služe za stabilizaciju ili poboljšanje rastvori)ivosti i prema tome da budu ostavljeni ako ovi ciljve i nisu od važnosti u smislu određene realizacije predmetnog pronalaska. Na primer, moguće je upotrebiti određene citokine kao grupe za izmenu u OPGL -u (cf.detalji će biti opisani u daljem tekstu) i u ovom slučaju pitanje stabilnosti može biti irelevantno budući da kupiovanje sa OPGL-om obezbeđuje neophodnu stabilnost.

Izraz "adjuvans" ima uobičajeno značenje u tehnologiji vakcina, tj..supstanca ili kompozicija predmeta 1) koja nije sama po sebi u mogućnosti da podigne specifični imunki odgovor na imunogen vakcine, ali koja je 2) ipak sposobna da poveća imuni odgovor na imunogen. Osnođno, drugim recima, vakcinacija samim adjuvansom ne obezbeđuje imuni odgovor na imunogen, vakcinacija imunogenom može, ali ne mora da podigne imuni odgovor na imunogen, ali kombinovana vakcincija imunogenom i adjuvansom indukuje imuni odgovor na imunogen koji je jači nego onaj indukovan samim imunogenom. "Ciljanje" molekula u ovom kontektu označava situaciju gde će se molekul nakon unošenja u životinju, poželjno pojaviti u određenom tkivu (tkivima) ili će se poželjno povezati sa određenim ćelijama ili ćelijskim vrstama. Efekat se može postići na brojne načine uključujući formulaciju molekula u kompoziciju omogućavajući ciljanje ili uvođenjem u molekul grupa koje omogućavaju ciljanje. O ovim tkivima ćemo diskutovati u daljem tekstu.

"Stimulacija imunog sistema" označava supstancu ili kompoziciju materije koja pokazuje opšti, ne-specifični imunostimulatorni efekat. Brojni adjuvansi i mogući adjuvansi (poput određenih citokina) dele sposobnost da stimulišu imuni sistem. Rezultat primene imunostimulatomog agena je povećana "budnost" imunog sistema, odnosno da istovremena ili uzastopna imunizacija imunogenom indukuje značajno efeikasniji imuni odgovor u poređenju sa izolovanom primenom imunogena.

Prefererentne real izacije smanjenja aktivnosti OPGL-a

Preferentno je daje OPGL polipeptid upotrebljen kao imunogen u postupku pronalaska mođifikovan (izmenjen) molekul kada postoji bar jedna promena u

aminokiselinskoj sekvenci OPGL-a budući da su, na ovaj način, povećane šanse za postizanje prestanka autotolerancije na OPGL, od opšte važnosti. Treba napomenuti da ovo ne isključuje mogućnost primene ovog modifikovanog OPGL-a u formulaciji koji dalje olakšava prestanak autotolerancije na OPGL, npr. formulacije koje sadrže adjuvanse.

Pokazano je (u Dalum I et al., 1996, J. Imunol. 157: 4796-4804) da su potencijalno samo-reaktivni B-limfocit prepoznavajući proteini fiziološki prisutni kod normalnih pojedinaca. Međutim, da bi se ovi B-limfociti indukovali tako da zapravo proizvode antitela reaktivna sa relevantnim autolognim proteinima, potrebna pomoć od tzv. pomoćničkih T-limfocita (TH-ćelije ili Tn-limfociti) koji proizvode citokin. Obično ove "pomoći" nema, zato što T-limfociti generalno ne prepoznaju epitope T-ćelija izvedene od autolognih- proteina kada su prezentovane antigen-prezentujućim ćelijama (APCs). Međutim, obezbeđivanjem elementa "nepoznatog"u autolognom- proteinu (tj. uvođenjem imunološki značajne modifikacije), T-ćelije koje prepoznaju strani element se aktiviraju posle prepoznavanja stranog epitopa na APC-u (poput, mononuklearne ćelije, u početku). Poliklonalni B-limfociti (koji su takođe APCs) koji su sposobni za prepoznavanje autolognih (sopstvenih)-epitopa na modifikovanom autolognom-proteinu takođe internizuje antigen i zatim prezentuju epitope stranih T-ćelija i aktivirani T-limfociti naknadno obezbeđuju citokinu pomoć ovim samo-reaktivnim poliklonalnim B-limfocitima. Budući da su antitela proizvedena ovim poliklonalnim B-limfocitima reaktivna sa različitim epitopima na modifikovanom polipeptidu, uključujući one koji su takođe prisutni u nativnom polipeptidu, indukovano je antitelo koje je unakrsno-reaktivno sa nemodifikovanim autolognim- proteinom. Kao zaključak sledi da se T-limfociti mogu navesti da deluju kao daje populacija poliklonalnih B-limfocita prepoznala u potpunosti strani antigen, dok je, u stvari, samo ubačen epitop (ili više njih) je (su) stran(i) za domaćina. Na ovaj način, indukovana su antitela koja mogu da unakrsno reaguju sa nemodifikovanim autolognim-antigenima.

U tehnici je poznato nekoliko načina modifikovanja peptida autolognih-antigena u cilju postizanja prestanka autotolerancije. Tako, prema pronalasku, modifikacija može da obuhvati:

- daje uveden bar jedan epitop strane T-ćelije, i/ili

- daje uvedena bar jedna prva grupa deluje na ciljanje modifikovanog molekula na antigen-prezentujuću ćeliju (APC), i/ili

- daje uvedena najmanje jedna druga grupa koja stimuliše imuni sistem, i/ili

-daje uvedena namanje jedna treća grupa koja optimizira prezentaciju modifikovanog OPGL polipeptida imunom sistemu.

Međutim, sve ove modifikacije bi trebalo sprovesti uz održavanje suštinske frakcije originalnih epitopa B-limfo-cita u OPGL-u, budući da tako B-limfociti bolje prepoznaju prirodni molekul.

U jednoj preferentnoj realizaciji, bočne grupe (u obliku stranih epitopa T-ćelija ili prethodno pomenute prva, druga i treća grupa) su kovalentno ili nekovalentno uvedene. Ovo znaci da su ostaci aminokiselinskih ostataka izvedenih od OPGL derivatizovani bez izmena primarne amino kiselinske sekvence, ili bar bez uvođenja izmena u peptidnim vezama između pojedinačnih amino kiselina u lancu.

Alternativa i prefererentna realizacija koristi supstituciju amino kiselina i/ili deleciju i/ili umetanje i/ili dodavanje (na koje može da utiče rekombinacija ili sinteza peptida; modifikacije koje obuhvataju duže protezanje amino kiselina mogu da dovedu do fuzije polipeptida). Posebno preferentna verzija ove realizacije je u tehnici opisana u WO 95/05849, gde je opisan postupak za smanjenje autolognih -proteina imunizacijom sa analozima autolognih-proteina gde je veći broj aminokiselinskih sekvenci supstituisan odgovarajućim brojem amino kiselinskih sekvenci od kojih svaka sadrži strane epitop imunodominatne T-ćelije, istovremeno održavajući ukupnu tercijemu strukturu autolognih-proteina u analogu. Za potrebe predmetnog pronalaska, je međutim dovoljno ako modifikacija (bilo umetanje, dodavanje, delecija ili supstitucija) dovodi do stranih epitopa T- ćelija i u isto vreme održava značajan broj epitopa B-ćelija u OPGL-u. Međutim, u cilju dobijanja maksimalne efikasnosti indukovanog imunog odgovora, preferentno je da se celokupna tercijerna strukutra OPGL-a održava u modifikovanom molekulu.

Sledeća formula opisuje građu OPGL -a obuhvaćenu u opštim crtama predmetnim pronalaskom:

-gde su OPGLei-OPGLex, epitopi x B-ćelija koji sadrže naknadne OPGL koji su nezavisno identični ili neidentični i koji mogu da sadrže strane bočne grupe ili da ih ne sadrže. x je broj > 3, nl-nx su x i brojevi<>>0 (najmanje jedan je 1), MOD|-MODxsu modifikacije x uvedene između epitopa očuvanih B-ćelija iSi-sxsu x brojevi<>>0 (najmanje jedan je 1 ako bočne grupe nisu uvedene u sekvencu OPGLe). Tako, imajući u vidu opšta funkcionalna

ograničenja imunogenosti konstrukata, pronalazak dozvoljava sve vrste permutacija originale sekvenceOPGL-a, i sve vrste njihovih modifikacija. Tako, predmetnim pronalaskom su obuhvaćene modifikacije OPGL -a dobijene izostavljanjem delova OPGL sekvence koje npr. pokazuju štetne efektein vivoili izostavljenjem delova koji su normalno intracelularni i prema tome mogu da pospeše neželjene imunološke reakcije.

Ovde je opisano održavanje glavne frakcije epitopa B-ćelije ili čak celokupne tercijerne strukture proteina koja je podvrgnuta modifikaciji i može se postiči na nekoliko načina. Jedan je jednostavno pripremiti poliklonalni anti- serum usmeren na OPGL (npr. antiserum pripremljen u zecu) i dalja upotreba ovog antiseruma kao reagensa za testiranje (ispitivanje) (npr. u kompetitivnoj ELISA) na modifikovane proteine koji su proizvedeni. Za modifikovane verzije (analozi) koje reaguju u istoj meri sa antiserumom kao i OPGL mora se smatrati da imaju istu celokupnu tercijernu strukturu kao OPGL dok se za analoge sa ograničenom (ali još uvek značajnom i specifičnom) reaktivnošću sa datim antiserumom smatra se da održavaju suštinsku frakciju originalnih epitopa B- ćelija.

Alternativno, deo monoklonalnih antitela koji reaguju sa udaljenim epitopima OPGL-a mogu se pripremiti i koristiti kao test paneli. Ovaj pristup ima prednost u tome što omogućava 1) mapiranje epitopa OPGL-a i 2) mapiranje epitopa koji se održavaju u pripremljenim analozima.

Naravno, treći pristup bi bio resiti 3-dimenzionalnu strukturu OPGL -a ili njegov biološki aktivan skraćeni deo (cf. prethodno) i uporediti ovaj sa rešenom trodimenzionalnom strukturom pripremljenih analoga. Trodimenzionalna strukutra se može resiti uz pomoć rengenske difraktometrijske analize i NMR-spektroskopije. Dodatne informacije koje se odnose na tercijernu strukturu mogu se donekle dobiti na osnovu ispitivanja cirkulamog dihroizma (CD) koji ima tu prednost da zahteva samo čist oblik polipeptida (dok rendgenska difraktometarska analiza zahteva kristalisani oblik polipeptida i NMR zahteva izotopske varijante polipeptida) u cilju obezbeđivanja korisnih informacija o tercijernoj strukturi datog molekula. Međutim, na kraju su rendgenska difraktometarska analiza i/ili NMR, su neophodne za dobijanje konačnih podataka dok cirkularni dihroizam (CD) može da obezbedi samo neposredne dokaze tačne 3-dimenzionalne strukture preko informacije o elementima sekundarne strukture.

Jedan preferentan pristup pronalaska obuhvata prezentacije epitopa B-limfocita OPGL-a (tj. formula 1 gde je bar jedan epitop B-ćelije prisutan na dva mesta). Ovaj efekat se može postići na različite načine, npr. jednostavnim pripremanjem fuzionih polipeptida strukture (OPGL) m, gde je m broj > 2 i zatim uvesti modifikacije opisane u ovom tekstu u bar jednu od OPGL sekvenci. Preferentno je da uvedena modifikacija obuhvata bar jedno umnožavanje epitopa B-limfocita i/ili uvođenje haptena.

Kao što je prethodno rečeno, uvođenje stranog epitopa T-ćelije može se postići uvođenjem umetanja, dodavanja, delecije ili supstitucije bar jedne aminokiseline. Naravno, normalna situacija bi bila uvođenje jednog ili više izmena u aminokiselinskoj sekvenci ( npr. umetanje ili supstitucija kompletnog epitopa T-ćelije) ali važan cilj koji treba postići je da će analog OPGL-a, kada je procesiran antigen- prezentujućom ćelijom (APC), izazvati epitop imunodominantne T-ćelije prezentovan u sklopu MCH molekula Klase II na površini APC-a. Tako, ako aminokiselinska sekvenca OPGL -a na odgovarajućem položaju obuhvata brojne aminokiselinske ostatke koji se takođe mogu naći u stranim Tuepitopima, onda se uvođenje stranog Thepitopa može postići obezbeđivanjem preostalih amino kiselina stranog epitopa umetanjem, dodavanje, delecijom i supstitucijom aminokiseline. Drugim rečima, nije neophodno uvesti kompletni Th epitop umetanjem ili supstitucijom u cilju ispunjavanja cilja predmetnog pronalaska.

Preferentno je da je broj umetanja, delecija, supstitucija ili adicija amino kiselina, najmanje 2, kao i 3.4,5,6,7,8,9,10,11,12,13.14,15,16,17.18,19. 20 i 25 umetanja, supstitucija, adicija ili delecija . Dalje je preferentno da broj aminokiselinskih umetanja, supstitucija, adicija ili delecija ne prelazi 150, najviše 100, najviše 90, najviše 80 i najviše 70. posebno je preferentni da broj supstitucija, umetanja, delecija ili adicija ne prelazi 60,a posebno kada ovaj broj ne prelazi 50 ili čak 40. Najpreferentnije je da ovaj broje ne prelazi 30. Što se tiče adicija amino kiselina, treba napomenuti da, kada je rezultujući konstrukt u obliku fuzionog polipeptida, često je znatno veći od 150.

Preferentne realizacije pronalaska obuhvataju modifikaciju uvođenjem bar jednog stranog epitopa imunodominantne T-ćelije. Treba napomenuti da pitanje imune dominancije epitopa T-ćelije zavisi od ispitivane životinjske vrste. Kao što je ovde upotrebljeno, izraz "imunodominancija" se jednostavno odnosi na epitope koje u vakcinisanoj jedinki/po pulaciji izazivaju značajan imuni odgovor, ali je veoma poznata činjenica da epitop T-ćelije koji je imunodominantan u jednoj jedinki/populaciji, ne mora da bude imunodominantan u drugoj jedinki iste vrste, iako možda može da veže molekule MHC-II kod ovih jedinki. Tako, za potrebe predmetnog pronalaska, imunodominantan epitop T-ćelije je epitop T-ćelije koji efikasan u obezbeđivanje pomoći T-ćeliji kada je prisutan u antigenu. Tipično, epitopi imunodominantne T-ćelije imaju svojstvene karakteristike koje će u suštini uvek biti prezentovane vezano za molekule MHC klase II, bez obzira na polipeptide u kojima se pojavljuju.

Drugo važno stanovište je pitanje restrikcije (ograničenja) MHC epitopa T- ćelije. Generalno, prirodni epitopi T-ćelije su ograničeni MHC-om (MHC-ograničeni), tj. određeni peptiđi koji sadrže epitope T- ćelije će efikasno biti vezani samo za podgrupu molekula MHC klase U. Ovo za uzvrat ima efekat u mnogim slučajevima da će primena jednog specifičnog epitopa T-ćelije, rezultovati u komponenti vakcine koja je samo efikasna u delu populacije i u zavisnosti od veličine ove frakcije, može biti neophodno da se uključi više epitopa T-ćelije u isti molekul, ili alternativno pripremiti multikomponentnu vakcinu gde su komponente varijante OPGL-a koje se međusobno razlikuju po prirodi uvedenih epitopa T-ćelije.

Ukoliko je primenjeno ograničenje MHC T-ćelije u potpunosti nepoznato (na primer u situaciji gde vakcinisana životinja ima slabo definisan sastav MHC), deo populacije obuhvaćen specifičnim sastavom vakcine se može odrediti pomoću sledeće formule

-gde je pifrekventnost u populaciji odgovara na zahtev/<h>stranih epitopa T-ćelije prisutnih u sastavu vakcine i n je ukupan broj stranih epitopa T-ćelije u vakcini. Tako, u sastav vakcine ulaze 3 strana epitopa T-ćelije sa frekvencijom odgovor u populaciji: 0.8,0.7, i 0.6, dajući: -tj.. 97.6 procenata populacije će statistički podići MHC-II posredovan odgovor na vakcinu.

Gornja formula se ne može primeniti na situacije gde je poznat manje ili više tačan model restrikcije MHC peptida. Ako, na primer, određeni peptid vezuje samo humane MHC-II molekule kodirane sa HLA-DR alelima DRI, DR3, DR5 i DR7, onda će primena ovog peptida zajedno sa drugim peptidom koji vezuje preostale molekule MHC-11 kodirane sa HLA-DR alelima, postići 100% pokrivenost u ispitivanoj populaciji. Slično, ukoliko drugi peptid samo veže DR3 i DR5 dodavanje ovog peptida uopšte neće povećati pokrivenost. Ukoliko se izračunavanje odgovora populacije zasniva samo ograničenju epitopa T-ćelije na MHC u vakcini, deo populacije pokrivene specifičnom kompozicijom vakcine se može odrediti pomoću sledeće formule: -gde je (p„ suma, u populaciji, frekventnosti alelinih haplotipova koji kodiraju MHC molekule koji vezuju jedan od epitopa T-ćelije u vakcini i koji pripadaju fh od 3 poznata HLA lokusa (DP, DR i DQ); u praksi, prvo se odredi koji će molekuli MHC prepoznati svaki epitop T- ćelije u vakcini i zatim se ovi poredaju po vrsti (tipu) (DP, DR i DQ)- zatim individualne frekvencije različitih navedenih alelnih haplotipova je sumrano dato za svaki tip, dajući tako (<p>i,<<>p2<i<>P3.

Može se desiti davrednost piu formuli II premaši odgovarajuću teorijsku vrednost 11,:

- gde jeujzbir, u populaciji, frekventnosti alelnih haplotipova koji kodiraju molekule MHC koji vezujui<lh>epitope T- ćelije u vakcini i kojipripadaju j' hod 3 poznata HLA lokusa (DP, DR i DQ). Ovo znači da u 1 -Dj populacije, frekventnost odgovora na zahtev ^ đv^ r (Pr ITiVO- Oj). Shodno tome, formula III se može podesiti tako da se dobija formula V: -gde je izraz l-freSidUai-/ podešen na nulu, a u slučaju da negativne vrednosti. Treba napomenuti da formula V zahteva da su svi epitopi haplotip mapirani na suprot identičnim setovima halotipova.

Shodno tome, prilikom odabiranja epitopa T-ćelije koji se uvodi u analog OPGL-a, važno je primeniti sve raspoloživo znanje o epitopima: 1) frekvenciju odgovora na zahtev svakog epitopa u populaciji, 2) podaci o MHC ograničenjima, i 3) frekvencija relevantnih halotipova u populaciji.

Postoje brojni prirodni "slobodnih "epitopi T- ćelija koji su aktivni kod velikog broja jedinki životinjskih vrsta ili životinjskih populacija i koji su preferentno dodati u vakcinu smanjujući tako potrebu za velikim brojem različitih analoga OPGL-a u istoj vakcini.

Slobodni epitop može prema pronalasku da bude prirodan epitop humane T-ćelije kao što su epitopi iz tetanus toksoida (npr. P2 i P30 epitopi), difterija toksoida, hemaglutinin (HA) Influenza virusa iP. falciparumCS antigena.

Tokom godina identifikovan je veliki broj drugih slobodnih promiskuitetnih epitopa T-ćelije. Posebno su identifikovani peptidi koji mogu da vezuju velike delove HLA-DR molekula koje kodiraju različiti aleli HLA-DR-a i ovo su svi mogući epitopi T-ćelije za uvođenje u OPGL analoge primenjene prema predmetnom pronalasku. Cf. takođe epitopi opisani u sledećim referencama koje su ovde date date referencom: WO 98/23635 (Frazer IH et al., assigned to The Universitv of Queensland); Southvvood S et. al, 1998, J. Imunol. 160: 3363-3373; Sinigaglia F et alT, 1988, Nature 336: 778-780; Chicz RM et al, 1993, J. Exp. Med 178: 27-47; Hammer J et al., 1993, Cell 74: 197-203; and Falk K et al., 1994, Imunogenetics 39: 230-242. Poslednja referenca opisuje i HLA-DQ i DP ligande. Svi epitopi navedeni u ovih 5 referenci su relevantni kao kandidati prirodnih epitopa za primenu u predmetnom pronalasku, budući da svi epitopi dele iste motive sa ovima.

Alternativno, epitope može biti bilo koji veštački epitop T-ćelije koji može da veže veliki deo molekula MHC klase II. U ovom kontekstu, peptidi par DR epitopa ("PADRE") opisani u 95/07707 i u odgovarajućem tektu Alexander J et al., 1994, Immunitv 1: 751-761 (oba otrkića su data referencom) su zanimljivi kandidati za epitope za primenu prema predmetnom pronalasku. Treba napomenuti da najefikasniji PADRE peptidi opisani u ovim tekstovima nose D-aminokiseline na C-i N-krajevima u cilju poboljšanja stabilnosti prilikom administracije. Međutim, predmetni pronalazak prvenstveno ima za cilj inkorporaciju relevantnih epitopa kao delova modifikovanog OPGL -a koji bi trebalo naknadno da bude enzimatski razložen unutar lizozomalnog dela APCa kako bi omogućio naknadnu prezentaciju u sklopu MHC-II molekula i shodno tome nije celishodno inkorporirati D-amino kiseline u epitope upotrebljene u predmetnom pronalasku.

Posebno preferentan PADRE peptid je onaj sa aminokiselinskom sekvencom AKFVAAVVTLKAAA ili njegovom imunološki efikasnom podsekvencom. Tako i drugi epitopi koji imaju isti nedostatak MHC ograničenja su preferentni epitopi T-ćelije koji bi trebalo da su prisutni u OPGL analozima upotrebljenim u inventivnim postupcima. Ovi super-slobodni epitopi će omogućiti, za najjednostavnije realizacije predmetnog pronalaska, daje samo jedan modifikovan OPGL prezentovan vakcinisanom životinjskom imunom sistemu.

Kao što je gore opisano, modifikacija OPGL-a takođe može da obuhvati i uvođenje prve grupe čiji je cilj modifikovan OPGL na APC-u ili B-limfocit. Na primer, prva grupa može biti specifični vezujući partner za B-limfocit specifični površinski antigen ili APC specifični površinski antigen. Mnogo specifičnih površinskih antigena je poznati u tehnici. Na primer, grupa može biti ugljenihidrat za koji postoji receptor na B-limfocitu ili APC (npr. manan ili manoza). Alternativno, druga grupa može biti hapten. Takođe, kao prva grupa može se upotrebiti fragment antitela koji posebno prepoznaje površinu molekula na APC-ima ili limfocitima (površina molekula može da bude npr. FCy receptor makrofaga i monocita. poput FCyRI ili, alternativno bilo koji specifični površinski marker poput CD40 ili CTLA-4). Treba napomenuti da se svi ovi primeri ciljnih molekula takođe mogu upotrebiti kao deo adjuvansa, videti u daljem tekstu.

Kao alternativa ili dodatak ciljanju modifikovanih OPGL polipeptida na određene vrste ćelija u cilju postizanja pojačanog imunog odgovora, moguće je povećati nivo odgovornosti imunog sistema uključivanjem gore pomenute druge grupe koja stimuliše imuni sistem. Tipični primeri drugih grupa su citokini i proteini toplotnog šoka( eng. heat- shock proteins ( hsps))ili molekularni šaperoni( engl. ehaperones),kao i njihovi efikasni delovi.

Odgovarajući citokini za primenu prema predmetnom pronalasku su oni koji noramlano deluju kao adjuvansi u kompoziciji vakcine, tj. na primer interferony(lFN-y), interleukin 1 (IL-1), interleukin 2 (IL-2), interleukin 4 (IL- 4), interleukin 6 (IL-6), interleukin 12 (IL-12), interleukin 13 (IL-13), interleukin 15 (IL-15) i faktor koji stimuliše granulocit-makrofagnu koloniju (GM-CSF); alternativno, funkcionalni deo molekula citokina može biti dovoljan kao druga grupa. Po pitanju primene ovih citokina kao adjuvantnih supstanci, cf. opisano u daljem tekstu.

Prema pronalasku, pogodni proteini toplotnog šoka ili molekularni šaperoni upotrebljeni kao druga grupa mogu biti HSP70, HSP90, HSC70, GRP94 (takođe poznat kao gp96, cf. Wearsch PA et al. 1998, Biochemistry 37: 5709-19), i CRT (karletikulin,eng.

carleticuliri).

Alternativno, druga grupa može biti toksin, poput listeriolicina (LLO), lipida A i toplotno-labilnog enterotoksina. Takođe, broj mikobakterijskih derivata poput MDP -a (muramil dipeptida), CFA (kompletan Freund's-ov adjuvans) i disetri trehaloze TDM i TDE su interesantne opcije.

Takođe, mogućnost uvođenja treće grupe koja koja poboljšavan prezentaciju modifikovanog OPGL -a imunom sistemu je važna realizacija predmetnog pronalaska. Stanje tehnike je pokazalo nekoliko primera ovog principa. Na primer, poznato je da palmitoil, anker lipidacije u OspA proteinuBorrelia burgdorferise može upotrebiti tako da obezbedi autologne-adjuvatne polipeptide (cf. npr. WO 96/40718)- izgleda da lipidizovani proteini obrazuju strukture slične micelama sa jezgrom koje se sastoje od delova polipeptida lipidizovanih ankera i preostalih delova molekula koji iz njih vire. rezultujući u multiploj prezentaciji antigenskih determinanti. Tako, upotreba ovih i srodnih pristupa primene različitih ankera lipidacije (npr. miristil grupa, miristil grupa, farnezil grupa, geranil-geranil grupa, GPI-anker i N-acil diglicerid grupa) su preferentne ralizacije pronalaska, naro;ito što obezbeđivanje ovakvih ankera lipidacije u rekombinantno proizvedenom proteinu je sasvim jasno i zahteva primenu npr. prirodnih signalnih sekvenci kao fuzionih partnera za modifikovane OPGL polipeptide. Druga mogućnost primene C3d fragmenta komplementarnog faktora C3 ili samog C3 (cf. Dempsey et al, 1996, Science 271,348-350 and Lou & Kohler, 1998, Nature Biotechnology 16,458-462).

Alternativna realizacija pronalaska koji rezultuje u preferentnoj prezentaciji multiplih (npr. najmanje 2) kopije važnih delova epitopa OPGL-a imunom sistemu je kovalentno kuplovanje OPGL-a, podsekvence ili njihove varijante za određene molekule. Na primer, mogu se upotrebiti polimeri, npr. ugljenihidrati poput dekstrana, cf. npr. Lees A et al., 1994, Vakcine 12: 1160-1166; Lees A et al., 1990, J Imunol. 145: 3594-3600, ali takođe su korisne alternative i manoza i manan. Integralni proteini membrane u npr.E. colii drugim bakterijama su takođe korisni partneri za konjugaciju. Tradicionalni molekuli nosači poput hemocijanina mekušaca( eng. keyhole limpet hemocyanine ( KLH)),tetanus toksoid, dfteria toksoid i goveđi serum albumina (BSA) su takođe preferentni i korisni konjugacioni partneri. Određene oblasti prirodnog OPGL-a izgledaju kao najprogonije za većinu obaljenih modifikacija. Budući da strukturni odnos OPGL-a sa TNF-om i drugim članovima iz familije tumour nekrozis faktora, predviđa se da uvođenje epitopa T-ćelije ili drugih modifikaciija u oblastima definisanim položajima 170-192,198-218,221-246,256-261 ili 285-316, (aminokiselinska numeracija SEQ ID NOs: 4,6 i 12) će njaverovatnije dati željene rezultate. Ovi položaji se odnose na misije OPGLodgovarajući položaji u molekulu čoveka su 171-193,199-219,222-247,257-262 i 286-317 ( aminokiseilnska onumeracija SEQ ID NO: 2).

Razmatranja koja leže u osnovi ovih odabranih oblasti su a) očuvanje poznatih i predviđenih epitopa B-ćelije, b) očuvanje tercijerne strukture itd. U svakom slučaju, kao što je prethodno dato, prilično je jednostavno izvesti skrining seta modifikovanih OPGL molekula koji su svi izloženi uvođenjem epitopa T-ćelije na različitim mestima.

Budući da najpreferentnije realizacije predmetnog pronalaska obuhvataju smanjenje humanog OPGL-a, prema tome je poželjno daje ranije opisan OPGL polipeptid, humani OPGL polipeptid. U ovoj realizaciji, posebno je preferentno daje humani OPGL polipeptid modifikovan supstitucijom najmanje jedne aminokiselinske sekvence u SEQ ID NO: 2 (ili u polipeptidu gde je Cys-221 u SEQ ID NO: 2 supstituisan serinom) najmanje jednom aminokiselinskom sekvencom iste ili različite dužine i sadrži strani THepitop. Supstituisani aminokisleinski ostatci su odabrani od ostataka 257-262,289-303 i 222-243 u SEQ ID NO: 2. Logička osnova koja leži u osnovi ovoga je detaljno opisana u primerima.

Formulacija OPGL - a i modifikovani OPGL polipeptidi

Prilikom izvođenja prezentovanja OPGL polipeptida ili modifikovanog OPGL polipeptida imunom sistemu životinja administracijom životinjama, formulacija polipeptida sledi principe koji su opšte priznati u tehnici.

Preparati vakcina koji kao aktivne sastojke sadrže peptidne sekvence generalno je dobro poznato u tehnici i dato primerima u U. S. Patentima 4,608,251; 4,601,903; 4,599,231; 4,599,230; 4,596,792 i 4,578,770, svi dati referencom. Tipično, ove vakcine su pripremljene kao preparati koji se injektiraju ili kao tečni rastvori ili kao suspenzije; čvrsti oblici pogodni za rastvaranje u, ili suspenzije u, tečnosti pre injektiranja takođe se mogu pripremiti. Preparati se mogu i emulgovati. Aktivni imunogeni sastojak je često pomešan sa ekspijensima koji su farmaceutski prihvatljivi i kompatibilni sa aktivnim sastojkom. Odgovarajući eksipijensi su, na primer, voda, rastvor soli, dekstroza, glicerol, etanol ili slično i njihove kombinacije. Dodatno, po potrebi, željena vakcina može da sadrži manje količine pomoćnih supstanci kao što su pomoćne supstance poput okvašivača ili emulgatora, reagenasa za podešavanje pH, ili adjuvanasa koji pospešuju efikasnost vakcina; cf.detaljan pregled adjuvanasa dat u daljem tekstu.

Vakcine su konvencionalno administriraju parenteralno, injekcijom, na primer ili subkutalno, intrakualno, intrademralno, subdermalno ili intramuskularno. Dodatne formulacije koje su pogodne za druge načine administracije su supozitoriji i u nekim slučajevima i oralne, bukalne, sublingvalne, intraperiotenalne, intravaginalne, analne, epiduralne, spinalne i intrakranialne formulacije. Za supozitorije, mogu se upotrebiti i tradicinalna vezivna sredstva i nosači, na primer, polialkalen glikoli ili trigliceridi; ovi supozitoriji se mogu dobiti od smeša koje sadrže aktivne sastojke i količini od 0.5% do 10%, preferentno 1-2%. Oralne formulacije sadrže uobičajene eksipijense kao što su, na primer, manitol, laktoza, škrob, magnezijum stearat, natrijum saharin, celuloza, magnezijum karbonat farmaceutskog stepena čistoće i slični. Ove kompozicije mogu biti u obliku rastvora, suspenzija, tableta, pilula, kapsula, formulacije sa kontinuiranim oslobađanjem ili u obliku praškova i sadrži 10-95% aktivnog sastojka, preferentno 25-70%. Za oralnu formulaciju, kolera toksin je interesantan partner za formulaciju (i takođe moguć partner za konjugaciju).

Polipeptidi se mogu formulsiati u vakcine kao neutralni ili u obliku soli. Farmaceutski prihvatljive soli su adiđone soli (dobijene sa slobodnim amino grupama peptida) i koje su dobijene sa neorganskim kiselinama, poput, npr. hlorovodonične ili fosforne kiseline, ili sa oraganskim kiselinama poput sirćetne, oksalne, vinske, bademove i slično.

Soli dobijene sa slobodnim karboksilnim grupamam takođe se mogu dobiti od neorganskih baza poput, na primer, natrijum, kalijum, amonijum, kalcijum ili gvožđe hidroksida i organskih baza poput izopropilamina, trimetilamin, 2-etilamino etanola, histidina, prokaina i si.

Vakcine su administerirane na način koji je kompatibilan sa doznom formulacijom i u količini koja je terapeutski efiksana i koja je imunogena Količina koja će se administrirati zavisiće od subjekta koji se leči, uključujući npr.,kapacitet imunog sistema individue da izazove imuni odgovor i stepen željene zaštite. Odgovarajući dozni opseg kreće se od nekoliko stotina mikrograma aktivnog sastojak po vakcinaciji sa poželjnim opsegom od oko O.lug do 2,000 u.g (razmatrane su čak i veće količine od 1-10 mg), odnosno u opsegu od oko 0.5ug do LOOOug, preferentno u opsegu od oko lug do 500ug,a posebno u opsegu od oko \ 0\ ig do lOOug. Odgovarajući režimi za inicijalnu administraciju i dodatne doze vakcine su takođe promenljive, ali tipizirane inicijalnom administracijom, pa zatim tnokulacijom ili drugim administracijama.

Način primene može veoma da varira. Može se primeniti bilo koji konvencionalni način administracije vakcine. Ovo uključuje oralnu primenu na čvrstoj fiziološki prihvatljivoj bazi ili u fiziološki prihvatljivoj disperziji, parenteralno, injekcijom ili slično. Doze vakcine zavisiće od načina adminsitracije i variraće u zavisnosti od godina osobe koja prima vakcinu formulacije antigena.

Neki polipeptidi vakcine su dovoljno imunogeni u vakcini, ali za neke druge, imuni odgovor će biti pojačan ukoliko vakcina sadrži i adjuvanse.

Poznati su različiti postupci postizanja pomoćnog efekta. Opšti principi i postupci opisani u "The Theory and Practical Application of Adjuvants", 1995, Duncan- E. S. Stevvart-Tull (ed.), John Wiley & Sons Ltd, ISBN 0-471- 95170-6, and also in"Vakcines: Nevv Generationn Imunological Adjuvants", 1995, Gregoriadis G et al. (eds.), Plenum Press, Nevv York, ISBN 0-306-45283-9, i ovde dati referencom.

Posebno je poželjno upotrebiti adjuvans koji može da izazove prestanak autotolerancije na autoantigene; u stvari, ovo je od velike važnosti u slučajevima gde je u autovakcini kao aktivna komponenta upotrebljen nemodifikovan OPGL. Neograničavajući primeri odgovarajućih adjuvanasa su odabrani iz grupe koju čine imuno-ciljajući adjuvansi; imuno-modulirajući adjuvans poput toksina, citokina i mikobakterijski derivati; uljana formulacija, polimer; adjuvans koji formira micele; saponin; imunostimulirajući kompleks matriks (ISCOM matriks); partikula; DDA; aluminijum adjuvansi; DNK adjuvansi; y-inulin i adjuvans u kapsuli. Generalno bi trebalo napomenuti da otkrića koja se odnose na jedinjenja i agense korisne kao prve, druge i treće grupe u analozima takođe se mutatis mutandis odnose i na njiihovu primenu u adjuvansima vakcine predmetnog pronalaska.

Upotreba adjuvanasa obuhvata primenu agensa popuz aluminijum hidroksida ili fosfata (alum), obično kao 0.05 do 0.1 postotni rastvor u puferovanom rastvoru soli, smeša sa sintetičkim polimerima ili šećerima (npr. Carbopol@) korišćen kao 0.25 postotni rastvor, agregacija proteina u vakcini primenom toplote pri čemu se temperature kreću u opsegu od 70° do 101°C u periodima od 30 sekundi do 2 minute i takođe je moguća agregacija pomoću regensa za umrežavanje. Takođe se može primeniti agregacija reaktivacijom sa antitelima tretranim pepsinom (Fab fragmenti) na albumin, smeša sa bakterijskom ćelijom poput C.parvumili endotoksinima ili lipopolisaharidnim komponentama gram- negativne bakterije, emulzja in fiziološki prihvatljivom uljanim nosačima poput manid mono-oleata (Aracel A) ili emulzija sa 20 postotnim rastvorom perfluorougljenika (Fluosol-DA) upotrebljen kao blok zamena . Smeša sa uljima. poput skvalena i IFA je takođe poželjna.

Prema pronalasku, DDA (dimetildioktađecilamonijum bromid) je interesantan kandidat za adjuvansa kao i DNK i7-inulin, ali takođe i Freund's -ovi kompletni i nekompetni adjuvansi kao i" quillaja"saponini poput QuilA i QS21 su interesantni kao RIBI. Dalje su mogući monofosforil lipid A (MPL), prethodno navedeni C3 i C3d i muramil dipeptid (MDP).

Formulacije lipozoma su takođe poznate da poseđuju adjuvantne efekte i shodno tome proželjni su lipozomalni adjuvansi prema pronalasku.

Takođe, adjuvansi tipa imunostimulatorm kompleks matriks( ISCOM®matriks) su poželjni izbori prema predmetnom pronalasku, posebno zbog toga što je pokazano da ove vrste adjuvanasa mogu da pospeše regulaciju ekpresije MHC klase II pomoću APCs. ISCOM® matriks se sastoji od (po izboru frakcionisanih) saponina (triterpenoida) iz" Qiiillaja saponaria ",holesterola i fosfolipida. Kad je pomešana sa imunogenim proteinom, dobijena formulacija u obliku čestica je pozanta kao ISCOM čestica (partikula) gde saponin čini 60-70% w/w, holesterol i fosfolipid 10-15% w/w i the protein 10-15% w/w. Detalji o sastavu i primeni imunostimulatornig kompleksa može se npr. naći u gore navedenim knjigama koji se odnose na adjuvanse, ali takođe i u Morein B et al., 1995, Clin. Imunother. 3: 461-475 , a takođe i i u Barr IG i Mitchell GF, 1996, Imunol. and Cell Biol. 74: 8-25 (bvde date referencom) dajući tako korisne instrukcije za priperamanje kompletnih imunostimulatornih kompleksa.

Druga veoma interesantna (i shodno tome, preferentna) mogućnost postizanja adjuvantnog efekta je primeniti tehniku opisanu u Gosselin et al., 1992 (ovde dato referencom). Ukratko, prezentacija relevantnog antigena kao stoje antigen predmetnog pronalaska može se pospešiti konjugacijom antigena za antitela (ili fragmente antitela koji vezuju antigen) protiv Fcy receptora na monocitima/makrofagama. Posebni konjugati između antigena i anti-FcyRI su pokazali da pojačavaju imunogenost za potrebe vakcinacije.

Druge mogućnosti uključuju primenu ciljnih i imuno modulirajućih supstanci (tj. citokine) koje su prethodno pomenute kao kanidati za prvu i drugu grupu u modifikovanim verzijama OPGL-a. U vezi sa ovim, mogućnosti su takođe i sintetički induktori (izazivači) citokina poput poli I: C.

Odgovarajući derivati mikobakterija su odabrni iz grupe koju čine muram.il dipeptid, kompletni Freund's-ov adjuvans, RIBI i diestar trehaloze poput TDM i TDE.

Odgovarajući ciljni imuni adjuvansi su odabrani iz grupe koju Čine ligand CD40 i antitela CD40 ili njihovi specifično vezujući fragmenti (cf.prethodno opisano), manoza, fragment Fab i CTLA-4.

Odgovarajući polimerni adjuvansi su odabrani iz grupe koju čine ugljenihidrati poput dekstrana, PEG-a, škroba, manana i manoze; plastični polimer poput; i lateks poput kuglica od lateksa.

Sledeći interesantan način moduliranja imunog odgovora je uključiti i OPGL imunogen (po izboru zajedno sa adjuvansima i farmceutski prihvatljivim nosačima i prenosnicima) u "virtuelnom limfnom čvoru " (VLN) ( zaštićen medicinski uređaj koji je razvijen: ImunoTherapy, Inc., 360 Lexington Avenue, Nevv York, NY 10017-6501). VLN (tanki cevasti uređaj) oponaša strukturu i funkciju limfnog čvora. Ubacivanje VLN pod kožu stvara sterilno mesto infiamacije razvojem citokina i hemokina. T- i B-ćelije kao i APC brzo reaguju na signale opasnosti, vrate na mesto infiamacije i akumiliraju unutar poroznog matriksa VLN-a. Pokazano je da neophodna doza antigena potrebna za podizanje imunog odgovora na antigen smanjena kada se koristi VLN i da imuna zaštita omogućena vakcinacijom sa VLN koja prevazilazi konvencionalnu imunizaciju pomoću Ribi kao adjuvansom. Tehnologija je npr. opisana in Gelber C et al., 1998,"Elicitation of Robust Cellular and Humoral Immune Odgovors to Small Amounts of Imunogens Using a Novel Medical Device Designateđ the Virtual Limf Node", in:"From the Laboratory to the Clinic, Book of Abstracts, October 12th-15th 1998, Seascape Resort, Aptos, California".

Očekivalo se daće se vakcina amidnistrirati 1-6 puta godišnje, odnosno L2,3,4,5,ili 6 puta godišenje u zavisnosti od individualnih potreba. Prethodno smo pokazali da nije permanentna memorija imuniteta indukovanog primenom preferente autovakcine prema predmetnom pronalasku i shodno tome imuni sistem mora periodično da bude izazavan OPGL-om ili modifikovanim OPGL polipeptidima.

Usled genetskih varijacija, različite individue mogu različito da reaguju sa imunim odgovorima različitih jačina, na isti polipeptid. Shodno tome, vakcina prema pronalasku može da sadrži nekoliko različitih polipeptida u cilju povećanja imunog odgovora, cf. takođe prethodna diskusija o izboru uvođenja stranih epitopa T-ćelije.

Vakcinacija nukleinskim kiselinama

Kao alternativa klasična administracija vakcine sa peptidnom-osnovom, tehnologija vakcinacije nukleinskom kiselinom (poznato i kao " imunizacija nukleinskom kiselina","genetska imunizacija ", i" imunizacija genima") nudi brojne atraktivne karakteri sitke.

Prvo, na suprot tradicionalnom pristupu vakcini, vakcinacija nukelinskim kiselinama ne zahteva izvor za proizvodnju imunogenskog agensa, na veliko (npr. kao industrijska fermentacija mikroorganizama koji proizvode modifikovan OPGL). Dalje, ne postoji uređaj za prečišćavanje i šema za ponovno strukturisanje imunogena. I konačno, budući da se vakcinacija nukelinskim kiselinama zasniva na biohemijskom aparatu vakcinisane jedinke u cilju dobijanja eksprimovanog proizvoda uvedene nukleinske kiseline, očekivano je da dođe do optimalnog posttranslacionog procesiranja eksprimovanog proizvoda; ovo je od posebne važnosti u slučaju auto vakcinacije, budući da bi, kao što je prethodno rečeno, značajnu frakciju epitopa B-ćelije originalnih OPGL trebalo konzervirati u modifikovanim molekulima i budući da epitopi B-ćelije u principu mogu da se sastoje od delova bilo kog (bio) molekula (npr. ugljenihidrat, lipid, protein itd.). Shodno tome, prirodna shema glikozilacije i lipidacije imunogena može biti od važnosti za celokupnu imunogenost i ovo je najbolje osigurano domaćinom koji proizvodi imunogen.

Tako, preferentna realizacija se zaniva na izvođenju prezentacije modifikovanog OPGL-a na imuni sistem, uvođenjem nukleinskih kiselina koje kodiraju modifikovan OPGL u ćelijama životinja i na taj način postićiin vivoekspresiju nukleinskih kiselina u ćelijama.

U ovoj realzaciji, nukelinska kiselina je preferentno DNK, koja može biti u obliku ogoljenje DNK, DNK formulisan sa naelektirsanim ili nenaelekrisanim lipidima, DNK formulisan u lipozome, DNK uključena u virusni vektor, DNK formulisana sa proteinom ili polipeptidom koji olakšava transfekciju, DNK formulisan sa ciljnim proteinom ili polipeptidom, DNK formulisan sa agensom za taloženje kalcijuma, DNK kuplovan sa inertnim molekulom nosača, DNK kapsuliran uhitin ili hitosan i DNK formulisan sa adjuvansom. U ovom kontektu primećeno je da se praktično sva razmatranja koja se odnose na primenu adjuvanasa u tradicionalnoj formulaciji vakcine mogu primeniti na formulacije DNK vakcina. Tako, sva razmatranja koja se odnose na primenu adjuvanasa u sklopu vakcina baziranih na polipeptidu odnose semutatis mutandisna njihovu primenu u tehnologiji vakcinacija nukleinskim kiselinama.

Što se tiče načina administracije i shema administracije vakcina baziranih na polipeptidu koje su prethodno opisane, one se takođe odnose i na vakcine sa nukelinskim kiselinama pronalaska i sva prethodna koja se odnose na način administracije i sheme administracije za polipeptide primenjuju semutatis mutandisna nukleinske kiseline. Ovom treba dodati i to da se vakcine sa nukleinskim kiselinama mogu administrirati intravenozno i intraarterijski. Dalje, u tehnici je dobro poznato da se vakcine sa nukleinskim kiselinama mogu administrirati uz pomoć tzv. genskog pištolja( eng. gene gun),te se tako smatra sa ovaj i ekvivalentni načini administracije, obuhvaćeni predmetnim pronalaskom. Konačno, prijavljeno je da upotreba VLN u administraciji nukleinskih kiselina jdovodi do dobrih prinosa i shodno tome ovaj način administracije je posebno poželjan.

Dalje,nukleinske kiseline upotrebljene kao agensi za imunizaciju, mogu da sadrže delove koji kodiraju l<st>, 2<nd>i /ili 3"<1>grupe, npr. u obliku prethodno opisanih imunomodulirajućih supstanci poput citokina, koji su opisani kao korisni adjuvansi. Preferentna verzija ove realizacije obuhvata kodirajući deo za analog i kodirajući deo za imunomodulator u različitim okvirima čitanja ili bar pod kontrolom različitih promotora. Tako je izbegnuto daje analog ili epitope proizveden kao fuzioni partner za imunomodulator. Alternativno, mogu se upotrebiti dva udaljena nukleotidna frag menta, ali je ovo manje popularno budući da se prednost daje osiguranim ko-eksprimovanjima kada su oba kodirajuća dela (regiona) sadržana u istom molekulu.

Shodno tome, pronalazak se odnosi i na kompoziciju za proizvodnju antitela na OPGL, gde kompozicija sadrži - fragment ili vektor nukelinske kiseline predmetnog pronalaska (cf. ravmatranja o vektorima u daljem tekstu), i - farmaceutski i imunološki prihvatljiv nosač i/ili djuvans kao sto je prethodno razmatrano.

Pod normalnim okolnostima, nukleinska kiselina koja kodira OPGL je uvedena u obliku vektora, pri čemu je ekspresija pod kontrolom viralnog promotora. Za detaljnija razmatranja vektora prema predmetnom pronalasku, cf. u daljem tekstu. Takođe su dostupna detaljna otkrića koja se odnose na formulaciju i primenu vakcina nukleinskih kiselina, cf. Donnelly JJ et al, 1997, Annu. Rev. Imunol. 15: 617-648 and Donnellv JJ et al., 1997, Life Sciences 60: 163-172. data referencama u ovom tekstu.

Žive vakcine

Treća alternativa izvođenja prezentacije modifikovanog OPGL -a na imuni sistem je primena tehnologije žive vakcine. U živim vakcinama, prezentacija imunom sistemu se izvodi administriranjem životinjama, ne-patogenih mikroorganizama koji su transformisani fragmentom nukleinske kiseline koja kodira modifikovan OPGL ili vektorom kojim se inkorporira dati fragment nukleinske kiseline. Ne-patogeni mikroorganizam može biti bilo koji adekvatno oslabljen soj bakterije (oslabljen pasažom ili uklanjanjem patogenih eksprimovanih proizvoda technologijom rekombinantne DNK),npr. Mycobacterium bovisBCG., ne-patogeneStreptococcusspp.,E. coli, Salmonellaspp.,Vibrio cholerae, Shigella,itd.

Pregled dokumenata o poslednjim dostignućima u pogledu ripremanja živih vakcina može se naći npr. u Saliou P, 1995, Rev. Prat. 45: 1492-1496 and Walker PD, 1992, Vakcine 10: 977-990, obe date referencom. Detalji o fragmentima i vektorima nukleinskih kiselina koji su upotrebljeni u živim vakcinama, dati su daljem tekstu.

Kao alternativa bakterijskim živim vakcinama, fragment nukleinske kiseline predmetog pronalaska razmatran u daljem tekstu može se inkorporirati u vektor ne-virulentne (ne-zarazne) virusne vakcine poputvacciniasoja ili drugog pogodnog virusa boginja( eng. pox

virus).

Normalno, ne-patogeni mikroorganizam ili virus je administriran životinji samo jednom, ali u nekim slučajevima potrebno je administrirati mikroorganizam više puta u toku života u cilju održavanja zaštitnog imuniteta. Čak je i razmatrano da raspored imunizacija poput onih opisanih za vakcinaciju polipeptidima , može da bude koristan kada se upotrebljavaju žive vakcine ili virusne vakcine.

Alternativno, živa ili virusna vakcina se kombinuje sa prethodno opisanim polipeptidnim vakcinama ili vakcinama nukelinske kiseline. Na primer, moguće je sprovesti primanu imunizaciju živim vakcinama ili vakcinama virusa, pa zatim dodatnu imunizaciju pomoću polipeptida ili nukleinskih kiselina.

Mikroorganizam ili virus se može transformisati nukleinskom kiselinom (nukleinskim kiselinama) koje sadrže delove koji kodiraju l<2>'. 2<nd>i/ili 3<rd>grupe, npr. u obliku prethodno opisane imunomodulatorne supstance poput citokina koji su razmatrani kao korisni adjuvansi. Preferenta verzija ove realizacije obuhvata kodirajući region za analog i kodirajući region za imunomodulator u različitim okvirima čitanja ili bar pod kontrolom različitih promotora. Tako je izbegnuta situacija gde su analog ili epitopi proizvedeni kao fuzioni partneri za imunomodulator. Alternativno, dva udaljena nukleotidna fragmenta se mogu koristiti kao agensi za transformisanje. Naravno, sa l<st>i/ili 2<nd>i/ili 3,<d>grupama u istom okviru čitanja može da obezbedi eksprimovanje proizvoda, analoga pronalaska i ova realizacija je posebno preferentna prema predmetnom pronalasku.

Upotreba postupka predmetnog pronalaska u lečenju bolesti

Kao što se vidi iz prethodnih razmatranja, obezbedivanje postupka pronalaska omogućava kontrolu nad bolestima koje su okarakterisane velikim gubitkom mase kostiju. U ovom smislu, bolest osteoporoza je ključni cilj za inventivni postupak, ali takođe i gubitak kosti koji je povezan sa kompiikovanim frakturama kostiju je ostvariv cilj za lečenje/ poboljšanje. Dakle, važna realizacija postupka pronalaska smanjenje aktivnosti OPGLa obuhvata lečenje i/ili prevenciju i/ili ublaženje osteoporoze ili drugih stanja okarakterisanih većom resorpcijom kostiju, postupak obuhvata smanjenje aktivnosti OPGL-a prema postupku predmetnog pronalaska u toj meri daje značajno smanjena brzina resoprcije kostiju.

U ovom kontekstu , značajno smanjenje u resorpciji kostiju iznosi najmanje 3% u poredenju sa patološkom brzinom, ali su razmatrani i veći procenti, kao recimo najmanje 5%, najmanje 7%, najmanje 9%, najmanje 11%, najmanje 13%, najmanje 15%, i najmanje 17%, pa Čak su očekivani i veći procenti, kao npr. jamanje 20%, pa čak i najmanje 30%. Posebno je poželjno da smanjenje u resorpciji kostiju rezultuje u inverziji razvnoteže između stvaranja kostiju i resorpcije kostiju, tj. da brzina stvaranja prevazilazi brzinu resorpcije. Naravno, ovu neravnotežu ne bi trebalo održavati (jer bi za rezultat imala osteoporozu), već pažljivo kontrolisati broj i imunološki učinak imunizacija obolelih pojedinaca, moguće je obezbediti ravnotežu tokom vremena što rezultuje u neto konverziji koštane mase. Alternativno, ukoliko se u pojedničanom postupku pronalaska ne može prekinuti gubitak kostiju, postupak pronalaska može (po izboru u kombinaciji sa drugim poznatim postupcima za smanjenje gubitka koštane mase kod pacijenata obolelih od osteoporoze)se upotrebiti za postizanje značajnog smanjenja gubitka koštane mase, produžavajući tako vreme tokom kojeg je kod pojedinica prisutna dovoljna gustina kostiju.

Postupci za merenje brzine resorpcije i stvaranja koštane mase su poznati u tehnici. Moguće je uz pomoć biohemijskih analoga, ispitati brzinu resorpcije kostiju merenjem koncentracije određenih fragmenata kolagenatipa I u krvi (cf. WO 93/15107 i WO 94/14844). Alternativno, brzina gubitka koštane mase može se proceniti fizičkim načinima, reprezentativna otkrića u tehnici koji se odnose na postupke za procenu koštane mase pomoću neizvazivnih fizičkih postupaka mogu se naći u WO 88/06862, WO 94/12855, WO 95/14431 i WO 97/00643.

Peptidi, polipeptidi i kompozicije pronalaska

Iz prethodnog je očigledno, da se predmetni pronalazak zasniva na konceptu imunizacije pojedinaca na OPGL antigen u cilju indirektnog dobijanja smanjene aktivnosti osteoklasta. Preferentan način postizanja ove imunizacije je primena modifikovane verzije OPGL-a,obezbeđujući tako molekule koji nisu perthodno opisani u stanju tehnike.

Treba napomenuti da referentni modifikovani molekuli OPGL-a sadrže modifikacije koje rezlutuju u polipeptidu sa sekvencom identiteta od najmanje 70% OPGL-a ili sa

podsekvencorn dužine najmanje 10 amino kiselina. Preferentne su sekvence, npr. od najmanje 75% ili čak od najmanje 80,85,90 ili 95%. Identitet sekvenci za proteine i nukleinske kiseline može se izračunati kao (Nref-Ndif)T00/Nref, gde je N<nf ukupan broj neidentičnih ostataka u dve sekvence kada se poredaju i gde je Nref, broj ostataka u jednoj od sekvenci. Dakle DNK sekvenca AGTCAGTC će biti 75% identična sa sekvencom AATCAATC (Nti,f=2 i Nref=8).

Ovaj pronalazak se prvenstveno odnosi na preparate koji su korisni u ostvarivanju postupka pronalaska. Tako, pronalazak se odnosi i na imunogene kompozicije koje sadrže imunogeno efikasne količine OPGL polipeptida koji je autologni-protein kod životinje, dati OPGL polipeptid je formulisan zajedno sa imunološki prihvatljivim adjuvansom, tako da dovodi do prestanka autotolerancije životinja na OPGL polipeptide, kompozicije dalje sadrže i farmaceutski i imunološki prihvatljiv razblaživač i/ili nosač L/ili prenosnik i/ili eksipiens. Drugim recima, ovaj deo pronalaska se odnosi na formulacije prirodnih OPGL polipeptida koji su opisani u vezi sa realizacijama postupka predmetnog pronalaska.

Pronalazak se takođe odnosi na imunogene kompozicije koje sadrže imunološki efikasne količine prethodno opisanog analoga OPGL, data kompozicija dalje sadrži farmaceutski i imunološki prihvatljiv diluent i/ili nosač i/ili prenosnik. i/ili eksipijens i po izboru adjuvans. Drugim rečima, ovaj deo pronalaska se odnosi na formulacije modifikovang OPGL-a. u osnovi kao što je gore opisano.

Izbor adjuvansa, nosača i prenosnika je shodno tome u u saglasnosti sa onim što je prethodno razmatrano o formulaciji modifikovanog i nemodifikovanog OPGLa za primenu u inventivnom postupku za smanjenje OPGL-a.

Polipeptidi su pripremljeni prema postupcima poznatim u tehnici. Duži polipeptidi su normalno pripremljeni tehnologijom rekombinantnog gena uključujući uvođenje sekvence nukleinske kiseline koja kodira OPGL analog u odgovarajući vektor, transformacija pogodne ćelije domaćina vektorom, eksprimovanje sekvence nukleinske kiseline, regeneracija eksprimovanog proizvoda iz ćelije domaćina ili supematanta ćelijske kulture i naknadnim prečišćavanjem i po izboru daljim modifikovanjem, npr. ponovnim restrukturisanjem ili derivatizacijom.

Kraći peptidi su preferentno pripremljeni poznatih tehnikama sinteze peptida u čvrstoj-ili tečnoj- fazi. Međutim, nedavni napredak u ovoj tehnologiji je prikazao mogućim proizvodnju polipeptida cele dužine i proteina i shodno tome takođe je obuhvaćeno pronalaskom pripremanje dugih konstrukata sintetičkim putem.

Fragmenti i vektori nukelinskih kiselina pronalaska

Iz prethodnih razmatranja očigledno je da se modifikovani OPGL polipeptidi mogu pripremiti tehnologijom rekombinantih gena, ali i hemijskim sintezama ili polusintezama; Ove dve opcije su posebno relevantne kada se modifikacija sastoji do kuplovanja za nosače proteina (poput KLH, difteria toksoid, tetanus toksoid i BSA) i neproteinskih molekula poput polimera ugljenih hidarata i takođe u slučaju kad modifikacija obuvhata dodavanje bočnih lanaca ili bočnih grupa na OPGL polipeptid-izveden peptidni lanac.

U svrhu tehnologije rekombinantih gena i takođe u cilju imunizacije nukleinskom kiselinom, fragmenti nukleinske kiseline koji kodiraju modifikovane OPGL su važni hemijski proizvodi. Tako, važan deo pronalaska odnosi se na fragment nukleinske kiseline koji kodira analog OPGL-a, tj. polipeptid izveden od OPGL-a koji sadrži ili prirodnu OPGL sekvencu na koju je dodat ili u koju je ubačen fuzioni partner ili, preferentnoOPGL izveden polipeptid koji je uveden u strane epitope T-ćelija, umetanjem i/ili dodavanjem, preferentno supstitucijom i/ili delecijom Fragmenti nukleinske kiseline pronalaska su ili DNK ili RNK fragmenti.

Fragmenti nukleinske kiseline pronalaska će normalno biti umetnuti u odgovarajuće vektore formirajući klonirajuće ili ekspresione vektore sa fragmentima nukleinskih kiselina pronalaska; poput novih vektora su takođe deo pronalaska, Detalji koji se odnose na konstrukciju ovih vektora pronalaska će biti diskutovani u kontesktu transformisane ćelije i mikroorganizama u daljem tekstu. Vektori mogu, u zavisnosi od svrhe i vrste primene, da budu u obliku plazmida, faga, kozmida, mini-hromozoma ili virusa, ali takođe je važan vektor i ogoljena DNK koja je eksprimovana samo tranzientno u određenim ćelijama. Poželjni vektori za kloniranje i ekspresiju predmetnog pronalaska mogu da se replikuju autonomono, što omogućuje veliki broj kopija kojima se postiže visok nivo ekpresije ili replikacije za naknadno kloniranje.

Opšti koncept vektora pronalaska obuhvata sledeće elemente u 5'-3'smeru i u operativnom vezivanju: promoter za vođenje ekspresije fragmenta nuklinske kiseline pronalaska, po izboru sekvenca nukleinske kiserlina koja kodira lider peptid koji omogućava sekreciju (u ekstracelularnu fazu ili, po potrebi, u periplazmu) ili integraciju u membranu fragmetna polipeptida, fragmenta nukleinske kiseline pronalaska i po izboru sekvenca nuklinske kiseline koja kodira terminator. Prilikom rada sa vektorima ekspresije u proizvodnim sojevima ili ćelijskim linijama u cilju genetske stabilnosti transformisanih ćelija preferentno je da vektor uveden u ćeliju domaćina je integrisan u genom ćelije domaćina. Na suprot tome, prilikom rada sa vektorima koji se koriste za uticaj nain vivoekspresiju kod žiivotinje (tj. kada se koristi vektor u DNK vakcinaciji) iz bezbednosnih razloga, preferentno je da vektor nema nesposbnost integracije u genom ćelije domaćina; tipično, koriste se ogoljena DNK ili ne-integrisani virusni vektori, poznati u tehnici, a koje bira prosečni stručnjak.

Vektori pronalaska upotrebljeni u predmetnom pronalasku su upotrebljeni za transformaciju ćelije domaćina u cilju proizvodnje modifikovanog OPGL polipeptida pronalaska . Ovako transformisane ćelije, koje su takođe deo pronalaska, mogu biti kultivisane ćelije ili ćelijske linije upotrebljene za propagaciju fragemnata nukleinskih kiselina i vektora pronalaska ili upotrebljeni za rekombinantnu proizvodnju modifiokvanih OPGL polipeptida pronalaska. Alternativno, transformisane ćelije mogu biti pogodni sojevi živih vakcina gde je fragment nukleinske kiseline (jedna ili višestruke kopije) su umetnute tako da utiču na sekreciju ili integraciju u bakterijsku membranu ili ćelijski zid modifikovanog OPGL-a.

Preferentne transformisane ćelije pronalaska su mikroorganizmi poput bakterija (poput vrstaEscherichia[npr.E. col i, Bacillus[npr.Bacillus subtilis, SalmonellailiMycobaclerium[preferentno ne-patogena. npr.M. bovis BCG)),kvasac (poputSaccharomyces cerevisiae)i protozoani. Alternativno, transformisane ćelije su izvedene iz višećelijskih organizama poput gljiva, ćelija insekta, ćelije biljke ili ćelije sisara. Naj referentnu'e su ćelije izvedene iz. čoveka, cf.razmatranja ćelijskih linija i vektora u daljem tekstu. Poslednji rezlutati puno obećavaju u pogledu primene komercijalno dostupne ćelijske linijeDrosophila melanogaster (Schneider 2 (S2) i sistem vektoar odInvitrogen- d)za rekombinantnu proizvodnju polipeptida u laboratoriji prijavioca i shodno tome ovaj sistem ekspresije je posebno preferentan.

U svrhu kloniranja i/ili optimizovane ekspresije takođe je preferentno daje transformisana ćelija sposobna za replikaciju fragmenta nukleinske kiseline pronalaska. Ćelije koje eksprimuju fragment nukelinske kiseline su preferentne realizacije pronalaska; mogu se upotrebiti ua pripremanje modifikovanih OPGL-a na malo i veliko ili uslučaju n-patogenih bakterija , kao komponente vakcine u živim vakcinama.

Prilikoma proizvodnje modifikovanog OPGL pronalaska pomoću transformisanih ćelija, pogodno je, ali daleko od neophodnog, daje proizvod ekspresije eksportiran u hranljivi medijum ili prenesen na površinu transformirane ćelije.

Kada je identifikovan efikasan proizvođač ćelije, preferentno je ustanoviti stabilne ćelijske linije koje nose vektor pronalaska i koji eksprimuje fragment nukleinske kiseline koji kodira modifikovan OPGL. Preferentno, ova stabilna ćelijska linija luči ili nosi analog OPGL-a pronalaska, omogućavajući tako njegovo prečišćavanje.

Generalno, plazmid vektori koji sadrže replikon i kontrolne sekvence koje su izvedene iz vrsta kompatibilnih sa ćelijom domaćinom, su upotrebljene u vezi sa domaćinima. Vektor obično nosi mesto replikacije, kao i sekvence za obeležavanje koje su u mogućnosti da obezbede fenotipnu selekciju u transformisanim. ćelijama. Na primer,E. colijeobično transformisana pomoću pBR.322, a plazmid izveden iz sojevaE. coli(videti npr., Bolivar et al, 1977). pBR322 plazmid sadrži gene za rezistenciju na ampicilin i tetraciklin i tako omogućava jednostavan način za identifikaciju transformisanih ćelija. pBR plazmid ili drugi mikrobiološki plazmid ili faga mora takođe da sadrži ili da bude modifikovan tako da sadrži promotore koje mogu da koriste prokariotski mikroorganizmi za ekspresiju.

Ovi promotori, najčešće upotrebljeni u građenju rekombinantne DNK su B-iaktamaza (penicilinaza) i sitemi promotora laktoze (Chang et al., 1978; Itakura et al., 1977; Goeddel et al., 1979) i sistemi promotora triptofana (trp) (Goeddel et al., 1979; EP-A-0 036 776). Dok su ovi najčešće upotrebljivani, otkriveni su i upotrebljeni drugi mikrobiotski promotori, i objavljeni su detalji o njihovim nukleotidnim sekvencama, omogućujući prosečnom stručnjaku da ih funkcionalno poveže sa plazmidnim vektorima (Siebwenlist et al., 1980). Određeni geni iz prokariota, mogu se efiksano eksprimovati uE. coliiz svojih promotorskih sekvenci, eliminišući tako potrebu za dodavanjem drugog promotora veštačkim sredstvima.

Pored prokariota, eukariotski mikrobi, poput kultura kvassa se takođe mogu upotrebiti

i ovde bi trebalo da promotor može da vodi ekspresiju.Saccharomyces cerevisiaseili pekarski kvasac je najčešće upotrebljavan od eukariotksih mikroorganizama, mada obično na raspolaganju stoji veliki broj drugih sojeva. Za ekspresiju uSaccharomyces,obično se koristi, na primer, plazmid YRp7 (Stinchcomb et al., 1979 ; Kingsman et al., 1979; Tschemper et al., 1980). Ovaj plazmid već sadrži gen trpi koji obezbeđuje selekcioni marker za mutantni soj kvasca koje nedostaje sposobnost da raste u triptofanu na primer, ATCC No. 44076 ili PEP4-1 (Jones, 1977). Prisustvo trpi lezija kao karakteristika genoma ćelije domaćina kvasca, tada obezbeđuje efikasnu okolinu za detektovanje transformacija rastom u odsustvu triptofana.

Odgovarajući promotorski nizovi u vektorima kvasca su promotori za 3-fosfoglicerat kinazu (Hitzman et al., 1980) ili druge glikolitičke enzime (Hess et al., 1968; Holland et al., 1978), poput enolaza, gliceralđehid-3-fosfat dehidrogenaze, hekdokinaze, piruvat dekarboksilaze, fosfo- fruktokinaze, glukoza-6-fosfat izomeraze, 3-fosfoglicerat mutaze, piruvat kinaze, triozafosfat izomeraze, fosfoglukoza izomeraze i glukokinaze. Prilikom stvaranja odgovarajućih ekspresionih plazmida, terminacione sekvence povezane sa ovim genima su takođe ubačeni u ekspresioni vektor 3' sekvence za koju je poželjno da se eksprimuje u cilju obezbeđivanja poliadenilacije mRNK i terminacije.

Drugi promotori, koji imaju dodatnu prednost transkripcije kontrolisane uslovima rasta su promotor regioni za alkohol dehidrogenazu 2, izocitohrom C, kiselu fosfatazu, degradativne enzime povezane sa metabolizmom azota i gorepomenute gliceraldehide-3-fosfat dehidrogenazu i enzime odgovorne za upotrebu maltoze i galaktoze. Prikladan je bilo koji plazmidni vektor koji sadrži promotor kompatibilan sa kvascem (kvasac- kompatiblni promotor), početak replikacije i terminacione sekvence.

Pored mikroorganizama, takođe se mogu koristiti kao domaćini i kulture ćelija izvedene od multićelijskih organizama. U principu, bilo koja ćelijska kultura je izvodljiva, bilo daje kultura vertebrata ili invertebrata. Međutim, od najvećeg interesa su ćelije vertebrata i propagacija vertebrata u kulturi (kultura tkiva) je postala rutinska procedura poslednjih godina (Tissue Culture, 1973).Primeri ovih korisnih ćehjskih linija domaćina su VERO i HeLa ćelije, ćelijske linije ćelija jajnika kineskog hrčka (CHO) i W138, BHK, COS-7 293, ćelijeSpodoptera frugiperda(SF) (komercijalno dostupne kao kompletni ekspresioni sistemi odi. a.Protein Sciences, 1000 Research Parkvvav, Meriden, CT 06450, U. S. A. i Invitrogen) i ćelijske linije MDCK. U predmetnom pronalasku posebno preferenta ćeli jska lini ja je S2 dostupna od Invitrogen, PO Box 2312,9704 CH Groningen, The Netherlands.

Ekspresioni vektori ovih ćelija obično obuhvataju (po potrebi) početak replikacije, promoter koji se nalazi ispred gena koji se eksprimuje, zajedno sa bilo kojim neophodnim mestima za vezivanje ribozoma, mestima za obradu RNK, mestima za poliadenilaciju i nizove za završavanje transkripije.

Za primenu u ćelijama sisara, kontrolne funkcije ekspresionih vektora su često date

virusnim materijalom. Na primer, uobičajeni promotori su izvedeni od polioma, Adcnovirus 2, i najčešće od Simian Virus 40 (SV40). Ovi promotori SV40 virusa su posebno korisni zato što su oba lako dobijena od virusa kao fragmenta koji takođe sadrži SV40 virusni izvor (poreklo) replikacije (Fiers et al., 1978). Manji ili veći fragmenti SV40 se takođe mogu upotrebiti, pod uslovom daje uključena sekvenca od oko 250 bp koja se pruža od mestaHindlUka mestuBgllkoje se nalazi na virusnom izvoru replikacije. Dalje, takođe je moguće i često je poželjno upotrebiti promotor ili kontrolne sekvence koje su obično povezane sa željenom sekvencom gena, pod uslovom da su kontrolne sekvence kompatiblne sa sistemima ćelije domaćina.

Poreklo replikacije se može obezbediti ili konstrukcijom vektora tako da uključe egzogeni izvor, koji se može na primer izvesti od SV40 ili drugog virusa (npr., Polioma, Adeno, VSV, BPV) ili se može obezbediti mehanizmom hromozomalne replikacije ćelije domaćina. Ukoliko je vektor integrisan u hromozom ćelije domaćina, ovo drugo je često sasvim dovoljno.

identifikacija korisnih OPGL analoga

Prosečnom stručnjaku će biti jasno da nemaju, sve moguće varijante ili modifikacije prirodnog (nativnog) OPGL-a, sposobnost da izazovu antitela kod životinja koja su tinakrsno-reaktivna sa prirodnim oblikom. Međutim, nije teško podesiti efikasni standardni skrining modifikovanih OPGL molekula koju ispunjavaju minimum zahteva za ovde opisanu imunološku reaktivnost. Stoga, drugi deo pronalaska se odnosi na postupak za identifikaciju modifikovanog OPGL polipeptida koji može da indukuje antitela na nemodifikovan OPGL kod životinjskih vrsta gde je nemodifikovan OPGL polipeptid, (ne-imunogeni) autologni-protein, postupak obuhvata

- pripremanje, tehnikama sinteze peptida ili genetskog inžinjeringa, skup (set) uzajamno različitih modifikovanih OPGL polipeptida, gde su amino kiseline, dodate umetnute , izostavljene ili supstituisane u sekvence amino kiselina OPGL polipeptida životinjskih vrsta čime nastaju sekvence amino kiselina u setu koji sadrži epitope T-ćelija stranih životinjskoj vrsti, ili pripremanje seta fragmenata nukleinskih kiselina koji kodiraju set modifikovanih OPGL polipeptida koji se međusobno razlikuju, - testiranje članova skupa modifikovanih OPGL polipeptida ili fragmenata nukleinskih kiselina na njihovu sposobnost da indukuju proizvodnju antitela pomoću životinjskih vrsta na na nemodifikovan OPGL, i - identifikaciju i po izboru izolovanje član(ov)a skupa modifikovanih OPGL polipeptida koji značajno indukuju proizvodnju antitela na nemodifikovane OPGL kod vrsta ili identifikacija i po izbora izolovanje eksprimovanih polipeptidih proizvoda koji su kodirani članovim skupa fragmenata nukleinskih kiselina koji značajno indukuju proizvodnju antitela na nemođifikovani OPGL kod životinjskih vrsta.

U ovom smislu, "set međusobno različitih modifikovanih OPGL polipeptida " predstavlja skup ne-identičnih modifikovanih OPGL polipeptida koji su npr. odabrani na osnovu prethodno razmatranih kriterijuma (npr. u kombinaciji sa ispitivanjima cirkularnog dihroizma. NMR spektra, i/ili rendgenskih đfrakcionih rešetaka). Skup može da sadrži samo nekoliko članova ali se razmatra da skup može da sadrži nekoliko stotina članova.

Ispitivanje (testiranje) članova skupa se može izvestiin vivo,ali se mogu primeniti brojniin vilrotestovi koji smanjuju broj modifikovanih molekula koji poslužiti predmetnom pronalasku.

Budući daje cilj uvođenja stranih epitopa T-ćelija, pomagati odgovor B-ćelija uz pomoć T-ćelija, a uslov je daje proliferacija T-ćelije inđukovana modifikovanim OPGL-om. Proliferacija T-ćelije se može testirati standardizovanim analizamain vitroproliferacije. Ukratko, uzorak obogaćen za T-ćelije je dobijen od subjekta i naknadno čuvan u kulturi. Gajene (kultivisane) T-ćelije su dovedene u kontakt sa APCs subjekta koji je prethodno vezao modifikovan molekul i obradile da tako da predstavlja epitope T-ćelija. Proliferacija T-ćelija je praćena i poređena sa odgovarajućom kontrolom (npr. T-ćelije u kulturi u kontaktu sa APCs koji ima procesiran intaktan prirodan OPGL). Alternativno, proliferacija se može meriti određivanjem koncentracije relevantnih citokina koje su oslobodile T-ćelije u odgovoru na njihovo prepoznavanje stranih T-ćelija.

Budući daje prikazana velika verovatnoća da bar jedan modifikovan OPGL bilo kojeg tipa skupa može da indukuje proizvodnju antitela na OPGL, onda je moguće pripremiti imunogene kompozicije koje sadrže bar jedan modifikovan OPGL polipeptid koji može da indukuje antitela na nemodifikovan OPGL kod životinjskih vrsta gde je nemodifikovan OPGL polipeptid, autologni-protein.a postupak obuhvata mešanje član(ov)a skupa koji značajno indukuju proizvodnju antitela kod životinjskih vrsta koja su reaktivna sa OPGL, sa farmaceutski i imunološki prihvatljivim nosačem i/ili prenosnikom i/ili razblaživačem i/ili ekscipiensom, po potebi u kombinaciji sa bar jednim farmaceutski i imunološki prihvatljivim adjuvansom.

Dati aspekti pronalaska odnose sa na testiranje skupova polipeptida se povoljno izvode prvo pripremanjem brojnih međusobno različiti sekvenci nukleinskih kiselina ili vektora pronalaska, umetanje ovih u odgovarajuće ekspresione vektore, transformisanjem odgovarajuće ćelije domaćina pomoću vektora i eksprimovanjem sekvenci nukleinskih kiselina pronalaska. Nakon ovoga može doći do izolovanja ekspreimovanih proizvoda. Poželjno je da su sekvence nukelinskih kiselina i/ili vektori pripremljeni prema postupcima koji obuhvataju primenu tehnike molekularne amplifikacije poput PCR ili pomoću sinteze nukelinskih kiselina.

PRIMER

Odlučeno je da se klonira ili sintetniše cDNK koja kodira misiji i humani OPGL u okrnjenoj verziji koja sadrži aminokiselinske ostatakel58-316 kod miša i ostatake 159-317 kod čoveka (brojevi odgovaraju numeraciji u SEQ ID NOs: 2 i 4, respektivno). Budući da ove okrnjene verzije pokazuju biološku aktivnost, logično je usmeritu autoantitela na ovaj deo OPGL-a. Dodatno, čini proteine manjim i time lakše za baratanje.

Sintetička cDNK koja kodira ostatake 158-316 misije OPGL je sintetisana uklanjanjem sub-optimalnih kodonaEschericia coliiPichiapastorisiz publikovanih sekvenci. Dodatno, histidinski privezak na N-kraju, deo mesta cepanja faktora alfa sparivanja signalne sekvence odSacharomyces cerevisiaei odgovarajući restrikcioni enzimi su inkorporirani u otvoreni okvir čitanja (cf. SEQ ID NO: 7).

Ova cDNK koja kodira divlji tip mišijeg OPGL-a je kloniran u standardni ekspresioni vektorEschericia coli(pTrc99a) pomoćuBspUliHindlllrestrikcionih n enzima i standardnih vektor kloniranja (pBluescript KS+) pomoćuSacliKpnlrestrikcionih enzima (dajući SEQ ID NO: 9).

Eksprimovanje u ćelijamaEschericia colirezultovalo je u približno 30% rekombinantnog OPGL ukupnog proteinaEschericia coli.Protein je ponovo strukturisan i prečišćen prema sledećoj proceduri:

1. Ćelije su prikupljene centrifugiranjem.

2. Ćelije su resuspendovane u rastvoru soli puferovane fosfatnim puferom (PBS) i ponovo centrifugirane. 3. Supernatant je odbačen i ćelije su resuspendovane u tri zapremine (100 mM Tris hidroksimetil aminometan hidrohlorida, 5 mM ditiotreitola (DTT), 0.5 M NaCl, pH 8.0). 4. Ćelijama je dodato 8 ul 50 mM PMSF i 80 ul lizozima (10 mg/ml) po gramu ćelije i inkubirane na sobnoj temperaturi, 20 min. 5. Na svaki gram ćelijskih kuglica, dodato je 4 mg dezokhlorne kiseline i suspenzija je inkubirana na 37°C dok ne postane viskozna. 6. Dodato je 20 ul DNaze (1 mg/ml) po gramu težine ćelije i MgCb u 5 mM i suspenzija je inkubirana na sobnoj temperaturi 30 min.

7. Suspenzija je sonifikovana na ledu do nestanka viskoznosti.

8. Posle centirfugacije (20000 x g u trajanju od 30 min) kuglice su resuspendovane u FfcO, ponovo centrifugirane i resuspendovane u 3 ml 1 M uree po gramu težine ćelije. 9. Posle centrifugiranja (20000 x g u trajanju od 30 min) kuglice su resuspendovane u 1 M Gvanidin hidrohloridu, 100 mM Tris hidroksimetil aminometan hidrohloridu, pH 7.5. 10. Posle centrifugiranja (20000 x g u trajanju od 30 min) kuglice su resuspendovane u 6 M Gvanidin hidrohloridu, 20 mM Tris [hidroksimetul jaminometan hidrohloridi, 5% etanolu, 1% beta-merkaptoetanolu, pH 8.0 i mešane preko noći na 4°C. 11. Posle centifugiranja (40000 x g u trajanju od 1-4 sata) supematant je profiltriran i ostavljen da stoji na -20°C. 12. Rastvorena inkluziona tela su odvojena gel filtratacionom hromatografijom na materijalu Superdex 200 (Pharmacia). 13. Frakcije koje sadrže rekombinantni OPGL su kombinovanei razblažene do 0.1 mg/ml sa 1,5M Gvanidin hidrohloridom, 20 mM Tris hidroksimetil aminometan hidrohloridom, 1 mM DTT, pH 7.5. 14. Materijal je dijaliziran preko noći na 4°C nasuprot 10 zapremina 1,5M Gvanidin hidrohlorida, 20 mM Tris [hidroksimetil] aminometan hidrohlorida, 1 mM DTT, pH 7.5 15. Materijal je dijaliziran preko noći na 4°C nasuprot 10 zapremina 1,0 M Gvanidin hidrohlorida, 20 mM Tris [hidroksimetil]aminometan hidrohlorida, 1 mM DTT, pH 7.5 16. Materijal je dijaliziran preko noći na 4°C nasuprot 10 zapremina 0,5 M Gvanidin hidrohlorida, 20 mM Tris [hidroksimetiljaminometan hidrohlorida. 1 mM DTT, pll 7.5 17. Materijal je dijaliziran preko noći na 4°C nasuprot 10 zapremina 20 mM Tris hidroksimetil aminometan hidrohlorida, 150 mM Arginina, 1 mM DTT, pH 7.5 18. Materijal je dijaliziran preko noći na 4°C nasuprot 10 zapremina 20 mM Tris hidroksimetil aminometan hidrohlorida. 150 mM Arginina, pH 7.5 19. Ponovo strukturisan materijal je osušen zamrzavanjem i ostavljen na -20°C.

Efikasnost ponovnog strukturisanja prema ovom postupku iznosi oko 40% i čistoća veća od 65%. Postupak prečišćavanja i proces ponovnog strukturisanja su i dalje predmet daljeg usavršavanja. Imobilizovano ponovno strukturisanj je u toku ispitivanja i enzimatsko uklanjanje histidinskih privezaka će se izvesti u suštini kao Što je opisao Pedersen et al., 1999. Priroda rekombinantnog proteina je okarakterisana i veri tikovana pomoću SDS-PAGE, sekvenciranjera na N-kraju, analizom amino kiselina i masenom spektrometrijom.

U toku ispitivanja je supstitucija cisteina mutanta mišijeg OPGL divljeg tipa (gde cistein koji odgovara amino kiselinskim ostacima u SEQ ID NO: 4 je supstituisan serinom; cf. SEQ ID NOs: 11 i 12). Ovo je urađeno da vi se eliminisali mogu'i problemi vezani za stabilnost prečišćenog rekombinantog proteina. Ovaj matirani okrnjeni OPGL će poslužiti kao osnova za konstrukte vakcine u kompletnoj analogiji sa opisom datim udaljem tekstu koji počinje od DNK sekvener SEQ IDNO: 9. Dalje, takođe će biti proizveden odgovarajući Cys-Ser mutant (gde je Cys-221 supstituisan) humanog OPGLa za istu namenu.

Molekuli vakcine su inicijalno dobijeni umetanjem ili unutrašnjom-supstitucijom P2 ili P30 epitopa iz toksoida tetanusa, na odabranim položajima. U kasnijim stupnjevima mogu se upotrebiti drugi odgovarajući imunodominanuii epitopi T-ćelije.

Odabrani položaji za uvođenje varijanti su zasnovani na znanju postojećih ili predviđenih epitopa B-ćelija i predviđene sekondarne strukture elemenata prirodnih (nativnih) molekula, kao i primeni usklađivanja sa postojećim trodimenzionim strukturama TNFa (la8m.pđb) i CD40 liganda (laly. pdb) za modeliranje sekundarne i tercijerne strukture ekstracelularnog dela OPGL-a. Uvođenje u misije molekule će se izvesti na mestima u delovima koji odgovaraju amino kiselinskim ostatacima 170-192,198-218,221-246,256-261 i 285-316 (cf. amino kiselnska numeracija u SEQ ID NO: 4), dok će se uvođenje u molekul čoveka izvesti u delovima sa odgovaraućim amino kiselinskim ostacima 171-393,199-219, 222-247,257-262 i 286-317.

Četiri varijante mišijeg OPGL-a su konstruisane i rekombinanino eksprimovane u

Eschericia coli:

DNK koja kodira mOPGL 158-316 P30 [256-261] sa histidinskim priveskom (SEQ ID NO: 13): na N-kraju

Izveden je PCR SEQ ID NO: 9 pomoću SEQ ID NOs: 22 i 25 kao prajmerima. Dobijeni PCR-fragment je obrađen restrikcionim enzimima saSadiiKpnli zatim prečišćen iz agaroznog gela. Izveden je drugi PCR sa SEQ ID NO: 9 kao templatom i SEQ ID NO: 26 kao prajmerom i vektor specifičnim prajmerom. Dobijeni PCR-fragment je obrađen restrikcionim enzimima saKpnliHindlll.Oba fragmenta su zatim povezana sa SEQ ID NO: 9 u pBluescript KS+prethodno obrađenim restrikcionim enzimimaSadiiHindlll.Za korekciju mutacije jedne baze u ovom konstruktu, izveden je PCR sa konstruktom kao templatom sa prajmerima SEQ ID NOs: 33 i 29. Dobijeni PCR-fragment je obrađen restrikcionim enzimima saPstl + EcoRl,prečišćen iz gela i naknadno povezan sa pogrešnim konstruktom koji je prethodno obrađen restrikcionimenzimima Pstli £coRl. Provereni konstrukt (SEQ ID NO: 13) je zatim prenet u pTrc99a korišćenjemBspHliHindlllrestrikcionih enzima.

DNK koja kodira mOPGL 158-316 P2 [256-261] sa histidinskim priveskom (SEQ ID NO:

15) na N-kraju:

Izveden je PCR pomoću prajmera SEQ ID NOs: 27 i 28 bez templata. Dobijeni PCR-fragment je obrađen restrikcionim enzimimasa. Pstli £coRI i zatim prečišćen iz agaroznog gela. Dobijeni fragment je zatim povezan sa SEQ ID NO: 9 u pBluescript KS+ prethodno obrađenim restrikcionim enzimimaSadiiHindlll.Provereni konstrukt (SEQ ID NO: 15) je zatim prenet u pTrc99a korišćenjemBspHliHindlllrestrikcionih enzima.

DNK koja kodira OPGL 158-316 P2 288-302 sa histidinskim priveskom (SEQ ID NO: 17) na N-kraju: Izveden je PCR SEQ ID NO: 9 pomoću SEQ ID NOs: 22 i 29 kao prajmerima. Dobijeni PCR-fragment je obrađen restrikcionim enzimima saPstliBstBliz nakon toga prečišćen iz agaroznog gela. Izveden je drugi PCR sa SEQ ID NO: 9 kao templatom i SEQ ID NO: 30 prajmerom i vektor specifičnim prajmerom. Dobijeni PCR-fragment je obrađen restrikcionim enzimima saBstBliKpnli zatim prečišćen iz gela. Oba fragmenta su zatim povezana sa SEQ ID NO: 9 u pBluescript KS+ prethodno obrađenim restrikcionim enzimimaPstliKpnl.Provereni konstrukt (SEQ ID NO: 17) je zatim prenet u pTrc99a korišćenjemBspHliHindlllrestrikcionih enzima.

DNK koja kodira mOPGL 158-316 P30 [221-241] sa histidinskim priveskom (SEQ ID NO: 19) na N-kraju: Izveden je PCR SEQ ID NO: 9 pomoću SEQ ID NOs: 22 i 23 kao prajmerima. Dobijeni PCR-fragment je obrađen restrikcionim enzimima saSadiiKpnli zatim prečišćen iz agaroznog gela. Izveden je drugi PCR sa SEQ ID NO: 9 kao templatom pomoću SEQ ID NOs: 24 i 31 kao prajmerima. PCR-fragment je obrađen restrikcionim enzimimasa KpnliEcoRli zatim prečišćen iz gela. Oba fragmenta su onda povezana sa SEQ ID NO: 9 u pBluescript KS+ prethodno obrađenim restrikcionim enzimima Sadi iEcoKl.Provereni konstrukt (SEQ ID NO: 19) je zatim prenet u pTrc99a korišćenjemBspHliHindlllrestrikcionih enzima.

Eksprimovanje ovih okrnjenih varijanti OPGL-a je izvedeno uE. colidajući prinos preko 20% ukupnog proteina za sve varijante. Predviđen je dalji razvoj prethodno opisanih postupaka prečišćavanja i pomoćnog strukturisanja proteina (SEQ ID NO: 9) divljeg tipa. Ova procedura će služiti kao osnova za razvoj optimalnih procedura za svaku od varijanti. Sledeći pristup koji se razmatra je imobilizovano ponovnog stukturisanj a varijanti proteina koriste histidinski privezak.

Alternativno, varijante se mogu direktno prebaciti do vektoraeksprimovanja Pichia pastorispomoću restrikcionih enzima ili drugih ekspresionih sistema kvasca ili drugih ekspresionih sistema kvasca koji koriste PCR ukoliko je poželjna glikozilacija. Treba napomenuti da glikozilacije nije potrebna zain vivobiološku aktivnost OPGL-a. Takođe je moguće eksprimovati okrnjen OPGL kod humanih 293 fibroblasta kao što je objavio Lacey et al. Ekspresija u ćelijama insekta će se takođe razmatrati (npr. Schneider 2 (S2) ćelijska linija i sistem vektora iliSpodoptera frugiperda(SF) ćelije i sistemi vektora, oda dostupna od Invitrogen-a).

Prečišćene varijante će se upotrebiti za proizvodnju antitela kod zečeva za kasniju upotrebu kao alat za detekciju budući da nema komercijalno dostupnih antitela . Dodatno, ovaj materijal će biti važan alat za biološke analize potrebne za procenu kandidata za autovakcine. Pripremanje antitela će biti izvedeno prema standardnim postupcima poznatim u tehnici.

Odabir najboljeg kandidata za autovakcine je zasnovan naproceni inhibitorne aktivnosti uin vitroanalizama za maturaciju/aktivaciju osteoklasta ili uin vivoživotinjskim modelima na osteoporozu. Korisne analize i sistemimodela su opisani u literaturi (npr. u Laceyet al.,Fulleret al,and Simonetet al.).

Aktivnost rekombinantih proteina će biti analiziranaa intravenoznom injekcijom lOOul mužjaku Balb/C miiša koji nije pod anestezijom (0,0. 1 i 1.0 mg proteina pr. kg miša) i sat kasnije je uzet uzorak od 125 u.1 krvi iz glavne vene oka pomoću kapilarnih cevčica obloženih heparinom koji je zasićen kalcijumom. Nivo kalcijum je meren pomoću ICA2 (Rađiometer, Denmark). Prečišćan i ponovno strukturisan rekombinantni OPGL miša (SEQ ID NO: 9) je reaktivan u voj analizi, povećavajući cirkulacione nivoe jonizovanog kalcijuma do 10%.

Kandidati za autovakcine će npr. biti vrednovani autovakcinacijom i naknadnim praćenjem njihove inhibicije oslobađanja jonizovanog kalcijuma u perifernu krv posle injekcije rekombinantog mOPGL mišu (kao što je opisao Burgesset ai).

Treba napomenuti da kao alternativa modifikovanom OPGL-u, antiidiotipična antitela usmerena na idiotip anti-OPGL antitela će takođe poslužiti kao korisni imunogeni. Takođe, primena mimotičnih polipeptida koji će biti izolovani u npr. faga displej sistemu pomoću anti-OPGL ili osteoprotegerina kao prihvatne sonde se takođe smatra kao deo imunogena predmetnog pronalaska.

LISTA REFERENCI

1. Bucay, N. et al. (1998), Genes Dev. 12,1260-1268.

2. Lacey, D. L. et al. (1998), Cell 93,165-176.

3. Marks, S. C, Jr. (1989), Am. J. Med. Genet. 34,43-53.

4. Simonet, W. S. et al. (1997), Cell 89,309-319.

5. Fuller, K. et al. (1998), J. Exp. Med. 188,997-1001.

6. Burgess, T. L. et al. (1999), J. Cell Biol. 145,527-538.

7. Pedersen J et al. (1999) Protein Expr. Purif. 15,389-400.

Claims (36)

1. Upotreba - OPGL polipeptida životinjskog porekla ili njegove pođsekvence, ili - analoga OPGL, koji je izveden iz životinjskog OPGL polipeptida u koji je uvedena modifikacija koja rezultuje u tome da imunizacija životinje analogom indukuje proizvodnju antitela na životinjski OPGL polipeptid, za dobijanje farmaceutske kompozicije koja sadrži OPGL polipeptid, podsekvencu ili analog za smanjenje OPGL kod životinja , naznačen time, stoje OPGL polipeptid, autologni-protein za lečenje, prevenciju ili poboljšanje osteoporoze ili drugih stanja koje karakteriše prekomerna resorpcija kostiju.

2. Upotreba prema zahtevu 1, naznačena time, što modifikacija koja rezultuje u očuvanosti značajna frakcija OPGL epitopa B-ćelija i da je - uveden bar jedan strani epitop pomoćničkih T-limfocita (Thepitop), i/ili - uvedena bar jedna prva grupa koja utiče na ciljanje modifikovanog molekula na antigen-prezentujuću ćeliju (APC) ili B-limfocit, i/ili - uvedena bar jedna druga grupa koja stimuliše imuni sistem, i/ili - uvedena bar jedna treća grupa koja optimizira prezenta van je modifikovanog OPGL polipeptida imunom sistemu.

3. Upotreba prema zahtevu 2, naznačena time, što modifikacija obuhvata uvođenje sporednih grupa, kovalentnim ili nekovalentnim vezivanjem za odgovarajuće hemijske grupe u OPGL-u ili njegovoj podsekvenci, stranog Thepitopa i/ili prve i/ili druge i/ili treće grupe.

4. Upotreba prema zahtevu 3, naznačena time, što modifikacija obuhvata supstituciju i/ili deleciju i/ili umetanje i/ili adiciju amino kiselina.

5. Upotreba prema zahtevu 4, naznačena time, što modifikacija rezultuje u obezbeđivanju fuzionog polipeptida.

6. Upotreba prema zahtevu 4 ili 5, naznačena time, što uvođenje aminokiselinske supstitucije i/ili delecije i/ili umetanja i/ili adicije rezultuje u značajnom očuvanju celokupne tercijerne strukture OPGL-a.

7. Upotreba prema jednom od zahteva 1-6, naznačena time, što modifikacija obuhvata duplikaciju bar jednog OPGL epitopa B-ćelije i/ili uvođenje haptena.

8. Upotreba prema jednom od zahteva 2-7 . naznačena time, što je strani epitop T-ćelije, imunodominantan u životinji.

9. Upotreba prema jednom od zahteva 2-8 , naznačena time, što je strani epitop T-ćelije sposoban za vezivanje velikog dela MHC molekula Klase II.

10. Upotreba prema zahtevu 9 , naznačena time, što je bar jedan strani epitop T-ćelije odabran od prirodnih epitopa T-ćelije i veštačke peptidne sekvence koja vezuje MHC-II.

11. Upotreba prema zahtevu 10 , naznačena time, što je prirodni epitop T-ćelije odabran od Tetanus toksoid epitopa poput P2 ili P30, difteria toksoid epitopa, influenza virus hemaglutinin epitopa iP. falcipanimCS epitopa.

12. Upotreba prema jednom od zahteva 2-11, naznačena time, što je prva grupa , specifičan vezujući partner za antigen specifičan za B-limfocite koji se nalazi na površini ćelije ili za antigen specifičan za površinu APC-a poput haptena ili ugljenog hidrata za koji postoji receptor na B-limfocitima ili APC-u.

13. Upotreba prema jednom od zahteva 2-12, naznačena time, stoje druga grupa odabrana od citokina, hormona i proteina toplotnog šoka.

14. Upotreba prema zahtevu 13, naznačena time. što je citokin odabran od, ili je delotvoran deo, interferona y (IFNy), Flt3L, interleukina 1 (IL-1), interleukina 2 (IL-2), interleukina 4 (IL-4), interleukina 6 (IL-6), interleukina 12 (IL-12). interleukina 13 (IL-13), interleukina 15 (IL-15) i faktora koji stimuliše koloniju granulocit-makrofaga (GM-CSF) i proteina toplotnog šoka odabranog od ili je delotvoran deo HSP70, HSP90, HSC70, GRP94 i kalretikulin (CRT).

15. Upotreba prema jednom od zahteva 2-14, naznačena time, što je treća grupa po prirodi lipid, kao što je palmitoil grupa, miristil grupa, famezil grupa, geranil-geranil grupa, GPI-anker i N-acil diglicerid grupa.

16. Upotreba prema jednom od prethodnih zahteva, naznačena time, što modifikacija obuhvata to daje OPGL polipeptid ili njegova podsekvenca modifikovana najednom od položaja 170-192, jednom od položaja 198-218, jednom od položaja 221-246, jednom od položaja 256-261 ili na jednom od položaja 285-316, a numeracija amino kiselina odgovara jednoj od SEQ ID NOs: 4, 6 i 12, ili je OPGL polipeptid modifikovan najednom od položaja 171-193, jednom od položaja 199-219, jednom od položaja 222-247, jednom od položaja 257-262, ili jednom od položaja 286-317, numeracija amino kiselina odgovara SEQ ID NO: 2, a istovremeno je sačuvana značajna frakcija epitopa OPGL-a B-ćelija životinja.

17. Upotreba prema zahtevu 16, naznačena time, što modifikacija obuhvata supstituciju bar jedne aminokiselinske sekvence, na položaju definisanom u zahtevu 16, aminokiselinskom sekvencom iste ili različite dužine koja sadrži strani Th epitop.

18. Upotreba prema zahtevu 17, naznačena time, što sekvenca amino kiselina koja sadrži strani Thepitop supstituiše aminokiseline 256-261 i/ili 288-302 i/ili 221-241 nađene u SEQ ID NO: 4 ili aminokiseline 257-262 i/ili 289-303 i/ili 222-243 u SEQ ID NO: 2 ili u polipeptidu gde je cistein koji odgovara Cys-221 supstituisan sa Ser.

19. Upotreba imunogene kompozicije koja sadrži - imunogenski delotvornu količinu autologog OPGL polipeptida kod životinja, gde je dati OPGL polipeptid formulisan zajedno sa imunološki prihvatljivim adjuvansom tako da dovodi do prestanka autotolerancije životinje na OPGL polipeptid, a preparat sadrži još i farmaceutski i imunološki prihvatljiv nosač i/ili prenosnik , ili - imunogenski delotvornu količinu analoga OPGL definisanog prema jednom od zahteva 1 do 18, a preparat sadrži još i farmaceutski i imunološki prihvatljiv nosač i/ili prenosnik i po izboru, adjuvans. za dobijanje farmaceutske kompozicije koja sadrži dalu imunogenu kompoziciju za smanjenje OPGL-a kod životinje, za lečenje, prevenciju ili poboljšanje osteoporoze ili drugih stanja koja karakteriše prekomerna resorpcija kostiju.

20. Upotreba fragmenta nukleinske kiseline koji kodira OPGL, podsekvence OPGL-a ili analoga OPGL-a kao što je definisano u zahtevima 1 do 18 za dobi janje farmaceutiske kompozicije koja sadrži fragment nukelinske kiseline za smanjenje OPGL-a kod životinje za lečenje, prevenciju ili poboljšanje osteoporoze ili drugih stanja okarakterisanih prekomernom resorpcijom kostiju.

21. Upotreba vektora koji nosi fragment nukleinske kiseline definisan u zahtevu 20 za dobijanje farmeceutske kompozicije koja sadrži dati vektor, za smanjenje OPGL kod životinje, za lečenje, prevenciju ili poboljšanje osteoporoze ili drugih stanja okarakterisanih prekomernom resorpcijom kostiju.

22. Upotreba prema zahtevu 21, naznačena time. što je vektor sposoban za autonomnu replikaciju.

23. Upotreba prema zahtevu 21 ili 22, naznačena time, što je vektor odabran iz grupe koju čine plazmid i virus.

24. Upotreba prema jednom od zahteva 21 -23, naznačena time, što vektor obuhvata, u smeru 5'—»3<*>u izvodljivom vezivanju, promotor za vođenje ekpresije fragmenta nukleinske kiseline definisan u zahtevu 20, po izboru sekveneu nukleinske kiseline koja kodira glavni peptid koji omogućava sekreciju, ili integraciju u membranu polipeptidnog fragmenta, gde je fragment nukleinske kiseline definisan u zahtevu 20 i po izboru terminator.

25. Upotreba prema jednom od zahteva 21-24, naznačena time, što se vektor, kada je uveden u ćeliju domaćina, može ili ne može integnsati u genom ćelije domaćina.

26. Upotreba prema zahtevu 24 ili 25, naznačena time, što promotor u vektoru vodi ekspresiju u eukariotskoj ćeliji i/ili prokariotskoj ćeliji.

27. Upotreba ne-patogeno transformisane ćelije koja nosi i eksprimuje vektor definisan u jednom od zahteva 21-26, za pripremanje farmaceutske kompozicije koja sadrži transformisanu ćeliju, za smanjenje OPGL -a kod životinje, za lečenje, prevenciju ili poboljšanje osteoporoze ili drugih stanja okarakterisanih prekomernom resorpcijom kostiju.

28. Upotreba prema zahtevu 27, naznačena time, što je transformisana ćelija sposobna za replikaciju fragmenta nukleinske kiseline koji je definisan u zahtevu 20.

29. Upotreba prema zahtevu 28, naznačena time, što je transformisana ćelija, bakterija

30. Upotreba prema zahtevu 29, naznačena time, što je bakterija odabrana iz grupe koju čine,Mycobacierium bovisBCG.,Streptococcusspp.,E. coli, Salmonellaspp.,Vibrio choleraeiShigella.

31. Upotreba prema zahtevu 30, naznačena time, što transformisana ćelija na površini izlučuje ili nosi. OPGL, podsekvencu OPGL-a ili analog OPGL-a definisan u jednom od zahteva 1 do 18.

32. Upotreba kompozicije koja sadrži - fragment nukleinske kiseline definisan zahtevu 20 ili vektor definisan u jednom od zahteva 21 -26, i - farmaceutski i imunološki prihvatljiv nosač i/ili prenosnik i/ili adjuvans, za pripremanje farmaceutske kompozicije koja sadrži datu kompoziciju za indukovanje proizvodnje antitetela, za smanjenje OPGL-a kod životinje, za lečenje, prevenciju ili poboljšanje osteoporoze ili drugih stanja okarakterisanih prekomernom resorpcijom kostiju.

33. Postupak za identifikaciju modifikovanog OPGL polipeptida koji ima sposobnost da indukuje antitela na nemodifikovan OPGL u životinjskim vrstama , pri čemu je nemodifikovan OPGL polipeptid, autologni-protein, naznačen time, što obuhvata - pripremanje, tehnikama sinteze peptide ili genetskog inženjeringa, set međusobno različitih modifikovanih OPGL polipeptida gde su amino kiseline dodate u. umetnute u, izostavljene iz ili supstituisane u aminokiselinsku sekvencu OPGL polipeptida životinjske vrste, čime nastaju aminokiselinske sekvence u setu koji sadrži epitope T-ćelija, stranih životinjskim vrstama, ili pripremanje seta fragmenata nukleinskih kiselina koji kodiraju set modifikovanih OPGL polipeptida koji se međusobno razlikuju, - testiranje članova seta modifikovanih OPGL polipeptida ili fragmenata nukleinskih kiselina na njihovu posobnost da indukuju proizvodnju antitela pomoću životinjskih vrsta na nemodifikovan OPGL, i - identifikovanje i po izboru izolovanje člana/članova seta modifikovanih OPGL polipeptida koji značajno indukuje proizvodnju antitela na nemodifikovani OPGL u životnjskim vrstama ili identifikovanje i po izboru izolovanje proizvoda ekspresije polipeptida kodiranih članovima seta fragmenata nukleinskih kiselina koji značajno indukuju proizvodnju antitela na nemodifikovan OPGL u životinjskim vrstama.

34. Postupak za pripremanje imunogene kompozicije koja sadrži bar jedan modifikovan OPGL polipeptid koji ima sposobnost da indukuje antitela na nemodifikovan OPGL u životinjskim vrstama, gde je nemodifikovan OPGL polipeptid, autologni-protein, naznačen time što obuhvata - pripremanje, teznikama sinteze peptida ili genetskog inženjeringa, seta međusobno različitih modifikovanih OPGL polipeptida gde su aminokiseline dodate, umetnute u, izostavljene iz ili supstituisane u aminokiselinsku sekvencu OPGL polipeptida životinjske vrste, ističući tako aminokiselinske sekvence u setu koji sadrži epitope T-ćelija koje su strane životinji, - testiranje članova seta na njihovu sposobnost da indukuju proizvodnju antitela životinjskim vrstama na nemodifikovan OPGL. i - mešanje članova seta koji značajno indukuje proizvodnju antitela u životinjskim vrstama koji su reaktivni sa OPGL sa farmaceutski imunološki prihvatljivim nosačem i/ili prenosnikom, po ozboru u kombinaciji sa bar jednim farmaceutski i imunološki prihvatljivim adjuvansom.

35. Postupak prema zahtevu 33 ili 34. naznačen time, što pripremanje članova seta obuhvata pripremanje međusobno različitih sekvenci nukleinskih kiselina, gde je svaka sekvenca, sekvenca nukelinske kiseline prema zahtevu 20, umetanje sekvenci nukleinskih kiselina u odgovarajuće vektore ekspresije, transformaciju odgovarajućih ćelija domaćina sa vektorima i ekspresiju sekvenci nukleinskih kiselina, po izboru zatim i izolovanje proizvoda ekpresije.

36. Postupak prema zahtevu 35, naznačen time, što je pripremanje sekvenci nukleinskih kiselina i/ili vektora postignuto uz pomoć tehnika molekularne amplifikacije poput PCR-a ili uz pomoć sinteze nukleinskih kiselina.