RS50075B - Postupak za proizvodnju heterolognih proteinskih supstanci u biljnom materijalu - Google Patents

Abstract

Postupak za proizvodnju heterolognih proteinskih supstanci u biljnom materijalu, naznačen time, što se kao biljni materijal koristi protonemsko tkivo mahovine i što se proizvedene proteinske supstance dobijaju iz sredine kulture bez prekida proizvodnje tkiva ili ćelija. Prijava sadrži još 5 zavisnih patentnih zahteva.

Description

Oblast tehnike

Ovaj pronalazak se uopšteno odnosi na područje proizvodnje proteinskih supstanci u biljnom materijalu. Konkretno, ovaj pronalazak se odnosi na nov postupak proizvodnje željenih proteinskih supstanci u mahovinama. Prema MKP pronalazak ima oznake C 12 N 15/82; C 12 P 21/02; A 01 H 11/00; C 07 K 14/52.

Stanje tehnike

Korišćenje biotehnoloških postupaka za potrebe proizvodnje je za čoveka značajna mogućnost da se proizvedu supstance koje se ne mogu ekonomski proizvesti, ili se ne mogu uopšte proizvesti na drugi način, na primer hemijskom sintezom, a njihova količina u prirodi je nedovoljna da bi poslužile kao sirovina. Poznato je preko 10000 biljnih metabolita, a samo nekoliko takvih spojeva proizvedeno je u industrijskom opsegu pomoću biljnih ćelijskih kultura. Ove supstance su pretežno farmaceutski aktivni sekundarni metaboliti. Primeri koji se mogu navesti su sledeći: a) berberin (proizvodnja u opsegu 40001), koji ima bakteriostatičko i fungicidno dejstvo (Y. Fujita i M. Tabata, u: Plant tissue and cell culture, plant science; Vol. 3, str. 169, C.E. Green et al. (Ed.), A.R. Liss Inc., New York (1987)), b) šikonin (opseg 7501) koji ima antibiotsko i protivupalno dejstvo (M. Tabata i Y. Fujita, u: Biotechnologv in plant science; str. 207-218, P. Day et al. (Ed.), Academic Press, Orlando (1985)), te c) paklitaksel (opseg 75 0001), koji je poznatiji pod imenom taksol, koji ima protivtumorno dejstvo (M. Jaziri et al., Taxus sp.cell, tissue and organ cultures as alternative sources for taxoids production: a litterature survev, Plant Cell Tiss. Org. Cult., 46, str. 59-75

(1996)).

Sledeći značajni biotehnološki postupak u kome se iskorišćavanju kulture biljnih ćelija, je biološko pretvaranje digitoksina u digoksin, lek za srce i poboljšanje cirkulacije. Stereospecifična reakcija hidroksilovanja sprovodi se uspešno u biološkom reaktoru kulturaDigitalis lanata(E. Reinhard i W. Kreiss, Kultivierung von pflanzlichen Zellen im Bioreaktor [Plant cell culture in the bioreactor], Bio. Engin ., 5, pp. 135-136 (1989)) uz visoki prinos. Aktuelan i opširan prikaz upotrebe kultura biljnih ćelija u biotehnologiji može se naći u Biotechnol, Annu Rev., 4, str. 113-176 (1998),

Razvoj postupka genetske transformacije za više biljke početkom osamdesetih omogućio je odgovarajuće povećanje proizvodnje biljaka za specifične sekundarne konstituente transformisanjem gena za specifične ključne enzime metaboličkih puteva. Korišćene se ne samo transgenske intaktne biljke već takođe i biljne ćelijske kulture. Primeri koji se mogu navesti su prekomerna izraženost bakterijske lizin dekarboksilaze utransgenskim kulturamaNicotiana tabacvm,što povećava prinos biogenskih amina kadaverina i anabasina za faktor do 14 (J. Berlin et al.. Genetic mođification of plant secondarz metabolism: Alteration of product levels by overexpression of amino acid decarboxylases, in: Advances in Plant Biologv, Studies in Plant Science, Vol. 4, str. 57-81, D.D.Y. Ryu i S. Furasaki (Ed.), Elsevier, Amsterdam (1994)).

Međutim, mogućnost prenošenja DNK u biljke nije omogućila samo kvantitativne i kvalitativne promene biljnih konstituenata, Kao dodatak tome, biljne kulture i kulture biljnih ćelija postale su privla;nije za proizvodnju heterolognih proteina (A.S.Moffat, High-Tech plants promise a bumper crop of nevv products, Science 256, str. 770-771 (1992)), pri čemu su odabrana dva različita pristupa.

Jedan pristup obuhvata proizvodnju heterolognih proteina u transgenskim intaktnim biljkama. Uz proizvodnju antitela u transgenskim biljkama duvana (J.K.-C.Ma et al., Generation and assembly of secretory anlibodies in plants, Science268,str. 716-719 (1995)), opisano je ispoljavanje i tačna obrada humanog serumskog albumina u transgenskim biljkama duvana i u transgenskim biljkama krompira (P.C.Sijtnons et al., Production of correctly processed human serum albumin in transgenic plants, Bio/Techn., 8, str. 217-221 (1990)). Humani epidermni činilac rasta (hEGF) takođe je podvrgnut izražavanju u transgenskim biljkama duvana (A.-H. Salmanian et al., Synthesis and expression of the gene for human epidermal growth factor in transgenic potato plants, Biotechnol. Lett, 18, str. 1095-1098 (1996)). Međutim, korišćene su i ostale biljke. Leu-encefalin je uspešno proizveden korišćenjemArabidopsis thalianaiBrassica napus(E. Krebbers i J. Vandekerckhove, Production of peptides in plant seeds, Tibtech., 8, str. 1-3. (1990)). Zatim transgenske biljkeVigna unguiculatakorišćene su za ispoljavanje kimernih virusnih čestica koje deluju kao vakcine (K. Dalsgaard et. al., Plant derived vaccine protects target animals against a viral disease, Nat. Biotech., 15, str. 248-252 (1997)).

Glavni nedostatak pri korišćenju intaktnih biljaka kao što su ove, na primer prethodno opisane, je nužnost njihovog uzgoja, što zahteva vreme i skupo je, te veliku površinu koja je potrebna za uzgajanje u industrijskom opsegu. Štaviše, izdvajanje željenih ciljnih supstanci obično zahteva složene stupnjeve obrade, posebno kada konzistentnost i kvalitet proizvoda moraju udovoljavati visokim zahtevima, kao stoje to slučaj sa supstancama koje se koriste u farmaceutske ili prehrambene svrhe.

U drugom pristupu, transgenske ćelijske kulture duvana korišćene su za proizvodnju antitela. Opisano je na primer, izražavanje antitela i njihovo otpuštanje u sredinu (N.S. Magnuson et al., Enhanced recoverv of a secreted mammalian protein from suspension culture of geneticallv modified tobacco cells, Prot. Expr. Pur., 7, str. 220-228 (1996)). Budući daje pročišćavanje heterolognih proteina iz ćelija složeno, otpuštanje ciljnog proteina u sredinu predstavlja značajno unapređenje. Štaviše, proizvodnja rekombinantnih, farmaceutski relevantnih proteina u ćelijskim kulturama je takođe od interesa sa sigurnosne tačke gledišta, jer transgenske biljne ćelije se mogu uzgajati isključivo u bioreaktorima i ne treba ih otpuštati. Neophodna masovna kultura je takođe moguća razvojem bioreaktora za heterotrofne biljne ćelijske kulture u većem opsegu (na primer M.L. Shuler et al., Bioreactor engineering as an enabling technologv to tap biodiversitv: The case of taxol., Ann. N.Y. Acad. Sci., 745, str. 455-461 (1994)).

Glavni nedostatak drugog pristupa je u tome što se koriste suspenzijske biljne kulture, s niskom brzinom rasta, sa srazmerno sporim nastajanjem sekundarnih metabolita. inhibiranjem nastajanja proizvoda pri velikim ćelijskim gustinama i, kao posledicom. niskom produktivnošću po zapremini, nastajanjem agregata i konstituenata ćelijskih zidova, te povećanom osetljivošću ćelija na sile smicanja. Treba uzeti u obzir da uvek kada se koriste heterotrofne ćelijske kulture treba imati složene sredine s više konstituenata, od kojih su neki skupi. Međutim, najozbiljniji nedostatak je pojava somaklonskih varijacija u biljnimin vitroćelijskim kulturama, što donosi kvantitativne i kvalitativne promene u proizvodnji heterolognih proteina (vidi, na primer, M.G.K. Jones i K. Lindsev, Plant biotechnologv, u: Molecular biologv and biotechnologv, J. M. Walker and E.W. Gingold (Eds.), 2nd Ed., Royal Soc. Of Chem., Burlington House, London (1988). Heterogenost nastalih proizvoda i njihovih funkcionalnih svojstava su neprihvatljivi, posebno u svezi s proizvodnjom farmaceutskih proizvoda i drugih poželjnih supstanci za čije službeno prihvatanje se traži pouzdano uverenje o kvalitetu i standardizovani postupak proizvodnje.

Tehnički problem

Ovim pronalaskom rešava se problem definisanja postupka za standardnu proizvodnju heterolognih proteinskih supstanci u biljnim materijalima koji suštinski uklanja ne samo prethodno navedene nedostatke korišćenja intaktnih biljaka, već takođe i nedostatke korišćenja sastava ćelijskih kultura.

Onis rešenja tehničkog problema

Gornji problem je rešen u skladu sa ovim pronalaskom definisanjem novog postupka za proizvodnju heterolognih proteinskih supstanci u biljnom materijalu u kojem se kao biljni materijal koristi protonemsko tkivo mahovine i što se proizvedene proteinske supstance dobijaju iz sredine kulture bez prekida proizvodnje tkiva ili ćelija.

Pojam „proteinska supstanca" koji se ovde upotrebljava, obuhvata peptide, polipeptide i proteine, a takođe i njihove fragmente koji su konkretno pogodni za dijagnostičke, kliničke, farmaceutske i prehrambene potrebe. Takođe su time obuhvaćeni oni molekuli koji imaju peptidne veze i koji su translatirani pomoću biljnog materijala.

U pogodnom ostvarenju ovog pronalaska, pogodna heterologna proteinska supstanca otpušta se u sredinu kulture u svom biološki aktivnom obliku.

Pojam „biološki aktivan" koji se koristi u ovom opisu označava da ciljne supstance kojima je dodeljen ovaj pridev imaju funkcionalna svojstva koja su poželjna ili potrebna za odgovarajuću namenu. Ako je na primer, poželjno da se dobiju antitela, proizvedeni protein ili njegov funkcionalni fragment su biološki aktivni kada je njima moguće uspostaviti očekivano specifično vezivanje za antigen. Očigledno je za iskusnu osobu da za takvu namenu nije uvek potreban celi protein, već je moguće tražiti epitope ili niskomolekularne strukture koje omogućavaju željenu biološku aktivnost ili funkcionalnost. Na primer, enzim je biološki aktivan kada može da izvrši pretvaranje svog ciljnog supstrata.

U daljem pogodnom ostvarenju ovog pronalaska biljni materijal raste u obliku intaktnih mahovinastih biljaka u sredini kulture koja je sasvim oslobođena šećera, vitamina i fitohormona ili njihovih funkcionalnih fragmenata.

Postupak u skladu sa ovim pronalaskom omogućuje rast intaktnih i sasvim diferenciranih biljaka u fotoautotrofnim uslovima koji mogu biti standaardizovani, tj. bez potrebe da se dodaju šećeri, vitamini, fitohoromoni ili slično, kao stoje potrebno u heterotrofnim sastavima kulture suspendovanih ćelija u stanju tehnike. Budući da se koristi jeftina i jednostavna sredina kulture, faze dobijanja i pročišćavanja željenih ciljnih supstanci su srazmerno olakšane.

Biljni materijal koji je korišćen u postupku u skladu sa ovim pronalaskom je poželjno intaktna biljka mahovine koja je odabrana iz grupe mahovina, uključujući jetrenjače, s vrstama iz rodaPhyscomitrella, Funaria, Sphagnum i Ceratodon,pri čemu suMarchanria i Sphaerocarposkorišćene kao naročito pogodne. Postupak u skladu sa ovim pronalaskom je najpoželjnije izveden korišćenjem mahovinePhyscomiirella

patens.

U daljem pogodnom ostvarenju korišćen je konstrukt nukleinske kiseline za transformacijsko kodiranje ne samo željene proteinske supstance, već i prelaznog peptida za izlučivanje supstance iz ćelije domaćina u kulturu sredine. U skladu sa ovim pronalaskom, mogu se koristiti bilo koji autologni i heterologni nizovi nukleinske kiseline koji su poznati stručnjacima iz ove oblasti, te se mogu koristiti za generisanje kasete za komprimovanje za transformisanje tkiva proizvođača. Upotreba signalnih peptida za endoplazmatski retikulum ili ćelijski prenos je naročito poželjna.

Rad koji je izvršen u vezi sa ovim pronalaskom pokazuje da prethodno opisani problem somaklonske varijacije, koji se susreće u ćelijskim kulturama, ne postoji u fotoautotrofnim tečnim kulturama mahovina. Štaviše, mahovine koje su korišćene u skladu sa ovim pronalaskom imaju tu prednost u odnosu na ostale sastave što postoji jasan niz tačno defmisanih faza diferencijacije (hloroneme, kauloneme, pupoljci, gametofore). na šta se može uticati dodavanjem biljnih hormona (indol-3-sirćetna kiselina izaziva razvoj kaulonema, izopenteniladenin izaziva razvoj pupoljaka) (vidi, na primer, N.\V. Ashton et al., Analvsis of gametophvtic development in the moss, Phvscomitrella patens, using auxin and cvtokinin resistant mutants, Planta, 144, str. 427-435 (1979)). Usmereno, diferencijacijski specifično ispoljavanje heterolognih proteina u bioreaktorskim kulturama je prema tome moguće, tako da je kultura hloronema koja se sinhronizacijski deli, čista, i prema tome homogena, naročito poželjna u skladu, sa pronalaskom zbog njene kontrolisane uniformne proizvodnje proteina u bioreaktoru, te zbog pogodnosti za korišćenje hormonski zavisnih ili diferencijacijski specifičnih promotera.

Uz takav sistem komprimovanja, u skladu sa ovim pronalaskom može se koristiti izvodljivi promoterski sistem, naročito za proizvodnju proteina koji imaju kratko vreme poluživota ili koji su citotoksični, pri čemu jeAgrobacterium tumefaciens1 '-promoter naročito poželjan.

Uzgajanje mahovina predloženo u skladu sa ovim pronalaskom i namenjeno proizvodnji heterolognih proteina prema ekonomskom aspektu može se na primer izvršiti korišćenjemPhyscomitretla- eu zapreminama po veličini od 20 ml do preko 61, sve do 101 i više, u protrešenoj kulturi ili u provetrenim staklenim kontejnerima (vidi, na primer, R.Reski, Zell-und molekularbiologische Untersuchungen der cvtokinin-induzierbaren Gewebedifferenzierung und Chloro plastenteilung bei Phvscomitrella patens (Hedw.) B.S.G., [Cell- and molecular-biological studies of the cvtokinin-inducible tissue differentiation and chloroplast division in Phvscomitrella patens (Hedw.)B.S.G.], doktorska disertacija, Univerzitet u Hamburgu (1960)). Budući daje ovo kultura diferencirane fotoautotrofne biljke, sredini nije potrebna dopuna biljnim hormonima, niti vitaminima, niti šećerima. U poređenju sa složenom sredinom koja je potrebna, na primer, za životinjske ćelijske kulture, cena je manja za faktor 100. U skladu sa ovim pronalaskom, proizlazi da se prinos biološki aktivnog heterolognog proteina u sredini kulture može povećati za faktor 35 u prisustvu PVP, što objašnjava zastoje PVP u kulturi sredine poželjan u postupku prema ovom pronalasku.

Detaljna informacija o uzgoju drugih mahovina prema ovom pronalasku kao što su, na primer,Leptobryum pyriformeiSphagnum magellanicumu bioreaktorima opisana je u stanju tehnike (vidi, na primer, E. Wilbert, Biotehnologische Studien zur Massenkultur von Moosen unter besonderer Beriicksichtigung des ArachiđonsaurestoffVvechels [Biotechnological studies concerning the mass culture of mosses with particular consideration of the arachidonic acid metabolism], doktorska disertacija. Univerzitet u Maincu (1991); H. Rudolph i S. Rasmussen, Studies on secondarv metabolism of Sphagnum cultivated in bioreactors, Crypt. Bot, 3, str 67-73

(1992)). Posebno poželjno za potrebe ovog pronalaska je korišćenjePhysicomitrella- e,naročito stoga jer su za ovaj organizam postignute sve od uobičajenih molekularno-bioloških tehnika (radi pregleda vidi R. Reski, Development, genetics and molecular biologv of mosses, Bot. Acta, 111, str. 1-15 (1998)).

Razvijeni su pogodni transformacijski sistemi za biotehnološko eksploatisanjePhyscomitrella- tu proizvodnji heterolognih proteina. Na primer, uspešne transformacije izvršene su direktnim prenosom DNK u protonemsko tkivo korišćenjem raspršivača čestica. PEG-upravljan prenos DNK u protoplaste mahovina bio je takođe uspešan. Ovaj postupak transformacije takođe je više puta opisan za Physcomitrella-u i vodi do prelaznih i postojanih transformanata (vidi, na primer, K. Reutter i R. Reski, Production of a heterologous protein in bioreactor cultures of fully differenttated moss plants, Pi. Tissue culture, @ Biotech., 2, str. 142-147 (1996)).

Premda je ovaj pronalazak suštinski pogodan za proizvodnju bilo kakvih proteinskih supstanci, proizvodnja farmaceutski relevatnog proteina biće ovde prikazana u odnosu na humani vaskularni endotelnt faktor rasta (VEGF).

VEGF su prvi izdvojili N. Ferrara i W. J. Henzel (Pituitary follicular cells secrete a novel heparin-binding growth factor specific for vascular endothelial cells, Biochem. Biophys. Res. Commun., 161, str. 851-858 (1989)) te su ga okarakterisali kao regulacijski faktor za kontrolisanu angiogenezu i deljenje endotelnih ćelija u normalnim fiziološkim uslovima (N. Ferrara etal., The vascular endothelial grovvth factor of family of polypeptides, J. Cell. Biochem., 47, str. 211-218 (1991)). Autoricu takođe pokazali da ovaj faktor rasta deluje visoko specifično na vaskularne endotelne ćelije i ne deluje na ostale tipove ćelija. VEGF je homodimerni glikoprotein koji je povezan disulfidnim mostovima. Poznata su četiri različita oblika humanog VEGF. Četiri izooblika su dužine 121, 165, 189 i 206 aminokiselina i formirani su alternativnim povezivanjem VEGF RNK. VEGF206je dokazan samo u cDNK jetre fetusa, dok su transkripti VEGFm, VEGF|65i VEGF]g9dokazani za određen broj tumornih ćelija i tumornih tkiva. Sve VEGF izoforme imaju vodeće nizove za izlučivanje, ali se efikasno izlučuju samo dva najmanja oblika (vidi, na primer, G. Martiny-Baron i D. Marme, VEGF-mediated tumor angiogenesis: A new target for cancer therapy, Curr. Opin. Biotechnol., 6, str.675-680

(1995)).

Pogodne količine VEGF još uvek su neophodne kako za razvoj, tako i za unapređenje postojećih pristupa terapiji tumora i za karakterisanje VEGF. Tokom početnih faza rada koje su izvršene u kontekstu ovog pronalaska, sve što je bilo opisano je rekombinantna proizvodnja VEGF u insektnim ćelijama pomoću sistema komprimovanja bakulovirusa (na primer B.L. Fiebich et al., Svnthesis and assembly of functiona!ly active human vascular endothelial grovvth factor homodimers in insect cells, Eur. J. Biochem., 211. str. 19-26 (1993)).Saccharomyces cerevisiae(S. Kondo et al., The shortest isoform of human vascular endothelial grovvth factor/vascular permeability factor (VEGF/VPF,2|) koji je dobijen pomoćuSaccharotm ves cerevisiaeunapređuje i angiogeneznu i vaskularnu popustljivost, Biochim. Biophvs. Acta, 1243, str. 195-202 (1995)), kvaščevaPichia pastoris(D. Mohanraj et al.. Expression of biologically active human vascular endothelial grovvth factor in Yeast, Grovvth factors, 12, str 17-27 (1995)) iEscherichia coli(G. Siemeister et al., Expressiort of biologicallv active isoforms of the tumor angiogenesis factor VEGF in Escherichia coli, Biochem. Biophvs. Res. Commun., 222, str. 249-255 (1996)) bili su sledeći organizmi za proizvodnju. Biološki aktivan VEGF dobijen je sa svim ovim rekombinantnim sistemima. Međutim, sistem komprimovanja E. coli složen je u odnosu na pročišćavanje i rekonstituciju proteina, jer su oni upakovani u inkluzivnim telima.

Primeri

Kratak prikaz

Uspostavljanje masovnih kulturaPhyscomitrella patenskoje se mogu kontrolisati (Reutter and Reski, loc. cit.) i postupaka za prenos i)NK u mahovinuPhyscomitrella patens(K. Reutter, Expression heterologer Gene in Phvscomitrella patens (Hedw.) B.S.G. [Expression of heterologous genes in Phvscomitrella patens (Hedw.) B.S.G.], doktorska disertacija, Univerzitet Hamburg (1994)), stvorilo je osnovne preduslove za biotehnološku eksploataciju ove biljke.

Rad koji je sproveden na početku je pokazao dugotrajnu postojanost integracije korišćenjem transgenskihPhyscomitrellalinija koje potiču iz Reutter-a (loc. cit., 1994). Komprimovanje heterolognihnptII igusgena, koji su kao primer korišćeni za ovu namenu, mogli su se još uvek detektovati nakon četiri godine.

Optimiziran jePhyscomitrellabioreaktor. Napravljena je mešalica kojom se postiže usitnjavanje protonemata i kojom se ostvaruje neophodna homogenost kulture pri kontinuiranoj brzini od 300-500 rpm. Tako je postignuto standardno uzorkovanje. Istovremeno, ulazni vazduh je ravnomernije raspodeljen u tečnoj kulturi. U ovim uslovima. pokazalo se da se razvoj biomase i proteina bez spoljnje regulacije pH odvija na identičan način kao i s regulisanjem pH. Iznenađujuće, pokazalo se da ovo poslednje i nije potrebno. U ovim poluindustrijskim uslovima postignuta je nedeljna proizvodnja od 500 mg težine suvog proizvoda, ili 22 mg ukupnog proteina po litri. To znači daje povećanje proizvodnje biomase za faktor 5 u odnosu na standardnu kulturu u posudi od 51. Smanjenje koncentracije soli u Knop-ovoj sredini na jednu desetinu daje slične rezultate, pa se time postiže smanjenje cene.

Dodatak 5mM amonijum tartarata ubrzao je razvoj biološke mase smanjivanjem vremena faze kašnjenja. Istovremeno, dodatak amonijum tartarata dao je kulture koje se sastoje praktično isključivo od hloronemskih ćelija. Pokazalo se, uz pomoć protočne citometrije, da je jedna stotina procenata ćelija ove kulture u G2/M fazi ćelijskog ciklusa. Ovaj rezultat je potvrđen daljim fiziološkim istraživanjima s auksinom i istraživanjima s diferencirano-specifičnim mutantimacal] 12ical\ 13,te je zaključeno da su kauionemske ćeije u G1/G0 fazi većinu vremena, dok su hloronemske ćelije pretežno u G2/M fazi.

Promoter je ispitan u vezi s mogućom inducibilnošću kod mahovine korišćenjem agrobakterijskog l'-promotera. p-glukuronidazni( gus)gen korišćen je kao gen za obeležavanje. U prelazno transformisanim protoplastima mahovine (brzina transformacije = 3 x IO"<4>), ispoljavanjegusgena je uočeno nakon indukcije s 5 pJvl indol-3-sirćetnom kiselinom. Ni u jednoj kontroli nije uočeno nikakvo komprimiranje.

Gen za spoj od 121 aminokiseline humanog vaskularnog endotelnog činioca rasta (VEGFm) transformisan je uPhyscomitrellabrzinom transformacije od 0,5 x 10"<5>i 3,3 x IO"<6>. Nakon toga, gen je kloniran konstitutivnim 35S'promoterom te u transfomacijski vektor pRT99, koji je pogodan za biljke. U drugom pristupu, niz koji kodira odgovarajući humani ER prelazni peptid je dodatno kloniran. Integrisanje heterologne DNK je potvrđeno i opisan je tip integrisanja podvrgavanjem dobijenih postojanih transformanata „Southern" analizi. „Northern" analiza je potvrdila postojanje nptll i dva VEGF transkripta u ovim transformantima. VEGF 121 komprimovanje u ćelijama mahovine demonstrirano je posrednom imunofluorescencijom. Pomoću konfokalnog laserskog skenirajućeg mikroskopa pokazalo se jasno da je protein lokalizovan u ćelijama. Ova istraživanja su pokazala da je za transformante bez prelaznog peptida, protein lokalizovan konkretno u citoplazmi. U transformantima koji takođe sadrže ER prelazni peptid, protein se može naći u područjima jezgra i u vršnim (apikalnim) područjima apikalnih ćelija, područjima s vrlo visokim sadržajem ER. Biološka aktivnost heterolognog proteina koji je proizveden u skladu sa ovim pronalaskom proverena je pomoću ELISA analize i dve funkcionalne analize s VEGF proteinom koji je dobijen iz sredine kulture.

Materijali i nostunci:

Ako u tekstu nije drukčije navedeno, hemikalije su bile analitičke čistoće i nabavljene od kompanija Fluka (Neu-Ulm), Merck (Darmstadt), Roth (Karlsruhe), Serva (Heidelberg) i Sigma (Deisenhofen).

Rastvori su napravljeni od čiste, apirogene vode koja je označena sa H2O, a dobijena iz sistema za prečišćavanje vode Milli-Q (Millipore, Eschborn).

Restrikcijske endonukleaze, enzimi koji menjaju DNK i molekularno biološki pribori dobijeni su od AGS (Heidelberg), Amersham (Braunschvveig), Applied Biosvstems (Weiterstadt), Biometra (Gottingen), Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim), Genomed (Bad Oevnhausen), New England Biolabs (Schvvalbach/Taunus), Novagen (Madison, Wisconsin, USA), Pharmacia (Freiburg), Qiagen (Hilden) i Stratagene (Heidelberg). Ako nije drugačije navedeno, oni su korišćeni prema uputstvu proizvođača.

Vektori i konstrukti

Plazmid pCYTEXP-VEGF|2ije derivat od pCYTEXPl (T.N. Belev et al., A fully modular vector svstem for the optimization of gene expression in Escherichia coli, Plasmid, 26, str. 147-150 (1991)), u kojem je cDNK humanog VEGFui integrisana za ispoljavanje uE. Coli.VEGF,2icDNK izvađen je iz pCYTEXR»VEGF12ipomoću restrikcijskih endonukleazaNde1 iSal I,prečišćen, s blagim završetkom, i kloniran uSrnaI mestu cepanja od pRTlOl (R. Topfer et al., A set of plant expression vectors for transcriptional and translational fusions, Nucleic Acids Res., 15, str. 5890 (1987)) između 35S promotera i poliadenilacijskog niza CaMV. PomoćuHindlll, tako dobijena kaseta je ponovo izvađena i klonirana uHindlll restrikcijskom mestu cepanja transformacijskog vektora pRT99. pRT99 ne sadrži samo višestruko mesto kloniranja, već takođe i neomicin fosfotransferaza gen pod regulisanjem 35S promotera i odgovarajućim poliadenilacijskim nizom CaMV (R. Topfer et al., Versatile cloning vectors for transient gene expression and direct gene transfer in plant cells, Nucleic Acids Res., 16, str. 8725 (1988)). Ovaj gen prenosi otpornost antibiotskom G418 u postojano transformisanim biljkama. Plazmidi su kopirani u sojuEscherichia coliDH5a (J. Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989)).

Pomoću restrikcijskih enzima Bam HI i Bgl II, cDNK je uklonjena iz vektora pVE-121, koji je izvorno napravljen za komprimovanje VEGFm u insektnim ćelijama i koji nadalje uz VEGFm niz sadrži DNK koja kodira prirodni prelazni peptid koji, u životinjskim ćelijskim sistemima, posreduje u izlučivanju u sredinu putem endoplazmatskog retikuluma (Fiebich et al., Synthesis and assembly of functionallv active human vascular endothelial gro\vth factor homodimers in insect cells, Eur. J. Biochem., 211, str. 19-26 (1993)), te je, pomoću pRTlOl, kloniran u pRT99 i proveren.

Plazmid pNA201 je derivat binarnog vektora pBHOl (A. Jefferson et al., Assaying chimeric genes in plants: The GUS gene fusion system, Plant Mol. Rep., 5, str. 387-405 (1987)). On sadržinptHgen pod promoterom nopalin sintaze kao selekcijski obeleživač za biljke.Gusgen, koji je takođe prisutan, regulisan je pomoću P-promotera odAgrobacterium htmefaciens.pNA201 je pogodan za direktno pretvaranjePhyscomitrella patens.

Antitela

Korišćena su dva različita antitela za VEGF protein. Prvo antitelo je kunić-anti VEGF antitelo i usmereno je protiv sintetskog peptida koji odgovara aminokiselinil-20 urođenog humanog VEGF (Fiebich et al., loc.cit. (1993)). Drugo antitelo je monoklonsko mišje antitelo usmereno protiv humanog VEGF121proteina (R&D Svstems, Wiesbaden).

Biljni materijal

Korišćen je divlji soj mahovinePhyscomitrella patens(Hedw.) B.S.G. koji potiče iz kolekcije Grupe za genetiku na Odeljenju za opštu botaniku Univerziteta u Hamburgu. Njegov izvor je soj 16/14, koji je sakupljen od H.L.K. Whitehouse iz Gransden Wood, Huntingdonshire (England), koji je uzgojen iz spore.

Divlji soj raste bilo u tečnoj kulturi s Knop-ovom sredinom (R. Reski i W.O. Abel, Induction of budding on chloronemata and caulonemata of the moss, Phvscomitrella patens, using isopentenvladenine, Planta, 165, str. 354-358 (1985)) ili na čvrstoj Knop-ovoj sredini s 1% oksoidnim agarom (Unipath, Basingstoke, England). Tečne kulture su načinjene kao stoje opisao Reski (loc. cit., 1990).

Kultura bioreaktora

Za uzgajanje u većem obimu, biljni materijal stavljen je u staklenu posudu s okruglim dnom od 71 koja je opremljena dvostrukom košuljicom (Applikon Biotek, Kniilivrald). U ovom bioreaktorskom sistemu, kondenzator otpadnog vazduha, cev za provetravanje, pH elektroda (Conducta, Gerlingen), temperaturni senzor. uređaj za mešanje. cev za izorkovanje i ulaz za kiselinu, bazu i sredinu postavljeni su u prostor kulture kroz otvore na zatvaraču. Uzgajanje je vršeno na 25°C i kontrolisano je pomoću odgovarajuće postavljene vodene kupke koja je povezana s dvostrukom košuljicom. U eksperimentima koji su izvršeni s regulisanjem pH, pH je održavana konstantno na 5, 8 pomoću titracijske jedinice, Merenje temperature i regulisanje pH izvršeno je pomoću Biocontroller ADI 1030 (Applikon Biotek, Kniilhvald). Brzina mešalice se može menjati pomoću kontrolora motora ADI 1012 (Applikon Biotek, Kniillvvald). Sredina kulture je stalno provetravana vazduhom pod pritiskom od 1 bara putem poroznog elementa za ubrizgavanje. Da se osigura sterilnost u posudi s kulturom, sve ulazne i izlazne linije opremljene su filterskim sterilizacijskim jedinicama (Midisart, 0,2um; Sartorius, Gottingen). Bioreaktorsko uzgajanje je izvršeno u kabinetu s kontrolisanim uslovima i bočnim osvetljenjem (belo svetio; Osram L 40 W/20; max lOOumols "' m"<2>). Kulture su pelcovane sa 0,5-1 g vlažnog biljnog materijala po litri bioreaktorske kulture u sterilnim uslovima. Cev za uzorkovanje smeštena je na isti nivo s mešalicom, tako da je osigurano jednako uzorkovanje pri mešanju. Male količine uzorka (<100ml) uzete su sterilnom brizgaljkom s Luer spojem, dok su velike zapremine uzorka uzete, na primer, peristaltičkom pumpom tipa 302/3A koja je opremljena glavom 501 Rl (Sartorius, Gottingen).

Hloronemske kulture divljeg tipa načinjene su dodatkom 5mM amonijum tartarata Knop-ovoj sredini.

Prinos biološki aktivnog heterolognog proteina koji je izlučen može se značajno povećati kada se u kulturi sredine nalazi stabilizator polivinilpirolidon (PVP).

Diferenciranje kaulonema, koje se zbiva tokom protonernskog razvoja, može se podstaknuti i povećati egzogenim dodatkom fizioloških količina auksina, pogodne koncentracije kao što je, na primer, 5umol/l indol-3-sirćetne kiseline (IAA).

Da se dobije tečna kultura pod odabranim pritiskom, 50 mg/l antibiotskog G418 (Calbiochem, Bad Soden) dodato je Knop-ovoj sredini. Nakon toga, kulture su uklonjene filtriranjem kroz sterilna lOOum sita (Wilson Sieves, Nottingham, England) svakih deset dana neposredno pre usitnjavanja i prenesene u Erlenmaverove boce koje su napunjene odabranom sredinom.

Za eksperimente hranjivih elemenata, Knopp-ova sredina je razređena vodom u razmeri 1:10.

Transformacija

Odabrani postupak transformacije je PEG-upravljan direktni prenos DNK u protoplaste kao što su opisali Reutter i Reski (loc. cit., 1996.). 50ug plazmida DNK koristi se za 3xl0<5>protoplasta u svakom pretvaranju. Regenerisanje protoplasta i odabiranje postojanih trnsformanata izvršeno je kao što su opisali Reutter i Reski (loc. cit. 1996), ako nije drugačije naznačeno.

Indirektna irnunoflourescencija

Pufer: MSB: lOOmM PIPES; 5-10 mM EGTA, 5mM MgS04, pH 6,8 F-MSB: MSB +5%

DMSO

E-MSB: MSB+5% DMSO+5% Nonidet

W-MSB:MSB razređen 1:2 s H20 (pufer za ispiranje)

Enzimski rastvor: 1% celulaza, 1% pektinaza, 2% drizelaza u MSB, pH 5,6 (sve Sigma, Deisenhofen).

Protonemat mahovine fiksiran je u 1,25% glutaraldehidu u F-MSB (v/v) inkubiranjem ne duže od 10 minuta i kratko ispran u W-MSB. Zatim je protonemat inkubiran s 2% paraformaldehidom u MSB (v/v) tokom 40 minuta i ispran 3x s W-MSB (ispiranje lx; pranje 2x; tokom 5 minuta).

Slobodni aldehidi koji ne mogu biti uklonjeni ispiranjem su smanjeni dodatkom MSB ijedne špatule borhidrida, s vremenom inkubiranja od 10 minuta. Borhidrid je uklonjen ispiranjem tri puta s W-MSB.

U sledećoj fazi učinjeno je da ćelijski zidovi postanu propustljivi dodatkom enzimskog rastvora tokom 10 minuta. Enzimska reakcija je zaustavljena pramenom pH (MSB, pH 6,8). Ponovo, smesa je isprana 3x s W-MSB.

Hlorofili su ekstrahovani inkubiranjem s rastvorom deterdženta tokom 120 minuta. Rastvor je zatim uklonjen ispiranjem 3 puta s W-MSB.

Nakon ove pripreme, protonemati mahovine inkubirani su s primarnim antitelom (anti-HVEF; razređenost 1/50). To je učinjeno na 37 °C tokom 45 minuta. Nakon tri ispiranja s W-MSB, obeieženo sekundarno antitelo (anti-kunić ili anti-miš; razređenost 1/30; obeieženo s fluorescein izotiocijanatom (FITC) (Molecular Probes, Leiden, Netherlands)) dodato je tokom 45 minuta na 37°C. Uz prethodno navedena tri ispiranja, smesa je jednom isprana s V/-MSB +0,1% Triton. Protonemati su zatim sakupljeni s W-MSB i čuvani na 4°C bar preko noći.

Materijal je ispitan pomoću konfokalnog laserskog skenirajućeg mikroskopa (CLSM) tipa TCS 4D (Leica Lasertechnik, Heidelberg) i programske podrške Scanware 5.0 (Leica Lasertechnik, Heidelberg).

Da bi se analizirali uzorci pod CLSM. oni su stavljeni na podlogu u rastvor za fiksiranje (Dabco, Sigma, Deisenhofen). Eksitiranje fluorescentne boje FITC koja je vezana za sekundarno antitelo izvršeno je pomoću argon-kripton lasera pri talasnoj dužini 488 nm. FITC emituje svetio talasne dužine 528 nm.

ELISA analiza

VEGF protein u sredini kulture, koji je nastao u odgovarajuće transformisanim biljkama mahovine, određen je kvalitativno i kvantitativno pogdnim postupcima pomoću ELISA analiza, te gore opisanim antitelima. Količina od 200u,l sredine kulture korišćena je direktno u ELISA analizi.

Analize funkcionalnosti

Biološka aktivnost rekombinantno nastaiog VEGF koji je dobijen iz sredine kulture proverena je mitogenom analizom (Mivazono et al., Purification and properties of an endothelial cell grovvth from human platelets, J. Biol. Chem., 262, str. 4098-4103

(1987)) te „Analizom 13-og dana korioalantoinsko-membranske angiogeneze" (Wilting et al., A morphological study of the rabbit corneal assay, Anat. Embrvol., 183 str. 1167-1174 (1991)). Sredina kulture je prvo podvrgnuta ultrafiltriranju, zatim je liofilizirana i nakon toga ponovo suspendovana u puferu. Po želji, može se izvršiti sledeća faza prečišćavanja na katjonskoj koloni.

Indukovanje 1'- promotera

Induktibilnost l'-promotera auksina ispitana jc s 5umol/l indol-3-sirćetne kiseline (IAA). Pet dana nakon transformacije, alikvoti protoplasta od 100 ui transformacijske reakcione smese s pNA201 prenešeni su u vrtloge mikrolitarske ploče s 96 vrtloga (Nunc, Wiesbaden). Suspenzije protoplasta inkubirane su 5 sati s IAA (konačna koncentracija=5uM). Induktivni eksperimenti su procenjeni direktno nakon inkubacijskog perioda pomoću kvalitativne analize p-glukuronidaze.

Kvalitativna analiza B- glukuronidaze

Aktivnost p-glukuronidaze određena je kvalitativnom analizom (A.R. Jefferson, Assaying chimeric genes in plants; The GUS gene fusion svstem, Plant Mol. Rep., 5, str. 387-405 (1987)).

Supstratni pufer: 50 mM K3Fe(CN)550mM Na2HP04

50 mM K4Fe(CN)6l%(v/v) Triton X-100

50 mM NaH2P0410 mM EDTA, pH 7.0 4 mg/ml

PVP (MW 10 000)

Rastvor za bojenje: 12,5 mg, 5-brom-4-hlor-3-indoIilglukuronska kiselina (Biomol, Hamburg) rastvorena u 250 u.1 N, N-dimetilformamid/50 ml supstratnog pufera.

Protonemati mahovine i protoplasti mahovine u Knop-ovoj ili regeneracijskoj sredini inkubirani su do 72 sata na 37°C u jednakoj zapermini rastvora za bojenje i neposredno nakon toga su ispitani pomoću mikroskopa.

Rezultati

Homogenost kulture bioreaktora; uzorkovanje

Samo homogene kulture omogućuju standardno uzorkovanje iz ćelijskih kultura. Nakon produženog uzgoja, rast protonema u duga ćelijska vlakna često dovodi do ćelijskog povezivanja i time do nehomogene raspodele biljnog materijala u tečnim kulturama. Da bi se izbeglo takvo povezivanje, protonemati su usitnjavani u specifičnim intervalima-u bioreaktoru svaki drugi dan nakon 10. dana i u mućkanoj kulturi svakih 12 dana-pomoću visokobrzinskih mešalica/homogenizatora. Da bi se postigli kontinuirani uslovi u bioreaktoru uz istovremeno standardizovano uzorkovanje, čak i tokom perioda produženog uzgoja, preporučuje se modifikovanje turbinske mešalice s tri lopatice za mešanje brušenjem rubova lopatica za mešanje, tako da se one transformišu u oštricu rezača. Konstantno „mešanje" pri 300-500 rpm daje homogene bioreaktorske kulture.

Razvoj biomase (u DW [mg/l] tokom perioda od 35 dana (840h) na 500 rpm u kontrolnim kulturama s turbinskom mešalicom bio je identičan kao i u bioreaktorskim kulturama koje su mešane s mešalicama tipa oštrog rezača.

Homogenost kulture je procenjena u svakom od šest slučajeva upoređivanjem s paralelnim uzorcima. Težina suvog biljnog materijala iz uzorka zapremine 100 ml određena je kao parametar za upoređivanje. Kada je korišćena nemodifikovana turbinska mešalica, standardno odstupanje povećalo se s povećanjem koncentracije biomase. Kao posledtca mešanja mešalicom s oštrim rezaČem, standardno odstupanje uzoraka ostalo je nisko. To navodi na zaključak da se uniformnost homogene kulture može postići s promenjenom mešalicom tokom perioda od 35 dana.

Istraživanja inducibilnosti l'- nromotera

U plazmidu pNA201, l'-promoter nalazi se uzvodno odgusgena i deluje kao kontrolni element. Poznata analiza p-glukuronidaze pogodna je kao detekcijska analiza za indukcijske eksperimente s mahovinom. Eksperimenti s transgenskim duvanom pokazali su da 1 '-promoter dovodi do ispoljavanja P-glukuronidaze u tkivima s visokim sadržajem auksina, pa se prema tome podrazumeva da ovaj promoter zavisi od auksina. Inducibilnost 1 '-promotera pomoću auksina uPhyscomitrella patens- uistražena je u prolazno transformisanim protoplastima.

Transformacijska reakciona smesa podvrgnuta je analizi (3-glukuronidaze sa (5h) i bez inkubiranja s 5uM indol-3-sirćetnom kiselinom (IAA). U kontrolama bez dodatka IAA, provera pod mikroskopom pokazala je da nema plavih protoplasta ni u jednoj reakcionoj smesi. Nasuprot tome, ispitivanje protoplasta koji su inkubirani s auksinom potvrđuje komprimovanjegusgena. Na osnovu plavih protoplasta postignuta je brzina transformacije od 3x1 0A. To jasno ukazuje daje l'-promoter inducibilan od strane biljnog hormona auksina u prelazno preobraženim protoplastima mahovine.

Generisanje vektora za VEGF transformacije

Da bi se transformisala cDNK od VEGF)2| bez vodećeg niza, koja je u nastavku nazvana VEGFC, te cDNK od VEGF121s vodećim nizom, koja je1* nastavku nazvana VEGFP, uPhyscomitrella,neophodno je klonirati nizove između jedinice promoter/terminator koja je pogodna za biljke. 35S CaMV promoter i odgovarajući poliadenilacijski signal odabrani su za ovu namenu. Odgovarajući priređeni VEGF cDNK nizovi klonirani su u Srna I restrikcijskom mestu cepanja višestrukog klonirajućeg mesta vektora pRTl 01.

Rezultirajući vektori (pRTl 01 VEGFC 3 i VEGFP 21) nanizani su putem izvora koji je izveden iz terminalnog područja 65S promotera, te je proverena tačnost integrisanja između promotera i poliadenilacijskog mesta.

Nastale kasete izvađene su iz restrikcijskog enzima Hin dlll i klonirane u stvarni transformacijski vektor pRT99 u Hin dll mestu cepanja (pRT99VEGFC 3 i VEGFP 21).

Orijentacija kaseta relativno prema NPTII kaseti može se odrediti restrikcijom saSrnaI iHineII. U slučaju orijentacije promoter-prema-poliadenilacijskom signalu, dobijeni su fragmenti 5250 (VEGFC) i 5380 bp (VEGFP), dok obrnuta orijentacija daje 1100 (VEGFCV1230 (VEGFP) i 4150 bp (VEGFC i P) fragment. Restrikcijska analiza dala je samo 5250/5380 bp fragment, pa sutako dobijene VEGFC/P kasete ugrađene u promoter-prema-adenilacijskom signalu orijentaciju relativno premanplllgenu od pRT99.

VEGFC transformacije uPhvscomhreUa - i

Apsolutna brzina transformacije za transformisanje VEGFC konstrukta protoplasta divljeg tipa nakon ponovljene izmene iz Knop-ove sredine u selekcijsku sredinu je 0.5 x IO"<5>, uz nepromenjenu postojanost transformanata.

Demonstracija integrisania transformisanog plazmida.

Uspešnost integrisanja u biljni genom demonstrirana je „Southern" hibridizacijom.

Korišćene probe su prvoNcoI fragment odnptII gena iz pRT99 i zatimNde MSa 11VEGFC fragmentt iz pCYTEXP-VEGF,2i.

Signali koji su zabeleženi u necepanoj ukupnoj DNK transformanata potvrđuju uspešno integrisanje DNK plazmida u biljni genom. Jesu li dobijene sve od 35S VEGFC PolyA kaseta čak i nakon integrisanja provereno je restrikcijom sHindlll. Ako je kaseta ostala intaktna nakon integrisanja, ovaj restrikcijski enzim izvlači 1100 bp fragment iz ukupne DNK.

Hibridizacijska slika s VEGFC uzorkom dala je 1100 bp fragment za sve transformante. Na taj način je demonstrirano integrisanje celokupne VEGFC komprimacijske jedinice, što je preduslov za tačnu transkripciju^i komprimovanje VEGF)2iu mahovini.

Demonstracija transkripcije heterolognih gena

Transkripti heterolognih gena VEGFC i NPTII transformanata zabeleženi su neradioaktivnim DIG sistemom detekcije koristeći VEGF i NPT II sonde. S 760 nukleotide za VEGFC transkript i 1100 nukleotide za NPT II transkript, veličine transkripata koji se zabeleženi u fluorogramu su unutar reda veličine koji je očekivan za ovaj slučaj. Kao što se očekivalo, nijedan od ova dva heterologna transkripta nije zabeležen u WT kontroli.

Analiza transformanta s humanim nrelaznim peptidom

PEG-posredovan DNK prenos 50ug pRT99P 21 plazmidne DNK po reakciji transformacije generira transformante koji su stalno postojani na selekcijskom mediju. Postignuta je postojana brzina transformacije od 3,3 x IO"6.

Demonstracija integrisania transformisanog plazmida

Integrisanje gore opisanih transformanata s prelaznim peptidom demonstrirano je kao što je prethodno opisano sa „Southern" hibridizacijom pomoću opisanih proba, te hibridizacijom Hin dlll-cepane ukupne DNK s VEGF probom što je dalo 1230 bp fragment: demonstracija potpunosti integrisane 35S VEGFP PolyA kasete.

Demonstracija transkripcije heterolognih gena

Gore navedenim postupkom mogu se detektovati NPTII i VEGFP transkripti.

Detektovanje humanog VEGF)2i u transgenskim ćelijama mahovine pomoću konfokalnog laserskog skenirajueeg mikroskopa.

U ovom postupku testni protein je obeležen direktno u fiksiranim ćelijama. Ispitivanje je izvršeno pod konfokalnim laserskim skenirajućim mikroskopom, koji ima poboljšanu snagu rezolucije u odnosu na normalni svetlosni mikroskop.

Rekombinantni VEGF|2tprotein-ako se može detektovati u ćelijama mahovine-trebalo bi da se nakuplja u citoplazmi VEGFC transformanata. U VEGFP transformantima on bi trebalo da se detektuje u ER sistemu ako je prelazni peptid funkcionalan kao signal u mahovini.

Komprimovanje humanog VEGF121u transgenskim ćelijama mahovine uspešno je demonstrirana posrednim imunofluoresceneijskim postupkom i računarski vođenim ispitivanjem s konfokalnim laserskim skenirajućim mikroskopom. Kao dodatak, pokazalo se daje u transgenskoj mahovini VEGF121uspešno prenesen u,andoplazmatski retikulum u prisustvu odgovarajućeg humanog prenosnog peptida.

Analiza na prisutnost VEGF u sredini kulture

Alikvot 200 jtl sredine kulture u prisutnosti PVP analiziran je pomoću ELISA i pokazuje da su se biljke mahovine transformisale, pri čemu komprimacijska kaseta s kodirajućim nizom prelaznog peptida može otpustiti VEGF u sredinu. Pozitivni rezultati omogućuju zaključak daje prisutan funkcionalni VEGF protein.

Analiza biološke aktivnosti

Obe analize koje su korišćene za proveru biološke aktivnosti VEGF proteina koji je otpušten u sredinu kulture dale su pozitivan rezultat i potvrdile da se VEGF koji je proizveden u skladu sa ovim pronalaskom može dobiti iz medija kulture sa željenom biološkom aktivnošću.

Claims (6)

1. Postupak za proizvodnju heterolognih proteinskih supstanci u biljnom materijalu, n a z n a č e n t i m e, što se kao biljni materijal koristi protonemsko tkivo mahovine i što se proizvedene proteinske supstance dobijaju iz sredine kulture bez prekida proizvodnje tkiva ili ćelija.

2. Postupak prema zahtevu 1, n a z n a č e n t i m e, što je proteinska supstanca koja se otpušta u sredinu kulture biološki aktivna.

3. Postupak prema zahtevima 1 ili 2, n a z n a č e n t i m e, što je sredina kulture koja se koristi oslobođena šećera, vitamina i fitohormona ili njihovih funkcionalnih fragmenata.

4. Postupak prema bilo kom zahtevu od 1 do 3, n a z n a č e n t i m e, što je tkivo mahovine odabrano iz grupe mahovina, uključujući jetrenjače.

5. Postupak prema zahtevu 4, naznačen time, stoje tkivo mahovine odabrano iz grupe mahovina koju sačinjavajuPhyscomitrella, Funaria, Sphagnum i Ceratodon.

6. Postupak prema zahtevu 4, n a z n a č e n t i m e. što je tkivo mahovine odabrano iz grupe jetrenjača koju sačinjavajuMarchantia i Sphaerocarpos.